程晓鸥[1]（2021）在《金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞并诱导异噬的机制》文中研究表明金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是奶牛乳腺炎的主要病原体,可以内化进入细胞。进入细胞内的S.aureus可以适应宿主细胞的内环境从而实现定植。异噬（xenophagy）是选择性自噬的一种形式,其中胞内的细菌被自噬小体捕获,在溶酶体中降解。细菌入侵和宿主细胞通过异噬抵御细菌感染是一个病原体与宿主细胞相互作用的过程,这个过程可能存在着一个复杂的调控网络,但机制并不完全清楚。奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）是奶牛乳腺的主要细胞,常被用于奶牛乳腺炎的研究。在本研究中,以BMECs作为细胞模型,通过转录组和蛋白质组分析,探究BMECs感染S.aureus后mRNA表达谱和蛋白质表达谱的变化,筛选出宿主细胞抵御细菌感染的关键分子,阐明S.aureus诱导宿主细胞异噬的分子机制。这些结果为S.aureus诱导的奶牛乳腺炎的防治提供了新思路。实验建立BMECs胞内S.aureus感染模型,通过转录组学分析及蛋白质组学再分析筛选出S.aureus入侵相关的差异表达基因和差异表达蛋白。对筛选出的ITGAV、ACTR2、ACTR3和CI-MPR分别进行功能验证,探讨其在细菌感染中发挥的作用。通过透射电镜、免疫荧光染色等方法检测S.aureus诱导的异噬,通过转录后沉默、抑制剂处理等方法,明确CI-MPR和Clathrin在S.aureus诱导的异噬中发挥的功能。进一步,检测S.aureus侵染BMECs后,PI3K/Akt信号通路和JNK/c-Jun信号通路的活性,探讨该信号通路对CI-MPR表达及异噬的调控作用。结果表明:1)通过菌落计数对细胞内和细胞外的细菌进行评估,在全细胞裂解液中检出S.aureus,而在培养液中没有发现。此外,激光共聚焦显微镜下可见细胞内染色的S.aureus,透射电镜观察到S.aureus游离于BMECs细胞质中。对S.aureus侵染BMECs 2 h和8 h分别进行转录组学分析,筛选到与细菌入侵相关的三个差异表达基因,分别为ITGAV,ACTR2,ACTR3。2)对S.aureus侵染2 h的BMECs和对照组的蛋白质组数据再分析。发现CI-MPR在KEGG数据库中被注释到溶酶体、吞噬体和内吞作用条目,预示可能参与抵御S.aureus侵染。Western blot检测,S.aureus感染的细胞中CI-MPR表达水平升高。3)ITGAV转录后沉默和整合素（Integrin）抑制剂RGD预处理,BMECs内S.aureus的数目均显着减少,提示Integrin介导S.aureus入侵BMECs。ACTR2转录后沉默和ACTR3转录后沉默,BMECs内S.aureus的数目均显着减少,提示ACTR2和ACTR3介导S.aureus入侵BMECs。4)CI-MPR转录后沉默和抗体封闭CI-MPR后,BMECs内S.aureus的数目显着升高;CI-MPR激动剂D-M6P处理,BMECs内S.aureus的数目显着降低。Clathrin抑制剂Pitstop 2处理,BMECs内S.aureus的数目显着升高。生物信息学预测结果和免疫共沉淀结果证明CI-MPR和Clathrin具有相互作用关系,提示CI-MPR偶联Clathrin抵御S.aureus入侵BMECs。5)S.aureus侵染BMECs后,透射电镜可见包裹着细菌的自噬溶酶体;激光共聚焦显微镜观察到S.aureus与LC3共定位,MDC阳性标记的囊泡增多;Western blot结果显示,p62和LC3的表达量增加;自噬抑制剂羟氯喹（HCQ）处理后,异噬受阻。以上结果证明,S.aureus入侵BMECs诱导异噬发生。6)CI-MPR转录后沉默,S.aureus诱导的异噬减弱;CI-MPR激动剂（DM6P）处理,异噬增强。网格蛋白抑制剂（Pitstop 2）处理,S.aureus诱导的异噬减弱,提示CI-MPR和网格蛋白均介导S.aureus诱导的异噬。7)S.aureus入侵BMECs,PI3K/Akt信号通路和JNK信号通路被激活。CIMPR转录后沉默和激动剂D-M6P处理,证明CI-MPR介导S.aureus入侵BMECs诱导的PI3K/Akt信号通路和JNK信号通路激活;PI3K抑制剂LY294002和JNK抑制剂SP600125处理,证明PI3K/Akt信号通路对JNK信号通路具有调节作用。8)生物信息学预测c-Jun是CI-MPR的转录因子。S.aureus侵袭后,JNK/c-Jun信号通路被激活,CI-MPR表达量增加。JNK抑制剂SP600125处理后,JNK/c-Jun活性受到抑制,CI-MPR表达水平下降,异噬减弱。提示JNK/c-Jun信号通路调控CI-MPR基因表达和异噬。总之,S.aureus通过Integrin和ACTR2、ACTR3入侵BMECs并诱导异噬发生,CI-MPR和Clathrin共同抵御S.aureus入侵并介导异噬。同时,细菌入侵导致宿主细胞内PI3K/Akt信号通路和JNK/c-Jun信号通路被激活,促进CI-MPR的表达。CI-MPR/PI3K/Akt偶联JNK/c-Jun调控异噬,从而抵御细菌感染。这些结果展示了S.aureus入侵BMECs及BMECs抵御S.aureus感染的新机制,为奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。
李根[2]（2021）在《嗜肺军团菌效应蛋白MavQ的生化及生物学功能研究》文中指出嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一种在世界范围内广泛分布的革兰氏阴性条件致病菌,感染人体后诱发以发热和呼吸道症状为主要特征的军团菌病。自1976年首次被发现以来,在全球不断有军团菌流行发病的报道。该病原菌在自然条件下广泛存在于水生环境及人造水系统中,近年来随着空调等人工水系统的广泛使用,军团菌病的发病率逐年攀升,已经成为现代社会人类健康的重大威胁之一。军团菌是一种胞内寄生菌,其在细胞内的生长严格依赖于其特殊的Dot/Icm Ⅳ（T4SS）分泌系统,当其被宿主细胞吞噬后,会在细胞内形成含军团菌的吞噬泡（Legionella-containing vacuole,LCV）,募集内质网与高尔基体间转运的囊泡到LCV表面以修饰LCV,使其形成类似内质网的结构,细菌则在其中完成增殖复制的过程并最终裂解细胞。LCV表面富含大量的磷脂酰肌醇-4-磷酸,而军团菌所分泌的众多效应蛋白中,很多都含有磷脂酰肌醇-4-磷酸结合结构域,通过结合该介质来锚定于LCV上发挥其功能。（1）本研究通过生物信息学分析发现军团菌效应蛋白MavQ（more regions allowing vacuolar colocalization Q）在整体氨基酸组成上和已知功能的蛋白没有同源性,但是其N端却存在着一个和多个真核生物、原核生物磷脂酰肌醇磷酸激酶催化结构域相类似的催化活化基序Dx Hxx N和IDH,并且在酵母细胞中异位表达MavQ可以显着的抑制酵母的生长,于是我们就选择酵母系统来验证这个潜在的催化结构域对MavQ功能的影响。分别将关键且保守氨基酸149位组氨酸（H）、152位天冬氨酰（N）和160位天冬氨酸（D）突变成丙氨酸（A）后,均可以显着的解除MavQ对酵母细胞生长的抑制作用。表明这个潜在的催化结构域对MavQ功能的发挥具有重要的作用。进一步我们通过原核表达系统纯化获取了MavQ的重组蛋白,在激酶反应的条件下分别与不同类型的磷脂酰肌醇类物质[PtdIns、PtdIns3P、PtdIns4P、PtdIns5P、PtdIns（3,4）P2、PtdIns（3,5）P2、PtdIns（4,5）P2]作用,筛选发现在磷脂酰肌醇（PtdIns）存在的条件下,MavQ表现出了显着的激酶活性,表明磷脂酰肌醇是MavQ的作用底物。进一步,我们通过薄层色谱实验（TLC）发现MavQ作用PtdIns所生成的单磷酸产物可以在能够水解磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns3P）的磷酸酶MTM的作用下降解。并且在PtdIns与MavQ的反应体系中加入以磷脂酰肌醇-3-磷酸为底物的LepB后,反应生成了一个明显的磷脂酰肌醇二磷酸产物,进而充分证明MavQ作用于PtdIns生成了磷脂酰肌醇-3-磷酸,MavQ具有磷脂酰肌醇3-磷酸激酶（PI3K）的活性。（2）在HeLa细胞中过表达MavQ,发现其可以选择性破坏中间和反式高尔基体,而对顺式高尔基体无影响。并且MavQ对真核细胞广谱磷脂酰肌醇3-磷酸激酶抑制剂渥曼青霉素不敏感,在细胞内MavQ也可以发挥其PI3K活性。在渥曼青霉素抑制内源性磷脂酰肌醇-3-磷酸产生后,转染表达MavQ的细胞中仍然可以检测到早期内体标志EEA1与磷脂酰肌醇-3-磷酸荧光探针2×FYVE的共定位,从而表明MavQ可以在内体上产生磷脂酰肌醇-3-磷酸。（3）通过军团菌敲除常用的三亲杂交法,我们成功的构建了mavQ缺失的军团菌菌株,在绘制胞内生长曲线的过程中,发现相比较于野生型军团菌,mavQ缺失的菌株在细胞内的生长并没有发生显着的变化,表明MavQ并不是军团菌生长所必需。进一步我们制备了鼠源的抗MavQ抗体,通过免疫荧光手段检测到MavQ可以定位到LCV表面。目前,LCV表面磷脂酰肌醇-4-磷酸来源被确切证明的途径之一是军团菌效应蛋白LepB以磷脂酰肌醇-3-磷酸为底物作用生成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸,进一步在SidF的协同作用下水解第3位的磷酸生成磷脂酰肌醇-4-磷酸,而LepB的作用底物磷脂酰肌醇-3-磷酸的来源尚不清楚,基于MavQ的酶活特性以及定位在LCV表面的特征,我们采用了SidC染色报告系统来鉴别MavQ是否会为LepB的作用提供底物,SidC是通过结合LCV上的磷脂酰肌醇-4-磷酸来定位在LCV表面,而mavQ缺失后,LCV表面SidC的比例显着降低,其效果与单独缺失lepB或sidF以及双缺失mavQ和lepB的效果相似,并且这种降低可以通过回补mavQ进行修复,而回补其激酶活性的突变子则没有作用。故而表明MavQ可以通过作用磷脂酰肌醇生成磷脂酰肌醇-3-磷酸为军团菌效应蛋白LepB提供底物,进而参与到LCV表面磷脂酰肌醇-4-磷酸的生物合成过程中。（4）通过GST Pull-down和表面等离子共振技术,我们确证了MavQ可以与军团菌具有磷脂酰肌醇磷酸酶活性的效应蛋白SidP结合互作,但是,SidP在体外和体内都不影响MavQ的激酶活性,并且sidP的缺失也不影响LCV表面磷脂酰肌醇-4-磷酸的生物合成过程。本研究阐明了未知功能的军团菌效应蛋白MavQ的生化及生物学功能,并证明LCV表面磷脂酰肌醇-4-磷酸的生物合成的上游机制,为更好的了解和认识嗜肺军团菌致病的分子机制提供了支持,也更进一步为嗜肺军团感染的治疗和预防提供理论基础。
王蕾[3]（2021）在《基于化学蛋白质组学的胞内病原体致病机制及防治策略的探索》文中认为我们所处的环境中充斥着各种各样的病原微生物,它们在适当的条件下能够识别并侵入到宿主的体内,引起感染性疾病,严重威胁着人类的健康。虽然抗生素、干扰素的应用能够有效控制多数的病原体引起的感染,但该方法的局限性和耐药性的弊端也已经日益显现。因此阐明病原体的致病机制及防控成为微生物学和免疫学领域的核心和前沿问题之一,也将为研发新药、推出适宜的应对策略提供理论基础。接下来我们将会从胞内病原菌和病毒两个方面展开描述。在第2章向大家介绍了运用化学蛋白质组学技术鉴定沙门氏菌的新型SPI-2T3SS效应蛋白。在本研究中,我们以沙门氏菌作为底盘细胞,在其基因组中插入突变型的大肠杆菌苯丙氨酸t RNA合成酶基因。突变型的苯丙氨酰t RNA合成酶是对野生型苯丙氨酸t RNA合成酶的294位氨基酸位点进行点突变,该处氨基酸由原来的丙氨酸突变为甘氨酸（A294G）。该突变型丙氨酸t RNA合成酶可以特异性的识别非天然氨基酸,进而对细菌的新生蛋白进行标记。本研究构建了稳定型的非天然氨基酸嵌入系统,解决了前人研究中遇到的质粒容易丢失、嵌入效果不稳定等问题。实现在沙门氏菌侵染宿主细胞模型中,对宿主细胞内的沙门氏菌新生蛋白质组进行非天然氨基酸标记的目的;然后通过点击化学反应对被标记的宿主细胞内沙门氏菌新生蛋白质进行高效富集和高灵敏度鉴定。通过与细胞外沙门氏菌的新生蛋白质组进行比较分析,结合已有的转录组数据进行比对,从中鉴定出候选效应蛋白。该研究方法实现了在沙门氏菌感染宿主细胞的互作模型中,对沙门氏菌在不同感染时期的新生蛋白质组进行化学标记及定量分析,从而获得了胞内病原菌的蛋白质组时空动力学图谱,揭示了沙门氏菌在不同侵染时期分泌的效应蛋白的种类。本研究的意义在于建立了胞内病原菌新型效应蛋白的化学蛋白质组学鉴定方法,为进一步揭示沙门氏菌的感染机制及其与宿主细胞间的相互作用奠定了基础,对现有病原菌与宿主细胞相互作用的谱图进行补充。在第3章我们筛选了新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂,并且验证Biotin-VAD-FMK是新型冠状病毒的活性分子探针。由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的不明肺炎疫情大流行,已发展成为现代历史上最严重的公共卫生健康危机之一,SARS-CoV-2对全球公共卫生和经济造成了非常严重的影响,迄今为止感染病毒的患者人数已逾1.29亿,超过282万人死亡。目前还未批准针对SARS-CoV-2的特效药,为了有效的抑制疫情的进一步扩大,我们以在病毒复制及感染过程中必不可少的主蛋白酶作为研究靶标。本研究通过将人工智能模型和湿实验相结合,构建一个互相反馈的闭环,通过多次循环逐渐提高用模型进行预测的准确率。利用该模型从生物活性分子库中筛选出可能的抑制剂,经过两轮酶学实验验证,确定了六种新型抑制剂以及一种针对SARS-CoV-2 Mpro的活性分子探针,结合基于活性的蛋白质组技术,用于筛选SARS-CoV-2主蛋白酶的活性分子探针及抑制剂,旨在寻找控制新型肺炎疫情的化合物,推动抗冠状病毒感染的药物研发进程。
吕军苹[4]（2021）在《中药马齿苋对小鼠沙门氏菌感染的保护作用及外泌体介导的机制研究》文中认为[背景]胞内菌感染给临床抗感染治疗带来严峻挑战。这些胞内感染菌进入人体后,能以不同方式逃避机体免疫防御和清除的一系列机制,在细胞内生存、繁殖,并可在动物和人群中传播,在适当时机如当机体免疫力减弱时,便出现临床发病,严重时可危及生命。沙门氏菌是生活中最常见的胞内菌之一,据统计,在世界各国的细菌性食物中毒病因中,沙门氏菌常列榜首。因其易扩散和耐药性,给防控和治疗带来严重困难。抗生素在抗菌方面有很好的疗效,但中药因其多成分多靶点的特点,同时具有抗炎、抗氧化、调节免疫等功能,且不易产生抗药性,使其在抗菌方面尤其是抗胞内菌具有得天独厚的优势,可作为胞内菌治疗或辅助治疗的新药来源。[目的]本课题通过中药马齿苋对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的保护实验,研究其对鼠伤寒沙门氏菌的治疗作用,并以小鼠血浆外泌体为研究对象,探究感染进程中小鼠外泌体中蛋白质种类及数量的变化以及马齿苋的治疗作用及作用机制。[方法]本课题首先利用了体外抗菌实验,筛选了不同部位马齿苋（茎、叶、全草）及不同提取方法（水回流提取、乙醇回流提取、乙醇超声冷浸）的体外抗菌活性。然后建立了鼠伤寒沙门氏菌感染模型,以鼠伤寒感染小鼠模型为研究对象,选取普通级雌性balb/c小鼠70只,按照体重分层随机分为空白组、1×105 CFU/mL 模型组、1×106CFU/mL 模型组、1×107 CFU/mL 模型组、马齿苋给药组,每组10只。将菌液梯度稀释至1×105 CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107 CFU/mL。造模前禁食12 h,模型组与给药组每只灌胃相应浓度菌液200μL,空白组灌胃等量PBS。给药组每只鼠给予0.15 g/20g小鼠体重的马齿苋水提物,连续给药7天,模型组给予等量无菌水。给药结束后继续观察一周。统计小鼠生长状态、体重变化及生存率。分别统计每组小鼠死亡时间、死亡率、小鼠生长情况,采用苏木素-伊红（HE）联合染色法对脾脏组织病理切片染色,观察脾脏病理学变化以及马齿苋对脾脏的保护作用。选取1×106 CFU/mL模型组及给药组重复实验,在实验第7天及第15天取小鼠血浆提取外泌体,利用蛋白质组学技术对外泌体中蛋白质组进行分析。并应用生物信息学技术分析模型组及给药组中差异蛋白及GO功能、KEGG富集情况。[结果]1.马齿苋提取物对鼠伤寒沙门氏菌的体外生长影响在体外实验中,在前6小时马齿苋提取物对鼠伤寒沙门氏菌的生长没有明显影响,在6-8小时后不同提取方法（水加热回流提取、乙醇加热回流提取、乙醇超声冷浸）、不同部位（叶、茎、全草）及不同浓度（40 mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL）马齿苋提取物对鼠伤寒沙门氏菌的生长均有不同程度的促进作用。因此马齿苋提取物在本研究中药物浓度范围内对鼠伤寒沙门氏菌的生长没有抑制作用。2.马齿苋对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的保护作用马齿苋提取物可以有效延长鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的存活时间、提高生存率;明显改善造模引发的脾组织淤血和出血现象,促使小鼠脾脏淋巴细胞增多。3.外泌体介导的中药马齿苋对胞内菌感染的机制研究蛋白质组学分析显示,鼠伤寒沙门氏菌感染进程中,第7天与第15天的小鼠的血浆外泌体中LBP、CD14、STAT1等蛋白持续上调。马齿苋治疗组第7天、15天的小鼠血浆外泌体中LBP、CD14、STAT1的表达水平显着下降。[结论]马齿苋水提物可以延长鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的生存时间,提高生存率;对鼠伤寒沙门氏菌引起的小鼠脾脏的病理变化有保护作用。马齿苋可以通过降低的小鼠血浆外泌体中LBP、CD14、STAT1蛋白的表达水平,从而影响靶器官或靶细胞的TLR4信号通路和JAK-STAT信号通路,抑制机体持续的过激的免疫反应来起到保护作用。
崔佳[5]（2020）在《ASAP1介导巨噬细胞和中性粒细胞迁移参与宿主抗结核分枝杆菌感染的研究》文中提出结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）是引起人畜重大慢性传染性疾病-结核病（Tuberculosis,TB）的单一病原菌。研究表明,宿主本身遗传特质影响结核病易感性,在俄罗斯人群和中国人群中全基因组关联分析（Genome Wide Association Study,GWAS）表明ASAP1（Arf GAP with SH3 domain,ankyrin repeat and PH domain 1）多态性与结核病易感性显着相关,然而ASAP1如何影响结核病易感性还未有报道。本文从反式遗传学的角度在斑马鱼模型和巨噬细胞系THP1和Raw264.7中敲除或敲低ASAP1后分析宿主对于结核病易感性的变化,并进一步从吞噬细胞生理功能的角度探究了ASAP1影响宿主对结核病易感性的机制。主要研究结果如下:1.asap1基因敲除斑马鱼模型的构建斑马鱼现已成为研究结核病的常见模式生物。本项目首先利用生物信息学分析了斑马鱼asap1a和asap1b基因,将斑马鱼asap1a和asap1b与人类ASAP1、小鼠的Asap1进行了染色体基因位点连锁性分析,并对斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白与人类、小鼠和大鼠的ASAP1蛋白进行了多重序列比对,通过进化树分析确定了斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白的进化位置。q RT-PCR方法检测发现斑马鱼asap1a和asap1b基因均系母性遗传控制,原位杂交显示两基因在斑马鱼体内通体表达,无组织特异性。应用基因编辑CRISPR/Cas9技术建立asap1a和asap1b基因敲除的斑马鱼,得到asap1a敲除突变斑马鱼3个品系,得到asap1b敲除突变斑马鱼3个品系,得到asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼1个品系,得到asap1a和asap1b双敲除突变且中性粒细胞荧光标记的斑马鱼1个品系。通过存活率分析发现,asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼在1-3天胚胎期死亡率明显增高,而asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼则无明显死亡率下降现象。通过q RT-PCR检测发现,asap1a单敲除突变斑马鱼中asap1b基因的表达量升高,在asap1b单敲除突变斑马鱼中未见asap1a基因的表达量有补偿性升高。另外,应用morpholino对斑马鱼asap1a和asap1b基因进行敲低,q RT-PCR和western blotting证实两基因共敲低。第一部分结果表明通过morpholino和基因编辑的手段在斑马鱼中成功建立了asap1a和asap1b敲低或敲除的突变体。2.应用斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型探讨Asap1影响巨噬细胞和中性粒细胞迁移能力进而影响宿主对结核病易感性关系海鱼分枝杆菌（Mycobacterium marinum,Mm）与结核分枝杆菌具有高度的同源性,是引起斑马鱼结核病的病原菌。斑马鱼的发育早期通体透明,能够通过应用荧光蛋白表达示踪细胞行为,所以在研究固有免疫相关吞噬细胞如巨噬细胞（macrophage,MΦ）和中性粒细胞（neutrophil）方面具有独特的可视化优势。本章首先在斑马鱼模型上系统研究Asap1对海鱼分枝杆菌易感性的影响,发现asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼对海鱼分枝杆菌易感性与野生型相比无明显的差异性,但asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼较野生型斑马鱼对海鱼分枝杆菌的感染能力增强。此结论与用morpholino敲低的asap1a和asap1b斑马鱼研究结果一致。在asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼中我们还发现,无论是尾部创口还是海鱼分枝杆菌感染后的定向趋化,巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力较之于野生型斑马鱼明显减弱。3.利用人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7研究ASAP1与结核分枝杆菌易感性的关系通过在人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7中建立敲低ASAP1的细胞模型,并经q RT-PCR与western blotting验证敲低效率。其次在THP1和Raw264.7中发现敲低ASAP1的细胞较野生型细胞感染结核分枝杆菌的能力增强。Transwell实验表明敲低ASAP1引起了THP1和Raw264.7细胞对于结核分枝杆菌的迁移能力减慢,进一步验证了在斑马鱼中得到的Asap1可能影响结核病易感性的机制结论。在细胞模型中,我们还进一步探究了敲低ASAP1后细胞骨架发生的重塑现象,其中actin puncta数量明显增加,并且相应的黏着斑蛋白Vinculin与桩蛋白Paxillin的聚合状态也发生了改变,这些都为解释ASAP1影响宿主抗结核分枝杆菌的机制提供了可能性。综合发现,降低ASAP1表达水平增强了宿主对于结核分枝杆菌的感染程度,并且影响了巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力,推测这可能是ASAP1影响宿主结核病易感性的生物学机制。此课题的实施和完成将丰富宿主遗传基因影响结核病易感性的认识,对结核病的预防、早前筛查或培育抗结核病家畜具有一定科学意义和应用价值。
胡治强[6]（2020）在《类鼻疽菌逃逸宿主囊泡转运的机制研究》文中认为类鼻疽（Melioidosis）是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌）引起的一种新发的、正在扩散的人兽共患传染病。该疾病可通过消化道、呼吸道或经破损表皮传播,主要引起肺炎、肺部多发性脓肿,还可造成肝脏、脾脏等多脏器脓肿,如不及时治疗,可发展为急性败血症,危及生命。鉴于类鼻疽临床症状多样极易误诊、致死率高且潜伏期长,目前尚无有效疫苗,美国CDC已将类鼻疽菌提升为B类生物战剂严加防范。类鼻疽主要流行区域集中在热带和亚热带地区,包括东南亚、澳大利亚北部以及我国海南、香港、台湾等南海主要战略地带,严重威胁人类健康和公共卫生安全,因此深入研究类鼻疽菌的感染机制及致病机理,发展新的有效的防治策略迫在眉睫。天然免疫系统是机体抵御病原微生物侵袭的第一道防线。专业性吞噬细胞（如巨噬细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞等）作为天然免疫系统重要组成部分,能够通过吞噬作用吞噬病原菌形成吞噬体囊泡,随后吞噬体囊泡逐渐成熟酸化,并转运至溶酶体与其融合形成吞噬溶酶体,以杀灭降解病原菌。而作为一种兼性胞内寄生病原菌,类鼻疽菌为了实现在宿主细胞内的生存、感染和致病的目的,有效逃逸宿主细胞免疫清除也就成为类鼻疽菌与宿主之间生存斗争的关键。深入研究类鼻疽菌胞内感染机制揭示其致病机理,对于发展新的有效的类鼻疽防治具有十分重要的理论指导意义。类鼻疽菌侵入宿主细胞后,可以形成不与溶酶体融合的吞噬体,称为含类鼻疽菌囊泡（B.pseudomallei-containing vacuole,BCV）,来逃避吞噬体-溶酶体降解途径,但其如何适应内部环境并操纵吞噬体转运过程仍不清楚。Rab蛋白被称为细胞内膜泡运输的关键调节因子,许多研究表明Rab蛋白参与了吞噬体的形成和成熟。因此,为了确定类鼻疽菌吞噬体在与囊泡运输通路的相互作用,本论文在类鼻疽菌感染过程中,初步对参与吞噬体转运的19种Rab蛋白进行定位和表达研究。发现类鼻疽菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞后Rab32表达上调并募集到BCV上,并且Rab32阳性BCV与多种晚期内体标记（Rab7、LAMP1和LAMP2）共定位,提示其具有晚期内体特性。进一步沉默Rab32后,类鼻疽菌与晚期内体标记定位减少,吞噬体逃逸增加,胞内细菌载量增多。同时在细胞中分别过表达Rab32不同活性突变型,发现过表达Rab32-WT和Rab32-Q83L能明显促进BCV的酸化及与组织蛋白酶CTSD的定位和成熟,从而限制细胞内类鼻疽菌的增殖。说明Rab32能够促进BCV与溶酶体融合使类鼻疽菌胞内生存受限。MicroRNA（mi RNA）是一类长度约20-25个核苷酸的小分子非编码RNA分子,结合于靶基因3’端非翻译区（UTR）,具有转录后调控基因表达和翻译的功能。进一步,为了从miRNA调控感染免疫的角度探讨类鼻疽菌感染巨噬细胞后Rab32表达上调的分子机制,利用miRNA表达谱芯片分析了类鼻疽菌感染后miRNA表达谱发生的变化,发现在显着下调miRNAs中miR-30家族的成员被预测靶向Rab32 mRNA的3’UTR。通过qRT-PCR方法发现只有miR-30b和mi R-30c的下调对于类鼻疽菌的感染是特异性的。并且miR-30b和mi R-30c以Rab32为靶基因影响Rab32的表达及募集到BCV表面,从而调控BCV与溶酶体融合过程。近年来对于病原菌效应蛋白在病原-宿主相互作用过程中的调控机制研究一直是病原微生物感染免疫研究领域的热点和难点。与许多革兰氏阴性病原菌一样,类鼻疽菌借助其自身的Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system,T3SS）将特异性效应蛋白注入宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路,从而促进其在细胞内的感染和定植。尤其是第三套Ⅲ型分泌系统（T3SS-3）效应蛋白在介导类鼻疽菌从吞噬体囊泡逃逸,避免被转运至溶酶体降解过程中至关重要。因此,为了进一步明确类鼻疽菌T3SS-3调控吞噬体囊泡转运的关键效应蛋白,我们针对目前推定的类鼻疽菌T3SS-3分泌的所有效应蛋白BopA、BopC、BopE、BapA和BapC使用同源重组的方法分别构建缺失突变株,并以之感染小鼠巨噬细胞RAW264.7观察胞内吞噬体囊泡逃逸情况以及胞内运动和增殖能力。筛选到有一个可能参与调控类鼻疽吞噬体转运的效应蛋白BapC。研究发现ΔbapC突变株在吞噬体中的逃逸延迟,通过充分利用相互作用蛋白质组学找到了BapC与宿主细胞骨架微管蛋白相互作用,不过并没有观察到BapC与微管蛋白在细胞内具有共定位,而是定位到细胞核中。进一步发现BapC缺失后类鼻疽菌在巨噬细胞和小鼠感染模型中的增殖受限,并导致宿主产生剧烈的炎症反应及各脏器损害。以上结果提示BapC可能在类鼻疽菌感染过程中扮演重要角色,综上所述,本论文以类鼻疽菌如何干扰宿主吞噬体转运,实现逃避胞内免疫清除作为研究出发点,重点围绕类鼻疽菌吞噬体在胞内的转运调控过程以及筛选T3SS-3调控吞噬体囊泡转运的关键效应蛋白。发现类鼻疽菌感染巨噬细胞过程中,miR-30b/30c表达下调,诱导Rab32表达上调。随后,在感染的早期阶段Rab32招募到类鼻疽菌吞噬体上,并有效促进BCV与溶酶体的融合,导致吞噬体酸化,激活CTSD的成熟,增强巨噬细胞对类鼻疽菌的杀伤和降解。同时类鼻疽菌T3SS-3效应蛋白BapC,能够协助类鼻疽菌逃离吞噬体,并能依赖微管蛋白入核,影响类鼻疽菌感染中宿主的免疫应答反应。这些研究发现有助于进一步理解类鼻疽菌与宿主相互作用机理,从而为预防和治疗类鼻疽菌感染提供重要的新思路和理论基础。
吕强华[7]（2020）在《丁香醛对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用及机制》文中研究指明沙门氏菌是在全球公共卫生学上具有重要意义的人兽共患病原菌之一。沙门氏菌感染给畜禽养殖业造成重大经济损失,同时造成食物中毒威胁人类生命健康。目前,治疗沙门氏菌感染的首选方法是使用抗生素,而随着沙门氏菌耐药性问题的日趋严重,给沙门氏菌病的防控带来严峻挑战。如何有效的对抗沙门氏菌感染已成为世界各国共同关注的问题,以抗细菌毒力为代表的抗生素替代策略引起人类广泛关注。研究证实,在感染过程中沙门氏菌主要依赖于其毒力岛（SPI）介导的Ⅲ型分泌系统（T3SS）发挥致病作用,而SPI1-1的某些关键基因或效应蛋白缺失后感染宿主的能力显着降低甚至丧失。因此,沙门氏菌T3SS成为抗感染药物研发的理想靶标。中药在我国的应用历史悠久,具有分布广、生物学活性多样、成本低、药残低和不易诱导耐药等诸多优势,为抗细菌毒力药物研发提供天然资源宝库。因此,自中药来源的天然化合物中进行抗细菌毒力药物的研发成为人们的首选。本研究通过构建沙门氏菌SipA/SipB-TEM-β-内酰胺酶融合报告菌株,以沙门氏菌T3SS效应蛋白的转运功能为表型进行天然化合物来源抑制剂筛选。通过大量筛选和鉴定,发现丁香醛、杨梅素和丹皮酚等在无抗菌活性浓度内有效抑制沙门氏菌T3SS效应蛋白的转运,后续选择活性最强的丁香醛进行研究。体外药物活性评价发现,丁香醛显着抑制沙门氏菌入侵宿主细胞和显着降低其介导的宿主细胞损伤。通过生物化学、分子生物学和高通量测序转录组学等研究方法进行作用机制研究,发现经丁香醛处理后,T3SS入侵效应蛋白和调节蛋白表达显着下调;高通量测序转录组学发现经丁香醛处理后沙门氏菌多个差异性表达基因mRNA转录水平均显着下调;继续追踪T3SS调控网络中多个关键毒力基因进行实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析,表明丁香醛通过抑制SPI-1中的hilD-hilC-rstA-hilA基因调控路径,降低下游效应蛋白（SipA,SipB和SipC）和调节蛋白（HilA）的表达,从而抑制沙门氏菌的致病力。沙门氏菌感染小鼠实验治疗学表明,丁香醛有效延长沙门氏菌感染小鼠的存活时间,并显着提高感染小鼠的存活率;病理组织学分析发现,丁香醛缓解鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的肝脏、脾脏和盲肠的病理性损伤;显着降低感染小鼠盲肠组织的细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ）含量。综上所述,本文从抑制剂的筛选、体内外药物活性评价和作用机制等三方面进行系统分析,发现丁香醛具有良好的体外药物活性和体内保护效果,并初步阐明其抑制沙门氏菌T3SS功能的作用机制,本研究将为抗沙门氏菌感染提供候选化合物。
崔朝辉[8]（2020）在《微小隐孢子虫与HCT-8细胞互作蛋白质组学及相关蛋白生物学功能研究》文中研究表明微小隐孢子虫是一种重要的人兽共患肠道寄生原虫,宿主范围广泛,是世界范围内导致人和动物腹泻性疾病的主要病原之一。由微小隐孢子虫引起的隐孢子虫病通常以自限性为特征,但对于免疫低下的人群则可发展为慢性和致死性的腹泻。目前,关于微小隐孢子虫与宿主细胞相互作用的分子机制以及涉及疾病病理过程的机制尚不清楚。因此,本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学的方法,分别对微小隐孢子虫与HCT-8细胞相互作用过程中的分泌蛋白及HCT-8细胞膜蛋白进行定量和生物信息学分析。根据组学分析结果,筛选出3个入侵相关基因进行重组表达,并探究了其在微小隐孢子虫入侵HCT-8细胞过程中相关生物学功能,以期为研究隐孢子虫入侵宿主细胞机制和抗隐孢子虫疫苗的筛选奠定理论基础。（1）C.parvum卵囊纯化与子孢子制备。隐孢子虫脱囊释放子孢子被认为是衡量卵囊活力和感染性的重要指标,从卵囊中分离纯化出子孢子也是隐孢子虫体外研究中的基础和关键环节。本研究采用单密度蔗糖离心法和氯化铯（Cs Cl）法相结合对传代卵囊进行纯化,共得到了7.2×1010个卵囊。通过对比4种实验室常用的卵囊脱囊方法,最终确定了方法4为最佳卵囊体外脱囊释放子孢子的方案。利用Percoll密度梯度离心法对C.parvum子孢子进行纯化,纯化得到的子孢子纯净单一。基于PCR和Time-course方法,确定了C.parvum子孢子在感染HCT-8细胞0-3 h时处于滑行运动状态,而在3.5-6 h时处于粘附/入侵状态。（2）C.parvum感染HCT-8细胞分泌蛋白组学研究。C.parvum子孢子在宿主细胞表面进行滑行运动期间,会分泌一些蛋白帮助其粘附/入侵宿主细胞。目前,关于隐孢子虫子孢子粘附/入侵宿主细胞过程中的分泌蛋白组成并不完全清楚。本研究在对C.parvum子孢子感染HCT-8细胞过程中分泌蛋白组进行解析的同时,运用TMT标记定量蛋白质组学技术,对隐孢子虫子孢子滑行运动状态时（3 hpi）和粘附/入侵HCT-8状态时（6 hpi）的分泌蛋白组进行比较及生物信息学分析。鉴定到了一些可能在虫体与宿主细胞互作过程中的重要分子,为C.parvum入侵关键功能基因的筛选及入侵机制的研究提供了基础数据。对C.parvum差异表达分泌蛋白功能进行了生物信息学分析发现,C.parvum含CAP结构域蛋白在子孢子处于滑行运动时表达量较高,对这些蛋白结构和功能的进一步研究可能为开发抗隐孢子虫病药物靶标和疫苗筛选提供新的思路。（3）C.parvum感染HCT-8细胞膜蛋白组学研究。隐孢子虫在入侵宿主细胞过程中,与细胞膜上一系列受体蛋白相结合,进而引起细胞膜表面受体蛋白以及介导信号通路相关蛋白发生变化来发挥相关生物学功能。目前,还未有关于C.parvum感染HCT-8细胞膜蛋白组学的相关研究的报道。本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学方法,对微小隐孢子虫感染和未感染HCT-8细胞膜蛋白质组进行比较分析,以1.5倍为差异表达变化的阈值,共鉴定到714个差异表达蛋白,其中上调蛋白625个,下调蛋白116个。通过对差异表达蛋白以及部分膜蛋白进行功能分析发现,C.parvum的感染主要参与了对HCT-8细胞屏障功能的破坏,以及引起宿主细胞骨架蛋白的改变;整合素（integrins）可能作为受体蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中具有重要作用。相关HCT-8细胞膜蛋白的鉴定与功能分析,为C.parvum与宿主细胞互作机制相关研究奠定了理论基础。（4）Cp Trap/Cp Crisp/Cp Carp蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能研究。本研究通过对C.parvum含CAP结构域蛋白进行功能分析,并对Cp Crisp、Cp Carp以及含TSP结构域的Cp Trap等三个蛋白进行了原核表达和多克隆抗体制备。从基因表达模式、内生发育阶段蛋白定位及体外中和特性等方面探究了Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能。q RT-PCR结果显示,Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp在检测时间过程中（0-72 h）均有表达,且在72 hpi时达到最大值。免疫荧光结果显示,Cp Trap蛋白定位在卵囊腔内和子孢子膜表面;Cp Crisp蛋白定位在卵囊腔内、子孢子中后部及裂殖子胞质中,而Cp Carp则定位在卵囊腔内,子孢子和裂殖子胞质中。与对照组相比,抗Cp Trap/Cp Crisp/Cpcarp多克隆抗体分别对C.parvum入侵HCT-8细胞都具有一定的阻断作用。综上所述,本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学方法,对C.parvum与HCT-8细胞互作过程中的分泌蛋白组和HCT-8细胞膜蛋白组进行鉴定和定量分析。通过对差异表达蛋白的生物信息学分析,为C.parvum入侵关键功能基因的筛选及研究C.parvum与宿主细胞互作机制奠定理论基础。此外,对Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp三个蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能进行了探究,并证实其可作为抗隐孢子虫疫苗的候选靶标。
郭珍珍[9]（2020）在《TGEV持续感染增强粪肠球菌对IPEC-J2细胞的侵袭能力》文中提出传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）是一种导致以腹泻和高发病率为临床特征的冠状病毒,TGEV可引起小于2周龄的仔猪严重腹泻和脱水,其死亡率高达100%。所有年龄段的猪都易受TGEV感染,5周龄以上的猪往往能存活下来,但易造成预后不良,而且病毒在感染后的长达104天后仍能在肺或肠中检测到,造成TGEV持续性感染。持续性病毒感染能引起细胞发生EMT现象,导致继发感染其他病原体,例如猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）、大肠杆菌和链球菌等,但尚未有TGEV继发感染粪肠球菌（E.faecalis）的报道。肠球菌是广泛存在于乳制品、发酵食品、自然环境（即植物、土壤和水体）以及人类、其他哺乳动物、爬行动物和昆虫的胃肠道中的生物,其中粪肠球菌作为机会性病原体引发较多的感染是尿路感染和菌血症。由于所有肠道病毒都会遇到肠腔内常驻密集微生物群,因此共生细菌和肠道病毒之间可能存在大量相互作用,从而可能对该部位的病毒感染产生有益或抑制作用;相反,病毒感染也可能对细菌的感染性有影响。TGEV持续感染造成肠道损伤引发腹泻,而作为机会致病菌的粪肠球菌是引发炎症性肠病的主要菌群,因此本研究旨在应用体外试验,探索同在胃肠道中存在的TGEV和粪肠球菌之间的相互作用及其机制,主要研究内容与结果如下。首先,为了在试验中对TGEV的含量进行有效监测,建立TGEV荧光实时定量PCR检测方法,该方法根据TGEV N基因设计一条长约171bp的特异引物,通过构建标准质粒,质粒浓度为8.2×1010 copies/μL。然后对实时定量PCR反应程序进行优化,包括引物浓度、引物体积和退火温度的优化,绘制标准曲线,然后利用不同浓度的标准质粒对TGEV实时定量PCR检测方法的特异性、重复性及敏感性进行评估,结果表明TGEV与PCV2、PEDV、PRRSV无交叉反应,说明该方法具有很好的特异性;此方法能检测到的最低质粒浓度为8.2×10copies/μL,高于普通PCR10倍,说明具有良好的灵敏性。该荧光定量PCR检测方法的建立对临床样品的TGEV快速检测具有很大意义。上皮细胞向运动性间充质细胞转分化这一过程被称为上皮-间充质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）,为了研究TGEV持续性感染是否可以引发IPEC-J2肠上皮细胞发生EMT,本研究以TGEV细胞感染复数比（Multiplicity of Infection,MOI）=0.1、1和10持续感染IPEC-J2细胞,并以TGF-β为阳性对照,发现TGEV在MOI=10持续感染的第五代细胞中,部分细胞由鹅卵石形态转变为细长型细胞,细胞的一些关键特性发生改变。同时通过RT-PCR和Western Blot方法在转录和蛋白表达两种水平上分析TGEV感染细胞后EMT标志物的变化,分析发现TGEV显着下调了上皮标志物E-cadherin,显着上调间充质标志物 N-cadherin、Vimentin、Smad2、Snaill、Twist 及β-Catenin 的表达。为了进一步验证持续性TGEV对细胞结构的影响,本研究采用鬼笔环肽染色检查F-actin表达情况,结果表明TGEV诱导F-actin表达增加,且使F-actin聚合成束状。为了更直观地看到发生EMT后上皮细胞运动性侵袭迁移情况,本研究又进行了划痕实验和Transwell迁移侵袭实验,结果发现很多感染TGEV的细胞在发生EMT后,细胞运动侵袭性显着增强（P<0.05）,能通过8μm的孔屏障迁移至下室,而正常细胞很少能通过8μm的孔屏障,分别从平面和立体层次证明了 TGEV感染诱导细胞运动性和侵袭性增加。促炎因子对EMT的发生具有促进作用,本研究通过荧光定量PCR探究TGEV持续感染对促炎因子的影响,结果炎性因子IL-12、IL-1β、TGF-β、IL-6的转录水平趋势相似,均被TGEV显着上调,TGEV感染诱导IL-6转录水平提高了 1.6倍、IL-12提高了 2倍、IL-1β提高4倍以及TGF-β提高了 1.3倍。综合以上实验结果,证明TGEV持续感染能引起IPEC-J2细胞发生EMT。临床上TGEV感染可促进多种病原菌的继发感染,为了研究TGEV能否促进粪肠球菌的感染,本研究首先进行了粪肠球菌对持续性感染TGEV的上皮细胞的黏附侵入试验,在黏附试验中,粪肠球菌以MOI为10、50、100感染细胞,在感染6h时,TGEV对粪肠球菌的黏附有明显的促进作用,与未发生EMT细胞相比黏附数量增加了约2～3倍,在侵入试验中入侵数量较未发生EMT细胞增加了约1～2倍。为了更形象观察粪肠球菌对IPEC-J2细胞的黏附,本研究通过间接免疫荧光和场扫描电镜对粪肠球菌黏附IPEC-J2细胞的表观状态进行观察,结果发现TGEV促进粪肠球菌对IPEC-J2细胞的黏附,趋势与黏附试验结果一致,且粪肠球菌在细胞表面并非均匀分布,而是呈聚集状态分布。为了研究粪肠球菌感染发生EMT细胞后细胞因子的变化,本研究通过荧光定量PCR测定了猪肠上皮细胞系的细胞因子的变化,发现IFN-y、IL-6、IL-1β和TGF-β存在较为相似的炎症反应规律,共感染组炎性因子的转录水平低于TGEV组。IFN-γ和IL-β具有抗病毒作用,粪肠球菌感染下调其转录水平,从而促进TGEV感染;IL-6在持续炎症期间能抑制细胞凋亡,共感染组转录水平较低这一现象与粪肠球菌感染后损伤细胞有关;对于趋化因子CCL5而言,具有招募淋巴细胞的能力,所以粪肠球菌和TGEV感染均能上调其转录水平,但二者共感染使其转录水平降低,可能是由于免疫力下降促进二者感染;另外TNF-α主要由粪肠球菌诱导产生,能显着上调TNF-α的转录水平继而损伤细胞,促进病毒感染。这一现象证明TGEV与粪肠球菌的确存在相互作用,TGEV促进粪肠球菌的黏附入侵,而粪肠球菌感染引发的炎症反应又有利于病毒的感染。病毒促进病原菌感染有多种机制,为了初步探索在IPEC-J2细胞发生EMT后,粪肠球菌侵袭性增强的机制,本研究首先经场发射扫描电镜观察粪肠球菌的入胞方式,由图片分析得出粪肠球菌通过Zipper机制进行内化。然后经Western Blot分析粪肠球菌受体表达的变化,发现TGEV感染诱导粪肠球菌受体纤连蛋白（FN）和整联蛋白-α5表达增加,进一步证实粪肠球菌通过Zipper机制进行入侵。另外通过间接免疫荧光和细菌迁移实验评估TGEV细胞间隙的变化对粪肠球菌入侵的影响,间接免疫荧光结果发现TGEV诱导E-cadherin荧光信号减弱,N-cadherin信号增强,表明细胞之间连接被破坏,细胞通透性增强。同时细菌迁移实验结果表明TGEV感染显着促进粪肠球菌透过单层细胞穿越3μm孔径进入下室（P<0.05）,说明细胞间隙变大,促进细菌入侵宿主内部。通过RT-PCR和Western Blot方法在转录和蛋白水平上分析粪肠球菌对EMT标志物的影响,结果发现粪肠球菌不仅对已发生的EMT具有促进作用,而且以MOI=100的浓度单独感染IPEC-J2细胞6h时也能诱导细胞发生EMT。综上所述,TGEV持续感染IPEC-J2细胞诱导其发生EMT,致使细胞由上皮细胞转换为运动性侵袭性增强的间充质细胞;另外细胞在发生EMT后,促使粪肠球菌黏附和入侵数量显着增加;粪肠球菌可通过Zipper机制与细菌受体纤连蛋白结合,进而与膜蛋白整联蛋白-α5结合入侵细胞,也可通过变大的细胞间隙入侵宿主;另外粪肠球菌不仅对TGEV引起的EMT具有促进作用,而且其单独感染亦能诱导IPEC-J2细胞发生EMT,因此形成恶性循环造成机体损伤。
唐思慧[10]（2020）在《Rac1经IQGAP1和Ezrin通路调节TNF-α诱导的大鼠肺微血管内皮细胞高通透性》文中研究指明研究背景及目的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）由多种传染性和无菌性病因,例如肺炎,胃内容物吸入,败血症,急性肝衰竭和急性胰腺炎等直接或间接引起肺损伤的致命疾病,发生和发展过程复杂,发病机理尚未完全阐明。潜在的发病机制可能归因于中性粒细胞积聚和促炎性细胞因子作用于肺微血管内皮细胞（PMVECs）,导致细胞间连接的破坏（例如粘附连接）,微管激活和肌动蛋白细胞骨架重塑,细胞收缩并形成间隙,炎症破坏肺微血管屏障,大量蛋白质和液体进入肺间质和肺泡腔,发生临床上严重的低氧血症性呼吸衰竭。研究表明,单一的阻断炎症介质并未取得理想效果,探究ARDS过程中相关的信号通路,阻断炎症风暴发生,是目前关注的新热点。Rac1作为小G蛋白家族一员,在稳定肌动蛋白的细胞骨架和维持微血管屏障功能方面发挥重要作用。Rac1通过促进皮质区肌动蛋白纤维束的形成来调节细胞骨架,通过连接复合物的重塑来维持细胞间连接。有证据表明,抑制Rac1可显着增加静脉微血管通透性。膜-F-肌动蛋白连接蛋白Ezrin与支架蛋白IQGAP1共定位于膜下细胞骨架,是聚集不同信号复合物的枢纽。近几年人们也开始研究它们在内皮通透性方面作用,但炎症条件下,它们究竟对细胞屏障有何影响,尚未见报道。F-肌动蛋白介导的粘附连接,是维持内皮屏障的关键因素,皮质肌动蛋白结合蛋白（cortactin）通过增加自身其在细胞皮质中的分布,促进其与皮质肌动蛋白细胞骨架的结合,从而增强粘附和紧密连接,调节细胞骨架的动力学,参与内皮屏障功能的调节。TNF-α是ARDS在疾病早期阶段分泌的主要促炎细胞因子。它通过改变内皮细胞紧密连接的结构和F-肌动蛋白的分布来破坏内皮细胞屏障的功能完整性。*本实验系国家自然科学基金资助项目（No.81770081）本研究拟通过TNF-α刺激PMVEC,破坏细胞屏障,并分别抑制Rac1、IQGAP1、Ezrin表达,观察它们在TNF-α致伤大鼠PMVEC中的作用。方法1.体外分离、培养、鉴定、传代RPMVECs。2.取已提前铺好胶的transwell小室若干,按制定的实验方案,构建相应的体外RPMVECs单层细胞模型。按照制定的实验分组给予细胞不同的刺激,检测跨内皮细胞电阻（transendothelial electrical resistance,TEER）变化和异硫氰酸荧光素标记的白蛋白（FITC-BSA）的通透性变化。3.给予不同浓度或品种试剂刺激RPMVECs,倒置荧光显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin和cortactin的变化。4.通过western blot检测不同实验分组中Rac1、IQGAP1、Ezrin、cortactin水平改变。5.分别构建靶向Rac1、IQGAP1、Ezrin的载体质粒,并包装相应慢病毒感染RPMVECs,分别下调这三者的表达。6.分别检测下调Rac1、IQGAP1、Ezrin表达后,TEER、FITC-BSA及细胞骨架的变化。结果1.体外成功分离、培养RPMVECs（约10-14天）,经显微镜下细胞形态学、FITC-植物血凝素结合试验鉴定证实。2.通过CCK8实验发现,当TNF-α浓度为0、1、10和100 ng/m L时对PMVECs细胞活性无显着影响。测细胞通透性发现,TEER呈剂量依赖性（1-100 ng/m L）和时间依赖性（0-6 h）下降。TNF-α刺激2 h后的FITC-BSA通透率也随着TNF-α浓度升高而升高。3.原代RPMVECs感染慢病毒后,倒置荧光显微镜下48 h即可见绿色荧光蛋白（GFP）表达,72 h后GFP表达强度进一步增强。感染效率,即72 h末占初始值比例:Rac1-sh RNA 15±7%,IQGAP1-sh RNA 10±1.1%,Ezrin-sh RNA 35±3.16%,阴性对照组三种蛋白表达无显着变化。4.TNF-α（100 ng/m L）刺激PMVECs后,Rac1的活性（Rac1-GTP）以时间依赖性（0-2 h）方式显着降低,而Rac1总的表达水平却保持不变。Rac1下调,细胞的TEER降低至对照组的约57%,用TNF-α刺激2 h后,sh Rac1组细胞的TEER降至36%,而control-sh RNA组的TEER降至61%。相反,若给予8-O-Me-c AMP（200 mmo L/L）预孵育,TNF-α组的TEER增加至130%,在3 h末仍稍高于对照组。FITC-BSA渗透率也显示出相似的通透性变化。5.TNF-α作用于细胞,可见F-actin聚集,细胞外周cortactin的分布减少。无论是否暴露于TNF-α,Rac1表达受到抑制后,PMVEC细胞内均会出现高应力纤维、细胞表面的cortactin水平显着下降。经Rac1特异性激动剂O-Me-c AMP预处理的PMVECs可逆转TNF-α刺激带来的细胞骨架重排现象。6.100 ng/m L TNF-α刺激PMVECs后,IQGAP1的表达水平以时间依赖性方式降低（0-3 h）。下调IQGAP1,细胞的TEER降低至阴性对照组的78%。当TNF-α刺激2 h后,IQGAP1-sh RNA组（TNF-α+IQGAP1-sh RNA组）的TEER降至34%,而阴性对照组（TNF-α+control-sh RNA）的TEER降至66%。FITC-BSA渗透率也显示出相似的通透性变化。7.单独TNF-α或sh IQGAP1作用于细胞,F-actin聚集,细胞外周cortactin分布减少。而二者共处理,胞内高水平的应激纤维形成和细膜cortactin分布减少。Western Blot发现在sh IQGAP1转染的细胞中,细胞外周cortactin表达降低。而暴露于TNF-α,膜上的cortactin含量进一步降低。8.下调IQGAP1,细胞中Rac1-GTP的表达显着降低,TNF-α刺激2 h后,与对照组（control-sh RNA+TNF-α组）相比,在IQGAP1下调的细胞（sh IQGAP1+TNF-α组）中Rac1-GTP的减少更为明显。9.O-Me-c AMP处理sh IQGAP1转染的细胞,可逆转TNF-α诱导的TEER的增加和FITC-BSA渗透降低,减轻细胞骨架重塑和cortactin细胞内再分布10.接受TNF-α刺激后,细胞内活性Ezrin（p-Ezrin）呈时间依赖性增加,总的细胞内Ezrin的表达水平却保持不变。静息状态下,sh Ezrin组的TEER值较阴性对照组的值略低,下调Ezrin可以恢复TNF-α引起的TEER降低。而Rac1特异性抑制剂NSC23766则进一步降低TNF-α和sh Ezrin诱导的TEER降低。sh Ezrin可以抵抗TNF-α引起的FITC-BSA通透率升高,加入NSC23766后,FITC-BSA通透率再次升高。11.下调Ezrin能够显着降低TNF-α诱导RPMVECs中F-actin的聚合、应力纤维的形成及cortactin再分布,而NSC23766能抑制sh Ezrin对TNF-α致伤PMVEC细胞骨架的维护,细胞骨架再次被重塑。结论1.TNF-α在不影响细胞活力的情况下,可以引起PMVEC通透性增高。2.活性Rac1在维持细胞骨架,维护细胞通透性方面起重要作用。3.TNF-α刺激PMVECs,IQGAP1表达量减少,引起活性Rac1含量降低,F-actin及cortactin再分布,导致细胞高通透性。4.TNF-α刺激PMVECs,磷酸化Ezrin表达量增加,引起活性Rac1含量减少,F-actin及cortactin再分布,导致细胞高通透性。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 ABBREVIATIONS |
| 第一章 金黄色葡萄球菌内化奶牛乳腺上皮细胞并诱导异噬的研究进展(文献综述) |
| 1 奶牛乳腺炎 |
| 2 金黄色葡萄球菌 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌的生物学特性 |
| 2.2 金黄色葡萄球菌分泌的毒力因子 |
| 2.2.1 溶血素 |
| 2.2.2 白细胞毒素 |
| 2.2.3 酚可溶性调控蛋白 |
| 2.2.4 剥脱毒素 |
| 2.2.5 超抗原 |
| 2.3 金黄色葡萄球菌内化细胞 |
| 2.3.1 黏附 |
| 2.3.2 细胞骨架重排 |
| 3 细胞通过异噬清除内化的细菌 |
| 3.1 自噬的概念及分类 |
| 3.2 细菌逃避自噬系统的进化策略 |
| 3.3 异噬 |
| 3.4 异噬的研究方法 |
| 3.4.1 透射电镜分析自噬相关结构 |
| 3.4.2 Atg8/LC3 的检测与定量 |
| 3.4.3 SQSTM1/p62 及相关LC3 结合蛋白的周转分析 |
| 3.4.4 其他自噬相关标记检测 |
| 3.5 非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体 |
| 3.6 网格蛋白 |
| 4 S.aureus入侵相关信号通路 |
| 4.1 PI3K/Akt信号通路 |
| 4.2 JNK信号通路 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 S.aureus内化BMECs的转录组学和蛋白质组学分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 .细胞系 |
| 2.2 菌株 |
| 2.3 试剂与耗材 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 软件与数据库 |
| 2.6 BMECs的培养 |
| 2.7 S.aureus的培养与计数 |
| 2.8 S.aureus入侵BMECs |
| 2.8.1 胞内菌落计数法检测S.aureus侵入BMECs的数量 |
| 2.8.2 激光扫描共聚焦显微镜观察胞内S.aureus |
| 2.8.3 透射电镜观察胞内S.aureus |
| 2.9 S.aureus入侵BMECs的转录组学分析 |
| 2.9.1 RNA样品制备 |
| 2.9.2 转录组测序 |
| 2.9.3 生物信息学分析流程概括 |
| 2.9.4 RT-qPCR验证差异基因 |
| 2.10 S.aureus入侵BMECs的蛋白质组学再分析 |
| 2.10.1 蛋白质组再分析 |
| 2.10.2 差异蛋白的验证 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 S.aureus侵入BMECs |
| 3.1.1 胞内菌落计数法检测S.aureus侵入BMECs的数量 |
| 3.1.2 激光扫描共聚焦显微镜观察胞内S.aureus |
| 3.1.3 透射电镜观察S.aureus入侵BMECs |
| 3.2 转录组学分析 |
| 3.2.1 RNA质量检测 |
| 3.2.2 转录组数据的产出统计 |
| 3.2.3 S.aureus侵染BMECs2 h的转录组学分析 |
| 3.2.4 S.aureus侵染BMECs8 h转录组学分析 |
| 3.3 蛋白质组学再分析 |
| 3.3.1 比较蛋白质组的再分析 |
| 3.3.2 Western blot验证差异蛋白 |
| 4 讨论 |
| 第三章 Integrin和 ACTR2/3 介导S.aureus入侵BMECs |
| 1 引言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 .细胞系 |
| 2.2 菌株及质粒 |
| 2.3 试剂与耗材 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 软件与数据库 |
| 2.6 BMECs的培养 |
| 2.7 S.aureus的培养与计数 |
| 2.8 整合素(Integrin)介导S.aureus入侵BMECs |
| 2.8.1 整合素抑制剂(RGD)对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.8.2 ITGAⅤ转录后沉默对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.8.2.1 细胞转染干扰载体 ITGAV |
| 2.8.2.2 ITGAV 干扰载体的 m RNA 水平鉴定 |
| 2.8.2.3 胞内菌落计数法检测ITGAⅤ转录后沉默对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.9 S.aureus入侵对ACTR2和ACTR3 表达量的影响 |
| 2.9.1 RT-qPCR检测ACTR2和ACTR3的m RNA表达 |
| 2.9.2 Western blot检测ACTR2和ACTR3 的蛋白表达 |
| 2.10 ACTR2 转录后沉默对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.10.1 细胞转染干扰载体 ACTR2 |
| 2.10.2 ACTR2 干扰载体的m RNA水平鉴定 |
| 2.10.3 ACTR2 干扰载体的蛋白水平鉴定 |
| 2.10.4 胞内菌落计数法检测ACTR2 转录后沉默对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.11 ACTR3 转录后沉默对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.11.1 细胞转染干扰载体ACTR3 |
| 2.11.2 ACTR3 干扰载体的m RNA水平鉴定 |
| 2.11.3 ACTR3 干扰载体的蛋白水平鉴定 |
| 2.11.4 胞内菌落计数法检测ACTR3 转录后沉默对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 整合素(Integrin)介导S.aureus入侵BMECs |
| 3.1.1 整合素抑制剂(RGD)抑制S.aureus入侵BMECs |
| 3.1.2 ITGAⅤ转录后沉默抑制S.aureus入侵BMECs |
| 3.2 ACTR2和ACTR3 介导S.aureus入侵BMECs |
| 3.2.1 S.aureus入侵诱导ACTR2和ACTR3 表达量增多 |
| 3.2.2 ACTR2 转录后沉默抑制S.aureus入侵BMECs |
| 3.2.3 ACTR3 转录后沉默抑制S.aureus入侵BMECs |
| 4 讨论 |
| 第四章 CI-MPR和 Clathrin抵御S.aureus入侵并介导宿主细胞异噬 |
| 1 引言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 菌株及质粒 |
| 2.3 试剂与耗材 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 软件与数据库 |
| 2.6 BMECs的培养 |
| 2.7 S.aureus的培养与计数 |
| 2.8 CI-MPR对 S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.8.1 S.aureus入侵BMECs后 CI-MPR的表达量变化 |
| 2.8.2 CI-MPR转录后沉默对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.8.3 抗体封闭CI-MPR对 S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.8.4 CI-MPR激动剂(D-M6P)处理对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.9 Clathrin抑制剂(Pitstop2)处理对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.9.1 S.aureus入侵BMECs后 Clathrin的表达量变化 |
| 2.9.2 CCK8 检测Pitstop2对BMECs增殖的影响 |
| 2.9.3 胞内菌落计数法检测Pitstop2对S.aureus入侵BMECs的影响 |
| 2.10 免疫共沉淀检测CI-MPR与 Clathrin的相互作用 |
| 2.11 检测S.aureus入侵BMECs诱导的异噬 |
| 2.11.1 透射电镜观察自噬相关结构 |
| 2.11.2 MDC染色法检测自噬结构 |
| 2.11.3 Western blot检测自噬相关标记蛋白 |
| 2.11.4 免疫荧光染色法验证S.aureus与自噬小体共定位 |
| 2.11.5 HCQ处理对S.aureus入侵BMECs诱导的异噬的影响 |
| 2.12 CI-MPR在 S.aureus入侵BMECs诱导的异噬中的作用 |
| 2.12.1 免疫荧光染色法检测S.aureus与 CI-MPR共定位 |
| 2.12.2 CI-MPR转录后沉默对异噬的影响 |
| 2.12.3 CI-MPR激动剂(D-M6P)处理对异噬的影响 |
| 2.13 Clathrin在 S.aureus入侵BMECs诱导的异噬中的的作用 |
| 2.13.1 免疫荧光染色法检测S.aureus与 Clathrin共定位 |
| 2.13.2 MDC染色法检测Clathrin抑制剂(Pitstop2)处理对异噬的影响 |
| 2.13.3 Clathrin抑制剂(Pitstop2)处理对自噬相关蛋白表达量的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CI-MPR抵御S.aureus入侵BMECs |
| 3.1.1 S.aureus入侵BMECs诱导CI-MPR表达增多 |
| 3.1.2 CI-MPR转录后沉默促进S.aureus入侵BMECs |
| 3.1.3 抗体封闭CI-MPR导致胞内载菌量升高 |
| 3.1.4 D-M6P处理后BMECs胞内细菌数降低 |
| 3.2 Clathrin抵御S.aureus入侵BMECs |
| 3.2.1 S.aureus入侵BMECs诱导Clathrin表达增多 |
| 3.2.2 Clathrin特异性抑制剂(Pitstop2)处理后细胞载菌量升高 |
| 3.3 CI-MPR与 Clathrin具有相互作用关系 |
| 3.3.1 生物信息学预测CI-MPR和 Clathrin具有相互作用关系 |
| 3.3.2 免疫共沉淀验证CI-MPR与 Clathrin具有相互作用关系 |
| 3.4 S.aureus入侵BMECs诱导异噬 |
| 3.4.1 透射电镜观察发现异噬溶酶体结构 |
| 3.4.2 S.aureus入侵BMECs后 MDC染色增强 |
| 3.4.3 S.aureus入侵BMECs诱导自噬相关标记蛋白积累 |
| 3.4.4 S.aureus与 LC3在BMECs胞内共定位 |
| 3.4.5 HCQ 预处理导致自噬通量降低 |
| 3.5 CI-MPR介导异噬 |
| 3.5.1 CI-MPR与 S.aureus在胞内共定位 |
| 3.5.2 CI-MPR转录后沉默抑制异噬 |
| 3.5.3 CI-MPR激动剂D-M6P促进异噬 |
| 3.6 Clathrin介导异噬 |
| 3.6.1 Clathrin与 S.aureus在胞内共定位 |
| 3.6.2 网格蛋白抑制剂Pitstop2 处理细胞后异噬受阻 |
| 4 讨论 |
| 第五章 CI-MPR/PI3K/Akt偶联/JNK/c-Jun调控S.aureus诱导的宿主细胞异噬 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 菌株及质粒 |
| 2.3 试剂与耗材 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 软件与数据库 |
| 2.6 BMECs的培养 |
| 2.7 S.aureus的培养与计数 |
| 2.8 S.aureus入侵BMECs对 PI3K/Akt和 JNK信号通路的影响 |
| 2.9 CI-MPR对S.aureus入侵诱导的PI3K/AKT和 JNK/c-Jun通路的影响 |
| 2.9.1 CI-MPR转录后沉默对PI3K/AKT和 JNK/c-Jun通路的影响 |
| 2.9.2 D-M6P处理对PI3K/AKT和 JNK/c-Jun信号通路的影响 |
| 2.10 PI3K抑制剂(LY294002)处理对JNK/c-Jun通路的影响 |
| 2.10.1 CCK8 检测LY294002对BMECs增殖的影响 |
| 2.10.2 Western blot检测JNK信号通路 |
| 2.11 JNK抑制剂处理对PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 2.11.1 CCK8 检测SP600125对BMECs增殖的影响 |
| 2.11.2 Western blot检测PI3K/Akt信号通路活性 |
| 2.12 c-Jun对 CI-MPR基因表达的调控 |
| 2.12.1 生物信息学方法预测CI-MPR的转录因子 |
| 2.12.2 免疫荧光法检测S.aureus入侵后JNK的细胞内定位 |
| 2.12.3 S.aureus入侵后c-Jun和 CI-MPR的 m RNA和蛋白表达变化 |
| 2.13 JNK信号通路对CI-MPR表达的影响 |
| 2.13.1 SP600125 预处理,RT-qPCR检测c-Jun和 CI-MPR m RNA表达 |
| 2.13.2 SP600125 预处理,Western blot检测c-Jun和 CI-MPR蛋白表达 |
| 2.13.3 SP600125 预处理,免疫荧光染色法检测p-c-Jun的表达 |
| 2.14 JNK信号通路对异噬的影响 |
| 2.14.1 MDC法检测 |
| 2.14.2 Western blot检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 S.aureus入侵BMECs激活PI3K/Akt和 JNK/c-Jun信号通路 |
| 3.2 CI-MPR介导S.aureus入侵诱导的PI3K/AKT和 JNK/c-Jun通路激活 |
| 3.2.1 CI-MPR转录后沉默抑制S.aureus诱导的PI3K/AKT和 JNK/c-Jun通路激活 |
| 3.2.2 D-M6P激活PI3K/AKT和 JNK/c-Jun通路 |
| 3.3 PI3K抑制剂处理抑制JNK/c-Jun通路激活 |
| 3.3.1 PI3K抑制剂(LY294002)浓度选择 |
| 3.3.2 PI3K抑制剂(LY294002)处理抑制JNK信号通路激活 |
| 3.4 JNK抑制剂预处理不影响PI3K/Akt信号通路活性 |
| 3.5 c-Jun调控CI-MPR基因表达 |
| 3.5.1 生物信息学预测c-Jun是 CI-MPR基因的转录因子 |
| 3.5.2 JNK/c-Jun信号通路调控CI-MPR表达 |
| 3.6 JNK信号通路调控S.aureus诱导的异噬 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 嗜肺军团菌的研究进展 |
| 1.1 嗜肺军团菌概述 |
| 1.2 嗜肺军团菌的胞内生活史 |
| 1.3 嗜肺军团菌Dot/Icm Ⅳ型分泌系统(Type Ⅳ secretion system,T4SS) |
| 1.3.1 Dot/Icm Ⅳ型分泌系统的构成 |
| 1.3.2 通过Dot/Icm Ⅳ型系统分泌的效应因子 |
| 1.4 嗜肺军团菌的流行病学 |
| 1.4.1 嗜肺军团菌的流行病学特征 |
| 1.4.2 欧美地区嗜肺军团菌的流行概况 |
| 1.4.3 中国嗜肺军团菌的流行概况 |
| 1.5 嗜肺军团菌的致病性 |
| 1.5.1 主要致病机制 |
| 1.5.2 主要的致病物质 |
| 1.6 嗜肺军团菌的检测和防治 |
| 1.6.1 嗜肺军团的检测方法 |
| 1.6.2 嗜肺军团菌感染的防治 |
| 2 细胞内磷脂酰肌醇类物质代谢的功能 |
| 2.1 磷脂酰肌醇作为细胞膜的标志物 |
| 2.2 参与细胞自噬 |
| 2.3 参与胞吐作用 |
| 2.4 参与细胞内吞作用 |
| 2.5 参与上皮细胞极化 |
| 2.6 参与细胞增殖 |
| 2.7 参与细胞迁移 |
| 3 病原微生物对宿主细胞内磷脂酰肌醇类物质代谢的调节 |
| 3.1 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) |
| 3.2 肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium) |
| 3.3 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis) |
| 3.4 志贺氏菌(Shigella) |
| 3.5 耶尔森菌(Yersinia) |
| 3.6 土拉杆菌(Francisella) |
| 3.7 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila) |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 MavQ生化功能的研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要试剂的制备及保存 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 pSB157m-MavQ、pET28a-MavQ、pET28a-LepB-NTD重组载体的构建 |
| 1.2.2 酵母转化 |
| 1.2.3 酵母毒性检测 |
| 1.2.4 酵母中蛋白表达检测 |
| 1.2.5 定点突变 |
| 1.2.6 His标签蛋白表达纯化 |
| 1.2.7 GST标签蛋白表达纯化 |
| 1.2.8 体外激酶实验 |
| 1.2.10 数据处理及分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 MavQ的生物信息学分析 |
| 1.3.2 MavQ的酵母毒性试验分析 |
| 1.3.3 重组MavQ及其突变子蛋白表达与纯化 |
| 1.3.4 MavQ的生化功能检测分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 MavQ的细胞生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的制备及保存 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GFP-MavQ、RFP-MavQ、Flag-MavQ真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 免疫荧光实验 |
| 2.2.4 定点突变 |
| 2.2.5 体外激酶实验 |
| 2.2.6 薄层色谱(TLC)实验 |
| 2.2.7 数据处理及分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MavQ亚细胞定位分析 |
| 2.3.2 转染MavQ对高尔基体结构的影响 |
| 2.3.3 转染MavQ对早期内体上PtdIns3P的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 MavQ在军团菌感染宿主细胞中的作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的制备及保存 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MavQ敲除(pSR47s)和回补(pZL507)质粒的构建 |
| 3.2.2 定点突变 |
| 3.2.3 三亲杂交构建mavQ、lepB/mavQ敲除菌株(Lp02-△mavQ、Lp02-△lepB/mavQ) |
| 3.2.4 电转化回补 |
| 3.2.5 小鼠骨髓巨噬细胞的分化培养 |
| 3.2.6 Lp02-△mavQ胞内生长曲线 |
| 3.2.7 MavQ鼠源抗体的制备 |
| 3.2.8 MavQ表达检测 |
| 3.2.9 军团菌的免疫荧光实验 |
| 3.2.10 SidC的表达和转运检测 |
| 3.2.11 数据处理及分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 mavQ缺失不影响军团菌的胞内生长 |
| 3.3.2 MavQ在LCV表面定位分析 |
| 3.3.3 MavQ对LCV表面SidC定位的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 效应蛋白SidP与MavQ的相互作用研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒、细胞和实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的制备及保存 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 SidP相关载体构建 |
| 4.2.2 SidP相关蛋白纯化 |
| 4.2.3 GST pull-down试验 |
| 4.2.4 Biacore分析 |
| 4.2.5 三亲杂交构建sidP敲除菌株(Lp02-△sidP) |
| 4.2.6 HeLa细胞培养、转染与免疫荧光 |
| 4.2.7 MavQ与SidP的体外激酶实验 |
| 4.2.8 SidP抗体制备与细菌免疫荧光 |
| 4.2.9 数据处理及分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MavQ与SidP相互作用分析 |
| 4.3.2 SidP对MavQ磷脂酰肌醇3-磷酸激酶活性的影响 |
| 4.3.3 sidP的缺失不影响LCV上PtdIns4P的生成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胞内病原体与宿主细胞间的互作 |
| 1.2 胞内病原菌 |
| 1.2.1 沙门氏菌 |
| 1.2.2 Ⅲ型分泌系统的结构和功能 |
| 1.3 冠状病毒 |
| 1.3.1 冠状病毒概述 |
| 1.3.2 SARS-CoV-2 基因组结构特征及其编码的蛋白质结构及功能 |
| 1.3.3 SARS-CoV侵入宿主细胞及其复制过程 |
| 1.3.4 SARS-CoV-2 主蛋白酶的结构特性 |
| 1.3.5 SARS-CoV-2 主蛋白酶的抑制剂的研究进展 |
| 1.4 基于活性的蛋白组学技术概述 |
| 1.4.1 半胱氨酸蛋白水解酶特异性分子探针研究进展 |
| 1.5 科学问题及研究意义 |
| 1.5.1 沙门氏菌SPI-2 T3SS新型效应蛋白的化学蛋白质组学鉴定 |
| 1.5.2 新型冠状病毒主蛋白酶的活性分子探针及抑制剂的筛选 |
| 第2章 沙门氏菌SPI-2 T3SS新型效应蛋白的化学蛋白质组学鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 质粒、菌株及细胞 |
| 2.2.2 主要试剂与药品 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 常用试剂的配制 |
| 2.3 分子生物学操作 |
| 2.3.1 聚合酶链式反应 |
| 2.3.2 限制性内切酶酶切反应 |
| 2.3.3 PCR产物凝胶回收 |
| 2.3.4 连接与转化 |
| 2.3.5 定点突变 |
| 2.3.6 一步克隆 |
| 2.3.7 细菌转化 |
| 2.3.8 感受态细胞的制备 |
| 2.3.9 本课题中构建的质粒与菌株汇总 |
| 2.4 细胞培养、感染实验 |
| 2.4.1 细胞来源、溶液配置、常规细胞培养操作 |
| 2.4.2 感染实验 |
| 2.5 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.5.1 常用试剂的配制 |
| 2.5.2 免疫印迹 |
| 2.6 蛋白质电泳及BCA法蛋白浓度的测定 |
| 2.6.1 蛋白质电泳 |
| 2.6.2 BCA法测定蛋白质浓度 |
| 2.7 铜催化的叠氮-炔基环加成反应 |
| 2.7.1 相同浓度AZF孵育不同时间 |
| 2.7.2 不同浓度的AZF孵育3h |
| 2.8 AZF标记的细菌蛋白的纯化富集 |
| 2.9 质谱样品的制备 |
| 2.9.1 Pull down实验 |
| 2.9.2 脱盐 |
| 2.10 质谱分析和数据处理 |
| 2.11 利用生物统计学和生物信息学方法进行蛋白质组学数据分析 |
| 2.12 实验结果与讨论 |
| 2.12.1 STm-Phe RS*菌株能够利用非天然氨基酸标记沙门氏菌的新生蛋白质组 |
| 2.12.2 STm-Phe RS*菌株嵌入非天然氨基酸具有时间和浓度依赖性 |
| 2.12.3 STm-Phe RS*菌株的生存性能及侵染能力不受影响 |
| 2.12.4 实现了在宿主细胞内对沙门氏菌的新生蛋白质组进行有效标记 |
| 2.12.5 鉴定到35 个候选SPI-2 T3SS效应蛋白 |
| 2.13 小结 |
| 第3章 新型冠状病毒主蛋白酶的活性分子探针及抑制剂的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 质粒、菌株及细胞 |
| 3.2.2 主要试剂与药品 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.3 分子生物学操作 |
| 3.4 原核表达、纯化重组蛋白 |
| 3.4.1 常用试剂的配制 |
| 3.4.2 重组质粒的构建 |
| 3.4.3 重组蛋白诱导、表达条件优化 |
| 3.4.4 重组蛋白提取、纯化流程 |
| 3.5 细胞培养及细胞转染 |
| 3.5.1 细胞来源、溶液配制、常规细胞培养操作 |
| 3.5.2 细胞转染实验 |
| 3.6 荧光共振能量转移(FRET)蛋白酶活性测定 |
| 3.6.1 实验材料 |
| 3.6.2 实验流程 |
| 3.7 Comparative ABPP |
| 3.7.1 浓度依赖性 |
| 3.7.2 时间依赖性 |
| 3.7.3 活性分子探针标记细胞裂解液 |
| 3.8 Competitive ABPP |
| 3.9 结果与讨论 |
| 3.9.1 主蛋白酶的诱导、表达与纯化 |
| 3.9.2 His-SUMO(CoV)重组蛋白的表达和纯化 |
| 3.9.3 制备天然主蛋白酶 |
| 3.9.4 获取天然的主蛋白酶的不同构建方案 |
| 3.10 建立基于荧光共振能量转移的酶活测定方法 |
| 3.10.1 SARS-CoV-2 M~(pro)第一轮筛选 |
| 3.10.2 SARS-CoV-2 M~(pro)第二轮筛选 |
| 3.10.3 Biotin-VAD-FMK能够有效的抑制主蛋白酶的活性 |
| 3.10.4 Biotin-VAD-FMK是 SARS-CoV-2 M~(pro)的活性分子探针 |
| 3.10.5 ABP在细胞裂解液中能够有效标记SARS-CoV-2 M~(pro) |
| 3.11 小结 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 沙门氏菌SPI-2 T3SS新型效应蛋白的化学蛋白质组学鉴定 |
| 4.1.1 该研究的创新点 |
| 4.1.2 展望 |
| 4.2 新型冠状病毒主蛋白酶的活性分子探针及抑制剂的筛选 |
| 4.2.1 该研究的创新点 |
| 4.2.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 马齿苋的免疫调节功能 |
| 2. 沙门氏菌介绍 |
| 3. 外泌体在疾病治疗中的作用 |
| 第一章 马齿苋对鼠伤寒沙门氏菌的作用研究 |
| 一、马齿苋不同部位、不同提取方法对鼠伤寒沙门氏菌生长曲线的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 二、鼠伤寒沙门氏菌动物模型的建立 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 鼠伤寒沙门氏菌对小鼠生存率的影响 |
| 2.2 鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠状态变化 |
| 3. 讨论 |
| 三、马齿苋对鼠伤寒沙门氏菌小鼠模型的保护作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二章 外泌体介导的马齿苋对鼠伤寒沙门氏菌小鼠的保护作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 外泌体鉴定 |
| 2.2 感染进程中差异蛋白分析 |
| 2.3 马齿苋对鼠伤寒沙门氏菌感染的影响 |
| 3. 讨论 |
| 综述 胞内菌在细胞内建立生命周期的过程 |
| 一、宿主细胞的内化 |
| 1. 胞内菌特异性表面成分黏附宿主细胞 |
| 2. 成功粘附后触发菌体吞噬作用 |
| 二、形成特定的含病原体的囊泡或释放到宿主细胞的胞浆中 |
| 三、回避宿主细胞防御机制 |
| 1. 逃避宿主先天性免疫应答 |
| 2. 逃避宿主获得性免疫应答 |
| 四、调节宿主细胞代谢获取自身必须的营养物质 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 论文综述 |
| 1 结核病流行现状与疫苗预防研究进展 |
| 1.1 结核病流行现状 |
| 1.2 结核病疫苗预防研究进展 |
| 1.3 结核分枝杆菌与巨噬细胞和中性粒细胞的相互作用 |
| 2 ASAP1基因与结核病易感性的研究进展 |
| 2.1 ASAP1基因在人群中与结核病易感性的研究进展 |
| 2.2 ASAP1基因 |
| 2.3 ASAP1及其相关基因抗结核免疫应答的机制研究进展 |
| 3 斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型研究结核病易感性的研究进展 |
| 3.1 斑马鱼作为模式动物的优点 |
| 3.2 海鱼分枝杆菌 |
| 3.3 斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型研究结核病易感性的研究进展 |
| 4 本课题的研究背景及目的意义 |
| 5 论文技术路线 |
| 第二章 asap1基因敲除斑马鱼模型的构建 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 斑马鱼 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 应用q RT-PCR技术检测斑马鱼胚胎在不同发育时期的表达 |
| 2.2.2 原位杂交 |
| 2.2.3 斑马鱼asap1a与asap1b基因的生物信息学分析 |
| 2.2.4 斑马鱼asap1a与 asap1b基因的克隆 |
| 2.2.5 斑马鱼asap1a与 asap1b基因敲除载体的构建 |
| 2.2.6 斑马鱼asap1a与asap1b基因敲除突变体F0代的建立 |
| 2.2.7 斑马鱼asap1a与 asap1b基因敲除杂合突变体和纯合突变体的筛选 |
| 2.2.8 Tg(mpx:GFP;asap1a-/-;asap1b-/-)转基因斑马鱼品系的构建 |
| 2.2.9 应用斑马鱼morpholino对asap1a与asap1b基因敲低 |
| 2.2.10 Western blotting检测morpholino对斑马鱼asap1a与asap1b基因敲低效率 |
| 2.2.11 斑马鱼各突变体生存情况与表型统计 |
| 2.2.12 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 斑马鱼asap1a与 asap1b的生物信息学分析 |
| 3.2 斑马鱼asap1a与 asap1b的时空表达 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 基因编辑中斑马鱼asap1a-g RNA与 asap1b-g RNA敲除效率检测 |
| 3.4 CRISPR/Cas9 基因编辑构建斑马鱼asap1a和 asap1b敲除突变体 |
| 3.5 斑马鱼各突变体生存情况与表型统计结果 |
| 3.6 单敲除突变体中asap1a与 asap1b基因的补偿现象 |
| 3.7 应用斑马鱼morpholino对 asap1a与 asap1b基因敲低 |
| 3.8 斑马鱼asap1a morphants,asap1b morphants和 asap1a/1b morphants的表型分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 应用斑马鱼模型探讨Asap1介导巨噬细胞、中性粒细胞迁移反应与结核病易感性关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 动物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 荧光海鱼分枝杆菌的制备 |
| 2.2.2 尾静脉注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.3 卵黄注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.4 中耳和后脑室注射海鱼分枝杆菌 |
| 2.2.5 中性红染色法观察巨噬细胞的迁移反应 |
| 2.2.6 利用qPCR定量海鱼分枝杆菌细菌数的标准曲线建立 |
| 2.2.7 斑马鱼幼鱼RNA/DNA的共提取 |
| 2.2.8 斑马鱼结核病易感表型的回转实验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 荧光海鱼分枝杆菌 |
| 3.2 Morpholino敲低asap1 基因后鱼胚体内的细菌载量变化 |
| 3.3 Morpholino敲低asap1 基因后鱼存活率的变化 |
| 3.4 Morpholino敲低asap1 基因后巨噬细胞的迁移变化 |
| 3.5 CRISPR/Cas9敲除asap1基因后鱼胚体内的细菌载量变化 |
| 3.6 利用qPCR建立海鱼分枝杆菌细菌数定量方法 |
| 3.7 asap1敲除突变体感染海鱼分枝杆菌后的存活率分析 |
| 3.8 CRISPR/Cas9敲除asap1基因后中性粒细胞与巨噬细胞的迁移变化 |
| 3.9 细胞炎症因子的检测 |
| 4 小结与讨论 |
| 第四章 利用人单核巨噬细胞系THP1 和鼠巨噬细胞系Raw264.7 研究ASAP1 与结核病易感性的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细菌 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 荧光结核分枝杆菌的制备 |
| 2.2.2 细胞培养与分化 |
| 2.2.3 Raw264.7和THP1感染结核分枝杆菌 |
| 2.2.4 ASAP1敲低的Raw264.7和THP1细胞建立 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 Western blotting |
| 2.2.7 巨噬细胞对于结核分枝杆菌的易感性分析实验 |
| 2.2.8 Transwell实验 |
| 2.2.9 免疫荧光检测细胞骨架和黏着斑变化 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 荧光结核分枝杆菌的制备 |
| 3.2 ASAP1参与Mtb感染的THP1和Raw264.7 细胞 |
| 3.3 ASAP1在THP1和Raw264.7细胞中的敲低 |
| 3.4 敲低ASAP1引起THP1和Raw264.7细胞感染Mtb后细菌载量变化 |
| 3.5 敲低ASAP1抑制巨噬细胞的迁移 |
| 3.6 敲低ASAP1 引起THP1 细胞骨架的改变 |
| 4 小结与讨论 |
| 第五章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略表 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
| 个人情况与联系方式 |
| 英文缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Rab32促进类鼻疽菌吞噬体成熟的作用机制 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 类鼻疽菌效应蛋白BapC生物学功能初步研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胞内病原菌操控宿主膜泡运输通路的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录A 类鼻疽菌感染RAW264.7 细胞后差异表达的micro RNA |
| 研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 沙门氏菌的研究进展 |
| 1.1 沙门氏菌的微生物学特性 |
| 1.2 沙门氏菌的危害 |
| 1.3 沙门氏菌的感染机制 |
| 1.4 沙门氏菌的毒力因子 |
| 第2章 沙门氏菌Ⅲ型分泌系统研究进展 |
| 2.1 T3SS的分子结构 |
| 2.2 T3SS结构的组装 |
| 2.3 T3SS的功能 |
| 第3章 Ⅲ型分泌系统抑制剂的筛选及应用的研究进展 |
| 3.1 T3SS抑制剂的研究简介 |
| 3.2 T3SS抑制剂筛选的方法和机理 |
| 3.3 沙门氏菌T3SS抑制剂的研究进展 |
| 3.4 丁香醛的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂的筛选与发现 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 丁香醛体外药物活性评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 丁香醛抑制沙门氏菌T3SS功能作用机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 丁香醛对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的治疗学实验 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间的学术成果 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| 第一篇 文献综述 微小隐孢子虫与宿主细胞相互作用机制研究进展 |
| 引言 |
| 1.1 隐孢子虫分类地位 |
| 1.2 隐孢子虫生活史及体外培养 |
| 1.3 隐孢子虫基因组及生物学特性 |
| 1.4 隐孢子虫蛋白组学研究进展 |
| 1.5 隐孢子虫与宿主细胞相互作用分子机制 |
| 1.6 隐孢子虫感染的细胞生物学研究 |
| 1.7 隐孢子虫病治疗策略和药物研发 |
| 1.8 亟待解决的问题与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 C.parvum卵囊纯化及子孢子的制备 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫株及实验动物 |
| 1.1.2 主要实验仪器和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 C.parvum卵囊的传代及纯化 |
| 1.2.2 C.parvum卵囊不同脱囊方法比较 |
| 1.2.3 C.parvum子孢子的制备 |
| 1.2.4 C.parvum子孢子感染HCT-8 细胞时间过程 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 C.parvum卵囊及子孢子纯化结果 |
| 2.2 不同脱囊方法效果比较 |
| 2.3 C.parvum子孢子感染HCT-8 细胞时间过程探究 |
| 3 结论与讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 C.parvum感染HCT-8 细胞分泌蛋白组学研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫株 |
| 1.1.2 试剂与试剂盒 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 C.parvum子孢子的制备 |
| 1.2.2 HCT-8细胞无血清培养 |
| 1.2.3 分泌蛋白的收集与处理 |
| 1.2.4 分泌蛋白浓度测定 |
| 1.2.5 SDS-PAGE分析 |
| 1.2.6 酶解及TMT标记 |
| 1.2.7 数据库搜索 |
| 1.2.8 生物信息学分析方法 |
| 1.2.9 TMT验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 分泌蛋白蛋白浓度测定 |
| 2.2 SDS-PAGE分析 |
| 2.3 质控分析 |
| 2.4 C.parvum子孢子分泌蛋白分析 |
| 2.4.1 蛋白定性和定量结果 |
| 2.4.2 定性分泌蛋白GO注释和亚细胞定位分析 |
| 2.4.3 定性蛋白GO富集 |
| 2.4.4 定性分泌蛋白KEGG富集 |
| 2.5 差异分泌蛋白的总体分析 |
| 2.5.1 COG/KOG分析 |
| 2.5.2 GO注释和亚细胞结构定位分析 |
| 2.5.3 GO、KEGG和 domain富集分析 |
| 2.6 TMT验证试验 |
| 3 讨论与结论 |
| 4 小结 |
| 第三章 C.parvum感染HCT-8 细胞膜蛋白组学研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 子孢子的制备 |
| 1.2.2 HCT-8细胞无血清培养 |
| 1.2.3 HCT-8细胞膜蛋白的提取 |
| 1.2.4 膜蛋白富集及浓度测定 |
| 1.2.5 SDS-PAGE分析及Western blot鉴定 |
| 1.2.6 基于TMT定量蛋白质组学及生物信息学分析 |
| 1.2.7 qRT-PCR验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 膜蛋白的富集及浓度测定 |
| 2.2 SDS-PAGE分析及Western blot鉴定 |
| 2.3 蛋白鉴定总览 |
| 2.4 样品质控分析 |
| 2.5 差异蛋白COG/KOG功能分类分析 |
| 2.6 差异蛋白GO聚类分析 |
| 2.7 差异表达蛋白GO富集 |
| 2.8 差异表达蛋白KEGG富集 |
| 2.9 差异表达蛋白结构域富集 |
| 2.10 KEGG富集聚类分析 |
| 2.11 部分差异表达膜蛋白功能分析 |
| 2.12 TMT组学验证 |
| 2.13 C.parvum感染对HCT-8 细胞E-cadherin蛋白的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 CpTrap/CpCrisp/CpCarp蛋白在C.parvum入侵HCT-8 细胞过程中的生物学功能研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫株与细胞系 |
| 1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.1.3 主要试验仪器 |
| 1.1.4 SDS-PAGE胶配制 |
| 1.1.5 Western Blot所需溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 C.parvum含 CAP结构域蛋白功能分析 |
| 1.2.2 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因的克隆与表达 |
| 1.2.3 CpTrap/CpCrisp/CpCarp重组蛋白多克隆抗体制备及效价检测 |
| 1.2.4 CpTrap/CpCrisp/CpCarp在卵囊和子孢子中定位分析 |
| 1.2.5 CpTrap/CpCrisp/CpCarp在内生发育阶段定位分析 |
| 1.2.6 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因不同发育阶段表达量检测 |
| 1.2.7 抗体阻断试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 C.parvum含 CAP结构域蛋白功能分析 |
| 2.2 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因序列分析 |
| 2.3 目的基因克隆 |
| 2.4 转化克隆及PCR鉴定 |
| 2.5 重组表达质粒PCR鉴定 |
| 2.6 重组表达质粒酶切鉴定 |
| 2.7 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.8 重组蛋白Western Blot鉴定 |
| 2.9 重组蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 2.10 CpTrap、CpCrisp和 CpCarp天然蛋白鉴定 |
| 2.11 CpTrap/CpCrisp/CpCarp蛋白亚细胞定位分析 |
| 2.12 CpTrap/CpCrisp/CpCarp基因表达模式分析 |
| 2.13 抗体阻断试验 |
| 3 结论与讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结与创新点 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1. 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)概述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 理化特性 |
| 1.4 培养特性 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 流行病学及危害 |
| 1.7 防治措施 |
| 2. 上皮-间充质转换概述 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 EMT机制 |
| 2.3 EMT相关转录因子 |
| 3 肠球菌概述 |
| 3.1 分类 |
| 3.2 研究背景 |
| 3.3 培养特性和生化特性 |
| 3.4 流行病学 |
| 3.5 肠球菌的致病性 |
| 4 细菌的黏附与侵袭 |
| 5 细菌病毒共感染 |
| 5.1 直接相互作用 |
| 5.2 间接相互作用 |
| 试验一 TGEV实时定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株与毒株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 TGEV的增殖 |
| 2.2 引物设计与合成 |
| 2.3 TGEV RNA的提取与cDNA的制备 |
| 2.4 PCR扩增 |
| 2.5 PCR产物的胶回收与纯化 |
| 2.6 标准质粒模板的制备 |
| 2.7 实时定量PCR反应程序的确定 |
| 2.8 标准曲线的建立 |
| 2.9 特异性、敏感性和重复性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 常规PCR扩增鉴定结果 |
| 3.2 菌液PCR鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒鉴定结果 |
| 3.4 质粒紫外检测结果 |
| 3.5 实时荧光定量PCR条件的优化 |
| 3.6 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.7 荧光定量PCR特异性检测 |
| 3.8 荧光定量PCR的敏感性检测 |
| 3.9 荧光定量PCR的重复性检测 |
| 4 讨论 |
| 试验二 TGEV持续感染诱导IPEC-J2细胞发生EMT |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株及毒株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 IPEC-J2的复苏与培养 |
| 2.2 TGEV TCID_(50)的测定 |
| 2.3 TGEV持续感染IPEC-J2细胞 |
| 2.4 细胞活性的测定 |
| 2.5 细胞全RNA的提取与RT-PCR |
| 2.6 EMT标志物转录水平的评估 |
| 2.7 EMT标志物蛋白水平的评估 |
| 2.8 鬼笔环肽染色 |
| 2.9 炎性因子的评估 |
| 2.10 细胞运动性的评估 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TCID_(50)的测定 |
| 3.2 TGEV持续感染IPEC-J2细胞 |
| 3.3 TGEV诱导EMT的结果 |
| 3.4 TGEV对炎性因子的影响 |
| 3.5 细胞运动性的评估 |
| 4 讨论 |
| 试验三 TGEV持续感染对粪肠球菌侵袭IPEC-J2细胞的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 粪肠球菌N41菌种的活化 |
| 2.2 EMT对粪肠球菌感染性的评估 |
| 2.3 细胞活性的测定 |
| 2.4 粪肠球菌对发生和未发生EMT细胞其炎性细胞因子表达的影响 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 粪肠球菌对感染TGEV的IPEC-J2细胞的黏附结果 |
| 3.2 粪肠球菌对感染TGEV的IPEC-J2细胞的入侵结果 |
| 3.3 细胞活性的测定 |
| 3.4 间接免疫荧光观察粪肠球菌黏附IPEC-J2细胞 |
| 3.5 场发射扫描电镜试验对粪肠球菌黏附IPEC-J2细胞的观察 |
| 3.6 粪肠球菌对细胞炎性因子转录的影响 |
| 4 讨论 |
| 试验四 TGEV持续感染加强粪肠球菌致病性的机制初探 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞株 |
| 1.2主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 场扫描发射电镜观察 |
| 2.2 EMT对粪肠球菌受体影响的评估 |
| 2.3 粪肠球菌迁移实验 |
| 2.4 间接免疫荧光 |
| 2.5 粪肠球菌对EMT的影响 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 场发射扫描电镜观察结果 |
| 3.2 EMT对粪肠球菌受体表达的影响 |
| 3.3 粪肠球菌迁移实验结果 |
| 3.4 间接免疫荧光观察连接蛋白表达情况 |
| 3.5 粪肠球菌对EMT影响的评估 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 TNF-α对大鼠肺微血管内皮细胞单层通透性的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验方案 |
| 3.结果 |
| 3.1 成功分离、培养RPMVEC |
| 3.2 不同浓度TNF-α对RPMVECs细胞活性的影响 |
| 3.3 TNF-α对RPMVECs单层通透性的影响 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 Rac1 参与调控TNF-α诱导的肺微血管通透性增高 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验方案 |
| 3.结果 |
| 3.1 重组pLL3.7-Rac1 质粒的双酶切鉴定及测序 |
| 3.2 慢病毒滴度测定 |
| 3.3 成功分离、培养RPMVEC |
| 3.4 慢病毒介导的RNAi |
| 3.5 TNF-α降低RPMVEC中的Rac1 活性 |
| 3.6 Rac1 介导TNF-α诱导的PMVECs血管高通透性 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 Rac1经IQGAP1通路调节TNF-α诱导的大鼠肺微血管内皮细胞高通透性 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验方案 |
| 3.结果 |
| 3.1 重组p LL3.7-IQGAP1 质粒的双酶切鉴定及测序 |
| 3.2 慢病毒滴度测定 |
| 3.3 成功分离、培养RPMVEC |
| 3.4 慢病毒介导的RNAi |
| 3.5 TNF-α降低RPMVEC中的IQGAP1 活性 |
| 3.6 下调IQGAP1 表达加重TNF-α诱导的血管屏障破坏 |
| 3.7 下调IQGAP1 表达抑制RPMVECs中 Rac1-GTP的表达 |
| 3.8 Rac1 激活减轻IQGAP1 沉默对TNF-α内皮屏障破坏的加剧 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 Rac1经Ezrin通路调节TNF-α诱导的大鼠肺微血管内皮细胞高通透性 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验方案 |
| 3.结果 |
| 3.1 重组pLL3.7-Ezrin质粒的双酶切鉴定及测序 |
| 3.2 慢病毒滴度测定 |
| 3.3 成功分离、培养RPMVEC |
| 3.4 慢病毒介导的RNAi |
| 3.5 TNF-α促进RPMVEC中活性Ezrin(p-Ezrin)表达 |
| 3.6 Ezrin介导TNF-α诱导的PMVECs血管高通透性 |
| 3.7 下调Ezrin表达促进RPMVECs中 Rac1-GTP的表达 |
| 4.讨论 |
| 全文结论 |
| 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 IQGAP1参与调控的信号转导通路研究进展 |
| 参考文献 |
