田景惠[1]（2019）在《miR-520e在HBV相关肝细胞癌中的作用及机制的研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内尤其是我国高发的消化系统恶性肿瘤,早期诊断困难,进展迅速且预后极差。HCC的发生与病毒感染、遗传易感性及酒精摄入等因素有关,其中,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在我国是导致HCC最主要的原因。HBV感染致HCC的过程可能涉及多种因素多个步骤,其具体机制目前仍不完全明确,研究由HBV感染致HCC的机制具有重要的理论意义与临床应用价值。乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus x protein,HBx）是HBV复制所必需的蛋白质成分,在HBV致HCC的发生过程中发挥重要作用。HBx作为一种反式激活因子,可以作用于细胞因子或生长因子等多种蛋白质,调节大量与细胞增殖、转移、周期、凋亡及多种信号通路相关的宿主功能基因。近年来的研究发现,HBx可以诱导微小RNA（microRNA,miRNA）的异常表达并影响相应的信号通路进而促进HBV相关HCC的发生。miRNA是一类长约18-25个核苷酸的非编码单链小分子RNA,广泛存在于病毒与真核生物中,参与了病毒防御、发育、造血、器官形成、代谢及细胞增殖和凋亡等过程,与多种疾病进程尤其是肿瘤密切相关。miRNA本身并不翻译产生蛋白质,但可以通过与靶基因3’末端的非编码区（3’-untranslated region,3’-UTR）结合引起靶基因mRNA的降解或翻译的抑制,从而在转录后水平对靶基因发挥负调控作用。在人类基因组中,大约一半的已知miRNA以基因簇的形式存在,同一基因簇中的miRNA通常功能上彼此相关。miR-520家族基因定位于人类第19号染色体,包括miR-371-373基因簇及mmiR-520a-g基因簇等十几个家族成员,是迄今为止发现的人类基因组中最大的miRNA簇。研究报道,miR-520家族与多种实体肿瘤包括HCC密切相关;且HBx可以下调miR-520b（miRNA-520家族中的成员之一）从而参与HCC的发生。miR-520e是miRNA-520家族成员之一,有研究报道miR-520e在HCC中水平下调。因此,我们推测,miR-520e可能也在HBV相关的HCC中发挥重要作用。促红细胞生成素产生人肝细胞受体A2（erythropoietin producing human hepatocelluar receptor A2,EphA2）属于受体型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases,RTKs）中的Eph家族,在人类胚胎发育、细胞的生长、分化和细胞内信号转导以及肿瘤的发生发展过程中发挥关键作用。研究发现,EphA2在多种不同类型的肿瘤组织及肿瘤细胞系中高水平表达,与肿瘤恶性程度、转移及预后密切相关,还参与了肿瘤血管的形成,是近年来倍受关注的致癌基因之一。近年来,诸多研究报道了 EphA2可以作为miRNA的靶基因参与肿瘤包括HCC的发生与发展,miRNA对EphA2转录后调控可能是EphA2在多种恶性肿瘤水平上调的可能机制之一。重要的是,我们利用miRNA目标基因预测软件发现,EphA2是miR-520e的靶基因之一。EphA2属于RTKs,活化后介导信号转导并引发一系列的生物效应。Ras-Raf-MAPK信号通路是EphA2的下游信号通路之一,主要调控细胞的增殖、分化及凋亡。已有研究证实,HBx通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路参与了 HBV 相关 HCC 的发生和发展;EphA2的磷酸化可以活化Ras,进而活化MAPK信号通路中的ERK1/2和p38MAPK信号通路影响细胞生长。综上所述,本研究的目的在于探讨miR-520e是否靶向EphA2并调控MAPK信号通路参与HBV相关HCC的发生与发展。课题从以下三个方面进行:1.探讨miR-520e与EphA2在HBV阳性的肝癌组织及细胞系中的水平变化;2.确证miR-520e与EphA2的靶向关系;3.进一步研究miR-520e在HBV相关HCC中的作用效应及其具体机制。希望通过本课题的研究,能够为HBV相关HCC的诊断和治疗提供新的理论依据。第一部分:HBV相关的HCC组织与细胞中miR-520e与EphA2的水平变化目的:通过检测HBV阳性的肝癌组织及HCC细胞系中miR-520e、EphA2的水平变化,以探讨二者是否在HBV相关的HCC发生与发展中发挥作用,并进一步分析二者的水平变化是否符合初步预测及其与HBV感染的相关性。方法:1.收集了 45例HBV阳性的早期HCC患者的肿瘤组织及癌旁组织样本,实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）检测组织中 miR-520e 与EphA2水平。2.以HBV阳性细胞系（HepG2.2.15和HepAd38）及HBV阴性细胞系（HepG2和Huh7）作为研究对象,分别采用qPCR与免疫印迹实验（Western blot,WB）检测miR-520e与EphA2水平。3.构建重组HBx真核细胞表达载体质粒GV146-HBx,转染并筛选能够稳定表达HBx的细胞系Huh7-X及HepG2-X;用不同剂量的si-HBx转染Huh7-X、HepG2-X与HepG2.2.15细胞,以不同程度下调细胞HBx的表达水平,并于转染48小时后分别检测HBx和miR-520e。结果:1.HBV阳性的组织中,miR-520e下降,EphA2水平升高:与癌旁正常肝脏组织相比,HBV阳性的HCC组织中miR-520e水平显着下降（P<0.001）,EphA2水平则显着升高（P<0.001）。2.HBV阳性的细胞系中,miR-520e下降,EphA2升高:与HBV阴性的细胞系HepG2及Huh7相比,HBV阳性细胞系HepG2.2.15和HepAd38中miR-520e水平显着降低（P<0.05）,HepAd38细胞miR-520e水平最低（P<0.05）;EphA2水平则显着升高（P<0.05）,HepAd38细胞phA2蛋白表达水平最高（P<0.05）。3.HBx下调miR-520:被不同剂量的si-HBx干扰后,HBx的表达被不同程度相应下调,miR-520e的水平呈剂量依赖性升高（P<0.05）,与HBx的变化趋势恰好相反,进一步证实了 HBx能够下调miR-520e的水平。结论:HBV阳性的HCC组织及细胞中,miR-520e下降,EphA2升高,二者的水平变化符合靶向关系的初步预测;HBx可以负调控mmiR-520;miR-520e可能通过靶向EphA2参与了 HBV相关HCC的发生与发展。第二部分miR-520e靶向调控EphA2的验证目的:预测miR-520e的靶基因并进一步证实miR-520e与EphA2的靶向关系。方法:1.利用常用的四个miRNA目标基因预测软件（miRanda、TargetScan、miRDB及miRWalk）预测miR-520e的靶基因。2.针对预测的miR-520e种子区与EphA2的3’ UTR的结合位点（“AGCACUU”）,构建重组野生型与突变型EphA2-3’UTR萤火虫荧光素酶报告质粒EphA2-WT与EphA2-MUT,分别与miR-520e mimics及miR-520e mimics NC共同转染HepG2细胞,转染48小时后分别检测各组的荧光素酶活性。结果:1.四个预测软件均预测到miR-520e的种子区与EphA2的3’-UTR的互补结合,提示EphA2是miR-520e的靶基因之一。2.双荧光素酶报告基因检测显示,与 EphA2 3’ UTR-WT+miR-520e NC 组相比,EphA2 3’ UTR-WT 和 miR-520e mimics共转染后荧光素酶相对活性显着降低（P<0.05）,证实EphA2是miR-520e靶基因。另外,EphA2 3’ UTR-MUT+miR-520e mimic 组和 EphA2 3’ UTR-MUT+miR-520e NC组荧光素酶活性无显着性差异,证实EphA2-3’ UTR的“AGCACUU”序列是与miR-520e种子区结合的特异位点。结论:EphA2是miR-520e的靶基因,EphA2-3’ UTR的“AGCACUU”序列是与miR-520e种子区结合的特异位点。第三部分miR-520e靶向调控EphA2在HBV相关HCC中的作用及机制目的:明确miR-520e靶向EphA2在HBV相关HCC中的作用效应,并进一步探讨具体机制。方法:1.建立稳定表达HBV的pHBV1.2+Huh7细胞系。2.将HepG2.2.15细胞和pHBV1.2+Huh7分为以下6组分别进行以下转染:Mock组（只加转染试剂）,NC 组（转染 miR-520e 阴性对照质粒）、miR-520e mimic 组（转染 miR-520e mimics）、miR-520e inhibitor 组（转染miR-520e inhibitor）、si-EphA2 组（转染 si-EphA2）、miR-520e inhibitor+si-EphA2（共转染 si-EphA2 和 miR-520e inhibitor）,转染48h后收集细胞,分别采用qRT-PCR与Western blot检测各组miR-520e和EphA2的水平;qRT-PCR对HBV DNA拷贝数进行定量;ELISA法检测HBsAg和HBeAg;采用CCK8试剂盒检测细胞增殖情况;采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡情况;采用Western blot检测p38MAPK和ERK1/2通路蛋白的表达情况。3.建立由重组腺相关病毒8型（rAAV8）介导的慢性HBV感染的小鼠模型以评价miR-520e在体内对HBV复制能力的影响。6周龄、雄性C57BL/6小鼠尾静脉注射rAAV8-1.3HBV,以构建慢性HBV感染的小鼠模型。建模成功的小鼠随机分为两组:HBV+miR-520e mimic组和HBV+NC组,每组8只,采用高压水动力法分别注射miR-520e mimics和阴性对照质粒,另8只未注射HBV的小鼠作为正常对照组。注射后3天,杀死小鼠取肝组织和尾静脉血,qRT-PCR检测肝脏组织中miR-520e、EphA2的水平及血清中HBV DNA拷贝数。结果:1.转染后各组miR-520e与EphA2的水平变化:Mock组、NC组两组间的miR-520e与EphA2水平没有显着差异（P>0.05）。与Mock及NC组相比,miR-520e mimic组的miR-520e水平显着升高,EphA2水平显着降低（P<0.05）;miR-520e inhibitor 组 miR-520e 水平显着下降,EphA2 水平显着升高（P<0.05）。以上结果提示,在上调或下调细胞中miR-520e的水平后,细胞中EphA2的水平发生了相反的变化。另外,与Mock及NC组相比,si-EphA2组EphA2的水平显着降低（P<0.05）,提示si-EphA2可以下调EphA2的表达水平。以上结果进一步证实了 miR-520e对EphA2的靶向负调控作用。2.miR-520e靶向EphA2抑制HBV复制。Mock组与NC组的HBV DNA拷贝数、HBsAg与HBeAg含量无显着差异（P>0.05）。与 Mock 组及 NC 组相比,miR-520e mimic 组与 si-EphA2 组的HBV DNA、HBsAg 与 HBeAg 显着下降,而 miR-520e inhibitor 组则显着升高（P值均<0.5）,提示上调miR-520e或下调EphA2抑制HBV的复制,下调miR-520e则促进 HBV 复制。与 miR-520e inhibitor 组相比,miR-520e inhibitor+si-EphA2组的 HBV DNA、HBsAg 与 HBeAg 显着降低（P<0.5）,提示 miR-520e inhibitor促进HBV复制的效应在一定程度上可以被si-EphA2组所逆转。以上结果证实,miR-520e靶向EphA2抑制HBV的复制。3.miR-520e靶向EphA2抑制细胞增殖。Mock组与NC组的细胞增殖活性无显着差异（P>0.05）。与Mock及NC组相比,miR-520e mimic 组、si-EphA2 组细胞增殖活性显着下降（P<0.05）,miR-520e inhibitor组细胞增殖活性显着增强（P<0.05）,提示在HBV相关的HCC细胞中,上调miR-520e或下调EphA2抑制细胞增殖,下调miR-520e则促进细胞增殖。与 miR-520e inhibitor 组相比,miR-520e inhibitor+si-EphA2 组的细胞增殖活性显着降低（P<0.05）,提示miR-520e inhibitor对细胞增殖产生的促进效应可以被si-EphA2所逆转。以上结果证实,miR-520e靶向EphA2抑制细胞的增殖。4.miR-520e靶向EphA2促进细胞凋亡。Mock组与NC组的细胞凋亡无显着差异（P>0.05）。与 Mock 及 NC 组相比,miR-520e mimic 组、si-EphA2 组细胞凋亡显着增多（P<0.05）,miR-520e inhibitor组细胞凋亡显着减少（P<0.05）,提示上调miR-520e或下调EphA2可促进细胞的凋亡,下调miR-520e可抑制细胞的凋亡。与 miR-520e inhibitor 组相比,miR-520e inhibitor+si-EphA2 组的细胞凋亡显着增多（P<0.05）,提示si-EphA2逆转了 miR-520e inhibitor抑制细胞凋亡的效应。以上结果证实,miR-520e靶向EphA2促进细胞凋亡。5.miR-520e上调阻断p38MAPK和ERK1/2通路,下调miR-520e则使通路活化。转染后各组细胞的p38MAPK与ERK1/2蛋白表达水平没有显着差异,但反应通路活性的标志蛋白磷酸化水平差异显着。与Mock及NC组比较,miR-520e inhibitor组p38MAPK与ERK1/2蛋白的磷酸化水平显着升高（P<0.05）,miR-520e mimic组与si-EphA2组相应蛋白的磷酸化水平显着降低（P<0.05）,提示上调miR-520e或下调EphA2可以阻断p38MAPK和ERK1/2通路,而下调miR-520e则使通路活化。与miR-520e inhibitor组比较,miR-520e inhibitor+si-EphA2组的相应蛋白的磷酸化水平显着降低,提示miR-520e inhibitor对p38MAPK和ERK1/2通路活性产生的活化效应可以被si-EphA2所逆转。以上结果提示,miR-520e靶向抑制EphA2及其下游的p38MAPK和ERK1/2通路。HBV复制、增殖、凋亡与信号通路的结果证实,在HBV相关的HCC细胞系中,miR-520e的上调降低EphA2水平并阻断EphA2下游的p38MAPK和ERK1/2通路,抑制HBV复制及细胞增殖并促进凋亡;下调miR-520e则升高EphA2水平并活化EphA2下游的p38MAPK和ERK1/2通路,促进HBV复制及细胞增殖并抑制凋亡。miR-520e靶向EphA2并调控EphA2下游的p38MAPK和ERK1/2通路影响HBV的复制及HBV相关HCC的增殖与凋亡。6.动物实验证实,HBV下调miR-520e,进而靶向EphA2促进HBV复制。与正常组相比,HBV+NC组小鼠肝脏组织中miR-520e水平下降,EphA2水平升高（P<0.05）,与HBV+NC组相比,HBV+miR-520e mimic组小鼠的肝脏组织中miR-520e水平升高,EphA2水平下降（P<0.05）,体内实验证实,HBV下调miR-520e,miR-520e靶向负调控EphA2。另外,与正常组相比,HBV+NC组小鼠血清HBV DNA水平升高;与HBV+NC组相比,HBV+miR-520e mimic组小鼠血清HBV DNA水平显着降低（P<0.05）,体内实验证实,上调miR-520e抑制HBV复制。以上结果表明,在HBV慢性感染的小鼠体内,HBV感染下调miR-520e,进而靶向EphA2促进了 HBV的复制。结论:HBV感染下调miR-520e,导致其靶基因EphA2水平升高,进而EphA2介导的下游MAPK信号通路活化,最终促进了 HBV的复制及HCC细胞增殖并抑制了细胞凋亡。miR-520e靶向调控EphA2及其下游的MAPK信号通路参与了 HBV相关HCC的发生发展。
谢洋洋[2]（2019）在《先天免疫分子TRIM14对乙型肝炎病毒的抑制及机制研究》文中提出乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是感染率极高的慢性病毒性感染病,目前在我国乃至世界范围仍然是一个重要的公共卫生问题。它能够导致慢性肝炎,肝硬化甚至发展为肝癌。HBV的感染目前还没有能够治愈的方法。HBV是仅含有3.2kb基因组的小包膜病毒,具有精密的基因组结构。与HBV生命周期中重要蛋白包括核心蛋白（HBcAg）、E抗原（HBeAg）、表面抗原（HBsAg）以及X蛋白HBx等。这些蛋白的表达受HBV相关启动子的调控。TRIM家族蛋白是一类在抗病毒先天免疫中发挥重要作用的蛋白,具有E3泛素连接酶活性。TRIM家族蛋白拥有相对保守的结构域,包括N端的RING结构域,B-box结构域、卷曲螺旋结构域,大部分TRIM蛋白在C端含有B30.2结构域,即PRYSPRY结构域。TRIM家族蛋白能够参与机体的多个生理过程,包括细胞分化、增殖、癌变、自噬、先天免疫的激活等。近年来,多种TRIM蛋白在抗病毒先天免疫中的作用相继被发现,如TRIM5α、TRIM11、TRIM19、TRIM22、TRIM25等。且许多TRIM蛋白与细胞的干扰素反应存在密切联系。说明TRIM家族蛋白是广泛存在的一类新型抗病毒先天免疫分子。因此我们希望研究TRIM蛋白在抗HBV反应中发挥怎样的作用。本课题的研究主要包括三个部分,第一部分主要通过构建大量TRIM家族表达质粒在乙肝癌症模型HepG2中筛选对HBV具有抑制效果的TRIM蛋白。我们发现TRIM14具有尤为显着的抑制HBV的能力。通过进一步实验发现TRIM14在HepG2以及乙肝细胞感染模型HepG2-NTCP中都显示了对HBV中HBsAg、HBeAg、HBcAg以及HBV的转录水平和DNA水平的强烈抑制效果。且在TRIM14敲除的细胞中能够增强HBV的复制。第二部分我们进一步探索TRIM14在体内实验中的效果,在尾静脉高压注射小鼠模型中,通过共注射TRIM14表达质粒与HBV复制子,发现TRIM14能够明显抑制小鼠血清和肝脏中的HBV病毒学水平。第三部分的研究主要聚焦于TRIM抗HBV作用的机制。我们发现TRIM14能够有效激活细胞内的I型干扰素反应和NF-kB信号通路,且TRIM14对HBV的抑制很大程度上依赖于NF-kB信号通路的激活。但TRIM14抵抗HBV的机制并不依赖于HBV复制周期的重要蛋白HBx。通过缺失PRYSPRY结构域的TRIM14蛋白的研究发现,缺失PRYSPRY结构域后TRIM14对HBV的抑制效果消失,说明PRYSPRY结构域在TRIM14的抗HBV过程中是至关重要的。通过构建HBV启动子的荧光报告基因我们发现TRIM14能够抑制HBV核心启动子以及S启动子的活性。从而对HBV的转录水平起到抑制作用。综上所述,我们发现了了先天免疫分子TRIM14能够在体外乙肝细胞模型和体内尾静脉高压注射小鼠模型中抑制HBV蛋白的表达和基因的复制;TRIM14能够激活I型感染素反应和NF-kB信号通路。TRIM14可以抑制HBV核心启动子和S启动子活性。说明TRIM14可能作为先天免疫激活因子和转录抑制因子发挥其抑制HBV作用,本研究有助于进一步阐释机体抵抗HBV的感染机制。并且基于先天免疫分子TRIM14的抗HBV机制对于HBV的治疗应用可能具有潜在的价值。
王丹阳[3]（2018）在《基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术发展及应用研究》文中研究指明NF-κB是一种序列特异性DNA结合转录因子。在未激活状态下,NF-κB与其抑制蛋白IκB结合滞留在细胞质中。当细胞受到刺激,如病毒感染、紫外线照射、细胞因子（TNFα等）作用下,通过细胞内的NF-κB信号传导通路,抑制蛋白IκB降解,NF-κB进入细胞核,与核内DNA靶点结合,控制其众多靶基因的表达,从而参与细胞生长、分裂、凋亡、更新、炎症、癌变等生理及病理过程。NF-κB在炎症和癌症中被广泛激活,因此一度成为药物筛选和疾病治疗的重要靶点,如各种NF-κB抑制剂的开发。但由于NF-κB所具有的双刃剑作用,传统NF-κB抑制剂因其显着的副作用而始终未成为临床药物。因此,基于NF-κB的生物医学应用价值的探索需要新的研究策略。本研究发展了三种基于NF-κB的新型基因表达控制技术,并探索了其生物医学应用价值。1.基于NF-κB的高活性真核启动子研制及其应用研究人巨细胞病毒（hCMV）主要早期启动子（MIEP）是目前生命科学基础研究和各类基因工程、基因治疗、基因编辑中广泛使用的活性最高的真核启动子。本研究用指数富集（SELEX）系统筛选获得的高亲和力人工序列替换人MIEP中的天然NF-κB结合位点（κBs）,构建了各种突变型的MIEP（mMIEP）。通过多种转录活性评价系统的检测,本研究成功筛选出了3个转录活性显着高于野生型MIEP的mMIEP。这些mMIEP作为人工启动子可以广泛用于基因工程药物生产及基因治疗领域。此外,本研究为启动子工程提供了一个快速构建和筛选各种活性启动子的新方法,并且制备了一系列具有多种转录活性的mMIEPs,可用于未来合成生物学中目的基因表达水平的灵活控制。本研究将改造的人工启动子应用于hG-CSF蛋白的分泌表达,针对该蛋白的表达研究不仅可以深入的验证启动子表达效率,还为mMIEP启动子在基因工程制药的应用提供了重要依据。2.新型NF-κB活性抑制基因载体的构建及其应用研究已有研究证明,NF-κB通过调控其靶基因,在肿瘤细胞增殖、血管生成和侵袭转移等过程中起重要作用。而且很多研究表明,NF-κB家族蛋白在肿瘤组织细胞中的表达量比在正常组织细胞中有明显的增强。NF-κB已经成为新型药物治疗和研发的重要靶点。因此,研究人员开发了很多不同的NF-κB抑制剂,但由于NF-κB不仅是疾病相关的转录因子,它在细胞的正常生理功能中也发挥重要作用,对其进行过强的抑制会产生严重的副作用,这些抑制剂很难成为商品化的临床药物。为了克服这一局限性,本研究中将经典的NF-κB特异诱骗子（decoy）序列作为一种NF-κB特异性启动子元件,与最小启动子序列融合,构建了一种NF-κB调控启动子（decoy minimal promoter,DMP）。本研究以此启动子构建了一种新型NF-κB活性控制基因载体,该载体能够在DMP启动子的控制下表达靶向于NF-κB RelA的人工miRNA。本研究证实,这种载体可以对细胞内NF-κB活性进行感知和调控。载体在细胞内的表达可以形成一个完美的反馈循环,实现NF-κB的自我调控。将载体转染到细胞内后,NF-κB的活性越高,DMP启动子的转录活性也就越高,amiRNA的表达量也就越高。DMP-amiRNA系统能够适度的抑制NF-κB过度活化细胞（如肿瘤细胞）内的NF-κB活性,引起肿瘤细胞的凋亡,但对正常细胞的不产生显着影响。本研究通过筛选,获得一种效果良好的新型NF-κB活性抑制剂——DMP-amiR533。本研究不仅发展了一种抑制NF-κB活性的新策略,所筛选获得的DMP-amiR533在治疗炎症和癌症等NF-κB过度活化疾病中具有重要应用价值。3.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体构建及其应用研究近年来,免疫疗法对癌症治疗有很大贡献,但是,肿瘤细胞特异性抗原仍然是目前癌症免疫疗法最关键的限制因素。因此,研究人员正在通过肿瘤测序和生物信息学预测等方法寻找新抗原来开发个性化癌症免疫疗法,但该策略技术复杂性高、成本高、周期长。本研究通过开发肿瘤细胞特异性基因表达技术,构建了一种癌症的新型免疫疗法,该技术使用NF-κB特异性基因表达载体在肿瘤细胞表面表达特定的蛋白质或多肽,这些蛋白质或多肽可以作为人造新抗原起作用,用于区分肿瘤细胞和正常细胞并刺激免疫系统杀死肿瘤细胞。本研究构建并验证了NF-κB活化基因表达（NF-κB-activating gene expression,Nage）载体系统,该载体利用DMP启动子,使载体携带的下游效应基因可以在各种肿瘤细胞表面特异性表达某种蛋白质或多肽,如HBsAg、CRT和SBP。本研究将Nage载体包装在腺相关病毒（AAV）中,作为肿瘤免疫治疗的病毒载体药物,最终结果显示,重组AAV可以显着抑制体内肿瘤的生长,并且在实验鼠上未观察到毒副作用。本研究中提出的新型癌症基因免疫疗法在癌症治疗领域具有重要应用价值。总之,本研究发展了基于转录因子NF-κB的新型基因表达控制技术,获得了转录活性显着提高的新型启动子（mMIEP）、新型NF-κB活性控制载体（DMP-amiR533）,以及NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因表达载体（Nage）;这些基于NF-κB的新型基因表达控制技术在生物制药及基因治疗领域具有重要应用价值。
陈坤[4]（2017）在《组蛋白甲基转移酶SETD2调控干扰素介导的抗病毒效应的分子机制研究》文中研究表明Ⅰ型干扰素（Type Ⅰ Interferon,IFN-Ⅰ）是一类由机体产生的具有抗病毒功能的细胞因子,它通过激活细胞内JAK-STAT信号通路诱导一系列干扰素诱导基因（IFN-stimulated gene,ISG）的表达,并通过这些基因直接发挥抑制病毒生命周期、激活免疫细胞对感染病毒的细胞进行杀伤等作用,为机体建立起抗病毒感染的第一道防线。相反,干扰素信号调节的异常与感染性疾病和过度的炎症反应的发生密切相关。因此,机体内的干扰素信号需要受到严格且精确的调控以确保其在实现抗病毒作用的同时,避免因为信号异常产生细胞毒性,破坏机体稳态。干扰素信号的调控是细胞内多个水平的分子调控间相互协同作用的结果。近年来,表观遗传调控与非经典的蛋白质翻译后修饰在该信号传导过程中的作用被逐渐揭示,然而它们调控干扰素介导的抗病毒免疫应答的分子机制目前尚不清楚。为了研究干扰素抗病毒免疫应答的表观遗传调控及其机制,本研究首先以稳定表达HBV的人肝癌细胞株HepG2.2.15为模型,探索调控IFN抗病毒效应的表观遗传修饰酶。我们针对目前已经报道的编码所有表观遗传修饰的基因（共711个基因）进行高通量的RNA干扰筛选,并通过初步筛选和二次验证,发现组蛋白甲基转移酶SETD2的干扰显着减弱了 IFNα抗HBV的效应。即SETD2的干扰使IFNα作用下HepG2.2.15细胞内HBV拷贝数增加,HBsAg的分泌量增多。此外,在HBV急性感染的小鼠模型实验中发现,肝脏特异性敲除Setd2小鼠的血清中具有更高的HBsAg的分泌、其肝脏组织有更多的HBcAg的表达。进一步研究发现,在不携带病毒的肝细胞系中敲除或敲低SETD2显着地减弱了 IFNα诱导的STAT1磷酸化,并广泛地降低了ISG表达和IFNα抑制病毒（如HBV、VSV）复制的效应。随后进一步证明SETD2也能够促进Ⅱ型与Ⅲ型IFN的信号转导。上述结果表明,SETD2能够通过正向调控IFN信号转导,促进IFN的抗病毒效应。接着,我们对SETD2介导干扰素的抗病毒效应的分子机制展开研究。通过体内和体外的蛋白互作分析发现,含有SET结构域的SETD2截短体片段可以与STAT1发生直接的相互作用,并通过SET结构域发挥其甲基转移酶活性,催化STAT1的第525位赖氨酸发生单甲基化修饰（STAT1-K525mel）。同时,STAT1 K525的单甲基化修饰促进了 IFNα诱导的STAT1磷酸化激活,进而激活下游ISG的表达。此外,SETD2还可以选择性的催化一些ISG（如ISG15等）远端启动子区发生组蛋白H3K36me3的修饰从而直接促进这些基因转录活化,上调它们的表达。我们还通过RNA-seq鉴定到一个新的ISG——RARRES3,初步研究显示该基因具有显着的抗HBV复制的功能。总的来说,SETD2通过蛋白质翻译后修饰和表观遗传修饰这两种重要的调节方式正向调控IFN下游的信号传导,从而增强IFN介导的抗病毒效应。综上所述,本研究发现了甲基转移酶SETD2正向调控IFN信号的新功能,鉴定出IFN信号关键转录因子STAT1上一个能够增加其磷酸化激活的新的甲基化修饰位点——K525,同时揭示了 SETD2通过催化STAT1的甲基化修饰以及ISG基因远端启动子区的H3K36me3修饰以增强IFN信号以及抗病毒活性的新机制,从而进一步完善了IFN信号的调控网络,并为临床上研发新的抗病毒药物提供新的潜在的研究靶标。
张宇飞[5]（2016）在《绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中enJSRV囊膜蛋白的细胞生物学作用》文中指出研究背景：几乎所有哺乳动物的基因组中都包含有很大一部分内源性逆转录病毒（Endogenous retroviruses,ERVs）的基因组,而且这些ERVs在多个物种中发现。它们与胎盘发育的关系密不可分。在绵羊的基因组中至少包含有27株与外源绵羊肺腺瘤逆转录病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）相关的内源性逆转录病毒,这些内源性逆转录病毒被称作内源性绵羊肺腺瘤逆转录病毒（Endogenous jaagsiekte sheep retrovirus,enJSRVs）。JSRV是一个可以引起绵羊发生肺癌的致癌性逆转录病毒。enJSRVs已经被发现在绵羊的生理过程中扮演了重要角色,因为它们能够阻止JSRV的入侵和复制来保护绵羊免受JSRV的感染,另外enJSRVs在绵羊孕体的发育以及胎盘的形成过程中也发挥了重要的辅助作用。enJSRVs勺囊膜基因在雌性绵羊生殖道和孕体中大量表达,并且它们对孕体发育以及胎盘的形成至关重要。研究目的：在本研究中,我们将主要聚焦到enJSRVs囊膜蛋白在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞发育过程中的细胞生物学作用。同时我们进一步探讨在该领域现有的争议（滋养层细胞融合的机制）,并强调未来关于enJSRVs囊膜蛋白的研究方向。研究方法：1.本研究通过酶消化法分离原代绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞（The primary sheep trophoblast cells,STCs）,然后应用Percoll及免疫磁珠筛选的方法进行纯化STCs。将携带有人端粒酶逆转录酶（Human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因的真核表达质粒利用电转染的方法转染到纯化后的STCs内,来建立永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞（Immortalized sheep trophoblast cell line,hTERT-STCs）。2.本研究利用反转录PCR技术从STCs中扩增出完整的enJSRV-env基因及其受体Hyal2基因序列,并通过分子克隆的手段定向插入真核表达载体pEGFP-C1中。同时我们对STCs的电转染条件进行了优化以及STCs的电转效率进行了测定。针对enJSRV-env基因我们设计并构建了具有靶向关系的RNA干扰质粒。并将这些RNA干扰质粒转染到能稳定表达enJSRV-env基因的STCs中,然后通过荧光定量PCR以及Western blot的方法检测其干扰效率3.本研究将构建好的真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2分别通过电转染,转染到STCs中,在荧光显微镜下观察enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达情况。同时检测高表达enJSRV囊膜基因及通过RNA干扰沉默enJSRV囊膜基因对STCs的细胞融合活性、侵袭性、绒毛膜促性腺激素p亚基（Chorionic Gonadotrophin β-subunit,CG-β）.胎盘催乳素（Placental Lactogen,PL）分泌量的影响。4.本研究利用绵羊肺腺瘤病（Ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA）病羊肺组织的RNA通过反转录PCR技术克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因（exJSRV-env）,并将其通过分子克隆的手段插入真核表达载体pEGFP-C1中。构建好的pEGFP-C1/exJSRV-env真核表达质粒利用PCR、酶切和测序的方法进行鉴定。同时将exJSRV囊膜基因与enJSRV囊膜基因序列进行生物信息学对比分析。将重组质粒pEGFP-C1/exJ SRV-env通过脂质体法转入293T细胞内,观察exJSRV囊膜蛋白在293T细胞中的表达及定位的情况。同时将重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJSRV-env分别转染到NIH3T3细胞内,在显微镜下观察转染后的NIH3T3细胞是否产生转化灶。用软琼脂集落形成实验以及裸鼠致瘤实验分别来检测转染重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJSRV-env的NIH3T3细胞的生长状态。将处于对数生长期的转染重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJ SRV-env的NIH3T3细胞经胰酶消化后,按照每种细胞分别接种6只裸鼠。4周后断颈处死裸鼠,分离皮下肿瘤结节,同时进行石蜡包埋和HE染色。5.从自然感染OPA的绵羊病肺中提取高分子量DNA。同时将高分子量的基因组DNA利用XbaI消化。基因组DNA片段用两次CHEF凝胶电泳分离。通过电洗脱回收在10kb～40kb范围的DNA片段,连接到CopyControl pCC 1 BAC克隆载体上。连接反应结束后,将透析的连接产物利用基因脉冲XcellTM系统导入TransforMax EPI300感受态大肠杆菌中。最后,将大肠杆菌涂布在含有IPTG 100μg/mL.氯霉素12.5μg/mL和X-gal 40μg/mL的固体LB平板上并在37℃下孵育16 h。用无菌牙签挑取白色克隆放入含有80 mL LB培养基的96孔板中,在37℃下温育过夜直至培养液变浑浊。我们通过设计混合池系统并利用PCR的方法快速筛选,这样可以减少BAC文库的筛选工作量。利用特异性的gag,pro,pol和env的引物来筛选BAC文库中含有enJSRV基因组的BAC克隆。研究结果：1.本研究建立的hTERT-STCs能稳定表达hTERT基因,细胞连续传代一年并持续增殖无衰老的迹象。hTERT-STCs仍然拥有正常的STCs的生物学特性,如表达特定的细胞内标记物细胞角蛋白7（CK-7）、能分泌绵羊绒毛膜促性腺激素以及绵羊胎盘催乳素,并且持续表达enJSRVs囊膜基因。Transwell细胞侵袭性试验表明hTERT-STCs仍然拥有类似正常的原代绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的侵袭特性。hTERT-STCs仍具有接触抑制性,在软琼脂内不能生长,同时也没有裸鼠致瘤性。2.本研究成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2。研究发现绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞在脉冲电压150 V,脉冲时间5 ms,电击次数2次,间隔时间 50 ms时电转染效率最高。重组干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-1, pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-2,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-e nJSRV-env-3,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-4,pcDNA6.2-GW/ EmGFPmiR-Negative-shRNA构建成功。荧光定量RT-PCR检测结果发现,将正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量作为参照,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-Negative-shRNA组及各RNA干扰质粒组的enJ SRV-env mRNA相对表达量分别为0.985±0.015、0.581±0.006、0.179±0.037、0.346+0.034和0.403±0.044。Western blot结果发现,RNA干扰沉默enJSRV囊膜基因的enJSRV囊膜蛋白表达量与空白和阴性对照组比较显着下降。以上实验数据充分表明pcDNA6.2-GW/Em GFPmiR-enJSRV-env-2的干扰效率最强。3.本研究发现转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒后的STCs及共转染pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2后的STCs,发生细胞融合的几率增大,平均每个视野分别可以观察到增加了20.44%±7.79%和24.09%±10.65%个STCs。转染pEGFP-C1/enJSRV-env的STCs的侵袭性明显增强,转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR/enJRSV-env-shRNA-2干扰质粒的STCs侵袭性明显减弱。然而转染pEGFP-C1/enJSRV-env, pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR/enJRSV-env-shRNA-2质粒的STCs的CG、PL分泌量差异不显着。4.本研究结果发现pEGFP-C1/exJSRV-env真核重组质粒构建成功。通过对exJSRV ENV蛋白的氨基酸序列比对研究发现该ENV的CT区内包含有一个exJSRV特有的YXXM基序。通过对enJSRV ENV蛋白的氨基酸序列比对研究发现该ENV的CT区内没有YXXM基序。系统进化树分析发现我们得到的exJSRV-env基因属于exJSRV。利用生物信息学软件对比研究exJSRV囊膜蛋白与exJSRV囊膜蛋白质的理化性质、功能和结构。ExJSRV ENV的亚细胞定位研究发现大量ENV出现在细胞膜上。在NIH3T3细胞中转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒后,细胞可在软琼脂中生长并产生集落,同时没有了细胞接触抑制性,在裸鼠体内可以产生肿瘤块。这些结果充分表明exJSRV囊膜蛋白促使NIH3T3细胞恶性转化。然而在NIH3T3细胞中转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒后,细胞不能在软琼脂中产生集落,细胞保持接触抑制性,接种裸鼠体后不能产生肿瘤结节。说明exJSRV ENV不能促使NIH3T3细胞恶性转化。5.本研究成功构建了OPA病羊肺组织基因组BAC文库,OPA病羊肺组织基因组细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）文库有三个子文库（1：文库10K,2：文库25K,3：文库40K）构成,共含有106500个克隆。我们从OPA病羊肺组织基因组BAC文库中随机挑取了526个白色的BAC克隆鉴定插入片段大小,发现文库的空载率为0.38%,插入的DNA片段以20～25kb为主。同时建立了高效快速的PCR筛选系统。用4对enJSRV特异性的PCR引物进行文库筛选,并从OPA病羊肺组织基因组BAC文库中筛选得到了一株阳性的BAC克隆。结论：本研究中成功建立了hTERT-STCs细胞系,它可以作为细胞模型来研究胎盘绒毛膜滋养层细胞的分泌功能、侵袭性的特点以及enJSRVs囊膜基因可能的生物学功能。同时还成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env, pEGFP-C1/Hyal2以及 pEGFP-C1/exJSRV-env,筛选出干扰效率最强的干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-2。并首次发现enJSRV囊膜蛋白可以促进STCs发生细胞融合以及增强细胞侵袭性。另外我们成功构建了OPA病羊肺组织基因组BAC文库,并从OPA病羊肺组织基因组BAC文库中筛选得到了一株阳性的BAC克隆。
白荷露[6]（2011）在《慢病毒系统HBV基因可调控表达细胞模型的构建》文中指出乙型病毒性肝炎（hepatitis B, HB）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的世界范围内流行的一种严重危害人类健康的疾病。HBV感染后,有相当部分的患者最终将转化为慢性肝病,并发肝硬化和原发性肝癌。以往用于HBV研究的实验模型多为HepG2细胞,HCC组织及转基因动物等模型,这些模型中HBV DNA均已稳定的整合入肝细胞的基因组,是一种与宿主细胞静态相容的结果,不能反映病毒感染过程中细胞中动态变化过程,以作为观察研究病毒抗原与宿主互作的研究模型。为此我们选用四环素调控的慢病毒系统来实现乙肝病毒基因的可调控表达,通过人为的控制可观察不同时期细胞内的整体变化情况。研究中,我们构建了含有乙肝病毒基因（X, P, C, preC-C, S, preS2-S, PreS1-S2-S）的七种可诱导表达载体质粒,经鉴定DNA序列正确。利用慢病毒包装细胞系HEK293T细胞分别获得含有调控质粒pLVX-Tet-On和表达质粒pLVX-GOI的病毒颗粒,滴度达到可108LPs/ml。将这两种病毒共感染HepG2和L02细胞株,并利用双重抗生素筛选（G418和Puromycin）获得整合有目的基因的稳定细胞株。随后,对于构建的细胞株中目的基因的存在进行了鉴定,并对其中含有X和PreS1-S2-S的细胞株HepG2-X/LS诱导表达的RNA进行鉴定,证明获得可诱导表达的mRNA,进一步对X转基因细胞HepG2-X进行诱导产物X蛋白鉴定,证明获得了X蛋白可诱导表达的细胞株。HBV基因可调控细胞模型的构建,为进一步研究HBV各基因在对宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了理想的实验模型。
虞瑛姿[7]（2011）在《胞嘧啶脱氨酶APOBEC3DE和APOBEC3B对乙型肝炎病毒抑制研究》文中研究说明慢性乙肝病毒（HBV）的感染是个全球性的健康卫生问题,世界卫生组织（WHO）统计全球有近4亿人为慢性乙肝病毒携带者,许多慢性HBV感染者最终发生严重的肝脏疾病包括慢性肝炎、肝硬变和肝细胞肝癌,这些疾病每年导致约近一百万人死亡。APOBEC3s具有针对多种逆转录病毒和内源性逆转录元件的强大的天然免疫功能,近年来陆续有报道多个APOBEC3s蛋白具有抑制HBV复制的作用,并且其表达能被IFN、IL-2和TNF等细胞因子诱导,并且有报道APOBEC3s对HBV的抑制作用并不完全依赖于脱氨酶活性。本课题组早期研究发现A3B能抑制HBV s基因启动子的活性并能通过与hnRNPK的结合抑制HBV的复制。综合先前的研究,我们用多种分子生物学技术探究A3DE对HBV是否具有抑制作用；该抑制作用是否依赖于脱氨酶活性；其表达能否被细胞因子诱导上调;并对A3B对HBV的抑制机制作补充。本研究分为以下三个部分：第一部分体外细胞系中APOBEC3DE对HBV的抑制作用及其机制研究本部分旨在了解APOBEC3s家族中哪些成员对HBV HBsAg和HBeAg水平具有抑制作用,同时对被选出的A3DE进一步探索其抑制HBV的作用机制。我们做了APOBEC3s蛋白对HBV HBsAg和HBeAg表达水平的影响的一系列研究。通过体外瞬时共转染实验,分别将HBV表达质粒与A3s真核表达质粒或对照空载体pcDNA3.1共转染人肝癌细胞系HepG2中,应用电化学发光法（ECLIA）测定转染48h后细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示,A3B和A3DE对HBsAg和HBeAg的抑制作用最为显着,HBsAg和HBeAg的表达分别为对照组的18.48%±1.88%和28.37%±1.18%以及11.06%±0.44%和22.87%±0.9%；与A3B和A3DE相比,A3F.A3G和A3H对转染后HepG2细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平的抑制作用要弱得多,分别为对照组的39.53±5.97%和40.44%±1.05%,44.34±3.23%和52.74%±0.81%以及65.52±11.96%和57.1%±5.72%；A3A对HBsAg和HBeAg抑制作用很弱,为86.38±7.38%和91.82%±4.94%；而A3C对其无抑制作用,两蛋白表达水平分别为110.4±5.3%和91.82±4.94%。我们用PCR突变技术构建了A3DE酶活性中心的点突变体,以观察A3DE对HBV HBsAg和HBeAg表达抑制是否依赖于脱氨酶活性,结果显示A3DE对其的抑制并未受到酶活性中心突变的影响。进一步分析A3DE及其三个突变体对HIV-1病毒感染力的影响,与HBV不同的是,A3DE对Vif缺陷的HIV-1病毒感染力为对照组的2.94%±0.12%,而E80K、E80/264K和E264K分别为42.84%±6.78%,38.76%±8.92%和13.59%±3.12%,即对HIV-1感染率的抑制分别下降了大约39%,35%和10%,并且只有野生型A3DE包被在人HIV-1病毒中。为揭示A3DE能否抑制HBV基因表达,我们分析了上述转染细胞中HBV s基因的mRNA表达。提取上述共转染48h后HepG2细胞总RNA,通过半定量RT-PCR方法检测HBV s基因的mRNA水平,结果显示,共转染A3DE和HBV表达质粒的HepG2细胞中s基因mRNA水平与对照相比明显降低,提示A3DE能抑制s基因mRNA的表达。并且其突变体也能抑制其表达，上述两个结果表明A3DE既能抑制HBsAg蛋白的表达,又能抑制s基因mRNA表达。接着观察A3DE蛋白对HBV core DNA合成的影响。将HBV质粒与A3DE表达载体或对照空载体VR1012共转染HepG2细胞,提取和纯化转染48h后细胞内的HBV core相关DNA,并应用定量PCR方法对其定量,用3D-PCR技术检测A3DE能否突变HBV基因组。结果显示A3DE不能抑制HBV core相关DNA的合成,但是能突变HBV X基因DNA。第二部分A3DE在细胞内的表达及其调控研究这部分研究检测了A3DE在外周血单个核细胞、多株人肝细胞系和白血病细胞系、及肝组织中的表达情况,观察IFN和TNF刺激对A3DE表达的影响,旨在揭示ADE在体内表达的调控和作用。应用半定量RT-PCR方法检测了原代标本和细胞系A3DE的表达情况。7例健康成人外周血单个核白细胞中均有A3DE表达。表达存在着个体差异,其中有一例标本A3DE的表达呈较低水平,其余6例表达较强。HepG2.2.15由HepG2细胞稳定转染HBV表达质粒构建而成,前者的A3DE表达高于后者约1.5倍,这表明HBV的感染激发了细胞内A3DE的增高。在5株肝细胞肝癌细胞系和2株人正常肝细胞系中,A3DE有一定的表达,其中Huh-7细胞中的A3DE表达相对最高,但是这些细胞系细胞中的本底表达并不高,远远不及外周血单个核细胞。但人白血病细胞系中A3DE的表达水平不低于外周血单个核细胞。为探讨A3DE在肝组织中的表达我们分析了16对配对人肝癌和癌旁肝组织中A3DE基因的表达情况。结果显示在16对肝癌或癌旁组织中均有A3DE的表达,表达水平各有高低,对A3DE与GAPDH电泳条带的灰度比值进行统计分析发现肝癌和癌旁A3DE的表达并无统计学差异（P=0.1219）。接着检测了IFN和TNF刺激肝细胞系对A3DE表达的效应。结果显示4株人肝细胞肝癌细胞系和1株人正常肝细胞系细胞中的A3DE表达均能被IFN和TNF上调,以QGY-7703的上调最为显着,不同细胞株上调的程度和时间点的持续各有不同。综合第一二部分结果我们认为A3DE具有抗HBV复制能力,其表达和调控对HBV感染的预后和治疗有积极的提示意义。第三部分A3B对HBV复制的抑制不依赖于N端和C端的胞嘧啶脱氨酶本部分的实验方法与第一部分类似。我们先前研究发现A3B能抑制HBV s基因的启动子活性并能通过与hnRNPK的结合来抑制HBV Enh II的作用,为进一步补充其抑制机制,构建了A3B两端的酶活性中心点突变体,用共转染和免疫沉淀技术验证A3B酶活性失活后仍能抑制HBV复制并与hnRNP K的结合不受影响。实验结果显示,以对照组中HBsAg和HBeAg的表达为100%, A3B、C100S、C289S和C100/289S中HBsAg的表达分别为对照组的18.98%±1.81%、17%±0.84%、20.89%±0.65%和19.39%±1.22%；HBeAg的表达为对照组的30%±2.8%27.45%±0.58%、33.05%±±2.54%和32.39%±±4.24%,突变体对HBV的抑制并不低于野生型A3B。通过RT-PCR方法检测HBVs基因mRNA水平,与对照相比,A3B和其突变体的HepG2细胞中的s基因mRNA水平明显降低。最后免疫共沉淀（IP）方法证实A3B三个突变体蛋白与野生型A3B相比,与hnRNP K的结合能力未受影响。这部分实验进一步证实了脱氨基作用并非A3B抑制HBV复制的主要手段,为APOBEC3s抑制HBV研究提供了新的方向。综合前两部分研究得出结论：A3DE具有不依赖于胞嘧啶脱氨酶活性的强大的抗HBV复制的能力；与A3B不同,A3DE的表达与人肝细胞肝癌发生无关,其表达能被IFN和TNF等细胞因子诱导上调；A3B和A3DE对HBV复制的抑制都不依赖于两端的脱氨酶活性,说明脱氨基作用并非A3B和A3DE抑制HBV的主要手段;这些结果为APOBEC3s蛋白抗HBV病毒机制研究提供了新的思路并为人类乙型肝炎病毒的治疗提供了新的方向。
蒲春文[8]（2011）在《优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究》文中提出RNA干扰为治疗人类疾病提供了一个很有前景的方法。前期已有一些学者对于RNAi抗HBV做过研究,但是每个研究小组设计的siRNA分子对病毒的抑制效果有明显的差异,因此还需在HBV的干扰靶点上做大量的工作；另外大多研究进行的都是siRNA的瞬时转染,未构建稳定的转染体系,不能观察清除HBV RNA的远期效果；目前临床应用的抗病毒药物也都需要进行长期治疗,包括干扰素、核苷酸类似物,RNA干扰的作用亦需持久。病毒基因突变是RNA干扰抗病毒失败的重要原因,针对病毒可逃逸RNAi作用的特点,我们设计了可在体内同时表达两个microRNA,靶向不同位点的串联序列amiRNA。即便是病毒一个基因位点的突变就可以逃逸siRNA,而并不能逃逸miRNA的干扰作用。miRNA在体内之所以能广泛存在并发挥作用,是因为它的特点是只要骨架与靶RNA相同,单一一个位点的变化不会影响其发挥作用。目前对于乙肝病毒的研究已从最初的化学合成siRNA、shRNA质粒载体等向应用性较强的microRNA的研究过渡。尽管有学者用化学合成的多个siRNA同时作用于一个细胞,证实了靶向多个区域基因的可行性,但其为剂量依赖性的,需经常向体内注入siRNA。通过质粒等载体在细胞内表达miRNA或siRNA不仅经济方便,还可进行稳定转染,使小干扰RNA持续表达,延长对目的基因的抑制时间。质粒载体能介导更长期的干扰效果,而过多的质粒载体可能对细胞造成一定的影响。串联序列表达载体的优点就在于只需导入一个质粒载体就可发挥作用。amiRNA使得导入的外源性基因在体内自然形成miRNA成为可能,并可同时表达多条miRNA。有学者利用polⅡ启动子表达多个串联的shRNAs,从而抑制了多个基因的表达,其对应蛋白的表达都有明显降低。但有研究提出siRNA可诱导IFN反应,从而存在一些安全性问题。相对于siRNA,由polⅡ启动子介导的amiRNA技术被证实不会引起宿主的免疫反应,亦没对miRNA的内源性途径产生影响,安全有效。有研究采用该种方法将2个串联序列amiRNA导入细胞,但未取得更好的干扰效果,可能是因为并没有找到最佳的干扰序列。另外,关于串联序列amiRNA在HBV DNA水平的干扰效果,尤其是cccDNA方面的干扰效率未见报道。HBV是一个DNA病毒,但必须经过前基因组RNA进行逆转录,使得RNA干扰得以发挥作用,临床中HBV DNA的检测更为实用。cccDNA是HBV的源泉,使得对它的观察更为重要。因为其半衰期较长,所以稳定转染更能接近临床研究情况。目的：本文结合以往研究的经验,针对HBV容易变异的特点,力图寻找针对HBV基因组保守区域的多个有效干扰位点；将构建的质粒瞬时转染入HepG2.2.15,检测各个序列在RNA水平对HBV的干扰效率；挑选干扰效果好的序列,优化设计并构建针对不同位点的串联序列amiRNA表达载体；通过瞬时转染和稳定筛选,全面研究单一序列及串联序列amiRNA表达载体在抑制HBV RNA、DNA和蛋白质表达及cccDNA方面的效果。方法：1.针对病毒容易变异而逃逸RNAi作用的特点,我们首先利用生物信息学软件找到不同基因型HBV基因的保守区域,避开临床常见的病毒变异位点选取4个HBV的RNAi靶位点,分别靶向HBV的S区或X区。2.利用microRNA设计软件,设计4条microRNA序列,并构建四个以CMV为启动子的内源性miR155为骨架的amiRNA表达质粒,分别命名为amiHBV-1、amiHBV-2、amiHBV-3和amiHBV-4。3.将构建成功的4个amiHBV表达载体分别瞬时转染到含有HBV-DNA全基因的人肝母细胞瘤HepG2.2.15细胞株,从mRNA水平研究单一序列amiHBV对HBV mRNA干扰效果,筛选干扰效率高的amiRNA序列,将其中2条干扰效率较高的单一序列串联,构建串联序列amiRNA表达质粒（amiHBV-3-4）。4.将串联序列amiHBV表达质粒瞬时转染入HepG2.2.15细胞,因为ami-HBVI和ami-HBV2在HBV mRNA水平的抑制效率低,在下一步的实验中将其舍去。采用实时定量荧光PCR法分别检测细胞培养上清液和细胞内的HBV DNA；采用CMIA法（Chemiluminescent Microparticle Immunoassay）定量检测分泌蛋白HBsAg和HBeAg的水平变化。5.通过转染后稳定细胞株的筛选,建立amiRNA稳定转染的HepG2.2.15细胞株,采用荧光实时定量检测试剂盒,对amiRNA干扰HBV的复制根源cccDNA的效果进行了研究。结果1.本研究中4个不同靶位的amiRNA载体被构建,4个单一序列及1条串联序列amiHBV表达载体均经测序验证构建成功。2.4个单一序列amiHBV表达质粒以amiHBV-4对HBV mRNA的抑制率最高可达75.6%, amiHBV-3对HBV mRNA的抑制率为61.2%；而amiHBV-1和amiHBV-2对HBVmRNA的抑制率仅为29.3%及14.9%；其中串联序列amiHBV 3-4的干扰效率为87.2%,串联序列组的干扰效率高于单一序列组。3.各组质粒对培养细胞上清中HBV DNA的干扰效率以串联序列质粒组最高可达到94.3%,单一序列组中干扰效率最高的分别为amiHBV-3组60.5%和amiHBV-4组68.0%。对细胞内HBV DNA的干扰效率amiHBV-3组、amiHBV-4组和amiHBV 3-4组分别为71.6%、80.2%和79.7%。4.在转染后72h对细胞上清中HBsAg的抑制效果最好的为串联序列组达到67.4%,其次为amiHBV-4组达到64.6%,再次为amiHBV-3组。对HBeAg的抑制总体效果不及对HBsAg的抑制效果好,串联序列组抑制效果最好,但也只达到了31%。稳定转染后两组（amiHBV 3-4和amiHBV-4）对HBsAg和HBeAg的分泌,均显示了显着的抑制效果。对HBsAg的抑制率最高达97.18%,对HBeAg的抑制率最高达97.00%。5.对HBV cccDNA的干扰情况进行了研究,瞬时转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为21.9%,串联序列amiHBV3-4组的抑制率（58.4%）明显高于单一序列组。稳定转染后串联序列组HBV cccDNA的抑制率为99.65%,单一序列组的抑制率为93.78%。结论：1.分别靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp位点的单一序列amiRNA对HBV RNA、DNA和表面抗原（HBsAg）均有显着的干扰效果。2.同时靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp两个位点的串联序列amiRNA对HBV RNA、DNA和HBsAg的干扰效果均显着优于单一序列HBVamiRNA的干扰效果。3.瞬时转染靶向HBV S区的串联序列amiRNA对HBsAg的抑制效果显着,对HBeAg的抑制不明显；稳定转染串联序列amiRNA对HBsAg和HBeAg均有显着的抑制效果。4.稳定转染的单一序列或串联序列amiRNA对HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果均优于瞬时转染的抑制效果。5.针对HBV S区基因的单一序列或串联序列amiRNA对HBV RNA、表面抗原（HBsAg）、DNA及cccDNA均有较好的干扰效果,提示HBV S区基因是RNA干扰的有效靶点之一。6.串联序列amiRNA介导的RNA干扰机制能极大程度的抑制HBV的复制、病毒蛋白的表达及复制根源cccDNA。7.本研究串联两个靶位点的amiRNA表达质粒构建成功并显示高效的抗病毒功能,提示针对多个靶基因或靶位点的amiRNA载体的构建和功能的实现具有可行性。
丁睿[9]（2010）在《Id-1与HBx在乙肝相关性肝癌成瘤过程中相互作用的研究》文中提出【背景】原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球发病率第五位的常见恶性肿瘤。在亚洲和大洋洲国家,特别是中国大陆,肝癌发病的主要诱因是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B,HBV）感染。对肝癌的早期诊断是提高肝癌患者疗效和预后的关键。目前包括肝癌切除术和肝移植在内的外科手术疗法仍是治疗早期肝癌的首选。然而,只有不到30%的患者能够在早期被诊断出肝癌并接受合适的治疗,大多数进展期患者由于治疗不及时而无法获得较理想的预后。由于我国众多的乙肝病毒携带者是肝癌的危险人群,更要求我们在早期发现并预测肝癌方面进行的研究,以期获得更好的肝癌的肿瘤标记物和预测因子。乙肝病毒感染在肝癌的发病过程中起到了重要作用,在中国大陆,约80%以上的肝癌患者伴随着慢性乙肝病毒的感染。即便是HBV的隐匿性感染者,甚至是乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）在体内已被廓清后的曾经感染者,其肝癌的发病风险仍高于普通人群。乙肝病毒可以整合入宿主基因组,并直接或间接的促进肝癌的发生。在这个过程中,乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx protein）起到了重要的促进作用。HBx是由HBV-DNA中最短的开放读取框所编码的。它增强了HBV的转录,并激活了癌基因、细胞因子和生长因子等不同细胞的基因转录过程。HBx和其它多种因子如p53、DDB1、Caspase3和蛋白酶体亚单位等相互作用,促进细胞转化。在肝癌患者血清和肝癌组织中均可检测到高水平HBxAg和抗-HBx的表达。Id蛋白即分化抑制蛋白或DNA结合抑制蛋白（Inhibitor of Differentiation and/or DNA-binding Protein）。由于Id蛋白缺少DNA结合结构域,它与其它碱性螺旋-环-螺旋转录因子（bHLH）结合后可形成没有DNA结合能力的异二聚体,起到了负性调节作用。作为Id蛋白家族的一员,Id-1在细胞分化过程中起到了重要的作用,它在包括肝癌在内的多种人类肿瘤中高表达。不受控制的Id-1蛋白表达将促进肿瘤细胞增殖、分化抑制、并刺激肿瘤血管生成及诱发基因组失稳。Id-1表达水平往往和肿瘤的高侵袭性、去分化程度和较差的临床预后相关。高表达的Id-1可以介导肝癌细胞的增殖,并且可成为预测慢性肝炎肝硬化患者肝癌发生风险的指标。Id-1可能在肝癌形成过程中的发挥重要作用,而它与HBV之间的关系值得进一步深入研究。【目的】（1）检测Id-1和HBx蛋白在乙肝相关性肝癌组织中的表达情况。（2）分析乙肝相关性肝癌患者临床病理学特征与Id-1及HBx蛋白表达水平的相关性。（3）检测Id-1和HBx在肝癌细胞中的共定位情况。（4）检测HBx对肝癌细胞系中Id-1表达水平的影响。（5）构建人Id-1干扰慢病毒载体。（6）人Id-1干扰慢病毒载体对肝癌HepG2细胞的感染验证。【方法】（1）对获得的96例乙肝相关性肝癌标本进行免疫组化染色,并对Id-1和HBx蛋白的染色结果进行分级。（2）借助SPSS软件,统计学分析Id-1和HBx的蛋白表达水平与肝癌临床病理学特征间的相关性以及Id-1的表达强度和乙肝相关性肝癌患者预后之间的关系。（3）用激光共聚焦免疫荧光染色法研究Id-1和HBx在肝癌细胞中的共定位情况。（4）Realtime-PCR和Western Blot分别检测Id-1 mRNA和蛋白在肝癌细胞系HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721、FHCC98和肝细胞系HL7702中的表达情况。（5）Realtime-PCR和Western Blot检测Id-1蛋白在转染入HBx的肝癌HepG2-X和转染空质粒的HepG2-PC细胞内的表达情况。（6）采用荧光素酶报告基因系统检测Id-1启动子序列在HepG2-X和HepG2-PC细胞内的表达情况。（7）筛选获得效率最高的Id-1 RNA干扰序列并构建人Id-1干扰慢病毒载体。（8）验证人Id-1干扰慢病毒载体对HepG2细胞中Id-1的沉默效果。【结果】（1）免疫组化染色发现,在96例乙肝相关性肝癌标本中,Id-1高表达率为64.6%,HBx的高表达率为74.0%。且Id-1的表达强度与HBx的表达强度正相关。（2）Id-1高表达水平与患者的血清高HBsAg水平、较差的肿瘤分化程度、门静脉侵犯、淋巴结转移及Child B/C级之间关系有统计学意义;Id-1高表达组的无瘤生存率和总生存率均较Id-1低表达组更差。（3）成对免疫组化染色和激光共聚焦免疫荧光染色发现Id-1和HBx在肝癌细胞中存在共定位现象,二者主要表达在细胞质和细胞核中。（4）经Realtime-PCR和Western Blot发现Id-1的mRNA和蛋白水平的表达强度在肝癌细胞系HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721和FHCC98中均显着高于肝细胞系HL7702。（5）在肝癌HepG2-X中,Id-1的mRNA和蛋白表达强度均高于转染空质粒的HepG2-PC细胞。（6）报告基因检测发现在HepG2-X细胞中被激活的Id-1启动子的表达强度高于HepG2-PC细胞。（7）成功筛选并构建了人Id-1干扰慢病毒载体Id1-RNAi-LV,经鉴定病毒滴度为2.0×10E9 TU/mL;在HepG2细胞中,该载体对HepG2细胞中Id-1的mRNA和蛋白的表达均有明显抑制效果,抑制效率为61.2%。【结论】（1）乙肝相关性肝癌标本中,Id-1和HBx均有表达,并且二者存在共定位现象。（2）Id-1蛋白的表达水平与乙肝相关性肝癌患者血清HBsAg水平、肿瘤分化程度、门静脉侵犯、淋巴结转移及Child分级等肿瘤恶性表型相关;Id-1高表达组患者有较差的预后。（3）Id-1在多种肝癌细胞系中均有表达,且其表达强度高于正常肝细胞系。（4）被转染入HepG2细胞中HBx,可提高Id-1启动子活性并使Id-1在mRNA及蛋白水平表达升高。（5）成功构建了Id-1干扰慢病毒载体Id1-RNAi-LV,并对肝癌HepG2细胞系中的Id-1基因有mRNA和蛋白水平的沉默效果。（6）综上Id-1可以作为乙肝相关性肝癌患者一个有用的预后指标。乙肝相关性肝癌标本中高表达的Id-1至少部分的受HBx表达所影响。构建成功的人Id-1干扰慢病毒载体可用于对Id-1参与肝癌机制的进一步研究,并可能成为新的治疗肝癌的分子靶向。
高波,段志坚,徐薇,熊思东[10]（2009）在《固有免疫分子TRIM5α对乙型肝炎病毒复制的影响》文中研究表明目的:构建固有免疫分子TRIM5α的真核表达质粒,研究TRIM5α对HBV复制的影响。方法:通过巢氏RT-PCR技术从恒河猴肺组织中扩增出TRIM5α的编码基因,并将其克隆入pcDNA3.1真核表达载体。将TRIM5α真核表达质粒转染HepG2细胞,用Western blot的方法鉴定TRIM5α蛋白表达情况。将TRIM5α真核表达质粒与复制型HBV质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HepG2细胞、通过尾静脉高压注射法共转染BALB/c小鼠。ELISA检测转染细胞上清及小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;免疫组化检测小鼠肝组织HBcAg的表达;Southern blot检测转染细胞中HBV复制中间体。将TRIM5α真核表达质粒转染293T细胞3小时后,再将基于HIV-1结构的慢病毒载体三质粒系统转染293T细胞,通过检测转染细胞上清中的HIV-1 p24抗原含量来鉴定TRIM5α抗HIV-1功能。结果:成功构建TRIM5α真核表达质粒;过表达TRIM5α不能有效降低HBV抗原和复制中间体水平,但可抑制HIV-1 p24抗原的表达。结论:TRIM5α不能有效抑制HBV的复制。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 引言(研究背景、内容与目的) |
| 第一部分 HBV阳性的HCC组织及细胞系中miR-520e、EphA2的水平变化 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 miR-520e靶向调控EphA2的验证 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 miR-520e靶向调控EphA2在HBV相关HCC中的作用及机制探讨 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 摘要 |
| Abstract |
| Abbreviations |
| 第一章 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒概述 |
| 1.1 HBV病毒结构与基因组 |
| 1.2 HBV生活史和cccDNA |
| 1.3 HBV流行病学分析 |
| 1.4 HBV病毒蛋白 |
| 2 HBV的体外模型 |
| 2.1 原代肝细胞 |
| 2.2 HepRG |
| 2.3 肝癌细胞系 |
| 2.4 表达NTCP的肝癌细胞 |
| 3 HBV的小鼠模型 |
| 3.1 HBV复制小鼠模型 |
| 3.2 小鼠感染模型 |
| 4 TRIM家族在抗病毒先天免疫中的作用 |
| 4.1 TRIM蛋白的结构 |
| 4.2 TRIM蛋白调节先天免疫信号 |
| 4.3 TRIM蛋白的直接抗病毒作用 |
| 4.4 TRIM14蛋白在抗病毒免疫中的作用 |
| 5 本研究的目的及意义及思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 主要实验设备 |
| 2 质粒、菌株、细胞株和实验动物 |
| 2.1 实验中用到的E.coli菌株 |
| 2.2 实验中需要的质粒 |
| 2.3 实验细胞株 |
| 2.4 实验动物 |
| 3 试剂 |
| 3.1 分子克隆实验试剂 |
| 3.2 细胞生物学实验试剂 |
| 3.3 酶标抗体及显色底物 |
| 4 实验室配制溶液和培养基 |
| 4.1 分子克隆实验常用溶液 |
| 4.2 细胞生物学常用溶液配置 |
| 4.3 Southern Blot及Northern Blot实酴用溶液 |
| 4.4 Western Blot实验检测溶液 |
| 4.5 酶联免疫实验检测用溶液 |
| 4.6 其他溶液 |
| 5 实验方法 |
| 5.1 分子克隆实验 |
| 5.2 细胞生物学实验方法 |
| 5.3 免疫学实验 |
| 5.4 小鼠实验操作 |
| 第三章: 结果与分析 |
| 1 TRIM14在体外细胞乙肝模型中对HBV的抑制作用 |
| 1.1 TRIM家族蛋白对HBV的抑制作用 |
| 1.2 TRIM14在HepG2细胞中的抗HBV作用 |
| 1.3 TRIM14的敲低增强HBV表达 |
| 1.4 TRIM14在细胞感染模型中对HBV的抑制作用 |
| 1.5 第一部分小结 |
| 2 TRIM14蛋白在尾静脉高压注射小鼠模型中对HBV的抑制作用 |
| 2.1 TRIM14对小鼠血清中HBV病毒学指标的抑制 |
| 2.2 TRIM14对肝脏中 HBV的抑制 |
| 2.3 第二部分小结 |
| 3 TRIM14抑制HBV的机制研究 |
| 3.1 TRIM14对HBV C启动子和S启动子的抑制作用 |
| 3.2 TRIM14促进细胞中Ⅰ型干扰素的应答 |
| 3.3 TRIM14促进细胞中NF-κB信号通路 |
| 3.4 TRIM14对HBV的抑制不依赖于HBx |
| 3.5 TRIM14的抗HBV作用依赖于PRYSPRY结构域 |
| 3.6 第三部分小结 |
| 第四章: 讨论 |
| 1 先天免疫及固有免疫分子在抵抗HBV感染中发挥关键作用 |
| 2 固有免疫分子TRIM14对HBV具有显着抑制效果 |
| 3 TRIM14抗HBV的机制 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB概述 |
| 1.1.1 NF-κB介绍 |
| 1.1.2 NF-κB与癌症 |
| 1.2 启动子改造及人工合成启动子 |
| 1.2.1 真核启动子改造 |
| 1.2.2 人工合成启动子 |
| 1.2.3 CMV启动子简介 |
| 1.3 肿瘤治疗 |
| 1.3.1 肿瘤的基因治疗 |
| 1.3.2 肿瘤的免疫治疗 |
| 1.3.3 rAAV病毒载体 |
| 1.4 研究内容和意义 |
| 第二章 基于NF-κB的高活性真核启动子研制及其应用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料及仪器 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 启动子的改造 |
| 2.2.4 质粒的构建 |
| 2.2.5 用细胞内表达报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.6 用单分泌报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.7 用双分泌报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.8 用EGFP报告基因检测启动子活性 |
| 2.2.9 评估NF-κB对启动子活性的影响 |
| 2.2.10 启动子应用于分泌型hG-CSF蛋白的表达 |
| 2.2.11 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 HepG2和CHO细胞中突变启动子的初步改造与活性检测 |
| 2.3.2 HepG2和CHO细胞中突变启动子的深入改造和活性检测 |
| 2.3.3 用EGFP报告基因检测启动子活性 |
| 2.3.4 检测启动子的NF-κB特异性调控 |
| 2.3.5 多种细胞检测优化启动子的表达效果 |
| 2.3.6 改造启动子应用于分泌型hG-CSF蛋白的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 新型NF-κB活性抑制基因载体的构建及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂材料及仪器 |
| 3.2.2 细胞培养和转染 |
| 3.2.3 NF-κB特异性启动子表达检测 |
| 3.2.4 NF-κB特异性表达系统报告基因质粒构建 |
| 3.2.5 NF-κB靶向性miRNA表达质粒构建和筛选检测 |
| 3.2.6 构建并评估NF-κB自调控miRNA表达载体 |
| 3.2.7 荧光定量检测RelA及其靶基因的表达 |
| 3.2.8 自调控系统对细胞活力影响检测 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 NF-κB特异性启动子表达效果检测 |
| 3.3.2 DMP-amiRNA原理示意图 |
| 3.3.3 靶向于NF-κB的miRNA筛选检测 |
| 3.3.4 DMP-miRNA抑制NF-κB活性效果检测 |
| 3.3.5 DMP-amiRNA对RelA及其靶基因的调控效果检测 |
| 3.3.6 DMP-amiRNA系统对细胞活力的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因载体构建及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂材料及仪器 |
| 4.2.2 细胞培养及转染 |
| 4.2.3 质粒构建 |
| 4.2.4 分析NF-κB RelA/p65 在多个细胞中的表达水平 |
| 4.2.5 使用EGFP报告基因评估表达载体 |
| 4.2.6 使用SBP报告基因评估表达载体 |
| 4.2.7 重组AAV病毒的制备 |
| 4.2.8 重组病毒在细胞中的表达检测 |
| 4.2.9 评估重组病毒的抗肿瘤功能 |
| 4.2.10 用qPCR检测病毒分布和抗原基因表达 |
| 4.2.11 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 NF-κB依赖性肿瘤免疫疗法原理 |
| 4.3.2 NF-κB RelA/p65 在各种细胞中的表达 |
| 4.3.3 使用EGFP报告基因检测表达载体 |
| 4.3.4 使用SBP作为报告基因检测表达载体 |
| 4.3.5 重组病毒载体的构建及表达检测 |
| 4.3.6 DMP活性基因表达系统在体内的癌症治疗 |
| 4.3.7 检测小鼠不同组织中病毒分布和抗原基因 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 序言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 高通量筛选体系的建立 |
| 3.2 高通量筛选调节IFNα抗HBV感染的表观修饰酶 |
| 3.3 SETD2促进IFNα的抗HBV效应 |
| 3.4 SETD2通过其甲基转移酶活性促进IFN信号活化 |
| 3.5 SETD2调节IFNα的抗病毒反应具有广泛性 |
| 3.6 SETD2促进三种亚型的IFN信号下游STATl的磷酸化以及ISG的表达 |
| 3.7 SETD2通过其甲基转移酶活性促进STAT1发生单甲基化修饰 |
| 3.8 SETD2通过SET结构域与STAT1直接相互作用 |
| 3.9 STATl赖氨酸甲基化修饰位点的鉴定 |
| 3.10 STAT1的磷酸化及转录活性依赖于K525甲基化修饰 |
| 3.11 SETD2催化STATl发生K525位点的甲基化修饰 |
| 3.12 SETD2选择性地催化部分ISGs基因区发生H3K36me3修饰从而促进转录 |
| 3.13 RARRES3是一种具有抑制HBV复制功能新的ISG |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 综述: Ⅰ型干扰素信号通路调控的分子机制 |
| 1 干扰素概述 |
| 1.1 干扰素及其产生 |
| 1.2 经典的IFN-Ⅰ信号转导 |
| 1.3 非经典的IFN-Ⅰ信号转导 |
| 2 IFN的功能 |
| 3 干扰素信号转导的分子调控机制 |
| 4 IFN信号转导的蛋白质翻译后修饰调节 |
| 4.1 磷酸化 |
| 4.2 泛素化 |
| 4.3 类泛素化修饰 |
| 4.4 乙酰化 |
| 4.5 甲基化 |
| 5 IFN信号转导的表观修饰调节 |
| 5.1 组蛋白修饰 |
| 5.2 染色质重塑 |
| 5.3 DNA甲基化 |
| 5.4 非编码RNA |
| 6 IFN-Ⅰ信号转导的失调与疾病的发生发展 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 作者筒历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 逆转录病毒 |
| 1.1.1 逆转录病毒基因组和基因产物 |
| 1.1.2 逆转录病毒生活史 |
| 1.2 外源性和内源性逆转录病毒的分类 |
| 1.3 外源性逆转录病毒 |
| 1.4 外源性绵羊肺腺瘤病毒 |
| 1.4.1 绵羊肺腺瘤病的概述 |
| 1.4.2 绵羊肺腺瘤病的发病机理 |
| 1.5 内源性逆转录病毒 |
| 1.5.1 内源性逆转录病毒的形成和灭亡 |
| 1.5.2 内源性逆转录病毒在宿主中的作用 |
| 1.5.3 内源性逆转录病毒囊膜蛋白与哺乳动物胎盘 |
| 1.5.4 内源性逆转录病毒囊膜蛋白在胎盘中可能的作用 |
| 1.6 内源性绵羊肺腺瘤病毒 |
| 1.6.1 内源性绵羊肺腺瘤病毒的表达模式 |
| 1.6.2 内源性绵羊肺腺瘤病毒抵抗外源性绵羊肺腺瘤病毒的感染 |
| 1.6.3 内源性绵羊肺腺瘤病毒与宿主共进化 |
| 1.6.4 内源性绵羊肺腺瘤病毒与绵羊胎盘的形成 |
| 1.7 细胞永生化 |
| 1.7.1 端粒和端粒酶 |
| 1.7.2 端粒酶与细胞永生化 |
| 1.7.3 滋养层细胞永生化 |
| 1.8 细菌人工染色体基因组文库概述 |
| 1.8.1 BAC文库的构建 |
| 1.8.2 外源性绵羊肺腺瘤病毒与绵羊基因组文库 |
| 1.8.3 内源性绵羊肺腺瘤病毒与绵羊基因组文库 |
| 1.9 研究的目的及意义 |
| 2 试验一 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞系的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物及主要试剂 |
| 2.1.2 试验所用溶液及其配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 质粒和细胞系 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的分离及培养 |
| 2.2.2 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的鉴定 |
| 2.2.3 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞电转染条件的测定 |
| 2.2.4 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞耐受新霉素(G418)的最低浓度 |
| 2.2.5 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的永生化 |
| 2.2.6 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的基因表达模式 |
| 2.2.7 永生化的绵羊胎盘滋养层细胞的生物学特性分析 |
| 2.2.8 永生化的绵羊胎盘滋养层细胞转化特征的检测 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 酶消化法分离的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞 |
| 2.3.2 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的最佳电转染条件 |
| 2.3.3 新霉素(G418)的最佳筛选浓度 |
| 2.3.4 阳性细胞克隆群的扩大培养 |
| 2.3.5 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞形态学特点 |
| 2.3.6 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞鉴定结果 |
| 2.3.7 hTERT基因在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中稳定表达 |
| 2.3.8 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的生长特性 |
| 2.3.9 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞可以分泌激素 |
| 2.3.10 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞可以表达enJSRV-env基因 |
| 2.3.11 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞具有侵袭性 |
| 2.3.12 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞没有发生转化 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二 enJSRV-env基因的克隆、真核表达质粒的构建及其shRNA真核表达质粒的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验动物及主要试剂 |
| 3.1.2 试验所用溶液及其配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 质粒和细胞系 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养 |
| 3.2.3 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞总RNA的提取 |
| 3.2.4 目的基因的扩增 |
| 3.2.5 enJSRV-env基因的序列分析 |
| 3.2.6 真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.2.7 enJSRV-env shRNA设计及合成 |
| 3.2.8 enJSRV-env基因的shRNA真核表达载体的构建 |
| 3.2.9 enJSRV-env基因沉默效果评价 |
| 3.2.10 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 enJSRV-env基因的扩增 |
| 3.3.2 Hyal2基因的扩增 |
| 3.3.3 enJSRV-env基因的序列分析 |
| 3.3.4 pEGFP-C1/enJSRV-env真核表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.5 pEGFP-C1/Hyal2真核表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.6 重组干扰质粒酶切鉴定 |
| 3.3.7 荧光定量PCR检测enJSRV-env基因沉默效果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 实验三 enJSRV ENV参与绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的融合及侵袭 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验动物及主要试剂 |
| 4.1.2 试验所用溶液及其配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 质粒和细胞系 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 绵羊胎盘组织HE染色 |
| 4.2.2 免疫组织化学染色 |
| 4.2.3 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞培养 |
| 4.2.4 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞转染 |
| 4.2.5 pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中瞬时表达 |
| 4.2.6 enJSRV囊膜蛋白氨基酸序列分析 |
| 4.2.7 enJSRV-env及其受体Hyal2对绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞融合作用的影响 |
| 4.2.8 enJSRV-env对绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞侵袭作用的影响 |
| 4.2.9 enJSRV-env对绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞激素分泌量的影响 |
| 4.2.10 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞大量表达enJSRV-env |
| 4.3.2 enJSRV囊膜蛋白氨基酸序列分析 |
| 4.3.3 enJSRV-env及Hyal2在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中瞬时表达 |
| 4.3.4 enJSRV-env可以促进绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞融合 |
| 4.3.5 enJSRV囊膜蛋白可以改变绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞侵袭性 |
| 4.3.6 enJSRV-env不影响绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的激素分泌量 |
| 4.4 讨论 |
| 5 实验四 enJSRV囊膜蛋白与JSRV囊膜蛋白结构和功能的对比研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验动物及主要试剂 |
| 5.1.2 试验所用溶液及其配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 质粒和细胞系 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 总RNA的提取与处理 |
| 5.2.2 引物设计 |
| 5.2.3 目的基因的扩增 |
| 5.2.4 pEGFP-C1/exJSRV-env真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 5.2.5 pEGFP-C1/exJSRV-env在293T细胞中表达并亚细胞定位 |
| 5.2.6 exJSRV-env与enJSRV-env基因的生物信息学分析 |
| 5.2.7 转化NIH3T3细胞 |
| 5.2.8 软琼脂集落形成实验 |
| 5.2.9 裸鼠致瘤实验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 exJSRV-env基因的扩增 |
| 5.3.2 真核表达质粒pEGFP-C1/exJSRV-env的构建与鉴定 |
| 5.3.3 exJSRV-env在293 T细胞中的亚细胞定位 |
| 5.3.4 exJSRV-env基因与enJSRV-env基因的生物信息学分析 |
| 5.3.5 转化NIH3T3细胞 |
| 5.3.6 软琼脂集落形成实验 |
| 5.3.7 裸鼠致瘤实验 |
| 5.4 讨论 |
| 6 试验五 OPA病羊肺组织基因组BAC文库的构建、鉴定及筛选 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 试验动物及主要试剂 |
| 6.1.2 试验所用溶液及其配制 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 菌株以及载体 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 文库构建 |
| 6.2.2 文库的鉴定 |
| 6.2.3 文库的筛选 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 基因组DNA的不完全酶切 |
| 6.3.2 DNA片段的选择及回收 |
| 6.3.3 文库的保存 |
| 6.3.4 BAC文库的评价 |
| 6.3.5 BAC质粒末端测序 |
| 6.3.6 PCR筛选BAC文库 |
| 6.3.7 JSRV相关的内源性逆转录病毒基因阳性克隆的获得 |
| 6.4 讨论 |
| 7 总体结论与创新点 |
| 7.1 总体结论 |
| 7.2 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 目录 摘要 ABSTRACT 第一部分 综述 |
| 第一章 乙肝病毒感染及其致病机制 |
| 一、 乙型肝炎病毒的结构及生物学特征 |
| 二、 乙型肝炎病毒的感染与整合 |
| 三、乙肝病毒慢性感染的免疫耐受机制 |
| 第二章 病毒感染的表观遗传学研究 |
| 一、 病毒对宿主的表观遗传学调控 |
| 二、 宿主对病毒的表观遗传学调控 |
| 第三章 慢病毒载体系统研究及应用 |
| 一、 慢病毒载体的研究 |
| 二、 可调控慢病毒载体的研究 第二部分 论文正文 |
| 第一章 HBV基因的慢病毒表达载体的构建 |
| 一、设计方案 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果和讨论 |
| 第二章 HBV基因可调控细胞模型的构建与验证 |
| 一、设计方案 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果和讨论 总结和展望 参考文献 致谢 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写及符号清单 |
| 插图和附表清单 |
| 目次 |
| 1 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎病毒结构及复制模式 |
| 1.2 型肝炎病毒流行病学 |
| 1.3 APOBEC3s对HBV的抑制 |
| 2 APOBEC3DE对HBV的抑制作用及其机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 A3DE在细胞内的表达及其调控研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 A3B对HBV复制的抑制不依赖于N端和C端的胞嘧啶脱氨酶 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 缩略语表 中文摘要 英文摘要 前言 文献回顾 正文 |
| 实验一：Id-1在乙肝相关性肝癌中的表达意义及其与HBX相互作用关系 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二：人Id-1干扰慢病毒载体的筛选构建 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 小结 参考文献 个人简历和研究成果 致谢 |
