张飞[1]（2021）在《长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析》文中研究表明睾丸发育、精子生成过程涉及生殖细胞、间质细胞和支持细胞在内的多种细胞协同作用,该过程受到极其复杂和严格的分子时空调控,人们对其理解仍十分有限。环状RNA作为一类新的长链非编码RNA存在于人和牛等动物的睾丸及精清中,可能参与调控睾丸发育及精子发生过程。然而,公猪睾丸组织发育成熟过程中环状RNA的表达谱及其潜在生物学功能尚不清楚。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是存在于RNA内部最常见的一类修饰,参与调控细胞分化、个体发育等多种生理病理进程,但关于m6A与睾丸发育、精子发生之间的关系目前仍知之甚少。因此,本文选取性成熟前后两个不同发育阶段的长白公猪睾丸组织,利用高通量测序技术和生物信息学等手段,揭示不同阶段睾丸中的环状RNA和m6A表达特征并比较分析其表达差异,预测和解析差异表达的环状RNA、m6A修饰在睾丸发育和精子发生事件中的潜在生物学功能,为增进了解环状RNA、m6A修饰参与公猪精子发生、睾丸发育调控等提供新的线索。本论文得到研究结果如下:本研究对未成年（30日龄,D30）和性成熟（210日龄,D210）长白公猪睾丸进行组织形态学观察。H&E染色结果显示,30日龄长白公猪睾丸曲细精管尚未发育完整,睾丸内未见明显管腔,处于性成熟前阶段;210日龄长白公猪睾丸体积显着增大,曲细精管发育完全,内含大量不同类型的生殖细胞并产生大量圆形精子及长形精子,已达到性成熟后阶段。使用去除核糖体RNA及线性RNA的总RNA-Seq来检测D30和D210长白公猪睾丸组织中环状RNA的表达谱。高通量测序显示睾丸组织中含有丰富的环状RNA,性成熟前后睾丸中分别鉴定出34521与31803个环状RNA。生物信息学分析发现这些环状RNA广泛分布于常染色体和性染色体上,长度主要位于100～10000 nt之间（58.97%）,主要来源于源头基因的外显子区域,大部分环状RNA由1-7个外显子形成（86.54%）,并且部分源头基因可以产生多个环状RNA。在公猪睾丸成熟过程中共发现来源于1526个源头基因的2326个差异表达的环状RNA,其中1003个D210公猪睾丸组织中上调,1323个下调。此外,差异表达的环状RNA源头基因GO功能分析显示这些环状RNA主要与精子发生、激素生物合成过程的正调控、生殖细胞发育、雄性减数分裂等生物过程有关。KEGG通路富集分析发现他们分别参与了干细胞多能性调节、紧密连接、粘附连接、cAMP等信号通路。因此,以上结果表明性成熟前后公猪睾丸表达大量的环状RNA,这些环状RNA呈现发育阶段特异性的动态表达模式,且主要与睾丸发育、精子发生等生物学过程密切相关。这些结果将有望为鉴定种公猪睾丸发育状态及筛选优秀种公猪提供一种潜在的分子标记物。同时为了研究睾丸发育成熟过程中m6A甲基化修饰的动态变化,本研究绘制了长白猪性成熟前后睾丸转录组范围信使RNA m6A甲基化图谱。本研究描述了m6A甲基化修饰在睾丸发育过程中的广泛分布模式,并分析了基因表达与m6A甲基化修饰的关系,同时广泛地鉴定了性成熟前后m6A甲基化修饰差异基因,这些基因可能与睾丸的生物学功能的密切相关。这些结果为确定睾丸中mRNA m6A甲基化的存在及其图谱提供了依据,并扩展了对m6A在哺乳动物器官发育和生长中作用的认识。
李讨讨[2]（2021）在《基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控》文中研究说明绵羊睾丸发育和精子发生直接决定着公羊的繁殖力。藏绵羊作为我国青藏高原及其毗邻地区最重要的家畜品种之一,具有繁殖力低、性成熟晚等生殖特点。因此,研究其睾丸发育和精子发生的调控机理对绵羊生殖生物学研究具有重要意义。然而目前在绵羊（尤其藏绵羊）上有关睾丸功能维持的分子生物学认识仍然非常欠缺。本研究以3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟后）、3岁龄（成年）藏绵羊睾丸组织作为研究材料,进行如下研究:1)借助RNA-seq技术及生物信息学分析对3个发育阶段睾丸组织中的m RNA、circ RNA和mi RNA表达谱进行分析,并进行差异表达分析和功能富集分析;2)根据“ce RNA假说”及circ RNAs、mi RNAs和m RNAs的表达变化趋势,构建ce RNA调控网络;3)基于3月龄和1岁龄组的睾丸转录组数据,对潜在的免疫稳态维持相关候选基因进行鉴定,并对这些基因所富集的mi RNA-m RNA模块及circ RNA-mi RNA-m RNA调控网络进行分析;4)原代分离培养绵羊睾丸支持细胞,以研究精子发生关键基因及相关的circ RNA-mi RNA-m RNA轴在绵羊睾丸细胞中的生物学作用。研究的主要结果如下:1.在3月龄vs 1岁龄、1岁龄vs 3岁龄、3月龄vs 3岁龄睾丸中,分别鉴定到26084（10247个上调,15837个下调）、57个（27个上调,30个下调）、25535个（10017个上调,15518个下调）差异表达m RNAs;分别鉴定到3982（2079个上调,1903个下调）、414（201个上调,213个下调）和4060个（2107个上调,1953个下调）差异表达circ RNAs;分别鉴定到715个（561个上调,154个下调）、57个（46个上调,11个下调）、790个（628个上调,162个下调）差异表达mi RNAs。随机选择的10个m RNAs、10个circ RNAs和12个mi RNAs的RT-q PCR验证结果表明RNA-seq获得的转录组数据是可靠的。差异表达m RNAs、差异表达circ RNAs来源基因、及二者共享基因的GO和KEGG分析结果均显示,它们主要参与生长、发育、生殖、免疫、代谢等相关生物学过程;显着富集在m TOR、TGFβ等生殖相关,以及紧密连接、减数分裂等细胞连接或细胞发育密切相关的信号通路上。2.基于circ RNAs、mi RNAs和m RNAs共表达ce RNA网络分析发现,差异表达circ RNAs的靶基因主要涉及细胞发育、生殖等生物学过程以及粘附连接、局部粘附、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节、MAPK、Wnt、TGFβ等信号通路。在此基础上,构建了睾丸功能（如精子发生、生殖细胞发育、细胞周期、减数分裂、血-睾屏障等）密切相关基因的ce RNA调控网络;通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光染色和双荧光素酶分析发现,BOLL基因主要表达于减数分裂后的圆形和长形精子细胞中,并且其表达受到circ＿029155/mi R-760-3p信号轴的调控。3.基于性成熟前、后藏绵羊睾丸的转录组测序和功能富集数据,共筛选出1118个免疫相关差异表达m RNAs（包括873个下调和245个上调的m RNAs）。GO和KEGG富集分析结果显示,它们主要富集在免疫系统发育、细胞粘附/连接、刺激反应调节、免疫反应调节等生物学过程,以及细胞粘附、T细胞和B细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、趋化因子、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路上。在此基础上,构建了与睾丸免疫稳态维持相关候选基因的潜在mi RNA-m RNA网络和circ RNA-m RNA-m RNA网络。此外,双荧光素酶分析证实了ITGB1/circ＿013761/circ＿014236与mi R-29b以及ITGB1/circ＿001254与mi R-1185-3p间存在靶向关系。4.由构建的ce RNA网络可知,IGF1基因受到oar-mi R-29b和circ＿026259的潜在调控。RT-PCR、RT-q PCR、荧光原位杂交和免疫荧光分析显示,它们在发育的藏绵羊睾丸中具有相似的RNA分布模式:广泛分布于生殖细胞、间质细胞和支持细胞中。随后,采用两步酶消化法成功分离获得了绵羊睾丸支持细胞。RNase R酶消化法、PCR和Sanger测序证实了circ＿026259的环化特征,即由绵羊KLHL5基因第2-5个外显子产生,且由第2和第5个外显子反向剪接形成环化结构（将circ＿026259命名为circ KLHL5）。通过一系列双荧光素酶、过表达、敲低、CCK-8、Ed U染色、细胞流式分析发现,circ KLHL5可通过靶向oar-mi R-29b促进支持细胞中IGF1基因的表达,进而诱导支持细胞的增殖并抑制其凋亡。综上所述,转录组测序结合相关分子生物学方法揭示了许多差异表达基因在发育的藏绵羊以年龄依赖的表达模式参与生殖细胞发育、减数分裂、血-睾屏障、免疫稳态等生物学过程,并且这些基因中的大多数表达可能受到mi RNAs和/或circ RNAs的调控,以响应不断发育的睾丸内环境及持续的精子发生过程。同时,鉴定到一个由绵羊KLHL5基因产生的新的环状RNA circ KLHL5,并证实其通过靶向oar-mi R-29b调节IGF1基因的表达和睾丸支持细胞的发育。这些发现填补了有关绵羊睾丸组织circ RNAs认识的空白,丰富了现有的绵羊转录组信息,并为进一步理解绵羊及其他高原哺乳动物睾丸发育和精子发生机制提供了理论依据。
李小英[3]（2021）在《基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制》文中指出不育症是严重影响哺乳动物繁殖能力的一类生殖系统疾病。营养缺乏、饲养管理不当、季节性原因、遗传原因（如杂交不育）和疾病等均可导致不育。在引起哺乳动物不育的因素中,雄性因素约占一半左右。无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症等是引起雄性不育的主要病因。少精症是以精子数量显着稀少为特征的雄性不育症类型,病因复杂发生机制仍不十分明确。遗传因素和环境因素均可导致精子数量减少,遗传因素对精子数量的影响主要通过精子形成过程中相应基因的表达和调控作用来实现。因此,寻找影响精子形成的特异性靶基因（蛋白）并阐释其作用机制,对于少精症的精准治疗和预后具有重要的理论价值和意义。4.1R蛋白是一种由epb41基因编码的细胞膜骨架蛋白组分,在红细胞和多种非红细胞组织中发挥作用。本文从以下三个方面阐述4.1R蛋白基于睾丸支持细胞在少精症发生中的作用机制:（1）以雷公藤多苷溶液诱导雄性C57BL/6J小鼠（7周龄）构建的少精症模型小鼠为研究对象,利用western blotting、q-PCR和免疫荧光技术检测4.1R蛋白在少精症小鼠睾丸内的表达特点。利用异硫氰酸荧光素（FITC）睾丸活体注射检测少精症模型小鼠血睾屏障完整性,并检测血睾屏障形成相关蛋白的表达,阐述4.1R蛋白表达与睾丸支持细胞（Sertoli）连接功能间的相关性。检测Wnt/β-catenin信号通路组分在少精症模型小鼠睾丸内的表达特点,阐述4.1R蛋白表达与Sertoli细胞增殖间的相关性。少精症小鼠模型研究结果:western blotting检测显示epb41基因在正常C57BL/6J小鼠睾丸内表达135k D和80k D两种亚型。即4.1R-135k D蛋白和4.1R-80k D蛋白。与对照相比较,少精症模型小鼠睾丸内4.1R-135k D蛋白表达显着下降（P<0.05）,4.1R-80k D蛋白表达无显着变化;epb41m RNA表达降低,差异不显着;4.1R蛋白在少精症模型小鼠睾丸Sertoli细胞膜上表达下降,而各级生精细胞细胞膜上的表达则无显着差异。少精症模型小鼠血睾屏障受损,FITC从基底室进入近腔室并分散其中。与对照组相比较,少精症模型小鼠睾丸内β-catenin蛋白表达显着下降,而E-cadherin表达增加。血睾屏障相关蛋白ZO-1表达显着下降（P<0.05）,occludin和claudin-11表达均下降;Wnt/β-catenin信号通路组分Wnt3a、β-catenin表达显着下降（P<0.05）,GSK3β、c-myc和CDK4表达也下降,但差异不显着。（2）以小鼠epb41基因第3外显子为模板,设计2对sg RNAs并构建p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP重组质粒载体。转染N2a细胞,验证第3外显子基因序列与4.1R蛋白亚型表达之间的相关性。以小鼠epb41基因为模板构建LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体和LV-Epb41-sg RNA（05765-1）基因敲除慢病毒载体,分别转染TM4细胞（正常小鼠睾丸支持细胞系,即Sertoli细胞）和原代Sertoli细胞。检测细胞中4.1R蛋白、血睾屏障相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路组分表达水平,阐述4.1R蛋白在体外培养Sertoli细胞增殖和连接中的作用机制。研究结果显示:重组质粒载体转染的N2a细胞中4.1R-135k D蛋白不再表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41-sg RNA（05765-1）慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,4.1R-135k D蛋白被抑制表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,显着提高4.1R-135k D蛋白（P<0.05）和4.1R-80k D蛋白的表达,证实已成功实现Sertoli细胞内4.1R-135k D蛋白的抑制表达和过表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除的TM4细胞中血睾屏障相关蛋白β-catenin、E-cadherin和ZO-1表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin、c-myc、GSK3β和Cyclin D1均显着下降（P<0.05）,CDK4表达也下降,CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达TM4细胞中β-catenin、ZO-1和occludin表达均上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β和Cyclin D1表达均上升,CDK4和CDK6表达则下降,差异均不显着。4.1R-135k D蛋白基因敲除原代Sertoli细胞中,血睾屏障相关蛋白β-catenin、ZO-1和occludin表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin和CDK4均显着下降（P<0.05）,c-myc和GSK3β表达也下降,Cyclin D1和CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达原代Sertoli细胞中β-catenin,ZO-1和occludin表达上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β,CDK4和CDK6表达均上升,Cyclin D1表达则下降,差异均不显着。（3）以7周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,将p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP质粒载体及LV-Epb41（43286-1）载体分别通过活体原位电穿孔转染法和慢病毒载体注射法作用于小鼠睾丸,比较两种载体转染方法的蛋白表达效率和靶向性,并利用免疫荧光法检测载体处理后睾丸组织中4.1R蛋白及血睾屏障相关蛋白的表达水平。阐述4.1R蛋白在活体水平对Sertoli细胞连接的调节作用与机制。质粒载体和慢病毒载体睾丸活体转染结果显示:质粒载体电转染法比慢病毒载体注射法更快在活体内表达,即质粒载体转染后3天,即在睾丸组织中高效表达,使Sertoli细胞中4.1R蛋白表达降低。慢病毒载体注射法表达相对较慢,注射后5天才可以在睾丸中表达。过表达慢病毒载体可显着提高4.1R蛋白在Sertoli细胞中的表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除载体作用于活体睾丸,BTB相关蛋白表达变化规律与少精症模型小鼠中的变化规律相同。4.1R-135k D蛋白过表达载体作用于睾丸活体,显着提高BTB相关蛋白的表达,E-cadherin表达除外。综上得出结论:（1）小鼠睾丸和Sertoli细胞中均表达4.1R-135k D和4.1R-80k D两种4.1R蛋白亚型,4.1R-135k D蛋白表达下降与精子细胞数量显着减少相关。（2）小鼠Sertoli细胞系中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起β-catenin表达下降,从而使Wnt/β-catenin信号通路组分表达异常,抑制睾丸支持细胞增殖。（3）成年小鼠睾丸组织Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起血睾屏障相关蛋白表达异常,导致细胞连接异常,精子细胞形成的微环境受损。因此,由于Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,可引起Sertoli细胞数量减少或血睾屏障受损,导致精子数量显着减少。
高源[4]（2021）在《安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制》文中提出安格斯牛是肉牛生产的主要品种之一,具有性成熟早、易产、初生重小、生长速度快、肉质好、适应力强等优点。安格斯牛作为肉质好的代表品种被大量引进用来改良地方牛品种,在优质高档牛肉的生产方面取得了显着成效。公牛是种牛群的重要组成部分,在肉牛群体遗传性能改良过程中发挥着重要作用。种公牛为肉牛的生产提供大量优质的精液,以便优良遗传性状得以稳定遗传,因此理想的繁殖性能对种公牛至关重要。睾丸是精子发生的重要器官,正常的睾丸发育是种公牛优良繁殖性能的基础,因此探究公牛睾丸发育及精子发生的遗传机理和分子调控机制,对选育高产优质种公牛具有重要意义。睾丸发育和精子生成依赖于转录、转录后水平相关基因精确的调控,而非编码RNA被证实在转录或转录后水平调控中扮演着极其重要的角色。因此,本研究选用安格斯牛为研究对象,在转录组水平进行ncRNA（lncRNA、miRNA、circRNA）的鉴定分析及功能验证,意在寻找安格斯牛性成熟过程中睾丸发育与精子生成相关的ncRNA,从而从ncRNA的角度解析牛睾丸发育的遗传基础。同时,借助单细胞转录组测序技术进行公牛睾丸发育的细胞图谱绘制和标记基因鉴定,为探索公牛精子生成、睾丸体细胞发育的分子调控及转录调节机制提供了基础数据。本研究的主要结果如下:（1）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸lncRNA进行测序分析,共鉴定出23,735个lncRNA;其中,540个lncRNA（P<0.05）和3,525个mRNA（P-adj<0.05）差异表达;GO和KEGG富集分析表明差异表达的lncRNA靶基因和mRNA大多富集在与精子发生相关的过程中富集;通过lncRNA-mRNA互作分析,构建了与睾丸发育相关的15个DE lncRNA和12个顺式作用靶基因的互作网络,其中lncRNA的靶基因（SPATA16、TCF21、ZPBP、PACRG、ATP8B3、COMP、ACE和OSBP2）与牛睾丸发育和性成熟有关。（2）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸miRNA进行测序分析,共鉴定出566个已知的miRNA,以及86个新miRNA;差异表达分析表明,性成熟期与初生期相比共有223个差异表达的miRNA（202个已知和21个新的miRNA）;相较于初生期组,性成熟期睾丸中有112个miRNA表达上调（92个已知的和20个新的miRNA）和111个表达下调的miRNA（110个已知的和20个新的miRNA）（P-adj<0.05,|log2fold-change|>1）;根据KEGG富集分析发现,差异表达的miRNA靶基因富集到与睾丸发育、精子生成相关的通路中。（3）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸circRNA进行测序分析,共鉴定出28,065个候选的circRNA,其中7,458个circRNA在初生期和性成熟期牛睾丸中共同存在;初生期和性成熟期牛睾丸中存在987个circRNAs差异表达（P<0.05）,以初生期为对照,性成熟期表达上调的有710个circRNAs,下调的有277个circRNAs。GO和KEGG功能富集分析发现差异circRNA的宿主基因显着富集在了36个GO项以及8条通路。（4）根据circRNA测序数据筛选出差异表达的circ SMC1B,并验证发现circ SMC1B在性成熟期高表达,且在牛雄性生殖干细胞中高表达。通过过表达circ SMC1B且利用CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现circ SMC1B促进牛m GSCs的增殖和凋亡;RNAhybrid软件预测及双荧光素酶报告实验证明circ SMC1B竞争性结合let-7i;通过CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现let-7i靶向HMGA1和NR6A1抑制牛m GSCs的增殖和凋亡;且发现circ SMC1B可竞争性结合let-7i调节靶基因HMGA1和NR6A1表达,促进m GSCs增殖凋亡。（5）利用scRNA-seq技术对性成熟前后牛睾丸细胞进行转录组测序,通过聚类分析将睾丸细胞分为12个类群,其中包括9种体细胞和3种生殖细胞;并鉴定出一些牛睾丸不同类群细胞的特异标记基因,如ARSE、CLEC12B、GAS1、KRT8、LOC101908015、HIGD1B、CCL21、ESX1、MEIOB、SPATA19等;通过聚类分析将睾丸生殖细胞分为13个类群,分别在其中鉴定了特异表达的基因,这为解释牛睾丸发育和精子生成的机制提供了理论依据。本研究通过RNA-seq和scRNA-seq对公牛睾丸组织编码基因和ncRNA表达进行综合分析,发现公牛睾丸组织中存在大量与睾丸发育和精子发生相关的差异表达ncRNA和mRNA,且鉴定出公牛睾丸组织中不同细胞类群的特异标记基因,这为丰富公牛睾丸发育和精子生成转录调节机制提供了宝贵资源,为利用分子辅助选育技术筛选优良种公牛,建立公牛良种繁育体系提供了可靠的理论指导和技术支撑。
付国庆[5]（2021）在《基于职业安全视角的DEHP对雄性生殖健康损伤及机制研究》文中研究表明邻苯二甲酸（2-乙基己基酯）（DEHP）是一种广泛使用的增塑剂,具有显着的雄性生殖毒性,可引起职业暴露人群血清睾酮和精子活力下降,精子数量减少。然而,全球范围内还没有完善的DEHP职业接触限值和职业危害防护措施。为了推进DEHP职业接触限值的研究,加强DEHP对雄性生殖毒性的防治,促进DEHP职业暴露人群的健康安全,采用动物实验证实了DEHP对雄性生殖毒性的影响,基于DEHP诱导的睾丸组织差异性表达pi RNA和PIWI蛋白预测DEHP诱导雄性生殖毒性的调控通路,探究预测通路在体内动物模型和体外细胞模型中的作用,初步提出了DEHP诱导雄性生殖毒性灵敏的效应指标以及可能的作用机理。筛选出DEHP诱导雄性生殖毒性可能的调控通路,为DEHP暴露灵敏效应标志物的筛选和职业接触限值的研究提供了基础的研究方向。构建DEHP暴露的大鼠模型,分别用pi RNA芯片和Western blot法检测大鼠睾丸组织pi RNA和PIWI蛋白表达水平,结果发现,DEHP暴露组大鼠睾丸中1351个pi RNA表达上调,944个pi RNA表达下调,选择10个经实时荧光定量PCR法检测验证的差异性表达pi RNA,用生物信息学方法进行靶基因预测以及GO和KEGG pathway富集,文献研究法探讨差异性表达的PIWI亚家族Piwil2蛋白的调控通路,综合分析差异性表达pi RNA和Piwil2调控通路,经筛选和初步验证Piwil2/STAT3/p53、Piwil2/PI3K/Akt、INSR/IRS1/PI3K/Akt/Fox O1和AMPK/Fox O1通路可能参与DEHP诱导的雄性生殖毒性调控。研究了经筛选的通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用。用250、500、1000 mg/kg DEHP的剂量连续染毒雄性大鼠28天,检测血清睾酮水平、附睾精子浓度、睾丸组织结构改变、睾丸组织凋亡和自噬水平评价雄性生殖毒性,检测睾丸组织中筛选通路相关蛋白表达水平,以了解它们在DEHP诱导雄性生殖毒性中的作用。结果发现,血清睾酮在所有DEHP暴露组均下降,是DEHP暴露的敏感指标。250 mg/kg·day暴露组DEHP诱导细胞自噬避免细胞凋亡,在500和1000 mg/kg·day暴露组,自噬水平下降,DEHP激活线粒体凋亡通路,导致睾丸细胞凋亡增加,睾丸组织损伤,可能与STAT3/p53通路有关。INSR、IRS1、Piwil2和STAT3是DEHP暴露灵敏且稳定的指标,其表达水平在所有暴露组均显着降低,可以作为DEHP早期暴露生物效应标志物进行进一步研究。探讨了piRNA/PIWI调控的不同通路在DEHP代谢产物MEHP诱导小鼠初级精母细胞（GC-2spd）毒性中的作用。用0、1、10、100μM MEHP和100μM NAC+100μM MEHP分别处理GC-2spd细胞,检测MEHP处理组和抗氧化剂NAC预处理组细胞氧化应激水平、凋亡和自噬水平以及pi RNA/PIWI调控通路相关蛋白表达水平。结果显示,在10、100μM MEHP暴露组,MEHP通过氧化应激介导STAT3/p53通路调控线粒体凋亡通路导致GC-2spd细胞凋亡,MEHP还通过氧化应激影响PI3K/Akt/m TOR和AMPK/m TOR通路促进GC-2spd细胞自噬。DEHP雄性生殖毒性现有的敏感效应指标为睾酮,INSR、IRS1、Piwil2和STAT3可以作为新的效应指标进行进一步的筛选,DEHP通过氧化应激调节STAT3/p53和PI3K/Akt/m TOR影响雄性生殖毒性,为DEHP雄性生殖毒性的防治提供可能的作用靶点,研究结果为DEHP职业接触限值研究提供基础资料,对促进DEHP职业健康安全具有重要意义。
常征辉[6]（2021）在《益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究》文中研究说明少弱精子症是常见的男性不育疾病之一,其发病率在近些年逐年升高,亟需安全有效的治疗手段。西医治疗本病存在一定的局限性,疗效欠佳,中医药在男性不育的防治方面有独特优势。益肾兴阳胶囊作为一种中成药,早期主要用于治疗阳痿早泄,现在越来越广泛地用于治疗少弱精子症,因此研究并揭示益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的作用机制具有重要意义。然而,目前尚未对其整体的药效机理形成全面的认识,为此迫切需要有效的研究思路和方法来对其药效物质基础及作用机制进行研究,指导临床安全、合理地用药。论文包括文献综述、网络药理学预测和实验研究。文献综述系统总结了近年来中医药对少弱精子症的研究进展,探讨了传统中医药对少弱精子症的认识、中医辨证分型、中药复方研究等进展;从现代医学角度探讨了少弱精子症的病因、睾丸生精功能的调控机制、治疗方法等。以上内容的探讨,为本课题顺利开展做了铺垫。研究目的:本研究拟通过网络药理学预测益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键靶点、生物通路等相关机制,为动物实验药效机制研究奠定基础。设计动物实验,观察益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型精子质量、生精细胞凋亡、增殖分化、以及精子能量代谢的影响,阐述其作用机制,为益肾兴阳胶囊组方用药及作用机制提供实验探索。研究方法:1.网络药理学通过多个中药成分与靶标数据库收集和筛选益肾兴阳胶囊的化学成分,构建益肾兴阳胶囊作用靶点PPI网络（protein protein interaction network,PPI network）;同时从疾病基因数据库对少弱精子症靶点进行检索及筛选;并将疾病基因映射到PPI网络,获取益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点;构建益肾兴阳胶囊来源中药-成分-靶点-模块-通路网络,通过富集分析预测益肾兴阳胶囊的潜在作用机制。2.实验研究。复制环磷酰胺诱导的少弱精子症小鼠模型,采用精液分析、电镜、流式细胞、Western Blot等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、精子腺嘌吟核苷三磷酸（Adenosine triphosphate,ATP）含量、生精细胞周期、睾丸超微结构、睾丸组织 B 细胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein,Bax）、磷脂酶肌醇 3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3k）、蛋白激酶B（Protein kinase B,Akt）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、C-Kit 原癌基因（C-Kit proto-oncogeneprotein,C-Kit）、A 细胞凋亡信号调节激酶 1（Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）、c-JunN 端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）表达的检测。复制雷公藤多苷诱导的少弱精子症大鼠模型,采用精液分析、ELISA、流式细胞、RT-PCR等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、性激素水平、线粒体膜电位、睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路蛋白、电压依赖性阴离子通道2（Voltage-dependent anion channel 2,VDAC2）、电压依赖性阴离子通道 3（Voltage-dependent anion channel 3,VDAC3）、细胞周期检查点激酶 1（Cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1）、细胞周期检查点激酶 2（Cell cycle checkpoint kinase 2,CHK2）蛋白表达的检测。研究结果:1.网络药理学共得到益肾兴阳胶囊418个化学成分、2447个靶点和少弱精子症134个致病基因;其中17个靶点为益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点,它们参与了 8个关键模块;中药-成分-靶点-模块-通路网络分析发现,其中有57个成分参与调控了关键的作用靶点和关键模块,有可能影响生精细胞凋亡、增殖分化和精子能量代谢。2.动物实验首先模型建立成功,与正常对照组相比,模型动物少弱精子症成立。小鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症小鼠模型精子质量和精子ATP含量（P<0.01）;睾丸组织超微结构与模型组相比,益肾兴阳胶囊各组生精细胞、支持细胞线粒体明显增多,轻微肿胀,并且可见正常形态高尔基体,睾丸超微结构改善明显。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症小鼠模型生精细胞周期、睾丸组织Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达（P<0.05）。大鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症大鼠模型精子质量、性激素水平和精子线粒体膜电位（P<0.05）。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症大鼠模型睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路、VDAC2、VDAC3、CHK1、CHK2蛋白表达（P<0.05）。通过动物实验,验证了网络药理学相关的生物学通路预测。研究结论:1.益肾兴阳胶囊可以显着提高少弱精子症模型精子质量并改善睾丸组织超微结构损伤情况。2.益肾兴阳胶囊可以抑制少弱精子症模型生精细胞凋亡,具体机制可能与调控 Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达有关。3.益肾兴阳胶囊可以改善睾丸的生精功能,促进生精细胞增殖分化,具体机制可能与调控TGF-β1/Smads信号转导通路以及CHK1、CHK2蛋白表达有关。4.益肾兴阳胶囊可以增强少弱精子症模型精子能量代谢,具体机制可能与提高线粒体膜电位、增强VDAC2、VDAC3蛋白表达有关。综上所述,本研究证实了益肾兴阳胶囊具有补肾精、促生殖的治疗效果,也揭示了益肾兴阳胶囊通过抑制生精细胞凋亡、促进生精细胞增殖分化、增强精子能量代谢治疗少弱精子症的相关作用机制。
孟雪丹[7]（2020）在《五子衍宗丸的生精作用及分子机制研究》文中认为近年来男性不育的发病率呈不断上升趋势,五子衍宗丸是中医治疗少弱精子症的经典名方,在治疗男性不育方面具有广泛的临床应用,被誉为古今种子第一方。治疗男性不育、改善男性精子质量已成为亟需解决的社会问题。然而由于中药的多成分多靶点,五子衍宗丸的作用机制尚不明确,因此,本研究首先建立白消安致少弱精症的小鼠模型,给与模型动物五子衍宗丸,通过睾丸组织病理分析、精子质量和生育能力评价五子衍宗丸的生精作用,在此基础上进一步应用基因芯片技术,分析五子衍宗丸对少弱精症小鼠基因表达谱的影响,进而探讨五子衍宗丸的生精作用的分子机制,以期为五子衍宗丸的开发和临床应用提供基础性参考。目的:建立少弱精症的动物模型,评价五子衍宗丸对少弱精症动物模型的影响,进一步探讨其治疗少弱精症的分子机制。方法:（1）实验动物分组及给药:分为正常对照组、少弱精症组、阳性药丙酸睾酮组、五子衍宗丸治疗组共四组,其中模型组给与腹腔注射白消安,建立少弱精症模型,阳性药对照组给与丙酸睾酮注射液;（2）测定小鼠睾丸和附睾的脏器指数、分析睾丸的HE染色组织切片;（3）利用全自动小鼠精子分析系统对小鼠精子数量和活力进行评价和测定;（4）通过与雌性小鼠合笼后雌鼠产仔数目对雄鼠生育能力进行评价;（5）通过基因芯片得到小鼠睾丸的基因表达谱,从分子层面探讨五子衍宗丸可能的作用机制。结果:（1）给小鼠腹腔注射20 mg/kg的剂量的白消安,经精子数量和活性检测,造模成功;（2）模型组小鼠睾丸脏器指数较正常组比下降,五子衍宗丸组小鼠睾丸脏器指数趋近于正常对照组,HE染色结果显示,模型组小鼠生精小管不完整,精原细胞比例减少,五子衍宗丸组小鼠生精小管、生殖细胞比例较模型组相比更加紧密,数量增多,体现了药物的恢复作用;（3）客观评价了各组小鼠的精子质量,五子衍宗丸体现出对精子活力和数量的修复作用;（4）五子衍宗丸雌鼠产仔数接近正常组,模型组和阳性药组产仔数较低;（5）通过基因芯片测序和生物信息学挖掘,推测五子衍宗丸主要是通过调节生精细胞的减数分裂、睾丸HR信号通路、睾丸RAS信号通路、睾丸胆固醇代谢通路等影响精子生成及睾丸生精功能,从而对少弱精症起到治疗作用。结论:本研究对首先成功建立了少弱精症的动物模型,并对五子衍宗丸的生精作用展开了系统的研究,评价了正常小鼠、少弱精症小鼠、五子衍宗丸给药后小鼠的精子运动活力参数,对四组小鼠进行了生育能力实验,从源头到最终受孕等多方面对精子的质量进行了考察,最后应用基因芯片测序技术,对小鼠睾丸细胞的基因表达水平进行检测,从基因表达层面探讨了五子衍宗丸改善精子质量的分子机制,为五子衍宗丸的进一步研究提供了基础数据。
安琪[8]（2020）在《睾酮治疗少弱精子症的疗效与作用机制的实验动物研究》文中指出背景:睾酮在精子发生的过程中发挥着至关重要的作用。一些无精子症和少弱精子症患者的外周血睾酮会有所降低,但也有少数患者的外周血睾酮水平未低于正常范围。男性不育症中的特发性少弱精子症发病机制不明,临床上主要还是依赖经验性的药物治疗,其中补充雄激素或其衍生物则是其中的一种常用疗法。此外,药物治疗在特发性男性不育的临床治疗上应用广泛且相对简单,同时与自然生育的期望更为符合,因此更易于被医患双方接受。目的:通过建立少弱精子症模型大鼠来探究雄激素治疗的效果,并对可能的机制进行探讨。方法:第一,系统回顾了有关TU单独或联合用药治疗男性少弱精子症的文献,通过荟萃分析为下一步探索雄激素治疗少弱精子症模型大鼠提供了循证医学支持。第二,在结合既往研究的基础上,选取了6月龄的雄性SD正常大鼠来观察四种不同剂量的雄激素对其生殖器官和内分泌代谢的影响,以进一步明确生理剂量范围并探索下一步治疗实验中适合的药物剂量。第三,根据筛选出可能适用于治疗的药物剂量,对雷公藤多苷诱导的少弱精子症模型大鼠进行治疗,并从生殖脏器质量、精子质量、血清激素水平、睾丸组织抗氧化指标以及病理组织形态学等多角度、多方面评估治疗效果。第四,通过电镜来观察大鼠睾丸组织中精曲小管的超微结构变化,并在借助HPLC-MS的基础上深入挖掘有关雄激素治疗少弱精子症大鼠的代谢组学变化,即通过生物体内代谢物的变化情况来探究代谢物与病理变化之间的相对关系从而进行定量分析。同时,结合相关的凋亡通路和细胞特异标志物,探索了雄激素治疗少弱精子症大鼠模型的准确靶点与作用机制,为其临床应用提供了理论基础。结果:首先,就改善患者精液质量的结果而言,荟萃分析显示TU联合治疗的效果整体上要优于单用十一酸睾酮或其他用药治疗,并且单用十一酸睾酮的疗效并不亚于使用其他药物。因此,十一酸睾酮可在一定程度上直接或间接地促进和改善特发性少弱精子症患者的精液质量,也为下一步探讨雄激素治疗少弱精子症大鼠模型提供了文献依据和理论基础。其次,通过探索不同剂量的雄激素对正常大鼠的生殖激素水平及生精功能的影响,并结合大鼠脏器质量、精子质量、血清激素水平以及病理组织形态学等,进一步筛选出了 7.56mg/kg和15.12mg/kg两个对于正常大鼠生理功能影响相对最小的“生理剂量”。第三,通过建立少弱精子症大鼠模型,结果提示雄激素治疗能够在一定程度上改善精子浓度和活动率（P<0.05）,但对于精子的运动参数并无改善作用（P>0.05）;H&E染色结果提示:与空白对照组相比,十一酸睾酮治疗组的生精细胞有所增多,间质细胞变性,支持细胞胞浆空泡化相对减少,生精上皮进一步恢复,继而Johnsen评分明显恢复并且凋亡率显着降低（P<0.05）;在血清生殖激素方面:FSH和LH水平明显恢复（P<0.05）,同时T和E2水平显着增加（P<0.05）;而睾丸组织中的氧化应激物MDA与GSH-PX的水平明显降低（P<0.05）,特别是睾丸内睾酮的水平明显升高（P<0.05）。第四,通过电镜观察十一睾酮治疗组中睾丸组织中精曲小管的超微结构,发现生精细胞间隙明显缩小,生精细胞排列相对紧密,线粒体略有肿胀但结构基本完整,线粒体嵴排列紊乱减少,空泡亦显着减少;借助HPLC-MS挖掘少弱精子症模型大鼠在治疗前后代谢物质的差异,结果发现花生四烯酸、精氨酸和脯氨酸、苯丙氨酸以及甘油磷脂这四条代谢物质通路在治疗前后存在显着差异（P<0.05）;第五,以甘油磷脂代谢途径为基础,验证了可能涉及的通路如Bcl-2/Bax-Caspase3/9以及RIPK1-MLKL/pMLKL的蛋白表达情况;与溶剂对照组相比,治疗后的线粒体凋亡通路Bax、Caspase3/9表达明显降低（P<0.05）,而Bcl-2表达显着增加（P<0.05）;在细胞坏死性凋亡通路中,TNF-α、RIPK1以及pMLKL表达量显着增加（P<0.05）,pMLKL表达则是明显降低（P<0.05）;细胞特异性标志物如睾丸紧密连接标志物Occludin,支持细胞标志物SOX9,间质细胞标志物StAR以及肽能神经纤维标志物PGP9.5等经治疗后都有明显恢复（P<0.05）。结论:雄激素治疗对于睾酮低下性少弱精子症大鼠模型精子生成与生殖功能恢复具有明显改善作用。1.通过探索不同剂量的雄激素对正常大鼠的生殖激素水平及生精功能的影响,筛选与确定7.56mg/kg和15.12mg/kg两个“生理剂量”用于少弱精子症模型大鼠的治疗实验;2.在建立的睾酮低下型少弱精子症大鼠模型的基础上,我们发现15.12mg/kg剂量的十一酸睾酮无论是在改善生殖内分泌激素水平和精子质量,还是在减轻氧化应激产物对细胞组织损伤都有相对更好的效果;3.电镜结果提示:十一酸睾酮15.12mg/kg剂量对于生精细胞超微结构,包括细胞间隙和线粒体地恢复更加明显,在借助HPLC-MS代谢组学的基础上发现磷脂甘油代谢通路具有显着差异性;4.雄激素可通过线粒体凋亡途径以及细胞坏死性凋亡途径来实现其治疗作用,并且可改善相关细胞标志物来调控生精过程。
夏蒙蒙[9]（2020）在《miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究及睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究》文中研究指明第1章miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究目的:本研究旨在探索miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡与自噬的分子机制。方法:1.合成miR-194-5p前体基因序列,构建GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒。用HEK293T细胞包装获得的慢病毒感染睾丸畸胎瘤细胞（F9细胞）,经嘌呤霉素筛选后,获得稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株,流式细胞仪分析过表达细胞比例,qRT-PCR验证过表达后miR-194-5p的表达水平,qRT-PCR和Western Blot验证miR-194-5p过表达后Stra8的表达水平。2.利用流式细胞仪检测miR-194-5p过表达后细胞凋亡水平,分析前期RNA-Seq筛选出的Stra8基因敲除小鼠差异表达的细胞凋亡相关分子,qRT-PCR及Western Blot检测这些分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势,揭示调控细胞凋亡的信号通路。3.MDC染色法检测miR-194-5p过表达后细胞自噬水平,qRT-PCR及Western Blot检测自噬相关分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势。结果:1.序列测定结果显示:构建的GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒无突变且序列正确。利用HEK293T细胞成功包装出miR-194-5p慢病毒,感染F9细胞,筛选后得到稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株。流式仪分析过表达细胞比例高;qRT-PCR和Western Blot结果显示,miR-194-5p F9细胞株中miR-194-5p表达水平升高,Stra8 mRNA和蛋白表达水平均降低。2.流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,miR-194-5p F9细胞的细胞凋亡率显着增加。与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞中Bc12表达水平降低,而JNK、p-JNK、Bax、Bak、Cytochrome C、Caspase9 以及 Caspase3 表达水平升高。这种表达趋势在Stra8 HOM小鼠睾丸组织与WT小鼠睾丸组织的比较中也得到验证。3.MDC染色结果显示,与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞自噬显着性增加。过表达miR-194-5p后,自噬底物分子P62表达降低,自噬相关分子Nrld1、Ulk1、Atg5、Vps18及自噬标记物LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。在Stra8 HOM小鼠睾丸中,与WT小鼠睾丸组织相比较,P62表达水平降低,LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。这与miR-194-5p F9细胞中的趋势相一致。结论:miR-194-5p可能通过抑制Stra8表达进而通过JNK线粒体细胞凋亡信号通路促进F9细胞和生精细胞的细胞凋亡,可能通过抑制Stra8表达促进F9细胞和生精细胞的细胞自噬。第2章睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究目的:本研究旨在研究Tex33的表达模式及其在精子发生中的作用。方法:1.Tex33多克隆抗体的制备与鉴定:PCR扩增Tex33基因ORF序列并构建pET-30a-Tex33原核表达重组质粒。IPTG诱导Tex33原核蛋白表达,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化Tex33原核蛋白,经梯度尿素复性后免疫雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。运用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western Blot检测抗体的特异性及有效性。2.应用RT-PCR及Western Blot分析Tex33基因在小鼠多种组织中的表达模式;运用RT-PCR及Western Blot方法分析Tex33基因在精子发生不同发育时相中的表达模式;应用免疫荧光染色法分析Tex33蛋白在睾丸组织和精子中的细胞及亚细胞定位。3.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建Tex33基因敲除小鼠;应用Western Blot及睾丸组织免疫荧光染色等方法进行基因敲除小鼠的鉴定。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:观察并比较Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸、附睾形态及睾丸/体重比是否存在差异;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠睾丸的组织学结构;运用PAS染色法观察Tex33 HOM小鼠顶体发育过程;应用H&E染色法结合CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子质量;应用α-Tubulin免疫荧光染色法观察Tex33 HOM小鼠manchette微管形态结构;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠卵巢的组织结构;运用小鼠合笼实验分析Tex33 HOM小鼠的生育能力。结果:1.RT-PCR法成功扩增了 Tex33基因ORF序列,测序结果显示:构建的pET-30a-Tex33原核表达重组质粒序列完全正确。经IPTG诱导、纯化和复性后,成功获得了高纯度的Tex33原核蛋白。经4次重复免疫新西兰大白兔,获得了 Tex33多克隆抗体。ELISA检测发现多克隆抗体效价为1:1 00 0000。Western Blot结果显示:Tex33多克隆抗体能特异性识别睾丸组织和纯化的Tex33蛋白,其大小与预测的相一致。2.多组织RT-PCR分析发现,Tex33基因的三个剪接体均为睾丸组织特异性表达。Western Blot结果显示Tex33蛋白也仅在睾丸组织中表达。RT-PCR分析表明,Tex33基因的剪接体V2在小鼠出生后第21天开始微弱表达,第28天达到高峰,之后一直维持到成年。V1和V3从出生后第28天开始表达,直到成年维持在最高水平。Western Blot结果显示,Tex33蛋白表达开始于出生后第28天,持续高表达至成年。免疫荧光染色结果显示Tex33蛋白定位于精子细胞的顶体及manchette微管,在成熟精子中位于顶体及精子的尾部全长。3.运用CRISPR/Cas9技术靶向敲除Tex33基因的外显子2-4号,PCR法对Tex33基因敲除子代小鼠进行基因型鉴定。Western Blot及免疫荧光染色结果显示:Tex33 HOM小鼠睾丸内无Tex33蛋白表达,提示Tex33基因敲除小鼠构建成功。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸及附睾体积大小无显着性差异;Tex33 HOM小鼠的睾丸/体重比与WT小鼠相比无统计学差异;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠睾丸组织结构与WT小鼠无显着差异,生精小管的直径及各级生精细胞排列均正常;PAS染色对精子发生时相进行分析,结果表明Tex33 HOM小鼠顶体发育过程无明显异常;精子涂片H&E染色发现Tex33 HOM小鼠的精子形态与WT小鼠相比无明显差异,应用CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子运动能力,结果显示,Tex33 HOM小鼠的精子数量、前向运动力和总运动力与WT小鼠相比无显着性差异;睾丸组织α-Tubulin免疫荧光染色,发现Tex33 HOM小鼠和WT小鼠manchette微管形态均正常;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠和WT小鼠卵巢组织形态无明显差异;小鼠合笼实验结果显示Tex33 HOM雄性及雌性小鼠与WT小鼠相比平均每窝产仔率无统计学差异。结论:成功制备了特异性的高效Tex33多克隆抗体。Tex33是一种特异性表达于睾丸组织,具有高度遗传保守性的精子顶体及尾部基因,Tex33基因敲除并不影响小鼠精子发生过程,也不影响小鼠的生育能力,可能与其他基因共同调控精子形成过程,但其并非精子发生所必须。
管斯琪[10]（2020）在《补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究》文中认为目的人类生育力逐年降低已经成为影响发展的医学和社会学问题,男性因素导致的不孕不育占了 40%-50%,其中少弱精子症是男性不育症最常见的病因之一。对于特发性精液异常,西药治疗效果欠佳,手术治疗的应用范围存在一定局限性,而中医药具有较好的疗效。菟枸助育汤是在五子衍宗丸的基础上加减化裁而来,临床用于治疗少弱精子症逾20年,但目前尚无相关的研究。故本研究设计临床试验,观察评价菟枸助育汤对男性不育少弱精子症患者的临床疗效,并设计动物实验探究菟枸助育汤的核心药对“菟丝子-枸杞子”对生精功能障碍模型大鼠生精功能的影响,并对其具体的作用机制进行探讨。方法临床研究:收集男性不育少弱精子症76例,采用无病例对照研究的方法,观察菟枸助育汤对少精子症和弱精子症受试者精液质量（包括精液液化状态、精液量、精子活动率、精子浓度和总数等指标）和中医证候评分的干预作用。入组时,采集所有受试者的一般信息、病史、合并用药、体格检查等相关资料。研究第1天起每日给予入组的受试者菟枸助育汤中药免煎颗粒治疗,疗程共90天,分别于第0、30、60、90天各进行一次访视,记录受试者的精液常规结果和中医证候评分,同时进行安全性观察,记录各类不良事件,填写病例报告表,每次访视时严格进行脱落、剔除的评估,最后统计所有数据。实验研究:1.将78只SD大鼠随机分为空白对照组（NC组）、模型对照组（GTW组）、左卡尼汀组（GTW+LEV组）、菟丝子-枸杞子药对组（GTW+SCFL组）和药对+抑制剂组（LY+SCFL组）。2.除NC组以外,其余各组用雷公藤多苷（40mg/kg）灌胃4周,建立生精功能障碍模型。3.第5周起GTW+LEV组（予10ml/kg左卡尼汀灌胃）、GTW+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）和LY+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）每日分别予以相应药物干预,LY+SCFL组于第1周起每周1次尾静脉注射PI3K抑制剂。4.实验8周后测定各组大鼠精子质量、附睾/睾丸脏器系数,检测性激素、抑制素B、附睾肉毒碱的水平,光镜下和透射电镜下观察睾丸的组织病理形态和细胞的超微结构,用免疫组化法、western blot以及Real-Time PCR技术检测大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、Bad、Bcl-2 和 Bax 蛋白及 mRNA 的表达。结果临床研究:本研究共完成临床病例76例,纳入研究的男性不育少精子症和弱精子症患者经过菟枸助育汤治疗后,总体的精液质量中液化状态、PR精子百分比、PR+NP精子百分比、精子浓度和精子总数等疗效性指标显着改善,具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;中医证候评分随着治疗进行有了明显的下降（P<0.05或P<0.01）;疗效判定为“痊愈”的11例,“显效”29例,“有效”32例,“无效”4例,总有效率为94.74%。整个观察期间脱落病例4例,无剔除病例,未见任何不良反应报告。实验研究:经菟丝子-枸杞子干预后的GTW+SCFL组与GTW组相比,大鼠的一般状态、附睾脏器系数、精子质量、卵泡生成素（FSH）、黄体生成素（LH）、泌乳素（PRL）和附睾肉毒碱均有显着的改善,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;睾丸组织病理形态及细胞的超微结构观察发现,GTW+SCFL组与GTW组比较,生精小管结构、排列较正常,生精细胞明显增多,形态改善,内含的线粒体等细胞器增多;免疫组化、western blot和Real-Time PCR结果显示,与GTW组比较,GTW+SCFL组大鼠睾丸SCF、c-kit、PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白含量升高,Bax、Bad蛋白表达下降（P<0.05或P<0.01）;LY+SCFL组与GTW+SCFL组相比,SCF、c-kit和PI3K的表达无明显差异,p-Akt和Bcl-2表达减少,Bad和Bax的蛋白表达增加（p<0.05或P<0.01）。结论1.菟枸助育汤在改善男性不育少弱精子症患者的精液参数和肾虚证候中医评分方面疗效显着,能提高患者的生精功能。2.菟枸助育汤中的核心药对“菟丝子-枸杞子”可以改善生精功能障碍模型大鼠一般状态、附睾脏器系数、精子质量、FSH、LH、PRL和附睾肉毒碱,并对雷公藤多苷致睾丸组织和生精细胞的形态结构和功能的损伤具有较好的修复作用。3.“菟丝子-枸杞子”药对可以有效调控模型大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、BAD、Bcl-2、Bax 蛋白及其 mRNA 的表达,通过调控 SCF/c-kit-PI3K-Bcl-2 信号通路促进生精细胞增殖和抑制生精细胞凋亡的作用。综上,菟枸助育汤可有效提高男性不育少弱精子症患者的生精功能,临床疗效显着,其作用机制可能是通过SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路调控生精细胞增殖和凋亡来实现的。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 本项研究受下列基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写与符号清单 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪睾丸发育过程及其表观遗传调控 |
| 1.1.1 公猪的性成熟 |
| 1.1.2 猪睾丸发育过程 |
| 1.1.3 间质细胞在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生的表观遗传调控 |
| 1.2 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.1 环状RNA的生物起源、特性及功能 |
| 1.2.2 环状RNA的数据发掘、分析及研究方法 |
| 1.2.3 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.4 结论和展望 |
| 1.3 m6A修饰在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3.1 m6A修饰概述 |
| 1.3.2 m6A修饰的检测 |
| 1.3.3 m6A修饰的生物学功能 |
| 1.3.4 哺乳动物精子发生过程中m6A修饰的动态调节 |
| 1.3.5 结论与展望 |
| 第二章 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学观察与分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 睾丸大小 |
| 2.2.2 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学特征 |
| 2.2.3 睾丸组织显微观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 石蜡切片及H&E染色 |
| 2.3.2 性成熟前后长白种公猪睾丸发育情况 |
| 2.3.3 性成熟前后长白种公猪睾丸组织结构观察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 性成熟前后公猪睾丸文库构建及环状RNA的鉴定与基本特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 睾丸组织样本RNA提取及质检结果 |
| 3.2.2 RNA文库构建及高通量测序数据质量分析 |
| 3.2.3 环状RNA的鉴定 |
| 3.2.4 性成熟前后长白种公猪睾丸组织中环状RNA的基本特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 性成熟前后长白种公猪睾丸环状RNA的差异表达及生物信息学分析 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 性成熟前后公猪睾丸组织中显着差异表达环状RNA的鉴定与分析 |
| 4.2.2 性成熟前后公猪睾丸组织环状RNA测序结果的试验验证 |
| 4.2.3 差异环状RNA的GO分析 |
| 4.2.4 差异环状RNA的 KEGG信号通路富集分析 |
| 4.2.5 环状RNA靶miRNA预测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 性成熟前后长白种公猪睾丸转录组信使RNA甲基化图谱的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 数据质控与序列统计 |
| 5.2.2 参考基因组比对 |
| 5.2.3 全基因组m6A Peak扫描分析 |
| 5.2.4 差异Peak分析 |
| 5.2.5 m6A Motif分析 |
| 5.2.6 RNA-seq基因/转录本差异结果分析 |
| 5.2.7 RNA-seq中差异基因GO富集分析 |
| 5.2.8 RNA-seq中差异基因KEGG富集分析 |
| 5.2.9 MeRIP-seq中差异m6A Peak GO富集分析 |
| 5.2.10 MeRIP-seq中差异m6A Peak KEGG富集分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 睾丸的生物学功能概述 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 睾丸支持细胞的生物学功能 |
| 1.3 免疫豁免特性 |
| 1.3.1 血-睾屏障 |
| 1.3.2 免疫抑制 |
| 2 非编码RNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 2.1 miRNAs及其在哺乳动物睾丸中的研究进展 |
| 2.2 CircRNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 3 转录组测序技术在哺乳动物生殖系统中的应用研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 不同发育期藏绵羊睾丸circRNA/miRNA/mRNA表达谱特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品收集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织形态学分析 |
| 1.3.2 总RNA提取及质检 |
| 1.3.3 cDNA文库和小RNA文库的构建及测序 |
| 1.3.4 数据质控及mRNA、circRNA、miRNA的鉴定 |
| 1.3.5 差异表达分析 |
| 1.3.6 功能富集分析 |
| 1.3.7 RT-qPCR验证 |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同发育阶段藏绵羊睾丸组织形态学特征比较分析 |
| 2.2 mRNA、circRNA和miRNA测序数据概述 |
| 2.3 差异表达分析 |
| 2.3.1 差异表达mRNA分析 |
| 2.3.2 CircRNA表征及差异表达分析 |
| 2.3.3 差异表达miRNA分析 |
| 2.4 测序结果验证 |
| 2.4.1 mRNA测序结果验证 |
| 2.4.2 CircRNA测序结果验证 |
| 2.4.3 miRNA测序结果验证 |
| 2.5 功能注释与富集分析 |
| 2.5.1 差异表达mRNAs功能注释与富集分析 |
| 2.5.2 差异circRNAs来源基因功能注释与富集分析 |
| 2.5.3 差异circRNAs来源基因与差异mRNAs共享基因的功能富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 CircRNA-miRNA-mRNA整合分析及睾丸功能维持相关基因的ceRNA调控网络鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 CircRNA-miRNA-mRNA关联性分析 |
| 1.3.2 功能注释与富集分析 |
| 1.3.3 荧光素酶报告基因载体构建及鉴定 |
| 1.3.4 细胞转染及双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.5 RT-qPCR检测 |
| 1.3.6 Western blot分析 |
| 1.3.7 组织免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CircRNA/miRNA/mRNA关联性分析 |
| 2.2 ceRNA网络中mRNAs的功能富集分析 |
| 2.3 CircRNA-miRNA-mRNA网络构建 |
| 2.4 Circ_015256/circ_029155-miR-760-3p-BOLL靶向关系验证 |
| 2.5 Circ_029155/miR-760-3p/BOLL在睾丸中的表达特征 |
| 2.6 BOLL蛋白在绵羊睾丸中的表达与分布特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 睾丸免疫特权维持相关基因的鉴定及其ceRNA调控网络研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫相关差异表达基因鉴定与筛选 |
| 1.3.2 免疫相关miRNA-mRNA对及ceRNA共表达网络构建 |
| 1.3.3 RT-qPCR分析 |
| 1.3.4 Western blot分析 |
| 1.3.5 免疫荧光染色 |
| 1.3.6 双荧光素酶报告试验 |
| 1.3.7 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 性成熟前、后睾丸差异基因功能分类 |
| 2.2 免疫相关基因鉴定及表达特征分析 |
| 2.3 免疫相关差异基因的RT-qPCR验证 |
| 2.4 免疫相关基因编码蛋白的表达与定位 |
| 2.5 免疫相关基因功能注释分析 |
| 2.6 免疫相关基因的miRNA-mRNA调控网络分析 |
| 2.7 免疫相关差异miRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.8 免疫相关基因的circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 2.9 免疫相关差异表达circRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.10 靶向关系验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CircKLHL5靶向miR-29b/IGF1信号轴对绵羊睾丸支持细胞发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品采集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 藏绵羊睾丸支持细胞的体外分离与纯化 |
| 1.3.2 支持细胞纯度鉴定 |
| 1.3.3 载体构建、细胞培养与转染 |
| 1.3.4 支持细胞核质分离 |
| 1.3.5 CircHLHL5成环鉴定 |
| 1.3.6 CCK-8分析 |
| 1.3.7 EdU染色 |
| 1.3.8 RT-qPCR |
| 1.3.9 Western blot |
| 1.3.10 细胞免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.11 酪胺信号放大-荧光原位杂交(TSA-FISH) |
| 1.3.12 流式检测细胞凋亡 |
| 1.3.13 双荧光素报告基因检测 |
| 1.3.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Circ_026259/miR-29b/IGF1轴的组织表达特征 |
| 2.2 绵羊睾丸支持细胞形态及免疫荧光鉴定 |
| 2.3 睾丸支持细胞中circKLHL5的鉴定 |
| 2.4 CircKLHL5转染效率检测 |
| 2.5 CircKLHL5可促进绵羊睾丸支持细胞增殖并抑制其凋亡 |
| 2.6 CircKLHL5与miR-29b靶向关系验证 |
| 2.7 Oar-miR-29b对睾丸支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.8 Oar-miR-29b与IGF1基因间靶向关系验证 |
| 2.9 IGF1转染效率检测 |
| 2.10 IGF1基因对支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.11 Oar-miR-29b可逆转circKLHL5对支持细胞表型的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1 少精症与动物模型 |
| 2 少精症与精子发生 |
| 3 4.1R蛋白与精子发生 |
| 4 血睾屏障与精子发生 |
| 5 Wnt/β-catenin信号通路与精子发生 |
| 6 研究意义与内容 |
| 7 试验方案 |
| 第二章 4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达与作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 少精症小鼠模型的建立 |
| 3.2 睾丸组织中4.1R蛋白表达水平检测 |
| 3.3 睾丸组织中epb41 基因转录水平检测 |
| 3.4 睾丸组织中4.1R蛋白表达分布检测 |
| 3.5 血睾屏障功能分析 |
| 3.6 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 少精症模型小鼠精子密度测定 |
| 4.2 少精症模型小鼠附睾和睾丸形态学检测 |
| 4.3 4.1R蛋白在小鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.4 少精症小鼠睾丸中epb41 基因转录水平检测 |
| 4.5 少精症小鼠睾丸组织中4.1R蛋白表达分布 |
| 4.6 少精症模型小鼠血睾屏障功能分析 |
| 4.7 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分转录检测 |
| 4.8 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 4.1R蛋白表达对睾丸支持细胞增殖和连接的调节作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 Epb41 基因CRISPR-cas9 质粒载体构建与验证 |
| 3.2 CRISPR-Cas9 慢病毒载体构建 |
| 3.3 过表达慢病毒载体的构建 |
| 3.4 TM4 细胞培养 |
| 3.5 原代睾丸支持细胞培养 |
| 3.6 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.7 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.8 过表达慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.9 过表达慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.10 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 Epb41-sg RNAs与 pGL3-U6-sg RNA-puromycin和 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体连接 |
| 4.2 pGL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和 pSpCas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP共转染N2a细胞 |
| 4.3 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP 慢病毒载体检测 |
| 4.4 过表达慢病毒载体的构建与验证 |
| 4.5 慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 4.6 慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 4.7 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 4.1R蛋白表达对体内睾丸支持细胞间连接的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒载体电转染小鼠活体睾丸组织 |
| 3.2 慢病毒载体睾丸活体转染 |
| 3.3 小鼠活体睾丸转染效果验证 |
| 4 结果 |
| 4.1 质粒载体活体电转染睾丸组织方法验证 |
| 4.2 重组CRISPR-Cas9 基因敲除质粒载体电转染睾丸 |
| 4.3 过表达慢病毒载体转染睾丸 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 附件 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛睾丸发育 |
| 1.1.1 出生后牛睾丸生长发育 |
| 1.1.2 牛的精子发生 |
| 1.1.3 牛睾丸间质细胞和支持细胞发育 |
| 1.2 非编码RNA与睾丸发育 |
| 1.2.1 miRNA与睾丸发育 |
| 1.2.2 lncRNA与睾丸发育 |
| 1.2.3 circRNA与睾丸发育 |
| 1.2.4 ceRNA调控与睾丸发育 |
| 1.3 单细胞测序技术与睾丸发育 |
| 1.3.1 单细胞测序技术 |
| 1.3.2 单细胞测序技术在睾丸发育中的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 安格斯牛睾丸组织不同时期lncRNA鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 切片制备和HE染色 |
| 2.2.2 总RNA提取 |
| 2.2.3 文库构建及测序 |
| 2.2.4 转录组测序数据分析 |
| 2.2.5 睾丸细胞的分离和RT-qPCR验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 睾丸组织的形态学检测 |
| 2.3.2 牛睾丸中lncRNA和 mRNA的测序信息 |
| 2.3.3 lncRNAs和 mRNA的基因组特征和表达谱分析 |
| 2.3.4 差异表达的mRNA富集分析 |
| 2.3.5 差异lncRNA靶基因富集分析 |
| 2.3.6 差异 lncRNA 及 mRNA 的表达谱验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 安格斯牛睾丸组织不同时期miRNA鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2 文库构建、测序及分析 |
| 3.2.3 RT-qPCR验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛睾丸小RNA测序文库质控分析 |
| 3.3.2 牛睾丸已知和新miRNA的鉴定和特征分析 |
| 3.3.3 性成熟前后睾丸差异表达的miRNA |
| 3.3.4 差异表达的miRNA靶基因预测 |
| 3.3.5 差异表达的miRNA靶基因富集分析 |
| 3.3.6 差异表达的miRNA RT-qPCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 安格斯牛睾丸组织不同时期circRNA鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 总RNA提取 |
| 4.2.2 文库构建及测序 |
| 4.2.3 测序结果分析 |
| 4.2.4 RT-qPCR验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛睾丸circRNA鉴定 |
| 4.3.2 初生期和性成熟期睾丸circRNA差异表达 |
| 4.3.3 差异表达circRNA宿主基因的富集分析 |
| 4.3.4 差异表达的circRNA RT-qPCR验证 |
| 4.3.5 circRNA-miRNA-mRNA网络的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 circSMC1B通过靶向let-7i调控公牛生殖干细胞的增殖及凋亡 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验样品 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 circSMC1B全长扩增及载体构建 |
| 5.2.2 细胞增殖实验 |
| 5.2.3 细胞凋亡实验 |
| 5.2.4 RNA提取及cDNA合成及RT-qPCR实验 |
| 5.2.5 双荧光素酶报告系统载体构建 |
| 5.2.6 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 circSMC1B鉴定 |
| 5.3.2 circSMC1B促进mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.3 circSMC1B促进mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.4 circSMC1B竞争性结合let-7i |
| 5.3.5 let-7i抑制mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.6 let-7i抑制mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.7 let-7i靶向HMGA1、NR6A1 调控mGSCs细胞增殖凋亡 |
| 5.3.8 circSMC1B竞争性结合let-7i促进mGSCs增殖凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 牛睾丸组织发育的单细胞转录图谱绘制 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验样品 |
| 6.1.2 主要试剂及仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 睾丸单细胞悬液制备 |
| 6.2.2 单细胞测序基本流程 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 睾丸样本的HE染色 |
| 6.3.2 单细胞数据的质控和细胞类型鉴定 |
| 6.3.3 牛睾丸不同细胞群特异表达基因的鉴定分析 |
| 6.3.4 牛睾丸生殖细胞类型鉴定及分化过程 |
| 6.3.5 牛精原细胞基因动态表达 |
| 6.3.6 牛精母细胞基因动态表达 |
| 6.3.7 牛精子细胞基因动态表达 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 DEHP的来源与危害 |
| 1.2 职业人群DEHP暴露现状 |
| 1.3 国内外PAEs职业接触限值制定现状 |
| 1.4 国内外男性生殖安全现状 |
| 1.5 DEHP对雄性生殖安全的影响 |
| 1.6 DEHP对雄性生殖安全影响机制的研究现状 |
| 1.6.1 氧化应激在雄性生殖毒性中的作用 |
| 1.6.2 凋亡和自噬在雄性生殖系统中的作用 |
| 1.6.3 piRNA/PIWI通路对男性生殖功能的调控 |
| 1.6.4 PIWI蛋白参与其他信号通路的调控 |
| 1.7 课题研究意义、研究内容 |
| 1.7.1 课题研究意义 |
| 1.7.2 课题研究内容 |
| 第2章 DEHP诱导雄性生殖毒性中piRNA/PIWI介导的通路研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 建立DEHP暴露导致雄性生殖毒性的动物模型 |
| 2.2.1 实验动物的选择 |
| 2.2.2 DEHP染毒时间和染毒途径的选择 |
| 2.2.3 DEHP染毒剂量的确定 |
| 2.2.4 实验动物的染毒方法 |
| 2.2.5 动物模型样本组织收集 |
| 2.3 DEHP诱导大鼠生殖毒性的研究 |
| 2.3.1 DEHP诱导大鼠生殖毒性的检测方法 |
| 2.3.2 DEHP诱导大鼠生殖毒性的分析 |
| 2.4 DEHP对大鼠睾丸组织piRNA和 PIWI蛋白表达水平的影响 |
| 2.4.1 大鼠睾丸组织PIWI蛋白表达水平检测的实验方法 |
| 2.4.2 大鼠睾丸组织piRNA表达水平检测实验方法 |
| 2.4.3 大鼠睾丸组织PIWI蛋白表达水平的分析 |
| 2.4.4 大鼠睾丸组织piRNA表达水平分析 |
| 2.5 基于piRNA/PIWI预测DEHP诱导雄性生殖毒性调控通路 |
| 2.5.1 piRNA介导的DEHP诱导雄性生殖毒性调控通路的研究 |
| 2.5.2 基于piRNA/PIWI预测DEHP诱导雄性生殖毒性调控通路的理论分析 |
| 2.5.3 预测的piRNA/PIWI调控通路中蛋白表达水平检测及分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 DEHP诱导青春期大鼠生殖毒性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 不同DEHP暴露水平对青春期大鼠生殖毒性的研究 |
| 3.2.1 DEHP暴露的大鼠模型构建 |
| 3.2.2 大鼠生殖功能检测方法 |
| 3.2.3 DEHP暴露对大鼠生殖功能的影响 |
| 3.2.4 DEHP暴露对睾丸组织形态学的影响 |
| 3.2.5 不同剂量DEHP对睾丸细胞凋亡和自噬的影响 |
| 3.2.6 DEHP对大鼠睾丸组织形态学、细胞凋亡和自噬影响的分析 |
| 3.3 不同暴露水平的DEHP对大鼠生殖毒性的作用机制 |
| 3.3.1 DEHP暴露对大鼠睾丸组织氧化应激的影响 |
| 3.3.2 DEHP对大鼠睾丸组织氧化应激影响的分析 |
| 3.3.3 STAT3/p53 通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用 |
| 3.3.4 FoxO通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用 |
| 3.4 DEHP诱导青春期雄性大鼠生殖毒性的分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 DEHP代谢产物MEHP对小鼠初级精母细胞(GC2-spd)毒性作用的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 GC-2spd细胞染毒方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 细胞染毒时间和染毒剂量的研究 |
| 4.3 MEHP对 GC-2spd细胞氧化应激的影响 |
| 4.3.1 抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)浓度筛选实验研究 |
| 4.3.2 GC-2spd细胞内氧化应激的检测方法 |
| 4.3.3 MEHP影响GC-2spd细胞氧化应激的分析 |
| 4.4 不同剂量MEHP对 GC-2spd细胞毒性的影响 |
| 4.4.1 MEHP暴露的GC-2spd细胞凋亡水平评价方法 |
| 4.4.2 不同剂量MEHP对 GC-2spd细胞凋亡影响的分析 |
| 4.5 不同剂量MEHP影响GC-2spd细胞自噬的研究 |
| 4.5.1 GC-2spd细胞自噬的检测方法 |
| 4.5.2 不同剂量MEHP对 GC-2spd细胞自噬影响的分析 |
| 4.6 不同剂量MEHP诱导GC-2spd细胞毒性机制的研究 |
| 4.6.1 MEHP对 GC-2spd细胞STAT3/p53 通路的影响 |
| 4.6.2 MEHP对 GC-2spd细胞FoxO通路的影响 |
| 4.6.3 STAT3/p53和FoxO通路在MEHP暴露的GC-2spd细胞中的作用 |
| 4.7 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药对少弱精子症的研究进展 |
| 1. 中医药对少弱精子症的认识 |
| 2. 中医病因及辨证分型 |
| 3. 中药复方研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 现代医学对少弱精子症的研究进展 |
| 1. 少弱精子症的病因 |
| 2. 睾丸生精细胞增殖分化相关机制 |
| 3. 少弱精子症的西医治疗 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第一部分 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的网络药理学预测 |
| 1. 引言 |
| 2. 方法与材料 |
| 2.1 益肾兴阳胶囊活性成分筛选及作用靶点预测 |
| 2.2 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症PPI网络的构建 |
| 2.3 功能模块分析及作用机制解析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 益肾兴阳胶囊化学成分筛选、作用靶点和疾病靶点预测结果 |
| 3.2 少弱精子症和益肾兴阳胶囊蛋白互作网络构建 |
| 3.3 功能模块分析结果 |
| 3.4 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的作用机制和有效成分分析 |
| 3.5 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的活性成分验证 |
| 4. 讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型治疗作用与机制的实验研究 |
| 第一章 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型的实验研究 |
| 第一节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型精子质量影响 |
| 参考文献 |
| 第二节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型精子ATP影响 |
| 参考文献 |
| 第三节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型生精细胞周期影响 |
| 参考文献 |
| 第四节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型睾丸组织生精细胞、支持细胞超微结构影响 |
| 第五节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型睾丸组织PI3K、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK、Bcl-2、Bax蛋白表达影响 |
| 参考文献 |
| 第二章 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型的实验研究 |
| 第一节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型精子质量影响 |
| 参考文献 |
| 第二节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型血清性激素影响 |
| 参考文献 |
| 第三节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型精子线粒体膜电位影响 |
| 参考文献 |
| 第四节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路影响 |
| 参考文献 |
| 第五节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型睾丸组织VDAC2、VDAC3、CHK1、CHK2蛋白表达的影响 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 第一节 五子衍宗丸概述 |
| 第二节 不育症动物模型的研究进展 |
| 第三节 基因表达谱在中药研究中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 白消安致少弱精症小鼠模型的建立 |
| 第一节 白消安诱导少弱精症小鼠模型的睾丸组织病理学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第二节 白消安诱导少弱精症小鼠模型的精子质量研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 5 综合讨论 |
| 第二章 五子衍宗丸对少弱精症小鼠的生精作用探究 |
| 第一节 五子衍宗丸对少弱精症小鼠睾丸脏器指数和组织病理学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 五子衍宗丸对少弱精症小鼠精子数量和活力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 五子衍宗丸对少弱精症小鼠生育能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 五子衍宗丸生精作用的分子机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 雄激素治疗少弱精子症的研究总结 |
| 前言 |
| 第一节 雄激素及相关制剂在男性特发性少弱精子症治疗中的应用现状 |
| 1. 男性不育症及特发性少弱精子症概念 |
| 2. 睾酮生成与精子发生的关系 |
| 3. 雄激素口服及注射常用制剂的药代动力学以及安全性 |
| 4. 雄激素制剂的用法和疗效 |
| 5. 中医药对少弱精子症的治疗 |
| 6. 雄激素在少弱精子症治疗中的展望 |
| 参考文献 |
| 第二节 国内雄激素治疗少弱精子症对患者精液参数改善情况的荟萃分析 |
| 1. 资料与方法 |
| 1.1 检索策略 |
| 1.2 干预措施以及结局变量 |
| 1.3 疗效判定标准 |
| 1.4 纳入标准 |
| 1.5 剔除标准 |
| 1.6 文献筛选与资料提取 |
| 1.7 文献质量评估 |
| 1.8 统计学处理方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 文献检索情况 |
| 2.2 荟萃分析结果 |
| 2.2.1 精液量 |
| 2.2.2 精子浓度 |
| 2.2.3 精子活力 |
| 2.2.4 精子畸形率 |
| 2.2.5 精子活动率 |
| 2.2.6 总有效率(%) |
| 2.3 发表偏倚分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 雄激素对正常大鼠生殖激素水平及生精功能的影响 |
| 前言 |
| 第一节 正常大鼠雄激素的给药方式及标本取材 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 第二节 TU注射对正常大鼠睾丸形态的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 第三节 TU注射对正常大鼠生殖激素的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 TST对少弱精子症模型大鼠生殖功能影响的研究 |
| 前言 |
| 第一节 少弱精子症大鼠模型的建立、雄激素治疗性给药以及标本取材 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 第二节 TST对少弱精子症大鼠模型的睾丸组织形态的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 第三节 TST对睾丸组织生精细胞凋亡的检测(TUNEL法) |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 第四节 TST对少弱精子症模型大鼠生殖激素的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 第五节 TST对少弱精子症模型大鼠睾丸组织氧化应激指标以及睾酮水平的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 TST对少弱精子症模型大鼠睾丸组织蛋白及血清代谢组学的调控研究 |
| 前言 |
| 第一节 透射电镜观察“生理剂量”TST对大鼠睾丸组织超微结构的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 第二节 TST对少弱精子症模型大鼠作用的HPLC-MS分析——基于代谢组学的研究 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 结论 |
| 第三节 Bcl-2/Bax-Caspase3/9和TNFα-RIPK1-MLKL凋亡途径相关基因蛋白表达调控 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 博士期间发表论文及参与科研项目情况 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 慢病毒载体及菌株 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 RNA提取(Trizol法) |
| 2.2 RNA逆转录 |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4 GV369-miR-194-5p重组质粒的构建 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 miR-194-5p慢病毒的包装 |
| 2.7 稳定过表达miR-194-5p F9细胞株的建立 |
| 2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.9 MDC法检测细胞自噬 |
| 2.10 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.11 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 过表达miR-194-5p慢病毒重组质粒的构建 |
| 3.2 过表达miR-194-5p慢病毒的包装 |
| 3.3 稳定过表达miR-194-5p F9细胞株的构建与鉴定 |
| 3.4 miR-194-5p通过Stra8调控细胞凋亡 |
| 3.5 miR-194-5p靶向Stra8通过JNK线粒体细胞凋亡信号通路调控生精细胞细胞凋 |
| 3.6 miR-194-5p通过Stra8促进细胞自噬 |
| 讨论 |
| 第2章 睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验载体及菌株 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Tex33多克隆抗体的制备 |
| 2.2 基因型鉴定 |
| 2.3 多组织RNA提取(Trizol法)及逆转录 |
| 2.4 多组织PCR扩增 |
| 2.5 多组织Western Blot |
| 2.6 石蜡切片的制作 |
| 2.7 H&E染色 |
| 2.8 PAS染色 |
| 2.9 组织免疫荧光染色 |
| 2.10 精子质量分析 |
| 2.11 敲除小鼠生育力检测 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 Tex33多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.2 Tex33基因在小鼠体内的组织表达模式 |
| 3.3 Tex33基因在小鼠精子发生的时间表达模式 |
| 3.4 Tex33蛋白在小鼠精子发生中的表达定位 |
| 3.5 应用CRISPR/Cas9系统构建Tex33基因敲除小鼠并鉴定 |
| 3.6 Tex33基因敲除小鼠的表型分析 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 MicroRNA参与调控睾丸支持细胞的增殖与粘附功能 |
| 参考文献(References) |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药诊治男性不育少弱精子症的研究进展 |
| 1 少弱精子症诱因 |
| 2 中医病名 |
| 3 中医病因病机 |
| 4 中医药治疗 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白及通路的研究进展 |
| 1 精子发生的三个阶段 |
| 2 生精细胞的增殖 |
| 3 生精细胞的凋亡 |
| 4 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 菟枸助育汤治疗男性不育少弱精子症的临床研究 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 菟丝子-枸杞子对生精功能障碍SD大鼠生精功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路探讨菟丝子-枸杞子调控生精细胞增殖与凋亡的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
