IL-6mRNA在排斥反应中的动态表达及其与移植心脏存活时间的相关性

一、IL-6mRNA在排异反应中的动态表达及其与移植心脏生存时间的相关性研究（论文文献综述）

叶书林^[1]（2021）在《木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中研究说明目的:同种异体器官移植是治疗终末器官衰竭的有效手段。为了维持移植物在受者体内的存活,往往需要长期服用免疫抑制剂。一方面,术后器官排斥反应因免疫抑制剂的使用得以降低;另一方面长期应用免疫抑制剂的不良反应严重影响移植物和移植患者的存活,是移植免疫学和临床医学研究亟待解决的一大难题。中药免疫调节相关的基础研究和临床研究取得许多新的进展,从中药中寻求高效、低毒的免疫抑制剂是当今移植免疫学领域的研究方向之一。木犀草素是一种黄酮类化合物,研究表明木犀草素具有许多药理作用,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等。在免疫调节作用方面的研究中发现木犀草素可以抑制小鼠T细胞的增殖和活化,下调IFN-γ、IL-6、IL-5等细胞因子的表达,具有免疫抑制作用。此外,还可以通过诱导CD4+CD25T淋巴细胞向CD4+CD25+调节性T细胞分化来减轻气道炎症。然而,目前木犀草素对于同种异体器官移植排斥反应方面的作用研究仍为空白。由于皮肤上抗原呈递细胞很多,排斥反应比其他器官移植更强,若药物能抑制皮肤排斥反应,则更能抑制其他器官移植排斥。因此,本实验首先通过小鼠同种异体皮肤移植模型探讨木犀草素对移植排斥反应的作用,再以同种异体胰岛移植模型进行验证,研究木犀草素对小鼠同种异体器官排斥反应的作用,以及其免疫调节的作用机制。方法:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究建立小鼠皮肤移植模型,以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植皮片生存时间的影响,用中位存活时间（Mediansurvival time,MST）表示;移植10天后,取移植皮片检测炎症细胞浸润、CD3、Foxp3及相关细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17a、Foxp3基因的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和外周引流淋巴结检测CD4+CD44high CD62Llow 和 CD8+CD44high CD62Llow 效应 T 细胞、CD4+Foxp3+调节性 T细胞、CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟树突状细胞的比例。木犀草素联合应用Anti-CD25删除小鼠体内Treg对小鼠皮肤移植反应的实验研究,分为四组:同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）、木犀草素高剂量联合同型对照组（Lut-H+Isotype,木犀草素50mg/kg灌胃联合Isotype抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,以及木犀草素高剂量联合Anti-CD25抗体组（Lut-H+PC61,木犀草素50mg/kg灌胃联合PC61抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,观察移植皮片生存时间,同时检测移植10天后脾脏和淋巴结中CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟DC的比例。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究以BALB/c小鼠胰岛细胞为供体,移植到STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠肾包膜下,建立小鼠同种异体胰岛移植模型。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体胰岛移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植后血糖的影响,用中位存活时间（Median survival time,MST）表示;移植10天后,取胰岛移植物检测胰岛素、炎症细胞浸润及CD3+T的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和引流淋巴结通过流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验流式细胞术分选CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8法检测木犀草素对体外CD3+T细胞的细胞毒性,CFSE法检测木犀草素对体外CD3+T淋巴细胞增殖的影响,ELISA检测CD3+T细胞上清液中细胞因子IFN-y、IL-10和IL-17a蛋白的表达水平,流式细胞术分选CD4+CD25-T,检测木犀草素干预后对CD4+CD25+Treg的分化情况,Western Blotting检测木犀草素干预后CD3+T细胞中AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。结果:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素低剂量组和高剂量组均能延长移植皮片的存活时间[MST=23.50±5.34（Lut-low）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.05;MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.01]。此外,与雷帕霉素组比较,木犀草素高剂量组在延长皮肤移植物存活率的作用差异无统计学意义（MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.35.00±6.70（Rapa）,P>0.05）。（2）在移植皮片中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均能改善炎症细胞浸润,抑制CD3+T淋巴细胞浸润,上调Foxp3的表达,同时抑制促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17amRNA的表达,上调IL-10和Foxp3mRNA的表达。（3）在受体小鼠淋巴器官脾脏和淋巴结中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均可显着降低CD4+CD44highCD62Llow和CD8+CD44highCD62Llow 效应 T 细胞以及 CD11c+CD86+和 CD11c+CD80+成熟 DC 的比例,同时显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）。（4）在应用Anti-CD25抗体删除Treg后,可逆转木犀草素延长移植皮片生存时间的作用,同时逆转对成熟DC的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素可延长移植术后胰岛的存活时间。（2）在胰岛移植区域,与对照组相比,木犀草素可减轻炎症细胞浸润。（3）在受体小鼠周围淋巴器官中,与对照组相比,木犀草素可上调移植后引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验（1）不同浓度的木犀草素（1.25、2.5、5、10和20μM）给药48h和96h后,仅20μM浓度木犀草素对T细胞有活力有明显抑制作用（P<0.01）。（2）在T细胞增殖实验中,与对照组相比,木犀草素低浓度（Lut-low,2.5μM）和木犀草素高浓度（Lut-high,5μM）组与雷帕霉素组（Rapa,0.1μM）一样,均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）。（3）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能显着抑制CD3+T细胞上清液中IFN-y和IL-17a的蛋白水平（P<0.01）,并上调IL-10蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01）。（4）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能明显促使CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+Treg分化（P<0.01）。（5）木犀草素（无论低浓度还是高浓度）能有效抑制P-p70S6K、P-mTOR和P-AKT蛋白的表达（P<0.01）,而雷帕霉素组对P-AKT蛋白的表达无明显作用（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了不管是在小鼠同种异体皮肤移植模型中还是胰岛同种异体移植模型中,木犀草素均可显着延长移植物的存活时间,提示木犀草素可抑制同种异体器官移植排斥反应,其潜在的作用机制可能是通过抑制效应性T细胞的增殖、DCs的成熟,同时诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,以及抑制AKT/mTOR信号通路的激活而实现的。因此,我们的研究填补了木犀草素在抑制移植反应作用方面的空白,木犀草素在自然界中来源广泛,无明显毒副作用,作为一种潜在的免疫抑制剂,具有进一步深入研究的价值。

黄涛^[2]（2020）在《α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中认为研究背景肾缺血再灌注损伤（Renal ischemia/reperfusion injury,IRI）是指肾脏缺血后血流再灌注或氧气再灌注后自身损伤加重,这一独特的病理生理反应可致肾功能严重损害,严重者甚至可致患者死亡。现有研究表明炎症反应的发生在肾IRI中发挥了重要作用,但具体机制仍未完全阐明。迷走神经的神经递质乙酰胆碱可以通过激 α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetycholine receptor,α7nAChR）调节炎症反应,缓解炎症。PHA568487为一种乙酰胆碱受体激动剂,通过激活α7nAChR活化胆碱能抗炎通路,在IRI过程中具有调控炎症反应的功能,具有较好的临床应用前景。在机体创伤或病理改变致使细胞损伤时,体内的核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2）表达上调,激活氧化应激反应,最终可增强细胞对氧化应激的耐受能力。在缺血再灌注导致的器官损伤中,Nrf2信号通路依赖还原型辅酶以及醌氧化还原酶被激活后产生的诱导效应,对各种代谢引起的氧化应激反应发挥保护作用。血红素加氧酶（heme oxygenase,HO）广泛分布于机体的各组织器官中,具有保护组织免受IRI的作用。目前已有研究发现,激活后的Nrf2/HO-1信号通路广泛参与心、脑、肾和神经系统等组织器官的抗氧化应激损伤,保护细胞免受氧化应激的损伤,发挥抗氧化和抗凋亡的作用。但在肾IRI过程中,PHA568487是否对Nrf2/HO-1通路有调节作用尚无相关报道。环状RNA（circularRNA,circRNA）是一种没有5’帽状结构和3’腺苷酸尾的以首尾相接的方式构成的非编码RNA,它具有调节微小RNA（microRNA,miRNA）的特殊功能。近年来,有文献报道具有调节多种炎症相关人类疾病的功能。CircRNA不仅可以作为预测肾相关疾病的生物标志物,还可以通过调节靶向基因的功能以调节疾病发展进程。且除去传统的炎症通路,PHA568487能否调节circRNA的表达及其与肾IRI炎症过程的相关性仍无一例研究。目的本研究旨在探究α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用,并分析可能涉及的调控机制。我们建立了大鼠肾IRI动物模型,并探究PHA568487预处理对肾IRI大鼠血清中尿素氮、血肌酐水平、血清炎症相关细胞因子的水平、大鼠肾组织的病理变化以及肾组织细胞的凋亡情况等方面的影响以明确PHA568487对大鼠肾IRI是否有缓解作用。最后,我们通过细胞生物学实验探究其下游信号通路及分子机制,为临床药物治疗及靶向治疗提供理论依据。方法1.我们通过大鼠肾组织缺血后复灌注的方法构建肾IRI的Wista大鼠动物模型,并通过再灌注前2 h腹腔注射2.4 mg/kg PHA568487以构建PHA568487预处理的Wista大鼠肾IRI动物模型。（1）观察各组大鼠的一般状态并采集各组大鼠的血液样本和肾组织样本。（2）血液生化检测仪测定血清尿素氮和血肌酐水平,酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定各组大鼠血清 C 反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）、白细胞介素-1（interleukin-1g,IL-1r）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）和IL-6的表达。（3）收集大鼠肾脏组织,制作肾组织病理切片,行高碘酸-雪夫氏染色法（Periodic Acid-Schiff stain,PAS）染色,观察各组大鼠肾组织的病理变化。（4）TUNEL法检测各组大鼠肾组织细胞的凋亡情况。（5）qRT-PCR和Western Blot检测各组大鼠肾组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达情况。2.我们通过将人肾小管上皮细胞HK-2置于缺氧复氧环境下以构建肾IRI的模型;PHA568487预处理以构建PHA568487预治疗的体外肾IRI细胞模型;并使用Nrf-2特异性抑制剂ML385和PHA568487共同提前处理细胞,以探究Nrf-2在IRI的HK-2细胞中的作用。（1）首先我们通过CCK-8法检测各组细胞的增殖活性;（2）流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;（3）提取各组细胞的总RNA和总蛋白,采用 qRT-PCR 和 Western Blot 法分别检测 Nrf-2、HO-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达情况。3.首先,我们通过将人肾小管上皮细胞HK-2置于缺氧缺葡萄糖、复氧环境下以构建肾IRI的模型;通过PHA568487预处理以构建PHA568487预治疗的体外肾细胞IRI模型。（1）采用qRT-PCR检测了 PHA568487处理后IRI的HK-2细胞中circYAP1表达情况。（2）随后转染circYAP1过表达质粒到HK-2细胞中并构建IRI细胞模型,使用CCK-8法和流式细胞术检测circYAP1对细胞活力和凋亡的影响。使用ELISA和活性氧（reactive oxygen species,ROS）分别检测circYAP1过表达后对IL-1对、IL-6分泌以及ROS形成的作用。（3）通过生物预测网站预测与circYAP1存在靶向关系的miRNA,通过qRT-PCR检测敲低circYAP1后IRI的HK-2细胞中miR-21-5p表达情况,并使用荧光素酶报告基因实验进一步分析circYAP1与miR-21-5p的结合情况。（4）同时过表达circYAP1和miR-21-5p并构建IRI细胞模型,检测miR-21-5p对细胞活力、凋亡、炎症因子分泌和ROS形成的影响。最后,利用Westen Blot实验检测IRI的HK-2细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。结果1.（1）在构建成功的Wista肾IRI大鼠动物模型中,大鼠食欲降低,进食、饮水均减少,精神萎靡、活动较少且迟缓;血液生化检测结果表明大鼠血清中尿素氮和肌酐水平明显增高;此外,PAS染色显示大鼠肾组织中肾小球体积增大,可观察到间质区内有大量炎性细胞浸润、肾小球细胞呈空泡变性。另外,肾IRI大鼠血清中CRP、TNF-中、IL-1中、IL-6水平明显高于对照组大鼠;而且IRI组大鼠肾组织的细胞凋亡率明显较高,肾组织中Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显下降而Bax和Caspase-3的表达均明显增高。（2）与IRI组大鼠相比,经过PHA568487预处理的Wista肾IRI大鼠饮水、进食、精神状态和活动量均较好,血清中尿素氮和肌酐水平均有所降低且肾组织病理状态得到改善,这表明PHA568487能够明显改善肾缺血-再灌注损伤大鼠的肾脏组织病变。此外,经过PHA568487预处理,肾IRI大鼠血清中CRP、TNF-中、IL-1中、IL-6水平和组织细胞凋亡率显着降低,且Bcl-2的表达有所回升、Bax和Caspase-3的表达受到抑制。2.（1）在模拟肾IRI的HK-2细胞模型中,细胞增殖活性较对照组有所降低,但细胞凋亡率较高,同时伴随着Nrf2、HO-1、Bcl-2表达水平的降低和Caspase-3和Bax表达水平的提高。（2）经过PHA568487预处理,肾IRI的HK-2细胞的增殖活性增加、凋亡率降低,且PHA568487还能够提高肾IRI的HK-2细胞中Nrf2、HO-1、Bcl-2表达水平并抑制Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达。（3）与PHA568487预处理组相比,经过PHA568487和Nrf2抑制剂共孵育组的细胞增殖活性明显降低、凋亡率明显增高,Nrf2、HO-1、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平明显降低,而Caspase-3和Bax mRNA和蛋白的表达水平明显增高。3.（1）与IRI的HK-2细胞相比,PHA568487预处理可以提高HK-2细胞中的circYAP1表达水平。（2）转染circYAP1过表达质粒到HK-2细胞中并构建IRI细胞模型,CCK-8法和流式细胞术结果显示过表达circYAP1后细胞活力增强、细胞凋亡率降低,且可抑制IRI上调IL-1 β和IL-6以及ROS水平的作用。这表明,上调circYAP1表达能够缓解HK-2细胞的炎症损伤。（3）生物信息学数据库和qRT-PCR实验表明有多个miRNA与circYAP1存在靶向互补序列,且在下调circYAP1的HK-2 IRI细胞模型中可检测到相应miRNA表达水平的上升。随后,我们通过荧光素酶报告基因实验验证circYAP1在模拟IRI的HK-2细胞中充当miR-21-5p的海绵。进一步的细胞生物学实验也表明miR-21-5p可能参与了circYAP1调节的HK-2细胞炎症损伤过程,上调miR-21-5p后,原本circYAP1过表达对HK-2细胞炎症损伤的缓解作用减弱。最后,Western Blot实验结果表明circYAP1过表达通过抑制miR-21-5p表达水平,促进PI3K、AKT和mTOR蛋白的磷酸化,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。结论本研究主要集中于α 7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究,主要得出以下结论:1、PHA568487预处理能够有效保护因缺血-再灌注而引发的肾功能损害,抑制肾组织细胞凋亡;2、PHA568487预处理对肾IRI的保护作用主要是通过其能够抑制炎症因子的表达,抑制促凋亡基因水平、促进凋亡抑制基因表达来实现的;3、Nrf-2/HO-1通路通过抑制促凋亡基因Caspase-3和Bax的表达,促进凋亡抑制基因BCL-2的表达,进而发挥抑制IRI的HK-2细胞凋亡的作用,而PHA568487对HK-2细胞的作用部分是通过Nrf-2/HO-1来实现的。4、在IRI的HK-2细胞中,PHA568487预处理可以提高circYAP1表达水平;CircYAP1通过靶向结合miR-21-5p,减轻HK-2细胞的IRI反应、促进损伤细胞凋亡、激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。

严胡铃^[3]（2020）在《探讨hUC-MSCs调节HBV肝硬化患者免疫功能的可能机制》文中研究表明目的:本研究通过分析人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）移植治疗脾切除术后HBV-LC患者的多项肝功能和免疫学指标的变化,对比其与标准内科治疗的HBV-LC和正常人群免疫功能之间是否存在差异,探究hUC-MSCs移植的疗效和可能的作用机制。方法:共纳入符合标准的HBV-LC患者20例,其中10例自愿接受hUC-MSCs移植治疗,其余10例接受标准内科治疗,并选取同期健康体检者10例作为健康对照。hUC-MSCs移植组患者入院后1周在超声引导下经皮经肝门静脉输注1×108个hUC-MSCs,1次。分别检测hUC-MSCs移植组与内科治疗组移植/治疗前1周、移植/治疗后1、4、12周,以及健康对照组在入院体检的各血生化、凝血常规等指标,并计算Child-Pugh分级与MELD评分;采用免疫图谱分析TCR多样性;流式细胞术分析各T淋巴细胞亚群比例;ELISA检测血清中相关细胞因子分泌情况、Real-time PCR检测相关转录因子mRNA表达水平。结果:（1）hUC-MSCs移植组及内科治疗组移植/治疗前TP、Alb、A/G值均低于健康对照组,且分别在hUC-MSCs移植后第4、12周及内科治疗后第1、4、12周明显升高,且hUC-MSCs移植组在第12周时以上指标高于内科治疗组,各指标差异均具有统计学意义（P<0.05）。（2）hUC-MSCs移植组及内科治疗组TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、γ-GGT、Child-Pugh分级、MELD评分在移植/治疗前均低于健康对照组,分别在hUC-MSCs移植后第4、12周以及内科治疗第1、4、12周后显着降低,此外,hUC-MSCs移植后第4、12周以上各指标均低于同期内科治疗组,各指标差异均具有统计学意义（P<0.05）。（3）hUC-MSCs移植组与内科治疗组TCR D50值在移植/治疗前均低于健康对照组,且hUC-MSCs移植组在移植后第1、4、12周TCR D50值显着升高,且高于内科治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）流式检测结果表明hUC-MSCs移植组与内科治疗组CTLs比例及CD28+/CD28-比值在移植/治疗前低于健康对照组,且在经hUC-MSCs移植后第4、12周较移植前增加,并高于内科治疗组;而Th17比例及Th17/Treg比值在移植/治疗前高于健康对照组,在移植后1、4、12周均较移植前明显降低,并低于内科治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）ELISA检测结果表明hUC-MSCs移植组移植前IL-17、IL-21浓度明显高于健康对照组,在移植后1、4、12周后显着降低;IL-10、TGF-β浓度低于健康对照组,于移植后4、12周明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）RT-PCR结果显示hUC-MSCs移植组RORγt mRNA表达量及RORγt/Foxp3 mRNA比值均高于健康对照组,经移植后1、4、12周后逐渐降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）hUC-MSCs移植治疗可有效改善HBV-LC患者的肝功,是一种治疗HBV-LC的有效方法。（2）hUC-MSCs移植可通过改善异常克隆,提高TCR多样性,从而调节免疫平衡,增加机体免疫力。（3）hUC-MSCs通过提高CD8+CD28+/CD8+CD28-比值,增加CTLs比例,增强HBV-LC患者抗感染能力;通过Th17、Treg淋巴细胞数量与功能的变化改善HBV-LC患者肝功能及免疫功能。（4）hUC-MSCs通过促进TGF-β分泌,促进Tregs增殖与活化,抑制Th17的数量与功能,调节免疫平衡以改善HBV-LC患者肝功能,延缓疾病进展。

陈艳^[4]（2019）在《p300/CBP分子在ARDS中的表达及其调控Th17细胞分化的研究》文中研究说明急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是严重急性呼吸衰竭的主要原因,其特点为肺泡渗透性增加及持续、严重的低氧血症。目前除呼吸及生命支持治疗外临床缺乏有效的手段,ARDS的发生与患者高死亡率相关,是危重症患者主要死亡原因之一。近几十年,在严重ARDS患者中保护性机械通气策略、限制性静脉液体管理、俯卧位通气以及体外膜肺氧合（ECOM）等抢救策略在临床治疗取得了极大的进步,但自1994年以来ARDS的总体死亡率仍持续在40%左右。先前众多针对ARDS炎症过程的基础研究,其临床抗炎疗效并不理想,免疫调控成为近年研究的新方向。Th17细胞作为近些年发现的一种新型不同于Th1和Th2的CD4+效应T细胞,兼具固有免疫应答和适应性免疫应答的特征,并有募集中性粒细胞的作用,Th17细胞介导的免疫应答可能是ARDS潜在的炎症调控机制。RORγt作为Th17细胞特异性核转录因子,其转录活性决定了Th17细胞的分化。转录辅因子p300/CBP作为主要的组蛋白乙酰化转移酶可通过其乙酰化核转录因子以调节转录活性,如p53,Foxp3,RORγt,通过乙酰化以改变其稳定性,亚细胞定位和DNA结合能力。新近发现β-catenin分子核内积累可促进RORγt的表达,其可能是调控Th17细胞分化的重要上游分子。有报道p300/CBP通过其乙酰化作用参与wnt/β-catenin及STAT3-RORγt通路激活的调节。目前p300/CBP分子在ARDS中所起的作用及其是否经β-catenin或RORγt参与Th17细胞分化的调节国内外尚无研究文献报道。而p300及HDAC分子抑制剂在肿瘤及慢性气道炎症疾病领域的应用已有大量研究证实其良好的临床应用前景,基于p300/CBP对于ARDS的作用机制尚不清楚,为此我们设计了此课题。目的:明确p300/CBP分子在ARDS中的表达特征,通过p300及HDAC抑制剂对ALI动物模型的干预探究其在ARDS炎症过程中对Th17细胞分化的调控作用及可能机制。方法:1)通过RT-PCR方法检测ARDS患者及健康体检者外周血样本分离出的单个核细胞（PBMC）中p300、CBP、RORγt、Foxp3基因的m RNA的表达;采用ELISA方法测定外周血浆中炎性因子IL-17、IL-6、IL-10的浓度。同时收集研究对象人口统计学和临床检验等基线资料,记录急性生理和慢性健康（APACHEⅡ）评分、序贯器官衰竭（SOFA）评分。主要结局定义为随访28天时ICU或者院内病死率。2)通过气管内注入LPS方法对40只小鼠建立ARDS动物模型,并行肺组织湿干重比测定及HE染色进行肺损伤半定量评分。40只小鼠分为NS+DMSO、LPS+DMSO、LPS+C646、LPS+TSA4组。两干预组在建模后腹腔分别注入p300特异性阻滞剂C646及HADC阻滞剂TSA,四组均在建模用药24小时后处死小鼠,取小鼠肺组织及BALF样本。通过ELISA测定肺组织及BALF中IL-17、IL-6、TGF-β的浓度;IHC观察p300、CBP及RORγt蛋白在肺组织的表达情况;western-blot检测小鼠肺组织p300、RORγt蛋白水平;RT-PCR检测p300、RORγt的m RNA表达。结果:（1）与健康对照组比较,急性期ARDS患者p300、CBP、RORγt m RNA及IL-17、IL-6表达水平显着增加（P<0.05）,而Foxp3 m RNA及血浆IL-10表达组间无显着差异。（2）亚组分析显示死亡组的p300、CBP m RNA及IL-6水平显着高于存活者,而Foxp3 m RNA表达在死亡组显着降低（P<0.05）;另发现RORγt m RNA表达水平在感染诱发ARDS亚组中明显高于非感染ARDS患者。（3）参数与非参数相关性分析结果显示急性期ARDS患者外周血p300 m RNA的表达与血浆IL-6、IL-17水平呈线性相关,相关系数分别为0.4522和0.3576（P<0.05）,并与RORγt、CBP m RNA表达具有等级相关,相关系数为0.3382和0.3042（P<0.05）;而CBP m RNA的表达除与p300具有相关外与其他检测因子不具有相关性。（4）Logistic回归分析提示IL-6、p300、CBP可能为预后相关指标,再进一步纳入基线资料、生存时间经Cox风险模型筛选出年龄,p300及CBP m RNA的表达可能为预测ARDS患者预后的影响因素。（5）IHC方法检测p300、RORγt、CBP在ALI肺组织中主要表达于肺间质的白细胞和少数肺泡上皮细胞,支气管上皮细胞极少发现;且主要定位于胞核,较少定位于胞浆。染色强度及百分比发现所有LPS干预组p300、RORγt、CBP染色均较NS对照组高。p300特异性抑制剂C646组显示出更低的p300和RORγt染色,而CBP染色强度在模型组中均较p300、RORγt弱,三模型组CBP染色无显着差异。结果提示p300受抑可能影响RORγt表达。（6）ELISA、WB及RT-PCR结果提示C646可以显着抑制p300蛋白水平,并引起IL-17,RORγt m RNA及其蛋白水平下降,改善急性肺损伤病理评分,显示其肺保护作用。HDAC抑制剂TSA表现出与之相反的作用,但作用强度不如C646明显。结论:p300/CBP在ARDS急性期呈高表达,尤其p300的表达与RORγt、IL-17的水平呈正相关且可能为ARDS患者的预后因素之一。进一步动物模型结果显示p300通过正向调节核转录因子RORγt促进Th17细胞分化,其特异性抑制剂C646显示出其对ALI的保护作用。

曾巧煌^[5]（2019）在《紫草素抑制小鼠皮肤移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中研究表明目的:器官移植作为一种有效的治疗手段,在临床上广泛应用。然而,几乎所有的移植患者都需要持续使用免疫抑制药物来防止同种异体移植排斥反应的发生。所以免疫抑制剂在器官移植中起着至关重要的作用。不过,目前常用的免疫抑制药物可能导致严重的副作用,如肾毒性、肿瘤和感染等。因此,对于长期接受免疫抑制剂治疗的临床患者来说,迫切需要开发一些具有更好的免疫抑制效果和最小副作用的新型免疫抑制分子。紫草素是一种从紫草根中提取的具有生物活性的萘醌类色素,现代药理学研究表明紫草素具有抗炎、抗癌和抗菌的作用。尤其是,紫草素被证明在动物模型中可以抑制关节炎的发展,在体外实验中还能抑制人类T淋巴细胞的活化。但目前紫草素对同种异体移植排斥反应的作用尚不明确,因此本实验通过建立小鼠皮肤移植模型,考察紫草素对同种异体排斥反应的作用,明确紫草素免疫调节的作用机制。方法:1.紫草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究研究采用小鼠皮肤移植模型,将BALB/C小鼠的皮肤移植到C57BL/6小鼠身上,造模成功后将C57BL/6小鼠随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control）、环孢素A组（CsA）、紫草素低剂量组（Shikonin-20mg/kg）、紫草素高剂量组（Shikonin-40mg/kg）,考察紫草素对移植物生存时间的影响;HE染色、免疫组化和免疫荧光分别测定移植皮片中的炎性细胞浸润及Foxp3和IDO的表达,细胞流式术检测受体小鼠外周引流淋巴结和脾脏细胞中CD4+Foxp3+Treg、效应CD8+CD44high CD62LlowT细胞、CD11c+CD80+和CD11c+CD86+成熟树突状细胞的比例,荧光定量PCR 法测定移植皮片中细胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-10、TGF-p1、FoxP3和IDO基因表达的水平。2.紫草素联合Anti-CD25抗体对小鼠皮肤移植排斥反应的研究研究采用小鼠皮肤移植模型,造模成功后将C57BL/6小鼠随机分为五组,分别为同种异体皮肤移植组（Control）、环孢素A组（CsA）、环孢素A联合Anti-CD25抗体组（CsA+anti-CD25）、紫草素组（Shikonin）、紫草素联合Anti-CD25抗体组（Shikonin+anti-CD25）,每天给予紫草素或环孢素,在移植后第0、4和8天分别按0.2mg/只的剂量腹腔注射Anti-CD25抗体;每天观察移植皮片有无炎症、水肿、坏死、结痂及脱落等情况,并记录移植皮片的存活时间,用中位生存时间（mediansurvival time,MST）表示。3.紫草素体外实验的研究用流式细胞仪分离纯化C57BL/6小鼠的CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8测定紫草素对T细胞的细胞毒性,流式细胞术测定CFSE标记的CD3+T淋巴细胞的增殖情况,ELISA检测培养上清液中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-17和TGF-β1的水平,Western Blotting检测mTOR信号通路的蛋白表达。分离纯化的CD4+CD25-T细胞在抗CD3e和CD28抗体（2.5μg/mL）以及rmIL-2（10ng/mL）共刺激后,分别给予TGF-β1（5ng/mL）和不同浓度的紫草素（0.25μM或0.5μM）,四天后采用流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。分离纯化C57BL/6小鼠骨髓中的树突状细胞,在rmGM-CSF（20ng/mL）和rmIL-4（1Ong/mL）的共刺激下,分别给予环孢素（0.1μM）和不同浓度的紫草素（0.25μM或0.5μM）,两天后收集细胞采用Western Blotting检测其中IDO的蛋白表达。结果:1.紫草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究紫草素低剂量（20mg/kg）和高剂量（40mg/kg）组均能显着延长同种异体皮肤移植的存活时间,MST分别是16.00±1.37和22.00±2.98天（P<0.05或P<0.01）,甚至紫草素高剂量的治疗效果接近于CsA（MST为26.00±1.49天）（PP>0.05）;紫草素低剂量和高剂量治疗后小鼠移植皮片中CD3+T细胞浸润明显减少（P<0.05或P<0.01）,同时可上调移植皮片中Foxp3和DC来源的IDO的表达（P<0.01）。在受体小鼠次级淋巴器官中,紫草素低剂量和高剂量组均能显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）,同时可显着降低脾脏和淋巴结细胞中CD11c+CD86+成熟树突状细胞和CD8+CD44highCD62Llow效应T细胞的比例（P<0.05 或P<0.01）。在移植皮片中,紫草素低剂量和高剂量组均能显着降低促炎因子TNF-α和IL-17的mRNA表达（P<0.05或P<0.01）,以及显着升高FoxP3和IDO mRNA的表达水平（P<0.05或P<0.01）,紫草素高剂量还能抑制IFN-γ和IL-6的mRNA表达（P<0.05 或P<0.01）,同时上调 IL-10和 TGF-β1 mRNA 的表达（P<0.05）。2.紫草素联合Anti-CD25抗体对小鼠皮肤移植排斥反应的研究实验结果表明,Shikonin+anti-CD25 组的 MST 是 16.00±0.75 天,与 Shikonin 单独给药组（MST=25.00±2.83天）相比,明显减少了小鼠的存活时间（P<0.05）;而CsA+anti-CD25组与CsA单独给药组相比没有显着差异（P>0.05）。3.紫草素体外实验的研究不同浓度的紫草素（0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μM）给药24h、48h和96h后,紫草素的给药浓度至1.OμM时,对T细胞并没有细胞毒性作用。在T细胞增殖实验中,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）,尤其是高剂量组的抑制效果与CsA组接近（P>0.05）;此外,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着降低细胞上清液中IFN-γ的水平（P<0.01）,仅紫草素（0.5μM）组可下调IL-17的浓度（P<0.05）,同时还能上调了抑制型细胞因子IL-10和TGF-β1在细胞上清液中的水平（P<0.05或P<0.01）;而CsA可以提高细胞上清液中TGF-β1的浓度（P<0.01）但对IL-10无影响（P>0.05）;在体外分离纯化的CD4+CD25-T细胞中,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着提高CD4+Foxp3+Treg 的比例（P<0.05 或P<0.01）。对于T细胞上mTOR信号通路,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着抑制P-p70S6K和P-mTOR的活化（P<0.01）,而作为阳性对照雷帕霉素在很大程度上阻断了 P-p70S6K和P-mTOR的激活（P<0.01）。在体外诱导的髓源性树突状细胞中,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能在体外增强树突状细胞IDO的蛋白表达（P<0.05或P<0.01）,而环孢素却没有显着差异（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了紫草素在诱导Tregs/IDO和抑制同种异体移植排斥反应中的新作用,表明紫草素可显着延长同种异体皮肤移植小鼠的存活时间,其可能的作用机制是诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,促进DC来源IDO的表达以及抑制了 mTOR信号通路的激活。因此,紫草素作为一种天然产物,在未来可能作为一种潜在的免疫抑制药物用于临床器官移植手术。

Edoo Muhammad Ibrahim Alhadi^[6]（2019）在《肝移植后糖蛋白130多态性与新发糖尿病风险分析》文中提出目的:经过半个多世纪的研究和开发,肝移植患者的预后得到了极大的改善。然而,肝移植后新发糖尿病的发病率仍然很高,这已成为影响患者长期存活率和生活质量的重要因素。我们的目的是研究GP130的单核苷酸多态性是否与NODAT相关。方法:本研究纳入了 2009年至2014年我中心接受肝移植的469例患者,分为两组:NODAT组和非NODAT组。我们使用单变量和多变量分析筛选了 NODAT的独立危险因素。我们进一步构建了两个包含风险因子的NODAT预测模型。最后,我们通过单变量分析分析了生存时间和存活率。排除标准患有家族性糖尿病史,多器官移植,不到6个月的随访或急性排斥反应结果:肝移植6个月后新发糖尿病的总发生率为31.3%（147/469）。男性414例,女性55例,平均年龄45.7±11.1岁。使用单变量分析,年龄（P<0.001）,BMI指数（P=0.029）,GP130 rs1800796 和 rs10941411 与 NODAT 显着相关。rs1800796和rs10941411的显性模型进一步证实了这些风险因素。NODAT组患者和移植肝脏的总生存时间和存活率显着低于非NODAT（P<0.05）。结论:NODAT代表移植的主要代谢并发症。根据这一声明,所有前瞻性移植患者都应该被告知移植后患糖尿病的潜在风险,并且应该鼓励他们在LT之前采取适当的生活方式措施,以降低患糖尿病的风险。此外,葡萄糖失调的筛查应该是系统性的,应该在移植过程的所有阶段进行。由于高血糖的程度可能因NODAT受试者而异,因此选择最合适的药物治疗以实现可接受的血糖控制非常重要。基于移植器官的恢复功能和抗糖尿病药物的毒性特征,应针对每位患者定制抗糖尿病治疗。因此,优化NODAT的预防和管理可以最大限度地降低与此病症相关的急性和长期风险.本研究首次证实GP130 rs1800796和rs10941411基因多态性与肝移植术后NODAT的发生密切相关。它揭示了年龄是NODAT的风险因素。进一步证实NODAT的存活时间和存活率比非NODAT的存活时间和存活率更差。

常顺^[7]（2018）在《Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究》文中认为目的:近年来研究发现支架蛋白Gab2（Gab2-associated binding protein 2）在多种恶性肿瘤中高表达,其表达增高与肿瘤的发生发展密切相关。同时有研究显示Gab2蛋白在胶质瘤组织中也存在高表达的趋势,但其转录水平和表达水平对胶质瘤发生发展的影响尚无定论。对胶质瘤组织中Gab2mRNA进行检测,定量分析Gab2转录水平,并将其与临床病理特征和胶质瘤影像学资料进行关联分析,将有利于进一步解释Gab2表达水平对胶质瘤发生发展的调控机制。所以本研究将对胶质瘤和瘤旁组织中的Gab2mRNA进行检测,并分析其与临床病理和影像学资料各因素间的关系;进一步建立科学、规范的Sprague-Dawley大鼠脑胶质瘤原位移植模型;通过敲减Gab2的表达,研究其对C6胶质瘤细胞在体外和SD-大鼠脑内增殖和凋亡的影响,及对细胞因子IL-6、TNF-a、VEGF和肿瘤相关因子 MMP-2、MMP-9,Bax、Bcl-2、p53、Cleaved-caspase-3 表达的影响;初步阐明Gab2表达水平与胶质瘤发生发展的关系,探讨Gab2的表达对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制,为寻求胶质瘤的有效治疗方法打下基础。方法:1.搜集临床胶质瘤患者样本40例,对其临床病理及影像学资料进行归纳总结,并应用qRT-PCR分别检测40例胶质瘤和瘤旁组织中Gab2mRNA的相对表达量,分析其表达差异,并研究其表达与临床病理特征及瘤周水肿的关系;2.利用胶质瘤细胞系C6研究Gab2对胶质瘤细胞的功能调控机制,将其分为对照组、空载体组及Gab2-siRNA组进行细胞Gab2-siRNA转染,以靶向沉默、敲减细胞中Gab2基因的表达,转染后48h用western-blot分别检测三组细胞Gab2蛋白的表达,验证转染效率,并于转染后72h用流式细胞仪检测三组细胞的凋亡情况;3.利用胶质瘤细胞系C6和SD-大鼠建立胶质瘤动物模型进一步研究Gab2对胶质瘤细胞体内增殖和凋亡的调控机制。将SD-大鼠分为三组:对照组、Gab2-siRNA组,每组47只,空白组5只;分别将数目相同的C6胶质瘤细胞和经Gab2-siRNA转染的C6胶质瘤细胞立体定向接种于对照组和Gab2-siRNA组SD-大鼠的右脑尾状核,构建动物模型,空白组5只则用等体积的生理盐水代替;在建模2周后,随机选取对照组和Gab2-siRNA组大鼠各15只行灌注后处死,剖颅探查取瘤,检测肿瘤的瘤重和体积,计算成瘤率;建模3周后,将对照组、Gab2-siRNA组大鼠各30只取眼眶血后和空白组大鼠5只灌注后处死,剖颅探查取瘤,检测肿瘤的瘤重和体积,计算成瘤率,与建模2周后的肿瘤瘤重、体积和成瘤率相比较;利用HE染色法明确肿瘤病理学特征,并采用GFAP染色法判断肿瘤来源,免疫组化染色检测肿瘤Bax、Bcl-2蛋白的表达水平;采用qRT-PCR和western-blot检测肿瘤MMP-2、MMP-9转录水平及蛋白表达水平;应用Western-blot检测肿瘤中Bax、Cleaved-caspase-3和p53蛋白的表达水平;采用ELISA检测经剖颅证实荷瘤成功的对照组及Gab2-siRNA组大鼠血清中细胞因子IL-6、TNF-α、VEGF的表达水平,并用电镜观察比较两组肿瘤细胞的超微结构。结果:1.Gab2在胶质瘤组织中的转录水平显着高于瘤旁组织（P<0.01）;且随着胶质瘤病理级别的升高及瘤周水肿的加重,Gab2-mRNA相对表达量的升高有显着统计学差异（P<0.01）,但其在不同性别和年龄间的表达差异无统计学意义（P>0.05）。2.Gab2-siRNA转染C6胶质瘤细胞后,与对照组和空载体组相比,Gab2-siRNA组Gab2蛋白的表达显着降低（P<0.01）,对照组及空载体组中Gab2蛋白的表达则无明显差异（P>0.05）;且对照组细胞的凋亡率与空载体组相比无明显差异（P>0.05）,而Gab2-siRNA组细胞凋亡率与对照组和空载体组相比明显增高,具有显着性差异（P<0.01）。3.剖颅探查取瘤、检测肿瘤体积和重量和计算成瘤率结果示:建模3周后肿瘤的体积和瘤重显着高于2周后（P<0.01）;同期,Gab2-siRNA组的肿瘤体积和瘤重显着低于对照组（P<0.01）,成瘤率稍低于对照组,但无统计学差异（P>0.05）,空白组无肿瘤形成。4.HE染色示:与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞异型性较小,核浆比例下降,病理性核分裂象和新生血管较少。两组肿瘤GFAP染色都呈阳性,说明肿瘤来源于神经胶质细胞,而非其它性质肿瘤,可用作后续研究。5.两组肿瘤组织中均有Bax和Bcl-2蛋白的表达;与对照组相比,Gab2-siRNA组Bcl-2蛋白的表达强度减弱（P<0.05）,Bax蛋白的表达强度则明显升高（P<0.01）。6.与对照组相比,Gab2-siRNA组中MMP-2、MMP-9的mRNA的相对表达量和MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平显着低于对照组（P<0.01）。7.与对照组相比,Gab2-siRNA组p53、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表达水平明显升高（P<0.01）。8.与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞因子IL-6、TNF-α、VEGF的表达明显降低（P<0.05）。9.电镜检查示:与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞凋亡征象明显多见。结论:1.Gab2基因在胶质瘤组织中的表达显着高于瘤旁组织（P<0.01）,且其表达明显受到胶质瘤的病理分级及瘤周水肿程度的影响;提示Gab2可能在肿瘤组织中特异性高表达,与胶质瘤的发生发展关系密切,有望成为一个新的分子靶点。2.Gab2-siRNA转染C6胶质瘤细胞效率较高,能显着降低Gab2蛋白的表达水平（P<0.01）,敲减Gab2能明显促进体外C6胶质瘤细胞的凋亡（P<0.01）;SD-大鼠脑尾状核C6胶质瘤模型成瘤周期较短,成瘤率高,模型稳定性好,是一种较为理想的胶质瘤动物模型。3.敲减Gab2能明显抑制C6胶质瘤细胞在SD-大鼠脑内的增殖和生长并促进其凋亡,减轻瘤重、缩小肿瘤体积。其机制可能与敲减Gab2下调了MMP-2、MMP-9和IL-6、TNF-α、VEGF的表达、升高Bax和下调Bcl-2的表达进而升高了Bax/Bcl-2的比值、活化了凋亡信号途径p53/Bax/Cleaved-caspase-3有关。

唐劲草^[8]（2017）在《间充质干细胞介导TGF-β1减轻移植肝急性排斥反应》文中研究说明众所周知,作为肝炎高发国,终末期肝病在我国有很高的发病率。肝移植作为治疗终末期肝病的唯一有效途径。移植肝的免疫排斥一直是不可回避和亟待解决的问题,应用免疫抑制剂虽能减少排斥反应的发生,但是它带来的并发症不可忽视。因此如何能够诱导移植物的自发免疫耐受,少用或者不用免疫抑制剂,成为移植免疫学研究的热点之一。自然发生调节性T细胞Tregs（naive Treg,nTreg）,具有很强的免疫抑制作用,在诱导同种异体器官移植中免疫耐受的作用已得到证实。Tregs能够被TGF-β在体内及体外诱导。由T细胞诱导生成的调节性T细胞（iTreg）与nTreg具有相似的表型和功能特性,抵抗向Thl、Th17细胞的分化,抑制Th17细胞的分化和发育,可以弥补nTreg的不足,在移植免疫中更具应用价值和前景。诱导移植肝产生iTreg,主要需要两个条件:1.足够的T细胞,2.能够稳定表达TGF-β基因的合适载体。移植肝在术中受到缺血再灌注损伤,移植后也会因排斥或其它因素导致移植肝损伤,移植肝内部大量T细胞聚集,满足了 iTreg生成的第一个条件;间充质干细胞（MSCs）的两个特点使其成为携带TGF-β基因的绝佳载体:①MSCs易于被外源基因感染,是携带外源基因的良好载体。②MSCs具有向损伤组织趋化、迁移的特性,因此在肝移植引起的组织损伤微环境中,能够携带TGF-β1靶向性、高浓度地聚集于移植肝,从而满足了 iTreg生成的第二个条件。本研究中以MSCs介导TGF-[β 1诱导iTreg生成减轻移植肝急性排斥反应。第一部分:TGF/MSCs体系构建及体外实验研究TGF/MSCs对iTreg生成的影响目的:在体外分离培养大鼠骨髓MSCs,并进行鉴定,构建携带人转化生长因子-β1（TGF-[β 1）基因的慢病毒并感染MSCs,观察表达TGF-β 1 的MSCs（TGF/MSCs）的特性,体外检测TGF/MSCs的免疫抑制作用,并观察其诱导iTreg的生成效率。方法:利用贴壁加酶消化法培养大鼠MSCs,并进一步传代扩增,并利用显微镜观察其生长特性。同时对细胞绘制生长曲线。利用流式细胞仪检测细胞表面标志。构建hTGF-β 1慢病毒表达质粒,以GFP为标记。转染293T细胞,PCR测定其滴度。将慢病毒感染MSC细胞,检测其感染效率,利用ELISA法检测细胞培养上清hTGF-β 1、大鼠TGF-β 1（rTGF-β 1）分泌水平。同时再利用大鼠脾脏细胞构建体外混合淋巴细胞反应（MLR）,检测TGF/MSCs细胞对T细胞增殖及IFN-y表达的抑制作用,同时用流式细胞仪测定iTreg的生成。结果:成功获得MSCs细胞,并能够再传代培养中得以进一步纯化。获取的MSCs,具有纯度高,生长良好,细胞增殖能力强的特点。5-6d左右传代,能在体外传代18代以上,增殖能力强大。检测了第3代的MSCs表面标志CD44为98.12%,呈阳性高表达。同时成功构建携带hTGF-β 1基因的慢病毒。MSCs感染携带hTGF-β 1基因的病毒上清后（细胞命名为TGF/MSC）,RT-PCR可以检测出TGF-β 1 mRNA表达,ELISA和western Blot能够检测到TGF-β 1因子,相比于MSCs组TGF/MSCs组显着抑制IFN-γ的表达和淋巴细胞增殖。同时TGF/MSCs和MSCs在体外都能诱导iTreg的生成,而TGF/MSCs诱导生成更多,两者具有统计学差异。结论:贴壁加酶消化法分离培养MSCs简单易行,可以得到高纯度的MSCs,有稳定的生物学特征。通过慢病毒载体感染MSCs细胞,使其能够介导hTGF-β 1基因,表达hTGF-β 1基因的MSCs组相对于MSCs组有更强的免疫抑制作用,说明TGF-β 1和MSC两者在体外免疫抑制具有协同作用。第二部分:体内实验验证TGF/MSCs对iTreg生成的影响目的:观察表达hTGF-β 1基因的MSCs（TGF/MSCs）在大鼠体内对同种异体移植肝的急性排斥反应的抑制作用,探讨其诱导免疫耐受的机制。方法:建立稳定的DA-LEWIS大鼠同种异体肝移植急性排斥模型,供肝植入、肝脏复苏后立即经门静脉注入1mLPS,1*109 TU LV-TGF,5*106 MSCs或者TGF/MSCs。记录生存时间;另建立4组模型,分别于术后1,3,5,7天处死大鼠,3,5,7天观察肝功能,第7天行肝脏病理切片,绘制生存曲线,进行Banff评分,ELISA方法检测受体肝组织和血清中hTGF-β 1、IL-1(β、IL-6、IL-10、IFN-γ等细胞因子的水平。RT-PCR检测肝组织中hTGF-β 1、rTGF-β 1、IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-y mRNA表达,检测MSCs在肝脏内表达,ELISA法检测MSCs、上调因子CCR1、CXCR4、SDF-1的表达。流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+Tregs表达及在组织中的分布、Treg表面因子Helios表达,RT-PCR检测Il-17mRNA表达,流式细胞仪检测T细胞向Th-17细胞及iTreg转化。结果:RT-PCR证实TGF/MSCs组肝组织内有hTGF-β 1基因转录。生存曲线显示,TGF-[β/MSCs组明显好于其他各组。TGF/MSCs组、LV-TGF和MSCs组均能减轻移植肝的急性排斥反应,使受体状况得到改善。对比MSCs组和LV-TGF组,TGF/MSCs组使肝功能得到明显改善,病理学仅能看到轻度急性排斥反应。TGF/MSCs、LV-TGF及MSCs都能抑制T细胞增殖,而且TGF/MSCs组明显低于LV-TGF组及MSCs组。无论是在组织还是血清中,TGF/MSCs组、LV-TGF组及MSCs组促炎症因子IL-1,IL-6及IFN-y表达低于PS组,TGF/MSCs组明显低于TGF组及MSC组。而抑制炎症因子IL-10则正好相反。移植前我们用CM-DIL作为标记MSC,发现在术后第7天TGF/MSCs组CM-DIL标记细胞显着多于MSCs组,同样我们可以看到TGF/MSCs组MSC上调因子CCR1,SDF-1,CXCR4表达显着高于MSCs组,而PS组及LV-TGF组未见有上述表达,说明TGF-β 1促进MSCs向肝内聚集。由于携带有外源性hTGF-[β 1,第1天总TGF-β 1在TGF/MSCs组表达明显增高,同时我们观察到TGF-β 1在7天时TGF/MSCs组表达最低。与之对应的,术后第1天各组Tregs减少,以TGF/MSCs组减少最多,但是随着炎症反应的降低,各组的Treg逐步上升,而TGF/MSCs组的增加幅度最大,术后第5天开始与PS组有统计学意义,第7天该组CD4+Foxp3+细胞达到峰值。nTreg表达Hellos+,而iTregs则为Helios阴性,可以作为区别nTreg和iTreg的标记。我们进一步研究发现,在术后第7天Helios阴性之iTreg在各组明显增多,而以TGF/MSCs组最多,说明在经历了移植后第1天nTregs的大量丢失之后,又生成了新的iTreg;在TGF/MSCs组外周血、脾脏和肝脏组织内,又以肝脏内iTreg最多。结论:TGF/MSCs能有效减少肝移植术后免疫排斥反应并能提高生存时间。TGF/MSCs可通过抑制T细胞增殖及炎性因子的释放起作用。TGF/MSCs能有效诱导iTreg的产生及抑制Th17细胞的生成。TGF/MSCs组早期高水平的TGF-β1表达促进nTreg凋亡和iTreg生成,有效抑制免疫反应。TGF-β 1和MSCs在体内协同作用,效果好于单独使用。TGF/MSCs诱导的iTreg主要局限于移植肝内。

王平,涂同涛,臧思思,丁宁,孙余,杨露,胡丽华^[9]（2015）在《心脏移植排斥反应患者血清IL-6检测的意义》文中提出目的研究心脏移植术后患者血清中IL-6的变化及其在疾病发展过程中的意义。方法分别在移植前及术后第1、3、7、14、30天抽取患者静脉血,采用双抗体夹心ELISA法检测血清中IL-6浓度,并监测患者血清中FK506药物浓度。结果心脏移植患者血清中IL-6在术前与健康对照组人群无显着性差异（P>0.05）,并在术后第一天明显升高（P<0.05）,并于第3天开始降低,在术后第7天基本回复术前水平;移植急性排斥组患者血清中IL-6浓度显着高于术前水平,在未发生排斥反应时,移植稳定组患者血清中IL-6与术前无明显差异;移植急性排斥反应患者血清中FK506浓度与IL-6浓度呈现显着地负相关性（P<0.05）。结论 IL-6在移植急性排斥反应病情的发展中起着重要作用,监测受者血清中IL-6水平可预测急性排斥反应发生的风险。

萨仁高娃^[10]（2015）在《IL-17相关性T细胞、调节性T细胞在肺动脉高压中的作用及机制研究》文中研究指明第一部分IL-17相关性T细胞、调节性T细胞在肺动脉高压中的表达及作用目的肺动脉高压治疗效果及预后较差,发病机理不完全清楚。目前研究认为免疫反应在该病的发生和发展中起到重要的作用。调节性T细胞和IL-17相关性T细胞共同参与机体免疫防御反应,对炎性疾病的发生及转归起到至关重要的作用。但目前尚缺乏调节性T细胞和IL-17相关性T细胞在肺动脉高压中表达及作用的相关研究。我们通过MCT诱导的大鼠肺动脉高压模型研究上述细胞群在肺动脉高压中的表达分布及作用。方法构建重组慢病毒Lenti-IL-17-shRNA.将实验大鼠24只,随机分为四组：对照组,野百合碱组,野百合碱+IL-17组,野百合碱+重组慢病毒Lenti-IL-17-shRNA组。野百合碱给药后第28天检测各组肺血流动力学参数,右心室重构表现；肺组织病理学表现；肺内Th17细胞,Treg细胞及相关细胞因子mRNA表达；肺组织内IL-17相关细胞及Treg细胞表达；全身免疫系统中IL-17+细胞和Treg细胞表达及外周血中相关细胞因子表达。结果重组慢病Lenli-IL-17-shRNA能稳定感染单个核细胞,并且可以有效敲减IL-17基因表达。给予野百合碱能有效诱导大鼠实验性肺动脉高压的产生。IL-17能协同野百合碱加剧肺血流动力学改变,干预IL-17表达在一定程度上能影响肺血流动力学表现。野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型肺组织血管重构显着,外源性IL-17能进一步加重血管重构,而通过重组慢病毒Lenti-IL-17-shRNA干预则在一定程度上能改善血管重构。肺组织mRNA检测发现包括IL-17在内的促炎细胞因子及包括TGF-β1和IL-10在内的抑炎细胞因子在实验组中均表达异常,此外也存在Treg细胞相关转录因子的表达异常。利用外源性IL-17上调表达或重组慢病毒敲减IL-17基因影响体内IL-17表达可能对其它促炎细胞因子,抑炎细胞因子以及Treg细胞的表达水平造成影响。游离肺组织内单个核细胞并进行流式细胞分析,结果说明,野百合碱介导的肺动脉高压能整体上调肺内Th17细胞和IL-17+γδT细胞的表达,但对IL-17+CD8+T细胞表达的影响作用较小。Treg细胞受到肺内炎症环境的影响表达下调,外源性上调或下调IL-17能进一步影响Treg细胞的表达水平。对脾脏单个核细胞进行流式细胞分析显示,野百合碱诱导的肺动脉高压并非局限性反应而是波及全身的系统性炎症反应,肺组织内IL-17相关性细胞和Treg细胞表达异常是由系统中IL-17+细胞表达上调和Treg细胞表达下降所引发的。外周血细胞因子表达含量检测显示,野百合碱诱导后能显着提高促炎细胞因子,并降低抑炎细胞因子的表达。外源性IL-17能抑制肺动脉高压模型大鼠血清中IL-10的表达,而敲减IL-17基因则能上调血清IL-10的表达。结论IL-17相关细胞,Treg细胞和其它相关促炎、抑炎细胞因子在肺动脉高压的特殊病理环境下存在异常表达。Th17与Treg细胞间的动态平衡发生移动能对肺动脉高压的发生发展起到影响作用。Thl7和γδT细胞在肺动脉高压中构成T细胞IL-17的主要来源。IL-17表达水平确能影响肺动脉高压的发病程度,上调IL-17能促进疾病发展,而下调IL-17则能够缓解疾病发展。该细胞因子的表达水平对肺动脉中膜平滑肌层增厚影响作用显着。降低器官中IL-17表达,不仅能缓解局部炎症反应也能改善全身炎症状态。第二部分体外培养诱导型Treg细胞过继输注干预肺动脉高压研究目的第一部分研究中我们发现在肺动脉高压背景下,机体无论局部肺组织还是系统免疫器官中均存在明显的IL-17相关T细胞和Treg细胞表达失衡,并且随疾病进展的加深,Treg细胞表达下降的趋势愈发加重。Treg细胞在近期研究中被广泛认为具有免疫调节作用,能够缓解炎症反应。但是Treg细胞在体内表达数量较少,且具有可塑性,在炎性环境下不稳定。因此,通过过继输注体外诱导的Treg细胞成为提高体内该细胞表达量,对抗炎性反应,缓解肺动脉高压的潜在治疗途径。方法通过体外磁珠分选大鼠脾脏原始T细胞,使用CD3/CD28抗体刺激,在IL-2和TGF-β环境下联合诱导原始T细胞向调节型Treg细胞分化。将体外诱导的Treg细胞过继输注到野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型体内并与未接受细胞过继的野百合碱诱导大鼠模型相对比。野百合碱给药后第28天检测诱导iTreg细胞在体稳定性；各实验组肺血流动力学参数,右心室重构表现；肺组织病理学表现；肺内Th17细胞,Treg细胞及相关细胞因子mRNA表达；全身免疫系统中IL-17+细胞和Treg细胞表达及外周血相关细胞因子的表达。结果原始T细胞在体外用上述方法能够诱导为Treg细胞,过继输注到肺动脉高压大鼠体内后,至观察终点,Treg细胞仍能维持原有细胞表型,极少转化为Th17细胞。经过外源性Treg细胞输注后,肺动脉高压大鼠肺血流动力学参数及右心室重构均有显着改善,在一定程度上干预了肺血管重构的发生。肺组织mRNA表达检测结果说明,过继输注体外诱导的iTreg细胞不仅能降低肺内IL-17+细胞及相关促炎细胞因子表达,并且能上调肺内Treg细胞和抑炎细胞因子IL-10的表达。对实验大鼠脾脏采用流式细胞术检测Thl细胞、IL-17+细胞和Treg细胞表达,结果提示过继输注体外诱导的iTreg细胞能促进免疫系统内Treg细胞表达,并能抑制ThL、 Th17和IL-17+γδ T细胞的表达。IL-17+CD8+T在两实验组中表达含量极低,外源性iTreg细胞干预因素不能对该群细胞表达水平造成影响。外周血中细胞因子表达含量检测显示,外源性iTreg细胞过继能下调促炎因子IL-17、 IL-6、 IFN-γ的表达,并上调血清IL-10表达。结论过继输注体外诱导培养的iTreg细胞能够改善肺动脉高压病理表现,缓解肺血流动力学异常,能对体内异常表达的Th1、Th17、IL-17+γδ细胞进行调节,并下调外周血中炎性细胞因子。第三部分结缔组织病相关肺动脉高压Th17/Treg细胞平衡状态及对预后的影响目的我们已证实野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型中存在Th17异常高表达和Treg细胞异常低表达,并且Th17细胞异常表达可能与肺部病理学改变和肺血流动力学表现有关。结缔组织疾病相关性肺动脉高压归于肺高血压分类中的第一大类。到目前为止,结缔组织疾病相关性肺动脉高压中是否存在Th17和Treg细胞的失衡,或者该种失衡的分布情况,都缺乏相关研究。假设该疾病表现有Th17/Treg细胞轴的偏移,这种指标是否会对病人的预后产生影响并可能作为预测指标反映病人的预后,目前尚不得而知。方法我们通过前瞻性队列研究探索结缔组织疾病相关性肺动脉高压病人外周血中Th17和Treg细胞的表达频率及其与疾病进展程度之间的关系,研究Th17/Treg细胞轴偏移对病人预后的影响。实验按照病人疾病严重程度进行分组,分别检测病人外周血中相关细胞因子和外周血单个核细胞中ROR γt和Foxp3 mRNA表达水平,评估Th17/Treg细胞轴在不同疾病阶段的表现。分析Th17/Treg细胞轴与相关细胞因子,N末端B型利钠肽原和肺动脉收缩压间的相关性。最后按照Th17/Treg细胞数量比值对入组结缔组织疾病相关性肺动脉高压病人进行分组,并进行亚组生存分析。从而研究Th17/Treg细胞轴对比病人预后的影响,探讨将Th17/Treg细胞轴作为预测结缔组织疾病相关肺动脉高压病人预后标志物的临床价值。结果结缔组织疾病相关性肺动脉高压病人外周循环中Treg细胞的表达比例和绝对数量以及Foxp3 mRNA表达水平均低于不伴有肺动脉高压的结缔组织病病人和正常人。相反,我们发现结缔组织病相关肺动脉高压病人外周循环中Th17细胞的表达比例和绝对数量,ROR rt mRNA和Th17相关细胞因子的表达水平均高于不伴有肺动脉高压的结缔组织疾病病人和正常人。在结缔组织疾病相关性肺动脉高压（CTD-aPAH）组中,Th17/Treg细胞,Th17相关细胞因子以及ROR yt/ Foxp3 mRNA表达水平在轻中度CTD-aPAH组和重度CTD-aPAH组均有显着性差别。更为重要的是,Thl7与Treg细胞数量比值与反映肺动脉高压严重程度的指标,如肺动脉收缩压和NT-proBNP存在线性相关性。以Th17/Treg细胞比值作为分组标准,发现合并肺动脉高压的结缔组织病病人中,表现为高Th17/Treg细胞比值的病人往往较低Th17/Treg细胞比值的病人生存情况更差。结论在合并肺动脉高压的结缔组织病病人外周循环中存在Th17细胞异常高表达,Treg细胞异常低表达,且上述两群细胞存在负相关性。Th17/Treg细胞轴偏移能影响该类病人的预后,Th17/Treg细胞轴可作为预测病人预后的生物标志物。

二、IL-6mRNA在排异反应中的动态表达及其与移植心脏生存时间的相关性研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、IL-6mRNA在排异反应中的动态表达及其与移植心脏生存时间的相关性研究（论文提纲范文）

（1）木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）

（2）α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）

（3）探讨hUC-MSCs调节HBV肝硬化患者免疫功能的可能机制（论文提纲范文）

（4）p300/CBP分子在ARDS中的表达及其调控Th17细胞分化的研究（论文提纲范文）

（5）紫草素抑制小鼠皮肤移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）

（6）肝移植后糖蛋白130多态性与新发糖尿病风险分析（论文提纲范文）

（7）Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究（论文提纲范文）

（8）间充质干细胞介导TGF-β1减轻移植肝急性排斥反应（论文提纲范文）

（9）心脏移植排斥反应患者血清IL-6检测的意义（论文提纲范文）

（10）IL-17相关性T细胞、调节性T细胞在肺动脉高压中的作用及机制研究（论文提纲范文）

四、IL-6mRNA在排异反应中的动态表达及其与移植心脏生存时间的相关性研究（论文参考文献）

• [1]木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 叶书林. 广州中医药大学, 2021(02)
• [2]α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 黄涛. 山东大学, 2020(04)
• [3]探讨hUC-MSCs调节HBV肝硬化患者免疫功能的可能机制[D]. 严胡铃. 电子科技大学, 2020(07)
• [4]p300/CBP分子在ARDS中的表达及其调控Th17细胞分化的研究[D]. 陈艳. 重庆医科大学, 2019(01)
• [5]紫草素抑制小鼠皮肤移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 曾巧煌. 广州中医药大学, 2019(03)
• [6]肝移植后糖蛋白130多态性与新发糖尿病风险分析[D]. Edoo Muhammad Ibrahim Alhadi. 浙江大学, 2019(03)
• [7]Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究[D]. 常顺. 昆明医科大学, 2018(06)
• [8]间充质干细胞介导TGF-β1减轻移植肝急性排斥反应[D]. 唐劲草. 南京医科大学, 2017(05)
• [9]心脏移植排斥反应患者血清IL-6检测的意义[J]. 王平,涂同涛,臧思思,丁宁,孙余,杨露,胡丽华. 中国实验诊断学, 2015(10)
• [10]IL-17相关性T细胞、调节性T细胞在肺动脉高压中的作用及机制研究[D]. 萨仁高娃. 武汉大学, 2015(07)