李焱[1]（2021）在《山东省猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及病毒GP5基因遗传变异分析》文中指出猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）又称“猪蓝耳病”、“猪神秘病”等,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种猪专一宿主的免疫抑制性疾病。经典毒株主要引起怀孕母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道疾病。高致病性变异毒株引起急性热性高致死性的疾病,为我国一类传染病。20世纪90年代Lelystad（LV）毒株和VR-2332毒株分别在荷兰和美国被分离,随后该病毒在亚洲暴发。1995年,中国爆发了经典PRRS的疫情,随后PRRSV在中国不同地区广泛传播。2006年,高致病性PRRSV在中国暴发。2010年-2012年,我国先后出现了重组毒株和类NADC30毒株,给我国养猪业造成了巨大损失。目前,猪繁殖与呼吸综合征不断有新的突变毒株出现,成为我国乃至全球的养猪业重要疫病之一。为了解近几年山东省PRRS的流行情况,本研究对2018-2020年采集的来自山东省各地不同规模猪场疑似PRRS的临床病例样品进行检测,对该病在山东省的流行特征进行分析。本研究基于2018年至2020年本实验室采集的来自山东省各地不同规模猪场PRRS的临床病例样品进行检测,对该病在山东省的流行特征进行分析。通过临床症状观察、剖检病变观察、病理组织学观察、PRRSV病毒分离纯化、PRRSV抗体ELISA检测分析,并对GP5蛋白基因遗传演化、主要氨基酸突变以及GP5潜在N-糖基化位点进行检测分析,进一步认识山东省PRRS流行病学特征。经调查结果显示,感染PRRSV的不同阶段的猪表现为呼吸道症状及生产母猪繁殖障碍。感染PRRSV的重症猪只剖检病变主要表现为肺脏的间质性肺炎。我们共采集来自山东各地2143份猪的病料,经RT-PCR检测发现PRRSV阳性数为355份,阳性率为16.57%,混合感染病例中PRRSV与PCV2混合感染率最高;对山东省不同规模猪场PRRS的发病情况进行调查发现以秋冬季最为严重,另外2018-2020年PRRSV感染阳性率呈略微下降趋势;对11247份血清样品进行了PRRSV N蛋白抗体ELISA检测,抗体总阳性率为78.86%（8869/11247）,表明山东省不同规模化猪场PRRSV抗体阳性率均呈较高态势。为了进一步对PRRSV的遗传分子特性进行研究,对阳性样品进行病毒分离鉴定及测序,筛选出了70株PRRSV GP5蛋白基因。通过遗传进化分析发现,山东省规模化猪场流行的PRRSV均为2型,主要分布于五个分枝上,表明山东省PRRSV流行毒株复杂多样。ORF5编码GP5蛋白,R13和R151与病毒的致病能力有关,这两处均为R时表现为强毒株。在推导氨基酸突变位点分析中,Lineage 1中的分离毒株出现了R13的突变,表现为强毒特征;Lineage 3中,只有一株表现为强毒株特征;处于Sub Lineage5.1的分离株未发现强毒株特征;处于Lineage 8的毒株均有R13的突变。GP5是PRRSV重要中和抗原表位,某些GP5氨基酸的突变对PRRSV的毒力影响较大,有些抗原表位在PRRSV诱导免疫应答中起着关键作用。位于Lineage1的分离毒株,大部分具有与NADC30毒株一样的中和抗原表位;位于Lineage3的毒株只有一处发生了A27LVS的突变;在Lineage8中出现了N30D和L28P两处AA替代。这些抗原表位的改变可能导致了病毒的进化,从而影响疫苗的免疫效果。有研究报道GP5的病毒外序列中有四个潜在的N-糖基化位点,这些N-糖基化位点对病毒感染、呈递抗原和病毒对体外中和抗体的敏感性具有非常重要的作用。本研究中的测序株有3-5个N-糖基化位点,在N44和N51处表现出了N-糖基化位点的高度保守,于Lineage 1的分离毒株在N34处出现了缺失,在N30、N33和N35处出现了新的N-糖基化位点;位于Lineage8的分离毒株在N30和N35处N-糖基化位点缺失,在N33处为缺失,在N34处缺失和突变。这些毒株的缺失、突变及增加可能增强PRRSV对中和抗体的抵抗能力和导致疫苗的免疫失败。综上所述,目前山东省猪场PRRSV感染压力较大,虽然大多数猪场使用了PRRSV疫苗进行高强度免疫,但由于毒株类型复杂多样,使得疫苗的免疫效果不尽理想,有些免疫猪场仍出现发病病例,并造成较为严重的经济损失,因此加强PRRSV流行病学调查,健全生物安全体系,本研究进一步丰富了山东省PRRS的流行病学资料,为该病的疫苗研制及免疫防控奠定了理论基础。
耿世晴[2]（2021）在《14种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究》文中提出猪繁殖与呼吸综合征（Porine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是因猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）后引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统症状为主要特征的一种传染病。PRRSV感染后,致炎因子的过量表达,会引起机体组织器官损伤。目前没有特效药物,主要的防治手段为疫苗免疫和生物安全防控。近年来,研究发现中药具有较强的抗病毒活性,不仅能直接抑制或杀灭病毒,还能增强机体免疫力。为探究鱼腥草、忍冬藤、天花粉等14味中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用,通过建立Marc-145细胞模型,测定其在Marc-145细胞上最大安全浓度的基础上,运用MTT法,通过阻断、抑制、杀灭3种作用方式探究其对PRRSV的抑制作用效果。进一步通过荧光定量PCR测定药物与病毒作用后的细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的转录水平,探讨中药抗PRRSV的机制。药物毒性试验显示中药的安全浓度都在0.78mg/m L和25mg/m L之间,其中玄参最高,为25mg/m L,紫草和虎杖最低,为0.78mg/m L。病毒的TCID50试验显示,PRRSV-JXA1毒株的TCID50为10-6.8/0.1m L。体外抗病毒试验表明,对PRRSV阻断作用最强的为虎杖、甘草、鱼腥草、射干、紫花地丁;对PRRSV直接杀灭作用最强的为射干、紫花地丁、虎杖、鱼腥草、玄参;对PRRSV抑制作用最强的为蒲公英、马齿苋、鱼腥草、紫草、虎杖。综合3种作用方式,鱼腥草、虎杖等对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制作用较强。运用q PCR法,探究三种作用方式下鱼腥草和虎杖对IL-6、IL-8、TNF-α的转录水平的影响。试验结果表明,同细胞对照组相比,病毒对照组IL-6、IL-8、TNF-α转录水平显着升高,而三种作用方式下,IL-6、IL-8、TNF-α的转录水平随药物浓度增加而降低,差异性变化不一致。但同病毒对照组相比,三种作用方式下鱼腥草和虎杖可显着（p<0.05）或极显着（p<0.01）的降低IL-6、IL-8、TNF-α的转录水平。结果表明鱼腥草和虎杖可减少PRRSV感染Marc-145细胞的促炎细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的产生。
乌东高娃[3]（2021）在《PRRSV GP2蛋白的单抗制备及Marc145-GP2细胞系的建立》文中认为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种高度接触性传染病,由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。PRRS在全球范围内广泛流行,尽管采取各项措施努力控制PRRSV的感染,但该病毒仍持续在全世界的养猪业中引起经济问题。本研究截短合成PRRSV ORF2序列,得到原核表达载体p ET-30a-ORF2,并进行诱导表达,经SDS-PAGE凝胶电泳检测,重组GP2蛋白成功表达。将纯化好的重组GP2蛋白免疫小鼠,进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。通过体内诱生法制备抗体并进行纯化,成功获得了重组GP2蛋白的单克隆抗体。为PRRSV GP2蛋白结构及功能的研究奠定了基础,也为今后PRRS的科学研究提供了技术储备。同时本研究以PRRSV全长感染性克隆pJXwn06为模板,利用PCR方法扩增ORF2基因序列,并克隆至慢病毒载体中,获得重组质粒pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2。通过慢病毒包装系统转染获得重组的慢病毒颗粒,并将其转导至Marc145细胞。用含有嘌呤霉素的培养基进行筛选,初筛后的细胞采用有限稀释法进行克隆,最终获得细胞系。通过PCR、Western blot试验验证了细胞系中GP2蛋白的稳定表达。本研究成功建立了稳定表达PRRSV GP2蛋白的Marc145-GP2细胞系,为研究GP2蛋白免疫学特性和功能奠定了基础。
宋健颖[4]（2021）在《规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整》文中研究表明随着我国养猪业的规模化发展,猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和猪伪狂犬五种主要疾病防控尤为重要,一旦发病就会造成重大经济损失。本研究通过对新疆南疆某地区3个规模化母猪场母猪群的猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬和口蹄疫等五种主要疫病进行抗体水平监测、病原检查,了解规模化母猪场抗体水平、是否存在野毒感染、野毒基因型,更好地评价免疫程序是否合理,以期提高免疫效果。1.2018年至2020年,对新疆南疆某地区3个规模猪场（A～C）采集的1604份血液进行了猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和圆环病毒2型的抗体检测。检测结果显示,猪瘟抗体阳性率分别为:A场92.30%（2018）、97.74%（2019）和89.22%（2020）;B场95.27%（2018）、93.04%（2019）和86.81%（2020）;C场91.67%（2018）、86.50%（2019）和90.80%（2020）;伪狂犬病抗体分阳性率别为:A场100.00%（2018）、99.25%（2019）和97.06%（2020）;B场98.82%（2018）、93.67%（2019）和94.44%（2020）;C场98.12%（2018）、84.00%（2019）和96.55%（2020）;猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率分别为:A场86.15%（2018）、75.19%（2019）和55.88%（2020）;B场86.39%（2018）、88.61%（2019）和88.89%（2020）;C场91.94%（2018）、96.50%（2019）和95.40%（2020）。口蹄疫抗体阳性率分别为:A场90.77%（2018）、100%（2019）和98.04%（2020）;B场100%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场95.97%（2018）、97.50%（2019）和96.55%（2020）;圆环病毒2型抗体阳性率分别为:A场80.00%（2018）、100.00%（2019）和92.16%（2020）;B场95.27%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场97.04%（2018）、97.50%（2019）和98.85%（2020）。2.以“发现疫病或证明无疫”的抽样策略采集A规模化母猪场血清样本,采用圆环病毒2型抗原ELISA检测,检测结果阳性率为4.4%,证明A场存在圆环病毒2型感染。3.对A规模化母猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪的样本,采用猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因序列特异性引物经RT-PCR扩增、测序、核苷酸同源性比较、系统进化树分析,结果证明,该样本测序结果与NADC30毒株同源性最高,为93.5%,属于类NADC30毒株。4.猪繁殖与呼吸综合征免疫程序进行调整初探,调整后母猪每年普免3次,每次免疫间隔4个月,采集调整后试验的猪群50份血清,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测,抗体阳性率达到96%以上。
关淼[5]（2021）在《辽宁地区PRRSV分型、分布及其区域化精准防制的应用》文中提出猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）临床主要引起母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸困难,可以造成感染仔猪的死亡,哺乳仔猪死亡率高达60%以上,保育仔猪达10%～30%不等。高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）感染可以使发病率和死亡率明显增加,仔猪发病率可达100%,死亡率可达70%以上,成年猪发病率和死亡率可达50%以上,母猪流产率达到30%以上。猪群中经典株和高致病株均有流行,在日常免疫和感染后确诊时,都需要加以明确和区分。针对PRRS没有有效的治疗药物,临床主要施行免疫接种对该病进行预防,严格的执行免疫接种防控措施是防控该病最积极有效的措施之一。目前该病在世界范围内普遍存在和流行,由其引发的PRRS疫情不仅给养猪业造成了巨大的经济损失,同时也严重的威胁着人类的食品安全。我国各地区PRRSV优势血清型存在差异,通过使用问卷调查、病原学、分子生物学以及血清学方法,对辽宁地区PRRS的发生和流行进行研究,结果显示在辽宁各地区PRRSV优势血清型和PRRS发生情况不尽相同,因此针对地方优势毒株和流行趋势有针对性的建立区域性精准分型方法和防制策略势在必行。通过结合本研究建立的分型方法和血清学、分子生物学等方法,对全省猪群PRRSV病原感染及免疫抗体情况进行研究。推荐并施行精准防制策略,最后对免疫效果进行评估。为今后辽宁地区PRRS精准防控措施的制定和指导猪场临床生产提供一定的科学依据和技术支撑。主要研究内容和结果如下:（1）PRRSV分型检测方法的建立及应用本研究根据PRRSV基因组NSP2编码区缺失基因的两端设计2条特异性引物,成功的建立了可以鉴别检测PRRSV经典株与高致病株的RT-PCR方法,并对其引物浓度、反应时间和反应温度等条件进行了优化。研究结果发现,该反应的最佳退火温度为58℃,体系中最佳引物浓度为0.4μmol/L。特异性试验结果表明,该方法与CSFV、PRV、PCV2和PEDV等常见感染猪的病毒无交叉反应,具有良好的特异性。通过敏感性试验,表明该方法可以在10-3稀释度扩增出经典株目的条带,在10-4稀释度扩增出高致病性株目的条带,具有良好的敏感性。重复性试验结果表明,试验检测结果之间无明显的差异,具有良好的重复性。本研究建立的分型检测方法对HP-PRRSV具有更高的检出率,经典株检出率与国标检测结果一致。本方法适合兽医实验室和养殖场对PRRSV进行鉴别筛查,指导辽宁地区PRRSV精准防控策略的制定和执行,为PRRSV的快速检测及预警提供了快捷、有效的检测方法和检测依据。（2）PRRS发病情况和病原体核酸检测及分析1)猪群PRRS临诊发病情况及分析通过对2014年～2015年辽宁省内14个地市596家不同规模化的养猪场进行调查,调查结果显示,总体上猪群PRRS临诊发病率为7.05%;随着养猪场养殖规模的增加,PRRS发病率呈下降的趋势;2014年和2015年的PRRS临诊发病情况较为平稳;2015年辽南地区PRRS临诊发病率最低为5.06%,2014年辽北地区最高为8.96%。PRRS临诊发病没有明显的地域特征,在辽宁地区处于一个比较普遍流行的状况,因此做好PRRSV免疫防制是必不可少的。2)病原检测及分析2014年～2018年5年间辽宁省假定健康猪群HP-PRRSV病原核酸平均阳性率为5.96%,其中2015年HP-PRRSV平均阳性率最高（14.70%）,2017年最低（0.97%）;四个季度HP-PRRSV平均阳性率第一季度最高（8.93%）,第三季度最低（8.40%）;辽北地区平均阳性率最高（7.54%）,辽南地区最低（4.26%）。2017年至2018年较2014年至2016年,辽宁省HP-PRRSV病原检出率下降。使用PRRSV分型检测方法进行检测,结果表明2016年和2017年疑似感染病例高致病株检出数量高于经典株,至2018年经典株检出数量高于高致病株,在辽宁省范围内高致病株为主要流行株,同时伴有经典株的流行,近年来高致病株流行趋势下降,经典株感染病例相应增多。在制定免疫政策的时候,应该根据具体情况选择弱毒疫苗免疫。对猪群进行主要传染性疫病病原核酸检测结果表明,PRRSV和PCV2混合感染率最高（43.72%）,与PRV的混合感染率最低（0.64%）。3)PRRSV及其他主要病毒性疫病分子演化分析本研究测定的基因序列均为HP-PRRSV株。ORF5基因间同源性为91.5%～99.0%,NSP2基因间同源性为92.9%～99.5%。与VR-2332相比,ORF5氨基酸序列的第39位均由L39突变为I39,与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJM相同;和VR-2332相比,第13位均由Q突变为R,LNeast2015第151位由R突变为K;同时在第137位均为S,表明本研究鉴定的毒株均为野毒株。进化树分析表明辽宁省PRRSV毒株发生了一定程度的基因变异,并且与疫苗毒有很近的亲缘关系。这些疫苗株相关分离株的出现可能与减毒修饰的活PRRS疫苗的广泛使用有关,结合氨基酸序列分析,提示为野毒株和疫苗株的基因重组毒株。对CSFV、PRV和PCV2目的基因进行序列分析结果表明,病原出现不同程度的变异并且发现部分强致病性毒株,辽宁地区部分病原与其他地区病原亲缘关系较近,存在较大的传入风险。（3）PRRSV疫苗免疫后抗体检测及分析2014年～2018年5年间辽宁省猪群PRRSV抗体平均阳性率为91.33%,其中2015年最高（94.26%）,2017年最低（87.76%）;四个季度抗体平均阳性率第四季度最高（93.31%）,第一季度最低（89.99%）;辽东地区抗体平均阳性率最高（93.82%）,辽南地区抗体平均阳性率最低（89.24%）。PRRSV抗体阳性率始终保持在70%以上,能够对群体提供免疫保护。不同生长时期猪血清样品PRRSV抗体总阳性率为94.39%,其中断奶仔猪最低（81.67%）,后备母猪、经产母猪和种公猪最高（100%）;病原总体阳性率为6.52%,其中种公猪最低（0%）,育肥猪最高（16.67%）;不同品系猪群血清样品中大白猪群PRRSV抗体阳性率最高（96%）,二元杂交阳性率最低（78%）。不同年龄阶段、不同品系PRRSV抗体阳性率差异不显着,并且都可以达到70%以上。对弱毒苗免疫后仔猪进行抗体动态检测结果表明,免疫后第1至4周仔猪体内抗体水平较低,免疫后5周开始上升,8～9周抗体水平达到峰值,可以持续到免疫后16周。免疫高致病株PRRSV弱毒苗的仔猪比免疫经典株PRRSV弱毒苗的早一周到达抗体阳性率峰值,但是二者之间没有显着的差别。因此建议在25～35日龄对仔猪进行首免,4个月后二免。（4）PRRS精准免疫防制措施实施效果及分析结合本研究建立的PRRSV分型检测方法和免疫程序,推荐精准免疫防制策略,在猪场实施以后取得了良好的效果,为辽宁地区PRRSV防控计划和猪场免疫防制措施的制定提供了很高的参考价值。试验猪场在实施精准免疫防制措施后,免疫抗体阻断率明显升高,水平趋于一致,大部分达到了0.8以上。PRRSV病原核酸检测结果表明,免疫后病原检出率明显降低。比对免疫前后母猪和哺乳仔猪的生产指标可以看出,免疫后母猪的流产发生率、木乃伊胎以及总死亡率明显降低,保胎率和仔猪成活率升高。按照推荐免疫程序进行免疫的猪群产生的抗体离散度更低,个体之间抗体水平差异性较小,具有更好的整体保护力。对辽宁地区抽样猪场进行调查及检测结果表明,2016年猪群免疫均为PRRSV高致病株疫苗,2017年、2018年PRRSV高致病株疫苗使用率降低,经典株疫苗使用率增加;在辽西、辽北部分市推广使用精准免疫措施后,辽西和辽北地区PRRS发生率下降;2018年相较2017年,各地区PRRSV高致病株检出数量均减少,辽西地区和辽北地区的经典株检出数量减少;2018年相较2017年,辽西地区和辽北地区抗体阳性率上升。2018年精准免疫防制措施推广场与未推广场相比,具有更低的病原阳性率和平均发病率,具有更高的抗体阳性率。猪场在制定并施行免疫防制策略的时候,应根据本猪场、周边环境、整个县市的PRRSV流行趋势,选择适合本猪场的弱毒苗和免疫程序。PRRSV阴性场如果周边场、县没有HP-PRRSV的流行应该尽量选择经典株弱毒苗进行免疫;PRRSV阳性场,应先确定本猪场发生的是哪种PRRSV血清型感染,再选择弱毒苗进行紧急的全群免疫。
邵清源[6]（2021）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白和Nsp4蛋白单克隆抗体的制备》文中指出猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,是目前危害全球猪养殖业的疾病之一,被俗称为猪蓝耳病。该病主要是引起猪繁殖障碍,仔猪明显的呼吸道症状。引起该病的病原是PRRSV。Nsp2是PRRSV中最大的非结构蛋白,在PRRSV-1型PRRSV-2型毒株之间的差异较大,同时含有丰富的B细胞表位,Nsp4是一种3C样的蛋白酶,可以切割其他非结构蛋白,含有丰富的B细胞表位。临床上感染猪血清中抗NSP2和NSP4的抗体均较早出现。因此,这2个蛋白及其单克隆抗体都可以作为PRRSV感染诊断的理想靶标。本研究首先原核表达出PRRSV Nsp2和PRRSV Nsp4重组蛋白。表达产物经过SDS-PAGE验证分析,PRRSV Nsp2重组蛋白呈不溶性表达（存在于包涵体中）,PRRSV Nsp4的重组蛋白呈可溶性表达,使用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,运用尿素梯度透析法复性纯化的PRRSV Nsp2的重组蛋白。将纯化后的两个重组蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化对7周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫,第三次免疫后10-14天从免疫小鼠的尾部采血分离血清,用IFA和ELISA检测小鼠体内抗体水平,对抗体效价达到细胞融合水平的小鼠进行了一次加强免疫,免疫后3-5天取小鼠的脾细胞与复苏的SP2/0细胞进行常规的细胞融合。对融合细胞培养上清进行ELISA检测,筛选出可以分泌抗体的杂交瘤细胞阳性孔,运用有限稀释法对杂交瘤细胞进行细胞亚克隆,经过两次细胞亚克隆最终制备出一株针对PRRSV Nsp2的单克隆抗体,命名为3-A8;一株针对PRRSV Nsp4的单克隆抗体,命名为B+D11。将两种杂交瘤细胞株扩大培养后分别注射到了经产母鼠的腹腔内,制备出了大量的杂交瘤细胞腹水。将制备的两个单抗应用于Western blot实验和IFA实验,发现两种单抗制备的腹水应用于Western blot实验的最佳使用稀释度是1:8000,针对PRRSV Nsp2蛋白的腹水单抗（3-A8）应用于IFA实验的最佳稀释度是1:100,针对PRRSV Nsp4单抗（B+D11）的杂交瘤细胞培养上清可用于IFA实验。本研究制备的两种单克隆抗体可以为PRRSV的研究和PRRS的检测诊断提供有利的工具,具有重要的应用价值。
杨婉婷[7]（2020）在《2018-2019年山东地区猪主要病毒性呼吸道疾病的病原学调查与分析》文中研究表明随着我国养猪业的发展,各种疾病不断涌现,严重危害着养猪产业的健康发展。最常见的三类疾病,即呼吸系统疾病、消化系统疾病和繁殖障碍性疾病危害最大。其中猪呼吸道类疾病发生最为普遍。在猪呼吸系统疾病发生过程中,免疫抑制性病毒如CSFV、PRRSV,PCV2及PRV的提前或者潜伏感染是重要的病因之一。免疫抑制性病毒能够导致机体免疫力下降,对各种病毒细菌的抵抗力降低,从而诱发更多的疾病,所以对猪呼吸系统相关疾病进行研究是很有必要的。鉴于此,本研究对2018-2019年山东省部分地区猪场进行猪呼吸系统疾病流行病学调查,以揭示出山东省猪群呼吸道疾病感染现状及病原的遗传变异,促进对目前CSFV、PRRSV和PCV2流行毒株遗传变异情况的了解和认识。并为以后猪呼吸系统疾病的预防、诊断及治疗奠定更加扎实的理论基础。调查结果为:1.2018-2019年期间,主要运用荧光定量PCR、荧光定量RT-PCR方法,共对2650份猪组织和猪鼻棉拭子,进行PRRSV、CSFV、PCV2和PRV共4种病原核酸检测。被检PRRSV、PCV2、CSFV和PRV的个体阳性率分别是3.81%（101/2650）、8.45%（224/2650）、4.42%（117/2650）和0.07%（2/2650）。数据分析显示,春秋季节各个猪群病原阳性率差异参差不齐,总的来说秋季发病率略高于春季,不同猪群中普遍存在PRRSV、CSFV和PCV2感染,不同地域被检测样品阳性率存在一定的差异。2.对扩增的9条猪瘟病毒的E2基因序列分析显示,与HCLV疫苗株相比,这些毒株均存在11处氨基酸位点突变。对9条猪瘟病毒5’UTR和E2基因进化树结果显示这9条病毒均属于2.1d亚群,与Shimen株、HCLV疫苗株亲缘关系较远。综上说明山东省猪瘟流行毒株已经朝着远离猪瘟兔化弱毒疫苗的方向进化。3.PRRSV部分基因的遗传变异分析,以ORF5基因序列进行进化树分析,结果显示有11条归类为谱系1,与NADC30样毒株处于同一分支。其他9条属于谱系8,其中8条与JXA1高致病性毒株处于同一分支,表明山东省以NADC30型PRRSV流行为主。nsp2具有很高的变异性,nsp2变异可以导致新型HP-PRRSV毒株出现。对nsp2基因研究发现,本研究中基因序列nsp2的HVR中氨基酸存在缺失和插入,这都可能导致高致病性毒株的出现。4.PCV2全基因的遗传变异分析,对所测得的22条PCV2全基因序列进行归类,发现PCV2b和PCV2e为山东省主要流行毒株。与疫苗株相比,本试验毒株存在多处氨基酸位点突变,尤其是变异度较高的区域是否能够导致当前疫苗免疫效果不理想仍需进一步研究。抗原指数预测分析发现,PCV2e亚型毒株的抗原指数与4株疫苗株差异最大,这提示了在免疫疫苗之前,我们需要对该地区对PCV2基因亚型进行流行性分析,特别是如果流行PCV2e亚型时,需要考虑是否免疫当前商品化疫苗。
陆民[8]（2019）在《克拉玛依市猪口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病的病原学调查及抗体检测分析》文中研究指明目的:生猪养殖是克拉玛依市的优势畜牧产业,随着克拉玛依市畜牧业的发展,当地生猪的存栏量逐年上升,猪的传染病也越来越多,给当地的养猪业带来了不小的损失。为掌握克拉玛依市猪口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病的流行情况,本研究针对性地开展了病原学调查、抗体检测与分析,以期为该地区有效控制三种疫病疫情提供理论依据。方法:本次试验对2017年、2018年克拉玛依市各辖区生猪三大疫病通过荧光定量RT-PCR的方法,进行病原学调查与比较分析;对克拉玛依市2015年秋季—2018年春季期间生猪三种疫病的免疫抗体采用酶联免疫吸附试验进行检测,并对结果进行分析;同时对比分析了传统防疫服务模式与购买兽医社会化服务模式的防控成效,在此基础上为克拉玛依市今后有效防控生猪三大疫病提供了合理建议。结果:（1）通过荧光定量RT-PCR方法调查2017年、2018年两年的三种疫病的流行情况,结果显示大三疫病的阳性率均为0.00%,得知克拉玛依市辖区近两年未出现口蹄疫、猪瘟、猪蓝耳疫情。（2）不同养殖模式下,规模化养殖的猪口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病的平均抗体合格率分别为92.41%、97.01%、91.72%,明显高于散养模式下71.68%、81.38%、82.94%的合格率。经差异分析可知,散养模式下各区的三大疫病抗体水平都存在显着差异,规模场之间差异不显着。（3）不同区域下,农业综合开发区的三种疫病抗体水平相对最高,合格率分别为95.35%、88.50%、99.53%,其次较高的是白碱滩区,三种疫病抗体水合格率分别为91.36%、89.30%和98.10%,主要原因是白碱滩区和农业开发区实行了购买兽医社会化服务模式,提高了防疫质量和效率。（4）不同年份下,口蹄疫的抗体合格率从2015年的75.96%到2018年的94.56%,呈逐年上升趋势;猪瘟和猪蓝耳抗体合格率呈现先低后高再到低的趋势变化,主要是因为口蹄疫一直作为国家强制免疫的动物疫病,而2017年国家对猪瘟和猪蓝耳不再执行强制免疫的政策。（5）通过对比两种防疫服务模式结果表明在购买兽医社会化服务模式中,猪口蹄疫的抗体水平大概提高了10个百分点,口蹄疫、猪瘟、猪蓝耳病免疫密度均达到99%以上,比传统防疫模式提高近10个百分点;随机抽样三种疫病的免疫抗体合格率,均比传统防疫模式的抗体合格率提高1015个百分点;疫苗浪费率比传统防疫模式下降近5个百分点;强制免疫动物应激死亡率比传统防疫模式下降低近3倍。结论:（1）通过抗原检测,证实克拉玛依市辖区近两年未出现口蹄疫、猪瘟、猪蓝耳疫情;（2）不同养殖模式下,规模场的三种疫病抗体合格率高于散养模式;（3）不同区域下,白碱滩区和农业综合开发区的三种疫病抗体水平显着高于其他三个区;（4）不同年份下,猪瘟和猪蓝耳抗体水平呈现先低后高再到低的曲线变化,而口蹄疫的抗体水平呈逐年升高趋势;（5）比较两种防疫服务模式,购买兽医社会化服务模式显着优于统防疫模式。
王惠[9]（2019）在《板蓝根配合不同中药制剂对PRRSV抗体及核酸载量的影响》文中研究指明猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的,以妊娠母猪流产、各种年龄段猪的呼吸障碍为特征的一种传染病,该病频繁爆发给全球养猪业造成了相当大的经济损失。临床上对于该病的免疫预防主要使用PRRSV弱毒疫苗,但存在散毒问题,而且有疫苗毒株毒力返强的潜在危险,因此,寻求减轻甚至净化猪体内残留毒的方法是防治PRRSV感染的关键。本实验将板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖、板青颗粒配合黄芪多糖作为免疫调节剂,与PRRSV弱毒疫苗配合使用,通过对PRRSV抗体及体内PRRSV残留毒变化的检测,探究其对于注射PRRSV弱毒疫苗的猪只的抗体影响及体内PRRSV残留毒的净化作用,旨在为板蓝根颗粒作为免疫增强剂提供理论依据,为以后的相关研究以及猪群免疫保健方案的制定作一参考。1.板蓝根对免疫猪血清中PRRSV抗体调节作用研究目的:研究板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖、板青颗粒配合黄芪多糖对PRRSV弱毒苗免疫抗体的影响。方法:在免疫PRRSV弱毒疫苗后分别以板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖、板青颗粒配合黄芪多糖饲喂后备母猪,在免疫30d后采血检测血清中抗PRRSV抗体水平。结果发现,板蓝根颗粒配合黄芪多糖作为免疫调节剂,可以稳定抗体水平,降低S/P值强阳性猪只抗体水平（S/P值>2.8）,减轻散毒风险,且效果明显优于板青颗粒配合黄芪多糖。2.板蓝根对猪血液中PRRSV病毒核酸载量的影响目的:通过检测饲喂板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖、板青颗粒配合黄芪多糖的带毒猪体内PRRSV病毒核酸载量的变化,初步揭示板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖净化PRRSV残留毒的作用。方法:免疫前及免疫30d后采血,以荧光定量RT-PCR技术检测PRRSV抗体S/P值高于2.5的试验猪中PRRSV病毒核酸载量。结果表明:使用板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖粉作为免疫调节剂PRRSV病毒核酸载量呈现下降趋势,使用板青颗粒配合黄芪多糖粉作为免疫调节剂PRRSV病毒核酸载量下降的幅度要明显低于板蓝根颗粒组和板蓝根颗粒配合黄芪多糖粉组。说明板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖能有效降低血液中PRRSV病毒核酸的载量,净化母猪体内PRRSV残留毒,改善猪群健康状况。
张日腾[10]（2020）在《PRRSV不同基因亚型毒株RT-LAMP检测方法及基因嵌合毒株致病性和免疫效力》文中认为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是引起母猪繁殖障碍、各日龄猪呼吸系统疾病的一种重要病原,对养殖业造成较大的经济损失。PRRSV基因组为RNA,极易发生变异或重组,造成毒株的遗传多样性。该病自我国被首次报道以后,国内相继出现了一系列变异毒株的流行,如2006年爆发的高致病性PRRSV、以及近年来流行的类NADC30毒株和类QYYZ毒株等多种基因亚型毒株,其抗原性和致病性均发生了变化。目前,PRRSV不同基因亚型鉴别检测方法研究不多,疫苗也尚不理想。本研究的具体内容如下:1.PRRSV不同基因型及亚型毒株RT-LAMP检测方法的建立与应用运用DNAstar软件对PRRSV欧洲型、美洲型基因亚型毒株的基因序列进行比对,针对ORF7基因保守区域,运用在线网页Primer Explorer V4分别设计特异性引物,每套引物分别包含外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB,成功建立了鉴别欧洲型、美洲型PRRSV毒株RT-LAMP检测方法。针对我国流行的经典株、高致病性和类NADC30三种基因亚型的美洲型毒株。根据其Nsp2基因,设计出三套特异性引物,建立了鉴别这3种基因亚型毒株的RT-LAMP检测方法。上述方法与CSFV、PCV2、PRV等病原均无交叉反应,与Real-Time PCR检测方法的敏感度相似,证明其具有较高特异性和敏感性,可用于PRRS临床样本的检测及亚型鉴定。2.美洲型PRRSV等温扩增冻干诊断试剂盒的研发LAMP方法不需要特殊的仪器设备,反应结果可通过肉眼直接判断,适合在基层开展病原学的早期诊断和研究。本研究上述建立PRRSV RT-LAMP方法的基础上,选用6种冻干保护剂,将环介导等温扩增反应试剂进行冷冻干燥,通过冻干品稳定保存性测定,筛选获得了对LAMP扩增反应无影响的3种冻干保护剂,根据冻干品物理性状,优化冻干保护剂配方为5%海藻糖、1.25%牛血清白蛋白和1.25%甘露醇。PRRSVRT-LAMP检测试剂盒主要成分包括:等温扩增冻干制剂、阳性对照品溶液、阴性对照品溶液、甜菜碱溶液以及显色液。试剂盒敏感性最低可检测到 102 copies/μL。取该试剂盒置4℃保存,不同时间点抽样进行稳定性检测,证明该试剂盒4℃保存,有效期为12个月。该试剂盒敏感性高、操作便捷,适合基层及现场疾病的快速检测,具有较好的推广应用价值。3.猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合疫苗候选株的免疫效果评价本研究采用本实验室构建的三种嵌合毒株rTd111、rTd111/F2-7、rTd111/F5-6,猪肺泡巨噬细胞（PAMs）体外培养试验结果显示,三种嵌合毒株在PAMs细胞的生长速度及病毒滴度与母本TJM-F92毒株相似。感染PAMs细胞后,rTd111/F5-6诱导的炎性细胞因子水平与rTd111相似,略高于TJM-F92,而rTd111/F2-7诱导的炎性细胞因子水平明显高于rTd111、rTd111/F5-6和TJM-F92。选择30-35 日龄PRRSV阴性健康仔猪,接种rTd111、rTd111/F2-7和rTd111/F5-6嵌合病毒,经对猪体临床症状、病毒载量、剖检病变以及病理学观察,结果显示,rTd111/F5-6毒力与TJM-F92相似,但明显低于FJ1402,而rTd111/F2-7毒力高于rTd111/F5-6,表明rTd111/F5-6致病性最低,可作为疫苗候选株。选择30-35日龄PRRSV阴性健康仔猪,接种rTd111/F5-6嵌合病毒和商品疫苗TJM-F92,免疫后28 d分别利用HP-PRRSV毒株BB0907和类NADC30毒株FJ1402经肌肉注射攻毒,结果显示,rTd111/F5-6免疫组猪感染PRRSVBB0907及FJ1402毒株后,病毒血症水平明显降低,临床症状和病理变化明显减轻,表明rTd111/F5-6嵌合毒株具有良好的免疫原性,可对高致病性毒株以及类NADC30毒株感染提供有效的交叉免疫保护,为该病新型疫苗研制奠定了重要基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 PRRSV形态和理化性质 |
| 1.2.2 PRRSV基因组结构 |
| 1.2.3 病毒蛋白结构及功能 |
| 1.3 PRRSV的致病机制 |
| 1.4 PRRS的流行病学 |
| 1.4.1 地理分布 |
| 1.4.2 易感动物 |
| 1.4.3 传播途径 |
| 1.4.4 临床症状 |
| 1.5 PRRS的检测方法 |
| 1.5.1 病原学检测方法 |
| 1.5.2 血清学检测方法 |
| 1.6 PRRS疫苗的使用情况 |
| 1.7 对PRRSV根除的展望 |
| 1.8 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品信息 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要实验材料 |
| 2.1.4 主要实验试剂配制 |
| 2.1.5 引物的设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病原学检测 |
| 2.2.2 组织病理学检测 |
| 2.2.3 病毒分离 |
| 2.2.4 GP5 基因序列测定及分析 |
| 2.2.5 PRRSV GP5 基因序列测定及分析 |
| 2.2.6 PRRSV抗体检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 临床病例症状 |
| 3.2 剖检病变 |
| 3.3 病理组织学观察 |
| 3.4 PRRSV病原检测结果 |
| 3.4.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.4.2 混合感染情况 |
| 3.4.3 PRRSV发病规律 |
| 3.4.4 PRRSV分离与鉴定结果 |
| 3.5 PRRSV分离毒株GP5 基因同源性比对及遗传进化分析 |
| 3.5.1 PRRSV分离毒株GP5 基因测序结果 |
| 3.5.2 遗传进化分析结果 |
| 3.5.3 核苷酸与推导氨基酸同源性对比结果 |
| 3.5.4 GP5 蛋白基因推导氨基酸位点突变分析 |
| 3.5.5 GP5 蛋白抗原表位分析 |
| 3.5.6 GP5 N-糖基化位点分析 |
| 3.6 不同猪群PRRSV N蛋白抗体检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 山东省PRRS流行病学调查 |
| 4.2 PRRSV ORF5 基因变异分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 PRRS的病原学和流行病学特点 |
| 1.1.1 PRRS的病原学特点 |
| 1.1.2 PRRS的流行病学特点 |
| 1.2 PRRS的主要临床症状和病理变化 |
| 1.2.1 PRRS的主要临床症状 |
| 1.2.2 PRRS的病理变化 |
| 1.3 PRRS的诊断方法 |
| 1.3.1 抗原诊断 |
| 1.3.2 抗体诊断 |
| 1.4 PRRS的中兽医发病机理 |
| 1.5 抗病毒药物概述 |
| 1.5.1 抗病毒药物的分类 |
| 1.5.2 抗病毒药物的作用机理 |
| 1.6 中草药抗病毒的研究进展 |
| 1.7 炎症因子概况 |
| 1.8 PRRSV的疫苗防控 |
| 1.9 研究的目的和意义 |
| 第二章 14 种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞和毒株 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 中草药药液的制备 |
| 2.2.2 Marc-145 细胞的培养 |
| 2.2.3 中药的毒性试验 |
| 2.2.4 PRRSV的增殖与TCID50 的测定 |
| 2.2.5 中药水提物体外抗PRRSV效果的测定 |
| 2.2.6 数据处理及药物评价 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 中草药的最大安全浓度 |
| 2.3.2 PRRSV的 TCID50 测定结果 |
| 2.3.3 中草药抗PRRSV作用效果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 荧光定量PCR试验检测细胞因子 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞和毒株 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试剂的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 中药的阻断作用(先加药物后加病毒)试验 |
| 3.2.2 中药的抑制作用(先加病毒后加药物)试验 |
| 3.2.3 中药直接杀灭作用(药物与病毒同时加)试验 |
| 3.2.4 RNA的提取及RT-PCR扩增目的片段 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 先加药物后加病毒(阻断作用) |
| 3.3.2 药物与病毒同时加(直接杀灭作用) |
| 3.3.3 先加病毒后加药物(抑制作用) |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 PRRSV的基因组结构 |
| 1.2.3 PRRSV的非结构蛋白 |
| 1.2.4 PRRSV的结构蛋白 |
| 1.3 PRRS的发病机理 |
| 1.4 PRRSV的感染特征 |
| 1.5 PRRS的流行病学 |
| 1.6 PRRS的临床症状 |
| 1.7 PRRS的诊断及防控 |
| 1.7.1 PRRS的诊断 |
| 1.7.2 PRRS的防控 |
| 1.8 PRRSV抗体的研究进展 |
| 1.9 PRRSV细胞系的研究进展 |
| 1.10 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 血清、质粒、细胞及引物 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 溶液的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GP2 蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.2 pET-30a-ORF2 的酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.4 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.2.5 重组蛋白的大量表达 |
| 2.2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 重组蛋白的Western-Blot检测 |
| 2.2.8 杂交瘤细胞的制备及筛选 |
| 2.2.9 单克隆抗体腹水的制备及纯化 |
| 2.2.10 目的基因的扩增 |
| 2.2.11 重组慢病毒质粒的构建 |
| 2.2.12 慢病毒的包装 |
| 2.2.13 测定嘌呤霉素的杀灭曲线 |
| 2.2.14 慢病毒转导和细胞克隆 |
| 2.2.15 细胞系的PCR鉴定 |
| 2.2.16 细胞系的蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 GP2 蛋白生物信息学分析 |
| 3.2 原核表达载体双酶切鉴定结果 |
| 3.3 重组蛋白的原核表达及SDS-PAGE电泳检测结果 |
| 3.4 重组蛋白的大量表达 |
| 3.5 重组蛋白的纯化结果 |
| 3.6 纯化后重组GP2 蛋白Western Blot结果 |
| 3.7 血清效价测定 |
| 3.8 杂交瘤细胞株的筛选及亚类鉴定 |
| 3.9 重组GP2 蛋白抗体的纯化 |
| 3.9.1 SDS-PAGE检测抗体纯度 |
| 3.9.2 用BCA法测定蛋白含量 |
| 3.10 ORF2 基因的扩增 |
| 3.11 重组慢病毒质粒的双酶切鉴定 |
| 3.12 重组慢病毒的包装 |
| 3.13 嘌呤霉素杀灭曲线的确定 |
| 3.14 慢病毒的转导及细胞系的筛选 |
| 3.15 细胞系的PCR鉴定 |
| 3.16 细胞系的Western blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 病原学 |
| 1.1.3 猪瘟流行病学和临床症状 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 伪狂犬的研究概况 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.2.3 伪狂犬流行病学和临床症状 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征的研究概况 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 病原学 |
| 1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征流行病学和临床症状 |
| 1.3.4 诊断方法 |
| 1.4 口蹄疫病的研究研究概况 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 病原学 |
| 1.4.3 口蹄疫病流行病学和临床症状 |
| 1.4.4 诊断方法 |
| 1.5 圆环病毒2 型的研究概况 |
| 1.5.1 概述 |
| 1.5.2 病原学 |
| 1.5.3 圆环病毒2型病流行病学和临床症状 |
| 1.5.4 诊断方法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 3 个规模化母猪场5 种疫病抗体检测与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品来源 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 样品处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 规模母猪场猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.2 规模母猪场伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.3 规模母猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.4 规模母猪场口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.5 规模母猪场圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测结果分析 |
| 第三章 A规模化母猪场圆环病毒2 型抗原检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品来源及抽样原则 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 圆环病毒2 型抗原ELISA检测 |
| 3.3 检测结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 A规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型鉴定及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病料采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 引物设计与合成 |
| 4.1.5 样品处理 |
| 4.1.6 病毒核酸提取 |
| 4.1.7 PCR产物纯化回收、测序 |
| 4.1.8 序列分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 PCR扩增结果 |
| 4.2.2 基因核苷酸同源性分析 |
| 4.2.3 基因遗传进化树分析 |
| 4.3 .讨论 |
| 第五章 A规模化母猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫程序调整试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 调整后母猪抗体检测结果 |
| 5.2.3 调整前后母猪抗体合格率对比 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 |
| 1.1.1 PRRS国内外流行历史及现状 |
| 1.1.2 病原学特性 |
| 1.1.3 流行病学特征 |
| 1.1.4 PRRSV分子生物学研究进展 |
| 1.1.5 PRRSV免疫学研究进展 |
| 1.1.6 PRRS诊断方法研究进展 |
| 1.1.7 PRRS的综合防制 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试病毒样品 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 主要生物制剂和化学试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品的来源、采集及前处理 |
| 2.2.2 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 2.2.3 猪群PRRS临诊发病情况调查 |
| 2.2.4 猪主要组织器官中病原核酸检测 |
| 2.2.5 目的基因序列扩增与分析 |
| 2.2.6 PRRSV疫苗免疫后抗体检测 |
| 2.2.7 PRRS精准免疫防制措施的实施及效果评估 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 3.1.1 RT-PCR体系及反应条件优化 |
| 3.1.2 特异性试验 |
| 3.1.3 敏感性试验 |
| 3.1.4 重复性试验 |
| 3.1.5 PRRSV分型检测方法与其他检测方法相符率的比较 |
| 3.2 猪群PRRS临诊发病情况 |
| 3.3 猪群病原核酸检测 |
| 3.3.1 假定健康猪群HP-PRRSV核酸检测 |
| 3.3.2 疑似感染PRRSV分型检测 |
| 3.3.3 PRRSV与 CSFV、PRV和 PCV2混合感染情况 |
| 3.4 PRRSV及其他主要病毒性疫病部分基因扩增与序列分析 |
| 3.4.1 PRRSV ORF5和NSP2基因的扩增 |
| 3.4.2 PRRSV目的基因序列分析 |
| 3.4.3 CSFV、PRV主要致病基因和PCV2基因的扩增及序列分析 |
| 3.5 PRRSV疫苗免疫后抗体检测 |
| 3.5.1 猪场PRRSV抗体检测 |
| 3.5.2 PRRSV抗体动态检测 |
| 3.6 PRRS精准免疫防制措施的实施及效果评估 |
| 3.6.1 免疫程序 |
| 3.6.2 PRRS精准免疫防制措施实施猪场一 |
| 3.6.3 PRRS精准免疫防制措施实施猪场二 |
| 3.6.4 各场抗体水平比较 |
| 3.6.5 辽宁地区 PRRS 精准免疫防制措施实施前后效果评估 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 4.2 PRRS发病情况和病原体核酸检测及分析 |
| 4.2.1 部分猪场PRRS临诊发病情况及分析 |
| 4.2.2 猪群病原检测及分析 |
| 4.2.3 PRRSV及其他主要病毒性疫病分子演化分析 |
| 4.3 PRRSV疫苗免疫后抗体检测及分析 |
| 4.4 PRRS精准免疫防制措施的实施效果及分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 符号及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 PRRS概述 |
| 1.2 PRRS的病原学特征及研究进展 |
| 1.2.1 PRRSV的分类和形态特征 |
| 1.2.2 PRRSV的主要蛋白及功能 |
| 1.2.3 PRRSV的遗传变异 |
| 1.3 PRRS的临床症状和主要诊断方法 |
| 1.4 单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.1 单克隆抗体制备原理 |
| 1.4.2 单克隆抗体的应用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物、毒株及细胞系 |
| 2.1.2 质粒、感受态 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PRRSV Nsp2 蛋白和Nsp4 蛋白的原核表达 |
| 2.2.2 PRRSV Nsp2 蛋白和Nsp4 蛋白的纯化 |
| 2.2.3 PRRSV Nsp2 蛋白的复性 |
| 2.2.4 动物免疫 |
| 2.2.5 免疫小鼠抗体效价的测定 |
| 2.2.6 细胞融合实验 |
| 2.2.7 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.2.8 单克隆抗体的特异性鉴定及应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSV Nsp2 蛋白和Nsp4 蛋白的原核表达 |
| 3.2 PRRSV Nsp2 蛋白和Nsp4 蛋白的纯化 |
| 3.3 免疫小鼠抗体效价的测定 |
| 3.4 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.5 杂交瘤细胞培养上清用Western blot鉴定 |
| 3.6 杂交瘤细胞培养上清用IFA鉴定 |
| 3.7 单抗应用于Western blot实验的使用浓度鉴定 |
| 3.8 单抗应用于IFA实验的使用浓度鉴定 |
| 3.9 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定 |
| 3.10 单抗亚型鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 山东省生猪养殖与疫病现状 |
| 1.1.1 山东省生猪养殖概况 |
| 1.1.2 山东省生猪疫病现状 |
| 1.2 猪呼吸系统疾病的主要的几种病毒性原发病原 |
| 1.2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 |
| 1.2.2 猪圆环病毒 |
| 1.2.3 猪瘟病毒 |
| 1.2.4 猪伪狂犬病毒 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 被检样品 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试验中相关溶液及培养基 |
| 2.1.5 实验引物设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 流行病学相关病料的收集 |
| 2.2.2 病原学检测方法 |
| 2.2.3 病毒目的基因的RT-PCR/PCR扩增与克隆测序分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 样品的初步临床诊断 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 收集到的病料剖检病变 |
| 3.2 病原检测结果 |
| 3.2.1 山东省不同季节猪场病原阳性率检测结果 |
| 3.2.2 山东省不同猪群病原阳性率检测结果 |
| 3.2.3 山东省不同区域病原阳性率检测结果 |
| 3.3 目的片段的扩增 |
| 3.3.1 山东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析 |
| 3.3.2 山东省猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株遗传多样性分析 |
| 3.3.3 山东省猪圆环2 型病毒流行毒株遗传多样性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 引发猪呼吸系统病毒病主要病原分析 |
| 4.2 病毒目的基因的RT-PCR/PCR扩增与克隆测序分析讨论 |
| 4.2.1 CSFV部分基因的遗传变异分析讨论 |
| 4.2.2 PRRSV部分基因的遗传变异分析讨论 |
| 4.2.3 PCV2 全基因的遗传变异分析讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 猪口蹄疫的研究概述 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 临床诊断 |
| 1.5 免疫程序 |
| 1.6 综合防制 |
| 1.7 口蹄疫疫苗的国内外研究 |
| 2 猪瘟的研究概述 |
| 2.1 病原 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 诊断 |
| 2.5 免疫程序 |
| 2.6 综合防治 |
| 2.7 猪瘟疫苗研究进展 |
| 3 猪繁殖与呼吸综合征的研究概述 |
| 3.1 病原 |
| 3.2 流行病学 |
| 3.3 临床症状 |
| 3.4 病理变化 |
| 3.5 诊断 |
| 3.6 免疫程序 |
| 3.7 综合防治 |
| 3.8 猪蓝耳病疫苗研究进展 |
| 4 研究目的意义 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 克拉玛依市猪口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病防控现状调查 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 地点 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 调查方法 |
| 2.2.2 调查内容 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 克拉玛依市生猪养殖现状 |
| 3.2 克拉玛依市生猪饲养管理现状 |
| 3.3 克拉玛依市防疫体系建设现状 |
| 3.4 克拉玛依市生猪疫苗使用情况及免疫方法 |
| 3.4.1 疫苗使用情况 |
| 3.4.2 免疫方法 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 试验二 克拉玛依市猪口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病病原学调查 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验分组及数据处理 |
| 2.2.2 口蹄疫病毒通用型直接扩增荧光定量RT-PCR抗原检测试验 |
| 2.2.3 猪瘟病毒通用型直接扩增荧光定量RT-PCR抗原检测试验 |
| 2.2.4 猪蓝耳病病毒变异株直接扩增荧光定量RT-PCR抗原检测试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 2017 年猪口蹄疫、猪瘟、猪蓝耳病病原学调查结果 |
| 3.2 2018 年猪口蹄疫、猪瘟、猪蓝耳病病原学调查结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 试验三 猪口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病的抗体水平检测分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验分组与数据处理 |
| 2.2.2 口蹄疫液相阻断ELISA试验 |
| 2.2.3 猪瘟抗体ELISA试验 |
| 2.2.4 猪蓝耳抗体ELISA试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同养殖模式下抗体水平检测分析 |
| 3.1.1 不同养殖模式下猪口蹄疫的抗体水平检测分析 |
| 3.1.2 不同养殖模式下猪瘟的抗体水平检测分析 |
| 3.1.3 不同养殖模式下猪蓝耳病的抗体水平检测分析 |
| 3.2 不同区域抗体水平检测分析 |
| 3.2.1 不同区域猪口蹄疫的抗体水平检测分析 |
| 3.2.2 不同区域猪瘟的抗体水平检测分析 |
| 3.2.3 不同区域猪蓝耳病的抗体水平检测分析 |
| 3.3 不同年份抗体水平检测分析 |
| 3.3.1 不同年份猪口蹄疫的抗体水平检测分析 |
| 3.3.2 不同年份猪瘟的抗体水平检测分析 |
| 3.3.3 不同年份猪蓝耳病的抗体水平检测分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 试验四 两种防疫服务模式防控效果的对比分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验分组与数据处理 |
| 2.2.2 免疫抗体的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 克拉玛依市政府购买兽医社会化服务现状 |
| 3.2 两种防疫服务模式防控效果对比的案例分析 |
| 3.2.1 克拉玛依市雪瑞防疫合作社成立背景 |
| 3.2.2 两种防疫服务模式费用对比 |
| 3.2.3 两种防疫服务模式工作内容对比 |
| 3.2.4 两种防疫服务模式免疫抗体水平检测 |
| 3.2.5 两种防疫服务模式防疫效果对比 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文章综述 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1.1 PRRSV病原学 |
| 1.1.1 PRRSV病原结构 |
| 1.1.2 PRRSV理化特性 |
| 1.1.3 P RRSV基因学特性 |
| 1.2 PRRSV流行病学 |
| 1.3 PRRSV临床症状 |
| 1.4 PRRSV诊断方法 |
| 1.4.1 PRRSV病原学诊断 |
| 1.4.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4.3 RT-PCR法 |
| 1.4.4 血清病毒中和试验(SVN) |
| 1.4.5 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA) |
| 1.4.6 荧光抗体检测抗原 |
| 1.5 PRRSV免疫学 |
| 1.5.1 PRRSV对体液免疫的影响 |
| 1.5.2 PRRSV对细胞免疫的影响 |
| 1.6 PRRSV的防控对策 |
| 2 板蓝根的研究进展 |
| 2.1 板蓝根的抗病毒作用 |
| 2.2 板蓝根的抗内毒素作用 |
| 2.3 板蓝根的免疫调节作用 |
| 2.4 板蓝根的抗炎抗菌作用 |
| 2.5 板蓝根的抗肿瘤作用 |
| 3 黄芪多糖的药理作用 |
| 4 技术路线图 |
| 第二章 板蓝根对PRRSV疫苗免疫调节作用研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 试验疫苗 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 实验动物分组 |
| 2.2 血样采集 |
| 2.3 血清ELISA抗体检测 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 板蓝根对猪血清中PRRSV病毒核酸载量的影响 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 样本选取 |
| 2.2 血液总RNA的提取 |
| 2.3 RNA 的反转录 |
| 2.4 猪血液中PRRSV病毒核酸载量的测定 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征的研究进展 |
| 1 病原学研究 |
| 1.1 病毒生物学特性 |
| 1.2 基因组结构 |
| 2 免疫学研究 |
| 3 病毒致病机制 |
| 3.1 感染机制 |
| 3.2 致病机制 |
| 4 诊断技术 |
| 4.1 病原学检测技术 |
| 4.2 血清学检测技术 |
| 4.3 分子生物学检测技术 |
| 5 防控策略 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒不同基因型及亚型毒株RT-LAMP检测方法的建立与应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及临床样本 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRRSV GP5基因的克隆及序列分析 |
| 2.2 美洲型、欧洲型毒株RT-LAMP检测方法的建立 |
| 2.3 美洲株不同亚型毒株RT-LAMP检测方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRRSV欧美洲基因型毒株RT-LAMP检测方法 |
| 3.2 PRRSV不同亚型美洲型毒株RT-LAMP检测方法 |
| 3.3 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 美洲型PRRSV RT-LAMP检测试剂盒的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 阳性标准品的制备 |
| 2.2 阴性标准品的制备 |
| 2.3 甜菜碱溶液的配置 |
| 2.4 显色液的配置 |
| 2.5 等温扩增试剂冻干品的制备 |
| 2.6 试剂盒组装 |
| 2.7 试剂盒敏感性检测 |
| 2.8 试剂盒保存期试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 LAMP反应体系冻干保护剂组分的筛选 |
| 3.2 LAMP反应体系冻干保护剂组方优化结果 |
| 3.3 冻干保护剂对LAMP敏感性的影响 |
| 3.4 LAMP试剂盒组装 |
| 3.5 试剂盒敏感性试验 |
| 3.6 试剂盒特异性试验 |
| 3.7 试剂盒保存期测定 |
| 3.8 试剂盒中冻干品冻融次数对检测结果的影响 |
| 3.9 试剂盒的临床应用 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 不同基因亚型PRRSV嵌合病毒株致病性及免疫保护效力 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 嵌合病毒感染PAMs炎性因子变化测定 |
| 2.2 嵌合病毒对仔猪致病性试验 |
| 2.3 IFN-γ酶联免疫斑点试验(ELISpot) |
| 2.4 疫苗免疫保护效力试验 |
| 2.5 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 嵌合病毒在PAMs细胞上的生长特性 |
| 3.2 嵌合病毒诱导PAMs炎性因子水平变化 |
| 3.3 嵌合疫苗毒株致病性试验 |
| 3.5 嵌合毒株对不同基因亚型毒株交叉细胞免疫作用 |
| 3.6 仔猪攻毒免疫保护效力试验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
