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重组人纤连蛋白C端细胞结合域单克隆抗体的制备与表征

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一、重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定(论文文献综述)

王宝剑[1](2021)在《基于“阳化气,阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中研究指明黄韧带肥厚(Ligamentum flavum hypertrophy,LFH)是退行性腰椎管狭窄症(Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS)的主要病理表现之一。黄韧带(ligamentum flavum,LF)位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:(1)在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation,LDH)组未增厚黄韧带,各25例。(2)通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。(3)对两组标本组织进行HE染色组织学观察。(4)进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层(腹侧层、中间层、背侧层)纤维化程度的差异。(5)免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads(TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、collagen Ⅰ(Col 1)、collagen Ⅲ(Col 3)的定位、半定量表达。(6)Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。(7)相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:(1)DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm(p<0.01)。(2)HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。(3)DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级(p<0.05);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组(p<0.05或p<0.01或p<0.001);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层(p<0.05或p<0.01);DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37(p<0.01);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组(p<0.05或p<0.01);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层(p<0.05或p<0.01)。(4)免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组(p<0.05或p<0.01或p<0.001)。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组(p<0.01)。(5)Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组(p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001)。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组(p<0.05);DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。(6)在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。(7)在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:(1)相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3(或p-Smad2/3)、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。(2)在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性(或负线性)相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。(3)结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:(1)将72只大鼠分为A假手术组(切开皮肤等组织后缝合)、B肌肉切除组(切除L5-L6椎旁肌肉)、C骨关节切除组(切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理)以及D肌肉+骨关节切除组(B+C混合)共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。(2)通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。(3)通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。(4)通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。(5)将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:(1)HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。(2)Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。(3)影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。(4)免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。(5)造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带(2.92);肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带(2.92);骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带(1.66-2.23);肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近(1.08-1.66)。结论:(1)建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。(2)三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。(3)在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。(4)腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。

李小英[2](2021)在《基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制》文中研究说明不育症是严重影响哺乳动物繁殖能力的一类生殖系统疾病。营养缺乏、饲养管理不当、季节性原因、遗传原因(如杂交不育)和疾病等均可导致不育。在引起哺乳动物不育的因素中,雄性因素约占一半左右。无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症等是引起雄性不育的主要病因。少精症是以精子数量显着稀少为特征的雄性不育症类型,病因复杂发生机制仍不十分明确。遗传因素和环境因素均可导致精子数量减少,遗传因素对精子数量的影响主要通过精子形成过程中相应基因的表达和调控作用来实现。因此,寻找影响精子形成的特异性靶基因(蛋白)并阐释其作用机制,对于少精症的精准治疗和预后具有重要的理论价值和意义。4.1R蛋白是一种由epb41基因编码的细胞膜骨架蛋白组分,在红细胞和多种非红细胞组织中发挥作用。本文从以下三个方面阐述4.1R蛋白基于睾丸支持细胞在少精症发生中的作用机制:(1)以雷公藤多苷溶液诱导雄性C57BL/6J小鼠(7周龄)构建的少精症模型小鼠为研究对象,利用western blotting、q-PCR和免疫荧光技术检测4.1R蛋白在少精症小鼠睾丸内的表达特点。利用异硫氰酸荧光素(FITC)睾丸活体注射检测少精症模型小鼠血睾屏障完整性,并检测血睾屏障形成相关蛋白的表达,阐述4.1R蛋白表达与睾丸支持细胞(Sertoli)连接功能间的相关性。检测Wnt/β-catenin信号通路组分在少精症模型小鼠睾丸内的表达特点,阐述4.1R蛋白表达与Sertoli细胞增殖间的相关性。少精症小鼠模型研究结果:western blotting检测显示epb41基因在正常C57BL/6J小鼠睾丸内表达135k D和80k D两种亚型。即4.1R-135k D蛋白和4.1R-80k D蛋白。与对照相比较,少精症模型小鼠睾丸内4.1R-135k D蛋白表达显着下降(P<0.05),4.1R-80k D蛋白表达无显着变化;epb41m RNA表达降低,差异不显着;4.1R蛋白在少精症模型小鼠睾丸Sertoli细胞膜上表达下降,而各级生精细胞细胞膜上的表达则无显着差异。少精症模型小鼠血睾屏障受损,FITC从基底室进入近腔室并分散其中。与对照组相比较,少精症模型小鼠睾丸内β-catenin蛋白表达显着下降,而E-cadherin表达增加。血睾屏障相关蛋白ZO-1表达显着下降(P<0.05),occludin和claudin-11表达均下降;Wnt/β-catenin信号通路组分Wnt3a、β-catenin表达显着下降(P<0.05),GSK3β、c-myc和CDK4表达也下降,但差异不显着。(2)以小鼠epb41基因第3外显子为模板,设计2对sg RNAs并构建p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP重组质粒载体。转染N2a细胞,验证第3外显子基因序列与4.1R蛋白亚型表达之间的相关性。以小鼠epb41基因为模板构建LV-Epb41(43286-1)过表达慢病毒载体和LV-Epb41-sg RNA(05765-1)基因敲除慢病毒载体,分别转染TM4细胞(正常小鼠睾丸支持细胞系,即Sertoli细胞)和原代Sertoli细胞。检测细胞中4.1R蛋白、血睾屏障相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路组分表达水平,阐述4.1R蛋白在体外培养Sertoli细胞增殖和连接中的作用机制。研究结果显示:重组质粒载体转染的N2a细胞中4.1R-135k D蛋白不再表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41-sg RNA(05765-1)慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,4.1R-135k D蛋白被抑制表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41(43286-1)过表达慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,显着提高4.1R-135k D蛋白(P<0.05)和4.1R-80k D蛋白的表达,证实已成功实现Sertoli细胞内4.1R-135k D蛋白的抑制表达和过表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除的TM4细胞中血睾屏障相关蛋白β-catenin、E-cadherin和ZO-1表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin、c-myc、GSK3β和Cyclin D1均显着下降(P<0.05),CDK4表达也下降,CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达TM4细胞中β-catenin、ZO-1和occludin表达均上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β和Cyclin D1表达均上升,CDK4和CDK6表达则下降,差异均不显着。4.1R-135k D蛋白基因敲除原代Sertoli细胞中,血睾屏障相关蛋白β-catenin、ZO-1和occludin表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin和CDK4均显着下降(P<0.05),c-myc和GSK3β表达也下降,Cyclin D1和CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达原代Sertoli细胞中β-catenin,ZO-1和occludin表达上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β,CDK4和CDK6表达均上升,Cyclin D1表达则下降,差异均不显着。(3)以7周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,将p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP质粒载体及LV-Epb41(43286-1)载体分别通过活体原位电穿孔转染法和慢病毒载体注射法作用于小鼠睾丸,比较两种载体转染方法的蛋白表达效率和靶向性,并利用免疫荧光法检测载体处理后睾丸组织中4.1R蛋白及血睾屏障相关蛋白的表达水平。阐述4.1R蛋白在活体水平对Sertoli细胞连接的调节作用与机制。质粒载体和慢病毒载体睾丸活体转染结果显示:质粒载体电转染法比慢病毒载体注射法更快在活体内表达,即质粒载体转染后3天,即在睾丸组织中高效表达,使Sertoli细胞中4.1R蛋白表达降低。慢病毒载体注射法表达相对较慢,注射后5天才可以在睾丸中表达。过表达慢病毒载体可显着提高4.1R蛋白在Sertoli细胞中的表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除载体作用于活体睾丸,BTB相关蛋白表达变化规律与少精症模型小鼠中的变化规律相同。4.1R-135k D蛋白过表达载体作用于睾丸活体,显着提高BTB相关蛋白的表达,E-cadherin表达除外。综上得出结论:(1)小鼠睾丸和Sertoli细胞中均表达4.1R-135k D和4.1R-80k D两种4.1R蛋白亚型,4.1R-135k D蛋白表达下降与精子细胞数量显着减少相关。(2)小鼠Sertoli细胞系中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起β-catenin表达下降,从而使Wnt/β-catenin信号通路组分表达异常,抑制睾丸支持细胞增殖。(3)成年小鼠睾丸组织Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起血睾屏障相关蛋白表达异常,导致细胞连接异常,精子细胞形成的微环境受损。因此,由于Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,可引起Sertoli细胞数量减少或血睾屏障受损,导致精子数量显着减少。

秦颖[3](2021)在《传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析》文中进行了进一步梳理传染性法氏囊病(Infectious bursal disease)又称甘布洛病(Gumboro disease),是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus)引起的鸡的急性、高度接触性、传染性疾病,严重危害养禽业发展。传染性法氏囊病主要感染3-6周龄雏鸡,引起严重的免疫抑制。近年来出现的新型变异株主要变现为法氏囊萎缩,虽不致死,但导致鸡的严重免疫抑制。由于传染性法氏囊病病毒由相对独立的两个节段组成,其不同毒株重组的可能性极高,导致不同毒株之间重组病毒的出现。超强毒株持续流行,变异株以及重组病毒的不断出现对传染性法氏囊病的防控形成了巨大的挑战。本研究分离鉴定了两株传染性法氏囊病病毒,对其进行遗传进化树及氨基酸序列分析,并针对VP2蛋白通过原核表达以及杆状病毒表达两种表达系统分别进行表达,将表达产物粗提纯后免疫SPF鸡,验证其免疫原性,为传染性法氏囊病的防控以及疫苗的研发提供了数据参考。1传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定本研究从临床上发生严重法氏囊萎缩的送检病料中用鸡胚接种分离出两株传染性法氏囊病病毒,该病毒可以在鸡胚上增殖;利用传染性法氏囊病特异性引物对其中一株进行全基因测序,对另一株VP1及VP2基因进行扩增测序,并通过生物信息学软件进行遗传进化树和氨基酸序列分析,结果表明两株分离株一株为新型重组病毒,一株为新型变异株。分离的新型重组病毒VP2基因属于超强毒株分支,而VP1基因属于非超强毒株分支。氨基酸序列分析发现该分离株VP2基因编码的氨基酸具有超强毒株所特有的氨基酸序列,和超强毒株同源性最高(99%-99.4%),VP1基因编码的氨基酸具有弱毒株所特有的氨基酸序列,和弱毒株同源性最高(99.3%-99.8%),遗传进化树和氨基酸分析结果表明该分离株为超强毒株和弱毒株的重组病毒。分离的新型变异株和中国分离的新型变异株同属于新型变异株分支,与新型变异株同源性达96.2%-98.2%,氨基酸序列分析该分离株具有新型变异株同源性氨基酸序列。本研究分离的两株传染性法氏囊病病毒为传染性法氏囊病的流行趋势以及防控提供了参考。2不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白传染性法氏囊病病毒的防控主要依赖于疫苗免疫预防,疫苗的研发是传染性法氏囊病防控的基础。本研究采用原核表达系统和杆状病毒表达系统分别表达VP2蛋白,将VP2基因成功克隆到原核表达载体pET-28a以及杆状病毒表达质粒中,构建了原核表达载体pET-28a-VP2和重组杆状病毒re-Bac-1-GP67-VP2,两种表达系统均成功表达了 VP2蛋白,原核表达系统主要以包涵体形式表达在裂解后的沉淀中,表达量约占蛋白总量的33%,杆状病毒表达系统以可溶性形式分泌到培养上清中,表达量约占总蛋白量的11%,优化表达条件后收集表达的蛋白,表达的蛋白均可与VP2单抗发生反应,具有一定的生物活性,为后续免疫原性试验提供了基础。3两种VP2重组蛋白免疫原性比较将上述重组蛋白大量表达,经粗提纯后混合佐剂制备疫苗,按照免疫程序免疫SPF鸡,免疫后采血测血清抗体效价,并于免疫后21天进行攻毒保护试验,剖检观察法氏囊大体变化,通过病理组织学分析法氏囊病理变变化,测定排毒量和病毒载量。试验结果表明,杆状病毒表达重组蛋白效果明显优于大肠杆菌表达重组蛋白免疫效果,其法氏囊病理损伤程度较低,血清学抗体水平高于原核表达产物免疫的抗体水平,病毒载量和排毒量相较于原核表达产物免疫较低,免疫程序对免疫效果也有明显影响,免疫两次效果优于免疫一次。本研究结果为传染性法氏囊病亚单位疫苗研制提供了数据参考。

伍春平[4](2021)在《A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定》文中研究说明A型塞内卡病毒(Senecavirua A,SVA)属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属,能引起各日龄的猪群出现类似口蹄疫等水泡性疾病样临床症状,并造成新生仔猪急性死亡,严重危害我国养猪业的发展。由于塞内卡病毒病是一种新发的传染病,以往的研究主要集中在其生物学特性上,而关于SVA疫苗、侵入机制和免疫机理等方面的研究甚少。VP1、VP2和VP3是SVA表面的结构蛋白,其既包含介导病毒入侵宿主细胞的受体结合域,也包含激发机体免疫应答产生中和抗体的抗原表位。因此,本研究对SVA这3个结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定,为SVA的病原学、诊断方法、抗原结构和新型表位疫苗的研究奠定了基础。本实验室前期利用分离获得的SVA田间流行毒株CH-FJ-2017制备了SVA灭活疫苗,并以此免疫猪群,获得免疫血清SOW6-1、PC6-2和PC4-3。本研究首先对3个免疫血清的生物学特性进行了分析鉴定。间接ELISA试验结果表明这些免疫血清与SVA的结构蛋白均具有良好的亲和性,Western Blotting(WB)和间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)结果表明这些血清与SVA及其结构蛋白均具有良好的免疫反应性,病毒中和试验(Virus Neutralization Test,VNT)结果表明这些血清对SVA流行毒株的中和效价大于1024。然后结合生物信息学预测法和交叠多肽生物合成法,并利用免疫血清对SVA 3种结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定。通过Protparam和PSIPRED在线软件对这3种结构蛋白的理化特性和二级结构进行分析。利用Bcepred、ABCpred、Bepipred、IEDB、SVMpred、Ellipro和SEPPA2.0等7种生物信息预测软件,对各结构蛋白的B细胞抗原表位进行综合分析。合成预测的抗原表位,并通过ELISA试验进行验证。最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出3、6和3个B细胞抗原表位。为进一步提高鉴定的准确性,基于这3种结构蛋白的氨基酸序列,构建96个带GST188标签的交叠16肽,相邻交叠多肽之间重叠8个氨基酸残基,并将这些肽段克隆至pXXGST-1原核表达载体,进行大肠杆菌表达。通过WB试验分析这些交叠多肽与血清的免疫反应性,最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出7、13和5个阳性片段。最后对筛选的B细胞抗原表位进行了免疫原性分析。根据以上两种方法的筛选结果,选择并合成两种方法鉴定一致性较好的抗原表位,将这些抗原表位分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,并通过豚鼠免疫试验制备血清。这些免疫血清与SVA结构蛋白具有良好的免疫反应性和较高的亲和力,且能特异性识别IBRS-2细胞中感染的SVA。综上所述,本研究鉴定出SVA VP1蛋白2个线性B细胞抗原表位VP1-1(6-21 aa)和VP1-2(221-233 aa),VP2蛋白4个线性B细胞表位VP2-1(5-16 aa)、VP2-2(35-57 aa)、VP2-3(175-187aa)和VP2-4(267-282 aa),VP3蛋白1个线性B细胞抗原表位VP3-1(135-153 aa),并且这些表位都具有能激发机体免疫应答的能力,为进一步研究VP1、VP2和VP3蛋白的功能、诊断方法和新型SVA表位疫苗的研究奠定了基础。

尹雪[5](2021)在《新型表面增强拉曼探针检测嗜铬粒蛋白A的研究》文中研究说明神经内分泌肿瘤(Neuroendocrine Neoplasm,NENs)是一种相对罕见且高度异质的肿瘤。虽然对其生物学行为及临床诊治的探索已逾百年,但对其发病机制尚不十分明确。而且NENs的症状和体征不典型临床表现多样,所以大部分N ENs患者发现均在晚期,诊断时已局部扩散和远处转移丧失了根治的机会。在神经内分泌肿瘤的辅助病理学检查中CgA是最常用最有效的肿瘤标志物,用于指导治疗、评估疗效。当血清中CgA含量高于94ng/m L时,则预示着存在患癌风险。CgA是目前用于诊断和治疗评估一般神经内分泌疾病最好的血清或血浆标志物。开发针对嗜铬粒蛋白A该疾病诊断重要标志物的新型超灵敏诊断方法,已成为神经内分泌肿瘤诊疗的主要发展方向。CgA可以在症状出现之前检测出肿瘤,它们在具有弥漫性腹部症状的患者中作为筛选试剂的使用可以降低检测到肿瘤的年龄,并且提高外科手术的治愈率。然而受限于检测手段的灵敏性,只能在大约60-80%NENs患者中可以检测到高水平的CgA。表面增强拉曼光谱技术(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是一种快速、无损的检测技术,可以识别和量化具有明显化学和分子特征的生物分子,脂类、蛋白质、DNA等。除了分子特异性,由于拉曼散射与近红外激发源兼容,可用于实时检测,使得这项技术在生物传感领域,如体内成像方面被广泛应用。[1]本研究中,我们利用SERS技术,通过设计合成的新型拉曼探针检测内分泌肿瘤标志物CgA实现对内源性肿瘤标志物的均相、灵敏、快速检测,为将来SERS技术在癌症筛查的应用提供研究基础。首先设计合成可以特异性识别免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,Ig G)抗体重链Fc段的金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus Protein A,SPA)的结构域SPAZMM、SPAZDM、SPAZTM实现对于抗体的定向连接。之后,将识别同一抗原(CgA)的不同抗体分别修饰在带有拉曼报告分子和可定向连接蛋白的银纳米粒子(Augentum Nanoparticles,Ag NPs)和磁纳米粒子(Magnetic Nanoparticle s,MNs)上形成两种探针。修饰抗体定向连接蛋白时,由于拉曼探针表面抗体的定向规则排列,可以检测到更加灵敏的拉曼信号。当CgA存在时,由于抗体对蛋白的识别作用使两种探针靠近,银探针上的报告分子信号被大幅度增强,反之则只得到报告分子本身的弱信号。通过对拉曼信号强弱的检测就可以快速判断CgA存在与否。本研究中,我们开发了新型抗体固相修饰方法,获得了新型连接物,实验结果显示,SPA的结构域突变体SPAZMM、SPAZDM、SPAZTM对Ig G抗体Fc段均有较强的识别能力;在纳米材料的制备工艺方面,发现合成过程中SH-PEG500的修饰对于探针的稳定性和拉曼信号的增强作用十分重要。在以上技术进步的基础上,我们利用SERS技术成功传感了抗原抗体识别的生物学信号,检测限低至1ng/m L,超过普遍的临床检测需求(20ng/m L)和最新学术文章中报道的检测限8ng/m L,建立了对神经内分泌肿瘤标志物CgA的均相微量超灵敏检测技术。

郑光来[6](2020)在《MERTK促进猪瘟病毒复制的分子机制》文中进行了进一步梳理病毒不能在细胞外繁殖,只有入侵到宿主细胞后才能复制并产生子代病毒粒子。病毒入侵宿主细胞时需要宿主细胞膜上受体蛋白的参与,同时,这些受体蛋白也决定了不同病毒的宿主范围及组织嗜性。因此,鉴定病毒的细胞受体,明确病毒的入侵机制,可为设计新型抗病毒药物提供靶标,为疫苗研发提供新的思路,对病毒的防控和治疗具有重要意义。猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、烈性传染病,在多个国家流行,给世界养猪业造成了严重的经济损失。目前,在CSFV入侵方面的研究,仅发现了硫酸乙酰肝素酶(Heparan sulfate,HS)和层粘连蛋白(Laminin receptor,LamR)两个吸附受体,且这两个吸附受体都与CSFV的Erns蛋白存在相互作用。然而,E1和E2蛋白足以介导CSFV的入侵,证明Erns蛋白对CSFV的入侵不是必需的。同时,还有研究表明,E2蛋白可能和某种细胞膜蛋白相互作用进而促进CSFV的入侵,但具体是哪种细胞膜蛋白尚不清楚。为了寻找影响CSFV入侵的细胞膜蛋白,我们分析了两组CSFV感染猪体后的转录组数据,并从中筛选出了12个候选膜蛋白,结合表达海肾荧光素酶报告基因的重组病毒rCSFV-Rluc,通过siRNA下调试验发现,下调MERTK、TYRO3、CD97和CD69这四个蛋白后可显着地抑制CSFV报告基因的表达,随后我们选取抑制效果最明显的MERTK进行了深入研究。结果显示,在PK-15细胞中过表达MERTK后可以促进CSFV的感染;抗MERTK的多克隆抗体和可溶性的MERTKED-His蛋白均可呈剂量依赖性的阻断CSFV的感染;同时,抗MERTK的多克隆抗体也可呈剂量依赖性的抑制基因2型CSFV的感染;随后通过免疫共沉淀和表面等离子共振试验结果发现,MERTK和CSFV的E2蛋白之间存在相互作用;病毒入侵试验结果发现,MERTK可促进CSFV对PK-15细胞的入侵;另外,我们发现,MERTK胞质尾区酪氨酸激酶的抑制剂LDC1267也可呈剂量依赖性的抑制CSFV的感染。在LDC1267或siMERTK处理后的PK-15细胞中,CSFV感染后与对照组相比,发现I型干扰素mRNA的转录水平均有显着上升,证明CSFV通过MERTK的激酶活性抑制了宿主细胞的固有免疫;而LDC1267处理对CSFV的入侵没有影响,证明MERTK的酪氨酸激酶活性不影响CSFV的入侵过程;值得一提的是,可溶性的MERTKED-His蛋白也可以阻断牛病毒性腹泻病毒的感染。综上所述,CSFV可通过E2蛋白与MERTK直接相互作用以促进其对PK-15细胞的入侵,同时CSFV也通过MERTK的激酶活性抑制宿主细胞的固有免疫来促进其本身的复制。另外,MERTK在基因2型CSFV和牛病毒性腹泻病毒的感染过程中也发挥着重要作用。

周小满[7](2020)在《唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究》文中进行了进一步梳理唾液酸是一种以九个碳原子作为骨架的酸性糖,常以单体或多聚形式存在于糖链末端。细胞以葡萄糖为底物,经过一系列酶催化过程合成唾液酸,最终由唾液酸转移酶将唾液酸添加至糖链中。已证实唾液酸在肿瘤的发生发展过程中具有重要的生物学功能,例如帮助肿瘤细胞躲避免疫系统监控,促进肿瘤相关血管生成,促进肿瘤细胞增殖和迁移,增加肿瘤细胞对化学治疗和放射线治疗的抵抗。唾液酸修饰受唾液酸转移酶和唾液酸酶共同调控。唾液酸转移酶在肿瘤组织中常高表达,且有助于癌细胞累积唾液酸修饰,但唾液酸酶在肿瘤中的作用仍存在争议。膀胱癌是起源于膀胱的恶性肿瘤,也是泌尿系统中最常见的肿瘤,男性发病率较高。膀胱癌因进展迅速且治疗方法有限,严重威胁着患者生存质量。本文以膀胱癌为主要的研究模型,结合基于质谱的糖组学和蛋白组学技术,研究了唾液酸修饰和膀胱癌发生发展的关联及分子机理,并探索了小细胞外囊泡唾液酸修饰在囊泡内吞过程中的作用,此外还针对唾液酸修饰,改进了基于质谱检测唾液酸不同键型的样品制备方法。主要结论如下:(1)改进基于滤膜的唾液酸质谱样品制备方法,使用二甲胺/氨水衍生化方法区分α2,3和α2,6连接唾液酸。该方法基于α2,3唾液酸与临近半乳糖形成内酯的特性,在EDC和HOBt的催化下,使用二甲胺和氨水对α2,3和α2,6唾液酸进行不同衍生化,借助质谱区分二者。以唾液酸化乳糖(α2,3唾液酸修饰乳糖和α2,6唾液酸修饰乳糖)及糖蛋白(胎球蛋白和重组人乳铁蛋白)为模型,验证了该样品制备及衍生化方法可以有效鉴定两种方式连接的唾液酸修饰。继而利用该方法分析了肿瘤细胞在常氧和低氧状态下的N-糖修饰变化。该方法在鉴定N-糖链结构的同时能表征唾液酸α2,3和α2,6连接类型,扩展了质谱所获得的糖组信息。(2)膀胱癌唾液酸修饰的异常增加与唾液酸酶NEU1低表达有关。经高通量N-糖组学分析发现恶性膀胱癌细胞含有较多唾液酸修饰。检测唾液酸酶活性,发现膀胱癌唾液酸修饰增加与总唾液酸酶活性低有关。经高通量蛋白质谱检测,发现膀胱癌细胞表达的唾液酸酶主要为NEU1,且恶性膀胱癌细胞NEU1表达量较低。使用凝集素和NEU1抗体荧光染色、激光共聚焦等实验检测,发现膀胱癌细胞NEU1表达量与唾液酸修饰呈负相关趋势。分析临床样本发现膀胱癌患者癌组织中NEU1的表达水平显着低于癌旁组织,且NEU1表达量与唾液酸修饰负相关,NEU1的低表达预示着患者有更短的生存期。(3)唾液酸酶NEU1催化降低纤维连接蛋白(FN)的唾液酸修饰,抑制由整合素α5β1介导的Akt磷酸化和细胞增殖。通过慢病毒感染的方式构建了高表达NEU1的膀胱癌细胞株YTS-1/NEU1。经检测YTS-1/NEU1细胞唾液酸修饰显着减少,且细胞增殖减缓、凋亡增加,细胞周期G0/G1期占比增加。经蛋白相互作用实验和免疫共沉淀等实验证实,部分NEU1定位于细胞膜并导致FN的去唾液酸化,而FN唾液酸修饰影响其与整合素α5β1的亲和力。因此FN去唾液酸修饰致使由整合素介导的与细胞黏附相关的信号通路减弱,促进细胞内吞并降解整合素α5β1和FN,导致细胞增殖减缓,凋亡增加。利用裸鼠皮下成瘤实验证明在体内条件下NEU1可以减少唾液酸修饰,降低FN、整合素α5β1表达并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。(4)小细胞外囊泡(sEV)的唾液酸修饰影响其被受体细胞摄入,可为膀胱癌临床诊断提供参考。通过凝集素印迹实验和ELISA等实验发现膀胱癌细胞分泌的sEV含有丰富的唾液酸修饰。膀胱癌细胞sEV能被正常膀胱细胞摄入,且激活其Akt信号通路,促进细胞增殖。对sEV的去唾液酸处理明显降低了其进入受体细胞的速率,且弱化了sEV对细胞的Akt通路的激活。通过检测48例膀胱癌患者和30例健康志愿者血浆和血浆sEV的唾液酸修饰水平,发现膀胱癌患者血浆和血浆sEV唾液酸修饰均显着高于健康志愿者。且以sEV唾液酸修饰水平作为膀胱癌检测指标,有较高准确性,可为临床诊断膀胱癌提供参考。

罗天霞[8](2020)在《Junctophilin2 MORN结构域对心肌小电导钙激活钾通道膜转运的调控》文中指出小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+activated K+channels,KCa2,SK)属于非电压依赖性的钙激活钾通道家族,主要分布于神经系统和心血管系统,对Ca2+的敏感性远高于大电导钙激活钾通道(big conductance Ca2+activated K+channels,BK),可至亚微摩尔级。Ca2+通过与SK通道羧基端钙调蛋白(calmodulin,Ca M)结合激活通道,K+外流从而使细胞内钙离子稳态的变化转换成细胞膜电位变化。SK通道可分为三个亚型,SK1、SK2及SK3,其中SK2通道主要表达于心房,参与心肌细胞动作电位复极化形成,在生理和病理状态下起关键作用。敲除小鼠SK2通道可延长动作电位复极化的时程,房颤的易感性增加;过表达SK3通道可使动作电位复极化缩短,亦增加房颤发生。由此提示,SK通道可作为治疗房颤等心血管疾病的靶点,但其分子调控机制,目前所知甚少。Junctophilins(JPs)在哺乳动物可兴奋细胞中可维持内质网/肌质网(endoplasmic reticulum/sarcoplasmic reticulum,ER/SR)与质膜之间的紧密联系。哺乳动物体内有JP1-4四个亚型,其中JP1主要在骨骼肌表达,JP2存在于骨骼肌、心肌和平滑肌细胞,JP3和JP4主要定位在中枢神经系统。在神经系统中的研究显示,敲除JP3和JP4可使Ry R2通道失去对SK2通道的调控作用;在骨骼肌和心肌中,敲除JP1和JP2可使L型钙通道(L-type voltage-dependent calcium channels,LTCC)与Ry R2通道(ryanodine receptor2)失偶联,骨骼肌和心肌收缩异常。高分辨率光学显微镜下观察到JP2与Ry R2之间紧密联系,JP2通过与Ry R2通道直接作用调节通道门控。敲除JP2也可影响钠钙交换体(sodium Calcium Exchanger,NCX1)的定位及功能。此外,JP2和Caveolin1蛋白之间的结合为血管平滑肌的质膜与肌质网膜耦联的钙微区(Ca2+microdomain)提供结构和功能基础,并维持Ry R2和BK通道之间的功能耦联;JP2与Caveolin3蛋白直接相互作用可调控新生小鼠耦联膜复合体(junction membrane complex,JMC)的成熟发育。由此可见,JP2作为心肌细胞中的“桥梁”蛋白,其与离子通道之间有效的信号传导为钙诱导钙释放过程(calcium-induced calcium release,CICR)和心肌正常收缩奠定基础,具有重要的生理意义。位于JP2氨基端的MORN(membrane occupation and recognition nexus)结构域,是与质膜偶联的特定功能结构域,由MORN结构域I和II组成。对于MORN结构域与质膜相互作用的机制有不同的研究,可能通过与质膜磷脂分子直接结合,或通过与细胞膜蛋白分子等进行结合。我们实验室之前结果证实小鼠心肌JP2蛋白与SK2通道有相互作用,那么JP2是否通过MORN结构域与SK2发生相互作用,以及它与SK2通道结合的具体结构域,目前尚未见报道。本研究根据文献报道及JP2和SK2的结构特点,制备SK2和JP2的不同片段质粒,采用分子生物学和细胞生物学的方法,检测二者结合的具体区域;观察JP2 MORN结构域对SK2通道表面膜表达的影响及第一部分JP2蛋白与SK2通道相互作用区域的验证材料与方法1.免疫共沉淀和细胞免疫荧光检测SK2和JP2的定位及相互作用:大鼠心肌组织或细胞裂解液中加入JP2或SK2抗体,用protein A/G珠子制备免疫共沉淀复合物,分析SK2和JP2蛋白之间的相互作用。制备H9c2细胞爬片,细胞免疫荧光观察SK2和JP2蛋白在细胞中的分布。2.构建SK2和JP2片段真核表达载体:将SK2不同片段SK2-N(1-145),SK2-M(141-390)和SK2-C(380-574)克隆至载体p IRES2-EGFP中,并在C末端插入Flag/HA标签。不同长度的JP2 c DNA:JP2-N1(1-253,包含MORN I结构域),JP2-N2(216-350,包含MORN II结构域),JP2-C(340-696)克隆至有His标签p EGFP-C1载体中。3.免疫共沉淀检测SK2和JP2片段相互作用:分别将SK2-N,SK2-M及SK2-C与JP2-N1,JP2-N2及JP2-C两两按1:1比例瞬时转染HEK293细胞后提取各转染组细胞总蛋白,使用特异性标签Flag和His抗体,分析SK2片段与JP2片段是否结合。4.GST pull-down分析:分别将GST-JP2-N1,GST-JP2-N2,GST-JP2-C及对照GST原核表达载体转化BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达及纯化。将各组纯化蛋白与HEK293细胞中表达的SK2-X-HA片段蛋白孵育,谷胱甘肽洗脱液特异性洗脱后用Western blot检测复合物中HA标签表达。结果1.SK2和JP2可在大鼠心肌及H9c2细胞中形成免疫沉淀复合物,并且二者在H9c2细胞中分布于细胞膜及胞浆中,有明显的共定位。提示SK2通道和JP2蛋白可能存在相互作用。2.免疫共沉淀实验结果显示JP2-N1与SK2-C末端可直接相互作用,其余实验组及对照组均未出现免疫阳性条带。3.GST-pulldown实验结果显示大肠杆菌BL21中表达的GST-JP2-N1融合蛋白可与HEK293细胞中表达的SK2-C末端蛋白结合,该结果提示JP2通过MORN结构域I与SK2羧基端发生相互作用。第二部分JP2 MORN结构域Ⅰ增加细胞膜SK2通道的表达和定位材料与方法1.构建SK2+JP2-N1、SK2+JP2-N1mut点突变真核表达载体:将SK2和JP2-N1的c DNA亚克隆至p IRES2-EGFP中,得到SK2+JP2-N1质粒。采用点突变技术在SK2+JP2-N1质粒中构建N101R和Y141H两个突变位点。2.HEK293稳定转染细胞株表达筛选:分别将SK2,SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒转染HEK293细胞,G418筛选,阳性克隆出现后采用有限稀释法扩大培养,提取总细胞RNA,RT-PCR检测目的基因。3.生物素提取细胞膜蛋白:将转染各组质粒的HEK293细胞表面生物素化,裂解细胞蛋白,生物素结合的蛋白与亲和素珠子孵育后还原洗脱蛋白复合物,W estern blot检测各组细胞的SK2通道蛋白表达。4.敲减JP2腺病毒构建及感染:将接种于培养皿中的H9c2细胞用携带阴性对照si RNA(Ad-NC)或JP2-si RNA(Ad-si JP2)的腺病毒感染。RT-q PCR和Western blot的方法分别测定各组感染细胞中JP2 m RNA和蛋白表达,并观察JP2敲减对SK2通道总蛋白及膜蛋白表达的影响。5.免疫共沉淀检测JP2 MORN结构域I突变对其与SK2通道结合的影响。6.电生理记录:选择稳定转染SK2和SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞作为研究对象,全细胞膜片钳记录SK2通道电流。结果1.建立HEK293稳定表达SK2、SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut细胞株,提取各转染细胞组SK2通道总蛋白和膜蛋白,Western blot结果显示,与单转SK2组相比,SK2+JP2-N1组SK2通道的总蛋白没有显着变化,膜蛋白显着增加;转染SK2和SK2+JP2-N1 mut两组比较,SK2总蛋白与膜蛋白均无显着差异。细胞免疫荧光实验结果显示,转染SK2的HEK293细胞,SK2通道分布于胞浆中;转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞,SK2通道的膜蛋白分布显着增加,该结果提示JP2 MORN结构域I可显着增加SK2通道的膜表达和定位。2.分别用JP2敲减si RNA及阴性对照si RNA感染H9c2细胞,提取H9c2细胞的总蛋白及膜蛋白,与阴性对照组相比,JP2敲减si RNA组SK2通道的总蛋白无明显变化,膜蛋白表达显着降低。3.分别取表达SK2+JP2和SK2+JP2mut稳定转染HEK293细胞株,用特异性SK2和JP2抗体进行免疫共沉淀实验,结果显示JP2突变显着降低其与SK2通道之间的结合。4.全细胞膜片钳记录不同稳转细胞组的SK2通道电流,与转染SK2质粒的HEK293细胞相比,转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞中SK2电流密度明显增加。第三部分JP2 MORN结构域Ⅰ调控细胞膜SK2通道表达的机制材料与方法1.RT-q PCR检测H9c2细胞中敲减JP2对SK2 m RNA表达的影响。2.细胞免疫荧光检测转染SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道在核内体及高尔基体中定位。3.Western blot方法检测伯氨喹处理转染SK2+JP2-N1或SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道膜表达。4.统计学分析:所有实验数据以均数±标准误表示,图形均使用Graph Pad Prism 5软件创建。以两样本均数t检验进行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.在稳定表达SK2+JP2-N1 mut质粒的HEK293细胞株中,SK2通道与早期核内体标记物Rab5、EEA1共定位明显,而与高尔基体标记物GM130共定位较弱。该结果提示JP2 MORN结构域I突变可能使SK2聚集于早期核内体致使其转运至细胞膜发生异常。2.用选择性抑制SK2通道循环转运途径的伯氨喹处理表达SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞,Western blot结果显示,与DMSO组比较,伯氨喹处理组的SK2通道膜蛋白均显着降低。进一步提示JP2 MORN结构域I可能通过影响逆向转运通路中的循环途径降低SK2通道膜表达。结论JP2 MORN结构域I通过与SK2羧基末端的相互作用直接调节SK2通道的功能和转运。

侯高鹏[9](2019)在《CD163 N端与MYH9 C端蛋白互作在促进PRRSV入侵易感细胞过程中的机制研究》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是导致猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的致病病原,PRRSV对易感细胞有着严格的细胞趋向性,该病毒主要感染单核-巨噬细胞系,包括其天然易感宿主细胞--猪肺泡巨噬细胞(PAMs)。PRRSV入侵易感细胞系需要多种因子的介导,包括CD163,非肌肉肌球蛋白重链9(MYH9),唾液酸黏附素(Sn),硫酸乙酰肝素(HS),Vimentin,CD151,CD209等。前人以及本实验室的研究结果显示,CD163和MYH9是PRRSV入侵易感细胞的两个不可或缺的受体或辅助受体蛋白,但是这两个蛋白在病毒感染过程中是否存在相互作用还未可知。因此,本研究对CD163与MYH9的相互作用及其在PRRSV入侵易感细胞系中的作用机制展开了一系列的探讨。主要得到以下结果:1.通过免疫共沉淀实验,我们发现CD163和MYH9在PRRSV天然宿主细胞PAMs中存在相互作用现象,并且该互作并不依赖于病毒的感染状态。2.在HEK293T细胞中,我们将构建的CD163和MYH9截短表达质粒共转染,免疫共沉淀实验结果表明CD163氨基端4个串联重复的SRCR结构域SRCR1-4与MYH9羧基端区域PRA之间存在相互作用。3.由于SRCR1-4与PRA之间的互作是通过免疫共沉淀鉴定的,因此该互作复合物可能是由中间调节蛋白介导的,为了验证该猜测的真实性,我们通过原核表达系统表达并纯化了SRCR1-4和PRA蛋白,并通过ELISA和Far-Western Blot实验验证了SRCR1-4与PRA之间的相互作用是直接的,并非由其他因子介导。4.为了验证SRCR1-4与PRA的互作在PRRSV感染过程中发挥的作用,我们构建了稳定表达CD163,SRCR1-4,SRCR5-CT的HEK293T细胞系,我们在该细胞系中验证了猪源CD163与人源MYH9之间的互作。通过在该细胞系中进行的病毒吸附,内化,解离以及复制过程,我们发现SRCR1-4与MYH9之间的互作在PRRSV的内化过程中发挥着重要的作用。5.我们还发现外源重组的SRCR1-4蛋白与PAMs孵育后,可以与该细胞膜中分布的MYH9发生互作,并且加入SRCR1-4蛋白后,PRRSV在PAMs中的内化显着降低,并最终导致病毒的感染水平下降。6.通过将PRA区域进行截短,我们证明了SRCR1-4与PRA的111-210aa区域(PRA100)有直接的相互作用。并且我们成功构建了稳定分泌表达PRA100蛋白的293s悬浮细胞系,从该细胞系中,我们获得了纯度较高的PRA100蛋白。同时,我们还构建了稳定分泌表达CD163胞外区结构域SRCR1-PSTII蛋白的293s悬浮细胞系,并纯化得到了纯度较高的SRCR1-PSTII蛋白。这两个蛋白的获得,将有助于我们开展CD163与MYH9互作的结构生物学研究。综上所述,本研究证明了CD163与MYH9在细胞内的相互作用,并且二者的互作区域位于CD163氨基端结构域SRCR1-4与MYH9羧基端区域PRA之间。进一步的研究表明,CD163与MYH9的互作对PRRSV在易感细胞中的内化过程中发挥着重要的作用。这些研究结果为我们更深入的了解PRRSV的细胞入侵机制提供了新的思路。

孙阁阁[10](2019)在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究》文中研究说明由旋毛虫引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要是通过食用含有旋毛虫感染性幼虫的生的或者不熟的肉类所导致的。近年来在我国周边国家如韩国、泰国、老挝、越南等国也已发生了多次人体旋毛虫病暴发,因此,旋毛虫病作为了一种新现和再现的人兽共患疾病,对人体健康、社会、经济均造成了巨大的影响。目前,国内外对旋毛虫病的诊断主要集中在肌肉幼虫阶段的旋毛虫抗原。国际旋毛虫病委员会(ICT)建议旋毛虫肌幼虫ES抗原可作为诊断旋毛虫的金标准。然而,当旋毛虫肌幼虫ES抗原用于检测旋毛虫感染小鼠或猪的血清时,抗旋毛虫抗体IgG直到感染后3-4周才能检测到阳性;并且感染旋毛虫的病人在感染28天以后抗旋毛虫的抗体阳性率才能达到100%。因此,在旋毛虫感染后存在有23周的“窗口期”(window phase)。在旋毛虫的生活史中,肠道感染性幼虫(IIL)和成虫是旋毛虫对宿主肠黏膜的侵入期,其ES蛋白最早与肠黏膜直接接触并相互作用,能够接触宿主的免疫系统首先引起宿主的免疫应答;因此,IIL和成虫的排泄分泌抗原含有刺激宿主产生早期免疫应答的主要成分。在旋毛虫感染后的早期,最早出现的抗旋毛虫抗体也是针对这些抗原的。由于旋毛虫感染宿主后4周才发育为成囊期幼虫(肌幼虫)且被包裹在胶原囊中,肌幼虫接触宿主的免疫系统比较晚,因此宿主产生的抗肌幼虫抗体也比较晚。所以,现在迫切的需要从旋毛虫肠道期虫体中鉴定和筛选特异性的早期诊断抗原。本研究运用血清学诊断的方法检测旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病的早期诊断价值,从成虫ES蛋白中筛选出旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP)进行克隆表达和功能鉴定,同时检测rTsSP对旋毛虫感染的早期诊断及疫苗靶标的潜在应用价值。材料方法1旋毛虫、实验动物、血清、菌种及细胞系不同种旋毛虫在本实验室传代保种备用。整个实验所用的动物均购买于实验动物中心。血清:旋毛虫不同种属、弓形虫、裂头蚴、日本血吸虫和广州管圆线虫感染小鼠血清,以及其他寄生虫感染病人血清。细胞系:IEC,C2C12,于本实验室液氮中冻存。载体和菌种:克隆载体pGEM-T,表达载体pQE-80L,宿主菌为BL21,为本实验室冻存。2旋毛虫成虫ES抗原的早期诊断价值评估AW ES-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性和特异性。准备30只雌性BALB/c小鼠,感染不同剂量的旋毛虫(100条/只和500条/只)。AW ES-ELISA检测旋毛虫早期和轻度感染小鼠血清的敏感性。最后AW ES-ELISA检测旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估AW ES对旋毛虫病早期诊断价值的敏感性和特异性。3旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(TsSP)生物信息学分析,克隆表达及鉴定将早期感染血清识别的成虫ES蛋白进行质谱分析后,从被鉴定的蛋白中挑选出了具有潜在早期诊断价值的旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP)。应用NCBI,ExPasy,SignalP3.0serve及TMHMM Server v.2.0等在线软件分析预测了TsSP的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域;在大肠杆菌中克隆表达并纯化,将纯化后的rTsSP皮下接种免疫小鼠,获得rTsSP免疫血清,Western-blot检测rTsSP的免疫原性及抗原性;通过RT-PCR和q-PCR检测TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期是否转录及转录水平的高低;通过间接免疫荧光(IFA)检测TsSP在不同发育虫期虫体表面及内部的表达;对不同虫期虫体进行石蜡包埋及冰冻组织切片,通过IFA观察TsSP在不同时期虫体的具体定位;制备不同虫期的可溶性蛋白,通过ELISA和Western blot,检测TsSP蛋白在不同虫期是否表达及表达量的高低。4 TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞(IEC)的特异性结合作用。将不同稀释度的抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与肠道感染性幼虫(IIL)混合后,分别接种到IEC单层中体外孵育2h进行幼虫体外侵入实验,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)检测抗rTsSP血清对虫体的杀伤作用,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率,并将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的ML经口感染小鼠,计算ADCC作用后肌幼虫的感染率。5 rTsSP对旋毛虫病的早期诊断按重度(500条/只)、中度(300条/只)及轻度(100条/只)3个剂量,将不同剂量的旋毛虫感染小鼠,每组各10只,感染后开始隔天采血,rTsSP-ELISA检测rTsSP对旋毛虫早期感染血清的识别、检测rTsSP对旋毛虫感染小鼠血清的敏感性与特异性。同时检测旋毛虫感染猪血清,旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估rTsSP对旋毛虫病的早期诊断的潜在应用价值。6 rTsSP在免疫保护中的应用为了评估rTsSP的免疫保护作用,每只小鼠皮下免疫20μg rTsSP,隔10天免疫1次,共免疫3次,检测免疫后抗rTsSP抗体水平及所诱导的体液免疫应答,并计算成虫和肌幼虫的减虫率;并用霍乱毒素亚单位(CTB)作为佐剂,通过滴鼻途径对小鼠接种rTsSP。间隔10d免疫1次,共免疫3次,分别检测滴鼻免疫后肠道内总的和特异性sIgA水平;肠道分泌sIgA细胞及杯状细胞的数量;检测脾细胞和肠系膜淋巴结诱导的细胞因子水平的变化;计算感染后收集不同天数成虫和肌幼虫的减虫率。7统计学分析用SPSS17.0分析软件和Graphpad Prism对所有结果和数据进行统计学分析及图表绘制,采用单因素方差分析,重复资料方差分析,t检验和卡方检验进行统计分析,检验水平α=0.05。结果1.成虫ES抗原的早期诊断应用成虫ES-ELISA检测感染旋毛虫不同剂量后不同天数的小鼠血清,结果表明,成虫ES抗原与粗抗原和肌幼虫ES在检测感染100条旋毛虫感染血清时,分别在感染后8、12及12天检测到抗旋毛虫抗体IgG,在检测高剂量组(500/条)时分别在10,8,10天检测到抗旋毛虫抗体。用这3种抗原分别检测旋毛虫早期和晚期病人血清结果表明,成虫ES的敏感性和特异性分别是100%和97.48%。2.TsSP生物信息学分析预测TsSP基因(GI:164521948)序列全长为1372bp,编码429个氨基酸残基,其分子质量为47.55kDa,等电点为8.73;不稳定指数为42.25,脂肪指数为71.52,总的平均亲水性是-0.360,认为该蛋白为亲水性蛋白。该蛋白N端具有明显的疏水性区域,无跨膜区。预测TsSP为分泌型蛋白,存在信号肽,切割位点在18-19位氨基酸残基之间,表明成熟的肽段始于第19位氨基酸,具有信号肽SP序列,认为其能够分泌到细胞外。该蛋白在第37-277位之间是个高度保守的结构功能域Tryp-SPC。I-TASSER预测TsSP属于丝氨酸蛋白酶家族。3.TsSP的克隆表达及鉴定设计PCR外引物和具有特异性酶切位点的内引物,通过巢式PCR扩增出大小为1236bp的TsSP基因,将TsSP基因连接到克隆载体pGEM-T中,双酶切后将TsSP基因再连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒,转染E.coli BL21感受态细胞。双酶切鉴定重组质粒构建成功。对连接成功的单菌落加入IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE,发现在45.2kDa处出现一条明显条带,而未经诱导的细菌未见此条带,表明TsSP重组蛋白表达成功。Western blot分析显示,rTsSP蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清和抗rTsSP血清识别,表明rTsSP具有良好的免疫原性和抗原性。RT-PCR和qPCR结果表明TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期(ML,IIL,3dAW,6dAW和NBL)均转录,并且各个发育期转录水平没有差异(P>0.05)。Western blot和ELISA结果表明TsSP在旋毛虫的各个虫期均表达,并且在IIL和NBL表达水平相对较高;IFA结果显示,TsSP在以上5个虫期均表达,并且主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎部位。4.TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定4.1 rTsSP与肠上皮细胞结合的特异性分别通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞(IEC)的特异性结合作用,Far-Western结果显示抗rTsSP免疫血清识别了24条蛋白带,分子量为14.4kDa86.5kDa,而rTsSP不能与C2C12蛋白结合,表明rTsSP能与IEC蛋白特异性结合。ELISA检测亦发现rTsSP能与IEC蛋白结合且具剂量依赖性。IFT发现rTsSP可与IEC和肠粘膜特异性结合;共聚焦显微镜检查结果表明rTsSP与IEC的结合部位是细胞膜与细胞质。4.2抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC的抑制或阻断作用体外侵入实验结果表明,在相同血清稀释度(1:50)时,抗rTsSP血清、感染血清及正常血清组的幼虫侵入率分别为31.48%,15.84%及84.16%(P<0.01),且抗rTsSP抗体对幼虫的侵入作用具有抗体剂量依赖性,随血清稀释度的增加而降低(P<0.01),表明抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC具有明显的抑制作用。4.3抗rTsSP抗体依赖的ADCC对旋毛虫幼虫的杀伤作用将抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与新生幼虫(NBL)和肌幼虫(ML)共孵育,再分别加入小鼠腹腔巨噬细胞孵育不同时间后,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率。结果显示当血清稀释度为1:100时,抗rTsSP血清能促进巨噬细胞对NBL和ML的粘附。抗rTsSP血清对NBL和ML的细胞毒性分别为52%与44.67%,明显高于正常血清的21.33%和18%(P<0.01);细胞毒性具有抗体剂量依赖性,且随孵育时间的延长而增加(P<0.01)。结果表明抗rTsSP抗体依赖的ADCC在体外对NBL和ML具有特异性杀伤作用。将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的100条ML经口感染小鼠,与正常血清组相比,感染后3d与42d的成虫与肌幼虫减率分别为89.4%和36.50%,表明抗rTsSP抗体可通过ADCC方式杀伤ML,并可明显降低ML的感染性及其在肠道中的发育。5.rTsSP的诊断价值在旋毛虫重度、中度和轻度感染小鼠,rTsSP-ELISA分别在感染后8、7及7天检测到抗rTsSP抗体,并且在感染后16、10及10天抗体检测阳性率达到100%;rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染小鼠的敏感性与特异性均为100%。rTsSP-ELISA诊断早期和晚期旋毛虫病人时的敏感性分别为95.24%和100%,对于早期旋毛虫病人诊断的敏感性明显高于肌幼虫ES诊断的敏感性(75%,P<0.05);rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病人的特异性(99.49%)明显高于ES-ELISA的特异性(91.41%)(P<0.05)。6.rTsSP的免疫保护6.1皮下接种rTsSP诱导的免疫第1次与第2次免疫后血清中rTsSP特异性抗体IgG水平明显升高,末次免疫后10d抗rTsSP抗体IgG效价为1:105;免疫后10、20、30及40d,IgG1水平明显高于IgG2a(P<0.01),表明rTsSP免疫小鼠诱导了Th2型为主的体液免疫应答。与PBS组相比,rTsSP免疫组和佐剂对照组在攻击感染后5d的成虫减虫率分别是52.70%和10.30%(P<0.05);感染后42d,rTsSP免疫组和佐剂对照组的肌幼虫减虫率分别是52.1%和3.66%(P<0.05)。结果表明,rTsSP皮下免疫小鼠可诱导明显的免疫保护。6.2经鼻接种rTsSP诱导的免疫保护用rTsSP经鼻免疫小鼠可引起明显的肠道总sIgA及TsSP特异性sIgA水平升高;血清TsSP特异性抗体IgG/IgM/IgA水平亦明显升高;在免疫接种小鼠的十二指肠中能检测到更多的杯状细胞/酸性粘蛋白和IgA分泌细胞。与对照组相比,rTsSP免疫组的IFN-γ,IL-4和IL-10水平显着增加。末次免疫后10d用300条幼虫攻击感染,与PBS对照组相比,感染后3、5、7、9d的成虫减虫率分别是49.95%、61.30%、68.30%及71.10%(P<0.001);感染42d免疫组和佐剂组的肌幼虫减虫率分别是62.1%及13.9%(P<0.001)。结果表明,rTsSP经鼻免疫小鼠后诱导了明显的肠道sIgA应答及全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。结论1.旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病早期诊断具有较高的敏感性和特异性,为旋毛虫病的早期诊断提供一个新的诊断抗原来源;2.克隆表达了旋毛虫TsSP,TsSP在旋毛虫的各个虫期均有转录和表达,主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎;3.rTsSP蛋白能够与肠上皮细胞特异性结合,抗rTsSP抗体能够抑制旋毛虫体外侵入肠上皮细胞,抗rTsSP抗体能够介导巨噬细胞对NBL和ML的杀伤作用。TsSP可能是旋毛虫对IEC的主要侵入蛋白;4.rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病具有较高的敏感性和特异性,可作为旋毛虫病潜在的早期诊断抗原;5.rTsSP蛋白皮下/经鼻免疫小鼠后,诱导了局部粘膜和全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。

二、重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定(论文提纲范文)

(1)基于“阳化气,阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
英文缩略词
第一部分 文献综述
    综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展
        参考文献
    综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化
        参考文献
第二部分 实验研究
    实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性
        前言
        1 材料与方法
        1.1 标本收集
        1.2 纳入与排除标准
        1.3 影像学测量
        1.4 主要器械、设备、试剂等
        1.5 手术方式
        1.6 标本的取材、运输等标准操作规程
        1.7 HE染色与组织形态学观察
        1.8 Masson染色与纤维化观察
        1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达
        1.10 实时焚光聚合酶链式反应(Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达
        1.11 统计学方法
        2 结果
        2.1 一般资料
        2.2 HE染色结果
        2.3 Masson染色结果
        2.4 免疫组化结果
        2.5 Real-Time PCR结果
        2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析
        2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析
        2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析
        3 讨论
        3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制
        3.2 黄韧带背侧层是退变的起点
        3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程
        3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗
        3.5 其他
        4 结论
        参考文献
    实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价
        前言
        1 材料与方法
        1.1 实验动物
        1.2 主要器械、设备、试剂等
        1.3 实验动物的分组与取材
        1.4 实验动物的造模
        1.5 影像学测量
        1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量
        1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察
        1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达
        1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达
        1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达
        1.11 统计学方法
        2 结果
        2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果
        2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果
        2.3 影像学测量结果
        2.4 免疫组化结果
        2.5 免疫印迹结果
        2.6 Real-Time PCR结果
        2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较
        2.8 模型成功率
        3 讨论
        3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法
        3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现
        3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素
        3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立
        4 结论
        参考文献
结语
不足与展望
创新点
致谢
附件

(2)基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制(论文提纲范文)

摘要
SUMMARY
中英文缩略词表
第一章 研究背景
    1 少精症与动物模型
    2 少精症与精子发生
    3 4.1R蛋白与精子发生
    4 血睾屏障与精子发生
    5 Wnt/β-catenin信号通路与精子发生
    6 研究意义与内容
    7 试验方案
第二章 4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达与作用
    1 前言
    2 材料、仪器与试剂
        2.1 材料
        2.2 仪器
        2.3 试剂
    3 方法
        3.1 少精症小鼠模型的建立
        3.2 睾丸组织中4.1R蛋白表达水平检测
        3.3 睾丸组织中epb41 基因转录水平检测
        3.4 睾丸组织中4.1R蛋白表达分布检测
        3.5 血睾屏障功能分析
        3.6 统计方法
    4 结果
        4.1 少精症模型小鼠精子密度测定
        4.2 少精症模型小鼠附睾和睾丸形态学检测
        4.3 4.1R蛋白在小鼠睾丸组织中的表达
        4.4 少精症小鼠睾丸中epb41 基因转录水平检测
        4.5 少精症小鼠睾丸组织中4.1R蛋白表达分布
        4.6 少精症模型小鼠血睾屏障功能分析
        4.7 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分转录检测
        4.8 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白表达
    5 讨论
    6 小结
第三章 4.1R蛋白表达对睾丸支持细胞增殖和连接的调节作用研究
    1 前言
    2 材料、仪器与试剂
        2.1 材料
        2.2 仪器
        2.3 试剂
    3 方法
        3.1 Epb41 基因CRISPR-cas9 质粒载体构建与验证
        3.2 CRISPR-Cas9 慢病毒载体构建
        3.3 过表达慢病毒载体的构建
        3.4 TM4 细胞培养
        3.5 原代睾丸支持细胞培养
        3.6 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染TM4 细胞
        3.7 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞
        3.8 过表达慢病毒载体转染TM4 细胞
        3.9 过表达慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞
        3.10 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测
    4 结果
        4.1 Epb41-sg RNAs与 pGL3-U6-sg RNA-puromycin和 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体连接
        4.2 pGL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和 pSpCas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP共转染N2a细胞
        4.3 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP 慢病毒载体检测
        4.4 过表达慢病毒载体的构建与验证
        4.5 慢病毒载体转染TM4 细胞
        4.6 慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞
        4.7 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测
    5 讨论
    6 小结
第四章 4.1R蛋白表达对体内睾丸支持细胞间连接的调节作用
    1 前言
    2 材料、仪器与试剂
        2.1 材料
        2.2 仪器
        2.3 试剂
    3 方法
        3.1 质粒载体电转染小鼠活体睾丸组织
        3.2 慢病毒载体睾丸活体转染
        3.3 小鼠活体睾丸转染效果验证
    4 结果
        4.1 质粒载体活体电转染睾丸组织方法验证
        4.2 重组CRISPR-Cas9 基因敲除质粒载体电转染睾丸
        4.3 过表达慢病毒载体转染睾丸
    5 讨论
    6 小结
第五章 总结与展望
    1 总结
    2 创新点
    3 展望
参考文献
致谢
作者简介
在读期间发表论文和研究成果等
导师简介
附件

(3)传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析(论文提纲范文)

摘要
Abstract
符号说明
第一章 传染性法氏囊病文献综述
    1 传染性法氏囊病病毒病原学
        1.1 病毒形态
        1.2 基因组结构
    2 传染性法氏囊病流行病学
        2.1 易感动物
        2.2 流行特点
        2.3 临床症状
        2.4 IBDV分子流行病学
    3 传染性法氏囊病的诊断
        3.1 临床诊断
        3.2 实验室诊断
    4 传染性法氏囊病的防控
    5 传染性法氏囊病疫苗研究进展
        5.1 传统疫苗
        5.2 新型基因工程疫苗
    6 本研究的目的和意义
第二章 传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定
    1 材料
        1.1 主要试剂
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂配制
        1.4 病料信息
    2 实验方法
        2.1 病毒RNA的提取
        2.2 RT-PCR检测病毒
        2.3 NT2020-8株VP2基因及VP1部分基因片段扩增及载体连接
        2.4 NP2104株全基因测序
        2.5 遗传进化树分析
        2.6 氨基酸变异分析
        2.7 同源性分析
        2.8 病毒在鸡胚上培养
        2.9 动物回归实验
    3 结果
        3.1 病料RT-PCR检测结果
        3.2 NT2020-8株VP2及VP1部分基因扩增结果
        3.3 NT2020-8株VP2及VP1基因遗传进化树分析结果
        3.4 NT2020-8株VP2及VP1部分基因编码氨基酸变异分析结果
        3.5 NT2020-8株同源性分析结果
        3.7 NP2104株全基因扩增结果
        3.8 NP2104株遗传进化分析结果
        3.9 NP2104株氨基酸序列分析结果
        3.10 NP2104株同源性分析结果
        3.11 鸡胚培养结果
        3.12 NP2104株动物回归实验结果
    4 讨论与小结
第三章 不同表达系统表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白
    1 材料
        1.1 主要化学试剂
        1.2 主要试剂配制
        1.3 主要生物材料
    2 实验方法
        2.1 IBDV超强毒株JS株总RNA的提取
        2.2 原核表达VP2基因的扩增
        2.3 VP2基因与原核表达载体连接
        2.4 原核表达重组质粒的小量诱导表达及鉴定
        2.5 重组转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的构建
        2.6 杆状病毒转移载体转座DH10 Bac感受态细胞
        2.7 重组杆状病毒质粒的提取
        2.8 重组杆状病毒质粒鉴定
        2.9 重组杆状病毒质粒转染sf9细胞
        2.10 收获P1代重组杆状病毒及鉴定
        2.11 重组杆状病毒表达鉴定
        2.12 重组杆状病毒表达条件优化
        2.13 重组杆状病毒大量表达及收获蛋白
    3 结果
        3.1 原核表达载体pET-28a-VP2酶切鉴定
        3.2 原核表达重组蛋白SDS-PAGE分析及最佳表达菌株的筛选
        3.3 原核表达重组蛋白Western Blot分析
        3.4 原核表达诱导表达条件优化
        3.5 大量诱导表达及包涵体提取效果
        3.6 杆状病毒转移载体pFast-Bac-1-GP67-VP2的酶切鉴定
        3.7 重组杆状病毒质粒的鉴定
        3.8 P1代重组杆状病毒的收获及鉴定
        3.9 重组杆状病毒表达鉴定
        3.10 测定重组杆状病毒TCID50
        3.11 重组杆状病毒表达条件优化
        3.12 重组杆状病毒优化表达条件后蛋白表达结果
    4 讨论与小结
第四章 两种VP2重组蛋白免疫原性比较
    1 材料
        1.1 试验动物
        1.2 毒株
        1.3 主要试剂
        1.4 主要生物材料
    2 实验方法
        2.1 免疫原制备
        2.2 SPF鸡免疫方案
        2.3 IFA抗体检测
        2.4 中和抗体检测
        2.5 琼扩抗体检测
        2.6 攻毒保护试验
        2.7 法氏囊组织病理学评价
        2.8 荧光定量PCR方法检测法氏囊病毒载量及泄殖腔排毒量
    3 结果
        3.1 血清IFA抗体效价
        3.2 血清中和抗体效价
        3.3 血清琼扩抗体效价
        3.4 攻毒保护试验结果
        3.5 法氏囊组织病理学评价结果
        3.6 法氏囊病毒载量及肛拭子排毒量结果
    4 讨论与小结
全文结论
参考文献
致谢

(4)A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定(论文提纲范文)

摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 A型塞内卡病毒研究概况
        1.1.1 A型塞内卡病毒的分子特征
        1.1.2 A型塞内卡病毒流行病学
        1.1.3 A型塞内卡病毒病临床症状及病理特征
        1.1.4 A型塞内卡病毒诊断与防控
    1.2 抗原表位研究进展
        1.2.1 抗原表位的概述
        1.2.2 抗原表位的研究方法
        1.2.3 表位的应用
        1.2.4 A型塞内卡病毒抗原表位研究进展
    1.3 本研究的目的与意义
第二章 表位预测法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位
    2.1 材料
        2.1.1 仪器
        2.1.2 试剂
        2.1.3 主要溶液配制
    2.2 方法
        2.2.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定
        2.2.2 SVA结构蛋白生物信息学分析
        2.2.3 潜在表位的合成及纯度分析
        2.2.4 潜在表位间接ELISA分析
    2.3 结果
        2.3.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定结果
        2.3.2 VP1、VP2和VP3 蛋白生物信息学分析结果
        2.3.3 ELISA分析结果
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 交叠多肽生物合成法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位
    3.1 材料
        3.1.1 仪器
        3.1.2 试剂
        3.1.3 主要溶液配制
    3.2 方法
        3.2.1 交叠多肽原核表达质粒构建
        3.2.2 重组质粒的鉴定与交叠多肽的表达
        3.2.3 WB分析
    3.3 结果
        3.3.1 交叠多肽的表达与鉴定
        3.3.2 抗原表位WB鉴定
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 A型塞内卡病毒抗原表位免疫原性分析
    4.1 材料
        4.1.1 仪器
        4.1.2 试剂
    4.2 方法
        4.2.1 抗原表位肽的KLH偶联
        4.2.2 KLH偶联表位多肽免疫豚鼠
        4.2.3 免疫血清ELISA分析
        4.2.4 免疫血清的WB分析
        4.2.5 免疫血清的IFA分析
    4.3 结果
        4.3.1 免疫血清的抗体水平检测和抗体亲和力分析
        4.3.2 免疫血清的免疫反应性分析
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 全文结论
参考文献
附录A GST-188 蛋白的核苷酸序列
附录B SVACH-FJ-2017(ID: KY747510)核苷酸序列
附录C SVA结构蛋白的核苷酸序列
附录D SVA结构蛋白的核苷酸序列
致谢
作者简历

(5)新型表面增强拉曼探针检测嗜铬粒蛋白A的研究(论文提纲范文)

缩略词注释表
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 表面增强拉曼光谱的概述
        1.1.1 拉曼光谱简述
        1.1.2 拉曼光谱仪器系统
        1.1.3 表面增强拉曼光谱的简述
        1.1.4 表面增强拉曼光谱在医学检测中的应用
        1.1.5 表面增强拉曼信号的数据处理
    1.2 嗜铬粒蛋白A的研究背景
        1.2.1 嗜铬粒蛋白A的来源和主要性质
        1.2.2 嗜铬粒蛋白A在临床内分泌肿瘤诊断中的应用
        1.2.3 嗜铬粒蛋白A作为肿瘤标志物的其他临床意义和局限性
        1.2.4 嗜铬粒蛋白A临床应用的检测范围
        1.2.5 肿瘤标志物现有检测方法的常见干扰
    1.3 利用金黄色葡萄球菌蛋白A对纳米颗粒表面进行定向抗体修饰的研究背景
        1.3.1 重组金黄色葡萄球菌蛋白A的性质及作用
        1.3.2 金黄色葡萄球菌蛋白A上Z结构域的性质
        1.3.3 设计合成抗体定向修饰蛋白SPAZ
    1.4 新型表面增强拉曼探针检测嗜铬粒蛋白A的研究思路和意义
第二章 利用金黄色葡萄球菌蛋白A的Z结构域对纳米颗粒表面进行定向抗体修饰的新方法
    2.1 引言
    2.2 结构域Z二倍体和四倍体的重组表达及鉴定
        2.2.1 实验设计
        2.2.2 菌种与表达质粒
        2.2.3 实验仪器与试剂
        2.2.4 实验方法
        2.2.4.1 试剂的配置
        2.2.4.2 质粒酶切与连接
        2.2.4.3 质粒的转化和目的蛋白重组表达
        2.2.4.4 重组表达蛋白的纯化
        2.2.4.5 两种重组表达蛋白的鉴定
        2.2.5 实验结果
    2.3 基于ELISA方法对嗜铬粒蛋白A配对抗体的验证
        2.3.1 实验设计
        2.3.2 实验仪器与试剂
        2.3.3 实验方法
        2.3.3.1 试剂配制
        2.3.3.2 试验步骤
        2.3.4 实验结果
    2.4 基于ELISA方法对结构域Z二倍体与四倍体识别抗体Fc片段的验证
        2.4.1 实验设计
        2.4.2 实验仪器与试剂
        2.4.3 实验方法
        2.4.4 实验结果
    2.5 小结与讨论
第三章 表面增强拉曼对嗜铬粒蛋白A的SERS检测
    3.1 引言
    3.2 新型表面增强拉曼探针对嗜铬粒蛋白A的SERS实验
        3.2.1 实验设计
        3.2.2 实验仪器与试剂
        3.2.3 实验方法
        3.2.3.1 试剂配制
        3.2.3.2 银纳米颗粒的合成
        3.2.3.3 新型表面增强拉曼探针的合成
        3.2.3.4 SERS检测
        3.2.3.5 拉曼信号数据处理
        3.2.4 实验结果
        3.2.4.1 抗体定向修饰的拉曼探针对抗体Fc段具有定向识别能力
        3.2.4.2 不同新型表面增强拉曼探针对SERS的增强信号效果对比
        3.2.4.3 新型表面增强拉曼探针的使用可以降低对Cg A识别的假阳性率
    3.3 新型表面增强拉曼探针合成方案的改进
        3.3.1 实验设计
        3.3.2 实验仪器与试剂
        3.3.3 实验方法
        3.3.4 实验结果
        3.3.4.1 SH-PEG_(500)封闭对表面增强拉曼探针封闭效果实验
        3.3.4.2 4-MBA拉曼信号分子替换4-ABP拉曼信号分子
        3.3.4.3 新型表面增强拉曼探针信号稳定性
    3.4 新型表面增强拉曼探针对Cg A检测限的初步研究
        3.4.1 实验设计
        3.4.2 实验仪器与试剂
        3.4.3 实验方法
        3.4.4 实验结果
    3.5 本章小结
结论
参考文献
致谢

(6)MERTK促进猪瘟病毒复制的分子机制(论文提纲范文)

摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 猪瘟与猪瘟病毒
        1.1.1 猪瘟
        1.1.2 猪瘟病毒
    1.2 猪瘟病毒囊膜蛋白的结构及功能
        1.2.1 猪瘟病毒囊膜蛋白的结构
        1.2.2 猪瘟病毒囊膜蛋白中的二硫键及其功能
        1.2.3 猪瘟病毒囊膜糖蛋白的糖基化修饰及其与病毒毒力的关系
        1.2.4 猪瘟病毒囊膜糖蛋白中的抗原表位
    1.3 猪瘟病毒入侵机制的研究进展
        1.3.1 猪瘟病毒的吸附
        1.3.2 猪瘟病毒的入侵方式
        1.3.3 猪瘟病毒潜在的膜融合机制
    1.4 TAM受体蛋白
        1.4.1 TAM受体蛋白及其配体结构特点
        1.4.2 TAM受体的功能多样性
        1.4.3 TAM受体蛋白与病毒感染
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 MERTK促进猪瘟病毒感染的机制研究
    2.1 材料和方法
        2.1.1 细胞、毒株和载体
        2.1.2 其他实验材料
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 主要试剂的配制
        2.1.5 候选分子的siRNA设计及其序列
        2.1.6 siRNA下调及CSFV感染试验
        2.1.7 rCSFV-Rluc报告病毒的Rluc活性检测
        2.1.8 细胞总RNA的提取及反转录
        2.1.9 荧光定量RT-qPCR检测不同靶基因的mRNA转录水平
        2.1.10 CSFV毒价的测定
        2.1.11 间接免疫荧光检测CSFV试验
        2.1.12 内源性MERTK蛋白的流式试验验证
        2.1.13 稳定过表达MERTK的 PK-15 细胞系的构建
        2.1.14 MERTK抗体封闭试验
        2.1.15 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白和pGas6 蛋白的表达及纯化
        2.1.16 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白和LDC1267 对细胞活力的影响试验
        2.1.17 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白阻断试验
        2.1.18 猪源Gas6 蛋白和胎牛血清对CSFV感染影响的试验
        2.1.19 MERTK和 E2 蛋白的免疫共沉淀试验
        2.1.20 Western blotting试验
        2.1.21 可溶性MERTK~(ED)-His和 E2 蛋白的表面等粒子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)试验
        2.1.22 MERTK和 CSFV E2 蛋白在293T细胞中的共定位试验
        2.1.23 可溶性MERTK~(ED)-His蛋白处理后对IFN-βmRNA转录水平的影响
        2.1.24 抗MERTK多克隆抗体处理后对IFN-βmRNA转录水平的影响
        2.1.25 MERTK在 CSFV入侵过程中的作用
        2.1.26 LDC1267抑制剂的处理试验
        2.1.27 MERTK在 MDBK和 BHK-21 细胞中的受体重建试验
        2.1.28 可溶性MERTK~(ED)-His对 BVDV复制影响的检测
        2.1.29 可溶性MERTK~(ED)-His对猪PRV TJ复制影响的检测
        2.1.30 数据统计学分析
    2.2 实验结果
        2.2.1 siRNA筛选结果
        2.2.2 确认下调MERTK对 CSFV复制的影响
        2.2.3 过表达MERTK对 CSFV复制的影响
        2.2.4 抗体封闭对CSFV复制的影响
        2.2.5 可溶性MERTK~(ED)-His对 CSFV复制的影响
        2.2.6 MERTK对基因2型CSFV复制的影响
        2.2.7 猪源Gas6 蛋白和胎牛血清对CSFV感染无影响
        2.2.8 MERTK与 CSFV E2 蛋白存在相互作用
        2.2.9 MERTK可促进CSFV的入侵
        2.2.10 LDC1267对CSFV复制的影响
        2.2.11 LDC1267在CSFV感染后对宿主固有免疫的影响
        2.2.12 LDC1267对CSFV入侵的影响
        2.2.13 MERTK对 PRV TJ和 BVDV复制的影响
    2.3 讨论
第三章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介

(7)唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩略语
第一章 绪论
    1.1 前言
    1.2 蛋白质的糖基化修饰
        1.2.1 N-糖基化修饰
        1.2.2 O-糖基化修饰
        1.2.3 GPI锚定修饰
        1.2.4 糖基化修饰的功能
    1.3 唾液酸
        1.3.1 唾液酸简介
        1.3.2 哺乳动物体内唾液酸的代谢
        1.3.3 唾液酸与肿瘤的关系
        1.3.4 唾液酸的研究方法
    1.4 膀胱癌
        1.4.1 膀胱癌简介
        1.4.2 膀胱癌分类
        1.4.3 膀胱癌的治疗
        1.4.4 膀胱癌与Akt信号通路
    1.5 细胞外囊泡
        1.5.1 细胞外囊泡的简介
        1.5.2 sEV的糖修饰研究进展
    1.6 本课题的立项依据、研究意义及主要研究内容
        1.6.1 立项依据与研究意义
        1.6.2 主要研究内容
第二章 唾液酸α2,3和α2,6连键类型质谱检测样品制备方法改进
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 主要试剂
        2.2.2 主要仪器
        2.2.3 试剂配制
        2.2.4 细胞及培养方法
        2.2.5 低氧培养模型
        2.2.6 细胞总蛋白的提取
        2.2.7 蛋白质定量
        2.2.8 Western blot
        2.2.9 Lectin blot
        2.2.10 唾液酸的衍生化
        2.2.11 N-糖链的释放
        2.2.12 N-糖链的除盐
        2.2.13 N-糖链的MALDI-TOF检测
        2.2.14 质谱数据分析方法
        2.2.15 数据统计方法及结果表示
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 MALDI-TOF区分唾液酸α2,3与α2,6 的原理分析
        2.3.2 衍生化方法的有效性验证
        2.3.3 胎球蛋白的N-糖链唾液酸分析
        2.3.4 重组乳铁蛋白复杂N-糖链及唾液酸分析
        2.3.5 肿瘤细胞低氧状态N-糖修饰及唾液酸修饰组学
    2.4 本章小结
第三章 膀胱癌唾液酸修饰与唾液酸酶NEU1的关联
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要试剂
        3.2.2 主要仪器
        3.2.3 试剂配制
        3.2.4 细胞株及培养方法
        3.2.5 总蛋白提取
        3.2.6 Western blot实验
        3.2.7 Lectin Blot实验
        3.2.8 细胞总唾液酸酶活性测定
        3.2.9 细胞N-糖链质谱
        3.2.10 SILAC标记定量蛋白质谱
        3.2.11 免疫组化和免疫荧光染色
        3.2.12 激光共聚焦荧光显微镜检测
        3.2.13 数据统计方法及结果表示
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 恶性膀胱癌唾液酸修饰增加
        3.3.2 膀胱癌细胞总唾液酸酶活性分析
        3.3.3 NEU1在膀胱癌细胞中的表达
        3.3.4 NEU1在膀胱癌临床样本中的含量
        3.3.5 临床样本中NEU1与唾液酸关系
        3.3.6 NEU1与膀胱癌患者预后的关系
    3.4 本章小结
第四章 过表达NEU1对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响及机理分析
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 主要试剂和材料
        4.2.2 主要仪器
        4.2.3 试剂配制
        4.2.4 细胞及培养方法
        4.2.5 过表达NEU1细胞构建
        4.2.6 NEU1瞬时干扰
        4.2.7 细胞总蛋白提取
        4.2.8 细胞组分分离和提取
        4.2.9 免疫共沉淀
        4.2.10 Western blot
        4.2.11 Lectin blot
        4.2.12 细胞总唾液酸酶活测定
        4.2.13 细胞表面唾液酸检测
        4.2.14 MTS检测细胞增殖
        4.2.15 细胞凋亡检测
        4.2.16 细胞周期检测
        4.2.17 激光共聚焦检测蛋白表达及定位
        4.2.18 FN-Integrin亲和力检测
        4.2.19 小鼠皮下成瘤实验
        4.2.20 组织免疫化学染色
        4.2.21 组织凋亡TUNEL染色
        4.2.22 数据统计与分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 构建过表达NEU1的膀胱癌细胞株
        4.3.2 过表达NEU1对细胞唾液酸修饰的影响
        4.3.3 过表达NEU1对细胞表型的影响
        4.3.4 过表达NEU1对膀胱癌细胞生长和抵抗凋亡相关分子表达的影响
        4.3.5 过表达NEU1抑制膀胱癌的分子机理探究
        4.3.6 过表达NEU1膀胱癌细胞小鼠皮下成瘤实验
    4.4 本章小结
第五章 膀胱癌细胞sEV唾液酸修饰对受体细胞摄入的影响及在临床诊断中的作用
    5.1 前言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 主要试剂及材料
        5.2.2 主要仪器
        5.2.3 试剂配制
        5.2.4 细胞及培养方法
        5.2.5 细胞总蛋白提取
        5.2.6 蛋白质含量测定
        5.2.7 Western blot
        5.2.8 Lectin blot
        5.2.9 sEV提取
        5.2.10 密度梯度离心纯化sEV
        5.2.11 透射电镜检测
        5.2.12 sEV粒径分析
        5.2.13 sEV内吞激光共聚焦制样及检测
        5.2.14 sEV生物素标记及内吞检测
        5.2.15 EdU细胞增殖检测
        5.2.16 s EV唾液酸含量检测(ELISA)
        5.2.17 数据量化及统计分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 细胞分泌的sEV的分离与鉴定
        5.3.2 sEV唾液酸修饰
        5.3.3 sEV唾液酸修饰对受体细胞影响
        5.3.4 血浆sEV与膀胱癌诊断
    5.4 本章小结
主要结论与展望
    主要结论
    课题展望
论文主要创新点
致谢
参考文献
附录 Ⅰ:附表
附录 Ⅱ:作者在攻读博士学位期间发表的论文

(8)Junctophilin2 MORN结构域对心肌小电导钙激活钾通道膜转运的调控(论文提纲范文)

摘要
Abstract
中英文缩略词表
引言
第一部分:JP2蛋白与SK2通道相互作用区域的验证
    1 前言
    2 材料与方法
    3 结果
    4 讨论
    5 小结
第二部分:JP2 MORN结构域Ⅰ增加细胞膜SK2 通道的表达和定位
    1 前言
    2 材料与方法
    3 结果
    4 讨论
    5 小结
第三部分:JP2 MORN结构域Ⅰ调控细胞膜SK2 通道表达的机制
    1 前言
    2 材料与方法
    3 结果
    4 讨论
    5 小结
全文总结
参考文献
综述 钾离子通道转运在相关疾病中作用的研究进展
    参考文献
个人简历
读博期间发表的论文
致谢

(9)CD163 N端与MYH9 C端蛋白互作在促进PRRSV入侵易感细胞过程中的机制研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展
    1.1 PRRSV起源
    1.2 PRRSV临床症状
    1.3 PRRSV病理变化
    1.4 PRRSV基因组组成
    1.5 PRRSV非结构蛋白
    1.6 PRRSV结构蛋白
    1.7 PRRSV疫苗防控
第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体研究进展
    2.1 CD163
    2.2 非肌肉肌球蛋白重链 9(MYH9)
    2.3 唾液酸黏附素(Sn)
    2.4 其他受体分子
    2.5 本研究的目的与意义
第三章 CD163与MYH9互作区域鉴定
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞,质粒和病毒
        3.1.2 实验试剂与主要耗材
        3.1.3 主要实验仪器设备
        3.1.4 主要缓冲液配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 免疫共沉淀实验验证PAMs内CD163与MYH9的互作
        3.2.2 PAMs膜蛋白提取
        3.2.3 免疫共沉淀实验验证CD163与MYH9的互作区域
        3.2.4 Western Blot检测蛋白表达
        3.2.5 原核表达系统表达纯化蛋白
        3.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测SRCR1-4 与PRA蛋白的直接互作
        3.2.7 Far-Western Blot检测SRCR1-4 与PRA的直接互作
        3.2.8 Confocal验证重组表达的SRCR1-4 与PAMs细胞膜上MYH9的共定位
        3.2.9 免疫共沉淀验证重组表达的SRCR1-4 与PAMs细胞膜上MYH9的互作
    3.3 实验结果
        3.3.1 CD163与MYH9在PAMs中相互作用
        3.3.2 CD163蛋白的N端结构域SRCR1-4 与MYH9蛋白的C端区域PRA相互作用
        3.3.3 SRCR1-4 蛋白表达与纯化
        3.3.4 SRCR1-4 与PRA直接相互作用
        3.3.5 SRCR1-4 蛋白与PAMs膜上分布的MYH9相互作用
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 SRCR1-4 与PRA的互作对PRRSV感染的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 细胞,质粒和病毒
        4.1.2 实验试剂和主要耗材
        4.1.3 主要实验仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 稳定表达CD163及其截短片段的HEK293T细胞系构建
        4.2.2 免疫共沉淀检测HEK293T细胞系中CD163与MYH9的互作
        4.2.3 PRRSV在HEK293T稳筛细胞系中吸附,内化,解离,复制过程的分析
        4.2.4 PRRSV在HEK293TCD163,HEK293TSRCR1-4,HEK293TSRCR5-CT细胞系中的复制差异分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)细胞系的建立与鉴定
        4.3.2 HEK293T~(CD163),HEK293T~(SRCR1-4),HEK293T~(SRCR5-CT)细胞系中CD163与MYH9的互作
        4.3.3 SRCR1-4 对于PRRSV在易感细胞内的入侵发挥重要作用
        4.3.4 SRCR1-4 的表达影响PRRSV的复制效率
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 重组表达SRCR1-4 蛋白对PRRSV感染的抑制作用
    5.1 实验材料
        5.1.1 细胞,病毒和蛋白
        5.1.2 实验试剂和主要耗材
        5.1.3 主要仪器设备
    5.2 实验方法
        5.2.1 原核表达的SRCR1-4 蛋白对PRRSV在PAMs中内化的影响
        5.2.2 不同浓度的SRCR1-4 蛋白孵育PAMs后对II型PRRSV的抑制作用
        5.2.3 SRCR1-4 蛋白对细胞的毒性检测
        5.2.4 重组SRCR1-4 蛋白对I,II型PRRSV的广谱性抑制作用
    5.3 实验结果
        5.3.1 重组SRCR1-4 蛋白抑制PRRSV在PAMs中的内化过程
        5.3.2 重组SRCR1-4 蛋白对PRRSV具有广谱性抑制作用
    5.4 讨论
    5.5 小结
第六章 CD163与MYH9互作区域的表达与纯化
    6.1 实验材料
        6.1.1 细胞与质粒
        6.1.2 主要试剂耗材
        6.1.3 主要实验仪器设备
    6.3 实验方法
        6.3.1 Far-Western Blot鉴定SRCR1-4 蛋白与截短PRA片段之间的互作
        6.3.2 His-pull down检测SRCR1-4 与截短PRA蛋白之间的相互作用
        6.3.3 SRCR1-4 与PRA互作区域的表达纯化
        6.3.4 真核表达的PRA100与原核表达的SRCR1-4 蛋白之间的互作检测
        6.3.5 稳定分泌表达 CD163 胞外区蛋白(SRCR1-PSTII)的 293s 悬浮细胞系构建
        6.3.6 SRCR1-PSTII蛋白的纯化
        6.3.7 SRCR1-PSTII蛋白透射电镜观察
    6.4 实验结果
        6.4.1 CD163 SRCR1-4 蛋白与PRA截短片段之间的互作
        6.4.2 PRA100蛋白的表达纯化
        6.4.3 真核表达的PRA100与原核表达SRCR1-4 蛋白之间的互作
        6.4.4 CD163胞外区结构域SRCR1-PSTII蛋白的表达与纯化
        6.4.5 SRCR1-PSTII透射电镜观察
    6.5 讨论
    6.6 小结
全文总结
本研究创新点
参考文献
致谢
个人简历

(10)旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究(论文提纲范文)

摘要 abstract 英文缩略词(Abbreviations) 第一部分 旋毛虫成虫排泄分泌抗原的血清学诊断
1 材料和方法
    1.1 主要试剂
    1.2 主要仪器
    1.3 试剂的配方
    1.4 寄生虫和实验动物
    1.5 血清样本的收集和制备
    1.6 旋毛虫肌幼虫,肠道感染性幼虫和成虫的收集
    1.7 ELISA法检测旋毛虫感染血清
    1.8 SDS-PAGE蛋白分析和Western-blot鉴定
    1.9 统计学分析
2 结果
    2.1 检测成虫ES和可溶最佳包被条件及Cut-off值
    2.2 成虫ES和成虫可溶检测感染不同旋毛虫虫种小鼠感染血清
    2.3 成虫ES和成虫可溶检测不同寄生虫感染小鼠血清抗体结果
    2.4 成虫ES和成虫可溶检测旋毛虫感染不同剂量不同天数小鼠血清抗体结果
    2.5 检测旋毛虫和其他寄生虫染的病人血清中抗旋毛虫抗体水平
3 讨论
4 小结
参考文献 第二部分 旋毛虫丝氨酸蛋白酶(TsSP)的克隆表达及功能鉴定
1 材料和方法
    1.1 主要实验试剂
    1.2 主要仪器
    1.3 试剂配方
    1.4 旋毛虫种、实验动物、菌体
    1.5 在线预测TsSP蛋白的理化性质
    1.6 TsSP序列比对及进化树的构建
    1.7 设计TsSP的 PCR扩增引物
    1.8 收集旋毛虫不同虫期的虫体
    1.9 旋毛虫不同虫期总RNA的提取
    1.10 RNA反转录制备各个虫期cDNA
    1.11 内参基因(GAPDH)检测cDNA质量
    1.12 TsSP目的基因扩增
    1.13 TsSP基因与克隆载体pGEM-T
    1.14 制备BL21感受态
    1.15 重组质粒转化入感受态中
    1.16 重组菌落PCR鉴定
    1.17 质粒提取步骤
    1.18 重组质粒pGEM-TsSP的双酶切和测序鉴定
    1.19 目的基因TsSP与表达载体的连接
    1.20 菌种冻存
    1.21 重组菌的诱导表达及可溶性分析
    1.22 rTsSP蛋白的亲和纯化
    1.23 rTsSP免疫血清的制备及效价的测定
    1.24 Western-blot检测rTsSP的抗原性和免疫原性
    1.25 旋毛虫TsSP基因在各个虫期核酸水平的表达
    1.29 旋毛虫TsSP蛋白在各个虫期的表达及定量
    1.30 检测TsSP在旋毛虫各个虫体的表达和定位
    1.31 ADCC-抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[9-11]
    1.32 体外侵入实验
    1.33 rTsSP与肠上皮细胞的特异性结合作用
    1.34 rTsSP免疫保护
    1.35 统计学分析
2 结果
    2.1 TsSP生物信息学分析
    2.2 旋毛虫TsSP基因引物设计
    2.3 扩增TsSP基因
    2.4 重组质粒PGEM-T-TSsp的测序及序列分析
    2.5 重组表达载体的PCR鉴定及双酶切鉴定
    2.6 重组质粒pQE80L-TsSP诱导表达及可溶性分析
    2.7 rTsSP的亲和纯化
    2.8 ELISA检测rTsSP免疫血清的效价
    2.9 Western-blot分析rTsSP重组蛋白的抗原性
    2.10 旋毛虫TsSP基因转录水平的表达
    2.11 TsSP蛋白在旋毛虫不同发育虫期蛋白表达水平的鉴定
    2.12 IFA检测TsSP蛋白在旋毛虫不同虫期虫体表面的表达及定位
    2.13 IFA检测TsSP在旋毛虫不同发育期虫体内部的表达
    2.14 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)
    2.15 体外侵入
    2.16 rTsSP与 IEC的结合作用
    2.17 rTsSP诱导免疫类型的鉴定
    2.18 rTsSP的免疫保护作用
3 讨论
4 小结
参考文献 第三部分 rTsSP在旋毛虫病早期诊断及免疫保护中的应用
1 材料和方法
    1.1 试剂和仪器
    1.2 蛋白的制备
    1.3 不同感染血清的制备
    1.4 Western-blot检测
    1.5 ELISA检测
    1.6 滴鼻免疫实验方案
    1.7 ELISA检测抗体反应
    1.8 肠道冲洗液中sIgA的检
    1.9 免疫荧光分析肠道分泌IgA细胞的数量
    1.10 肠道杯状细胞及粘蛋白的鉴定
    1.11 细胞因子检测
    1.12 旋毛虫攻击感染小鼠及免疫保护评估
    1.13 统计学分析
2 结果
    2.1 Western-blot检测rTsSP对早期旋毛虫感染血清的识别
    2.2 Western-blot分析对rTsSP的敏感性
    2.3 rTsSP-ELISA检测其他旋毛虫种属感染小鼠血清结果
    2.4 rTsSP-ELISA检测其他寄生虫感染小鼠血清结果
    2.5 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染不同剂量不同时间的小鼠血清
    2.6 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染猪血清
    2.7 rTsSP检测旋毛虫和其他寄生虫感染的病人血清
    2.8 rTsSP滴鼻免疫所引起的体液免疫应答
    2.9 肠道粘膜sIgA应答
    2.10 IFA检测旋毛虫天然TsSP在不同期的表达
    2.11 肠道杯状细胞及粘蛋白的检测
    2.12 小肠分泌IgA细胞的荧光鉴定
    2.13 rTsSP滴鼻免疫后细胞因子的变化
    2.14 rTsSP滴鼻免疫后所产生的免疫保护作用
3 讨论
4 小结
参考文献 全文结论 综述 寄生虫丝氨酸蛋白酶功能与旋毛虫病免疫保护的研究
1 丝氨酸蛋白酶和酶的作用机制
2 寄生线虫的丝氨酸蛋白酶
    2.1 鞭虫丝氨酸蛋白酶
    2.2 简单异尖线虫丝氨酸蛋白酶
    2.3 猪蛔虫丝氨酸蛋白酶
    2.4 丝虫丝氨酸蛋白酶
    2.5 犬钩虫丝氨酸蛋白酶
    2.6 小卷蛾斯氏线虫丝氨酸蛋白酶
    2.7 绦虫丝氨酸蛋白酶
    2.8 吸虫丝氨酸蛋白酶
    2.9 旋毛虫丝氨酸蛋白酶
3 旋毛虫病的免疫生物学
4 抗旋毛虫感染疫苗的发展
    4.1 虫体提取物和分泌物诱导的保护免疫
    4.2 用于诱导保护预防旋毛虫的免疫途径和佐剂
    4.3 重组蛋白和亚型表位所诱导的抗旋毛虫的保护应答
    4.4 抗旋毛虫的DNA疫苗
    4.5 旋毛虫疫苗的远景
5 结论
参考文献 个人简历及博士期间发表论文
1 个人基本信息
2 教育背景
3 发表论文情况
4 获奖荣誉
5 参加国际会议 致谢

四、重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定(论文参考文献)

  • [1]基于“阳化气,阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
  • [2]基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制[D]. 李小英. 甘肃农业大学, 2021(01)
  • [3]传染性法氏囊病病毒变异株分离鉴定及不同系统表达VP2蛋白免疫原性分析[D]. 秦颖. 扬州大学, 2021(02)
  • [4]A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定[D]. 伍春平. 中国农业科学院, 2021(09)
  • [5]新型表面增强拉曼探针检测嗜铬粒蛋白A的研究[D]. 尹雪. 吉林大学, 2021(01)
  • [6]MERTK促进猪瘟病毒复制的分子机制[D]. 郑光来. 中国农业科学院, 2020
  • [7]唾液酸异常修饰影响膀胱癌细胞增殖和凋亡的分子机制探究[D]. 周小满. 江南大学, 2020(01)
  • [8]Junctophilin2 MORN结构域对心肌小电导钙激活钾通道膜转运的调控[D]. 罗天霞. 郑州大学, 2020(02)
  • [9]CD163 N端与MYH9 C端蛋白互作在促进PRRSV入侵易感细胞过程中的机制研究[D]. 侯高鹏. 西北农林科技大学, 2019
  • [10]旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究[D]. 孙阁阁. 郑州大学, 2019(07)


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