田丝竹[1]（2021）在《基于金属探针的电子自旋共振法测定免疫球蛋白和抗氧化能力的研究》文中研究说明引入180 nm的四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4 nanoparticles,FeNPs）标记抗体,将FeNPs中的Fe3+作为电子自旋共振（electron spin resonance,ESR）探针,以微米级粒径的琼脂糖微球为固相载体,建立了一种新的免疫分析方法并将其用于兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）的检测。采用了免疫夹心法和免疫竞争法两种方法并比较了两种方法的灵敏度。分析结果表明,夹心法的灵敏度优于竞争法。通过四参数logistic模型（4-parameter logistic model,4PLM）拟合实验数据得到标准曲线。将本方法用于兔血清中兔IgG的检测,通过与先前报导的兔血清中兔IgG浓度数据对比,本方法与文献报道的结果符合度较好,证明了本方法的可靠性。本方法的分析灵敏度良好,与近年来其他免疫分析方法进行对比,本方法的样品制备时间比现有的大多数方法都要短。此外,本方法还有操作简单、分析样品稳定等优点。通过水相合成法合成一种粒径约为5 nm的水溶性硫化铜纳米粒子,并以此为ESR探针,构建了一种新的电子自旋共振免疫分析方法。采用免疫夹心法,以聚苯乙烯96孔板作为固相载体,将多个生物素偶联到山羊抗兔IgG抗体上,将链霉亲和素偶联到硫化铜纳米粒子上。相较于直接测量纳米粒子的ESR信号,本方法通过后续处理来检测纳米粒子中Cu2+离子的ESR信号。方法具有较高的灵敏度,并且检测线性范围宽,几乎跨越了5个数量级。此外,日内精密度、日间精密度和血清加标回收样品的检测结果均令人满意。与其他方法相比,本方法的灵敏度和线性范围具有一定的优势,并且在检测时不受样品颜色和基质背景信号的干扰。此外所采用的合成原料便宜易得,合成条件比较温和,合成方法比较简单、省时和环保。分析样品对热和光都不敏感,至少可以保存两周,在此期间内重现性很好,符合临床检验中对复查的要求。水果中的抗氧化剂将Cu2+还原为Cu+,Cu+以CuSCN沉淀的形式除去后,通过检测剩余Cu2+的ESR信号,建立一种能检测多种水果抗氧化能力的ESR方法。本方法检测了市面上常见的22种水果的抗氧化能力,并与传统的1,1-二苯-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,·DPPH）自由基清除法和铜离子(Cu2+)还原抗氧化能力（cupric reducing antioxidant capacity,CUPRAC）法进行比较。结果表明,本方法可以用于检测大量、复杂实际样品的抗氧化能力,具有较高的实际应用价值。此外,通过福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法测定水果中总酚的含量,证明了总酚含量与水果抗氧化能力密切相关。
欧阳子程[2]（2020）在《蔬菜中百草枯残留的免疫学快速检测方法学研究》文中研究说明百草枯（Paraquat,PQ）是一种速效触杀型灭生性除草剂,因其高效、实用而被广泛使用。然而百草枯在土壤中产生残留,对水资源产生污染,且其对人畜可产生毒性。在多数国家已禁用百草枯的情况下,百草枯中毒现象仍逐年上升。目前百草枯检测方法大多需要专业配套仪器设备,前处理繁琐且有较高的操作人员专业技术要求,无法满足现场快速检测的要求。因此,建立食品中百草枯残留的便捷、快速和高效的检测方法显得必要和紧迫。本文采用单克隆抗体、胶体金合成标记以及水凝胶合成技术,建立了百草枯的酶联免疫（ELISA）、金标免疫层析以及水凝胶免疫检测方法,并进行了方法的验证。首先,基于单克隆抗体建立了百草枯残留检测的间接竞争ELISA方法。通过小鼠制备得到百草枯的单克隆抗体,抗体效价为80000。标准曲线在0.1μg/L～25μg/L范围内具有较好的线性关系,其线性回归方程为y=-31.994x+38.092,R=0.9807。方法的重复性变异系数小于15%,检测重复性较好。百草枯标准品最低检出限为0.015μg/L,青菜加标回收率为71.6%～125.1%,大豆加标回收率为85.2%～116.5%。其次,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,建立了百草枯残留的免疫胶体金检测方法。采用金标单克隆抗体作为分析探针,PQ-BSA作为竞争抗原,以羊抗鼠Ig G为控制抗体,构建间接胶体金标免疫层析检测体系。确定羊抗兔二抗的最佳包被浓度为0.4μL/m L。制备的胶体金免疫试纸条和试纸卡,通过视觉观察,微孔法检测百草枯标准品的可视检出限为5μg/L,检测卡的标准品检出限为15μg/L。两种方法检测韭菜的检测限均为18μg/kg,稳定性较好。试纸条带4℃有效期为8个月。免疫试纸条检测韭菜中百草枯的可视检测限LOD明显低于国家标准中叶菜类蔬菜中百草枯的最大残留限量。最后,将水凝胶应用到了食品的百草枯残留检测。选择15%聚乙二醇丙烯酸酯和10%聚乙二醇600通过紫外光照和氯化钙溶液双交联制备水凝胶,吸附1:10000稀释度的抗原和羊抗鼠Ig G,建立水凝胶免疫可视化检测方法,通过目视观察,标准品的检出限为500μg/L,大豆的检测限为500μg/kg,韭菜的检测限为1000μg/kg,稳定性较好。使用高效液相色谱检测提取方法的回收率,百草枯的标准曲线回归方程为y=61.382x+2.5129,R2=0.999,得出大豆加标相对回收率为85.23%～95.68%,绝对回收率为81.27%～89.12%。韭菜加标相对回收率为90.37%～94.45%,绝对回收率为86.32%～93.76%。本文成功建立了食品中百草枯残留检测的间接酶联免疫法、免疫胶体金法和水凝胶免疫检测法,具有灵敏性好、准确性高、快速和操作方便的优点,并实现了肉眼可视化,有很好的实用价值,为食品中百草枯的残留检测提供了多种可利用的方法。
朱永智[3]（2020）在《牛乳中三种主要过敏原双抗夹心ELISA检测方法的建立》文中研究说明牛乳是人们日常生活中比较普遍的蛋白质来源之一,同时也被WHO认定为人类食物过敏的八大类食品之一。酪蛋白（CN）、β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）被认为是牛乳中的主要过敏原,目前还没有一个可以有效治疗牛乳过敏的手段。而开展针对乳及乳制品主要过敏原酪蛋白（CN）、β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）的检测,能够为乳及乳制品过敏原标识标准的建立提供理论支撑和技术支持,也为易感特殊人群的健康提供保障。本论文主要研究了牛乳中三种主要过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备及性能鉴定、单克隆抗体的制备及性能鉴定、双抗夹心ELISA检测方法的建立及方法学评价。具体研究内容和结果如下:1、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定以牛乳主要过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂等量混合后,采用颈背部皮下注射的免疫方式对健康的新西兰大白兔进行免疫,制备的兔血清通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化分离后,分别采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度、间接ELISA法测定效价。结果表明,本研究成功制备高纯度抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体;三种蛋白均进行了四次免疫,每次免疫的剂量为500μg/只,四免后测得三种多抗效价均达到1:729000。2、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白单克隆抗体的制备采用与兔多抗制备相同的免疫方式和免疫抗原对健康的适龄雌性BALB/c小鼠进行免疫,三种蛋白均进行了六次免疫,初免剂量均为100μg/只,加强免疫（26免）剂量均为50μg/只,冲刺免疫剂量为25μg/只,利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清,选取六免血清效价最高的小鼠（酪蛋白效价为1:81000,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白效价均为1:243000）。通过细胞融合和间接ELISA法检测筛选阳性孔,采用有限稀释法通过三次亚克隆后筛选分别得到2株（2A8、8B6）稳定分泌酪蛋白单抗的杂交瘤细胞株,8株（1C3、2F8、2H11、3A5、3A10、4A2、4A3、4B10）稳定分泌α-乳白蛋白单抗的杂交瘤细胞株,1株（2A8）稳定分泌β-乳球蛋白单抗的杂交瘤细胞株。采用体内腹水诱生法进行单克隆抗体的大量生产。3、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白单克隆抗体的鉴定通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对获得的腹水单抗进行纯化后,分别采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度、间接ELISA法测定效价、Westen-blotting鉴定特异性、非竞争性间接ELISA法检测亲和力。结果表明,α-乳白蛋白的2个单抗2H11和3A10效价偏低（1:27000）,α-乳白蛋白其余6个单抗（1C3、2F8、3A5、4A2、4A3、4B10）、酪蛋白的2个（2A8、8B6）单抗以及β-乳球蛋白的1个（2A8）单抗的效价均可达到1:243000;酪蛋白单克隆抗体亲和力常数为3.1×107L/mol,α-乳白蛋白单克隆抗体亲和力常数为3.5×107 L/mol,β-乳球蛋白单克隆抗体亲和力常数为3.27×107 L/mol;商用单抗亚型试剂盒鉴定表明,α-乳白蛋白的3A10分泌的单抗亚型为IgG2b,α-乳白蛋白的其余细胞株、酪蛋白细胞株以及β-乳球蛋白细胞株分泌的单抗亚型均为IgG1。4、酪蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立通过对最佳捕获抗体的筛选、兔多抗和酶标二抗工作浓度优化,建立了酪蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,其中最佳捕获抗体为2A8,兔多抗最佳工作浓度为1:10000,HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（酶标二抗）最佳工作浓度为1:10000。该方法建立的标准曲线线性范围为401280 ng/mL,最低检测限（limit of detetion,LOD）为40 ng/mL;该方法对酪蛋白检测的批内变异系数CV在2.72%5.97%之间,批间变异系数CV在7.99%12.33%之间,具有较高的精密度;该方法只与酪蛋白发生交叉反应,与牛乳中其他几种主要蛋白不发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法对酪蛋白的回收率为80.4%92.25%,该方法具有较高的准确度,能够满足牛乳中酪蛋白过敏原的检测要求。5、α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立通过对最佳捕获抗体的筛选、兔多抗和酶标二抗工作浓度优化,建立了α-乳白蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,其中最佳捕获抗体为4A2,兔多抗最佳工作浓度为1:15000,HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（酶标二抗）最佳工作浓度为1:10000。该方法建立的标准曲线线性范围为2.540 ng/mL,LOD为2.5 ng/mL;该方法对α-乳白蛋白检测的批内变异系数CV在2.69%6.27%之间,批间变异系数CV在8.06%12.41%之间,具有较高的精密度;该方法只与α-乳白蛋白发生交叉反应,与牛乳中其他几种主要蛋白不发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法对α-乳白蛋白的回收率为84.6%93.6%,该方法具有较高的准确度,能够满足牛乳中α-乳白蛋白过敏原的检测要求。6、β-乳球蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立通过对兔多抗和酶标二抗工作浓度优化,建立了β-乳球蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,捕获抗体为2A8,兔多抗最佳工作浓度为1:10000,HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（酶标二抗）最佳工作浓度为1:10000。该方法建立的标准曲线线性范围为12.5200 ng/mL,LOD为12.5 ng/mL;该方法对酪蛋白检测的批内变异系数CV在3.33%5.96%之间,批间变异系数CV在7.81%12.36%之间,具有较高的精密度;该方法只与酪蛋白发生交叉反应,与牛乳中其他几种主要蛋白不发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法对β-乳球蛋白的回收率为86.8%92.3%,该方法具有较高的准确度,能够满足牛乳中β-乳球蛋白过敏原的检测要求。
刘卫华[4]（2019）在《动物源食品中氟甲喹快速免疫检测技术的研究》文中研究指明氟甲喹（flumequine,FLU）是一种动物专用的喹诺酮类抗生素,用于预防和治疗畜禽及水产类动物的疾病。但是,滥用或者超标使用的情况时有发生,造成动物性食品中的氟甲喹残留问题,对人类的健康造成极大的危害。世界各国都规定了动物性食品中氟甲喹残留的最大限量,作为食品安全监管的标准和依据,而建立简单、快速、高通量的检测方法也很有必要。本研究采用活泼酯法合成氟甲喹完全抗原,通过免疫动物制备了多克隆抗体,建立了氟甲喹间接竞争酶联免疫分析方法（icELISA）;建立了氟甲喹固相膜免疫分析方法;制备了氟甲喹分子印迹膜,并将其作为人工抗体,建立了直接竞争仿生酶联免疫分析方法（BELISA）。建立的icELISA法和BELISA法适于大量样品的快速定量筛查,预处理简单,操作方便快速,检测限低;固相膜免疫分析方法适于快速定性筛查,准确可靠,简便易操作。氟甲喹完全抗原的合成及多克隆抗体的制备。采用活泼酯法将FLU半抗原与载体蛋白牛血清蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）偶联,制备出FLU-BSA（免疫原）和FLU-OVA（包被原）。通过紫外光谱扫描和SDS-PAGE凝胶电泳两种方法确定人工抗原成功地合成。用免疫原FLU-BSA免疫两只新西兰大耳白兔,获得抗血清（FLU-1和FLU-2）;采用间接竞争ELISA方法测定抗血清效价和亲和性,FLU-1与FLU-2效价相当（均为1:12800）,经纯化后,FLU-1抗体（IC50为0.06 ng/mL）亲和性明显高于FLU-2（IC50为0.21 ng/mL）,故选择FLU-1抗体进行后续免疫检测试验。氟甲喹残留的ELISA检测方法的建立。采用间接竞争ELISA法优化FLU的检测条件,最优条件为:包被量10 μg/mL,抗血清稀释度1:3200,封闭液为1%明胶,酶标二抗稀释度1:2500,pH值7.5,反应缓冲液是1×PBS,乙腈含量是0%～20%。在最优条件下建立间接竞争ELISA方法,该方法的IC50为2.03 ng/mL,最低检出限达1.21×10-4 ng/mL,具有比较高的准确性和灵敏度。将FLU与其结构类似物左氧氟沙星（LVX）、加替沙星（GAT）和氧氟沙星（OFX）进行交叉反应试验,交叉反应率都很低,抗体特异性好。选择牛肉、猪肉、虾肉、牛奶、熟猪肝和生猪肝作为试样,研究基质影响的消除方法。牛肉、猪肉和牛奶经过超声提取后以PBS稀释10倍,虾肉需稀释20倍,猪肝等内脏类需要稀释40倍,就可以有效地消除基质的影响。在加标回收试验中,在三个加标水平上的回收率在72.80%～97.30%之间。用HPLC法对建立的间接竞争ELISA法进行验证,其检测结果之间的拟合程度很高,相关系数R2均大于0.96,这可以说明所建立的ELISA方法准确、可靠、简便、快速,可用于动物性食品中氟甲喹残留的快速定量分析。氟甲喹残留的固相膜免疫检测方法的建立。采用柠檬酸三钠还原法制备出来胶体金,以胶体金标记FLU抗体制备出来免疫金。以硝酸纤维素（NC）膜作为固相载体,分别包被上FLU-OVA、酶标二抗作为T线、C线,对测定条件进行的优化结果是:封闭液为5%脱脂乳、酶标二抗最佳稀释倍数为40倍、包被量1.0 μg、免疫金稀释度为1:5（v/v）、金标抗体与待测溶液的混合比例为1:5（v/v）在最优条件下,制成FLU胶体金标记免疫层析固相膜,最低检出限为40 μg/L。对牛肉、猪肉、虾肉、牛奶、熟猪肝、生猪肝进行基质影响的消除试验,牛肉、猪肉、虾肉基质的提取液需用1×PBS缓冲液稀释20倍,牛奶、熟猪肝、生猪肝稀释40倍,可以消除基质的影响。加标回收试验的结果用肉眼观察即可看到有明显的梯度,说明方法有效。建立的胶体金标记固相膜免疫检测方法是一种定性检测方法,在实际的检测工作中无需仪器,目测结果即可,时间较短,适用于大批量样品的现场快速定性筛选。氟甲喹残留的BELISA检测方法的建立。通过分子动力学模拟,确定氟甲喹与甲基丙烯酸（MAA）结合的最佳摩尔比为1:2。以FLU为模板,以MAA作为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）作为交联剂,偶氮二异丁腈（AIBN）作为引发剂,以96孔酶标板作为固相载体,制备出了分子印迹膜（MIPs）。通过静态吸附试验和吸附动力学试验对其进行表征,结果表明分子印迹膜已经成功合成。采用活泼酯法制备酶标抗原,对BELISA反应体系的条件进行优化,确定的最优条件是:酶标抗原的稀释倍数为8000倍,pH为7.1,甲醇含量为5%的PBST缓冲液。在此条件下建立直接竞争BELISA法,该方法检测线性范围是1～100000 ng/mL,灵敏度IC50为140.62 ng/mL,检测限为1.09ng/mL。与结构类似物左氧氟沙星（LVX）、氧氟沙星（OFX）和依诺沙星（ENX）的交叉反应率分别为17.8%、17.5%和11.0%,表明该方法的特异性较高。采用直接稀释法进行基质消除,虾肉样品提取液经过20倍稀释、牛肉样品提取液经过40倍稀释后即可消除基质的干扰。三个加标水平下的回收率在80.7%～92.3%之间,这即可表明此样品前处理方法可行。通过HPLC法验证该方法的准确性,结果表明,HPLC与BELISA呈现良好的线性关系,相关系数R2在0.98以上,这说明建立的BELISA方法准确、可靠,可以用于动物性食品中氟甲喹残留的快速检测。
张宸宁[5]（2019）在《大肠杆菌与单增李斯特菌免疫检测方法建立》文中研究表明肠出血性大肠杆菌0157:H7是造成严重感染疾病暴发的食源性病原体,在全球每73,000例食源性疾病中约占据2-7%。单增李斯特菌是一种人畜共患食源性致病菌,能导致败血症、脑膜炎等多种疾病,病死率高达30%。传统检测方法费时费力,分子生物学检测方法操作复杂、且容易出现假阳性结果。因此,迫切需要建立快速、稳定的检测方法。本研究针对大肠杆菌0157:H7建立了双抗夹心ELISA检测方法,优化后的最佳检测条件为:选择鸡源多克隆抗体作为捕获抗体,包被量为0.5 μg/孔;封闭液为1%的脱脂乳粉,封闭时间为1.0 h;兔源多克隆抗体作为检测抗体,稀释倍数为1:8000,作用时间为1.0 h:酶标羊抗兔抗体作用时间为0.5 h。该双抗夹心ELISA方法对于大肠杆菌0157:H7菌液检测限为1.7×105 CFU/mL。将人工染菌的牛肉和牛奶作为实际样品验证方法的实用性,在37℃下增菌3 h后检测限分别可以达到101、100 CFU/mL。选择3株大肠杆菌0157:H7、9株非0157大肠杆菌、6株其他菌株进行特异性检测,结果显示,3株大肠杆菌0157:H7均为阳性,其他菌株均没有交叉反应。针对大肠杆菌0157:H7,建立了胶体金试纸条检测方法,经过优化确定最佳实验条件为:采用20 nm的胶体金颗粒;在pH 7.5条件下与兔源多克隆抗体结合为金标抗体固定在金标垫上;最适金标抗体量为15μL/mL;将1.5 mg/mL兔源多克隆抗体包被于T线,5倍稀释羊抗兔抗体包被于C线。对于大肠杆菌0157:H7菌液检测限105 CFU/mL:将人工增菌的牛肉和牛奶作为实际样品,当增菌时间分别为6、7 h时,牛肉及牛奶的检测限可以达到2.5 CFU/25g。此外,本研究还初步建立了单增李斯特菌的免疫检测方法。利用单增李斯特菌表面蛋白,通过小鼠腹腔注射与细胞融合,筛选出了1株分泌抗体特异性良好的杂交瘤细胞,制备了鼠单克隆抗体,效价为810000,特异性良好。利用制备的单克隆抗体和实验室前期制备的多克隆抗体初步建立了单增李斯特菌双抗夹心ELISA方法,经过优化确定最佳检测条件为:利用鼠单克隆抗体作为捕获抗体,包被量为0.5 μg/孔;兔源多克隆抗体作为检测抗体,稀释抗体稀释倍数1:100;0.5%脱脂乳粉在37℃下封闭1.0 h;酶标羊抗兔抗体作用时间为0.5 h。在最佳条件下建立标准曲线,确定方法的检测限为104 CFU/mL。选取5株种内单增李斯特菌、5株李斯特菌属内菌种,以及5株非李斯特菌进行特异性检测,检测结果显示特异性良好。
于秋荣[6]（2019）在《基于SERS结合免疫层析技术检测β-伴大豆球蛋白的方法研究》文中进行了进一步梳理β-伴大豆球蛋白是大豆中重要的贮藏蛋白,同时也是大豆主要过敏原之一,会引发食物过敏危害人体健康。目前食物过敏在临床上尚未有有效的预防及根除方法,唯一安全有效的措施是避免食用及接触过敏原。对于大豆潜在过敏患者和大豆及其副产品加工企业,建立β-伴大豆球蛋白的定量检测方法显得尤为重要。由于表面增强拉曼散射技术具有高灵敏度、高亲和力、指纹式的分辨能力,并能使信号强度增强610个数量级等优点。因此,本论文基于β-伴大豆球蛋白抗体的制备,组装β-伴大豆球蛋白快速检测的双抗体夹心方法,并尝试建立新型以胶体金为活性基底的拉曼增强免疫试纸检测方法,为过敏消费者食物中过敏原的检测提供方便快捷的检测工具。本课题的主要研究内容如下:1.通过等电点沉淀法分离提取,硫酸铵沉淀法纯化制备β-伴大豆球蛋白。将β-伴大豆球蛋白按照免疫程序免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA法鉴定获得效价高达1:12800的多克隆抗体,其敏感性IC50值达到718 ng/mL,与芝麻蛋白、麦胚球蛋白交叉反应率小于0.2%,与花生蛋白交叉反应率为5.6%,与大豆球蛋白交叉反应率为8%。2.通过细胞融合技术将高效价及强敏感性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞,通过筛选及亚克隆获得产特异性抗体的细胞株3C9和3D11,经体内诱生法大量制备单克隆抗体,得到两株单抗3D11 mAb、3C9 mAb。两株单克隆抗体亚型鉴定均为重链IgG1型,轻链Kappa型,且特异性良好,均与α’亚基反应最强烈;间接ELISA测定3D11 mAb效价达到1:1.28×105,其半数抑制浓度IC50值为911 ng/mL,亲和力常数为9.6×109 L/moL;间接ELISA法测定3C9 mAb效价达到1:2.56×105,其IC50值为2.91μg/mL,亲和力常数为1.42×1011 L/moL。并利用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,纯化后单克隆抗体纯度提高到72%。3.建立以β-伴大豆球蛋白的兔源多克隆抗体作为检测抗体和以3D11 mAb作为固定化捕捉抗体的双抗体夹心免疫层析试纸方法。经4-氨基苯硫酚修饰胶体金并结合抗体制备成拉曼免疫探针,建立表面增强拉曼侧向免疫层析试纸的快速检测方法。SERS-LFA法在160 ng/mL100μg/mL范围可对样品中β-伴大豆球蛋白含量的进行检测,其满足y=65.1360x+113.9210,R2=0.9636,检测限为32 ng/mL。
何圣发[7]（2018）在《基于IgE表位识别检测牛乳β-乳球蛋白过敏原的新技术》文中研究说明牛乳含有丰富的蛋白质和多种营养物质,深受人们喜爱,但牛乳作为八大过敏食物之一,由牛乳引起的食物过敏现象引起了广泛的关注。欧美、日本、澳大利亚等发达国家均要求标识食品中的过敏原成分,其中就包括牛乳及乳制品。β-乳球蛋白是牛乳中的主要过敏原,含量约占牛乳总蛋白质的10%和乳清总蛋白质的50%,约有82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。另外,IgE表位是引起过敏反应的物质基础,基于IgE表位识别检测β-乳球蛋白能够更精准地检测和评估食品中牛乳过敏原的含量及潜在的致敏性风险。本论文开展的研究工作包括牛乳β-乳球蛋白IgE表位串联体多克隆抗体的制备与鉴定;牛乳β-乳球蛋白IgE表位单克隆抗体的制备与鉴定;基于β-乳球蛋白多克隆及表位串联体多克隆抗体夹心ELISA（sELISA）方法的建立;基于表位串联体多克隆抗体及纳米铂探针sELISA方法检测β-乳球蛋白;基于表位单克隆抗体及双氧水敏感型量子点荧光免疫吸附法的建立;基于共价固定表位单克隆抗体sELISA方法的建立。研究的主要方法、结果及结论如下:1以牛乳β-乳球蛋白IgE表位串联体重组大肠杆菌为基础,通过原核表达制备了表位串联体重组蛋白,结合亲和纯化和切胶回收制备了高纯度的表位串联体重组蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原,制备了高特异性的兔多克隆抗体。所制备的抗体能识别表位串联体中的7个IgE表位及其阻断肽,且具有较好的特异性。通过亲和纯化得到了β-乳球蛋白特异性表位串联体多克隆抗体。2以牛乳β-乳球蛋白的5个主要IgE线性表位肽为对象,通过杂交瘤技术制备得到相应的细胞株和表位单克隆抗体。所制备的单克隆抗体均为IgG亚型,不含IgM和IgA,轻链均为Igκ;均能识别相应的表位肽及其阻断肽;除1P1外,其余均对β-乳球蛋白具有较高的亲和常数。3基于兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体及生物素化兔抗β-乳球蛋白表位串联体多克隆抗体建立了sELISA方法。该方法对β-乳球蛋白的线性检测范围为31.25–8,000 ng/mL,最低检出限为1.96 ng/mL。在牛乳、乳清、乳清粉中加标回收率为95.17%–104.67%,检测结果与RP-HPLC法具有良好的一致性,表明所建立的sELISA方法准确可靠。在酸奶、巧克力和糖果中的加标回收率为98.33%–110.53%。并对婴幼儿水解配方奶粉中β-乳球蛋白及其致敏性残基进行了检测分析,在深度水解奶粉中未检测到β-乳球蛋白,但在不同部分水解奶粉中差异较大。4基于β-乳球蛋白表位串联体多克隆抗体及纳米铂探针建立了sELISA方法。所建立的纳米铂探针sELISA方法对牛乳β-乳球蛋白的最低检出限和线性检测范围分别为0.12 ng/mL和0.49–1.6×104ng/mL,分别比普通sELISA低16倍和宽4倍。纳米铂探针sELISA方法对样品具有高回收率,检测结果与普通sELISA方法和sELISA商业试剂盒具有良好一致性。5基于β-乳球蛋白表位单克隆抗体（1G9）及双氧水敏感性量子点（CdTe QDs）建立了荧光sELISA。所建立的荧光sELISA的β-乳球蛋白的最低检出限为0.49 ng/mL,比普通sELISA方法低16倍。对样品的检测性能与普通sELISA及sELISA试剂盒的性能相似,且回收率高（98.29%–111.84%）。对婴幼儿水解配方奶粉中β-乳球蛋白及其致敏性残基进行了检测分析,检测结果与普通sELISA没有显着差异,但与商业sELISA试剂盒检测结果存在一定差异。6基于共价固定表位单克隆抗体1G9及胶体金探针建立了sELISA。检测牛乳β-乳球蛋白的灵敏度（0.49 ng/mL）和线性范围（31.25–64×103 ng/mL）分别比普通sELISA方法高16倍和宽32倍。对样品加标回收检测结果与普通sELISA及商业sELISA试剂盒具有良好的一致性,且回收率为98.29%–111.84%;对婴幼儿水解配方奶粉中β-乳球蛋白及其致敏性残基进行了检测分析,检测结果与普通sELISA没有显着差异,但与商业sELISA试剂盒检测结果存在一定差异。7制备了一种表位串联体多克隆抗体,5个表位单克隆抗体,弥补了普通抗体不能特异性识别β-乳球蛋白IgE表位的缺点。基于表位抗体建立了四种sELISA方法,通过RP-HPLC或商业化的sELISA试剂盒验证了所建方法的准确性,结果表明所建立的免疫学方法具有灵敏度高、准确性好和回收率高的特点,可以作为检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的可靠方法。
曾海娟[8]（2018）在《瓜类细菌性果斑病菌单克隆抗体的制备及免疫层析快速检测方法的建立》文中认为瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli,Ac）是一种种传病菌,可感染西瓜、甜瓜、哈密瓜、南瓜、黄瓜、丝瓜等多种葫芦科植物,导致减产甚至绝收。该病菌的抗逆能力非常强,可在种子表面存活35年,并通过带菌种子实现远距离传播。Ac可侵染果实、植株及种子,具有发病迅速、爆发性强、传播快等特点,一旦感染会对瓜类产量带来巨大经济损失,该病害是影响我国瓜类生产的主要病害之一。目前,检测果斑病菌常用的方法为基于PCR的方法,该方法检测灵敏度相对较高,但需要精密的热循环仪,且需要34 h才能获得比较准确的结果。此方法需要在一个装备齐全的实验室中进行,不适用于病原菌的田间快速检测。免疫学检测方法,如酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）需要较长的孵育时间,不适用于田间快速检测。而免疫学快速检测方法,如免疫层析试纸条,其操作简便、检测时间短,不需要使用仪器,在田间病原菌的快速筛查上具有良好的应用前景。为建立检测果斑病菌的免疫学快速检测方法,本课题首先制备了抗瓜类细菌性果斑病菌SD01的单克隆抗体,结果显示:以果斑病菌野生型菌株SD01免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术,选择性培养基及间接ELISA法筛选,成功获得4株分泌抗菌株SD01抗体的单克隆杂交瘤细胞,抗体亚型均为IgG 2a。经制备小鼠腹水并纯化后得到4种单克隆抗体,命名为:6F,6D,7E,4F。间接ELISA法检测4种抗体（2 mg/mL）的效价分别可达到1:12800、1:6400、1:3200、1:6400,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证纯化的4种抗体均有一条约25 kD的轻链,一条约50 kD的重链,无多余的杂带,抗体纯化效果较好。间接ELISA法检测4种抗体对8株果斑病菌及6株近源的植物病原菌的结合情况,发现6D及4F可以结合8株果斑病菌;6F可以结合6株果斑病菌,与00-1、tw31不结合;7E可以结合5株果斑病菌,与ATCC 29625、00-1、tw31不能结合;6D及7E与6株近源的植物菌均无交叉反应,6F与NCPPB 961、ATCC 33996存在交叉反应;4F与ATCC 33996、ATCC 19307存在交叉反应。通过HRP酶标记6D及4F成功研制了双抗体夹心ELISA法,用于检测果斑病菌SD01的检测灵敏度为105 CFU/mL,研究结果表明,本实验成功制备了一株特异性较强的单克隆抗体6D,其次为4F,可用于建立免疫学快速检测方法。由于单抗6F及7E存在与其它果斑病菌不结合的情况,在制备免疫快速检测方法上并不适用。为进一步验证制备的单克隆抗体在实际应用时的检测性能,本课题选取胶体金纳米粒子作为示踪标记物,选取单克隆抗体6D用于胶体金标记后固定在试纸条的结合垫上,同时选取单抗6D及羊抗鼠IgG抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜（NC膜）的检测线区域及质控线区域,研制抗体自配对型的胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性、稳定性进行评估。对分别携带8株果斑病菌的西瓜植株样品进行模拟带菌检测,并采用PCR法验证试纸条检测实际样品结果的准确性。研究结果表明,抗体自配对的胶体金免疫层析试纸条特异性良好,可检测8株果斑病菌,与6株近源的植物病原菌无交叉反应;对纯培养细菌的检测灵敏度为105CFU/mL;试纸条可以在室温条件下储存至少6个月而不失去检测的稳定性;对分别携带8株果斑病菌（浓度为105 CFU/mL）的西瓜植株样品均检出为阳性;常规PCR法对实际样品的验证结果与试纸条检测结果一致,表明研制的抗体自配对型的胶体金试纸条可用于田间样品的快速检测。目前,基于抗体自配对的免疫层析试纸条在国内外尚未见报道,抗体自配对的方法为双抗体夹心模式的一种扩展,仅使用一种抗体研制双抗体夹心模式的免疫层析试纸条的成功应用,进一步表明该应用模式可以延伸到其它免疫学检测方法的研制上,并成为特异性强的单抗难以获得时研制免疫学检测方法的一种新的构建方式及补充。胶体金作为示踪标记物是目前免疫层析分析技术中最常用的有色标记物,为进一步简化制备免疫层析试纸条的程序并节省成本,本课题进一步研制了一种新型的基于抗原标记的荧光免疫层析试纸条。在本研究中,使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）作为示踪标记物,将其添加到细菌培养基中对培养基进行改良。细菌通过改良的培养基培养后可以发出稳定的黄绿色荧光,使其在培养过程中成为一种荧光探针。荧光免疫试纸条的成功研制基于荧光细菌与固定在检测线上未标记的单抗6D结合而实现,本方法研制的荧光试纸条仅需要一株未标记的抗体,简化了试纸条的制备程序并省去标记抗体的使用从而节约了成本。对试纸条的灵敏度、稳定性、特异性进行评估,并对田间采集的13种西瓜植株样品、13种西瓜种子样品及6种西瓜病变样品进行检测,同时用常规PCR法对试纸条检测结果的准确性进行验证。结果表明,试纸条的检测灵敏度为106 CFU/mL,检测结果可在15分钟内观察;试纸条可以检测8株果斑病菌,且与其它30株病原菌无交叉反应;试纸条可以在室温条件下储存至少4个月;对实际样品的检测结果与使用常规PCR法的结果一致,表明荧光试纸条在检测实际样品时具有较高的准确性。本研究实现了示踪标记物从标记抗体到标记抗原的转移,研制的基于抗原标记的荧光试纸条,由于仅需要一种无标记的抗体,成功摆脱了传统的抗体标记式的双抗体夹心模式,从而降低了成本,使荧光试纸条更容易推广应用及普及化。为提高制备的荧光免疫层析试纸条的检测灵敏度,本课题进一步使用FITC标记单抗4F,并喷涂于试纸条的结合垫上成为捕捉抗体,同时使用改良的培养基培养细菌,成功研制出了基于信号放大系统的抗原-抗体双标记的荧光试纸条。在本次研究中,荧光细菌作为第一个荧光探针,FITC标记的单抗4F作为第二个荧光探针,质控线和检测线的获得是通过将羊抗鼠IgG抗体及抗果斑病菌的单克隆抗体6D分别喷涂在NC膜的两端。对试纸条的灵敏度,稳定性,特异性进行评估,并分别对携带8种果斑病菌的西瓜样品进行检测。结果表明,试纸条可以检出8种果斑病菌,与其它6株近源的植物病原菌无交叉反应;肉眼可观察到的最低检出限为105 CFU/mL,与使用FITC仅标记抗原或仅标记抗体的荧光免疫层析试纸条相比,灵敏度提高了10倍;可在室温条件下储存至少4个月;试纸条对模拟带菌样品的检测结果与PCR的检测结果一致,表明研制的双标记的荧光免疫层析试纸条可用于实际样品的快速检测。本研究通过使用FITC标记抗原及抗体,成功研制了基于信号放大系统的双标记荧光免疫层析试纸条,成功实现了信号放大,检测灵敏度可提高10倍。本研究在制备了抗果斑病菌的特异性较强的单克隆抗体的基础上,选取有色标记物中胶体金纳米粒子、发光标记材料中的FITC用于研制免疫层析试纸条的示踪标记物。在胶体金标记单抗6D的基础上,成功研制了抗体自配对型的免疫层析试纸条;以FITC标记细菌为基础,成功研制了以标记抗原为基础的荧光免疫层析试纸条;以FITC标记细菌及单抗4F为基础,研制了基于抗原-抗体双标记的免疫层析试纸条。并分别评价了三种试纸条的灵敏度,特异性,稳定性及对实际样品的检测性能。研制的三种免疫层析试纸条与传统的ELISA法及常规PCR方法相比,缩短了检测时间并简化了操作步骤,这种简单,低成本且易于推广的方法将在植物病原菌的监测中起重要作用。
侯瑾,李迎秋[9]（2017）在《酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用》文中提出酶联免疫吸附法（ELISA）具有方法简捷、检测成本低、分析容量大等优点,适合于复杂基质中的微量成分分析,受到越来越多人的青睐。简单概述了ELISA技术,并从农药残留、兽药残留、违禁添加物、病原微生物和生物毒素以及转基因食品安全性等方面,对该技术在食品安全检测中的应用进行详细的介绍,提出了ELISA技术存在的问题和相应的解决方法,并对该技术进行了展望。
刘金[10]（2016）在《牛初乳免疫球蛋白IgG的免疫学测定方法研究》文中研究指明乳牛分娩7d内乳汁称为牛初乳,作为一种功能性食品,其富含免疫因子及生长因子等生理功能性物质和多种营养物质都远远高于常乳,其中免疫球蛋白（IgG）是最重要的免疫成分,是由于IgG具有抗体活性且与抗体结构相似,能与抗原发生特异性结合,能够显着增加T淋巴细胞的增殖活性、巨噬细胞的吞噬能力,从而减少病原对机体伤害,提高机体的免疫力,故IgG含量成为衡量牛初乳的重要指标之一。本研究首先复苏小鼠抗牛免疫球蛋白IgG杂交瘤细胞,然后采用小鼠体内诱生法进行大量制备,对采集的腹水首先选用辛酸—硫酸铵法粗提纯,然后再进行亲和层析法纯化。经测定,所分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,浓度为46.85 mg/mL,效价为5.12×106；经辛酸-硫酸铵法纯化后浓度为10.88 mg/mL,效价为2.56×106；进一步经亲和层析纯化法纯度较高,浓度为2.21 mg/mL,效价为2.56×106,亲和力常数为8.92×108,属高亲和力抗体。用纯化后的单克隆抗体建立双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）来检测牛IgG,该方法的线性回归方程为y=0.4703 lgx一0.1582（R2=0.9926）,最低检测限为7.06ng/mL,批内变异系数为4.52%，批间变异系数为4.94%，加标回收率平均值为95.87%,精密度、准确度、稳定性较好。采用此方法分别检测10份牛初乳样品,IgG含量在为50.29-79.68 mg/mL,平均值为65.40 mg/mL.磁珠双抗夹心ELISA法的线性回归方程为y=0.3822 lgx-0.0648（R2=0.9736）,最低检测限能达到7.67 ng/mL,批内变异系数为8.89%,批间内变异系数为9.81%,加标回收率平均值为103.66%。采用此方法分别检测10份牛初乳样品,IgG含量在为58.64-82.66 mg/mL,平均值为69.66 mg/mL。磁珠双抗夹心ELISA法检测更快速,但准确度比双抗夹心ELISA法低,适合快速检测,而双抗体夹心ELISA法适用于精确检测。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 电子自旋共振技术 |
| 1.1.1 电子自旋共振技术的起源和基本原理 |
| 1.1.2 电子自旋共振波谱仪 |
| 1.1.3 电子自旋共振技术的检测对象及应用 |
| 1.1.3.1 自由基的检测 |
| 1.1.3.2 过渡金属离子的检测 |
| 1.1.3.3 晶体色心的检测 |
| 1.1.4 电子自旋共振技术与核磁共振技术的联系与区别 |
| 1.2 免疫分析 |
| 1.2.1 免疫分析法的发展及其基本原理 |
| 1.2.2 生物素-链霉亲和素/亲和素系统 |
| 1.2.3 免疫分析的应用和发展 |
| 1.2.3.1 放射免疫分析法 |
| 1.2.3.2 酶联免疫分析法 |
| 1.2.3.3 荧光免疫分析法 |
| 1.3 食品的抗氧化能力 |
| 1.3.1 氧化应激 |
| 1.3.2 抗氧化剂 |
| 1.3.3 抗氧化能力的测定 |
| 1.3.3.1 DPPH法 |
| 1.3.3.2 DMPD法 |
| 1.3.3.3 ORAC法 |
| 1.3.3.4 CUPRAC法 |
| 1.4 本论文主要研究内容 |
| 1.4.1 水溶性铁纳米粒子为探针的电子自旋共振法检测兔IgG |
| 1.4.2 水溶性硫化铜纳米粒子为探针的电子自旋共振法检测兔IgG |
| 1.4.3 铜离子为探针的电子自旋共振法测定22 种水果的抗氧化能力 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二章 水溶性铁纳米粒子为探针的电子自旋共振法检测兔IgG |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂与材料 |
| 2.1.2.1 试剂 |
| 2.1.2.2 材料 |
| 2.1.2.3 溶液配制 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.3.1 铁纳米粒子-山羊抗兔 IgG多克隆抗体(FeNP-山羊抗兔 IgG)溶液的制备 |
| 2.1.3.2 琼脂糖-山羊抗兔IgG溶液的制备 |
| 2.1.3.3 琼脂糖-兔IgG溶液的制备 |
| 2.1.3.4 用夹心法和竞争法对兔IgG的免疫分析 |
| 2.1.3.5 制备用于ESR检测的分析样品 |
| 2.1.3.6 ESR检测 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 铁纳米粒子与山羊抗兔IgG多克隆抗体连接比率的选择 |
| 2.2.2 FeNPs与 FeNP-山羊抗兔IgG的表征 |
| 2.2.3 ESR检测样品与ESR图谱 |
| 2.2.4 基于ESR的夹心法与竞争法检测兔IgG的标准曲线 |
| 2.2.5 实际样品兔血清分析 |
| 2.2.6 与其他方法比较 |
| 2.3 小结 |
| 2.4 参考文献 |
| 第三章 水溶性硫化铜纳米粒子为探针的电子自旋共振法检测兔IgG |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂与材料 |
| 3.1.2.1 试剂 |
| 3.1.2.2 材料 |
| 3.1.2.3 溶液配制 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.3.1 CuS纳米粒子的合成 |
| 3.1.3.2 CuS-链霉亲和素的制备 |
| 3.1.3.3 山羊抗兔IgG-生物素的制备 |
| 3.1.3.4 免疫分析 |
| 3.1.3.5 制备用于电子自旋共振法和紫外-可见分光光度法的分析样品 |
| 3.1.3.6 电子自旋共振法 |
| 3.1.3.7 紫外-可见分光光度法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 硫化铜纳米粒子的合成与表征 |
| 3.2.2 免疫分析实验条件的优化 |
| 3.2.2.1 山羊抗兔IgG多克隆抗体与生物素的偶联 |
| 3.2.2.2 链霉亲和素与CuS纳米粒子的连接量 |
| 3.2.2.3 包被抗体的浓度 |
| 3.2.3 电子自旋共振谱图 |
| 3.2.4 标准曲线 |
| 3.2.5 方法分析 |
| 3.2.6 实际兔血清的分析 |
| 3.3 小结 |
| 3.4 参考文献 |
| 第四章 铜离子为探针的电子自旋共振法测定22 种水果的抗氧化能力 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 试剂与材料 |
| 4.1.2.1 实验试剂 |
| 4.1.2.2 实验材料 |
| 4.1.2.3 水果样品 |
| 4.1.2.4 溶液配制 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.3.1 水果存储样品的制备 |
| 4.1.3.2 水果样品的制备 |
| 4.1.3.3 检测样品的制备 |
| 4.1.3.4 电子自旋共振法 |
| 4.1.3.5 紫外-可见分光光度法 |
| 4.1.3.6 DPPH法 |
| 4.1.3.7 CUPRAC法 |
| 4.1.3.8 总酚含量测定 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 条件优化 |
| 4.2.2 电子自旋共振谱图 |
| 4.2.3 标准曲线 |
| 4.2.4 水果的抗氧化能力 |
| 4.2.5 与其他抗氧化能力测量方法对比 |
| 4.2.6 抗氧化能力与总酚含量的关系 |
| 4.2.7 统计分析 |
| 4.2.8 方法评估 |
| 4.3 小结 |
| 4.4 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食品中百草枯残留的研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 百草枯的毒性研究进展 |
| 1.1.3 百草枯的毒性作用机制研究进展 |
| 1.1.4 百草枯的代谢规律研究进展 |
| 1.1.5 食品中除草剂的限量标准 |
| 1.2 百草枯残留的检测技术研究进展 |
| 1.2.1 理化分析方法 |
| 1.2.2 酶联免疫检测技术在农药残留检测中的应用研究进展 |
| 1.2.3 胶体金免疫检测技术在农药残留检测中的应用研究进展 |
| 1.2.4 水凝胶在分析检测中的研究进展 |
| 1.3 研究目的与内容 |
| 1.3.1 目的与意义 |
| 1.3.2 主要研究内容与技术路线 |
| 第2章 百草枯单克隆抗体制备与酶联免疫检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 PQ-BSA完全抗原的制备 |
| 2.2.5 百草枯单克隆抗体的制备与质量评价 |
| 2.2.6 酶联免疫检测方法的建立 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 百草枯包被抗原的质量评价 |
| 2.3.2 单克隆抗体的质量评价 |
| 2.3.3 抗原和抗体最佳工作浓度粗筛结果 |
| 2.3.4 包被条件的确定 |
| 2.3.5 反应条件 |
| 2.3.6 显色时间确定 |
| 2.3.7 抗体最佳工作时间 |
| 2.3.8 抗原最佳包被浓度细筛 |
| 2.3.9 抗体最佳工作浓度细筛 |
| 2.3.10 抗体最佳工作量 |
| 2.3.11 标准曲线 |
| 2.3.12 重复性实验 |
| 2.3.13 精密度实验 |
| 2.3.14 回收率 |
| 2.3.15 最低检测限的测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 食品中百草枯免疫胶体金检测方法建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.2.4 免疫胶体金检测方法建立 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胶体金质量评估 |
| 3.3.2 金标抗体的最适pH值 |
| 3.3.3 金标抗体的最佳抗体量 |
| 3.3.4 包被抗原和羊抗鼠IgG的最佳浓度 |
| 3.3.5 最佳提取方法 |
| 3.3.6 百草枯标准溶液分析 |
| 3.3.7 韭菜样品的灵敏度和稳定性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 食品中百草枯残留的水凝胶可视化检测方法建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.2.4 水凝胶可视化检测方法的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 水凝胶的质量评价 |
| 4.3.2 胶体金最佳酸碱度和抗体标记量 |
| 4.3.3 水凝胶对胶体金的吸附性能 |
| 4.3.4 抗原和二抗的最佳包被浓度 |
| 4.3.5 灵敏度测定 |
| 4.3.6 高效液相法检测验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 存在问题与展望 |
| 参考文献 |
| 指导教师对研究生学位论文的学术评语 |
| 答辩委员会决议书 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食物过敏概述 |
| 1.2 食物过敏的原因及研究现状 |
| 1.2.1 主要过敏性食物及分类 |
| 1.2.2 食物过敏的危害 |
| 1.2.3 食物中过敏原的检测方法 |
| 1.3 酶联免疫分析 |
| 1.3.1 酶联免疫分析基本理论 |
| 1.3.2 酶联免疫分析原理 |
| 1.3.3 酶联免疫分析主要分类 |
| 1.3.4 酶联免疫分析的应用 |
| 1.4 牛乳主要过敏原 |
| 1.4.1 酪蛋白 |
| 1.4.2 α-乳白蛋白 |
| 1.4.3 β-乳球蛋白 |
| 1.5 本课题的研究目的和主要内容 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 主要内容 |
| 第2章 CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂、材料及仪器 |
| 2.2.1 实验试剂、材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 主要溶液的配制 |
| 2.2.4 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔抗血清的制备 |
| 2.3.2 兔免疫血清效价的测定 |
| 2.3.3 兔多抗血清的纯化 |
| 2.3.4 兔多克隆抗体效价的测定 |
| 2.3.5 兔多克隆抗体浓度的测定 |
| 2.3.6 兔多克隆抗体纯度的测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 兔免疫血清效价的测定 |
| 2.4.2 兔多克隆抗体纯度的测定 |
| 2.4.3 兔多克隆抗体浓度的测定 |
| 2.4.4 兔多克隆抗体效价的测定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 CN、α-LA和β-LG单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂、材料及仪器 |
| 3.2.1 实验试剂、材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 主要溶液的配制 |
| 3.2.4 实验动物、细胞 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 BALB/c小鼠的免疫 |
| 3.3.2 小鼠免疫血清效价的测定 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞株的筛选建立 |
| 3.3.3.1 骨髓瘤细胞SP2/0 的复苏与培养 |
| 3.3.3.2 阳性脾细胞的制备 |
| 3.3.3.3 细胞融合 |
| 3.3.3.4 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.3.3.5 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.3.4 单克隆抗体的大量生产 |
| 3.3.5 腹水纯化及效价的测定 |
| 3.3.6 单克隆抗体浓度的测定 |
| 3.3.7 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.3.8 单抗亚型鉴定 |
| 3.3.9 单抗亲和力鉴定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 BALB/c小鼠抗血清效价分析 |
| 3.4.2 杂交瘤细胞融合及阳性筛选 |
| 3.4.3 单抗效价结果分析 |
| 3.4.4 腹水纯化及纯度鉴定 |
| 3.4.5 单克隆抗体浓度的测定 |
| 3.4.6 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.4.7 单克隆抗体亚型/亚类鉴定 |
| 3.4.8 单克隆抗体亲和力的测定分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 CN、α-LA和β-LG双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂、材料及仪器 |
| 4.2.1 实验试剂、材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 主要溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 双抗夹心ELISA操作过程 |
| 4.3.2 酪蛋白双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.3.2.1 酪蛋白最优捕获抗体的筛选及酶标二抗工作浓度的优化 |
| 4.3.2.2 酪蛋白兔多抗工作浓度的优化 |
| 4.3.2.3 双抗夹心ELISA法检测酪蛋白标准曲线的建立 |
| 4.3.2.4 酪蛋白双抗夹心ELISA方法特异性的测定 |
| 4.3.2.5 酪蛋白双抗夹心ELISA方法精密度的测定 |
| 4.3.2.6 酪蛋白双抗夹心ELISA方法加标回收率的测定 |
| 4.3.3 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.3.3.1 α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选及兔多抗工作浓度的优化 |
| 4.3.3.2 α-乳白蛋白酶标二抗工作浓度的优化 |
| 4.3.3.3 双抗夹心ELISA法检测α-乳白蛋白标准曲线的建立 |
| 4.3.3.4 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法特异性的测定 |
| 4.3.3.5 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法精密度的测定 |
| 4.3.3.6 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法准确度的测定 |
| 4.3.4 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.3.4.1 β-乳球蛋白兔多抗工作浓度的优化 |
| 4.3.4.2 β-乳球蛋白酶标二抗工作浓度的优化 |
| 4.3.4.3 双抗夹心ELISA法检测β-乳球蛋白标准曲线的建立 |
| 4.3.4.4 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法特异性的测定 |
| 4.3.4.5 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法精密度的测定 |
| 4.3.4.6 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法准确度的测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 酪蛋白双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4.1.1 酪蛋白最优捕获抗体的筛选及酶标二抗工作浓度的优化 |
| 4.4.1.2 酪蛋白兔多抗最佳工作浓度的优化 |
| 4.4.1.3 双抗夹心ELISA法检测酪蛋白标准曲线的建立 |
| 4.4.1.4 酪蛋白双抗夹心ELISA方法特异性的测定 |
| 4.4.1.5 酪蛋白双抗夹心ELISA方法精密度的测定 |
| 4.4.1.6 酪蛋白双抗夹心ELISA方法准确度的测定 |
| 4.4.2 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4.2.1 α-乳白蛋白最优捕获抗体的筛选及兔多抗工作浓度的优化 |
| 4.4.2.2 α-乳白蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定 |
| 4.4.2.3 双抗夹心ELISA法检测α-乳白蛋白标准曲线的建立 |
| 4.4.2.4 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法特异性的测定 |
| 4.4.2.5 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法精密度的测定 |
| 4.4.2.6 α-乳白蛋白双抗夹心ELISA方法准确度的测定 |
| 4.4.3 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 4.4.3.1 β-乳球蛋白兔多抗最佳工作浓度的确定 |
| 4.4.3.2 β-乳球蛋白酶标二抗最佳工作浓度的确定 |
| 4.4.3.3 双抗夹心ELISA法检测β-乳球蛋白标准曲线的建立 |
| 4.4.3.4 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法特异性的测定 |
| 4.4.3.5 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法精密度的测定 |
| 4.4.3.6 β-乳球蛋白双抗夹心ELISA方法准确度的测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.1.1 动物性食品安全与兽药残留 |
| 1.1.2 氟甲喹概述 |
| 1.1.3 研究意义 |
| 1.2 喹诺酮类及氟甲喹检测方法的研究进展 |
| 1.2.1 喹诺酮类检测方法的研究进展 |
| 1.2.2 氟甲喹检测方法的研究进展 |
| 1.3 存在的主要问题 |
| 1.4 主要研究内容和方法 |
| 第二章 氟甲喹完全抗原合成及多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 缓冲溶液体系 |
| 2.1.3 仪器及设备 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 完全抗原的合成与鉴定 |
| 2.2.2 氟甲喹多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 完全抗原的合成与鉴定 |
| 2.3.2 氟甲喹多克隆抗体的制备及纯化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 氟甲喹残留的ELISA检测方法研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 缓冲溶液体系 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 包被原最适浓度和抗血清最适稀释度的确定 |
| 3.2.2 间接竞争ELISA反应体系条件的优化 |
| 3.2.3 间接竞争ELISA标准曲线的建立 |
| 3.2.4 ELISA方法的稳定性 |
| 3.2.5 抗体的特异性 |
| 3.2.6 样品的测定 |
| 3.2.7 ELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 包被原最适浓度和抗血清最适稀释度的确定 |
| 3.3.2 间接竞争ELISA反应体系条件的优化 |
| 3.3.3 间接竞争ELISA法标准曲线的建立 |
| 3.3.4 ELISA方法的稳定性 |
| 3.3.5 抗体的特异性 |
| 3.3.6 样品的测定 |
| 3.3.7 ELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 氟甲喹残留的固相膜免疫检测方法研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 仪器及设备 |
| 4.1.3 试验样品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 胶体金及金标抗体的制备 |
| 4.2.2 胶体金标记固相膜的制备 |
| 4.2.3 胶体金标记固相膜检测条件的优化 |
| 4.2.4 最低检出限的确定 |
| 4.2.5 样品的基质消除 |
| 4.2.6 样品的加标回收测定 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 胶体金的制备及质量鉴定 |
| 4.3.2 胶体金与FLU抗体结合最适pH值的确定 |
| 4.3.3 胶体金标记最佳抗体加入量的确定 |
| 4.3.4 胶体金标记固相膜检测条件的优化 |
| 4.3.5 最低检出限的确定 |
| 4.3.6 样品基质的消除 |
| 4.3.7 样品的加标回收测定结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 氟甲喹残留的仿生酶联免疫检测方法研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 药品及试剂 |
| 5.1.2 仪器及设备 |
| 5.1.3 实验样品 |
| 5.1.4 溶液体系的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 氟甲喹分子印迹膜(MIPs)的制备及表征 |
| 5.2.2 酶标抗原的制备 |
| 5.2.3 仿生酶联免疫分析方法的操作过程 |
| 5.2.4 BELISA反应体系条件的优化及方法的建立 |
| 5.2.5 样品检测 |
| 5.2.6 BELISA方法的验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 氟甲喹分子印迹膜的制备及表征 |
| 5.3.2 仿生酶联免疫分析方法的条件优化及建立 |
| 5.3.3 方法的特异性 |
| 5.3.4 样品测定 |
| 5.3.5 BELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.1.1 氟甲喹完全抗原的合成及多克隆抗体的制备 |
| 6.1.2 氟甲喹间接竞争ELISA检测方法的建立与应用 |
| 6.1.3 氟甲喹固相膜免疫检测方法的建立与应用 |
| 6.1.4 基于分子印迹技术的氟甲喹仿生酶联免疫检测方法的建立与应用 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 本研究的不足之处 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 附件 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 致病性大肠杆菌简介 |
| 1.2 肠出血性大肠杆菌O157: H7检测方法研究进展 |
| 1.2.1 常规的检测方法 |
| 1.2.2 基于PCR的分子生物学检测方法 |
| 1.2.3 免疫学检测方法 |
| 1.3 单增李斯特菌简介 |
| 1.4 单增李斯特菌检测方法研究进展 |
| 1.4.1 细菌分离鉴定法 |
| 1.4.2 分子生物学检测方法 |
| 1.4.3 免疫学检测方法 |
| 1.5 致病菌检测方法的存在问题及发展趋势 |
| 1.6 论文研究的目的及意义 |
| 1.7 论文研究的主要内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 常用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2 间接ELISA检测抗血清效价水平 |
| 2.2.3 抗体的纯化 |
| 2.2.4 大肠杆菌O157:H7双抗夹心ELISA检测方法的建立 |
| 2.2.5 胶体金试纸条检测方法的建立 |
| 2.2.6 单增李斯特菌单克隆抗体的制备 |
| 2.2.7 单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的建立 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 免疫后抗血清效价测定 |
| 3.2 纯化后抗血清效价测定 |
| 3.3 双抗夹心ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.1 捕获抗体与检测抗体的选择 |
| 3.3.2 捕获抗体包被量的优化 |
| 3.3.3 封闭液种类的优化 |
| 3.3.4 封闭液浓度的优化 |
| 3.3.5 封闭时间的优化 |
| 3.3.6 检测抗体稀释倍数的优化 |
| 3.3.7 检测抗体作用时间的优化 |
| 3.3.8 酶标二抗作用时间的优化 |
| 3.3.9 双抗夹心酶联免疫吸附试验检测法标准曲线的绘制 |
| 3.3.10 双抗夹心ELISA检测EHEC O157:H7的检测限和定量限 |
| 3.3.11 双抗夹心ELISA检测EHEC O157:H7的特异性 |
| 3.3.12 双抗体夹心酶联免疫检测方法实际样品检测 |
| 3.4 胶体金试纸条检测方法的建立 |
| 3.4.1 胶体金粒径的选择 |
| 3.4.2 检测线包被抗体浓度的优化 |
| 3.4.3 质控线包被抗体最佳浓度的优化 |
| 3.4.4 硝酸纤维素膜的优化 |
| 3.4.5 金标垫封闭液的优化 |
| 3.4.6 硝酸纤维素膜封闭液的优化 |
| 3.4.7 样品展开液的优化 |
| 3.4.8 胶体金免疫层析试纸条的工作条件 |
| 3.4.9 胶体金免疫层析试纸条特异性验证 |
| 3.4.10 试纸条对于实际样品的检测 |
| 3.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 单增李斯特菌重组蛋白可溶性分析 |
| 3.5.2 单增李斯特菌重组蛋白纯化结果 |
| 3.5.3 小鼠抗血清效价的测定 |
| 3.5.4 杂交瘤细胞株的筛选和克隆 |
| 3.6 单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的建立 |
| 3.6.1 捕获抗体与检测抗体组合的优化 |
| 3.6.2 捕获抗体包被量的优化 |
| 3.6.3 封闭液种类的优化 |
| 3.6.4 检测抗体稀释倍数的优化 |
| 3.6.5 双抗夹心ELISA检测方法标准曲线的绘制 |
| 3.6.6 单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的特异性 |
| 4 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 论文的创新点 |
| 4.3 论文的不足之处 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 大豆蛋白的研究现状 |
| 1.2 β-伴大豆球蛋白(Gly m5) |
| 1.2.1 β-伴大豆球蛋白的结构和性质 |
| 1.2.2 β-伴大豆球蛋白所引起的食物过敏 |
| 1.2.3 β-伴大豆球蛋白脱敏技术的研究进展 |
| 1.3 国内外β-伴大豆球蛋白的检测方法研究 |
| 1.3.1 液相色谱法 |
| 1.3.2 质谱法 |
| 1.3.3 PCR技术 |
| 1.3.4 免疫分析法 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 1.5 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 β-伴大豆球蛋白鼠源多克隆抗体的制备及其特性鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验溶液及配方 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 免疫原的制备 |
| 2.2.2 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 多克隆抗体的特性鉴定 |
| 2.2.4 多克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 天然抗原的SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.2 多克隆抗体的特性鉴定 |
| 2.3.3 多克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的制备及免疫学特性鉴定 |
| 3.1 材料和仪器 |
| 3.1.1 试剂及溶液 |
| 3.1.2 实验动物、骨髓瘤细胞及其他材料 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 |
| 3.2.3 β-伴大豆球蛋白鼠源单克隆抗体的制备 |
| 3.2.4 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.2.5 阳性细胞株培养上清、腹水效价测定 |
| 3.2.6 单克隆抗体敏感性测定 |
| 3.2.7 单克隆抗体亲和常数测定 |
| 3.2.8 单克隆抗体特异性测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 β-伴大豆球蛋白鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.2 抗体纯化前后电泳鉴定 |
| 3.3.3 阳性细胞株培养上清、腹水效价测定 |
| 3.3.4 敏感性测定 |
| 3.3.5 亲和常数测定 |
| 3.3.6 亚型鉴定 |
| 3.3.7 特异性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 表面增强拉曼散射免疫层析试纸方法的研究 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.1.1 试剂与溶液 |
| 4.1.2 主要仪器及来源 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 胶体金标记抗体的制备 |
| 4.2.2 拉曼免疫探针的制备 |
| 4.2.3 免疫层析试纸的组装 |
| 4.2.4 双抗夹心法检测β-伴大豆球蛋白方法的建立 |
| 4.2.5 表面增强拉曼散射免疫层析方法(SERS-LFA)的建立 |
| 4.2.6 双抗夹心ELISA法对试纸条方法的确证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 金标探针的制备 |
| 4.3.2 间接法确定胶体金标记抗体的灵敏度 |
| 4.3.3 双抗夹心法的检测方法 |
| 4.3.4 拉曼免疫探针的制备 |
| 4.3.5 表面增强拉曼散射层析试纸方法 |
| 4.3.6 表面增强拉曼试纸的准确性 |
| 4.3.7 双抗体夹心ELISA方法的验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介、攻读硕士期间取得的成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 食物过敏概述 |
| 1.1.1 食物过敏的历史 |
| 1.1.2 食物过敏与公共卫生 |
| 1.1.3 食物过敏与食品安全 |
| 1.2 食物过敏危害性 |
| 1.2.1 食物过敏的分子机制 |
| 1.2.2 食物过敏的流行病学 |
| 1.2.3 食物过敏的防治 |
| 1.3 食物过敏的物质基础 |
| 1.3.1 食物过敏原的分类 |
| 1.3.2 食物过敏原的结构 |
| 1.3.3 食物过敏原的表位定位 |
| 1.4 食物过敏原的风险评估与管理 |
| 1.4.1 食物过敏原致敏性评价 |
| 1.4.2 食物过敏的阈值 |
| 1.4.3 食物过敏原的标识 |
| 1.4.4 过敏食物的召回 |
| 1.5 牛乳过敏 |
| 1.5.1 牛乳过敏流行病学 |
| 1.5.2 牛乳中的主要过敏原蛋白 |
| 1.5.3 牛乳过敏原的结构与致敏性 |
| 1.6 牛乳β-乳球蛋白 |
| 1.6.1 β-乳球蛋白的理化性质 |
| 1.6.2 β-乳球蛋白表位的研究 |
| 1.7 食物过敏原检测技术进展及对β-乳球蛋白的检测 |
| 1.7.1 色谱学方法 |
| 1.7.2 免疫学方法 |
| 1.7.3 检测产品与市场 |
| 1.8 检测方法发展方向 |
| 1.8.1 检测速度更快 |
| 1.8.2 检测灵敏度更高 |
| 1.8.3 便携式检测 |
| 1.8.4 经济、环保检测材料 |
| 1.8.5 高通量检测 |
| 1.8.6 新型抗体以及核酸适配体 |
| 1.9 立题背景与研究内容 |
| 1.9.1 立题背景 |
| 1.9.2 研究内容 |
| 第2章 牛乳β-乳球蛋白IgE表位串联体多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 溶液的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 原核表达制备β-乳球蛋白表位串联体重组蛋白 |
| 2.3.2 核酸测序 |
| 2.3.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.3.4 Western blotting |
| 2.3.5 纯化重组蛋白 |
| 2.3.6 兔抗β-乳球蛋白表位串联体多克隆抗体的制备 |
| 2.3.7 间接ELISA测定抗体效价 |
| 2.3.8 兔抗β-乳球蛋白表位串联体血清对表位肽的识别 |
| 2.3.9 兔抗β-乳球蛋白表位串联体多克隆抗体特异性分析 |
| 2.3.10 亲和纯化兔抗β-乳球蛋白表位串联体特异性抗体 |
| 2.3.11 数据统计与分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 pGEX-4T-1-tan测序结果 |
| 2.4.2 原核表达SDS-PAGE电泳图 |
| 2.4.3 Western blotting分析串联体重组蛋白 |
| 2.4.4 表位串联体重组蛋白的纯化结果 |
| 2.4.5 免疫过程中兔抗血清效价的变化 |
| 2.4.6 抗体对表位肽的识别 |
| 2.4.7 抗体特异性 |
| 2.4.8 Sepharose4B免疫亲和柱的制备 |
| 2.4.9 亲和纯化特异性抗体 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 表位串联体 |
| 2.5.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.5.3 抗体的制备 |
| 2.5.4 抗体的纯化及其免疫学特性 |
| 2.5.5 β-乳球蛋白表位串联体蛋白多克隆抗体的潜在应用 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 牛乳β-乳球蛋白IgE线性表位单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 制备单克隆抗体 |
| 3.3.2 亲和纯化单克隆抗体 |
| 3.3.3 单克隆抗体表征 |
| 3.3.4 数据统计与分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 亲和纯化单克隆抗体 |
| 3.4.2 抗体IgG类/亚类鉴定 |
| 3.4.3 抗体对表位肽和阻断肽的识别 |
| 3.4.4 抗体亲和力的检测 |
| 3.4.5 抗体1P1 对变性β-乳球蛋白的识别 |
| 3.4.6 抗体特异性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 表位的选择 |
| 3.5.2 表位抗体与表位的识别 |
| 3.5.3 表位单克隆抗体 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 基于β-乳球蛋白多抗及串联体多抗夹心ELISA方法的构建与应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 溶液的配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 亲和纯化β-乳球蛋白特异性抗体 |
| 4.3.2 生物素标记串联体多克隆抗 |
| 4.3.3 竞争ELISA |
| 4.3.4 sELISA方法的程序 |
| 4.3.5 sELISA方法条件的优化 |
| 4.3.6 sELISA方法检测性能评价 |
| 4.3.7 检测样品 |
| 4.3.8 反相高效液相分析 |
| 4.3.9 Tricine-SDS-PAGE电泳 |
| 4.3.10 数据统计与分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 抗体对表位肽的识别 |
| 4.4.2 夹心ELISA条件的优化 |
| 4.4.3 sELISA方法标准曲线的建立 |
| 4.4.4 sELISA方法的准确度与精密度 |
| 4.4.5 sELISA方法的特异性 |
| 4.4.6 检测样品 |
| 4.4.7 婴幼儿水解低致敏配方奶粉的检测结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 封阻条件与非特异性吸附 |
| 4.5.2 对水解奶粉中β-乳球蛋白致敏性残基的检测 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 基于纳米铂探针夹心ELISA方法检测β-乳球蛋白 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 溶液的配制 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 亲和纯化抗体 |
| 5.3.2 纳米铂探针制备方法 |
| 5.3.3 生物素化IgG与纳米铂偶联比的优化 |
| 5.3.4 普通sELISA方法的程序 |
| 5.3.5 基于纳米铂探针sELISA方法条件的优化 |
| 5.3.6 sELISA方法检测性能分析 |
| 5.3.7 纳米铂探针储存性研究 |
| 5.3.8 检测样品 |
| 5.3.9 Tricine-SDS-PAGE电泳 |
| 5.3.10 数据统计与分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 扫描电镜分析 |
| 5.4.2 Bio-IgG与纳米铂偶联比的确定 |
| 5.4.3 纳米铂探针sELISA条件的优化 |
| 5.4.4 sELISA方法标准曲线的建立 |
| 5.4.5 纳米铂探针sELISA方法的准确度与精密度 |
| 5.4.6 纳米铂探针sELISA方法的特异性 |
| 5.4.7 纳米铂探针储存性研究 |
| 5.4.8 检测样品 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 纳米铂在检测方法中的应用 |
| 5.5.2 纳米铂探针sELISA方法与其它检测方法的对比 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 基于双氧水敏感型量子点荧光免疫吸附法检测β-乳球蛋白 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与设备 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 仪器与设备 |
| 6.2.3 溶液的配制 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 亲和纯化抗体 |
| 6.3.2 生物素化IgG |
| 6.3.3 普通sELISA程序 |
| 6.3.4 对CdTe QDs的表征 |
| 6.3.5 制备链霉亲和素-过氧化氢酶偶联物 |
| 6.3.6 对SA-CAT偶联物的表征 |
| 6.3.7 基于荧光淬灭sELISA方法条件的优化 |
| 6.3.8 荧光sELISA方法检测性能分析 |
| 6.3.9 检测样品 |
| 6.3.10 Tricine-SDS-PAGE电泳 |
| 6.3.11 数据统计与分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 对CdTe QDs的表征 |
| 6.4.2 对SA-CAT的表征 |
| 6.4.3 荧光sELISA条件的优化 |
| 6.4.4 荧光sELISA方法标准曲线的建立 |
| 6.4.5 荧光sELISA方法的准确度与精密度 |
| 6.4.6 荧光sELISA方法的特异性 |
| 6.4.7 检测样品 |
| 6.5 讨论 |
| 6.5.1 双氧水敏感型量子点在检测方法中的应用 |
| 6.5.2 表位单克隆抗体在检测方法中的应用 |
| 6.6 小结 |
| 第7章 基于固定化抗体夹心ELISA方法检测β-乳球蛋白 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与设备 |
| 7.2.1 材料与试剂 |
| 7.2.2 仪器与设备 |
| 7.2.3 溶液的配制 |
| 7.3 方法 |
| 7.3.1 亲和纯化抗体 |
| 7.3.2 胶体金探针制备方法 |
| 7.3.3 胶体金粒径及与抗体偶联比的确定 |
| 7.3.4 基于固定化抗体sELISA方法条件的优化 |
| 7.3.5 sELISA方法检测性能分析 |
| 7.3.6 普通sELISA方法的程序 |
| 7.3.7 检测样品 |
| 7.3.8 Tricine-SDS-PAGE电泳 |
| 7.3.9 数据统计与分析 |
| 7.4 结果 |
| 7.4.1 扫描电镜分析 |
| 7.4.2 胶体金粒径以及与Bio-IgG偶联比的确定 |
| 7.4.3 固定化抗体sELISA条件的优化 |
| 7.4.4 胶体金探针sELISA方法标准曲线的建立 |
| 7.4.5 胶体金探针sELISA方法的准确度与精密度 |
| 7.4.6 胶体金探针sELISA方法的特异性 |
| 7.4.7 检测样品 |
| 7.5 讨论 |
| 7.5.1 胶体金在检测方法中的应用 |
| 7.5.2 抗体固定化在检测方法中的应用 |
| 7.6 小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 本研究的创新点 |
| 8.3 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 瓜类细菌性果斑病菌概述 |
| 1.2 单克隆抗体技术概述 |
| 1.2.1 单克隆抗体技术简介 |
| 1.2.2 抗体的制备方式 |
| 1.3 免疫层析技术简介 |
| 1.3.1 免疫层析技术的原理 |
| 1.3.2 层析试纸条技术的示踪标记物 |
| 1.4 瓜类果斑病菌检测及防治技术进展 |
| 1.4.1 检测技术 |
| 1.4.2 防治方法 |
| 1.4.3 小结 |
| 1.5 研究内容及意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 第二章 果斑病菌免疫原的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株鉴定 |
| 2.2.2 免疫菌株选择及培养基优化 |
| 2.2.3 免疫原制备 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株鉴定 |
| 2.3.2 免疫菌株选择 |
| 2.3.3 免疫菌株培养基优化 |
| 2.3.4 免疫原制备 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 抗果斑病菌单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA法的研制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验动物及细胞 |
| 3.1.3 试剂与耗材 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠免疫方式 |
| 3.2.2 细胞融合及筛选 |
| 3.2.3 腹水制备及亚型测定 |
| 3.2.4 抗体纯化及纯度测定 |
| 3.2.5 抗体效价测定 |
| 3.2.6 单克隆抗体的特异性分析 |
| 3.2.7 单克隆抗体的HRP酶标记 |
| 3.2.8 双抗体夹心ELISA法的建立 |
| 3.2.9 双抗体夹心ELISA法的特异性 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 小鼠血清效价 |
| 3.3.2 单克隆抗体筛选 |
| 3.3.3 单克隆抗体的亚型测定 |
| 3.3.4 单克隆抗体的效价测定 |
| 3.3.5 单克隆抗体的SDS-PAGE分析 |
| 3.3.6 单克隆抗体的特异性 |
| 3.3.7 酶标记抗体的效果测定 |
| 3.3.8 双抗体夹心ELISA法的检测特异性 |
| 3.3.9 双抗体夹心ELISA法的检测灵敏度 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 基于抗体自配对的胶体金免疫层析试纸条的研制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 试剂与耗材 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 胶体金的制备 |
| 4.2.2 胶体金标记抗体的条件优化 |
| 4.2.3 金标抗体的制备 |
| 4.2.4 试纸条的组装及结果判读 |
| 4.2.5 试纸条的灵敏度 |
| 4.2.6 试纸条的特异性 |
| 4.2.7 试纸条的稳定性 |
| 4.2.8 实际样品检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抗体标记条件的优化 |
| 4.3.2 金标抗体的波长扫描 |
| 4.3.3 检测线浓度的优化 |
| 4.3.4 试纸条的特异性 |
| 4.3.5 试纸条的灵敏度 |
| 4.3.6 试纸条的稳定性 |
| 4.3.7 试纸条检测实际样品 |
| 4.3.8 常规PCR法检测实际样品 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 基于抗原标记的荧光免疫层析试纸条的研制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂与耗材 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 改良的培养基培养细菌 |
| 5.2.2 改良培养基对果斑病菌生长的影响 |
| 5.2.3 最佳FITC浓度的优化 |
| 5.2.4 免疫荧光试纸条的组装及结果判读 |
| 5.2.5 试纸条的灵敏度及稳定性 |
| 5.2.6 试纸条的特异性 |
| 5.2.7 试纸条检测模拟带菌样品 |
| 5.2.8 试纸条检测实际样品 |
| 5.2.9 常规PCR法验证试纸条的检测准确性 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 改良培养基对细菌生长的影响 |
| 5.3.2 最佳FITC浓度的优化 |
| 5.3.3 细菌的荧光效果观察 |
| 5.3.4 检测线浓度的优化 |
| 5.3.5 荧光试纸条的灵敏度及稳定性 |
| 5.3.6 荧光试纸条的特异性 |
| 5.3.7 荧光试纸条检测模拟带菌样品 |
| 5.3.8 荧光试纸条检测实际样品 |
| 5.3.9 常规PCR法验证试纸条检测模拟带菌样品的准确性 |
| 5.3.10 常规PCR法验证试纸条检测实际样品的准确性 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 基于抗原抗体双标记的免疫荧光试纸条的研制 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 实验菌株 |
| 6.1.2 主要试剂与耗材 |
| 6.1.3 主要仪器设备 |
| 6.1.4 试剂配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 单抗4F的荧光素标记 |
| 6.2.2 细菌培养及样品预处理 |
| 6.2.3 试纸条的组装及结果判读 |
| 6.2.4 荧光抗体使用量的确定 |
| 6.2.5 试纸条的灵敏度及稳定性 |
| 6.2.6 试纸条的特异性 |
| 6.2.7 模拟带菌样品检测 |
| 6.2.8 常规PCR法检测果斑病菌的灵敏度 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 抗体标记效果的检测 |
| 6.3.2 荧光抗体使用量的优化 |
| 6.3.3 试纸条的灵敏度 |
| 6.3.4 试纸条的特异性 |
| 6.3.5 试纸条的稳定性 |
| 6.3.6 试纸条检测西瓜样品 |
| 6.3.7 常规PCR法验证荧光试纸条检测实际样品的准确性 |
| 6.3.8 常规PCR法检测果斑病菌的灵敏度 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果 |
| 致谢 |
| 1 酶联免疫吸附法的概述 |
| 1.1 基本原理 |
| 1.2 类型和形式 |
| 2 酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用 |
| 2.1 农药残留的检测 |
| 2.2 动物中兽药残留的检测 |
| 2.3 食品中违禁添加物的检测 |
| 2.4 食物中病原微生物的应用 |
| 2.5 在生物毒素中的测定 |
| 2.6 转基因食品的检测 |
| 2.7 食品中其他成分的检测 |
| 3 ELISA在食品安全检测中的局限性和应用展望 |
| 英文缩写词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 牛初乳简介 |
| 1.1.1 牛初乳的营养成分 |
| 1.1.2 牛初乳的功能性组分 |
| 1.1.3 牛初乳的生理功能 |
| 1.2 免疫球蛋白简介 |
| 1.2.1 免疫球蛋白的结构 |
| 1.2.2 免疫球蛋白的稳定性 |
| 1.3 免疫球蛋白测定方法的研究进展 |
| 1.3.1 紫外分光光度法 |
| 1.3.2 高效液相色谱法 |
| 1.3.3 免疫比浊法 |
| 1.3.4 免疫扩散法 |
| 1.3.5 火箭免疫电泳法 |
| 1.3.6 酶联免疫吸附法 |
| 1.3.7 胶体金免疫层析法 |
| 1.4 免疫磁珠的研究进展 |
| 1.4.1 免疫磁珠 |
| 1.4.2 免疫磁珠的应用 |
| 1.5 本课题研究的目的和意义 |
| 1.6 研究的主要内容 |
| 第二章 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.1 材料和设备 |
| 2.1.1 试剂与耗材 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 复苏杂交瘤细胞 |
| 2.2.2 制备单克隆抗体 |
| 2.2.3 纯化腹水 |
| 2.2.4 单抗特性鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 单抗亚类鉴定结果 |
| 2.3.2 腹水单抗纯化结果 |
| 2.3.3 纯化后单抗纯度鉴定 |
| 2.3.4 纯化前后单抗效价测定结果 |
| 2.3.5 亲和力测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 单抗的制备 |
| 2.4.2 单抗纯化方法 |
| 2.4.3 单抗的亲和力 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料和设备 |
| 3.1.1 试剂与试剂 |
| 3.1.2 仪器与设备 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 双抗夹心ELISA法的建立 |
| 3.2.2 标准曲线的建立 |
| 3.2.3 最低限测限 |
| 3.2.4 精密度 |
| 3.2.5 加标回收率检测 |
| 3.2.6 实际样品检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 双抗ELISA法的优化结果 |
| 3.3.2 标准曲线的建立 |
| 3.3.3 最低检出限 |
| 3.3.4 精密度 |
| 3.3.5 加标回收率 |
| 3.3.6 实际样品检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于酶联免疫法 |
| 3.4.2 关于检测方法的条件优化 |
| 3.4.3 关于实际样品检测 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 磁珠双抗体夹心ELISA方法的建立 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 制备磁珠单抗偶联物 |
| 4.2.2 建立磁珠的双抗ELISA方法 |
| 4.2.3 标准曲线的建立 |
| 4.2.4 最低检测限 |
| 4.2.5 精密度 |
| 4.2.6 加标回收率 |
| 4.2.7 实际样品检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 磁珠双抗夹心ELISA法的优化结果 |
| 4.3.2 标准曲线的建立 |
| 4.3.3 最低检测限 |
| 4.3.4 精密度 |
| 4.3.5 加标回收率 |
| 4.3.6 实际样品检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于磁珠 |
| 4.4.2 与双抗夹心ELISA法比较 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表文章 |
