胡坤敏[1]（2020）在《三种并殖吸虫囊蚴的多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理目的:建立一种能特异性鉴别卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫及三平正并殖吸虫囊蚴的荧光定量PCR方法,并将该方法在我国4省并殖吸虫病流行区进行初步评价。方法:1、通过GenB ank TM下载卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的CO1序列进行比对分析,设计了3对特异性引物和探针,可特异性的鉴别上述三种并殖吸虫。2、对三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR引物浓度、探针浓度和退火温度进行优化,分别建立了卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的单重荧光定量PCR鉴定检测方法,并进行特异性实验、灵敏度实验和建立了相应的标准曲线。3、使用与单重荧光定量PCR方法相同的引物和探针,并对其浓度进行优化,建立同时鉴别检测卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的多重荧光定量PCR检测方法,并进行特异性实验、灵敏度实验和建立了相应的标准曲线。4、采集来自安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县陡门乡、河南省济源市邵原镇、福建省政和县岭腰乡及漳州市南靖县和溪镇的并殖吸虫囊蚴,提取囊蚴DNA后,使用常规PCR方法和多重荧光定量PCR方法同时分类鉴定采集的囊蚴样本,评估多重荧光定量PCR方法的分类鉴定能力。结果:1、构建的阳性质粒分别与GenBankTM中发表的卫氏并殖吸虫（AY140692.1）、斯氏并殖吸虫（AY618798.1）、三平正并殖吸虫（AF159594.1）序列相似性分别为99.65%、98.17%、98.85%。2、卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的单重荧光定量PCR方法仅对目的基因有扩增曲线,对其他寄生虫无特异性扩增。在灵敏度试验中,三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR检测的DNA最低浓度分别达到卫氏并殖吸虫30.5 copies/μL、斯氏并殖吸虫32.1 copies/μL、三平正并殖吸虫0.322 copies/μL。单重荧光定量PCR扩增效率、扩增曲线方程式及相关系数分别为:卫氏并殖吸虫E=96.6%、Y=-6.8128x+37.059、R2=0.9998;斯氏并殖吸虫 E=91.8%、Y=-7.0721x+45.106、R2=0.9997;三平正并殖吸虫E=105.40%、Y=-6.3993x+33.957、R2=0.9995。可见本研究建立的三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR方法满足荧光定量的基本参数,且具有较高的特异性和灵敏度。3、本研究建立的多重荧光定量PCR方法能同时特异性扩增卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的目的基因片段,而其他寄生虫无特异性扩增。在灵敏度试验中,多重荧光定量PCR方法检测到的最低浓度为:卫氏并殖吸虫3.05×102 copies/μL、斯氏并殖吸虫 3.21×103 copies/μL、三平正并殖吸虫3.22×102 copies/μL。多重荧光定量PCR方法建立的相关系数、扩增效率及标准曲线方程分别为:卫氏并殖吸虫R2=0.9984,E=85.8%,Y=-3.7082x+27.501;斯氏并殖吸虫R2=0.9974,E=97.5%,Y=-3.3715x+33.68;三平正并殖吸虫 R2=0.9938,E=93.0%,Y=-3.5608x+18.874。因此,本研究建立的多重荧光定量PCR方法满足荧光定量的基本参数,且具有较高的特异性和灵敏度。4、多重荧光定量PCR方法鉴定5个调查点的样本结果分析显示:安徽省休宁县蓝田镇和浙江省永嘉县陡门乡的并殖吸虫囊蚴DNA在FAM通道（465-510）显示阳性结果（图2.4 A）,而其他均为阴性;河南省济源市邵原镇和福建省政和县岭腰乡的并殖吸虫囊蚴DNA在VIC通道（533-580）显示阳性结果（图2.4 B）,而其他均为阴性;福建省漳州市南靖县和溪镇的并殖吸虫囊蚴DNA在CY5通道（618-660）显示阳性结果（图2.4 C）,而其他均为阴性。结果表明多重荧光定量PCR方法鉴定安徽省休宁县和浙江省永嘉县的并殖吸虫囊蚴为卫氏并殖吸虫,河南省济源市和福建省政和县的并殖吸虫囊蚴为斯氏并殖吸虫,福建省漳州市的并殖吸虫囊蚴为三平正并殖吸虫。5、采用多重荧光定量PCR方法与常规PCR后测序方法同时分类鉴定65份囊蚴样本。结果显示,多重荧光定量PCR方法对采集的并殖吸虫囊蚴样本的分类鉴定率为100%（65/65）,而常规PCR后测序方法对采集的并殖吸虫囊蚴样本的分类鉴定率为72.31%（47/65）,常规PCR方法中显示阳性的结果在多重荧光定量PCR方法中均显示阳性,显示阴性的结果经加量测序分析或形态学鉴定,鉴定结果均与多重荧光定量PCR方法鉴定结果一致。该结果表明多重荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度和特异性。6、安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县陡门乡、河南省济源市邵原镇、福建省政和县岭腰乡、福建省漳州市南靖县和溪镇5个调查点的溪蟹阳性率分别为82%（49/60）、41%（29/70）、55%（41/74）、65%（41/63）和 45%（32/71）。经形态学鉴定,5个地区的并殖吸虫囊蚴虫种分别为卫氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫。经常规PCR后分子鉴定分析:安徽省和浙江省两地区采集的并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1基因序列与卫氏并殖吸虫ITS2、CO1 基因（KC417492.1,AF219379.2）相似性最高,分别为 99%～100%、96%～99%,均与卫氏并殖吸虫聚为一支;河南省采集的并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1基因序列与斯氏并殖吸虫ITS2、CO1基因（KX129924.1,MK568551.1）相似性最高,分别为98%～100%、95%～99%,均与斯氏并殖吸虫聚为一支;福建政和县采集的并殖吸虫囊蚴ITS2基因序列与斯氏并殖吸虫ITS2基因（KX129924.1）的相似性最高,为98%～100%,与斯氏并殖吸虫、宫崎并殖吸虫聚为一大支（两虫种分支不明显）,CO1基因序列与宫崎并殖吸虫CO1基因（AY618823.1,AY618834.1）相似性最高,为91%～94%,与宫崎并殖吸虫聚为一小支,而与斯氏并殖吸虫聚为一大支（两虫种分支较为明显）;福建省漳州市南靖县和溪镇溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2基因序列与卫氏并殖吸虫ITS2基因（KC417492.1）的相似性最高,达100%,CO1基因序列与三平正并殖吸虫CO1基因（AF159595.1）的相似性最高,为97%～99%,ITS2、CO1序列均与三平正并殖吸虫聚为一支。此结果表明无论是形态学鉴定,还是分子序列分析鉴定,结果均与多重荧光定量PCR方法鉴定结果一致,进一步证明了多重荧光定量PCR方法的高灵敏性和强特异性。结论:本研究建立的多重荧光定量PCR方法能够对溪蟹中并殖吸虫囊蚴样本进行快速鉴别。此方法的建立对并殖吸虫的分类研究提供了技术支持,开辟了并殖吸虫囊拗鉴定检测方法的新路径,对并殖吸虫的分类、地理分布、流行病学调查、食品安全、检疫具有重要应用价值。
顾梦杰,李友松,董惠芬,赵琴平[2]（2019）在《并殖吸虫的分类和遗传多样性研究概述》文中研究表明并殖吸虫是肺吸虫病的病原体。随着大量新种的报道,单一的形态学依据难以准确区分虫种,结合生活史各阶段虫体形态的多特征分析成为了鉴别虫种的主要方法。此外,利用不同的分子标记,不仅为并殖吸虫的系统分类补充了更有力的证据,亦为其遗传进化的相关研究提供了更丰富的信息。本文将对并殖吸虫的分类和遗传多样性的研究进展进行综述。
陈少华[3]（2012）在《Sinopotamon wanzaiense胃磨形态发育研究及其在分类上的意义》文中研究表明目的：研究不同发育阶段雌雄万载华溪蟹（Sinopotamon wanzaiense）胃磨形态结构的差异，深入探讨淡水蟹类胃磨形态在分类中的意义。方法：1.分类确定采自江西省靖安县三爪仑采育林场的S.wanzaiense。2.在体视显微镜下比较观察不同发育阶段的雌雄S.wanzaiense胃磨形态；拍照、绘制不同发育阶段雌雄S.wanzaiense的胃磨；定义胃磨结构特征性指标并用SDC软件（1.2版）测量，统计分析其测量数值。3.筛选有效的分类指标。4.建立不同生长发育阶段S.wanzaiense胃磨的生长曲线及生长方程。5.探讨S.wanzaiense的胃磨形态结构的系列发育特征及其在分类中的意义。结果：体视显微镜下比较观察S.wanzaiense胃磨形态，结果显示雌雄S.wanzaiense胃磨形态高度相似，且不同发育阶段的S.wanzaiense胃磨形态结构相似。统计分析所测得的S.wanzaiense胃磨特征性形态指标值，表明雌雄S.wanzaiense胃磨形态高度相似，且不同发育阶段的S.wanzaiense胃磨形态结构相似，与体视显微镜下比较观察的结果一致。此外，本实验证实S.wanzaiense胃磨形态特征性指标和头胸甲长（年龄）呈线性相关。结论：不同发育阶段的雌雄S.wanzaiense个体胃磨形态结构相似，其特征性指标和头胸甲长（年龄）呈线性相关，研究结果证实其胃磨结构种内稳定，可作为一种新的形态学分类指标，是目前以雄性第一腹肢为主要分类依据的有益补充。
贾万忠,闫鸿斌,史万贵,郭爱疆,詹芳[4]（2011）在《吸虫线粒体基因组及其应用研究进展》文中提出吸虫病（Trematodiasis）如血吸虫病、肝片形吸虫病等是一类重要的人兽共患寄生虫病,在我国和世界各地普遍流行,危害严重。本文将对吸虫线粒体基因组全序列分析的研究进展、应用和今后的发展方向作一综述。目前,已完成包括复殖亚纲10个种和单殖亚纲4个种总计14种吸虫线粒体基因组全序列测定。吸虫线粒体基因组碱基组成、基因结构与排列、基因变异等分析结果为线粒体功能基因组学研究、比较基因组学研究、分子分类学研究、物种起源、分子系统发育与进化分析及其疾病诊断等提供了重要依据和指导作用。线粒体基因组序列分析有助于解决一些新近发现的种如三平并殖吸虫、中华血吸虫等独立种的分类地位;而怡乐村并殖吸虫和佐渡并殖吸虫是大平并殖吸虫的同物异名吸虫。日本片形吸虫与大片形吸虫的cox1基因序列完全一致,这些日本片形吸虫应为大片形吸虫;大片形吸虫不同株虽然在cox1基因序列上无差异,但nad1基因却有8.3%变异性,这表明大片形吸虫不同株中可能存在隐蔽种。总之,线粒体基因组序列可为吸虫虫种与虫株的分类学地位的确定提供重要依据。同时,人们可根据线粒体基因组序列,通过PCR方法有效地对临床上易混淆的吸虫的种、株或群等作出确切的鉴别与诊断,从而为吸虫病流行病学调查和防治工作等提供重要参考依据。
朱春潮[5]（2010）在《武夷山脉Potamidae和Parathelphusidae淡水蟹类的动物地理学意义》文中指出目的：对武夷山脉地区淡水蟹类物种进行系统整理,分析武夷山脉地区淡水蟹类物种多样性及其滋生地的特点,探讨其动物地理学意义。方法：基于检视与比对武夷山脉淡水蟹类模式标本（Holotype）的工作基础并参考文献资料,实地采集了武夷山脉全境99个样点标本,并采用形态学方法进行分类与整理。结论：研究发现,武夷山脉地区分布有淡水蟹类5属33种,其种数占中国地区淡水蟹总量的11.7%（33/282）,其中87.9%（29/33）的淡水蟹,有29种淡水蟹仅见于分布在山脉的东西两侧,可能是因为受海拔较高的武夷山脉阻隔的影响,从而印证了淡水蟹大多以山（水）系分布为主要特征的地理分布格局,显示山脉对淡水水生生物一淡水蟹具有明显的阻隔与生殖隔离作用。研究还显示,有4种淡水蟹可分布于武夷山脉的两侧,分析可能的原因之一,在该种淡水蟹分布地域的山体间,均存在低海拔隘口,并且此地两侧的水系均相连通,客观上造就了淡水蟹沿水系扩散的自然条件。同时,实地考察和对资料的分析都表明,武夷山脉不同海拔高度所形成的地势、地貌及其植被、气候、温度等的不同与变化,也对淡水蟹种群的滋生繁衍具有明显的影响,从而使不同种属的淡水蟹选择性地存在于其适宜的特定微生态自然地理环境中。
杨振兴[6]（2010）在《云南省异盘并殖吸虫的形态和分子标记研究》文中研究说明[目的]在形态学分类的基础上,结合DNA序列分析的方法深入研究异盘并殖吸虫的虫种独立性,及其在并殖科吸虫中的分类学地位,建立基因进化树,确定云南省异盘并殖吸虫与其他地区相同或不同虫种间的亲缘关系,逐步澄清并殖科吸虫的虫种争议,探讨更加客观和易于鉴定的分类学方法,并为进一步研究各虫种的生物学特性、地理分布、对人体的致病性,以及开展相关的防治工作奠定重要基础,为云南省并殖吸虫的研究和并殖吸虫病的防治提供有价值的科学依据。[方法]从异盘并殖吸虫流行区采集溪蟹,经分类鉴定后分离囊蚴,感染实验动物大白鼠获得成虫和虫卵。观察囊蚴、成虫及虫卵形态,并测量其大小；扫描电镜观察成虫的皮棘形态特征。用试剂盒分别提取囊蚴和成虫的DNA，利用ITS2和CO1引物体外扩增获得ITS2和CO1基因序列,通过GenBank的Blast程序和DNASTAR的MagAlign程序进行基因的同源性分析,使用MAGE 4.0软件构建基因进化树。[结果]本次共采集到两类溪蟹,分类地位隶属于溪蟹总科,溪蟹科,溪蟹属,分别为景洪溪蟹和毛足溪蟹；景洪溪蟹头胸甲表面较隆,暗红色,分区明显,前侧缘具有细齿10余个；两螯不对称,以右螯为大；雄性第1腹肢粗壮,倒数第2节长度约为末节的3.6倍,末缘似山峰样起伏,尖锐指向外方；雄性尾节三角形,雌性尾节半圆形。毛足溪蟹头胸甲表面扁平,暗褐色,具有短刚毛,前侧缘具有细齿13-15个；两螯稍不对称；第3颚足外肢有短鞭；雄性第1腹肢扁平,倒数第2节长度约为末节的3.0倍；雄性腹部呈三角形,尾节长三角形；雌性腹部卵圆形,尾节半圆形。异盘并殖吸虫活体成虫肉红色,作蛭样运动。轻压固定后呈椭圆形,虫体宽长比为1：1.56-2.12。口腹吸盘比为1.62-2.09：1,口吸盘明显大于腹吸盘。卵巢多位于腹吸盘左侧，前缘位于腹吸盘水平前后,分支细而多；子宫管状蟠曲成团,与卵巢并列、大于卵巢,其前缘多超过腹吸盘水平,并与腹吸盘部分或完全重叠。睾丸分别位于卵巢和子宫团的下方,中心部较小,分支末端常有显着膨大。异盘并殖吸虫囊蚴多呈椭圆形,具有二层囊壁,外壁薄而均匀,内壁远较外壁厚且两极增厚明显,内外壁之间的间隙明显。异盘并殖吸虫虫卵多呈卵圆形,金黄色,绝大多数两侧对称；卵壳厚薄不均匀,末端增厚明显；卵盖位于较宽一端,肩峰多明显；扫描电镜观察成虫体表被有单生型皮棘,虫体前中部皮棘密集,排列规则；虫体后部皮棘稀疏,排列不规则,形状似尖刀状或三角形；口吸盘内壁为纵向皱襞,腹吸盘内壁为环形皱襞。通过Blast同源性比较,来自中国云南与印度Arunachal和Manipur地区的异盘并殖吸虫ITS2基因同源性为98%,与泰国Saraburi地区的异盘并殖吸虫ITS2同源性99%,与中国云南的丰宫和印度的卫氏并殖吸虫ITS2同源性分别为95%和93%；来自中国云南与泰国、越南、中国广西地区的异盘并殖吸虫CO1基因同源性为98%,与来自印度的异盘并殖吸虫CO1基因同源性为91%。ITS2和CO1基因进化树显示已报道的所有异盘并殖吸虫聚为一支,与其它虫种间差异明显。[结论]云南的景洪溪蟹和毛足溪蟹是异盘并殖吸虫的第二中间宿主。家猫对异盘并殖吸虫的易感性明显优于SD大鼠,家猫是异盘并殖吸虫的理想实验动物模型；而大鼠则不理想。云南省存在的异盘并殖吸虫与其它地区报道的异盘并殖吸虫无明显形态学差异。DNA序列分析显示来自不同地区的异盘并殖吸虫同源性极高,进化树上聚类为一支,独立于其它虫种之外。
梅浩砚,关飞,牛安欧[7]（2009）在《鄂赣浙3省10地并殖吸虫遗传变异的ITS2分析》文中认为目的对鄂赣浙3省10地12株并殖吸虫进行遗传变异检测,进一步为并殖吸虫分类提供证据。方法提取并殖吸虫的基因,采用一对特异引物3s’和BD2,经PCR特异扩增ITS2基因,PCR产物纯化后直接基因测序,分析遗传距离,并构建进化树。结果从DNA序列结果来看,12株并殖吸虫群体间存在种内和种间差异。大致可以将12株并殖吸虫分为三类:⑴江西武宁株、湖北赤壁株、湖北咸宁株和浙江兰亭株;（1）湖北五峰a株、湖北五峰b株、湖北走马a株、湖北走马b株、湖北五里株、湖北十堰株和湖北随州株;（3）湖北神农架株。结论湖北省内存在三种并殖吸虫:第一类为卫氏并殖吸虫;第二类为斯氏并殖吸虫;第三类为神农架并殖吸虫,且可能是一种新种。
梅浩砚[8]（2009）在《鄂赣浙3省10地12株并殖吸虫基因ITS2分析》文中指出并殖吸虫俗称肺吸虫,某些寄生于人体的虫体可引起并殖吸虫病（肺吸虫病）。并殖吸虫在分类上隶属于生物的真核总界、动物界、扁形动物门、吸虫纲、复殖目、并殖科。并殖吸虫种类命名甚多,存在同种异名和种名错定等诸多问题。并殖吸虫在东亚、东南亚、非洲和拉丁美州等国家广泛存在；中国各地也均有发现,主要在江南、西南与东北各地。从1879年Ringer首先在我国台湾发现人体病例130年以来,世界学者对并殖吸虫的特征、独立地位、地理分布和致病作用等存在分歧。主要以并殖吸虫成虫形态和生活史为依据的传统分类存在一定的局限性,如因不同地区、不同宿主、不同发育期和标本制作时个体差异所导致成虫的形态差异。而对于生活史,目前只有少数虫种的生活史被完整阐明,有一些虫种的第一和第二中间宿主尚未被证实。20世纪60-80年代,由于并殖吸虫分类研究极度活跃,出现了很多并殖吸虫新种的描述。20世纪90年代以来,分子生物学的发展为研究物种遗传变异奠定了基础。本课题基于物种DNA分析的分子生物技术较先进,具有仅需少量的材料即可进行研究、操作简单、快速、特异和敏感等特点。又基于本课题组先前研究结果显示并殖吸虫可能存在种间差异,而ITS2序列具有种株特异性。因此,本实验采用ITS2基因序列分析技术对鄂浙赣3省10地12株并殖吸虫进行遗传变异检测,以了解基因序列变化差异,为并殖吸虫分类提供依据,同时也为湖北省并殖吸虫流行区的划分提供可靠的分子生物学依据。材料与方法采集鄂赣浙3省10地：湖北省咸宁市温泉区桂花镇茅田、江西武宁县三爪、浙江绍兴兰亭乡、湖北省赤壁市赵李桥镇柘砰村、湖北省十堰市花果、湖北省五峰县、湖北鹤峰县五里镇南村、湖北鹤峰县走马镇大典、湖北随州和湖北神农架林区等10地共12株并殖吸虫。其中湖北咸宁株、湖北十堰株、江西武宁株和浙江兰亭株为成虫,湖北随州株为童虫,其余5地标本均为囊蚴。为避免混淆,本文中均以地理株命名。对12株并殖吸虫标本进行形态学观察测量,并提取4地成虫、1地童虫和5地囊蚴的基因组DNA。用3s’和BD2两对引物扩增ITS2序列,获得基因片段交由上海生工公司进行基因测序。所得12株并殖吸虫ITS2序列经Bioedit、Clustalx和MEGA4.0等软件进行遗传距离分析,并构建遗传进化树。结果1.外形观察：成虫湖北十堰株呈长梭形,湖北咸宁株、江西武宁株和浙江兰亭株等3株呈椭圆形；囊蚴5地囊蚴呈椭圆形或类圆形,囊壁2层,排泄囊内含黑色颗粒,经鉴定为并殖吸虫囊蚴。其中湖北赤壁株内壁较厚；五峰a、五峰b、走马a、走马b和五里等5株内壁较薄；湖北神农架株的囊蚴形态因故已有变形,但可以确定为并殖吸虫；童虫湖北随州株呈长梭形。2.DNA提取：DNA溶液A260/280值经测定在1.60～2.00之间,纯度符合要求。3.PCR扩增及基因测序,通过MEGA4.0分析基因序列。①各株间差异湖北咸宁株、江西武宁株、浙江兰亭株和湖北赤壁株等4株的遗传距离在0.01897～0.11278；湖北走马a、b两株,湖北五峰a、b两株,湖北十堰株,湖北五里株和湖北随州株等7株斯氏并殖吸虫在遗传树上呈现两支,最后成一大支,其7株遗传距离是0.00004-0.08401；湖北神农架发现的并殖吸虫,该株在进化树上独立成一支,与卫氏并殖吸虫遗传距离在0.01897-0.11278,与斯氏并殖吸虫遗传距离在0.01355-0.12195。②系统进化树通过MEGA4.0软件所构建的进化树中12株并殖吸虫分为三类：江西武宁株、浙江兰亭株、湖北咸宁株和湖北赤壁株等4株为卫氏并殖吸虫；湖北走马a、b两株,湖北五峰a、b两株,湖北十堰,湖北五里和湖北随州等7株为斯氏并殖吸虫；湖北神农架株独立成一类,为尚不明确的一种并殖吸虫。4.湖北省存在两个并殖吸虫流行区：以卫氏并殖吸虫为主的鄂东南和以斯氏并殖吸虫为主的鄂西两个并殖吸虫病流行区。结论1.根据基因测序分析的结果,3省10地12株并殖吸虫在基因水平上分为3类：江西武宁株、浙江兰亭株、湖北咸宁株和湖北赤壁株等4株为卫氏并殖吸虫；湖北走马a、b两株,湖北五峰a、b两株,湖北十堰,湖北五里和湖北随州等7株为斯氏并殖吸虫；湖北神农架株独立成一类,为尚不明确的一种并殖吸虫。2.湖北省存在以卫氏并殖吸虫为主的鄂东南和以斯氏为主的鄂西两个并殖吸虫病流行区。3.采用童虫、成虫和囊蚴等3个不同虫期标本,尤其是本实验首次采用童虫样本,对研究并殖吸虫遗传变异不存在影响。
高忠萱[9]（2009）在《小睾并殖吸虫的形态学及DNA序列分析》文中进行了进一步梳理[目的]应用形态学分类及DNA序列分析相结合的方法深入研究小睾并殖吸虫（Paragonimus microrchis Hsia Zhou & Chang,1978）的虫种独立性,在并殖科吸虫中的分类学地位,以及与其它并殖吸虫虫种的亲缘关系,逐步澄清并殖科吸虫的虫种争议,探讨更加客观和易于鉴定的分类学方法,并为进一步研究各虫种的生物学特性、地理分布、对人体的致病性,以及开展相关的防治工作奠定重要基础。[方法]从小睾并殖吸虫流行区采集第二中间宿主,分离囊蚴、脱囊蚴、感染实验动物获得成虫和虫卵。通过生物体视镜、显微镜观察囊蚴、后尾蚴、成虫及虫卵形态,并测量其大小;扫描电镜观察成虫的皮棘形态特征。结合DNA序列分析,Blast软件同源性比较,及MEGA4.0软件构建基因进化树。[结果]小睾并殖吸虫成虫活体呈肉红色,固定后呈砖灰色,封片标本测量:虫体大小为8.5-12.9×3.6-5.0mm,平均10.47±1.94×4.35±0.74mm。宽长之比1:2.1-2.8,平均1:2.41。口吸盘横径为0.511-0.778mm,平均0.657±0.103mm。腹吸盘位于体前1/3与中1/3横线处或稍后缘,大小为0.648-0.821×0.648-0.828mm,平均0.748±0.107×0.745±0.102mm。两吸盘横径之比为1:1.13。卵巢位于腹吸盘的左或右下方,大小为0.720-1.598×0.662-1.397mm,平均1.238±0.475×1.032±0.376mm,自中心体发出6-8叶,每叶又可发出3-4小叶。睾丸位于体中1/3与后1/3横线处或前缘,无分支或具1-5个芽状突起,左睾大小为0.662-1.390×0.504-0.979mm,平均0.974±0.334×0.732±0.250mm;右睾为0.526-1.570×0.504-1.210mm,平均0.989±0.437×0.701±0.344mm。睾丸明显地小于卵巢。扫描电镜观察成虫的皮棘,除口、腹吸盘之外均披有单生皮棘,虫体前中部的皮棘密集,排列规则,体后部的稀疏,排列不规则,形状似尖刀状或三角型。口吸盘内壁为纵向皱襞,腹吸盘内壁为环形皱襞。小睾并殖吸虫后尾蚴呈长椭圆形,排泄囊巨大,位于两肠支间。封片标本测量其大小0.878-1.210×0.432-0.634mm,平均1.034±0.167×0.509±0.108mm。口吸盘横径为0.115-0.180mm,平均为0.140±0.025;腹吸盘大小为0.130-0.202×0.130-0.209mm,平均为0.170±0.027×0.173±0.031mm,口腹吸盘之比平均为1:1.236。小睾并殖吸虫囊蚴呈球形,个体巨大,具有双层囊壁,外壁薄而透明,易破裂,内壁较厚。蚴体常蜷曲充满于内层囊腔内,可见蚴体盘曲而折光的肠支,排泄囊呈袋状位于两肠支间。未加盖玻片测量其大小（有外壁）为0.760-1.406×0.689-1.399mm,平均1.006×0.951mm,外壁厚度为0.003-0.014mm,平均为0.008mm。未加盖玻片测量只有内壁的囊蚴的大小为0.632-0.852×0.596-0.831mm,平均为0.728×0.703mm,内壁厚为0.007-0.031mm,平均为0.011mm。小睾并殖吸虫虫卵一般呈宽椭圆形,金黄色,大多数卵盖明显,卵壳薄厚不均,且末端增厚。加盖玻片测量其大小为73.1-95.9×42.3-55.3μm,平均为81.37±9.90×47.67±5.58μtm。通过Blast同源性比较,小睾并殖吸虫与老挝哈氏并殖吸虫的ITS2和CO1同源性分别为100%和99%,与泰国曼谷并殖吸虫同源性分别为98%和96%,与中国浙江的哈氏并殖吸虫同源性分别为96%和88%。ITS2和CO1基因进化树显示小睾并殖吸虫与老挝的哈氏并殖吸虫聚为一支、此支再与泰国曼谷并殖吸虫聚为一支,此大支再与中国浙江的哈氏并殖吸虫聚为一支。[结论]小睾并殖吸虫成虫、后尾蚴、囊蚴、虫卵的形态与夏代光教授等（1978年）、周本江教授（1988年）描述的各期形态一致,符合小睾并殖吸虫的形态特征。首次应用扫描电镜观察小睾并殖吸虫成虫皮棘,为单生型,形状似尖刀状或三角型,体前中部的皮棘密集,排列规则,体后部稀疏,排列不规则。口吸盘内壁为纵向皱襞,腹吸盘内壁为环形皱襞,其形态结构的特点与并殖吸虫的摄食、附着及运动功能有关。就基因序列而言,小睾并殖吸虫与老挝的哈氏并殖吸虫为同一虫种,老挝的哈氏并殖吸虫的真实性有待进一步澄清。小睾并殖吸虫与泰国曼谷并殖吸虫同源性较高,亲缘关系较近,按照Blair.D的观点小睾并殖吸虫与泰国的曼谷并殖吸虫应为同一虫种的复合型（Complex）。
陈诚[10]（2008）在《广西两地异盘并殖吸虫分子系统发生研究》文中研究表明目的:通过研究广西两地（灵川、那坡）异盘并殖吸虫分离株的核糖体DNA第二内部转录间隔区基因（ITS2）和细胞色素c氧化酶亚单位Ⅰ基因（CO1）序列,比较分析两地虫体的基因差异,揭示它们之间的亲缘关系和分类学地位。方法:采集灵川和那坡两地的异盘并殖吸虫囊蚴接种适宜终宿主大鼠,获得成虫后提取基因组DNA,PCR扩增其ITS2和CO1基因序列并测序。从Genebank检索到与它们同源性相近的并殖吸虫基因序列,应用Megalign软件对基因序列进行比较和同源性分析,然后用Mega及Phylip软件以最小进化法（ME）、邻接法（N-J）、最大似然法（ML）、最大简约法（MP）构建系统发生树,其中ME和N-J法用Kimura双参数法计算遗传距离,自举检验副本数为1000,ML和MP法自举检验副本数为500。结果:那坡异盘并殖吸虫分离株与灵川异盘并殖吸虫分离株的ITS2基因序列相似度为100%,CO1基因序列相似度为97.5%,同源性较高;而那坡与泰国一个分离株的ITS2和CO1基因序列相似度高达100%,具有高度同源性。从ITS2序列系统发生树来看,来自那坡、灵川、越南、泰国和印度的分离株均处于异盘并殖吸虫的种群下,但印度分离株是个相对独立的分枝,亲缘关系较远。从CO1序列系统发生树来看,不同的发生树中那坡分离株均与泰国、越南分离株的亲缘关系较近,以较高的自举检验置信值形成单系群,而灵川分离株的分枝均处在这个群之外,印度分离株的亲缘关系则更远一些。结论:那坡分离株与灵川分离株的ITS2基因和CO1基因序列的同源性比较高,而那坡分离株与泰国分离株的2个基因序列的同源性更高。虽然那坡和灵川分离株在形态学上有一定差异,但在不同方法构建的系统发生树中都位于异盘并殖吸虫的种群分枝下。CO1系统发生树中那坡分离株均与泰国、越南分离株的亲缘关系较近,形成有共同起源的单系群,而灵川分离株的分枝均处在这个群之外。据此认为,灵川和那坡的分离株可能属于不同的地理株。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 并殖吸虫的分类 |
| 1.2 并殖吸虫病的危害 |
| 1.3 并殖吸虫的分类技术研究进展 |
| 1.3.1 形态学分类 |
| 1.3.2 分子生物学分类 |
| 1.3.3 研究局限 |
| 2 研究意义 |
| 3 研究目的 |
| 4 研究内容 |
| 4.1 单重荧光定量方法的建立及优化 |
| 4.2 多重荧光定量方法的建立及应用评价 |
| 4.3 溪蟹感染情况及虫种分子鉴定分析 |
| 5 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第一部分 单重荧光定量PCR方法的建立 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 标准寄生虫种株 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 序列分析与引物设计 |
| 1.2.2 DNA提取方法 |
| 1.2.3 目的基因扩增 |
| 1.2.4 重组标准质粒的制备 |
| 1.2.5 优化单重荧光PCR反应条件 |
| 1.2.6 单重荧光定量PCR特异性的实验 |
| 1.2.7 单重荧光定量PCR灵敏度的实验 |
| 1.2.8 构建单重荧光定量PCR方法标准曲线 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的片段的扩增及并殖吸虫重组质粒标准品的制备 |
| 2.2 三种并殖吸虫重组质粒OD值的测定结果 |
| 2.3 单重荧光定量PCR反应条件优化结果 |
| 2.3.1 单重荧光定量PCR反应探针优化的结果 |
| 2.3.2 单重荧光定量PCR引物浓度优化结果 |
| 2.3.3 单重荧光定量PCR反应体系中退火温度的优化 |
| 2.4 单重荧光定量PCR特异性的鉴定 |
| 2.5 单重荧光定量PCR灵敏度实验 |
| 2.6 单重荧光定量PCR标准曲线的构建 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多重荧光定量PCR方法的建立及应用 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 标准寄生虫种株 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 现场囊蚴样本 |
| 2 多重荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.1 多重荧光定量PCR反应条件 |
| 2.2 多重荧光定量PCR特异性的试验 |
| 2.3 多重荧光定量PCR灵敏度的试验 |
| 2.4 多重荧光定量PCR稳定性试验 |
| 2.5 多重荧光定量PCR标准曲线的构建 |
| 2.6 现场应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 3.2 多重荧光定量PCR灵敏度试验结果 |
| 3.3 多重荧光定量PCR稳定性试验结果 |
| 3.4 标准曲线的构建试验结果 |
| 3.5 多重荧光定量PCR方法的现场应用评价 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 豫皖闽浙4省5地区溪蟹感染情况及虫种分子鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本采集 |
| 1.2 主要的试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 囊蚴分离 |
| 2.2 基因组DNA提取 |
| 2.3 目的基因常规PCR扩增 |
| 2.3.1 扩增引物 |
| 2.3.2 扩增体系和条件 |
| 2.4 扩增产物鉴定 |
| 2.5 数据分析 |
| 2.5.1 溪蟹感染资料分析 |
| 2.5.2 DNA序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 豫皖闽浙4省5地区溪蟹并殖吸虫囊蚴感染情况 |
| 3.2 豫皖闽浙4省5地区溪蟹并殖吸虫囊蚴形态 |
| 3.3 并殖吸虫ITS2、CO1基因PCR扩增结果 |
| 3.4 并殖吸虫ITS2、CO1基因序列Blast比对结果 |
| 3.5 并殖吸虫ITS2、CO1基因序列遗传距离分析 |
| 3.6 并殖吸虫ITS2、CO1基因序列系统进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 综述 并殖吸虫DNA分类技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 1 分类学研究 |
| 1.1 形态学 |
| 1.1.1 成虫 |
| 1.1.2 囊蚴 |
| 1.1.3 虫卵 |
| 1.2 分子分类 |
| 1.2.1 核基因标记 |
| 1.2.2 线粒体基因标记 |
| 2 种群遗传多样性 |
| 2.1 种内多样性 |
| 2.2 种间交流 |
| 3 卫氏并殖吸虫三倍体的研究 |
| 3.1 三倍体的定种争论 |
| 3.2 三倍体地理起源的讨论 |
| 4 小 结 |
| 摘要 ABSTRACT 第1章 引言 |
| 1.1 淡水蟹类分类系统 |
| 1.2 胃磨形态及其在分类研究中的进展 |
| 1.3 本课题的研究意义 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验标本 |
| 2.2 主要实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 标本采集 |
| 2.3.2 S.wanzaiense 标本常规形态鉴定与分组 |
| 2.3.3 标本解剖 |
| 2.3.4 标本拍照 |
| 2.3.5 标本测量 |
| 2.3.6 标本绘图 |
| 2.3.7 数据处理 第3章 结果 |
| 3.1 S.wanzaiense 胃磨形态描述 |
| 3.1.1 尾贲门骨形态描述 |
| 3.1.2 轭贲门骨形态描述 |
| 3.2 S.wanzaiense 不同性别及不同发育阶段胃磨形态比较 |
| 3.3 S.wanzaiense 胃磨形态特征性指标的确定 |
| 3.3.1 尾贲门骨各个测量指标（26 个）及定义 |
| 3.3.2 轭贲门骨各个测量指标（26 个）及定义 |
| 3.4 雌雄 S.wanzaiense 胃磨特征性形态指标测量数据统计学分析 |
| 3.5 S.wanzaiense 胃磨形态有效指标测量值统计分析 |
| 3.6 不同发育阶段 S.wanzaiense 胃磨的生长曲线及其方程 第4章 讨论 第5章 结论 附图 致谢 参考文献 攻读学位期间的研究成果 综述 |
| 参考文献 |
| 1 吸虫线粒体基因组的一般特征 |
| 1.1 线粒体基因组大小及碱基组成 |
| 1.2 线粒体基因组基因的组成与排列 |
| 1.3 蛋白编码基因长度的保守性 |
| 1.4 tRNA的二级结构 |
| 1.5 非编码区 (Non-coding region, NR |
| 1.6 密码子使用 |
| 1.7 线粒体DNA序列的变异性 |
| 2 线粒体DNA在吸虫分子分类学方面的应用 |
| 2.1 在吸虫分类学中的应用 |
| 2.2 在动物进化和系统发育研究中的应用 |
| 3 在临床分子诊断中的应用 |
| 4 在流行病学调查中的应用 |
| 5 结语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究的目的和意义 |
| 1.2 武夷山脉地区淡水蟹类研究概况 |
| 1.2.1 武夷山脉地区淡水蟹类生物种群的研究 |
| 1.2.2 武夷山脉地区淡水蟹类区系及其动物地理学意义 |
| 第2章 武夷山脉自然地理概况 |
| 2.1 武夷山脉的地理位置及地形概况 |
| 2.2 武夷山脉的气候概况 |
| 2.3 武夷山脉的水系分布和地质概况 |
| 第3章 武夷山脉淡水蟹类的物种多样性及其特点 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料来源 |
| 3.1.2 物种检测方法 |
| 3.2 结果及分析 |
| 3.2.1 武夷山脉淡水蟹类的物种构成分析 |
| 3.2.2 武夷山脉与邻近省区淡水蟹类物种多样性的比较 |
| 3.2.3 武夷山脉淡水蟹类物种多样性的主要特点及其与自然地理的关系 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附带综述 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本采集 |
| 1.2 DNA提取 |
| 1.2.1 因采用童虫与成虫样本为甲醛封存, 童虫DNA提取办法与成虫相同。 |
| 1.2.2 囊蚴 |
| 1.3 PCR扩增和ITS2序列测定 |
| 1.4 序列分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 12株并殖吸虫的ITS2基因PCR扩增结果 |
| 2.2 ITS2基因序列同源性分析 |
| 2.3 12种并殖吸虫ITS2种系发生树 |
| 3 讨 论 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 2.1 研究内容 |
| 2.2 标本收集 |
| 2.3 主要试剂和仪器 |
| 2.4 基因组DNA的提取 |
| 2.5 PCR扩增 |
| 结果 |
| 3.1 12株并殖吸虫的外形 |
| 3.2 PCR扩增电泳图 |
| 3.3 12株并殖吸虫ITS2基因序列 |
| 3.4 序列分析 |
| 3.5 湖北省并殖吸虫流行区的划分 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 一、论文 |
| 1、中文摘要 |
| 2、英文摘要 |
| 3、英文缩略词 |
| 4、前言 |
| 5、材料与方法 |
| 6、结果 |
| 7、讨论 |
| 8、结论 |
| 9、参考文献 |
| 10、附录 |
| 二、综述 |
| 1、正文 |
| 2、参考文献 |
| 三、致谢 |
| 四、攻读学位期间发表的论文 |
