沈陈兰[1]（2021）在《新型光学生物传感策略的开发及其在肿瘤标志物检测中的应用研究》文中研究指明恶性肿瘤是一种对人类生命威胁性极大的高危性疾病,其发病率和死亡人数都在逐年升高。肿瘤标志物对于肿瘤的早期诊断、鉴别诊断、疗效观察、复发监测和预后评估具有重要的参考价值,但目前临床使用的各类对肿瘤标志物的测定方法仍有一定局限性。生物传感器是利用生物活性物质作为识别元件,将识别到的靶标通过转换元件输出信号,达到检测目的的装置,它具有简便、高灵敏、高特异等优点,其中,光学生物传感器是运用最多的一种。等温扩增技术是一种在简单条件下可实现的可控的核酸扩增技术,有着高效、低价、简单、精确、快速等优点,可弥补已有的核酸扩增方法的一些缺陷。纳米材料因其独特的光学、稳定性、磁性、导电等特性,为生物传感的发展提供了新工具。本论文主要基于等温扩增和新型纳米材料,结合目前已开发的生物传感器的不足和临床检验诊断学的实际发展需求,构建了一系列高效、简单的光学生物传感新策略并应用于基因点突变、循环肿瘤细胞和特定核酸序列高灵敏、高特异性的检测,为临床肿瘤标志物的检测和生物传感器的研究提供了有力支持。主要研究内容如下:1.基于错配连接反应触发的级联链置换扩增反应构建的比色生物传感器用于PIK3CA基因点突变的检测低丰度肿瘤相关基因点突变高灵敏检测新方法的建立对肿瘤的早期诊断和个体化用药具有重要意义。在本研究中,我们将错配连接反应触发的级联链置换扩增反应（SDA）与G-四联体/Hemin DNAzymes催化反应相结合,提出了一种新型比色生物传感策略,用于灵敏、特异地检测PIK3CAH1047R基因点突变。在此工作中,我们对检测探针的错配碱基类型和突变互补位置进行了详细探讨,获得了对PIK3CAH1047R基因点突变检测的优越能力。错配连接反应可选择性地触发下游级联SDA产生大量的G-四联体序列,随后,大量的G-四联体与Hemin结合形成G-四联体/Hemin DNAzymes,催化底物产生比色信号实现对靶基因点突变的高灵敏检测。基于这种错配连接反应触发的级联SDA,所开发的策略展示出了对点突变良好的区分能力和信号放大效率。本工作中开发的生物传感策略可以检测到低至0.2%的PIK3CAH1047R突变。此外,本生物传感策略可用于分析添加到人类血清样本中的低丰度点突变基因。因此,这种比色生物传感器可能成为遗传分析和临床分子诊断的潜在替代工具。2.基于适配体修饰的磁珠和碳量子点/羟基氧化钴纳米片构建的新型三明治样荧光细胞传感器用于循环肿瘤细胞的检测作为“肿瘤液体活检”的一部分,循环肿瘤细胞（CTCs）中包含了大量的肿瘤信息,所以,高灵敏地检测CTCs对临床诊断和肿瘤治疗有很大帮助。本研究运用适体修饰的磁珠（Apt@MBs）和碳量子点/氢氧化钴纳米片信号系统（CDs/CoOOH）开发了一种新型细胞传感器,用于超灵敏和特异性检测CTCs。首先,将氨基功能化的磁珠（MBs）与羧基修饰的MUC1适体（Apt）交联得到Apt@MBs。然后,将叶酸（FA）功能化的碳量子点（FA@CDs）组装到羟基氧化钴纳米片（CoOOH）上,得到荧光信号淬灭状态的FA@CDs/CoOOH。在检测系统中,Apt@MBs特异性识别并富集靶MCF-7细胞,形成Apt@MBs/MCF-7细胞复合物,随后,此复合物再与FA@CDs/CoOOH结合得到三明治样Apt@MBs/MCF-7细胞/FA@CDs/CoOOH复合物。最后,加入抗坏血酸（AA）可分解CoOOH释放CDs,大量CDs的荧光作为有效的信号输出。所开发的细胞传感器对MCF-7细胞的线性检测范围为10105 cell/m L,检测限（LOD）为5 cell/m L,这是由于Apt@MBs特异性的识别能力和有效的富集能力以及FA@CDs/CoOOH很好的抗干扰能力和信号放大能力。最重要的是,该细胞传感器可成功地将MCF-7细胞从白细胞样本中检测出来,展示出在超灵敏CTCs检测中潜在的临床应用价值。3.基于等温扩增和羟基氧钴纳米片/量子点双重信号放大策略的新型生物传感器用于PML/RARα融合基因的检测通过结合三链DNA杂交触发的链置换扩增（tri-HT SDA）和氢氧钴纳米片/量子点（CoOOH/QD）纳米材料放大,我们开发了一种检测PML/RARα融合基因（P/R）的新型生物传感器。我们首次使用等温扩增和纳米材料扩增两种方法相结合对特异性DNA序列进行检测。首先,将QD组装到CoOOH上得到CoOOH/QD,用PEI修饰CoOOH/QD后得到PEI/CoOOH/QD,然后,在PEI上修饰连接探针（LP）,最后,PEI/CoOOH/QD通过LP连接到Fe3O4/Au上,形成Fe3O4/Au@LP@PEI/CoOOH/QD信号系统。在检测系统中,两条检测探针可以识别P/R,形成三链DNA杂交结构,而后触发下游SDA。然后,通过连续的链置换延伸和剪切,获得了大量的tri-HT SDA产物（DNAzymes）。随后,得到的DNAzymes可以与LP杂交并将其裂解,释放出Fe3O4/Au@LP@PEI/CoOOH/QD中的PEI/CoOOH/QD到体系上清液中。最后,抗坏血酸分解CoOOH释放QD,从而产生有效的信号输出。由于tri-HT SDA特异性的识别功能及高效的扩增能力和CoOOH/QD良好的抗干扰性和较强的信号放大能力,该生物传感器在P/R检测中具有较宽的线性检测范围（10 fM10 nM）和较低的LOD（5.50 f M）,在临床工作中对特异性DNA序列的灵敏检测具有一定的应用潜力。
王梓璇[2]（2021）在《尼龙膜反向杂交和聚合酶螺旋反应用于主要病原真菌的检测》文中研究说明近年来,由于广谱抗生素、免疫抑制剂和新型化疗药物的广泛使用,器官移植、造血干细胞移植技术的开展,以及传染性疾病爆发流行及获得性免疫综合症人群增加等,真菌感染的发病率逐年上升,病死率高,严重威胁着人类的生命与健康,已引起医学界的广泛关注。由于真菌感染临床早期缺乏特异性体征表现,诊断困难,易错过最佳治疗期。因此,建立快速、特异、灵敏的病原真菌检测方法,对于早期诊断、及时治疗,降低患者死亡率及改善预后至关重要。目前,临床上对于真菌感染的诊断方法主要为形态学观察、组织病理学检测、血清学诊断,但存在耗时长、主观性强、易造成二次创伤、假阳性率高等缺点。以核酸为基础的分子生物学诊断方法因具有耗时较短、特异性强和灵敏度高的优势,在真菌感染临床早期检测中具有广阔的应用前景。尼龙膜反向杂交（Nylon membrane reverse hybridization,NRH）、聚合酶螺旋反应（Polymerase spiral reaction,PSR）是较新的病原微生物鉴定、诊断方法,已应用于某些细菌、病毒的检测,但在真菌检测方面报道较少。NRH根据反向斑点杂交原理,通过特异性探针与靶核酸的杂交,可以目视观察反应结果,具有特异性强、检测通量大、设备简易、操作简便等优点,适宜在临床实验室推广应用。PSR是一种恒温扩增方法,引物设计简单,仅需要一对引物,依赖于Bst DNA聚合酶在65℃下快速度、高效率的扩增靶核酸,特异性强、可重复性好、耗时较短且灵敏度高。本研究针对临床感染的主要病原真菌,包括烟曲霉、白假丝酵母、新生隐球菌、茄病镰刀菌及米根霉,建立了NRH和PSR检测方法。一、实验方法1.建立NRH检测法:以核糖体DNA的ITS区为靶序列,设计烟曲霉、白假丝酵母、新生隐球菌、茄病镰刀菌、米根霉的特异性探针,进行了相关病原真菌的检测。2.建立PSR检测法:以β-微管蛋白（β-tubulin）为靶基因,设计烟曲霉特异性引物;以线粒体翻译优化基因（MTO1）为靶基因,设计白假丝酵母特异性引物;以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为靶基因,设计新生隐球菌特异性引物,进行了相关病原真菌的检测。3.利用上述两种方法,对模拟的临床感染血液样本和肺组织样本进行了烟曲霉、白假丝酵母、新生隐球菌、茄病镰刀菌、米根霉的检测,并对两种方法进行比较与评估。二、研究结果1.利用建立的NRH方法检测了烟曲霉、白假丝酵母、新生隐球菌、茄病镰刀菌、米根霉。根据尼龙膜上出现蓝紫色斑点可以特异性鉴定以上五种病原真菌,灵敏度可达5 pg,耗时约4-5 h。2.利用建立的PSR方法检测了烟曲霉、白假丝酵母、新生隐球菌。可根据特异性梯形条带的带型、片段大小及数量的不同（其中,烟曲霉最小条带约120bp、白假丝酵母约100 bp、新生隐球菌约110 bp）;也可通过目视检测（溶液颜色由紫色变为蓝色）或OD值读数(OD650nm约为0.3左右)进行鉴定,灵敏度可达fg级（其中,烟曲霉5 fg、白假丝酵母0.5 fg、新生隐球菌5 fg）,耗时约40min。3.针对模拟的临床感染血液样本、肺组织样本,NRH方法阳性检出率为60%-100%;PSR方法阳性检出率为80%-100%。三、结论本研究针对主要病原真菌烟曲霉、白假丝酵母、新生隐球菌、茄病镰刀菌、米根霉建立了NRH和PSR检测方法。这两种方法可以特异鉴定以上五种病原真菌,灵敏度高、检测时间短、通量大、成本相对较低。根据方法特点,在待检测样本较多时,可选择NRH筛查感染菌种,并可评估是否存在混合感染;在对早期临床样本中痕量DNA检测时,可选择PSR进行快速检测。
张杰[3]（2021）在《MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析及早期鉴定的应用研究》文中研究说明第一部分MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析的应用研究目的:探究基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）分析耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）同源性在临床中的应用价值。方法:收取我院2019年12月2020年12月临床分离的肺炎克雷伯菌非重复菌株150株,经耐药表型筛选出CRKP;利用MALDI-TOF MS采集CRKP的质谱图,分别运用SARAMIS软件中的相似性分型和identical masses分型进行同源性分析;以脉冲场凝胶电泳（PFGE）为参考标准,将CRKP分为高度、中度、低度同源性三组,评价MALDI-TOF MS在分析CRKP同源性分析中的应用价值。结果:经耐药表型筛选出55株CRKP;三组同源性分析显示:高度同源组中,应用SARAMIS软件自带的identical mass分型和相似性分型分析,大多identical mass集中分布（60%80%）,相似性>80%,与PFGE结果较为一致;中度同源组中,identical mass>70%,相似性>85%,显示菌株间高度集中,跟PFGE结果存在较大的差异;低度同源组中,identical mass<70%,相似性<80%,与PFGE结果类似,能较好体现菌株间的差别。结论:MALDI-TOF MS自带的SARAMIS软件目前仅在高度同源和低度同源菌株中,可作为分析同源性的初筛方式。第二部分MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌早期鉴定的应用研究目的:探讨MALDI-TOF MS对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的早期鉴定能力。方法:收集2019年12月2020年12月我院临床分离的肺炎克雷伯菌150株,采用纸片扩散法进行药敏实验,结果参照2020版CLSI M100 30th药敏标准执行。PCR作为耐药初筛的参考标准。采用MALDI-TOF MS收集CRKP和碳青霉烯酶敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitive Klebsiella pneumoniae,CSKP）的质谱图,各自选取其中20株菌株图谱,建立产CRKP和CSKP的超级图库（Super-spectra）。选择除建库以外的KPN菌株验证是否耐药,并根据耐药表型和PCR方法,判断验证结果是否准确。结果:150株KPN经耐药表型筛选出CRKP 55株和CSKP 95株。根据建库要求,选取建库质谱图,建立出CRKP和CSKP的超级图库（Super-spectra）;设置error值<0.5,二者重合率达80%,并根据对比图发现,4154.4m/z、8310.7m/z、10880.8m/z、3579m/z及10079.3m/z这五个峰可作为区分CRKP和CSKP的特征峰。选取除建库以外的110株KPN进行验证,CRKP准确率91.43%（32/35）,CSKP准确率90.67%（68/75）,新建的Super-spectra鉴定KPN是否对碳青霉烯酶耐药的准确率为90.91%（100/110）。结论:通过MALDI-TOF MS建立Super-spectra,可快速鉴定CRKP,有助于提高临床诊疗和院内感染控制水平。
赵婷婷[4]（2020）在《罕见血红蛋白病突变类型临床血液学特征的研究》文中研究表明目的:了解云南省罕见血红蛋白病的突变类型及其血液学特征,为血红蛋白病的遗传咨询和产前诊断提供有价值的数据支持。方法:2018年9月-2020年1月到云南省第一人民医院医学遗传科就诊的育龄人群,登记患者民族籍贯等个人信息,使用二代测序检出罕见血红蛋白病突变的样本,并用一代测序验证其突变位点。使用全自动血液细胞分析仪进行血常规检测,使用全自动毛细管电泳仪检测血红蛋白成分。结果:收集罕见血红蛋白病突变患者样本23例,包括异常血红蛋白病突变样本21例和2例新型α-地中海贫血。21例异常血红蛋白病患者中男性5例,女性16例,共检出12种异常血红蛋白病突变类型,4种是α-珠蛋白基因突变类型,包括Hb Hekinan II杂合3例,Hb J-Broussais杂合2例,Hb Groene Hart杂合1例,Hb Daneshgah-Tehran杂合1例;8种是β-珠蛋白基因突变类型,其中Hb New York杂合3例,Hb Shizuoka杂合3例,Hb J-Bangkok杂合3例,Hb Las Palmas杂合1例,Hb Rush杂合1例,Hb Agenogi杂合1例,Hb J-Lome杂合1例,Hb G-Coushatta杂合1例。两例新型α-地中海贫血突变分别为错义突变HBA2:c.245C>T和内含子缺失HBA2:c.95+11＿95+34 del CTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCC。23例患者均未出现明显的贫血症状,血红蛋白电泳结果显示3例Hb New York杂合患者在Z11区有45.03%左右的条带,3例Hb J-Bangkok杂合患者在Z12区有52.60%左右的条带,2例Hb J-Broussais杂合患者在Z12区有22.55%左右的条带,1例Hb Daneshgah-Tehran杂合患者在Z5区有24.5%的条带,1例Hb Rush杂合患者在Z11区有50.80%的条带,1例Hb Agenogi杂合患者在Z4区有39.60%的条带,1例Hb J-Lome杂合患者在Z13区有50.80%的条带,1例Hb G-Coushattae杂合患者在Z6区有40.80%的条带,其他异常血红蛋白病突变类型的血红蛋白结果无异常情况。结论:23例患者血常规结果均无明显的贫血情况。8种异常血红蛋白杂合子患者毛细管电泳结果出现异常条带,4种异常血红蛋白杂合子患者毛细管电泳无异常情况。仅通过血常规和电泳方法筛查异常血红蛋白病会造成漏检。本研究丰富了血红蛋白病的临床诊断,为血红蛋白病的产前诊断提供了一定的基础。
徐欢[5]（2020）在《基于3D打印及智能手机的多能iPOCT检测平台的构建及其在DNA和生化标志物检测中的应用》文中研究指明研究背景DNA和生化标志物在生命科学中发挥着越来越重要的作用,广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全和农作物保护中。目前,DNA和生化标志物的检测仍然主要依赖于现代化的实验室环境、昂贵的仪器设备和专业的操作人员,这限制了DNA和生化标志物检测在疾病现场或资源有限地区的应用。即时检测（Point-of-care testing,POCT）具有快速、简便、高度集成,不依赖大型仪器设备和专业工作人员等优点,在资源有限的地区具有巨大的潜力。但是现有的即时检测技术仍然存在以下限制:首先大部分设备只能实现一个或几个环节上的POCT,如核酸扩增或结果读取,无法全流程地完成“sample-to-answer”的检测;其次即时检测设备往往只针对一种或少数几种DNA靶标类型和样本来源,无法实现多用途的平台式检测。综上,本研究在即时检测技术现有发展基础上,针对DNA和生化标志物,建立了全新的智能即时检测平台（intelligent Point-of-care testing,i POCT）,并对其临床应用性能进行了系统的评价,对即时检测平台的深入开发和转化提供了一定的研究基础。研究目的1.建立超便携、多功能的DNA智能即时检测平台;2.对DNA智能即时检测平台的临床应用性能进行评价;3.建立生化标志物智能即时定量检测平台;4.对生化标志物智能即时定量检测平台的临床应用性能进行评价。研究方法1.采用3D打印技术和微流控技术,设计构建包含3D打印前处理单元和微流体信号放大单元的集成芯片。设计可折叠支架,并搭建手机光路系统。设计智能手机应用程序,开发智能手机温控系统和结果读取系统。利用恒温重组酶聚合酶扩增与金-银纳米颗粒结合的方法,构建i RPAS（isothermal Recombinase Polymerase Au-Silver,iRPAS system）三重信号放大系统。利用地中海贫血全血样本、细菌感染尿液样本、唾液样本,测试DNA智能即时检测平台对不同类型的基因突变、尿液细菌感染和单核苷酸多态性（SNP）的检测效果。利用细菌污染牛奶样本、细菌污染河水样本、细菌感染植物叶片样本,测试DNA智能即时检测平台对食品样本、环境样本和农作物样本的检测效果。2.通过恒温烘箱模拟不同环境温度测试智能手机温控系统在极端环境下的检测效果和电池耗电量。构建基因突变质粒,通过质粒DNA进行检测平台灵敏度和理论检测下限测定。通过每周测定常温放置的i-chip,分析i-chip在没有冷链保存情况下的稳定性。通过比较受过训练与未受过训练的用户组间的检测效果,分析检测平台的易操作性。通过使用不同品牌的智能手机测试DNA检测平台在不同品牌智能手机间的稳定性。通过检测172例临床样本,分析平台对不同类型基因突变、SNP、细菌检测的准确性、阳性预测值、阴性预测值。3.利用侧向层析技术和3D打印技术构建血浆分离模块,通过显微镜观测血浆分离模块对血浆的分离效果。利用3D打印技术构建检测模块,通过不同浓度血清化学质控品进行生化反应,分析检测模块的稳定性。利用智能手机环境光传感器并设计相应应用程序进行透射光强度的记录和浓度换算。4.使用血清化学质控品测定即时生化标志物智能定量检测平台对总胆红素和直接胆红素的线性范围和检测灵敏度。通过血液中10种干扰生化标志物来分析检测平台的对总胆红素和直接胆红素的检测特异性。通过真实血浆中掺入血清生化质控品,来评估检测平台的回收率。通过检测19份临床血液样本,验证检测平台在临床全血样本中对总胆红素和直接胆红素的定量性能,并与全自动临床化学分析仪进行比对。通过使用Passing-Bablok回归、Bland-Altman差异图分析和Kappa检验分析平台与临床化学分析仪的相关性和一致性。研究结果1.通过3D打印技术和微流控技术建立了由i-chip和f-box组成的POCKET DNA检测平台。平台重量不足100 g,长度小于25 cm。建立并优化了i RPAS三重信号放大系统,iRPAS结果可通过智能手机进行半量化分析。搭建了智能手机温控系统,并设计了在寒冷环境下使用的保温袋。POCKET DNA检测平台在检测各种类型的基因突变、SNP、细菌感染时,阳性标本和与对照组之间有明显的信号差异（p<0.05）。POCKET DNA检测平台在检测血液、尿液、唾液、牛奶、河水、树叶时,实验组与对照组之间有明显信号差异（p<0.05）。2.智能手机温控系统在不同的环境温度下（4°C、15°C、25°C、37°C）达到并维持37°C所需的时间均不超过20 min,并且在所有测试温度下均获得显着的强信号。手机电量至少可以完成四次完整检测。DNA智能即时检测平台检测下限在103-104copies/m L左右,计算可得理论灵敏下限为113 copies/m L。i-chip在10周的观察时间内检测效果保持稳定。训练与未经训练的用户检测效果类似,没有显着差异。使用三个不同品牌的智能手机得到的检测结果之间也没有显着差异。POCKET平台用于临床样本检测的总准确度为97.1%,每个靶标AUC都超过0.950,特异性均大于77.8%,PPV大于88.2%。3.通过侧向层析技术和3D打印技术成功构建了包含血浆分离模块和检测模块的即时生化标志物智能定量检测平台,平台总重量不足40 g,成本不足5美元,整个检测周期小于5 min。在血浆分离试纸条尾部血浆分离效果最好,可用于后续血浆转运。无论是高、中还是低浓度,检测模块在30 min观察时间内均非常稳定。设计的“Light to Concentration”智能手机应用程序,可对智能手机环境光传感器光强度值进行读取和记录并将其转换为生化标记物的浓度。4.总胆红素在1.0μM至30.3μM范围内具有良好的线性回归,检测下限为0.8μM,校准曲线回归方程为y=10.86*ln（x）+4.17。直接胆红素线性回归范围为0.7μM至21.3μM,检测下限为0.5μM,校准曲线回归方程为y=19.5*ln（x）+15.00。血液中10种检测波长接近胆红素的生化标志物在总胆红素和直接胆红素检测中光强度信号没有显着变化。与总胆红素和直接胆红素的光强度信号之间有显着差异。总胆红素和直接胆红素的平均回收率均高于95%。总胆红素的准确性为89.5%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为84.6%。直接胆红素的准确性为94.7%,阳性预测值为90.0%,阴性预测值为100.0%。Passing-Bablok回归分析、Bland-Altman差异图分析和Kappa检验都表明,我们的平台与临床化学分析仪具有良好的相关性和一致性。研究结论1.我们建立了一个超便携、多功能的DNA智能即时检测平台。首先,该平台具有超便携的特点,整个平台重量小于100 g,体积小于1 L,从样本制备到信号放大到结果读取全流程无需仪器设备。我们开发了i RPAS三重信号放大技术和智能手机温控系统。智能手机可作为温控系统、信号检测器和结果读数装置,从而实现了恶劣环境下也可以进行即时DNA扩增。其次,该平台具有多用途的特点,从临床样本（血液、尿液和唾液）,环境样本（河水）,食品（牛奶）,农业样本（植物叶片）等各种样本来源中检测了不同类型的DNA包括各种类型的基因突变、SNP、细菌DNA。2.我们的平台在不同的环境温度下均能良好运行。平台检测灵敏、特异（单碱基特异性）、快速（<2 h）、稳定（在室温下至少保存10周）,用户友好、兼容不同品牌智能手机。通过分析并测定了172份临床样本,证明我们的平台对于基因突变、细菌感染和SNP检测均有极佳的检测性能。3.我们建立了一个即时生化标志物智能定量检测平台,实现了全血样本中sample-to-answer的生化标记物定量检测。平台集成了血浆分离模块和检测模块。血浆分离模块实现了快速血浆分离。检测模块实现了无需移液器进行生化反应。通过智能手机环境光传感器和我们设计的应用程序,实现了光强度值的读取和记录并将其转换为生化标记物的浓度。通过总胆红素和直接胆红素我们验证了平台的可行性。4.即时生化标志物智能定量检测平台具有很好的便携性（<40 g）,低成本（<5美元）,快速（<5 min）,无需仪器,高灵敏度（<1μM）。并且我们平台具有较好的特异性和回收率。通过分析并测定了19份临床样本并与全自动临床化学分析仪进行比对。我们的平台对临床样本的定量性能与临床化学分析仪具有较好的一致性。
高芃[6]（2020）在《肿瘤基因突变高通量测序检测参考物质制备平台的建立及其应用研究》文中研究表明恶性肿瘤是导致我国居民死亡的主要原因之一,严重威胁着我国人民的健康。随着精准医学的不断发展,通过基于肿瘤患者的基因突变谱来制定个性化的治疗方案,已成为临床肿瘤诊疗至关重要的一部分。由于对肿瘤突变位点研究的不断深入以及个体化医学的快速发展,临床分子检测技术也在不断更新。高通量测序（High-throughput sequencing,HTS）即下一代测序（Next generation sequencing,NGS）的出现,使得肿瘤多个基因突变同时大批量检测成为可能。但相较于传统的分子检测方法,NGS检测更为复杂,无论是操作步骤繁多的“湿实验”还是生物信息学分析流程的“干实验”,任何一个环节出现问题,都可能导致不可靠的检测结果。为了确保基因突变检测结果的准确性,临床实验室必须选取合适的参考物质用以建立完整的质量管理体系,其中包括对实验室自建检测（Laboratory developed tests,LDTs）的性能确认（Validation）、商品化试剂盒的性能验证（Verification）、进行室内质量控制（Internal quality control,IQC）以及定期参加室间质量评价（External quality assessment,EQA）或能力验证（Proficiency testing,PT）。目前对于肿瘤基因突变NGS检测参考物质的制备,还没有统一的标准。然而,来源于患者样本的参考物质难以大批量获取且肿瘤组织间或肿瘤组织内具有异质性,无法对基于NGS的肿瘤基因突变检测进行全面的性能评估,也无法满足实验室检测质量保证的需求。为解决这个难题,本研究建立了肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台。通过使用该平台,制备了一种易于生产且来源于同一基因组背景并具有不同等位基因突变频率（Variant allele frequency,VAF）的肿瘤基因突变NGS检测参考物质（见第一部分）。经该平台制备的参考物质具有以下优势:第一,参考物质可同时适用于只测肿瘤组织（“tumor-only”）的小肿瘤基因突变检测盘（panel）及肿瘤正常配对（“tumor-normal”）的大肿瘤基因突变检测盘（panel）。具体来讲,我们将细胞系提取的人基因组DNA（Genome DNA,gDNA）为模板DNA,使用重叠延伸PCR（Overlap extension PCR,OE-PCR）技术定点诱变产生了多种具有相同基因组背景但含有不同突变位点的DNA片段,将其与gDNA按照一定比例均匀混合制备为肿瘤基因突变样本,该样本可独立作为参考物质适用于“tumor-only”的检测模式。而未经诱变的gDNA作为正常配对样本,与肿瘤基因突变样本一起作为参考物质用于“tumor-normal”的检测模式。第二,本研究中选取的背景细胞系是已知基因组序列信息的GM12878细胞系,因此本研究中的正常配对样本,即GM12878细胞系提取的gDNA也可单独用于临床实验室的常规基因突变检测来验证结果的准确性。第三,经本平台制备的参考物质中可覆盖多种突变类型,且各突变的VAF%可自行设置。在本研究中,通过该制备平台我们共构建了 15种含有肿瘤突变位点的DNA片段,突变类型覆盖了单核苷酸变异（Singlenucleotidevariant,SNV）、短片段插入或缺失突变（Insertion and deletion,InDel）以及拷贝数变异（Copy number variation,CNV）。这些DNA片段经菌液PCR电泳验证、Sanger测序验证,均证明含有准确的突变位点,经限制性内切酶酶切回收最终获取了含突变位点的DNA片段。随后我们通过计算gDNA及每个含突变位点DNA片段的拷贝数浓度,根据每个突变预先设定的VAF%,计算出每个含突变DNA片段的加入体积。第四,参考物质的均一性及稳定性均良好。第五,该参考物质不仅适用于基于NGS的基因突变检测过程的评估,还可作为IQC样本应用于其他常规的基因突变检测方法,如扩增突变阻滞系统(Amplification refractory mutation system,ARMS-PCR,数字 PCR（Digital PCR,dPCR）及实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR,qPCR）等的评估。室间质量评价是监测各临床实验室检测能力的一种方式,也是临床实验室质量管理的重要方面。通过对实验室回报的室间质评结果进行全面评估,可以发现实验室进行基于NGS的肿瘤基因突变检测包括“湿实验”、“干实验”及突变解读中存在的问题,帮助临床实验室进行改进及全面优化,从而为临床医生提供准确可靠的基因突变检测报告。为了评估不同临床实验室的肿瘤基因突变NGS检测及突变解读水平,2017年国家卫生健康委临床检验中心开展了肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价活动（见第二部分）。该室间质量评价在2017年上半年及下半年各开展一轮,分别针对非小细胞肺癌和乳腺癌这两种在肿瘤靶向治疗应用中最为常见的肿瘤类型。通过第一部分中建立的肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台,分别制备了针对非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘和乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘。每个样本盘中均包含1个正常配对样本和6个肿瘤基因突变样本。非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘中覆盖了 SNV、InDel和融合基因等突变类型,而乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘则覆盖了 SNV、InDel以及CNV等突变类型。每个样本的浓度均大于30ng/μL,且核酸总量至少为750ng,可以满足各类NGS平台、各种靶向捕获方法及各种文库制备方法的要求。样本盘中大部分突变的VAF%设置在10%至45%之间,满足大部分实验室的检测能力水平,同时在个别样本中加入了少量VAF%小于5%的低频突变用以评价实验室在检测识别低频突变的能力。此外,样本盘中覆盖了不同等级临床意义的突变,包括具有明确临床意义的突变,潜在临床意义的突变及临床意义未知的突变。我们随后将样本盘发放给参加该室间质量评价的实验室,各实验室在规定时间内回报突变检测结果及完整报告。我们通过对实验室回报的突变检测过程、突变检测结果及突变解读信息进行统计分析,从而探究各临床实验室在突变检测及突变解读方面存在的问题。全国共有102家临床实验室报名参加本次室间质量评价活动,其中有效回报结果的实验室为89家。在非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质量评价中,实验室总体合格率为62.9%（56/89）,其中仅有48家（53.9%,48/89）的实验室突变结果检测全部正确,还有5家临床实验室（5.6%,5/89）的室间质评成绩为0分。乳腺癌基因突变NGS检测室间质量评价的成绩有所提高,总体合格率为87.6%（78/89）,其中检测全部正确的实验室为76家（85.4%,76/89）,但仍有1家实验室（1.1%,1/89）的成绩为0分。通过分析实验室回报的突变检测结果,我们发现假阳性、假阴性的错误较常出现。如在非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评中,有三家实验室均报告超过20个的假阳性结果。而假阴性结果往往出现在临床意义不明确的突变中,且以采用基于杂交捕获方法的Illumina测序平台的实验室最为常见。我们还发现,临床实验室对于检测复杂的短片段插入-缺失突变的能力相对较弱,如ERBB2（NM004448.3）:c.2326delGinsTTAT（p.Gly776delinsLeuCys）,该突变在两个室间质评样本中的正确检出率仅为67.9%（57/84）和69.0%（58/84）。其次,实验室精准识别短片段插入-缺失突变碱基位置的能力也有待提高,如导致EGFR（NM005228.3）:c.22352249de115（p.Glu746Ala750del）和 ERBB2（NM004448.3）:c.22632277de115（p.L755T759delLRENT）的错误回报结果的原因大多是实验室对于缺失部位碱基的识别发生移位、错位。此外,部分临床实验室的突变回报结果还体现出其对突变正确命名方式的忽视,实验室应严格按照人类基因组变异学会（Human genome variation society,HGVS）基因突变命名规则对突变进行标准化命名。经过本次两轮室间质评,各临床实验室通过查找自己在“湿实验”操作步骤或“干实验”生物信息学分析流程中的不足之处并加以改进,致使第二轮的室间质评成绩有了很大的提高。这也说明开展肿瘤基因突变NGS检测室间质评活动可以帮助临床实验室进行质量改进,完善其质量管理体系。我们还对各临床实验室的突变解读过程进行了分析。在非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评中,我们主要对突变检测结果正确且检测范围一致的34家临床实验室反馈的突变解读信息,包括数据库信息、各突变临床意义分类结果及提交的靶向药物信息等方面进行了分析。结果表明,除EML4 exon 13-ALK exon 20和EGFR c.22352249deIGGAATTAAGAGAAGC（p.Glu746Ala750del）这两个临床意义明确且有明确靶向药物的突变外,其他突变的临床意义分类结果及靶向药物信息均出现不一致的情况。我们分析了导致这种情况的原因,主要是以下两个方面:第一,某些实验室在进行突变解读时并未参考美国国家食品药品监督管理局（Food and drug administration,FDA）或权威指南中所提及的内容,导致所涵盖的临床证据不充分,因此当该类突变进行临床意义分级及提交靶向药物信息时,其结果会出现问题。第二,各临床实验室通过使用不同组合方式的公共数据库或自建数据库的方式来获取突变临床证据。由于每种类型的数据库根据其数据库特征仅提供有限且不同的突变信息,因此使用不同类型的公共数据库的实验室可能会产生不同级别的突变临床证据,从而导致突变解读结果的不一致。在乳腺癌基因突变NGS检测室间质评中,我们主要对临床实验室反馈的靶向药物信息的准确性和充分性进行了汇总和评价。结果显示,实验室提供的靶向药物信息存在不准确的情况,主要在于某些实验室提供了一些对某些特定突变显示出低疗效的药物。其次,有些实验室还提交了一些与其检测突变不相符的靶向药物信息。此外,实验室提供靶向药物信息也存在不充分的情况。通过与Ion Torrent Oncomine Knowledgebase Reporter v.3.1.0系统提供的靶向药物信息相比,没有任何一家实验室可以完全覆盖该系统中展示的所有靶向药物信息。61.8%（21/34）的实验室仅提供了少于10种的靶向药物,分析原因主要在于实验室只提供经指南或FDA批准的药物,而忽略了临床试验中的药物信息。临床实验室应从突变的临床有效性和临床可操作性来进行突变临床意义的评价及提供靶向药物信息。因此,本研究提供了一种突变解读流程,通过整合癌症变异解读指南中不同级别的临床证据,从不同类型的数据库和文献中获取突变信息,以进行准确的突变分类并提供准确且全面的靶向药物信息。综上所述,本研究建立了一个肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台,以简单、精准、经济的方式成功地制备了肿瘤基因突变NGS检测的参考物质,其具有可按照预先设定的突变位点及VAF%进行大批量制备、具有相同的已知序列基因组背景、均一性稳定性良好等优点。该参考物质不但适用于“tumor-only”的小肿瘤基因突变检测panel,也适用于“tumor-normal”大肿瘤基因突变检测panel,可同时评估基于NGS的肿瘤基因突变检测的“湿实验”操作部分以及生物信息学分析的“干实验”部分。通过开展两轮肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价活动,各实验室在第一轮室间质评中发现问题,查找自己在检测流程中的不足之处并加以改进,致使第二轮的室间质评成绩有了很大的提高。说明通过室间质量评价可以帮助临床实验室进行质量改进,完善其质量管理体系。此外,基于NGS的肿瘤基因突变检测不仅应确保准确的突变检测结果,还应对突变进行准确且全面的解读。实验室应通过结合不同类型的数据库,采集不同等级的临床证据,从而准确地划分突变的临床意义等级以及提供准确且充分的靶向药物信息,为临床医生提供可靠且全面的基因突变检测报告,这对实现“精准医学”至关重要。本研究的创新性主要有:（1）通过使用OE-PCR技术对gDNA进行定点诱变的方法,建立了一个易于快速准确生产且来源于同一基因组背景并具有不同突变类型、不同VAF%的肿瘤基因突变NGS检测参考物质的通用制备平台,并且这样制备的参考物质不但适用于“tumor-only”的小肿瘤基因突变检测panel,也适用于“tumor-normal”大肿瘤基因突变检测panel;（2）采用该平台研制的肿瘤基因突变NGS参考物质,第一次在全国范围内正式开展肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价活动,通过对各实验室的室间质量评价结果进行全面比较,发现了临床实验室在基于NGS的肿瘤基因突变检测及突变解读过程中存在的问题,从而有助于各临床实验室改进及全面优化突变检测及解读流程,为临床医生提供准确且全面的基因突变检测报告,有助于临床实验室肿瘤基因突变NGS检测的规范化和标准化;（3）除了上述的室间质量评价外,采用本研究的平台制备的肿瘤基因突变NGS检测参考物质还可用于LDTs的性能确认、对商品化试剂盒的性能验证和IQC等。
吴祁生[7]（2018）在《基于重组MS2病毒样颗粒的急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因检测质控品及其应用研究》文中研究表明PML-RARβ融合基因检测在急性早幼粒细胞白血病的临床管理中发挥重要作用。使用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）的PML-RARα融合基因分子检测可以证实基于形态学、免疫表型和/或凝血障碍筛查对APL的假定诊断。同时,使用RT-qPCR连续检测PML-RARα融合基因转录水平可以监测最小残留病（MRD）,用于记录白血病负担并最终确认分子缓解。基于PML-RARβ融合基因转录物的RT-qPCR检测已广泛开展于临床常规实验室,尤其是血液病分子实验室。依据PML-RAR融合基因检测目的,临床真实骨髓标本有核白细胞提取的总RNA可分为3个部分,即PML-RARα融合基因mRNA,内参基因mRNA和其他无关RNA,其中无关RNA占总RNA 比例最大。我们选择生物安全性高、稳定性好、对RNA保护作用强的噬菌体MS2病毒样颗粒（Bacteriophage MS2 virus-like particles,MS2VLPs）来制作PML-RARα融合基因、内参基因和无关RNA的盔甲RNA。其中PML-RAR融合基因包括L、S和V三种亚型,选择外源性23s rRNA作为无关RNA。混合PML-RARα融合基因不同亚型,内参基因和23s rRNA的盔甲RNA,就可模拟有核白细胞总RNA组成特征和RNA产量,进而制备不同PML-RRα转录水平的模拟白细胞样本。针对不同亚型的PML-RARα融合基因,我们设计不同的APL临床模拟病例,同时提供从入院诊断到随访的各个MRD监测点的临床检测信息。依据APL病程不同MRD监测点临床信息制备不同的模拟白细胞样本,作为PML-RARα融合基因检测EQA样本。根据PML-RARα临床检测流程,采用严格的EQA评价标准,突出PML-RARα融合基因入院诊断筛查和定性检测在临床治疗决策中的重要作用。参考多种国内外基因诊断报告标准,建立PML-RARα融合基因临床检验报告单评分标准,考查参评实验室临床检验报告的规范完整性。各实验室需根据APL模拟病例和质控样本临床检查信息,给出相应的临床治疗方案和治疗调整,以考查实验室与临床科室的沟通意愿和能力。我们要求参评实验室对EQA样本进行融合基因检测流程,包括RNA提取、白血病相关融合基因诊断筛查、定性和定量RT-qPCR检测,最终提交实验数据回报表和临床检验报告。我们制备的模拟白细胞样本对各种RNA提取方法有很好的适应性,各实验室RNA产量与真实BM样本基本一致（2.27～35.70μg）,内参基因的拷贝数>104,可以满足后续的PCR实验检测。针对PML-RARα融合基因临床检测流程,在50家参评实验室中,30.0%（15/50）的整体表现被认为是“优秀”,8.0%（4/50）参评者被归类为“尚可”,62.0%（31/50）实验室被纳入“有待提高”。白血病相关融合基因诊断筛查和定量检测的整体表现明显优于定性检测和临床检验报告表现。（1）参评实验室的诊断筛查表现好,只有1家实验室出现PML-RARα亚型鉴定错误结果。（2）RT-qPCR定性检测表现不能令人满意,51.0%（25/49）实验室在治疗决策重要性的MRD监测点出现了至少1个假阳性或假阴性结果,共报告28个假阳性结果和15个假阴性结果;RT-qPCR定量检测稳定性差,表现为参评实验室不同样本之间检测能力不一致,不同实验室之间检测结果不一致;对PML-RAα融合基因低频亚型V,RT-qPCR定性和定量检测能力明显差于亚型L/S。（3）临床检验报告规范完整性表现差,只有检测结果却很少有基于给定APL模拟病例的临床解释和进一步检测建议;多数临床实验室有与临床科室沟通意愿,但深度有待加强。综上所述,模拟白细胞样本可以胜任PML-RAR融合基因临床检测流程质量评价,在RNA提取、内参基因和融合基因检测方面成功模拟了临床标本特征。针对不同的室间评价结果,临床实验室需要严格执行PCR分区操作防止样本污染,常规进行室内质量控制,定期进行仪器设备的维护和校准,以避免假阳性和假阴性结果;同时要主动优化和验证RT-qPCR检测程序,完善实验室程序性文件,以保证实验室定量检测结果的稳定性和准确性。临床实验室需关注检测样本的临床信息,合理分析检测结果,得出有专业临床解释的临床检验报告。临床实验室需加强与临床医师之间的沟通交流,继续参加室间质量评价和教育活动,以改进PML-RARα融合基因临床检测流程。本研究的创新性主要有:（1）使用MS2VLPs制备APL模拟白细胞样本,包括PML-RAR融合基因低频亚型V;（2）设计APL常规顺利型和极端复发型病例,在不同MRD监测点制备相应PML-RAR融合基因转录水平的模拟白细胞EQA样本,组成PML-RAR融合基因不同亚型的室间质评样本盘;（3）模拟APL临床检测流程,考查质控样本的RNA提取、入院诊断筛查、定性和定量检测,临床报告与临床治疗;（4）建立了适合急性早幼粒白血病PML-RARα FG检测流程的严格的EQA评分标准,评价实验室筛杏、定性和定量检测能力:（5）建立临床检验报告单评分标准,考查PML-RAR融合基因临床检验报告的规范完整性;（6）设计APL模拟病例和各EQA样本临床检查信息,以临床治疗响应和调整的有无为指标考查实验室与临床科室的沟通意愿和能力。
马丽丽[8]（2012）在《新疆不同民族食管鳞癌VEGF、HER-2、EGFR基因mRNA的表达及其与临床病理特征的关系》文中研究表明目的：探讨新疆汉族、维吾尔族和哈萨克族食管鳞癌中VEGF、HER-2、EGFR基因mRNA的表达及其与临床病理特征之间的关系。方法：采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测60例食管鳞癌组织及30例食管癌旁组织中VEGF、HER-2、EGFR基因mRNA的表达情况，分析其与临床病理特征的关系。结果：1食管癌旁组织中VEGF、HER-2、EGFR基因mRNA表达含量在汉族、维吾尔族及哈萨克族中差异无统计学意义（P＞0.05）；2食管鳞癌患者组中VEGF、HER-2、EGFR基因mRNA表达高于食管癌旁组（P＜0.05）；3汉族食管鳞癌中VEGF、HER-2mRNA的表达水平高于维吾尔族和哈萨克族患者（P＜0.05）；4组织中有淋巴结转移者的VEGF、HER-2、EGFR基因mRNA表达水平高于无淋巴结转移组（P＜0.05）；5HER-2mRNA的表达与病理分化程度有关，且病理分化程度越高，HER-2表达量越低（P＜0.05）。结论：1VEGF、HER-2基因mRNA的表达水平在新疆汉族、维吾尔族及哈萨克族食管鳞癌中具有民族差异。2VEGF、HER-2及EGFRmRNA可能与食管鳞癌的发生发展相关，并且可能对判断食管癌预后、筛选高危转移患者具有临床指导意义。
潘毓萱[9]（2004）在《结核病实验室诊断的某些概念问题》文中提出 一实验室诊断的目的和意义在仍缺乏有效的菌苗控制结核病的情况下,发现病人并进行合理治疗从而切断传染链就成为当今控制结核病策略重要策略。显然,诊断结核病人就成为整个结核病控制策略的起始。虽然结核病是因感染结核分枝杆菌而致已是不争的事实。但是,临床确诊所有的结核病人也并非易事。目前为止,结核病诊断仍然是一包括临床诊断,影象诊断和实验室诊断在内的综合诊断。
孙召洋,刘文健,张景皓,方毅,赵虎,张艳梅[10]（2019）在《泌尿系统感染检测方法研究进展》文中研究表明泌尿系统感染是临床最常见的感染性疾病之一,及时有效地控制泌尿系统感染可避免病原菌侵袭肾脏等重要脏器,显着改善患者预后和生活质量。快速、准确地确定泌尿系统感染病原体的种类并明确其对抗菌药物的敏感性是有效控制泌尿系统感染的关键。目前临床上诊断泌尿系统感染的主要依据是中段尿培养和尿常规检测,这些方法在时效性和准确性方面存在一定的不足。质谱技术、表面增强拉曼光谱技术、传感器和分子生物学技术等新技术和新方法为实现泌尿系统感染的快速、精准诊疗、改善公众健康状况提供了许多新思路,展现出较好的应用前景,文章对其展开综述。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于错配连接反应触发的级联链置换扩增反应构建的比色生物传感器用于PIK3CA基因点突变的检测 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 3 结果和讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于适配体修饰的磁珠和碳量子点/羟基氧化钴纳米片构建的新型三明治样荧光细胞传感器用于循环肿瘤细胞的检测 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 3 结果和讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于等温扩增和氢氧钴纳米片/量子点双重信号放大策略的新型生物传感器用于PML/RARa融合基因的检测 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 3 结果和讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 用于医疗生物传感的纳米材料 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间成果 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 真菌感染现状 |
| 1.1.1 曲霉属感染现状 |
| 1.1.2 镰刀菌属感染现状 |
| 1.1.3 假丝酵母属感染现状 |
| 1.1.4 隐球菌属感染现状 |
| 1.1.5 毛霉属感染现状 |
| 1.1.6 新冠病毒合并引发真菌感染现状 |
| 1.2 真菌感染的现有诊断方法 |
| 1.2.1 聚合酶链式反应 |
| 1.2.2 恒温扩增技术 |
| 1.2.3 分子杂交检测 |
| 1.2.4 测序技术 |
| 1.2.5 质谱技术 |
| 1.2.6 磁共振技术 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 NRH用于主要病原真菌的检测 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NRH法特异性、灵敏度检验 |
| 2.2.2 模拟临床样本的检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 PSR用于主要病原真菌的检测 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PSR用于主要病原真菌检测条件的优化 |
| 3.2.2 烟曲霉PSR检测方法的建立 |
| 3.2.3 白假丝酵母PSR检测方法的建立 |
| 3.2.4 新生隐球菌PSR检测方法的建立 |
| 3.2.5 模拟临床样本的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析的应用研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌早期鉴定的应用研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 A 英语术语(缩略语)对照表 |
| 附录 B 研究生期间发表的文章 |
| 附录 C 个人简历 |
| 附录 D 综述 MALDI-TOF MS 在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的应用进展 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 血红蛋白病简介 |
| 1.1.1 异常血红蛋白病简介 |
| 1.1.1.1 异常血红蛋白病的临床表现 |
| 1.1.2 地中海贫血简介 |
| 1.1.2.1 α-地中海贫血 |
| 1.1.2.2 β-地中海贫血 |
| 1.1.2.3 δβ-地中海贫血 |
| 1.1.2.4 δ-地中海贫血 |
| 1.2 地中海贫血临床筛查程序 |
| 1.2.1 婚前检查和孕前筛查 |
| 1.2.2 产前诊断和新生儿筛查 |
| 1.3 地中海贫血的筛查 |
| 1.3.1 血常规筛查 |
| 1.3.2 单管渗透性脆性试验 |
| 1.3.3 二氯苯酚吲哚酚沉淀试验 |
| 1.3.4 柠檬酸琼脂电泳 |
| 1.3.5 醋酸纤维薄膜电泳法 |
| 1.3.6 质谱法 |
| 1.3.7 等电聚焦电泳 |
| 1.3.8 高效液相色谱技术筛查 |
| 1.3.9 全自动毛细管电泳筛查 |
| 1.4 地中海贫血的诊断 |
| 1.4.1 跨越断裂位点PCR |
| 1.4.2 多重PCR |
| 1.4.3 高分辨率熔解曲线分析 |
| 1.4.4 实时定量聚合酶链反应 |
| 1.4.5 等位基因特异性寡核苷酸杂交技术 |
| 1.4.6 限制性片段长度多态性分析 |
| 1.4.7 多重扩增难治性突变系统 |
| 1.4.8 反向斑点印迹技术 |
| 1.4.9 多重连接探针扩增技术 |
| 1.4.10 DNA微阵列 |
| 1.4.11 连接酶检测反应 |
| 1.4.12 基因芯片技术 |
| 1.4.13 二代测序技术 |
| 1.5 地中海贫血检测结果的解释 |
| 1.6 地中海贫血的遗传咨询 |
| 1.7 地中海贫血的治疗和预防 |
| 1.7.1 地中海贫血的治疗 |
| 1.7.1.1 输血治疗 |
| 1.7.1.2 铁螯合治疗 |
| 1.7.1.3 胎儿血红蛋白的化学诱导 |
| 1.7.1.4 抗氧化剂 |
| 1.7.1.5 脾切除术 |
| 1.7.1.6 异体造血干细胞移植 |
| 1.7.1.7 基因治疗 |
| 1.7.1.8 慢病毒载体基因治疗 |
| 1.7.1.9 基因组编辑方法 |
| 1.7.2 地中海贫血的预防 |
| 1.8 本课题研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与研究方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究对象及样本的采集、存放 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.2.1 血红蛋白电泳试剂 |
| 2.1.2.2 基因组DNA提取试剂 |
| 2.1.2.3 PCR试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验技术路线 |
| 2.2.2 地中海贫血基因检测 |
| 2.2.3 基因组DNA提取 |
| 2.2.3.1 基因组DNA提取原理 |
| 2.2.3.2 实验前仪器和试剂准备 |
| 2.2.3.3 仪器自动化提取DNA步骤 |
| 2.2.3.4 仪器操作和DNA提取注意事项 |
| 2.2.4 PCR扩增 |
| 2.2.4.1 PCR扩增体系 |
| 2.2.4.2 PCR循环参数 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 血液学检测 |
| 2.2.6.1 血常规检测 |
| 2.2.6.2 血红蛋白电泳检测 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 基因诊断 |
| 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果 |
| 3.1.2 一代测序结果 |
| 3.2 血常规和血红蛋白电泳结果 |
| 3.3 新发突变家系研究 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A (攻读学位其间发表的论文) |
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 超便携、多功能DNA智能即时检测平台的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 DNA智能即时检测平台的临床应用性能评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 生化标志物智能即时定量检测平台的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 生化标志物智能即时定量检测平台的临床应用性能评价 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 微纳技术在下一代即时检测中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 肿瘤基因突变高通量测序检测参考物质制备平台的建立 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1 实验仪器 |
| 1.1.2 实验耗材 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 溶液配制 |
| 1.1.5 细胞系 |
| 1.1.6 宿主细菌和克隆载体 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台的建立 |
| 1.2.1.1 建立肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台的总体技术路线 |
| 1.2.1.2 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘的设计 |
| 1.2.1.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘中目的基因的选择 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.2.1 细胞复苏 |
| 1.2.2.2 细胞换液 |
| 1.2.2.3 细胞计数及传代 |
| 1.2.2.4 细胞冻存 |
| 1.2.2.5 细胞系基因DNA的提取及浓度测定 |
| 1.2.3 制备含肿瘤体细胞突变位点的DNA片段 |
| 1.2.3.1 突变位点引物设计 |
| 1.2.3.2 第一轮PCR |
| 1.2.3.3 第二轮PCR |
| 1.2.3.4 构建重组质粒 |
| 1.2.3.5 重组质粒验证 |
| 1.2.3.6 酶切回收含突变位点的DNA片段 |
| 1.2.4 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本盘的制备 |
| 1.2.4.1 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本中gDNA及突变片段拷贝数计算 |
| 1.2.4.2 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本稀释及制备 |
| 1.2.4.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘的制备 |
| 1.2.5 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘在不同NGS平台验证 |
| 1.2.5.1 Ion Torrent PGM平台靶向测序验证 |
| 1.2.5.2 Illumina Hiseq 2500平台靶向测序验证 |
| 1.2.6 肿瘤基因突变NGS检测参考物质均一性及稳定性探究 |
| 1.2.6.1 肿瘤基因突变NGS检测参考物质均一性探究 |
| 1.2.6.2 肿瘤基因突变NGS检测参考物质稳定性探究 |
| 2. 结果 |
| 2.1 HEK293T、1-F8-G9、GM12878细胞系的培养、细胞系基因组DNA提取及浓度测定 |
| 2.1.1 HEK293T、1-F8-G9、GM12878细胞系的培养 |
| 2.1.2 HEK293T、1-F8-G9、GM12878细胞系基因组gDNA的提取及浓度测定 |
| 2.2 含肿瘤基因突变位点的DNA片段结果 |
| 2.2.1 肿瘤基因突变位点的设计 |
| 2.2.2 肿瘤基因突变引物设计结果 |
| 2.2.3 含突变位点重组质粒的验证结果 |
| 2.2.3.1 单克隆菌落菌液PCR及电泳验证 |
| 2.2.3.2 重组质粒Sanger测序验证结果 |
| 2.2.4 酶切回收含突变位点的DNA片段结果 |
| 2.2.4.1 重组质粒提取结果 |
| 2.2.4.2 酶切回收含突变的DNA片段浓度及电泳图 |
| 2.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本盘制备 |
| 2.3.1 gDNA及含突变位点DNA片段拷贝数计算结果 |
| 2.3.1.1 人基因组细胞系gDNA拷贝数浓度计算结果 |
| 2.3.1.2 含肿瘤突变位点的DNA片段拷贝数浓度计算结果 |
| 2.3.2 含突变位点的DNA片段拷贝数稀释及加入体积的计算 |
| 2.3.2.1 含突变位点的DNA片段拷贝数稀释 |
| 2.3.2.2 含肿瘤基因突变的DNA片段加入体积 |
| 2.3.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘配制 |
| 2.3.3.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘的配制 |
| 2.3.3.2 乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘的配制 |
| 2.4 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘在不同NGS平台参考物质验证结果 |
| 2.4.1 Ion Torrent PGM平台验证结果 |
| 2.4.1.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在Ion TorrentPGM平台的验证结果 |
| 2.4.1.2 乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在Ion Torrent PGM平台的验证结果 |
| 2.4.2 Illumina Hiseq 2500平台验证结果 |
| 2.4.2.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在IlluminaHiseq 2500平台的验证结果 |
| 2.4.2.2 乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在Illumina Hiseq 2500平台的验证结果 |
| 2.5 参考物质均一性及稳定性结果 |
| 2.5.1 参考物质均一性验证结果 |
| 2.5.2 参考物质稳定性验证结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肿瘤基因突变高通量测序检测室间质量评价 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验方法 |
| 1.1.1 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价方案 |
| 1.1.2 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价临床实验室回报内容 |
| 1.1.3 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价检测结果的评价原则 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价结果 |
| 2.1.1 临床实验室测序平台使用情况 |
| 2.1.2 临床实验室NGS仪器使用情况 |
| 2.1.3 临床实验室靶向捕获方法使用情况 |
| 2.1.4 临床实验室靶向测序检测基因盘情况 |
| 2.1.5 临床实验室肿瘤基因突变NGS检测室间质评成绩情况 |
| 2.2 临床实验室的肿瘤基因突变NGS检测能力分析 |
| 2.2.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室检测能力分析 |
| 2.2.2 乳腺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室检测能力分析 |
| 2.3 临床实验室的肿瘤基因突变NGS检测突变解读结果分析 |
| 2.3.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室突变解读结果分析 |
| 2.3.2 乳腺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室突变解读结果分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 Comprehensive elaboration of database resources utilized in next generationsequencing-based tumor somatic mutation detection |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 pMD18-T载体信息 |
| 附录2 构建的含突变位点的DNA序列 |
| 附录3 Ion AmpliSeq Cancer Hotspot panel v2扩增子panel覆盖的基因列表 |
| 附录4 Illumina Hiseq 2500平台使用自制杂交捕获panel覆盖的基因列表 |
| 附录5 2017年全国肿瘤体细胞基因突变高通量测序检测生物信息学分析室间质评活动安排及注意事项(第一轮) |
| 附录6 2017年全国肿瘤体细胞基因突变高通量测序检测生物信息学分析室间质评活动安排及注意事项(第二轮) |
| 附录7 2017年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价测定结果回报表(第一轮) |
| 附录8 2017年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价测定结果回报表(第二轮) |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1. 仪器 |
| 1.1.2. 菌株和质粒 |
| 1.1.2.1. 宿主细菌 |
| 1.1.2.2. 表达质粒 |
| 1.1.2.3. 克隆质粒 |
| 1.1.3. 主要实验耗材 |
| 1.1.4. 主要实验试剂 |
| 1.1.5. 培养基和溶液的配制 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 内含PML-RARα融合基因L/S/V、内参基因和23s rRNA序列的重组病毒样颗粒原核表达载体的构建 |
| 1.2.1.1 提取pACYC-MS2质粒 |
| 1.2.1.2 PML-RARα融合基因亚型L/S/V、内参基因和23s rRNA目的序列的选择 |
| 1.2.1.3. 获取PML-RARα融合基因亚型L/S/V、内参基因和23s rRNA目的序列 |
| 1.2.1.3.1 外周血总RNA提取 |
| 1.2.1.3.2 大肠杆菌基因组DNA提取 |
| 1.2.1.3.3 总RNA逆转录 |
| 1.2.1.3.4 目的基因的PCR扩增 |
| 1.2.1.3.5 目的基因片段鉴定及纯化回收 |
| 1.2.1.3.6 目的基因片段与pMD18-T载体的连接 |
| 1.2.1.3.7 连接产物向凡E.Coli Top10的转化 |
| 1.2.1.3.8 阳性克隆菌落的鉴定 |
| 1.2.1.3.9 质粒的提取 |
| 1.2.1.4. 使用加入酶切位点的引物PCR目的序列并纯化PCR产物 |
| 1.2.1.5. 插入片段与目的载体pACYC-Duet1的双酶切 |
| 1.2.1.6. 目的片段与载体连接 |
| 1.2.1.7. 连接产物转化Top 10 E.Coli感受态细胞 |
| 1.2.1.8. 质粒小量提取 |
| 1.2.1.9. 鉴定重组质粒 |
| 1.2.1.10. 测序鉴定 |
| 1.2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 1.2.2.1. 提取pACYC-MS2-PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23s rRNA重组质粒 |
| 1.2.2.2. 重组质粒DNA的浓度定量和纯度鉴定 |
| 1.2.2.3. pACYC-MS2-PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23srRNA重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌 |
| 1.2.2.4. 重组病毒样颗粒在BL21(DE3)大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.2.5. 超声破碎 |
| 1.2.2.6. PEG 6000富集重组病毒样颗粒 |
| 1.2.2.7. 丙烯葡聚糖凝胶层析纯化重组病毒样颗粒 |
| 1.2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 1.2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组病毒样颗粒 |
| 1.2.3.2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定 |
| 1.2.3.3. RT-PCR鉴定重组病毒样颗粒内包装的目的RNA |
| 1.2.3.4. 透射电子显微镜鉴定重组病毒样颗粒 |
| 1.2.3.5. 重组病毒样颗粒的耐酶性实验 |
| 1.2.4. APL临床模拟病例的设计 |
| 1.2.5. 模拟白细胞样本的制备 |
| 1.2.5.1. E.Coli 23 rRNA MS2 VLPs添加量的确定 |
| 1.2.5.2. 阳性模拟白细胞样本AR-FG L/V/S和AR-CG s配比的棋盘格筛选 |
| 1.2.5.3. 模拟白细胞样本EQA样本盘的配制 |
| 1.2.5.4. 模拟白细胞样本EQA样本盘的验证 |
| 1.2.6. 报告单评分标准 |
| 1.2.7. 急性早幼粒白血病模拟白细胞样本作为质控样本开展全国PML-RARα融合基因临床检测流程室间质量评价 |
| 1.2.7.1. PML-RARα融合基因临床检测流程室间质量评价方案 |
| 1.2.7.2. 白细胞模拟样本EQA样本盘的建立 |
| 1.2.7.3. 白细胞模拟样本的稳定性评价 |
| 1.2.7.4. 白细胞模拟样本EQA样本盘的发放 |
| 1.2.8. 室间质评活动评分标准 |
| 1.2.9. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. 内含PML-RARα融合基因L/S/V、内参基因和23s rRNA序列的重组病毒样颗粒原核表达载体的构建 |
| 2.1.1. PCR扩增PML-RARα融合基因L/S/V、内参基因和23s rRNA序列目的片段 |
| 2.1.2. pACYC-MS2PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23srRNA重组载体的验证 |
| 2.2. PML-RARα FG L/V/S盔甲RNA (AR-FG L/V/S),chimeric CGs盔甲RNA(AR-CGs)和23s rRNA盔甲RNA (AR-23s)的表达和纯化 |
| 2.3. 重组MS2盔甲RNA的鉴定 |
| 2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组MS2盔甲RNA |
| 2.3.2. SDS-PAGE鉴定重组MS2盔甲RNA |
| 2.3.3. RT-PCR鉴定重组MS2盔甲RNA内含目的RNA序列 |
| 2.3.4. 透射电子显微镜鉴定重组MS2盔甲RNA |
| 2.4. 模拟白细胞样本的配制及EQA样本盘制作 |
| 2.4.1. E.Coli 23 rRNA盔甲RNA添加量的确定 |
| 2.4.2. 阳性模拟白细胞样本AR-FG L/V/S和AR-CG s配比的棋盘格筛选 |
| 2.4.3. 模拟白细胞样本EQA样本盘的配制 |
| 2.4.4. 模拟白细胞样本EQA样本盘的验证 |
| 2.4.5. 样本盘的稳定性实验 |
| 2.5. 模拟白细胞样本的PML-RARα临床检测流程室间质量评价 |
| 2.5.1. 模拟白细胞样本EQA样本盘的实验室分布和响应 |
| 2.5.2. PML-RARα临床检测流程室间质量评价结果 |
| 2.5.3. 临床检验报告规范完整性 |
| 2.5.4. 临床治疗的响应与调整 |
| 3. 讨论 |
| 3.1. 模拟白细胞样本性能验证 |
| 3.2. 白血病相关融合基因入院诊断筛查检测 |
| 3.3. PML-RARα融合基因RT-qPCR定性检测 |
| 3.4. PML-RARα融合基因RT-qPCR定量检测 |
| 3.5. 临床检验报告评分 |
| 3.6. 临床治疗方案及调整 |
| 3.7. 模拟白细胞样本总RNA的提取 |
| 3.8. 研究结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 急性早幼粒细胞白血病中RARA融合基因概述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: pACYCDuet-1载体详细信息 |
| 附录2: pMD18-T载体信息 |
| 附录3: 早幼粒白血病基因(PML) mRNA基因序列 |
| 附录4: 视黄酸受体α基因(RARA) mRNA基因序列 |
| 附录5: PML-RARα L/V/S,嵌合内参基因,23srRNA目的区域DNA序列 |
| 附录6: 表达载体pACYC-MS2-PML-RARα L/V/S,pACYC-MS2-CGs和pACYC-MS2-23s rRNA目的序列测序比对结果 |
| 附录7: APL临床模拟病例 |
| 附录8: 临床基因检验诊断报告模板 |
| 附录9: 室间质量评价调查活动安排及注意事项(样本号:A1711-A1715;C1731-C1736) |
| 附录10: 室间质量评价调查活动安排及注意事项(样本号:B1721-B1725;C1731-C1736) |
| 附录11: 室间质量评价调查活动结果回报表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 内容与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 标本处理 |
| 2.2 实时荧光定量聚合酶链反应 |
| 2.3 主要试剂与仪器 |
| 2.4 实验步骤 |
| 3 质量控制 |
| 4 统计学处理 |
| 附：技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
| 1 泌尿系统感染诊断的现状 |
| 1.1 中段尿细菌定量培养和菌种鉴定 |
| 1.2 全自动尿沉渣分析仪用于泌尿系统感染的快速筛查 |
| 1.3 尿干化学分析 |
| 2 泌尿系统感染相关生化标志物的检测 |
| 2.1 降钙素原用于区分上尿路感染和下尿路感染 |
| 2.2 Optotracing技术用于鉴别细菌耐药和反复发作性泌尿系统感染 |
| 3 质谱技术 |
| 4 表面增强拉曼光谱技术 |
| 5 微生物传感器技术 |
| 6 病原体靶向基因扩增技术 |
| 6.1 实时聚合酶链反应 |
| 6.2 重组聚合酶扩增技术 |
| 6.3 多重聚合酶链反应 |
| 7 微流控成像流式平台 |
| 8 总结与展望 |
