高糖增强过氧化氢诱导的牛主动脉内皮细胞凋亡

一、高糖增强过氧化氢诱导牛主动脉内皮细胞凋亡(英文)（论文文献综述）

张洋^[1]（2021）在《罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制》文中研究表明蒽环类药物,包括多柔比星（Doxorubicin,DOX）、表柔比星（Epirubicin,EPI）、吡柔比星（Pirarubicin,THP）等,广泛用于实体恶性肿瘤和血液系统肿瘤的治疗,但是蒽环类药物的心脏毒性在一定程度上限制了其临床应用。右雷佐生（Dexrazoxane,DZR）是目前FDA唯一批准使用的心脏保护药,但有报道发现DZR可能会加重化疗药物引起的骨髓抑制,并诱发第二癌的发生。因此,寻求一种减轻蒽环类药物所致心脏损伤的药物显得尤为重要。罗布麻叶总黄酮（AVLE）为罗布麻叶的主要活性成分,具有抗高血压、抗焦虑、抗抑郁和保护心脏等药理作用,随着对AVLE研究的不断深入,其对心血管系统疾病的防治作用已成为研究热点。异槲皮苷,又称槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Isoquercitrin,IQC）是一种天然黄酮类化合物,是AVLE中有效成份之一,广泛存在于水果、蔬菜、谷物和多种饮品中,具有抗氧化应激、抗肿瘤、保护心血管、降血糖及抗过敏等多种药理作用。非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）在许多重要生命活动中发挥功能,随着微小RNA（microRNA,miRNA）在人类疾病中的作用逐渐被揭示,深化miRNA的研究对于理解疾病发生发展的分子机制具有现实意义。本研究首先通过体内、外实验探讨IQC和AVLE对THP诱导的心脏损伤的保护作用及机制,然后通过生物信息学分析构建miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路,以此信号通路为切入点,利用AKT阻断剂及miRNA过表达/沉默瞬转细胞,从细胞水平加以验证,以期为开发和利用以IQC和AVLE为药效成分的中药资源提供科学依据。研究分为5部分:（1）AVLE对THP诱导大鼠心脏损伤的保护作用及机制首先预防性灌胃给予大鼠不同剂量的AVLE 1w,然后尾静脉注射THP（3mg/kg/w,6w）建立大鼠慢性心脏损伤模型,同时继续灌胃给予大鼠AVLE。观察大鼠心电图和大鼠心脏组织形态变化,并对血液动力学、血清BNP、CK-MB、CTn T和LDH水平、氧化应激相关指标、心肌线粒体膜m RNA水平及AKT/Bcl-2信号通路相关蛋白进行检测,探讨AVLE对THP诱导大鼠心肌损伤的保护作用及其可能的分子机制。结果如下:（1）AVLE中、高剂量组可提高THP所致心脏损伤大鼠的心率,减轻QRS波群改变,降低LVEDP,提高LVSP和±dp/dtmax水平;降低血清BNP、CK-MB、CTn T和LDH水平,提高SOD活性,降低MDA含量;改善THP所致的心肌病理学改变;降低心脏组织内线粒体膜VDAC1、ANT1和CYPD m RNA的表达,改善线粒体膜通透性。AVLE低剂量组对上述指标改善不明显。（2）AVLE抑制Cyt c由线粒体向胞浆的释放;提高pro-caspase-9、pro-caspase-3、p-AKT和Bcl-2蛋白的表达,降低Bax、cleaved-caspase-3的蛋白水平,减轻THP诱导心脏组织细胞凋亡的发生。（2）AVLE的制备及成份分析采用醇提法制备AVL提取物,大孔树脂进行纯化,富集其中黄酮类化合物。利用液相色谱-质谱串联法（HPLC-ESI-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）分析技术对AVLE进行定性和定量分析。结果如下:AVLE中含有7个黄酮类化合物,随后对其中4个主要单体化合物进行定量分析,确定IQC为AVLE中含量最多的化合物。（3）AKT在AVLE和IQC保护THP诱导H9c2细胞损伤中的作用以THP诱导H9c2细胞损伤,加入IQC/AVLE及AKT inhibitor,应用MTT、DCFH-DA荧光探针、ELISA、Mito-Tracker Red CMXRos探针、JC-1探针、TUNEL、RT-qPCR、Western blot等方法,探讨AKT在AVLE和IQC保护THP诱导H9c2细胞损伤中的作用。结果如下:（1）IQC（5～500μM）和AVLE（5～400μg/ml）在不同时间点（6、12、24及36h）对H9c2细胞无毒性作用;以5μM THP处理H9c2细胞24h,可使细胞发生凋亡,存活率降低;而IQC和AVLE均可抑制THP诱导的H9c2细胞损伤,最佳给药浓度及时间为70μM及70μg/ml,24h。IQC或AVLE均可降低THP处理H9c2细胞内ROS含量,提高SOD活性,降低MDA含量;提高H9c2细胞内线粒体活力,改善细胞线粒体膜电位,降低线粒体膜相关基因的表达。（2）IQC和AVLE提高H9c2细胞内pAKT的蛋白表达,抑制Cyt c由细胞线粒体向胞浆释放,降低细胞凋亡率,同时降低胞浆内cleaved-caspase-3蛋白表达水平,提高pro-caspase-9和procaspase-3的蛋白水平和Bcl-2/Bax的蛋白比值;应用AKT inhibitor可阻断IQC或AVLE对THP诱导细胞损伤的保护作用,说明AKT为IQC或AVLE发挥心脏保护作用的节点分子。（4）THP诱导大鼠心脏损伤miRNA芯片生物信息学分析及miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路的构建和验证对课题组前期构建THP所致大鼠心脏损伤的miRNA表达谱进行分析,最终确定miR-190a-5p作为研究对象。通过对miR-190a-5p靶基因预测和KEGG富集分析,发现在Phlpp1 m RNA的3’UTR处有miR-190a-5p的潜在结合位点,靶向性较好,且Phlpp1位于AKT上游调控分子中;同时搜索AVL靶基因并对其进行KEGG富集分析,结果发现AVL可参与调控AKT及其下游Bcl-2家族蛋白。因此,构建出miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路。采用RT-qPCR和Western blot法对预测得到的miR-190a-5p及其靶基因Phlpp1在THP所致大鼠心脏损伤组织/H9c2细胞中进行初步验证,结果发现IQC和AVLE可提高miR-190a-5p的表达,抑制Phlpp1基因和蛋白表达。采用双荧光素酶报告基因实验证实,miR-190-5p可直接调控Phlpp1,且只有唯一一个结合位点。（5）miR-190a-5p在THP诱导H9c2细胞损伤中的作用及机制通过构建miR-190a-5p过表达/沉默瞬转H9c2细胞,采用DCFH-DA探针、ELISA、Mito-Tracker Red CMXRos探针、JC-1探针、RT-qPCR、TUNEL和Western blot实验方法,探讨miR-190a-5p在THP处理H9c2细胞损伤中的作用及机制。结果如下:（1）miR-190a-5p mimics降低H9c2细胞内ROS的含量,提高SOD活性,降低MDA含量;同时提高H9c2细胞线粒体活力和膜电位,降低线粒体膜基因的表达;而转染miR-190a-5p inhibitor对THP处理H9c2细胞无改善作用。（2）miR-190a-5p mimics升高H9c2细胞内miR-190a-5p的表达,抑制Phlpp1基因及蛋白,升高p-AKT蛋白表达,并抑制Cyt c由线粒体向胞浆释放,降低细胞凋亡率,同时降低胞浆内cleaved-caspase-3蛋白表达,提高procaspase-9和pro-caspase-3的蛋白水平和Bcl-2/Bax蛋白比值;而转染miR-190a-5p inhibitor对THP处理的H9c2细胞中上述基因及蛋白无改善作用。综上所述:本研究分别从整体动物水平和细胞水平探讨IQC和AVLE对THP诱导大鼠心脏组织/H9c2细胞损伤的保护作用及其机制,所得结论如下:1.在体内研究中,AVLE对THP所致大鼠心肌损伤具有保护作用。2.通过对AVLE进行定性和定量分析,推测出7个黄酮类化合物,其中IQC是含量最多的化合物,为16.7%。3.在体外研究中,IQC和AVLE对THP诱导的H9c2细胞的损伤具有保护作用,且二者的保护作用相等。4.IQC和AVLE对THP诱导心脏/心肌细胞损伤的保护作用是通过调控miR-190a-5p/Phlpp1/AKT/Bcl-2信号通路实现的,且AKT为二者发挥心脏保护作用的节点分子。

李藤藤^[2]（2021）在《ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应》文中提出随着生活水平提高和生活方式的改变,动脉粥样硬化（AS）等心血管疾病病发率呈现逐年上升的趋势。AS是一种涉及平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞等多种细胞的慢性炎症性疾病,并伴随着一系列的并发症,给人们的生活带来诸多的困扰。淫羊藿是我国一种传统的药用植物,主要化学成分有黄酮、木脂素、苯酚苷、生物碱、多糖、挥发油、蒽醌、鞣质、甾醇、倍半萜等。淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿的主要化学成分,是一种黄酮类的化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、抗骨质疏松、抗心肌缺血缺氧、促进免疫调节及促进生殖内分泌功能等多种药理作用。ICA具有抗AS的作用,目前多集中于ICA对平滑肌细胞增殖迁移、内皮细胞损伤等的研究,对巨噬细胞炎症反应的相关研究比较少。微小RNA（microRNA,miRNA）是一种短链非编码RNA,miRNA在细胞的增殖、分化,生物体的生长、发育及疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。研究表明,miRNAs能够成为心血管疾病的治疗靶点、诊断标志。因此为我们寻找治疗、诊断AS提供了新思路和方法。本课题组前期实验研究已证实ICA具有抗AS的作用,并且构建了 ApoE-/-小鼠胸主动脉miRNA表达谱,但是有关ICA发挥抗AS的具体分子机制尚需进一步探索和研究。本研究从miRNA芯片入手,利用生物信息学分析构建了miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,并以该信号通路为切入点研究ICA对ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应及分子机制。本研究分为3部分:（1）ICA 抗 AS miRNAs 芯片生物信息学分析及 miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路构建首先比较ApoE-/-小鼠胸主动脉MOD组/CON组miRNA芯片结果,将差异基因的条件设定为p<0.05且|log2 fold change|>1.32,筛选出差异表达的miRNAs共16个。为了寻找RAW264.7中ICA发挥抗AS的关键miRNAs,随机挑选6个miRNAs,利用qPCR技术进行miRNAs表达的验证并确定miR-672-5p作为研究对象。通过TargetScan和DAVID数据库对其靶基因进行预测、GO分析及KEGG分析,我们发现miR-672-5p与细胞增殖、凋亡,蛋白质的转录与翻译等生物学过程密切相关,在miR-672-5p富集的信号通路中PI3K-AKT通路p值较小、富集到其中的靶基因较多,同时AKT3 mRNA的3’ UTR处与miR-672-5p存在结合位点且靶向性较好,因此我们构建出miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路。（2）ICA对ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应的作用及机制研究以ox-LDL诱导RAW264.7构建巨噬细胞源性泡沫细胞,同时加入ICA进行干预,通过 CCK-8、油红 O 染色、ELISA、qPCR 及 Western Blot 探讨 ICA 对 ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用,结果发现,ox-LDL可以降低RAW264.7细胞活力,诱导RAW264.7的泡沫化,增加培养上清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。ICA可以逆转上述反应的变化。说明ICA可以抑制ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应。进一步通过qPCR和Western Blot检测miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路相关基因及蛋白表达,结果表明,ox-LDL可以降低RAW264.7中miR-672-5p的表达,提高AKT3 mRNA及蛋白的表达,并且上调IKK、IκBα及p65的磷酸化水平,而ICA可以逆转上述基因和蛋白表达的改变。说明ICA可能通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,从而抑制ox-LDL诱导RAW264.7的炎症反应。（3）miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应中的作用构建过表达/沉默miR-672-5p的RAW264.7,利用油红O染色、ELISA、qPCR及Western Blot技术探讨miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用。结果发现,ox-LDL可以诱导RAW264.7的泡沫化,增加RAW264.7培养上清IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的含量,降低 RAW264.7 miR-672-5p 的表达,提高 AKT3 mRNA及蛋白的表达,并且上调IKK、IκBα和p65的磷酸化水平。过表达miR-672-5p可以逆转ox-LDL的作用,而沉默miR-672-5p则增强ox-LDL的作用。说明miR-672-5p通过调控AKT3,介导NF-κB信号通路,从而抑制ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应。综上所述,本实验证明ICA可能通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应,进而治疗AS。miR-672-5p是ICA治疗AS的分子靶点。

刘晓玲^[3]（2021）在《熊果酸减轻高糖高脂诱导的人主动脉内皮细胞损伤》文中进行了进一步梳理目的:1.选择适宜浓度的高糖（high glucose,HG）和棕榈酸钠（sodium palmitate,SPA）联合培养人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAEC）,模拟糖尿病患者高糖高脂的内环境,建立高糖高脂诱导的HAEC损伤模型。选择适宜浓度的熊果酸（ursolic acid,UA）进行干预,研究UA对高糖高脂诱导的内皮细胞是否有保护作用。2.探讨UA对高糖高脂诱导的内皮细胞保护作用的相关机制。方法:1.建立高糖高脂诱导的HAEC损伤模型。以不同浓度UA(1、5、10、20、40μmol·L-1)孵育细胞4 h,MTT法判断UA对HAEC的细胞毒性,确定UA的给药浓度。将HAEC细胞分为CON组、HG+SPA组、UA-L(1μmol·L-1)组、UA-H(5μmol·L-1)组,试剂盒检测HAEC的LDH释放率、培养液中NO的浓度。通过Western Blot法检测蛋白e NOS的表达情况。2.将HAEC细胞分为CON组、HG+SPA组、UA-L(1μmol·L-1)组、UA-H(5μmol·L-1)组。试剂盒检测细胞中ROS的生成、抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性。通过Western Blot法检测内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α和ATF6,粘附分子ICAM-1、VCAM-1,炎症反应相关蛋白TXNIP、NLRP3,caspase-1以及GSDMD的蛋白表达情况。荧光试剂盒检测细胞膜的完整状态以探讨焦亡发生情况。使用ELISA试剂盒检测细胞培养液上清中炎症因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量。结果:1.MTT法确定UA的给药浓度为1和5μmol·L-1。高糖高脂孵育后,细胞活力下降,LDH释放增多,NO释放和e NOS的蛋白表达减少。而预孵UA(1、5μmol·L-1)可以显着改善上述结果。2.UA可以显着抑制高糖高脂诱导的内皮细胞中ROS的生成,提高三种抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性,逆转内质网应激标志蛋白GRP78、p-PERK、ATF6、p-IRE1α的表达水平。此外,UA可以抑制粘附分子ICAM-1、VCAM-1,炎症反应相关蛋白TXNIP、NLRP3以及caspase-1和焦亡标志性蛋白GSDMD的表达水平,抑制炎症因子的胞外释放,对内皮细胞产生有益作用。结论:1.高糖高脂(30 mmol·L-1 HG+0.1 mmol·L-1SPA)孵育24 h后,HAEC明显损伤。预孵UA(1、5μmol·L-1)4 h对高糖高脂诱导的内皮细胞损伤具有一定的保护作用。2.UA可能通过抑制氧化应激以及抑制内质网应激,进而下调TXNIP/NLRP3炎症小体的表达,减轻炎症反应及细胞焦亡反应发挥内皮细胞保护作用。

陈芳芳^[4]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中指出研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。

刘晓琳^[5]（2021）在《DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用》文中研究表明研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,各种危险因素导致的血管重构和动脉粥样硬化是常见的病理基础。临床和病理研究表明,动脉粥样硬化病变主要发生在血管分叉、弯曲以及狭窄区域,高血压可引起血管壁细胞增殖、血管壁增厚,介入治疗术后异常血流可引起血管增生和再狭窄。这些因素提示血管力学因素是血管重塑和动脉粥样硬化形成的重要诱因。血管重塑主要表现为血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常增殖、凋亡和迁移。血管内皮细胞能够直接感受血流剪切力的刺激,通过细胞间的相互作用影响平滑肌细胞的功能。研究病理剪切力诱导血管重塑的分子机制以及内皮细胞和血管平滑肌细胞之间的相互作用有助于更好地理解心血管疾病的发病机制。近年来研究表明生物力学在新生内膜增生方面发挥了重要作用。DKK1蛋白,又称Dickkopf1,是一种分泌性糖蛋白,可通过旁分泌与自分泌发挥作用。一方面,DKK1通过与LRP6结合,从而拮抗下游Wnt通路发挥作用。另一方面,DKK1可以结合受体CKAP4,进而胞内段募集PI3K,激活Akt,促进增殖。既往研究中发现DKK1可通过调控CKAP4/PI3K/Akt、非经典Wnt/PCP/JNK以及β-catenin/MMP7通路促进肿瘤细胞增殖迁移及肿瘤存活。近年来,DKK1在心血管疾病中的作用受到关注,以DKK1为靶点的药物开发已进行到Ⅱ期临床试验。研究发现,DKK1与颈动脉内膜中层厚度呈正相关;接受双联抗血小板治疗的急性冠脉综合征患者中,DKK1水平与心血管事件和单独心血管死亡有独立相关性,内皮细胞与血小板来源的DKK1可通过抑制Wnt/β-catenin通路、活化NF-κB促进内皮细胞炎症反应,促进动脉粥样硬化。我们课题组前期研究发现,血清DKK1水平升高可作为急性冠脉综合征再发不良心血管事件的独立预测指标,联合危险因素显着提高预测价值。DKK1能够影响血管内皮细胞的功能。ox-LDL与病理剪切力均可上调血管内皮细胞DKK1表达,通过拮抗经典Wnt通路、激活JNK、促进脐静脉内皮细胞内质网应激,诱导凋亡,促进血流中单核细胞与内皮细胞黏附,并抑制内皮细胞间紧密连接分子的表达,从而促进动脉粥样硬化发生。在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默DKK1进一步证实,DKK1促进内皮细胞功能紊乱,促进斑块发生,增加斑块不稳定性。然而,DKK1对血管新生内膜形成的作用及机制尚未深入研究,DKK1受剪切力调节,剪切力干预下内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。本研究旨在研究剪切力-DKK1在内皮细胞-平滑肌细胞中对平滑肌增殖、迁移和新生内膜形成的影响及其潜在机制。研究目的1.探讨病理剪切力作用于内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能;2.检测内皮细胞DKK1蛋白缺失在低剪切力区域对血管新生内膜形成的影响;3.探索内皮细胞DKK1对血管新生内膜形成影响的潜在机制。研究方法1.采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl条敲小鼠模型鉴于目前DKK1-/-小鼠胚胎致死,本课题采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl（DKK1ECKO）条敲小鼠模型。2.小鼠颈动脉结扎模型的构建8-10周DKK1ECKO条敲小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄性小鼠行左侧颈动脉结扎制备血管低剪切力模型,21天后取材。3.动物取材小鼠麻醉,称量体重,固定。用1ml注射器于心尖取血,后续实验中检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。4.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μl细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。5.蛋白质印迹法（Western Blot,WB）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。6.组织切片染色颈动脉石蜡切片分别进行H&E染色、免疫组织化学染色及免疫荧光染色。测量结扎处颈动脉新生内膜面积、检测DKK1表达水平、检测PCNA及Ki67等增殖指标的表达水平。7.小鼠原代内皮细胞提取与培养4-5周大小的DKK1ECKO基因敲除小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄鼠用于提取小鼠主动脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞。8.人原代平滑肌细胞HASMC以及脐静脉内皮HUVECs的培养内皮细胞和平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。9.细胞共培养本实验中细胞共培养下的剪切力加载系统由3个部分组成:（1）用于内皮细胞-平滑肌细胞联合培养的平行平板流动腔;（2）培养基灌流循环系统;（3）细胞培养箱。给予内皮细胞加载生理剪切力（12dyne/cm2）和病理性低剪切力（4dyne/cm2）。静止状态下的共培养采用Transwell小室,上层接种转染Lenti-GFP-DKK1慢病毒过表达DKK1的内皮细胞,下室接种平滑肌细胞。10.VSMC细胞迁移的检测采用细胞划痕实验评价rDKK1对平滑肌细胞迁移的影响。11.VSMC细胞增殖的检测采用EdU试剂盒检测rDKK1对平滑肌细胞增殖的影响。12.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显着统计学差异。研究结果1.病理性低剪切力上调小鼠血管壁细胞中DKK1的表达小鼠体内在血管的平直段,单向的生理性脉冲剪切力起到血管保护作用;主动脉弓小弯侧等处主要为病理性的低剪切力及震荡剪切力,容易导致炎症、氧化应激反应和血栓形成。Western Blot结果显示主动脉弓小弯侧血管组织中DKK1的表达含量较胸主动脉直段显着升高（P<0.05）。说明在体内,自然状态下病理性低剪切力能够促进血管壁细胞中DKK1的表达。为进一步观察病理剪切力对血管壁细胞DKK1表达的影响,对小鼠行左侧颈总动脉结扎建立病理性低剪切力模型。结扎后48小时,通过Western Blot以及免疫荧光双染检测DKK1在血管壁细胞中的表达情况,结果均显示结扎组颈总动脉血管壁细胞中DKK1表达高于假手术组。以上结果说明,在体内病理剪切力能够上调血管壁细胞中DKK1的表达。2.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1具有旁分泌作用在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为 4dyne/cm2 的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。构建带有GFP标签的DKK1过表达慢病毒,转染内皮细胞并构建稳转株。Lenti-DKK1病毒转染的内皮细胞（上室）与平滑肌细胞（下室）共培养,24h后观察下室细胞荧光表达;发现共培养的平滑肌细胞内出现GFP荧光,提示内皮细胞分泌的DKK1可被共培养的平滑肌细胞摄取。3.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1通过旁分泌作用对平滑肌细胞功能的影响在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果显示,与0h相比,病理性低剪切力促进平滑肌细胞PCNA的表达,3h开始升高,12h达峰,并持续至24h（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予联合培养的内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为4dyne/cm2的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,生理对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,平滑肌细胞中PCNA表达上调（p<0.05）。将前期实验获得的DKK1干扰稳转株内皮细胞与平滑肌细胞联合培养,给予内皮细胞病理性低剪切力刺激12h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果提示:干扰内皮细胞的DKK1,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。中和抗体封闭实验:在进行剪切力加载前3h,在平滑肌细胞的培养液中加入10μg/ml DKK1的中和抗体。然后给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力12h。结果显示:使用DKK1中和抗体,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。重组蛋白刺激实验:用不同浓度的rDKK1（0,25,50,100,150,200ng/ml）对平滑肌细胞进行刺激不同时间（0,1,3,6,12,24h）,增殖的标志物PCNA表达上调（P<0.05）。免疫荧光显示,与Con组相比,rDKK1组Ki67以及PCNA阳性细胞的比率增加。EdU结果:与Con组相比,rDKK1组EdU阳性细胞量升高。结果提示外源性DKK1具有促进平滑肌细胞的增殖作用。4.DKK1内皮条件性敲基因小鼠一般情况检测DKK1ECKO基因敲除小鼠及DKK1fl/fl对照组小鼠的TC、TG、LDL-C及HDL-C的血清水平,均无统计学差异,说明DKK1不影响敲基因小鼠的血脂。5.内皮细胞DKK1蛋白不参与维持小鼠的血管形态DKK1不影响小鼠的血管形态。实验选取未造模的5、6、7周龄DKK1ECKO组及对照组小鼠,每周龄组各3只,行颈动脉H&E染色,结果显示2组小鼠血管形态均正常且无显着差异。6.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制小鼠结扎血管的内膜新生HE染色显示,与同窝对照的小鼠相比,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制了小鼠颈动脉结扎导致的病理性低剪切力区域的新生内膜形成（P<0.05）。7.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的增殖体内EdU以及组织免疫荧光染色显示,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制血管新生内膜中平滑肌细胞的增殖（P<0.05）。8.血管组织全基因组测序分析（RNA-seq）为了确定DKK1影响血管功能所涉及的分子特征和生物学过程,选取同窝生DKK1ECKO雄性小鼠与DKK1fl/fl雄性小鼠各6只,于8周龄时取材主动脉及颈动脉全长,2只同种小鼠血管为1个样本,进行血管组织全基因组测序分析。测序结果显示基因COX2及转录因子MYB的表达水平有明显差异。9.DKK1通过COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调COX2的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激,COX2表达上调。siRNA转染干扰COX2,然后给与rDKK1刺激12h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中PCNA的表达上调被抑制,说明COX2参与DKK1对平滑肌细胞增殖功能的调节。10.COX2是c-myb的靶基因,DKK1通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调c-myb的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激c-myb表达水平升高。利用siRNA转染干扰c-myb,然后给与rDKK1刺激6h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中COX2的表达上调被抑制,说明DKK1能够通过c-myb调控COX2的表达。11.DKK1主要通过与平滑肌细胞表面的CKAP4受体结合,通过PI3K/AKT通路促进平滑肌细胞的增殖利用siRNA转染干扰DKK1的常见受体LRP6以及CKAP4,然后给予人重组蛋白DKK1干预12h,敲除受体CKAP4可显着抑制DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用（P<0.05）。AKT是受体CKAP4的下游通路,使用AKT通路的抑制剂可阻断外源性DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用,也可阻断DKK1对c-myb的促表达作用（P<0.05）。结论1.病理性低剪切力可增加内皮细胞分泌DKK1并促进平滑肌细胞的增殖;2.内皮细胞DKK1促进小鼠血管结扎导致的低剪切力作用区域新生内膜的形成;3.DKK1可通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖。研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,高血压是心血管疾病的主要危险因素。高血压常常伴随血管壁的机械力异常,包括牵张力和剪切力,而牵张力增加是主要的力学改变。牵张力的异常可引起血管壁细胞的形态和功能改变,从而造成血管结构和功能异常,促进动脉粥样硬化斑块形成、血管增生、动脉瘤,并加重高血压靶器官损害。因此,进一步研究明确高血压的发生和致病机制,对于减少心血管病事件具有重要意义。肾素-血管紧张素（RAS）系统在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用,血管紧张素转化酶2（ACE2）是其关键组分之一。近年来,大量研究研究表明ACE2对心血管具有广泛的保护作用。ACE2是ACE的同源物,但在底物特异性上与ACE不同,ACE2能够裂解AngⅡ并产生血管扩张肽Ang（1-7）。ACE2在多种心血管疾病如心力衰竭、腹主动脉瘤和糖尿病肾病以及心脏纤维化等中发挥重要保护作用。我们实验室前期研究表明在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默ACE2进一步证实,ACE2能够抑制斑块发生发展,增加斑块稳定性。Dickkopf-1（DKK1）是一种多功能的分泌蛋白,Wnt信号通路抑制剂,最初在肿瘤学研究中发现DKK1在肺癌、结肠癌等肿瘤的发生起重要作用,并作为药物开发靶点进行二期临床研究。近期临床研究表明,DKK1与心血管疾病关系密切。我们课题组前期研究发现,不良心血管事件发生率随DKK1水平升高增加,DKK1联合hs-CRP与GRACE危险评分可以提高对ACS患者再发心血管事件的预测价值;进一步研究证明DKK1能够促进斑块形成,增加斑块不稳定性。近期研究发现DKK1参与牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用,进而参与到牵张力对平滑肌细胞功能的影响和血管壁重构,但机制尚未见报道。关于机械刺激调节血管细胞中ACE2表达的机制尚需深入研究。牵张力是否通过调控平滑肌细胞DKK1从而影响ACE2的表达,进而影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。研究目的1.明确病理性牵张力对平滑肌细胞ACE2、DKK1表达的影响;2.探讨ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响;3.探讨DKK1在牵张力调控平滑肌细胞ACE2表达中的作用。研究方法1.人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）的培养与处理人主动脉平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。2.动物模型的建立与取材对大鼠行腹主动脉缩窄术建立病理牵张力模型,随机分为腹主动脉缩窄组和假手术对照组,造模后3、5及7天后取材。将大鼠麻醉,称量体重后将其固定于泡沫板上。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。3.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μ1细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃ 10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。4.蛋白质印迹法（Western Blot）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。5.酶联免疫吸附测定（ELISA）牵张力加载结束后,收集不同组中平滑肌细胞的培养上清液,ELISA法检测上清中DKK1,Ang1-7及Ang Ⅱ的含量。6.EdU检测平滑肌细胞增殖采用EdU试剂盒检测ACE2在调节病理牵张力调节平滑肌细胞增殖中的作用。7.细胞划痕实验用细胞划痕实验检测ACE2在病理牵张力调节平滑肌迁移中的作用。8.流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin V/PI染色,通过流式细胞术检测ACE2在介导病理牵张力调节平滑肌细胞凋亡中的作用。9.细胞转染利用 Invitrogen 公司的 Lipo3000 分别转染DKK1 siRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA,检测ACE2的表达变化,验证DKK1及ATF3是否参与病理牵张力对ACE2的表达调节。10.双荧光素酶报告实验分别构建不同长度的ACE2启动子序列。将ATF3过表达质粒或ATF3 siRNA和ACE2启动子序列共转染HEK293工具细胞,双荧光素酶报告实验检测荧光表达强度。明确ATF3与ACE2基因的启动子结合。11.组织切片染色腹主动脉切片分别进行苏木素-伊红染色（H&E）、免疫组织化学染色。检测DKK1、ACE2表达水平。同时观察人体组织的血管,比较高血压与非高血压血管ACE2与DKK1的表达。12.人体血管组织的获取研究方案由山东大学齐鲁医院科研伦理委员会批准科研伦理号:KYLL-2021-121。13.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显着统计学差异。结果1.在体大鼠腹主动脉缩窄影响ACE2和DKK1的表达免疫组化与Western Blot结果均显示:与假手术组相比,大鼠腹主动脉缩窄后,血管壁细胞中ACE2表达下降（P<0.01）,DKK1以及ACE表达升高（P<0.01）。2.在高血压患者观察血管壁ACE2、DKK1的表达情况人体血管免疫组化染色显示:高血压患者血管壁平滑肌细胞中的ACE2表达均显着降低,DKK1的表达明显升高。3.病理牵张力调节血管平滑肌细胞中DKK1,ACE2/Ang-（1-7）和ACE/AngⅡ的表达给予平滑肌细胞不同时间（0,3,6,12,24h）18%机械牵张力刺激,同0h相比,18%机械牵张力能够抑制ACE2的表达（p<0.05）;促进ACE以及DKK1的表达（p<0.05）。18%机械牵张力促进AngⅡ及DKK1分泌（P<0.01）,抑制Ang（1-7）分泌（P<0.01）。4.ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响通过EdU检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞增殖的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的增殖（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞增殖（P<0.05）;通过细胞划痕实验检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞迁移能力的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的迁移（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞迁移（P<0.05）;通过流式细胞术检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞凋亡的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的凋亡（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞凋亡（P<0.05）;通过Western Blot检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞胶原合成的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的表达（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的合成（P<0.05）:5.病理牵张力通过p38/DKK1调控ACE2的表达为了探讨DKK1是否参与病理牵张力对人主动脉平滑肌细胞中ACE2的调节作用,利用小干扰转染干扰DKK1表达,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,病理牵张力干预下HASMCs中ACE2的下调被抑制（p<0.05）。给予平滑肌细胞抗DKK1中和抗体处理,也可抑制病理性牵张力对平滑肌细胞中ACE2的下调。以上结果提示,DKK1参与介导病理牵张力对平滑肌细胞中ACE2的表达调节（p<0.05）。病理牵张力诱导p38 MAPK、JNK和ERK1/2磷酸化（P<0.05）。p38 MAPK抑制剂SB203580显着减弱了病理牵张力诱导的ACE2下调（P<0.05）。给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,DKK1表达增加,SB203580阻断了病理牵张力对DKK1的上调作用（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力通过p38 MAPK促进DKK1的表达与分泌,进而调控ACE2的表达。6.病理牵张力通过ATF3调控ACE2的表达给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,ATF3表达增加,免疫荧光染色显示18%病理牵张力促进ATF3的核转位。利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了病理牵张力下调的 ACE2 水平（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力促进ATF3的表达增高,并促进转位进入细胞核来调控ACE2的表达。7.外源性DKK1可通过ATF3调控ACE2的表达使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组 DKK1 蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。与 0h 相比,rDKK1 刺激 6h 后 ACE2蛋白表达水平即明显下调,持续至24h（p<0.05）。使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、15、30、60、120、180min）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。由于ATF3是一种快速反应蛋白,因此我们使用较短的时间梯度。与0h相比,rDKK1刺激15min即可明显促进ATF3的表达,30min达到高峰（p<0.05）。然后,利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了 DKK1下调的ACE2水平（P<0.05）。8.ACE2是ATF3的靶基因为了进一步确定ATF3是否直接能够调节ACE2的表达,我们利用JASPAR数据库（jaspar.genereg.net）分析了 ACE2启动子序列区域中ATF3潜在的结合位点。双荧光素酶基因报告实验证实,ATF3可调控ACE2的转录活性。ChIP实验结果进一步验证了 ATF3与ACE2基因的这个转录区域结合。结论1.病理性牵张力促进血管平滑肌细胞DKK1表达,抑制ACE2表达;2.ACE2参与病理性牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移等功能的作用;3.病理性牵张力可通过促进平滑肌细胞DKK1的分泌进而抑制ACE2的表达;4.病理牵张力通过p38/DKK1/ATF3调控ACE2的表达,ACE2是转录因子ATF3的靶基因。

郑腾飞^[6]（2021）在《DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究》文中研究表明1 研究背景病理性的机械牵张力可导致心脏和血管重构,包括心肌肥大、心肌纤维化、心力衰竭、血管壁增厚和硬化以及动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）。血管中膜的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在维持血管稳态中发挥重要作用,主要受到牵张力调控。病理性牵张力可以促使VSMCs从收缩表型向合成表型转换,表现为细胞增殖和迁移活性增强,收缩能力减弱以及细胞外基质分泌增加。然而,牵张力调节VSMCs功能的分子机制仍有待进一步阐明。机械牵张力调控平滑肌细胞基因表达及细胞功能需要将机械力转换为细胞内部信号,这个过程需要位于细胞膜表面及细胞内部的分子和细胞结构的介导。既往研究表明,初级纤毛、整合素、离子通道、钙黏蛋白以及近年报道的细胞核膜蛋白等参与了力学刺激向平滑肌细胞内部的信号转导。其中研究较为深入的是整合素家族,整合素β3亚基可介导病理性牵张力促平滑肌细胞增殖和表型转换的作用。Dickkopf-1（DKK1）是一种分泌型糖蛋白,是Dickkopf家族中最早被发现的成员。DKK1的经典作用是可阻断经典Wnt通路。除此之外,DKK1还可调控非β-连环蛋白（β-catenin）依赖的Wnt通路。另一方面,DKK1还可以结合细胞膜上的细胞骨架关联蛋白4（CKAP4）,激活PI3K/AKT通路发挥生物学作用。DKK1早期在肿瘤中研究得比较深入,目前已经有多项临床试验研究以DKK1作为肿瘤的治疗靶点。近年研究也证明DKK1在心血管疾病发生发展中发挥重要作用。DKK1参与动脉粥硬化发生发展的研究较为明确,本课题组既往研究发现DKK1介导病理性剪切力导致的AS。但其是否参与其他类型的血管重构及其可能机制研究相对较少,DKK1是否介导病理性牵张力导致的血管重构尚无报道。进一步揭示DKK1在心血管疾病发展中的作用及机制,对于研发和应用DKK1相关的抗肿瘤和心血管疾病的药物以及防治肿瘤治疗带来的心血管损害具有重要意义。2 研究目的（1）明确不同机械牵张力对血管平滑肌细胞DKK1表达的调控作用;（2）探讨DKK1在病理性牵张导致的血管重构中的作用。3 研究方法3.1 小鼠腹主动脉缩窄（AAC）模型的构建使用手术缝线在肾动脉以上水平部分结扎小鼠腹主动脉以构建病理性牵张力刺激的动物模型。3.2 构建平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠将Dkk1flox/flox小鼠与SM22-Cre小鼠交配,F1代互相杂交得到Dkk1flox/floxSM22-Cre+小鼠,即为平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠。该小鼠被命名为Dkk1SMKO小鼠。3.3 心率和血压测量小鼠的基线心率和血压使用自动血压分析系统通过鼠尾袖带法测量。AAC手术组和假手术组小鼠的血压用插入左颈动脉的Millar导管测量。3.4 超声心动图评价小鼠心功能使用Vevo 2100成像系统对小鼠进行超声心动图检查。异氟醚妥善麻醉后测量小鼠左心室分数缩短率（FS,%）和射血分数（EF,%）以评价收缩心脏功能,通过组织多普勒超声测量E/E’评价舒张功能。3.5 动物取材及病理组织学检测小鼠麻醉后心尖取血,分离血清,检测DKK1水平。取材小鼠心脏和主动脉全长。小鼠胸主动脉及心脏固定后石蜡包埋切片后行HE染色观察形态,免疫荧光染色检测小鼠胸主动脉及冠脉中DKK1、PCNA、α-SMA表达水平。3.6 蛋白质印迹法（Western Blot,WB）组织或HASMCs裂解后提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后加入5×上样缓冲液,煮沸变性。按照蛋白总量10μg/孔上样,凝胶电泳后,应用电转法将蛋白转印到膜上。膜经过封闭后孵育一抗4℃过夜,次日充分洗膜3次,在室温下孵育二抗1小时。应用化学发光法检测蛋白信号,拍照,分析条带灰度值。3.7 平滑肌细胞培养原代人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）使用SMCM培养基培养,选取4-6代进行细胞实验。采用组织贴块法提取小鼠原代主动脉平滑肌细胞,使用含10%血清的DMEM培养基培养,选用4-6代细胞进行实验。3.8 体外牵张力刺激使细胞生长于包被有Ⅰ型鼠尾胶原的Bioflex板底部,加载于FX5000-Tension系统中对细胞施加周期性机械牵张力刺激。生理性牵张力刺激:5%延伸幅度,1Hz（60次/分钟）;病理性牵张力刺激:18%延伸幅度,1Hz（60次/分钟）。3.9 小干扰RNA与转染利用lipo2000转染目的基因的siRNA和对照siRNA,依照实验分组给予刺激,转染48h后进行下一步实验。3.10 EdU细胞增殖实验按照试剂盒说明书操作,细胞上清中加入10μM的EdU溶液,孵育6小时后固定细胞,经通透化处理后加入配好的Apollo染色液避光染色30分钟,充分洗涤后,复染细胞核。荧光显微镜下观察、拍照。3.11 CCK-8细胞增殖实验细胞上清中加入CCK-8溶液,细胞培养箱内孵育2-3小时,随时观察上清颜色变化,使用酶标仪在450nm波长测定吸光度。3.12细胞周期检测使用细胞周期检测试剂盒检测细胞周期。将HASMCs用胰酶消化,离心并用预冷PBS洗涤细胞1次,使用预冷的70%乙醇在4℃下固定过夜。然后用PBS洗涤细胞两次,加入碘化丙啶在37℃下避光染色30分钟。过滤细胞并在流式细胞仪的FL2通道中进行分析。3.13 Transwell细胞迁移实验使用具有8μm孔径的24孔插件进行Transwell实验。上室中加入200μl含有2×104个VSMCs的无血清SMCM,下室中加入600μl的含10%血清的SMCM。6小时后,将穿透至膜底的细胞固定,用结晶紫染色,并在显微镜下拍照。3.14 ELISA细胞上清和小鼠血清应用人和小鼠DKK1的ELISA试剂盒检测DKK1浓度。3.15 统计分析数据以均数±标准误表示,以Prism 6软件行数据统计分析。所有数据经过正态性检验,符合正态分布的使用非配对t检验分析两样本间差异,单因素方差分析和双因素方差分析检测多个样本间差异,然后进行Turkey事后检验。不符合正态分布的使用非参数检验。P<0.05为有显着统计学差异。4 研究结果4.1 AAC术后小鼠动脉平滑肌细胞中的DKK1表达增加AAC小鼠的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）明显高于假手术对照组。免疫荧光实验结果显示,与假手术对照组相比,AAC小鼠术后1周胸主动脉和冠状动脉的中膜中检测到DKK1蛋白水平显着增加。胸主动脉组织蛋白行Western blot分析显示,AAC小鼠中DKK1的相对蛋白表达水平明显增加。4.2 平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠构建及验证荧光双标检测到动脉中膜平滑肌DKK1敲除效率满意。分别提取对照和Dkk1SMKO主动脉组织蛋白和原代主动脉平滑肌细胞,经Western blot分析显示DKK1敲除效果良好。Dkk1SMKO与对照组小鼠在体重、血压、心率方面均无显着差异。4.3 平滑肌细胞特异性敲除DKK1改善AAC导致的血管重构将Dkk1SMKO小鼠与同窝生Dkk1flox/flox对照小鼠构建AAC模型,并设置假手术对照。术后3周取材,石蜡切片HE染色显示与Dkk1flox/flox对照小鼠相比Dkk1SMKO小鼠AAC术后3周胸主动脉和冠状动脉动脉中膜增厚明显减轻（P<0.05）。与Dkk1flox/flox对照小鼠相比,Dkk1SMKO小鼠AAC术后3周胸主动脉和冠脉中PCNA表达量明显减少,α-SMA表达量明显增高（P<0.05）。平滑肌细胞特异性敲除DKK1对AAC术导致的小鼠心脏增大和心功能改变没有明显影响。4.4病理性牵张力刺激促进平滑肌细胞中DKK1表达用病理性牵张力（18%）处理HASMCs不同持续时间（0、3、6、12或24小时）,HASMCs和细胞上清液都表现出DKK1蛋白水平的时间依赖性增加,并在6小时差异到达统计学意义,而在5%循环拉伸下HASMCs的DKK1蛋白水平无明显变化。静止、生理性（5%）或病理性牵张力（18%）处理HASMCs持续6小时,DKK1的蛋白水平在病理性牵张力处理的细胞中显着升高（P<0.05）。后续研究DKK1表达变化实验选择6小时作为机械牵张力刺激持续时间。4.5 整合素亚基β3介导机械拉伸对DKK1的调节Western blot、ELISA和RT-qPCR分析表明,在病理性牵张力刺激下,用siRNA干扰整合素亚基β3（ITGB3）表达。与对照组相比,干扰ITGB3表达组的DKK1蛋白水平、mRNA水平和分泌水平均明显下调（P<0.05）。4.6 DKK1介导病理性牵张力刺激调控平滑肌细胞功能在HASMCs转染DKK1 siRNA或对照siRNA后,用生理性或病理性牵张力刺激HASMCs 24hr。EdU和CCK-8实验表明,18%的牵张力刺激显着促进了HASMCs的增殖,而干扰DKK1表达可部分逆转这一作用（P<0.05）。细胞周期分析发现,干扰DKK1表达使G0-G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少（P<0.05）。同样,Transwell测定结果显示,DKK1 siRNA组迁移到下腔的细胞数量明显低于对照组（P<0.05）。提取细胞全蛋白行Western blot分析显示,与生理性牵张力处理相比,病理性牵张力上调了 PCNA的蛋白水平,下调了 α-SMA的蛋白水平（P<0.05）,干扰DKK1的表达可部分逆转这一作用。给予HASMCs外源性重组DKK1刺激促进了细胞的增殖和迁移,促进了 PCNA的表达,抑制了 α-SMA的表达（P<0.05）。5结论（1）人血管平滑肌细胞中DKK1表达受机械牵张力调控,病理性牵张力促进平滑肌细胞DKK1表达;（2）DKK1介导了机械牵张力调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移功能;（3）平滑肌细胞敲除DKK1可减轻病理性牵张力导致的动脉中膜增厚,降低中膜平滑肌细胞增殖,改善中膜平滑肌细胞收缩表型的异常。1 研究背景Dickkopf-1（DKK1）蛋白,是一种分泌性糖蛋白。它最为人们熟知的作用是与Wnt分子竞争受体LRP5/6以及促进LRP5/6内吞降解进而拮抗经典Wnt/β-catenin通路。DKK1还能通过调控一些非β-catenin依赖的途径影影响细胞增殖、迁移、凋亡及炎症反应,如非经典Wnt通路等。DKK1还可与CKAP4结合,激活PI3K/AKT通路,促进肿瘤细胞增殖。因其在多种病理过程中的重要作用,DKK1成为一种有前景的药物开发靶点。在心血管疾病中,DKK1同样扮演重要角色,在内皮细胞功能失调以及动脉粥样硬化当中的作用已经得到证实。但是DKK1在平滑肌细胞功能失调和其他类型的血管重构中的作用仍有待研究。更加详细地阐明DKK1在心血管疾病中的作用及其机制对于指导靶向DKK1药物的开发和应用具有重要意义。在本研究第一部分,我们发现,敲除小鼠平滑肌中的DKK1可明显抑制病理牵张力所导致的血管重构。体外研究同样证实,干扰DKK1的表达可以显着抑制病理性牵张力导致的平滑肌细胞功能失调,包括增殖、迁移活性的增加以及收缩表型标记物的降低。然而,DKK1通过怎样的途径介导了机械牵张力调控平滑肌细胞的功能尚需进一步探讨。2研究目的（1）确定参与DKK1调控血管平滑肌功能的下游靶标;（2）揭示DKK1调控该靶标的信号通路和分子机制。3 研究方法3.1 细胞培养原代人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）使用SMCM培养基培养,选取4-6代进行细胞实验。293T细胞和原代小鼠主动脉平滑肌细胞在DMEM培养基中培养。3.2 质粒构建与转染分别构建含有野生型UHRF1启动子区、突变型UHRF1启动子区的萤光素酶报告基因质粒（pGL3）:UHRF1-WT和UHRF1-MUT。构建PCDNA3.1-YAP过表达质粒质粒,空白载体质粒PCDNA3.1。质粒使用Lipofectamine3000转染试剂进行瞬时转染。3.3 小干扰RNA与转染利用lipo2000转染目的siRNA和对照siRNA,依照实验分组给予刺激,转染48h后进行下一步实验。3.4 实时定量 PCR（RT-qPCR）用试剂盒提取细胞的总RNA,反转录为cDNA后,使用SYBR Green进行RT-qPCR。采用2-ΔΔCT方法测定相对基因表达。CT值以甘油醛酸-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为对照进行归一化。3.5 体外牵张刺激使细胞生长于包被有Ⅰ型鼠尾胶原的Bioflex板底部,于FX5000-Tension系统中对细胞施加牵张力刺激。生理性牵张刺激:1Hz（60个循环/分钟）,5%elongation;病理性牵张刺激:1Hz（60个循环/分钟）,18%elongation。3.6 EdU细胞增殖实验按照试剂盒说明书操作,细胞上清中加入10μM的EdU溶液,孵育6小时后固定细胞,经通透化处理后加入配好的Apollo染色液避光染色30分钟,充分洗涤后,使用Hoechst 33342染核,荧光显微镜下观察拍照。3.7 CCK-8细胞增殖实验细胞上清中加入CCK-8溶液,细胞培养箱内孵育2-3小时,待出现明显颜色变化后,在450nm波长处测定吸光度。3.8 Transwell 细胞迁移实验使用具有8μm孔径的24孔插件进行Transwell实验。将含有10%FBS的600μl SMCM培养基加入Transwell小室的下室,上室中加入200ul含有2×104个VSMCs无FBS的SMCM培养基加入上室。6小时后,将穿透至膜底的细胞固定,用结晶紫染色,并在显微镜下拍照。3.9 组织学检测新鲜组织在4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,切片。石蜡切片脱蜡至水。用免疫荧光染色法检测小鼠胸主动脉和冠状动脉中YAP的表达水平,用免疫组化染色法检测UHRF1的表达水平。3.10 蛋白质印迹法（Western Blot,WB）组织或HASMCs裂解后提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后加入5×上样缓冲液,煮沸变性。按照蛋白总量10μg/孔上样,凝胶电泳后,应用电转法将蛋白转印到膜上。膜经过封闭后孵育一抗4℃过夜,次日充分洗膜3次,在室温下孵育二抗1小时。应用化学发光法检测蛋白信号,拍照,分析条带灰度值。3.11染色质免疫沉淀法用1%甲醛交联HASMCs,然后加入125mM甘氨酸。洗涤后,将细胞收集在离心管中,超声处理,用正常IgG、抗组蛋白H3、抗TEAD1和抗TEAD4抗体免疫沉淀,4℃过夜。洗脱和解交联后纯化DNA,并用覆盖UHRF1启动子特定区域的引物进行PCR分析。3.12萤光素酶报告基因检测将Renilla报告基因下游的野生型和突变型UHRF1-启动子克隆到PGL-3质粒中,并使用Lipofectamine 3000转染到YAP1过表达的293T细胞和对照293T细胞中。转染48小时后用双萤光素酶报告试剂盒分析荧光素酶活性。3.13统计分析数据以均数±标准误表示,以Prism 6软件行数据统计分析。所有数据经过正态性检验,符合正态分布的使用非配对t检验分析两样本间差异,单因素方差分析和双因素方差分析检测多个样本间差异,然后进行Turkey事后检验。不符合正态分布的使用非参数检验。P<0.05为有显着统计学差异。4研究结果4.1经典Wnt通路不参与DKK1在VSMCs中的作用用FH535对HASMCs进行预处理,不影响DKK1-siRNA转染导致的PCNA表达下调和α-SMA表达上调。EdU实验、CCK-8实验和Transwell实验也表明,用FH535预处理HASMCs不影响DKK1-siRNA转染导致的HASMCs细胞增殖和细胞迁移能力的下调。4.2 UHRF1的表达受DKK1调控UHRF1的蛋白水平在病理性牵张刺激下显着增加,而在生理性牵张刺激下无明显变化。在病理性牵张刺激下,通过转染siRNA干扰DKK1的表达后,UHRF1的mRNA和蛋白水平显着下调。此外,rhDKK1刺激显着增加HASMCs中UHRF1的表达。免疫组化和Western印迹分析显示,AAC增加了主动脉和冠状动脉中膜中UHRF1的表达,这种变化在Dkk1SMKO小鼠中明显减弱（P<0.05）。提取对照小鼠和Dkk1SMKO小鼠主动脉平滑肌细胞,体外培养后提取细胞全蛋白,发现敲除DKK1的小鼠主动脉平滑肌细胞中UHRF1蛋白水平显着降低。4.3 UHRF1介导了DKK1对HASMCs增殖和迁移功能的作用用siRNA干扰UHRF1 48小时后给予HASMCs以rhDKK1刺激的同时分别施加生理性牵张（5%）、病理性牵张（18%）刺激24小时。结果发现干扰UHRF1表达显着减弱了在rhDKK1刺激的HASMCs中观察到的细胞增殖和迁移的增加（P<0.05）。Western blot分析表明,干扰UHRF1表达后PCNA的蛋白水平明显下降,α-SMA的蛋白水平上升。4.4 DKK1 通过 YAP/TEAD 途径调控 UHRF1Western blot分析表明,病理性牵张减少了 YAP在Ser127处的磷酸化,干扰DKK1表达后,YAP的磷酸化增强（P<0.05）。用rhDKK1处理后,HASMCs中YAP在Ser127处的磷酸化也减少（P<0.05）。此外,免疫荧光结果证实DKK1敲除后明显降低了核YAP的定位。当用维替泊芬（VP）破坏YAP-TEAD的相互作用或用小干扰RNA干扰YAP在HASMCs中表达时,UHRF1的mRNA和蛋白水平明显下降（P<0.05）。Western blot分析显示,与假手术的小鼠主动脉相比,AAC小鼠主动脉表现出更高的YAP蛋白水平,敲除DKK1可以降低AAC诱导的YAP上调（P<0.05）。免疫荧光显示AAC增加了血管平滑肌细胞核中YAP阳性的比例。而在Dkk1SMKO小鼠中,这一比例显着降低。VP处理显着逆转了rhDKK1在HASMCs中的作用,导致HASMCs中UHRF1和PCNA表达减少,α-SMA表达增加。4.5 YAP/TEAD通路调控UHRF1表达的分子机制通过使用JASPAR数据库预测到TEAD蛋白家族成员可直接与UHRF1启动子区域结合。干扰TEAD1和TEAD4的表达,UHRF1 mRNA明显下调（P<0.05）。当同时敲除TEAD1和TEAD4时,UHRF1蛋白的减少比单独的siRNA处理更加明显（P<0.05）。此外,染色质免疫共沉淀（ChIP）实验表明,在UHRF1基因ATG上游275 bp和229 bp之间检测到TEAD1和TEAD4的富集。双萤光素酶实验数据证实,YAP过表达可显着激活野生型UHRF1启动子萤光素酶活性,而干扰TEAD1和TEAD4的表达可抑制这种激活（P<0.05）;YAP过表达可显着激活野生型UHRF1启动子萤光素酶活性,但不能激活结合位点突变的UHRF1启动子萤光素酶活性（P<0.05）。5结论（1）UHRF1参与DKK1对平滑肌细胞增殖和迁移功能的调控;（2）在机械牵张力刺激下,DKK1通过YAP/TEAD通路平滑肌细胞调控UHRF1的表达。

商国凯^[7]（2021）在《骨骼肌间质纤维脂肪沉积在肌少症中的作用及其干预机制研究》文中提出研究背景肌少症是一类以进行性和广泛性骨骼肌肌力减弱和肌量减少为特征,以肌细胞的萎缩和减少、间质纤维和脂肪组织增多为主要病理表现的综合征。肌少症的发生与年龄增长息息相关,自35岁起人体肌肉组织含量逐渐减少,100%的老人患有肌少症。肌少症可以造成诸多不良事件,包括摔倒、功能减退、虚弱乃至死亡。在人口老龄化愈益明显的当代,肌少症作为一个在老年人群中普遍存在的现象,探寻其可能的发生机制及有效的干预靶点具有重要意义。骨骼肌细胞萎缩是肌少症的主要病理学改变之一。骨骼肌细胞包括慢肌细胞（Ⅰ型肌细胞）和快肌细胞（Ⅱ型肌细胞）。研究报道,在老年人群中,骨骼肌细胞大小及数量均发生衰减,而这种衰减以快肌细胞为着。运动训练虽然可以部分减轻快肌细胞的衰减,但是并不能完全阻止。快肌细胞的减少与老年人群快速运动能力下降密切相关,而慢肌细胞的保留与老年群体缓慢行走的特点相符合。因此,改善骨骼肌细胞萎缩,特别是快肌细胞的萎缩,对于改善老年人群运动功能十分重要。骨骼肌间质纤维组织增多是肌少症的另一主要组织病理学改变,是导致老年人群骨骼肌功能减退的重要原因。研究显示,老年小鼠骨骼肌间质存在纤维结缔组织的增多,增加了骨骼肌的僵硬程度,限制伸展和收缩,降低老年人的运动能力。此外,纤维组织沉积会干扰肌卫星细胞与周围细胞的相互作用,导致其成肌功能减退,从而影响肌组织再生。因此,改善间质纤维化有望改善衰老骨骼肌功能。骨骼肌细胞萎缩和间质纤维化是肌少症的两大主要改变,是老年人群骨骼肌功能和整体运动能力减退的重要原因,如何减轻肌细胞萎缩、抑制间质纤维化,是改善老年人群肌少症的关键。TRB3可能是架起老年人骨骼肌细胞萎缩、间质纤维化和运动能力减退的桥梁。研究报道,TRB3基因的表达水平存在年龄相关性,并在细胞增殖、细胞分化和间质纤维化中起到重要作用。TRB3能够在食物剥夺的情况下通过负性调节蛋白转换导致骨骼肌细胞萎缩和骨骼肌功能抑制,能够抑制体外培养的C2C12细胞的成肌分化。TRB3与多种疾病的间质纤维化相关,例如糖尿病心肌病变、糖尿病肾病和系统性硬化等。因此,有理由推测,TRB3表达水平改变可能在衰老相关骨骼肌细胞萎缩和间质纤维化中发挥作用。在本研究中,我们以野生型及TRB3基因敲除小鼠为研究对象,建立自然衰老小鼠动物模型,探讨小鼠骨骼肌中TRB3表达水平改变对骨骼肌细胞萎缩及间质纤维化程度的影响及其可能机制。研究目的1.研究TRB3基因是否参与老年肌少症的发生发展;2.研究TRB3基因干预改善老年肌少症的可能机制。研究方法1.实验动物分组4周龄雄性C57/BL6野生型（WT）小鼠和同品系TRB3基因敲除（TRB3-/-）小鼠随机分为年轻组和老年组:WT年轻组、WT老年组、TRB3-/-年轻组、TRB3-/-老年组。年轻组小鼠饲养至3月龄,老年组小鼠饲养18月龄。2.运动能力检测于实验末进行小鼠运动能力检测,包括:拉力测试:水平放置测力计,抓住鼠尾,通过训练使小鼠双前肢抓紧测力元件,水平向后拉动小鼠使其腾空,直至其松开测力元件,记录测力计数值,测量3次取平均值。笼线测试:将45 cm×45 cm铁丝网置于55 cm高的笼线架上方,下方铺5 cm厚的软垫,将小鼠放在笼线中间部位,经其头侧翻转,使之倒挂,记录力竭掉落的时间,间隔30min以上进行3次测量,取平均值。跑步力竭运动测试:将小鼠放在跑道上,初始速度13 m/min、坡度0°,每3 min速度和坡度分别增加2 m/min和2°,直至分别达到39 m/min和14°,当小鼠至少连续20 s不上跑道,并对外界刺激反应明显下降时,记录运动时间。3.骨骼肌功能检测麻醉小鼠,暴露趾长伸肌,远端肌腱处用外科缝线打结后离断,沿肌肉边界分离至近端附着处。将缝线另一端连接到力量传感器上,调节至较低的基础张力。采用铂丝将肌肉与脉冲刺激仪相连。以20 V/cm的电压,发放5 ms方波,同时逐渐增加基础张力,直至检测到最大力量。固定在该张力,以5 ms方波刺激肌肉收缩,记录最大等长抽搐力,间隔5 s测量3次取平均值;以5 ms 100 Hz方波连续刺激300 ms,记录最大等长强直力,间隔1 min测量3次取平均值。4.组织病理学检测将腓肠肌组织切片进行HE染色,观察形态学改变,计算平均肌细胞面积;进行slow MyHC和fast MyHC的免疫组织化学染色,计算快肌细胞和慢肌细胞的平均肌细胞面积和相对含量;进行Masson和天狼星红染色,计算胶原容积分数;进行胶原的免疫组织化学染色,计算Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量及比例。5.分子学检测采用western blotting技术检测腓肠肌衰老相关β-半乳糖苷酶（GLB1）、p16、p21、p53、TRB3、肌萎缩因子 atrogin 1 和 MuRF 1、Ⅰ 型和 Ⅲ 型胶原、p62、LC3、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38、p38的相对含量。采用免疫共沉淀技术检测TRB3 与 p62、MEK1/MEK2、MEK3/MEK6、MEK4/MKK4 及 MKK7 能否相互作用。研究结果1.自然衰老小鼠动物模型的构建将野生型C57/BL6小鼠分别以普通饮食喂养至3月龄和18月龄,分别作为年轻组和老年组。与年轻组小鼠相比,老年组小鼠毛发稀疏、色泽暗淡、行动缓慢,体重呈上升趋势,腓肠肌GLB1、p53、p21、p16的相对含量明显升高,说明成功建立了自然衰老小鼠动物模型。2.衰老小鼠运动能力明显减低与年轻组相比,老年组小鼠前肢拉力、笼线悬挂时间及跑步力竭运动时间均显着缩短,说明衰老小鼠运动能力明显减低。3.衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩,且以Ⅱ型肌细胞为主与年轻组相比,老年组小鼠腓肠肌占体重的百分比、腓肠肌重量与胫骨长度的比值均显着降低。HE染色发现,与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌细胞大小不一、排列紊乱,平均肌细胞面积显着缩小。Fast MyHC和slow MyHC的免疫组织化学染色发现,与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌快肌细胞的平均肌细胞面积显着缩小,慢肌细胞的平均肌细胞面积显着增加,慢肌细胞数量与快肌细胞数量的比值显着增加。与年轻组相比,老年组小鼠肌萎缩因子atrogin 1和MuRF 1的蛋白水平显着增加。4.衰老小鼠骨骼肌存在明显的间质纤维化与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌胶原容积分数、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量均显着增加,Ⅰ型与Ⅲ型胶原含量的比值亦显着增加。5.TRB3表达水平与衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩和纤维化相关与年轻组相比,老年组小鼠骨骼肌TRB3蛋白水平显着增加。小鼠骨骼肌平均肌细胞面积与TRB3蛋白水平呈负相关;小鼠骨骼肌胶原容积分数与TRB3蛋白水平呈正相关。6.TRB3基因敲除能够改善衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩与WT老年组小鼠相比,TRB3-/-老年组小鼠腓肠肌重量占体重的百分比和腓肠肌重量与胫骨长度的比值呈增加趋势,骨骼肌细胞排列相对整齐,平均肌细胞面积显着增加,平均快肌细胞面积显着增加,平均慢肌细胞面积无显着改变,慢肌细胞与快肌细胞数量的比值呈增加趋势,肌萎缩因子atrogin 1蛋白水平显着下降,MuRF 1蛋白水平呈下降趋势。7.TRB3基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌间质纤维化与WT老年组相比,TRB3-/-老年组小鼠骨骼肌间质纤维组织明显减少,胶原容积分数、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量以及Ⅰ型与Ⅲ型胶原含量的比值亦显着降低。8.TRB3基因敲除能够改善衰老小鼠运动能力和肌肉功能与WT老年组相比,TRB3-/-老年组小鼠前肢拉力和笼线悬挂时间显着改善,跑步力竭运动时间呈改善趋势,趾长伸肌抽搐力呈增加趋势,强直力显着增加。9.TRB3基因敲除可能通过改善自噬水平减轻骨骼肌细胞萎缩与WT年轻组相比,WT老年组骨骼肌LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值和p62蛋白水平显着增加;与WT老年组相比,TRB3-/-老年组骨骼肌LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值和p62蛋白水平显着减少。免疫共沉淀检测发现,骨骼肌组织中的TRB3能够与p62结合。10.TRB3基因敲除可能通过影响MAPK信号通路减轻骨骼肌纤维化与WT年轻组相比,WT老年组小鼠骨骼肌TRB3蛋白水平、JNK磷酸化水平和ERK磷酸化水平显着增加,p38磷酸化水平呈下降趋势;与WT老年组相比,TRB3-/-老年组小鼠骨骼肌TRB3蛋白水平和JNK磷酸化水平显着降低,ERK磷酸化水平呈下降趋势,p38磷酸化水平显着升高。免疫共沉淀检测发现,骨骼肌组织中的TRB3能够与MEK1/MEK2、MEK3/MEK6以及MEK4/MKK4结合,但是不能与MKK7结合。研究结论1.衰老小鼠骨骼肌TRB3呈高表达状态;2.TRB3基因敲除减轻骨骼肌细胞萎缩和间质纤维化,改善衰老小鼠运动能力;3.TRB3基因敲除通过改善衰老后受阻的自噬流、降低JNK磷酸化水平、增加p38磷酸化水平,实现对老年肌少症的保护作用。研究背景人口老龄化正在加速进展,带来一系列医养服务需求及经济负担,是全球面临的严峻挑战。肌少症作为一种老年人群中普遍存在并带来诸多不利影响的状态,已成为研究热点。肌少症是一类以进行性和广泛性骨骼肌肌力减弱和肌量减少为特征的综合征,与年龄相关,能够引起诸多不良事件,并导致多种疾病预后不良。但目前,关于肌少症的明确发病机制有待进一步研究。骨骼肌间质脂肪组织增多是肌少症的主要组织病理学改变。间质脂肪组织是一种特殊的异位脂肪组织,具有旁分泌、自分泌功能,可改变骨骼肌微环境,并与肌细胞相互作用,导致肌肉功能障碍,与机体运动耐力、紧张度、力量及机动功能的减低密切相关。研究报道,年龄是肌间脂肪组织增加的独立危险因素。肌间脂肪含量以每年9克至70克不等的速度增长,是导致衰老骨骼肌功能减退的重要原因。但是衰老后骨骼肌间质脂肪组织沉积的具体机制尚不清楚。骨骼肌间叶祖细胞成脂分化增多可能是衰老骨骼肌间质脂肪沉积的重要因素。多项体内和体外研究均证实,骨骼肌异位脂肪细胞来源于间叶祖细胞。间叶祖细胞是间充质起源的多能祖细胞,在病理条件下能够发生异常增殖和分化,导致肌间脂肪增加和成肌能力受损。骨骼肌间叶祖细胞与骨髓间充质干细胞具有同源性,后者衰老后成骨分化能力下降、成脂分化能力增强,是衰老机体骨质疏松和骨髓脂质沉积的重要原因,提示骨骼肌间叶祖细胞衰老后成脂分化能力增强可能是衰老骨骼肌肌间脂质沉积的重要因素。但是,目前尚无研究予以证实,且衰老骨骼肌间叶祖细胞向脂肪细胞分化增加的具体分子机制尚不清楚。Pim1可能是调节间叶祖细胞向脂肪细胞分化的关键分子。基因芯片检测显示Pim1在衰老骨骼肌高表达。Pim1蛋白具有丝/苏氨酸激酶活性,与细胞增殖、凋亡、分化、代谢等密切相关。Pim1与牛肌肉内脂肪含量相关。Pim1在良、恶性脂肪细胞肿瘤中均高表达,而在非脂肪细胞肿瘤中不表达或表达量很低。Pim1抑制剂SGI1776能够抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。因此,有理由推测Pim1可能是调控衰老骨骼肌间叶祖细胞成脂分化的关键靶点。在本研究中,我们通过构建野生型及Pim1基因敲除小鼠自然衰老模型以及骨骼肌间叶祖细胞复制衰老模型,研究Pim1对骨骼肌间质脂肪组织沉积的影响及其可能的机制。研究目的1.研究Pim1干预对老年肌少症是否具有改善作用;2.研究Pim1干预是否影响肌间脂肪含量;3.研究Pim1干预影响衰老小鼠肌间脂肪含量的机制;4.研究Pim1干预介导的肌间脂肪含量改变影响老年肌少症的机制。研究方法1.实验动物分组4周龄雄性野生型（WT）和同品系Pim1基因敲除（Piml-/-）小鼠分别随机分为年轻组和老年组。年轻组小鼠饲养至3月龄,老年组小鼠饲养至18月龄。2.双能X射线检测于实验末,测量体重,麻醉小鼠,固定在泡沫板上,采用双能X线检测小鼠脂肪和肌肉含量。3.运动能力检测于实验末进行小鼠运动能力检测,如下:拉力测试:训练小鼠双前肢抓紧水平放置的测力计,水平向后拉动使其腾空,缓慢加力直至其松开测力计,测量3次取平均值。笼线测试:将小鼠放于笼线中央,经头侧翻转使之倒挂,记录力竭掉落时间,间隔30 min以上测量3次取平均值,计算悬挂冲量。跑步力竭运动测试:将小鼠放在跑步机跑道上,初始速度和坡度分别为5 m/min和0°,每5 min分别增加5 m/min和5°,直至分别达到20 m/min和14°,记录力竭运动时间。4.骨骼肌功能检测于实验末,麻醉小鼠后暴露趾长伸肌,远端用缝线打结后离断肌腱,沿肌肉边缘分离至近端附着处。缝线远端固定于传感器上,调节为较低的基础张力,以铂丝连接肌肉与脉冲刺激仪。采用20 V/cm 5-ms方波刺激,同时逐渐增加基础张力,直至检测到最大力量,固定在该张力,以20 V/cm 5-ms方波刺激肌肉收缩,记录最大等长抽搐力,间隔5s测量3次取平均值;20 V/cm 5-ms 100 Hz方波刺激300ms,记录最大等长强直力,间隔1 min测量3次取平均值。分离趾长伸肌并横切,采集横切面图像,计算最大横截面积。5.组织处理于实验末,称量体重,麻醉小鼠,采血,灌注,分离双侧腓肠肌并称重。收集血清,-80℃冻存备用。一侧腓肠肌经液氮处理后存放于-80℃;一侧腓肠肌以4%多聚甲醛固定后横切,近段经梯度酒精脱水后石蜡包埋,制作5 μm石蜡切片,远段经梯度蔗糖溶液脱水后,制作10μm冰冻切片。6.血液生化指标测定采用血液化学分析仪检测血清游离脂肪酸、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯的含量。应用ELISA技术检测血清中的脂联素及瘦素的含量。7.骨骼肌病理学检测对于骨骼肌组织切片,采用HE染色检测形态学改变;采用免疫组织化学染色检测myosin、fast MyHC和slow MyHC,计算平均肌细胞面积、平均快肌细胞面积、平均慢肌细胞面积以及快慢肌相对含量;采用免疫组织化学染色检测laminin,计算中心核细胞含量;采用油红O染色检测肌间脂肪含量;采用免疫组织化学染色技术检测骨骼肌中脂联素的含量;采用免疫组织化学染色法检测骨骼肌中TNF-α和IL-6的含量。8.骨骼肌分子学检测采用western blotting技术检测腓肠肌衰老相关β-半乳糖苷酶（GLB1）、p53、p16、Pim1、脂联素、肌萎缩相关因子atrogin 1和MuRF1、早期成肌分化标志物MyoD和Myf5、晚期成肌分化标志物MyoG、成脂相关转录因子PPARγ、C/EBPβ、C/EBPδ、FABP4的相对含量。9.骨骼肌PDGFRα+间叶祖细胞的分离和鉴定采用免疫磁珠分选的方法从1月龄小鼠下肢骨骼肌中分离PDGFRα+间叶祖细胞;采用免疫荧光染色鉴定其纯度。10.PDGFRα+间叶祖细胞复制衰老模型的构建PDGFRα+间叶祖细胞以生长培养基培养,每周换液2次,传代1次。以复制6代和22代的细胞分别作为年轻组和衰老组。采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色的方法染色衰老细胞,计算衰老细胞比例;采用western blotting技术检测衰老标志物的蛋白水平;采用实时定量PCR技术检测相对端粒长度,以评估细胞衰老。11.PDGFRα+间叶祖细胞的成脂诱导将年轻和衰老细胞以成脂诱导培养基诱导成脂,隔日换液,评估成脂情况,筛选最适成脂诱导时间。年轻和衰老细胞分别以含有不同浓度Pim1抑制剂SGI1776的成脂诱导培养基培养相同时间,评估成脂情况,以筛选抑制成脂的最适浓度。12.细胞成脂检测采用油红O染色观察细胞形态改变,以等量异丙醇萃取后,检测OD510,以评估成脂情况;采用western blotting技术检测脂肪细胞标志物脂联素的蛋白水平;通过ELISA技术测定细胞上清中脂联素的含量。13.Pim1调控细胞成脂分化的机制检测年轻和衰老细胞分别以普通成脂诱导培养基、含DMSO的成脂诱导培养基、含5 μM SGI1776的成脂诱导培养基培养,采用western blotting技术检测成脂相关转录因子PPARγ、C/EBPβ、C/EBPδ、FABP4的相对含量。14.Pim1抑制对PDGFRα+间叶祖细胞衰老的影响年轻和衰老细胞分别以普通生长培养基、含DMSO的生长培养基、含5 μM SGI1776的生长培养基培养,采用衰老相关β半乳糖苷酶染色技术染色衰老细胞,计算衰老细胞含量,采用western blotting技术检测细胞中衰老标志物的水平。15.Pim1介导的PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化对体外培养的肌细胞的影响将年轻和衰老PDGFRα+间叶祖细胞分别以含DMSO或SGI1776的成脂诱导培养基诱导成脂后以普通培养基培养24 h,取其上清作为条件培养基培养肌细胞,采用western blotting技术检测肌细胞中肌萎缩指标蛋白水平改变。研究结果:1.野生型和Pim1基因敲除小鼠自然衰老模型构建将WT和Piml-/-小鼠随机分为年轻组和老年组,分别喂养至3月龄和18月龄。与年轻组小鼠相比,老年组小鼠毛发稀疏、色泽暗淡、反应迟钝、行动迟缓,其腓肠肌高表达衰老标志物GLB1、p53和p16蛋白,表明成功构建自然衰老小鼠模型。与WT小鼠相比,Pim1-/-小鼠腓肠肌Pim1蛋白水平显着降低,表明成功构建Pim1基因敲除小鼠模型。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠骨骼肌Pim1蛋白水平显着增加。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠体重显着增加,血清学指标无显着改变;与WT老年组小鼠相比,Pim1-/-老年组小鼠体重显着降低,血清瘦素和游离脂肪酸水平显着降低。2.Pim1基因敲除改善衰老小鼠肌少症与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠前肢拉力、倒置悬挂冲量、跑步力竭运动时间均显着降低;与WT老年组小鼠相比,Pim1-/-老年组小鼠前肢拉力、倒置悬挂冲量、跑步力竭运动时间均显着增加。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠运动能力的衰退。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠趾长伸肌强直力显着降低;与WT老年组小鼠相比,Pim1-/-老年组小鼠趾长伸肌强直力显着增加。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌功能的衰退。与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠整体肌肉含量、腓肠肌占体重百分比显着降低;与WT老年组小鼠相比,Piml-/-老年组小鼠整体肌肉含量、腓肠肌占体重百分比显着增加。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌含量的衰退。上述结果表明,Pim1基因敲除能够改善衰老小鼠肌少症。3.Pim1基因敲除减少衰老小鼠肌间脂肪含量与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠整体脂肪含量、腓肠肌脂质含量、脂联素蛋白水平显着增加;与WT老年组小鼠相比,Piml-/-老年组小鼠整体脂肪含量、腓肠肌脂质含量、脂联素蛋白水平显着降低。表明Pim1基因敲除能够减少衰老小鼠骨骼肌肌间脂肪含量。4.Pim1正性调节PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化能力,促进肌间脂肪生成4.1 PDGFRα+间叶祖细胞的分离、鉴定和衰老模型构建采用磁珠分选的方法获取PDGFRα+间叶祖细胞,采用免疫荧光染色法证实其纯度,以复制6代和22代的细胞作为年轻组和衰老组。与年轻组相比,衰老组衰老相关β半乳糖苷酶染色阳性细胞含量、衰老标志物GLB1、p53、p16蛋白水平显着增加,相对端粒长度显着缩短,提示成功构建PDGFRα+间叶祖细胞衰老模型。与年轻组相比,衰老组细胞Pim1蛋白水平显着增加。4.2衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化能力增强在年轻组,随成脂诱导时间延长,细胞内脂滴逐渐增多、OD510递增、细胞内脂联素蛋白含量递增,呈时间依赖性,在第9天达峰值;在衰老组,随成脂诱导时间延长,细胞内脂滴增多、OD510增加、细胞内脂联素蛋白含量增加,呈时间依赖性,在第6天达峰值;在第3天和第6天,衰老组细胞内脂滴含量和OD510显着高于年轻组。表明衰老细胞对成脂刺激的反应更为灵敏,具有更强的成脂分化能力。进一步检测成脂分化过程中成脂相关转录因子蛋白水平改变,结果显示,随成脂诱导,年轻组细胞中PPARγ、C/EBPβ、C/EBPδ和FABP4蛋白水平呈时间依赖性增加,在第9天达峰值,衰老细胞中C/EBPβ、C/EBPδ和FABP4蛋白水平首先呈时间依赖性增加,在第6天达高峰,而后减少;在第6天,衰老细胞内C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平显着高于年轻细胞。综合上述结果,选择6天作为成脂诱导时间。4.3 PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化过程中出现Pim1表达上调在年轻组,随成脂诱导时间延长,Pim1蛋白水平呈增加趋势;在衰老组,随成脂诱导时间延长,Pim1蛋白水平呈先降低、后升高、再降低的趋势,可能与细胞增殖停滞、成脂分化开始、成脂分化结束有关;在成脂诱导第6天,衰老组细胞内Pim1蛋白水平显着高于年轻组。4.4抑制Pim1显着降低衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化在成脂诱导培养基中加入不同浓度的Pim1抑制剂SGI1776,结果显示,SGI1776以浓度依赖的方式抑制细胞内脂滴形成、降低OD510。与年轻溶剂组相比,5 μMSGI1776使年轻细胞的OD510呈下降趋势,显着降低年轻组细胞内和上清中的脂联素水平。与衰老溶剂组相比,5μM SGI1776能够显着降低衰老细胞的OD510,使衰老细胞内脂联素水平呈降低趋势,显着降低衰老细胞上清中的脂联素含量。结果说明,5μM Pim1抑制剂能够显着抑制衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化。5.Pim1通过激活C/EBPδ成脂通路促进衰老间叶祖细胞成脂分化与年轻溶剂组相比,年轻抑制剂组PPARγ、FABP4蛋白水平显着降低;与衰老溶剂组相比,衰老抑制剂组C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平显着降低;与年轻对照组相比,衰老对照组细胞内C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平显着增加,PPARγ、FABP4蛋白水平显着降低。与WT年轻组相比,WT老年组小鼠腓肠肌C/EBPδ蛋白水平显着增加;与WT老年组相比,Piml-/-老年组小鼠腓肠肌C/EBPδ、FABP4蛋白水平显着降低。综合上述结果,C/EBPδ可能是介导Pim1调控衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化的关键分子。此外,抑制Pim1能够显着降低PDGFRα+间叶祖细胞中衰老标志物的含量,提示Pim1抑制有可能通过年轻化PDGFRα+间叶祖细胞降低其成脂分化能力。6.Pim1基因敲除介导的肌间脂肪减少通过减轻衰老小鼠肌细胞萎缩改善肌少症与WT年轻组小鼠相比,WT老年组小鼠肌细胞明显变小,且大小不一、排列紊乱,间质成分增多,其平均肌细胞面积、平均快肌细胞面积显着降低,慢肌细胞数量与快肌细胞数量的比值显着增加,肌萎缩因子MuRF 1和atrogin 1蛋白水平显着增加;与WT老年组小鼠相比,Piml-/-老年组小鼠肌细胞显着增大、排列规则,间质成分减少,其平均肌细胞面积、平均快肌细胞面积显着增加,肌萎缩因子MuRF 1和atrogin 1蛋白水平显着降低。表明Pim1基因敲除能够减轻衰老小鼠骨骼肌细胞萎缩。进一步通过体外实验验证Pim1敲除对肌细胞萎缩的改善作用是否通过介导肌间脂肪减少而实现,发现来自衰老的成脂分化后的PDGFRα+间叶祖细胞的条件培养基能够增加体外培养的肌细胞中肌萎缩标志物的蛋白水平,而Pim1抑制能够显着改善衰老PDGFRα+间叶祖细胞条件培养基引起的肌细胞萎缩,提示Pim1基因敲除可能通过减少肌间脂肪生成,减轻肌细胞萎缩,发挥改善肌少症的作用。研究结论1.Pim1基因敲除对衰老小鼠肌少症具有改善作用;2.Pim1基因敲除能够减少衰老小鼠肌间脂肪含量;3.Pim1抑制能够降低衰老骨骼肌PDGFRα+间叶祖细胞增强的成脂分化能力,这可能是Pim1基因敲除减少衰老小鼠肌间脂肪含量的重要机制,Pim1的这一作用可能通过影响C/EBPδ成脂通路而实现;4.Pim1抑制或敲除介导的衰老间叶祖细胞成脂分化能力减低能够改善肌细胞萎缩,可能是其改善肌少症的重要机制,提示Pim1是架起衰老PDGFRα+间叶祖细胞成脂分化与肌萎缩、实现对肌少症调控的重要桥梁。

曹其栋^[8]（2021）在《环状RNA CDR1as通过miR-135a/SIRT1轴调控H2O2诱导的人冠状动脉内皮细胞焦亡的机制研究》文中研究说明研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）引起的心血管疾病（cardiovascular disease,CVDs）是全球首位的死亡原因,也是世界面临的重大公共卫生问题。目前AS的机制尚未阐明,针对AS的防治仍未彻底解决。因此,探索AS的发病机制,控制其发生发展有助于降低AS性CVDs发病率和死亡率。AS发病机制复杂,目前的研究发现氧化应激及慢性持续性炎症在AS中发挥了十分重要的作用。长期的氧化应激及炎症刺激可引起血管内皮功能障碍,甚至出现血管损伤性反应,这种损伤性反应可以表现为自噬、凋亡、焦亡、坏死等形式。与其它几种损伤方式不同的是,细胞焦亡是一种程序性的炎性细胞死亡方式,与炎症密切相关,而炎症反应贯穿于AS的始终。而且研究发现,AS斑块中存在大量的焦亡细胞,而体外研究发现许多致AS的病理因素都可诱导细胞焦亡,从而进一步导致AS的发生。可见,细胞焦亡与AS密不可分。细胞焦亡的特征表现为炎症小体的形成、GSDMD（gasdermin D）依赖的细胞穿孔及炎症因子（白介素（interleukin,IL）-1β、IL-18）的释放,其中含NLR家族PYRIN域蛋白3（NLR Family,Pyrin Domain Containing Protein 3,NLRP3）炎症小体是目前研究较多的一种经典细胞焦亡途径。研究发现,多种病理性因素激活NLRP3炎症小体的共同关键因素就是活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,ox-LDL、活性氧等可诱导血管内皮细胞氧化应激,而氧化应激自始至终贯穿于AS的整个过程,并促进细胞焦亡的发生以及AS的发生发展。因此,干预氧化应激诱导的内皮细胞焦亡的发生发展对AS的防治具有重要意义。尽管药理学研究发现多种药物,如白藜芦醇、曲美他嗪等可用于抗细胞焦亡治疗,但基因干预治疗因更强的靶向性可能在抑制细胞焦亡方面是一个更好的选择,目前的研究发现,非编码RNA通过基因的转录后调控参与了多种病理生理过程。其中,环状核糖核酸（circularRNA,circRNA）是一类首尾共价相连的非编码RNA。因其环状结构不易被核酸酶降解,发挥稳定的调控作用而受到关注。研究发现circRNA在细胞焦亡过程中发挥重要的调控作用。其中,现有研究较为深入的circRNA是小脑变性相关蛋白1反义转录物（Cerebellar degeneration associated protein 1 antisense transcripts,CDR1as）,它是由位于人类X染色体q27.1位点的基因转录而来,全长1485bp。目前,已有研究发现在IL-1β诱导的炎症模型中,CDR1as参与了对IL-6、IL-8、IL10及TNF-α等炎症因子的调控,而细胞焦亡作为一种炎性死亡方式与炎症反应密切相关。因此,我们猜测CDR1as有可能参与了内皮细胞焦亡过程。MicroRNA是一种长度约22nt的单链核糖核酸,在转录后水平调控靶基因的表达。细胞质中的circRNA通过与microRNA结合发挥生物学作用,在细胞焦亡等病理生理过程中发挥重要作用。研究发现,在急性胰腺炎细胞模型中,上调的miR-135a促进细胞死亡,并增加炎症因子（肿瘤坏死因子-α、IL-6及IL-1β）的表达。也有研究发现miR-135a可通过靶向FOXO1促进血管平滑肌细胞的炎症。这表明miR-135a参与调控细胞炎症及存活过程,但miR-135a是否在内皮细胞炎症反应中发挥调控作用,并进而参与内皮细胞焦亡过程尚未有报道。经检索生物信息数据库发现miR-135a与CDR1as碱基位点高度互补配对,由此我们推测,CDR1as很可能通过miR-135a参与内皮细胞焦亡过程。同时,经检索生物信息数据库发现miR-135a与SIRT1存在高度碱基互补配对位点。SIRT1是一种具有NAD+-依赖性组蛋白去乙酰化酶活性的蛋白。已有研究表明,SIRT1在调控细胞焦亡中发挥保护作用。此外,在血管疾病中,SIRT1通过对多种底物的去乙酰化来调节关键代谢过程,而发挥了保护作用的。还有研究发现,SIRT1在氧化低密度脂蛋白处理的内皮细胞中表达降低,而且SIRT1的低表达也与ROS的产生密切相关。因此,SIRT1很有可能在内皮细胞焦亡中发挥着保护作用。综上所述,我们提出假设,CDR1as可能通过miR-135a靶向作用于SIRT1,参与人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCAECs）焦亡过程。因此,本实验通过过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）刺激构建HCAECs焦亡模型,探索CDR1as通过miR-135a靶向SIRT1对HCAECs焦亡的影响及调控机制。研究目的本实验通过分析CDR1as、miR-135a在H2O2诱导的HCAECs焦亡中的表达及调控作用,明确CDR1as及miR-135a是否参与H2O2诱导的HCAECs焦亡的调控,并进一步探索CDR1as通过miR-135a靶向SIRT1对HCAECs焦亡的调控机制,为AS早期防治提供新理念和新依据。研究方法1.利用H2O2处理HCAECs构建HCAECs焦亡模型。利用600μmol/L的H2O2刺激HCAECs不同时间（0,1h,2h,4h,8h）,通过检测细胞乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）释放量及Hoechst33342/PI荧光双染评估细胞焦亡;2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’-Dichloro Fluorescent Yellow Diacetate,DCFH-DA）探针用于检测HCAECs内ROS的水平;蛋白质印迹（Westernblot,WB）检测焦亡相关蛋白（NLRP3,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase）-1,凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC））的表达;并通过酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒检测IL-1β及IL-18的表达。2.采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real time Quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测CDR1as、miR-135a、SIRT1在H2O2诱导的HCAECs焦亡中的表达。3.通过转染过表达CDR1as及sh-CDR1as慢病毒,构建高低表达CDR1as的HCAECs模型。探索CDR1as对H2O2诱导的HCAECs焦亡的影响。通过对不同实验组细胞LDH释放量及Hoechst33342/PI荧光双染的检测评估CDR1as对HCAECs焦亡的影响;通过Westernblot检测各组焦亡相关蛋白（NLRP3,caspase-1,ASC）的表达,免疫荧光染色观察各实验组细胞内NLRP3的点状聚集,ELISA试剂盒检测各组IL-1β及IL-18的表达,来进一步检测CDR1as对HCAECs焦亡的影响。4.分析HCAECs中CDR1as对miR-135a,SIRT1的调控作用。采用q RT-PCR检测高低表达CDR1as的HCAECs中miR-135a的表达情况,并通过双萤光素酶实验检测CDR1as与miR-135a是否靶向结合。通过q RT-PCR及Westernblot检测高低表达CDR1as的HCAECs中SIRT1的表达情况。5.通过转染miR-135a mimics及miR-135a inhibitor,构建高低表达miR-135a的HCAECs模型,探索miR-135a对H2O2诱导的HCAECs焦亡的影响。通过检测不同实验组细胞LDH释放量及Hoechst33342/PI荧光双染评估miR-135a对HCAECs焦亡的影响;通过Westernblot检测各实验组焦亡相关蛋白（NLRP3,caspase-1,ASC）的表达,免疫荧光染色观察各组细胞内NLRP3的点状聚集,ELISA试剂盒检测各组炎症因子IL-1β及IL-18的表达,来进一步检测miR-135a对HCAECs焦亡的影响。6.分析HCAECs中miR-135a对SIRT1的调控作用及SIRT1对HCAECs焦亡的影响。采用q RT-PCR及Westernblot检测高低表达miR-135a的HCAECs中SIRT1的表达情况,并通过双萤光素酶实验检测SIRT1与miR-135a是否靶向结合。通过转染sh-SIRT1质粒及阴性对照,构建低表达SIRT1的HCAECs模型,探索SIRT1对H2O2诱导的HCAECs焦亡的影响。通过检测不同实验组细胞LDH释放量及Hoechst33342/PI荧光双染评估SIRT1对HCAECs焦亡的影响;通过Westernblot检测各组焦亡相关蛋白（NLRP3,caspase-1,ASC）的表达,免疫荧光染色观察NLRP3的点状聚集;通过ELISA试剂盒检测炎症因子IL-1β及IL-18的表达,来进一步检测SIRT1对HCAECs焦亡的影响。研究结果1.利用600μmol/L的H2O2刺激HCAECs不同时间（0,1h,2h,4h,8h）后,细胞LDH释放增加并呈时间依赖性。HCAECs内ROS水平增加,PI+细胞数增多,焦亡相关蛋白（NLRP3,caspase-1,ASC）的表达增加,IL-1β及IL-18水平增加并呈时间依赖性。提示H2O2诱导的HCAECs焦亡模型构建成功。2.在H2O2诱导的HCAECs焦亡过程中,CDR1as与SIRT1表达降低,miR-135a表达升高,并且呈时间依赖性。3.在H2O2诱导的HCAECs焦亡模型中,与H2O2组相比,过表达CDR1as组细胞LDH释放降低,PI+细胞数减少,焦亡相关蛋白（NLRP3,caspase-1,ASC）的表达降低,NLRP3的点状聚集减少,IL-1β及IL-18的释放减少;而低表达CDR1as组则相反。4.MiR-135a在高表达CDR1as的HCAECs中下调,而在低表达CDR1as的HCAECs中则上调。双荧光素酶实验结果显示,与NC组相比,wt-CDR1as与miR-135amimics共转染组荧光活性降低。SIRT1在高表达CDR1as的HCAECs中上调,而在低表达CDR1as的HCAECs中则下调。5.在H2O2诱导的HCAECs焦亡模型中,与miR-NC组相比,miR-135a inhibitor组细胞LDH释放降低,PI+细胞数减少,焦亡相关蛋白（NLRP3,caspase-1,ASC）的表达降低,NLRP3的点状聚集减少,IL-1β及IL-18的释放也减少;而miR-135a mimics组则相反。6.SIRT1在miR-135a inhibitor组表达上调,而在miR-135a mimics组下调。双荧光素酶实验结果显示,与NC组相比,wt-SIRT1与miR-135a mimics共转染组荧光活性降低。在H2O2诱导的HCAECs焦亡模型中,与H2O2组相比,Sh-SIRT1组细胞LDH释放增加,PI+细胞数增多,焦亡相关蛋白（NLRP3,caspase-1,ASC）的表达升高,NLRP3的点状聚集增多,IL-1β及IL-18的释放也增加。结论1.通过对LDH、PI染色、焦亡相关蛋白及炎症因子的检测,发现H2O2可诱导HCAECs发生焦亡。2.环状RNA CDR1as能够抑制H2O2诱导的HCAECs焦亡,表明CDR1as与H2O2诱导的HCAECs焦亡有关。3.CDR1as通过与miR-135a结合抑制其表达,同时miR-135a可促进HCAECs的焦亡,表明CDR1as可能是通过miR-135a抑制H2O2诱导的HCAECs焦亡。4.CDR1as及MiR-135a可能通过SIRT1调控H2O2诱导的HCAECs焦亡,前者抑制HCAECs的焦亡,而后者发挥促HCAECs焦亡的作用。综上,通过探讨CDR1as抑制氧化应激诱导的HCAECs焦亡机制可能为治疗AS等心血管疾病提供了一个新的途径。创新点及研究意义本实验揭示了CDR1as具有抗HCAECs焦亡的作用,并进一步阐明CDR1as是通过抑制miR-135a靶向SIRT1抗HCAECs焦亡,从而发挥抗AS作用。为AS早期防治提供了新的理论及科学依据。

王美娟^[9]（2021）在《氯氮平对高糖诱导HUVEC氧化应激损伤的影响》文中提出背景与目的氯氮平是难治性精神分裂症（SP）患者的主要治疗药物。有研究报道,氯氮平的使用可增加静脉血栓栓塞（VTE）的风险,但是具体的生物学机制尚未明确。另外,长期使用氯氮平会引起血糖升高,细胞内高糖会过度激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路及己糖胺通路,使晚期糖基化终末产物（AGEs）产生增多并堆积,诱导活性氧（ROS）自由基积聚,引起血管内皮细胞氧化应激损伤甚至凋亡。而内皮细胞损伤是VTE发生的始动因素。本实验通过体外建立人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的高糖氧化应激损伤模型,分析氯氮平对高糖诱导HUVEC氧化应激损伤的影响,探讨氯氮平是否可能通过诱导血管内皮细胞氧化应激损伤,从而引起VTE的发生和发展。材料与方法获取新鲜的新生儿脐带,0.1%Ⅰ型胶原酶灌注脐静脉消化分离和培养HUVEC,采用倒置相差显微镜来观察其形态及生长状况,免疫荧光法鉴定细胞,流式细胞法检测细胞纯度,CCK-8试剂盒检测不同浓度葡萄糖(5.5、10、20、30、40、50、60 mmol·L-1)分别作用24、48、72小时后HUVEC活性的变化,根据结果选取最佳的葡萄糖浓度和作用时间作为造模条件;CCK-8试剂盒检测不同浓度氯氮平(0、250、500、1000、1500、2000、300ng·m L-1)对HUVEC活性的影响以及高糖条件下不同浓度氯氮平对HUVEC活性的影响;ELISA检测高糖条件下不同浓度氯氮平对HUVEC分泌氧化应激相关指标ROS、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）的水平的影响。结果1.分离培养的HUVEC在倒置显微镜下贴壁生长,呈“鹅卵石”样排列。免疫荧光鉴定血管性血友病因子（v WF）表达为阳性,血小板-内皮黏附分子（CD31）流式细胞法检测细胞纯度达97.7%。2.CCK-8检测发现HUVEC活性（OD值）随着作用时间的延长逐渐下降,差异有统计学意义（P<0.001）。在同一时间段,10 mmol·L-1葡萄糖时HUVEC活性较对照组升高,差异没有统计学意义（P>0.05）;作用24小时,20～60 mmol·L-1葡萄糖可使HUVEC活性呈浓度依赖性下降,差异有统计学意义（P<0.05）;作用48小时,40～60 mmol·L-1葡萄糖可使HUVEC活性呈浓度依赖性下降,差异有统计学意义（P<0.05）;作用72小时,各葡萄糖浓度间HUVEC活性没有明显差异（P>0.05）。成功建立了体外HUVEC的高糖（HG）损伤模型,最终选取30 mmol·L-1葡萄糖作用24小时作为造模条件进行后续实验。3.与对照组比较,不同浓度氯氮平孵育24小时对HUVEC活性没有明显影响（P>0.05）;与高糖组比较,不同浓度氯氮平与高糖共同孵育24小时对HUVEC活性也没有明显影响（P>0.05）。4.HUVEC经高糖和氯氮平处理24小时后,500～3000 ng·m L-1氯氮平组ROS水平与高糖模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）;1000～2000 ng·m L-1氯氮平组MDA水平与高糖模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）;而SOD及NO水平改变差异与高糖模型组相比没有统计学意义（P>0.05）。结论1.随着葡萄糖浓度的升高和作用时间的延长,HUVEC活性逐渐下降,其作用机制可能是细胞内葡萄糖水平升高引起氧化应激水平增高,进而激活多条代谢通路促进细胞凋亡;2.体外条件下,与不加药组比较,加入250～3000 ng·m L-1氯氮平对HUVEC活性没有明显影响;与高糖模型不加氯氮平组比较,加入250～3000 ng·m L-1氯氮平对HUVEC活性没有明显影响;3.体外条件下,氯氮平能够降低高糖导致的ROS、MDA水平升高,对血管内皮细胞氧化应激损伤起到一定保护作用。

刘洋^[10]（2020）在《NADPH氧化酶抑制剂对糖尿病兔心房重构及线粒体功能的影响》文中研究指明目的:随着人口老龄化及生活方式的改变,糖尿病的发病率日益增长,糖尿病是心房颤动的独立危险因素,但糖尿病引起房颤的具体机制仍未明确。线粒体功能障碍及氧化应激参与糖尿病合并心房颤动的病理生理过程。本研究中,我们探究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制剂夹竹桃麻素对糖尿病兔心房重构及房颤诱发的影响,以及夹竹桃麻素对心房线粒体功能的保护作用。方法:日本大耳白兔48只成功建立糖尿病模型,随机分为2组,四氧嘧啶诱导的糖尿病组（DM组）,夹竹桃麻素治疗组（DA组）,每组24只,另选取24只日本大耳白兔作为对照（C组）。DA组每日给予夹竹桃麻素（15mg/kg）,连续8周。所有动物均在同一环境下饲养,自由饮食,每周检测体重及血糖变化。造模成功并饲养8周后,每组随机选取8只,完成如下实验:1.心脏超声检查、血流动力学检查、病理学实验。心脏超声检测指标:左房内经（LAD）、室间隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）、左室收缩末内径（LVESD）及左室舒张末内径（LVEDD）,右室舒张末内经（RVEDD）、二尖瓣前向血流E峰/二尖瓣环组织多普勒e’波（E/e’）、左房射血分数（LAEF）和左室射血分数（LVEF）。血流动力学检测指标:主动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP）,计算脉压差（DP）及平均动脉压（MAP）。记录左室舒张末压（LVEDP）及左室压力最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。病理学实验:HE染色观察心肌细胞形态,Masson染色检测心房纤维化水平。2.应用Langendorff离体心脏灌流装置建立离体心脏灌流模型,先用Mapping Lab多通道矩阵式心脏电生理标测系统记录左、右心房电传导速度及传导异质性,接着连接4对电极,测量心房间传导时间（IACT）及房室传导文氏周长（AVWCL）,心房各点的有效不应期（AERP）并计算心房有效不应期离散度（AERPD）,测完后进行Burst刺激和S1S2刺激诱发房颤,并记录房颤诱发次数及持续时间,计算房颤诱发率。3.线粒体功能试验,主要包括心房肌组织线粒体呼吸控制率（RCR）。结果:1.心脏超声结果显示,与C组比较,DM组LAD、IVST和LVPWT增加（P<0.05）,夹竹桃麻素干预后,LAD、IVST和LVPWT均有所缩小（P<0.05）。DM组和DA组的LVEF与C组比较显着下降（P<0.05）,夹竹桃麻素未能改善糖尿病兔左室射血分数。各组白兔血流动力学指标均无统计学差异,体表心电图结果显示,DM组和DA组心率低于C组,差异有统计学意义（P<0.05）,且DA组与DM比较,心率加快。2.HE染色结果发现,DM组心房肌细胞排列紊乱,可见炎性细胞浸润,DA组心房肌细胞形态有所改善;DM组胶原容积分数大于C组和DA组（P<0.01）。3.电生理结果显示,DM组心房电传导速度明显下降（P<0.05）,传导异质性显着增加（P<0.05）,DA组传导速度及传导异质性改善（P<0.05）。DM组IACT在250ms和200ms起搏时延长（P<0.01）。DM组在250ms及200ms起搏周长刺激下,AERPD明显增加,DA组AERPD下降,且差异有统计学意义（P<0.01）。DM组房颤诱发率显着高于C组和DA组（P<0.01）。4.线粒体实验发现,DM组心房线粒体RCR明显下降,DA组有所改善,有统计学差异（P<0.01）。结论:夹竹桃麻素可以改善糖尿病心房基质,抑制心房纤维化,改善糖尿病兔心房电重构并降低房颤诱发率,改善心房线粒体呼吸功能。

二、高糖增强过氧化氢诱导牛主动脉内皮细胞凋亡(英文)（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、高糖增强过氧化氢诱导牛主动脉内皮细胞凋亡(英文)（论文提纲范文）

（1）罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制（论文提纲范文）

（2）ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应（论文提纲范文）

（3）熊果酸减轻高糖高脂诱导的人主动脉内皮细胞损伤（论文提纲范文）

（4）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（5）DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用（论文提纲范文）

（6）DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（7）骨骼肌间质纤维脂肪沉积在肌少症中的作用及其干预机制研究（论文提纲范文）

（8）环状RNA CDR1as通过miR-135a/SIRT1轴调控H2O2诱导的人冠状动脉内皮细胞焦亡的机制研究（论文提纲范文）

（9）氯氮平对高糖诱导HUVEC氧化应激损伤的影响（论文提纲范文）

（10）NADPH氧化酶抑制剂对糖尿病兔心房重构及线粒体功能的影响（论文提纲范文）

四、高糖增强过氧化氢诱导牛主动脉内皮细胞凋亡(英文)（论文参考文献）

• [1]罗布麻叶总黄酮及异槲皮苷对吡柔比星致心脏损伤的保护作用和机制[D]. 张洋. 吉林大学, 2021(01)
• [2]ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应[D]. 李藤藤. 吉林大学, 2021(01)
• [3]熊果酸减轻高糖高脂诱导的人主动脉内皮细胞损伤[D]. 刘晓玲. 山西医科大学, 2021(01)
• [4]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
• [5]DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用[D]. 刘晓琳. 山东大学, 2021(10)
• [6]DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究[D]. 郑腾飞. 山东大学, 2021(11)
• [7]骨骼肌间质纤维脂肪沉积在肌少症中的作用及其干预机制研究[D]. 商国凯. 山东大学, 2021(11)
• [8]环状RNA CDR1as通过miR-135a/SIRT1轴调控H2O2诱导的人冠状动脉内皮细胞焦亡的机制研究[D]. 曹其栋. 吉林大学, 2021(01)
• [9]氯氮平对高糖诱导HUVEC氧化应激损伤的影响[D]. 王美娟. 汕头大学, 2021(02)
• [10]NADPH氧化酶抑制剂对糖尿病兔心房重构及线粒体功能的影响[D]. 刘洋. 天津医科大学, 2020