人脑垂体三细胞包埋染色方法的改进

一、人脑垂体三种细胞包埋及染色方法的改进（论文文献综述）

董杏^[1]（2020）在《ING4、p53、p21在子宫内膜样癌中的表达及意义》文中研究说明研究背景:子宫内膜癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。近年来其发病率逐n年上升且呈现年轻化趋势,加上病死率逐年升高,为女性的身心健康及生活质量带来很大影响。据统计2018年全球约有6 3230例子宫内膜癌新增病例和11350例死亡病例。已有研究发现原癌基因和抑癌基因的异常表达与子宫内膜样癌的发生有关,但是目前国内外的研究中对于子宫内膜样癌发生和发展的具体分子机制仍不明确。生长抑制因子4（Inhibitor of growth family memember 4,ING4）是一种肿瘤抑制基因,近年来被广泛的研究和报道。据报道ING4可通过与p300结合,进而激活p53,诱导p21肿瘤抑制因子的表达,从而调节细胞周期、抑制细胞增殖。目前有研究表明ING4基因参与了多种肿瘤的发生发展,比如在人肺腺癌、乳腺癌、前列腺癌和黑素色瘤等肿瘤中ING4的表达量均明显降低。然而目前国内外对ING4在子宫内膜样癌中的作用机制报道较少,因此本研究通过检测ING4-p53-p21信号通路在子宫内膜样癌中的表达情况,一方面探讨ING4对子宫内膜样癌的作用,另一方面检测他们在子宫内膜样癌中表达的相关性,为临床预防及治疗子宫内膜样癌提供新的标志物,也为指导子宫内膜样癌的靶向治疗等提供理论依据。研究目的:研究ING4、p53、p21在正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜样癌组织中的表达情况,及其与子宫内膜样癌临床病理特征之间的关系。探讨ING4信号通路在子宫内膜样癌中的作用,拟为子宫内膜样癌的病理诊断、预防及靶向治疗提供理论依据。研究方法:本研究采用组织芯片技术和免疫组化方法检测正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织和子宫内膜样癌组织中ING4、p53和p21的蛋白表达情况;同时采用Western blot方法比较子宫内膜样癌组织及癌旁正常子宫内膜组织中ING4、p53和p21的蛋白表达水平;并分析各蛋白的表达水平与子宫内膜样癌临床病理特征之间的关系,及其与子宫内膜病变程度的相关性。研究结果:1.子宫内膜样癌组织中ING4的阳性表达率为23.3%,显着低于不典型增生组53.3%和正常子宫内膜组95.0%,三组相比差异显着（χ2=32.477,P<0.05）;低分化子宫内膜样癌组阳性率显着低于中分化及高分化组;随着肌层浸润深度及临床病理分期的增加,ING4的阳性表达率逐渐降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。2.子宫内膜样癌组织中p53的阳性表达率为63.3%,显着高于不典型增生组40.0%和正常子宫内膜组15.0%,差异具有统计学意义（χ2=15.141,P<0.05）;在不同组织学分级、临床病理分期及肿瘤肌层浸润深度的子宫内膜样癌患者组织中p53的表达差异有统计学意义（P<0.05）。3.子宫内膜样癌组织中p21的阳性表达率为28.8%,显着低于不典型增生组63.3%和正常子宫内膜组90.0%,三组相比差异具有统计学意义（χ2=26.172,P<0.05）;在不同组织学分级、临床病理分期及肿瘤肌层浸润深度的子宫内膜样癌患者组织中p21的表达差异有统计学意义（P<0.05）。4.Western blot结果显示,癌旁正常子宫内膜组织中ING4、p21蛋白表达量显着高于子宫内膜样癌组织;p53在子宫内膜样癌组织中的表达量高于癌旁的正常子宫内膜,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.子宫内膜样癌组织中ING4及p21的阳性表达与p53的表达呈负相关;p21与ING4的阳性表达呈正相关。结论:1.ING4及p21的表达在子宫内膜样癌中显着降低;ING4、p53及p21的表达与子宫内膜样癌分化程度及临床分期呈负相关。2.ING4与p21表达的降低及p53异常表达参与了子宫内膜样癌的发生发展。ING4通过p53及p21信号通路对细胞周期的调节机制在子宫内膜样癌中发挥重要作用,能够对子宫内膜癌的早期诊断及预测预后提供一定的帮助。

金美芳^[2]（2019）在《Clusterin调控NIX介导的线粒体自噬在发育期惊厥脑损伤修复中的作用及机制研究》文中研究说明癫痫（Epilepsy,EP）是儿童时期常见的慢性神经系统疾病之一,我国儿童癫痫发病率为每年151/10万,患病率约为3.45‰。发育期长期反复癫痫发作能够造成认知缺陷、情感障碍及行为异常,给个人、家庭和社会均造成负担。目前,癫痫的治疗以抗痫药物（antiepileptic drugs,AEDs）为主,辅助手术治疗。传统抗癫痫药物虽有一定疗效,但毒副作用较大,特别是认知功能损伤和行为障碍。而手术治疗癫痫不但适应症较局限而且具有一定风险性。因此,从癫痫发生机制入手,寻找抗癫痫新途径,以最小的副作用达到治疗癫痫的目的,成为国内外儿科癫痫治疗上的研究热点。癫痫的病理过程十分复杂,启动了多个细胞生物学过程,其中包括细胞自噬。自噬对于维持胞内稳态、应对应激状态非常重要,与多种人类疾病密切相关。通过自噬途径降解细胞内损伤或多余线粒体称作线粒体自噬,损伤线粒体的清除有助于细胞存活,研究表明神经元损伤过程中伴随线粒体自噬的激活。载脂蛋白J,即丛生蛋白clusterin的神经保护作用近年来已被广泛认可,但其机制尚未完全明确。clusterin具有抗凋亡的功能,这种凋亡是线粒体主导的,近来研究又发现clusterin的这种抗凋亡作用与自噬的激活关系密切。我们课题组前期研究发现clusterin在惊厥过程中高表达,且与自噬相关蛋白表达密切相关。以上这些启发了我们研究惊厥过程中clusterin与线粒体白噬的关系及其可能的作用。因此,本课题旨在明确clusterin在惊厥脑损伤过程中的作用,探讨其与线粒体自噬的关系及其在线粒体自噬中作用,阐明调控机制,并探讨其作为惊厥治疗靶点的可能性。第一部分 发育期惊厥致clusterin高表达并上调NIX介导的线粒体自噬目的:明确clusterin及线粒体自噬蛋白在惊厥模型中的表达规律,分析其相关性,并初步明确clusterin在线粒体自噬及神经元存活中的作用。方法:（1）取日龄21天（Postnatal days 21,P21）的ICR小鼠,依据随机数字表法随机分为对照组和惊厥组。适应性喂养1天后,于P22天,惊厥组腹腔注射海人酸诱导惊厥发作;对照组注射生理盐水。确认造模成功后24h取海马组织提取线粒体蛋白,运用免疫印迹（western blot,WB）方法,检测clusterin及线粒体自噬蛋白的表达,并对惊厥组中clusterin与线粒体自噬蛋白表达进行相关性分析。在此基础上取P21天小鼠同上方法制作海人酸惊厥模型,取60只制模成功的小鼠作为惊厥组,同时取60只小鼠注射生理盐水作为对照组。分别在惊厥后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d不同时间点取海马组织（每个时间点每组6只）,运用RT-PCR方法检测各时间点clusterin及NIX基因的表达,并运用免疫印迹（western blot,WB）方法,检测clusterin及线粒体自噬蛋白NIX、LC3的表达,分析其表达规律和趋势。采用原位免疫荧光染色法,原位检测clusterin、NIX及LC3在海马中的表达并进行分析。（2）为进一步验证以上结果,我们培养原代海马神经元细胞。首先在培养7天的细胞中制作谷氨酸损伤模型,分谷氨酸组和对照组,谷氨酸组加入谷氨酸使其终浓度为50μM,对照组加入相应体积培养基。6h后运用细胞免疫荧光检测检测clusterin、NIX、LC3的表达和分布。为探明clusterin是否在NIX介导的线粒体自噬中起作用,我们利用原代神经元细胞制作谷氨酸损伤模型,并加入外源clusterin进行干预（谷氨酸损伤+clusterin干预模型）。分正常对照组（control组）、单纯clusterin对照组（CLU组）、单纯谷氨酸组（Glu组）及谷氨酸+clusterin干预组（Glu+CLU组）。control组加入对应单纯体积培养基;CLU组加入clusterin,终浓度为100ng/ml;Glu组加入谷氨酸,终浓度为100μM;Glu+CLU组在加入谷氨酸前2h加入clusterin（终浓度分别是100ng/ml和 100μM）。分别在加入谷氨酸后 1.5h、3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h收集细胞。RT-PCR方法检测clusterin、NIX基因的表达,WB检测clusterin、NIX、LC3在线粒体中的表达规律。在上述模型6h这个时间点中,运用线粒体自噬检测试剂盒检测clusterin对线粒体自噬的影响。利用CCK8和LDH检测clusterin对神经元细胞存活的影响。结果:（1）24小时惊厥模型结果显示:与正常对照组比较,惊厥组海马组织中clusterin表达显着上调,自噬相关蛋白NIX、LC3II/I、PINK1、Parkin表达均上调,NIX及LC3II/I上调显着,分析惊厥组线粒体中clusterin、NIX、LC31I/1表达的相关性,结果显示三者呈正相关。（2）RT-PCR结果显示:正常组海马组织在不同时间clusterin和NIX的基因mRNA水平表达基本无变化;惊厥后海马组织中clusterin、NIX的基因表达均显着上调,且具有表达规律,均在惊厥后6小时出现高峰,并且在惊厥后5d恢复至正常水平。在惊厥后14d、21d、28d,clusterin mRNA的表达低于正常对照组,差异具有统计学意义;惊厥后期（7d、14d、21d、28d）NIX mRNA的表达与正常对照组比较,差异无统计学意义。（3）WB结果显示正常组海马组织线粒体中clusterin、NIX、LC3II/I的表达在不同时间的表达基本无变化,惊厥后海马组织线粒体中clusterin、NIX、LC3I1/I的表达均显着上调,且具有表达规律,均在惊厥后12小时出现高峰,clusterin和LC3LC3II/I在惊厥后10d恢复至正常水平,NIX在惊厥后7d恢复至正常水平;惊厥后21d、28d,clusterin蛋白的表达低于正常对照组,差异具有统计学意义;（4）原位免疫荧光分析显示:与正常组对照比较,clusterin与NIX及LC3在惊厥组海马中的表达显着上调,且呈现共表达。（5）原代神经元谷氨酸损伤模型免疫荧光显示:clusterin与NIX及LC3在谷氨酸组细胞中高表达,表达部位一致。（6）原代神经元谷氨酸损伤+clusterin干预模型中PCR结果显示:control组和CLU组中clusterin、NIX的基因在各时间段的表达均无变化;Glu组中clusterin与NIX的表达高峰出现在3h这个时间点,Glu+CLU组中,clusterin与NIX的表达高峰仍然出现在3h这个时间点,与Glu组中无差异,并且两组均在9h后开始回落。（7）原代神经元细胞谷氨酸损伤+clusterin干预模型中WB结果显示:control组和CLU组中clusterin、NIX及LC3的蛋白在各时间段的表达均无变化;Glu组中clusterin与NIX、LC3的表达高峰出现在6h这个时间点,Glu+CLU组中,clusterin与NIX、LC3的表达高峰出现在3h这个时间点,比单纯谷氨酸损伤组早出现。（8）在原代神经元细胞谷氨酸损伤+clusterin干预模型中线粒体自噬检测显示,与control组比较,Glu组中线粒体自噬水平显着上调,而Glu+CLU组中外源clusterin的加入能进一步提高细胞线粒体自噬水平。（9）CCK8及LDH结果显示:与Glu组比较,Glu+CLU组能显着提高细胞的存活率,CLU组与control组比较无明显变化。结论:（1）惊厥后线粒体上自噬相关蛋白表达上调,且NIX、LC3II/I与clusterin的表达呈正相关,提示clusterin可能与NIX介导的线粒体自噬关系密切。（2）惊厥后clusterin和NIX基因表达及线粒体中NIX、LC3II/I与clusterin蛋白表达在时空上表达规律基本一致。（3）外源clusterin的加入能使线粒体上NIX及LC3的表达时间高峰前移,但不影响clusterin及NIX基因水平的表达变化。（4）谷氨酸损伤模型中,clusterin干预能明显上调细胞中线粒体自噬水平。（5）谷氨酸损伤模型中,clusterin干预能提高神经元细胞的存活。第二部分 clusterin调控NIX介导的线粒体自噬抑制神经元损伤的机制目的:明确clusterin调控NIX介导的线粒体自噬发挥神经保护作用的机制。方法:（1）利用小鼠神经元细胞株HT22制作谷氨酸损伤模型,分正常对照组（control组）、单纯clusterin对照组（CLU组）、单纯谷氨酸组（Glu组）及谷氨酸+clusterin干预组（Glu+CLU组）。control组加入对应体积培养基;Glu组加入1μg/ml,终浓度为1μg/ml;Glu组加入谷氨酸,终浓度为5mM;Glu+CLU组在加入谷氨酸前2h加入clusterin,终浓度分别是1μg/ml和5mM。谷氨酸作用6h后利用线粒体自噬检测试剂盒检测各组线粒体自噬水平。并运用western blot检测各组线粒体中clusterin、NIX及LC3的表达变化。运用Real time PCR检测各组线粒体DNA编码基因,并用Nd2/GAPDH之比表征单位细胞/组织内的线粒体数量。运用线粒体红绿探针染色,并用流式细胞仪检测两者在各组细胞中的表达情况,用红（活性线粒体着色）/绿（所有线粒体着色）比率表示细胞中活性线粒体的比率（线粒体整体质量指标）。CCK8和LDH分析各组细胞存活情况。运用凋亡检测试剂盒流式检测上述各组细胞的凋亡。（2）进一步利用慢病毒载体构建clusterin过表达及沉默的稳定细胞株从正反两方面验证以上结果。各自分3组制作谷氨酸损伤模型（谷氨酸终浓度为5mM）,分别是:正常细胞+谷氨酸组（N+Glu组）、空载病毒+谷氨酸组（C+Glu组）、clusterin病毒+谷氨酸组（CLU+Glu）;正常细胞+谷氨酸组（N+Glu组）、空载病毒+谷氨酸组（siC+Glu组）、沉默clusterin病毒+谷氨酸组（siCLU+Glu组）。谷氨酸作用6h后,线粒体自噬检测试剂盒检测各组细胞内线粒体自噬水平。WB检测线粒体中clusterin、NIX及LC3的表达;（3）在此基础上,利用线粒体自噬抑制剂mdivi-1检测clusterin的促细胞存活作用是否通过线粒体自噬途径实现的,细胞分四组:谷氨酸组（Glu组）、谷氨酸+clusterin组（Glu+CLU 组）、谷氨酸+mdivi-1（Glu+mdivi-1组）、谷氨酸+clusterin+mdivi-1 组（Glu+CLU+mdivi-1组）（预先加入线粒体自噬抑制剂mdivi-1）,CCK8和LDH检测各组细胞存活率;（4）利用慢病毒载体构建NIX沉默稳定细胞株,制作谷氨酸损伤模型,并加入clusterin进行干预,以此检测clusterin是否通过NIX影响线粒体自噬水平。细胞分四组:空载病毒+谷氨酸组（siC+Glu组）、空载病毒+谷氨酸+clusterin组（siC+Glu+CLU组）、沉默NIX病毒+谷氨酸组（siNIX+Glu组）、沉默NIX病毒+谷氨酸组+clusterin组（siNIX+Glu+CLU组）。WB检测各组线粒体中clusterin、NIX及LC3的表达;线粒体自噬检测试剂盒检测各组线粒体自噬水平。（5）利用过表达clusterin细胞株制作谷氨酸损伤模型,并通过免疫共沉淀实验检测clusterin与NIX、LC3是否相互作用。利用细胞免疫共定位检测clusterin对NIX、LC3与线粒体结合能力的影响,同上方法（1）中分四组:正常对照组（control）、单纯clusterin对照组（CLU）、单纯谷氨酸组（Glu）及谷氨酸+clusterin干预组（Glu+CLU组）。利用免疫双荧光标记法分别检测各组中NIX与线粒体、LC3与线粒体结合情况。结果:（1）线粒体自噬检测显示与control组比较,CLU组中线粒体自噬无明显改变,而Glu组和Glu+CLU组中,线粒体自噬显着上调;与Glu组比较,Glu+CLU组中线粒体自噬水平进一步上调。（2）Real time PCR结果表明,control组和CLU组中mtDNA表达差异无统计学意义;与control组比较,Glu组和Glu+CLU组中mtDNA的表达显着下调;与Glu组比较,Glu+CLU组中mtDNA进一步下调。（3）线粒体探针染色后流式细胞仪分析结果表明,与control组比较,Glu组和Glu+CLU组中线粒体红/绿比率上调显着下降;与Glu组比较,Glu+CLU组中红/绿比率则显着上调,而control组与CLU组中差异无统计学意义,提示clusterin能降低谷氨酸模型中线粒体的损伤。（4）CCK8及LDH结果显示,与control组比较,谷氨酸使细胞LDH释放量显示上调,而存活率则显着降低;与Glu组比较,Glu+CLU组中clusterin能降低LDH的释放量并提高细胞的存活,control组与CLU组中差异无统计学意义。（5）与N组相比,利用过表达clusterin细胞株制作谷氨酸损伤模型后,即CLU+Glu组中线粒体上NIX和LC3II表达增加,并提高线粒体自噬水平;与N组相比,利用沉默clusterin细胞株制作谷氨酸损伤模型后,即siCLU+Glu组中线粒体上NIX和LC3II表达则显着下降,并降低线粒体自噬水平。（6）CCK8和LDH结果显示,线粒体自噬抑制剂mdivi-1能显着逆转clusterin的促细胞存活的作用,提示clusterin可通过线粒体自噬水平影响细胞的存活。（7）沉默NIX表达能逆转clusterin促线粒体自噬水平升高的作用,细胞整体线粒体自噬水平显着降低,并且能明显降低线粒体膜上LC3的表达。（8）免疫共沉淀结果显示,clusterin与NIX及LC3能相互结合,clusterin与后两者可能存在相互作用位点。（9）细胞免疫荧光共定位显示,与Glu组比较,Glu+CLU组中NIX及LC3在线粒体周围聚集量增多。结论:（1）在谷氨酸损伤作用下,clusterin干预可通过上调NIX介导的线粒体自噬提高神经元细胞的存活。（2）clusterin可与NIX及LC3相互作用,并通过影响两者在线粒体上的结合进而调节线粒体自噬水平。第三部分 Clusterin早期干预可通过NIX介导的线粒体自噬发挥抗发育期惊厥所致脑损伤作用目的:上述研究表明clusterin能促进线粒体自噬发生并抑制神经元损伤,此部分实验在动物模型中验证clusterin抗惊厥所致脑损伤作用,为其能成为潜在的神经损伤治疗提供依据。方法:（1）选取新生7天的ICR幼鼠随机分三组进行侧脑室注射,分别是:假手术组（Sham）、病毒对照组（AAVctrl+KA）、clusterin 病毒组（AAVclu+KA）。Sham 组选择人工脑脊液进行注射,后期不做任何处理;AAVctrl+KA组选择腺相关病毒空载体进行注射,AAVclu+KA组选择过表达clusterin的腺相关病毒进行注射,后两者在侧脑室注射两周后腹腔注射海人酸制作惊厥模型。分别于制膜后6h、12h、1d、3d、7d、14d、28d取海马,RT-PCR检测clusterin和NIX的基因表达,western blot方法检测clusterin、NIX、LC3在线粒体上的表达。取12小时小鼠脑组织固定切片后进行免疫荧光组化,检测clusterin对NIX与LC3结合的影响。取28d的小鼠全脑固定脱水,冰冻切片,进行尼氏染色和Timm染色检测。（2）惊厥后7d,14d,21d运用爬杆实验、悬挂实验,检测小鼠神经反射能力,与惊厥后24d、25d运用旷场实验检测clusterin干预对小鼠惊厥后认知情绪功能的影响。惊厥后22d,23d进行Y迷宫、惊厥后26-28d进行暗箱实验检测clusterin是否能改善惊厥后记忆及认知受损程度。结果:（1）RT-PCR结果显示:Sham组中clusterin和NIX基因表达在各时间点基本无改变,AAVctrl+KA组和AAVclu+KA组中clusterin、NIX的表达高峰出现在惊厥后6h。AAVctrl+KA组及AAVclu+KA组中两个基因的表达均较Sham组高,但AAVclu+KA组较AAVctrl+KA组整体表达水平上调。（2）Sham组中clusterin、NIX、LC3在线粒体中的表达在各时间点无明显变化,AAVclu+KA组海马组织中线粒体上NIX、LC3的表达高峰出现在制模后6h,而AAVctrl+KA组则在12小时出现高峰,clusterin提早了 NIX和LC3在线粒体膜上的表达,且每个时间点的表达均比AAVctrl+KA组和Sham组高。（3）clusterin提高LC3与NIX的结合。提示clusterin可能具有促进LC3与NIX结合进而促进线粒体自噬的作用。（4）尼氏染色结果显示:clusterin能降低神经元丢失。（5）TIMM染色显示:clusterin能改善CA3和DG区神经元发芽。（6）与AAVctrl+KA组相比,AAVclu+KA组小鼠的前肢悬挂时间明显延长,但爬杆实验中两者无明显区别。（7）Y迷宫显示:与AAVctrl+KA组比较,AAVclu+KA组进入食物臂的次数和时间显着增加;（8）旷场实验显示,与AAVctrl+KA组比较,AAVclu+KA组能明显缩短延迟时间,增加开场得分。（9）与AAVctrl+KA组比较,AAVclu+KA组进入暗箱的次数和时间明显减少。结论:（1）clusterin能提早并提高NIX及LC3在线粒体上的表达,并能促进NIX与LC3的结合,促进线粒体自噬的发生。（2）clusterin对新生期惊厥性脑损伤致远期神经元脱失、苔藓纤维发芽、神经行为、认知等有干预作用,即clusterin干预可抑制神经元脱失、海马苔藓纤维异常发芽并减轻远期神经行为、认知的损伤。

赵磊^[3]（2019）在《NADPH氧化酶介导的氧化应激在脂联素减轻脑缺血—再灌注损伤中的作用和机制研究》文中认为脑卒中严重危害我国人口的健康,其发病率高、致残致死率高。由于其治疗时间窗窄,给治疗带来了极大的困难。急性缺血性卒中是脑卒中各种亚型中发病率最高的一种,而尽快恢复血流的再灌注是治疗急性缺血性卒中的最重要方法。随着溶栓和介入治疗的进步,急性缺血性卒中的治疗效果已经有了很大的提高,但由于时间窗窄、副作用大等其他一些因素,治疗效果仍然不理想,这其中很重要的原因是缺血再灌注损伤。恢复脑组织的灌注虽然是治疗急性缺血性脑卒中的目标,但是缺血-再灌注损伤会增加神经元的损伤。多种机制参与缺血-再灌注损伤的病理生理学,包括氧化应激,炎症,血脑屏障破坏,线粒体介导的机制和白细胞浸润。氧化应激是由于再灌注后氧气的供应,产生过量的自由基,这些自由基的量超过了体内抗氧化酶系统的清除能力,从而对细胞产生了损害。NOX,即NADPH氧化酶,是产生ROS的主要酶家族。脂联素是由脂肪细胞表达并分泌。最初,科学家发现脂联素可以增强胰岛素的敏感性,对调节全身的代谢有重要作用。之后的研究发现脂联素对于缺血性脑卒中具有保护作用,但是其具体机制有待阐明。本研究利用线栓法大脑中动脉闭塞模型诱导脑缺血并移除线栓进行再灌注,对象为雄性C57/BL6小鼠,研究APN-P对小鼠脑I/R损伤的保护作用,并探索NOX介导的氧化应激在APN-P脑保护中的作用。本研究将为APN-P的神经保护机制提供新的证据,并为其临床应用提供理论基础。本研究共分为以下三部分:1.氧化应激相关分子在小鼠脑缺血再灌注损伤中的表达变化2.APN-P对于小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用3.NOX介导的氧化应激在APN-P神经保护机制中的作用及机制第一部分小鼠脑缺血再灌注损伤后氧化应激相关分子的表达变化方法以雄性C57BL/6小鼠为研究对象,采用线栓法MCAO模型并在缺血30分钟后再灌注以建立脑缺血-再灌注损伤模型。将小鼠随机分为六组:Sham组,I/R-6h组,I/R-12h组,I/R-24h组,I/R-48h组,I/R-72h组。先评价各组小鼠的神经功能评分,并于再灌注不同时间后提取小鼠缺血半暗带区组织,通过Western blot检测缺血组织中gp91phox,p47phox,4-HNE和8-OHdG氧化应激相关分子的表达变化。结果1.与Sham组相比,各个I/R组的神经功能评分显着下降,但是各个I/R组之间没有显着差异。2.在I/R后,氧化应激相关蛋白(gp91phox,p47phox,4-HNE和8-OHdG)表达的表达增加,于再灌注24小时达到高峰,随后下降。结论缺血-再灌注后,出现神经功能损伤,氧化应激相关蛋白表达的表达增加,于再灌注24小时达到高峰,随后下降。第二部分APN-P减轻小鼠脑缺血-再灌注损伤方法以雄性C57BL/6小鼠为研究对象,采用线栓法MCAO模型并在缺血30分钟后再灌注24h以建立脑缺血-再灌注损伤模型。将小鼠随机分为六组:Sham组,I/R组,Vehicle+I/R组,APN-P 2.5 mg/kg+I/R组,APN-P 5 mg/kg+I/R组,APN-P 10 mg/kg+I/R组。先评价各组小鼠的神经功能评分,之后测定梗死容积,进行Nissl染色,TUNEL染色和ROS染色,并利用电镜观察神经元超微结构的变化。结果1.与Vehicle+I/R组相比,APN-P 5 mg/kg+I/R组和APN-P 10 mg/kg+I/R组的神经功能评分和梗死容积显着降低,我们选取APN-P 5 mg/kg作为之后研究的剂量。2.Nissl染色的结果提示,APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后神经元损伤。3.TUNEL染色的结果提示,APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后神经元凋亡。4.电镜的结果提示,APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后神经元超微结构的损伤。5.ROS染色的结果提示APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后ROS的生成。结论APN-P减轻缺血-再灌注后神经功能的损伤和梗死容积,并减轻神经元的凋亡和超微结构的损伤,同时降低ROS的生成。第三部分APN-P减轻NOX介导的氧化应激发挥其脑保护作用方法以雄性C57BL/6小鼠为研究对象,采用线栓法MCAO模型并在缺血30分钟后再灌注24h以建立脑缺血-再灌注损伤模型。将小鼠随机分为六组:Sham组,I/R组,Vehicle+I/R组,APN-P+I/R组,Apo+I/R组,APN-P+Apo+I/R组。利用Western blot检测缺血组织中gp91phox,p47phox,4-HNE和8-OHdG氧化应激相关分子的表达变化以及凋亡相关蛋白的表达变化,利用TUNEL染色检测神经元凋亡。结果1.给予APN-P或者Apo处理后,gp91phox,p47phox,4-HNE,8-OHdG的表达水平显着下降（与Vehicle+I/R组相比,P<0.05）。同时,APN-P+I/R组的gp91phox,p47phox和4-HNE的蛋白水平显着低于Apo+I/R组的水平（P<0.05）。在APN-P+I/R和Apo+I/R组之间,8-OHdG的蛋白水平没有显着差异。2.Bax和active caspase-3的蛋白水平在APN-P+I/R,Apo+I/R和APN-P+Apo+I/R组中显着下调（与Vehicle+I/R组相比,P<0.05）。此外,APN-P+I/R组的Bax和active caspase-3蛋白水平较低（与Apo+I/R组相比,P<0.05）。相反,Bcl-2的水平在APN-P+I/R组中表达水平较高（与Apo+I/R组相比,P<0.05）。TUNEL染色的结果提示神经元凋亡的比例在APN-P+I/R,Apo+I/R和APN-P+Apo+I/R组中显着下调（与Vehicle+I/R组相比,P<0.05）。此外,凋亡水平在APN-P+I/R组中更低（与Apo+I/R组相比,P<0.05）。结论APN-P减轻缺血-再灌注后NOX介导的氧化应激是其神经保护作用的重要机制。

黎小红^[4]（2019）在《TPPP3在鼻咽癌中的表达及生物学功能研究》文中认为目的:鼻咽癌在广西高发,初发隐匿性高、病情发展迅速易转移。原癌基因的激活和抑癌基因的失活与鼻咽癌病变相关,而抑癌基因的失活在鼻咽癌的发生发展中更为普遍。研究发现促微管聚合蛋白3 （Tubulin polymerization promoting protein 3,TPPP3）在不同肿瘤中所表现的功能有所不同,但在鼻咽癌中尚未见报道。本课题将研究TPPP3在鼻咽癌中的表达情况,进一步探讨TPPP3对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。方法:1、通过生物信息学分析TPPP3基因在鼻咽癌和正常鼻咽组织中的表达。2、应用qRT-PCR技术检测16例鼻咽癌和16例鼻咽粘膜慢性炎组织中TPPP3 mRNA的相对表达水平;应用免疫组织化学技术检测72例鼻咽癌和51例鼻咽粘膜慢性炎组织中TPPP3蛋白的表达水平。3、应用qRT-PCR技术检测正常鼻咽上皮NP69细胞和鼻咽癌CNE2、HK1、5-8F、HONE1细胞中TPPP3 mRNA的相对表达水平。4、分别构建含TPPP3基因过表达片段和空载片段的慢病毒,感染鼻咽癌细胞株5-8F、HONE1,经嘌呤霉素筛选得到稳定细胞株,分别作为TPPP3过表达实验组（5-8F-TPPP3、HONE1-TPPP3）和空载组（5-8F-NC、HONE1-NC）,未处理的细胞作为空白对照组（5-8F、HONE1）。5、应用qRT-PCR和western blot技术检测各组细胞中TPPP3 mRNA和蛋白的表达水平,以验证TPPP3的过表达效果。6、应用CCK8实验和平板细胞克隆形成实验研究TPPP3过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。7、应用细胞划痕实验、Transwell迁移实验研究TPPP3过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。8、应用Transwell侵袭实验研究TPPP3过表达对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响。9、应用qRT-PCR技术检测各组细胞中基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达水平。结果:1、在31例鼻咽癌和10例正常鼻咽组织的全基因组芯片数据中,鼻咽癌组织中TPPP3 mRNA的相对表达水平明显低于正常鼻咽组织（P<0.05）。2、16例鼻咽癌和16例鼻咽粘膜慢性炎组织中TPPP3 mRNA的相对表达水平分别为0.114±0.069和1.340±0.707。相对于鼻咽粘膜慢性炎组织,TPPP3 mRNA在鼻咽癌组织中的相对表达水平明显降低（P<0.05）。在鼻咽癌组织中TPPP3蛋白的阳性表达率为9.72% （7/72）,在鼻咽粘膜慢性炎组织中TPPP3蛋白的阳性表达率为92.16% （47/51）,TPPP3蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率明显低于鼻咽粘膜慢性炎组织（P<0.05）。3、TPPP3 mRNA在NP69、CNE2、HK1、5-8F和HONE1细胞中的相对表达量分别为 1.004±0.013、0.026±0.005、0.020±0.004、0.148±0.005、0.073±0.005。鼻咽癌CNE2、HK1、5-8F和HONE1细胞中TPPP3 mRNA的相对表达量均明显低于正常鼻咽上皮 NP69 细胞（P<0.05）。4、5-8F、5-8F-NC、5-8F-TPPP3细胞中TPPP3 mRNA的相对表达量分别为1.003±0.013,1.114±0.132,141.263±0.523。HONE1、HONE1-NC、HONE1-TPPP3 细胞中 TPPP3 mRNA的相对表达量分别为1.004±0.058,0.928±0.104,125.037±0.631。与空载组、对照组相比,实验组TPPP3 mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）,表明5-8F-TPPP3、HONE1-TPPP3稳定细胞株成功构建。5、CCK8实验结果显示,TPPP3过表达实验组与空载组、对照组在Oh的OD值相比无明显差异,结果无统计学意义（P>0.05）;与对应的空载组和对照组相比,TPPP3过表达实验组细胞在四个时间点（24h、48h、72h、96h）的OD值明显降低（P<0.05）。5-8F、5-8F-NC、5-8F-TPPP3 的克隆形成率分别为（50.6± 1.7）%、（52.1±1.1） %、（32.5±1.1） %,HONE1、HONE1-NC、HONE1-TPPP3 的克隆形成率分别为（58.0±2.7）%、（56.4±2.2） %、（34.4±2.2）%,TPPP3 过表达实验组细胞克隆形成率明显低于对应的空载组和对照组（P<0.05）。6、划痕实验结果显示,5-8F、5-8F-NC、5-8F-TPPP3细胞在36h向划痕区域中央迁移的相对迁移率分别为（53.91 ±1.05）%、（ 52.72±0.81）%、（51.61 ± 0.95）%;HONE1、HONE1-NC、HONE1-TPPP3细胞向划痕区域中央迁移的相对迁移率分别为（51.04±0.90） %、（49.66±0.85） %、（48.91±0.50） %。各组细胞之间相对迁移率无明显差异,结果无统计学意义（P>0.05）。Transwell迁移实验结果显示,5-8F、5-8F-NC、5-8F-TPPP3在24h穿膜细胞数量分别为265.0±6.2、266.0±4.4、269.7±6.1 个;HONE1、HONE1-NC、HONE1-TPPP3穿膜细胞数量分别为236.3±3.5、245.0±4.0、246.3±4.1个。各组穿膜细胞数量之间无明显差异,结果无统计学意义（P>0.05）。7、Transwell侵袭实验结果显示,5-8F、5-8F-NC、5-8F-TPPP3在24h穿膜细胞数量分别为312.3±7.6、308.0±6.6、202.3±7.1 个;HONE1、HONE1-NC、HONE1-TPPP3 穿膜细胞数量分别为293.3±3.1、298.3±7.1、209.0±7.0个。与对应的空载组、对照组相比,TPPP3过表达实验组穿膜细胞数量明显减少（P<0.05）。8、5-8F、5-8F-NC、5-8F-TPPP3 细胞中 MMP-2mRNA 的相对表达量分别为 1.004±0.002,0.922±0.063,0.065±0.020;5-8F、5-8F-NC、5-8F-TPPP3 细胞中 MMP-9mRNA的相对表达量分别为 1.008±0.010,0.963±0.101,0.469±0.041。HONE1、HONE1-NC、HONE1-TPPP3细胞中MMP-2 mRNA的相对表达量分别为1.003±0.04,0.987±0.063,0.696±0.044;HONE1、HONE1-NC、HONE1-TPPP3细胞中MMP-9 mRNA的相对表达量分别为1.013±0.014,0.969±0.023,0.715±0.073。TPPP3过表达实验组较对应的空载组、对照组MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达水平明显降低（P<0.05）。结论:1、TPPP3 mRNA和蛋白水平在鼻咽癌组织中的表达下调,及TPPP3 mRNA在鼻咽癌细胞中的表达下调。2、TPPP3过表达可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖及侵袭能力,而对鼻咽癌细胞的迁移能力无明显影响。3、TPPP3过表达可能降低MMP-2、MMP-9的表达,提示TPPP3表达下调可能是一种与鼻咽癌侵袭有关的分子标志物。

李晓龙^[5]（2019）在《星康吉鳗驯养及不同激素组合对人工诱导星康吉鳗性成熟效果的比较分析》文中认为星康吉鳗（Conger myriaster）属于鳗鲡目（Anguilliformes）,康吉鳗科（Congridae）,星康吉鳗属,是我国东海、渤海等近海常见的食用鱼类。星康吉鳗喜欢生活在沙质海底及岛礁附近,被当地渔民俗称为沙鳗。它的经济价值较高,出口创汇潜力巨大。浙江北部近海海域是其主要分布区之一,进入80年代以来,星康吉鳗被逐步开发利用。然而,由于星康吉鳗的生活史复杂,目前尚未完成星康吉鳗全人工繁殖,也没有建立起人工养殖模式,目前市场消费产品仍旧依靠捕捞天然野生星康吉鳗供给。但由于星康吉鳗捕捞量逐年增加,野生资源面临枯竭的风险。为此非常有必要开展星康吉鳗的相关研究工作。本论文通过对野生捕捞的星康吉鳗进行养殖模式的探讨,以及人工催熟方法的初步研究。1.为探究星康吉鳗的人工养殖模式以及激素注射对星康吉鳗肌肉生化成分的影响。本实验采用人工模拟自然环境条件下的栖息环境。实验分为两组,对照组（不注射激素）,实验组（鲤鱼脑垂体提取液CPE 1mg/kg和人绒毛膜促性腺激素HCG100IU/kg）,1周/次,共12次。经过3个月的人工养殖和激素催熟,观察发现,星康吉鳗具有很强的趋光性,胆小喜安静环境,常常钻入沙子或管道中躲避,昼伏夜出,进食异常凶猛,以撕咬、吞食方式进食。对照组星康吉鳗存活率略高于实验组,存活率分别为80%、75.86%。激素注射后发现,星康吉鳗的性腺发育显着高于对照组（P<0.05）,性腺指数分别为（23.17±2.08）%、（2.88±0.37）%。另外,本次实验对星康吉鳗肌肉中的水分、粗脂肪、粗蛋白、灰分进行检测。星康吉鳗肌肉鲜样中水分、灰分含量在实验前后变化不明显;实验结束后发现,实验组及对照组星康吉鳗肌肉中粗脂肪含量分别为（26.97±5.20）%、（20.31±4.43）%,与室内养殖前（7.82±4.29）%相比,均显着上升（P<0.05）;实验组星康吉鳗肌肉中粗蛋白含量下降比较明显（P<0.0 5）,由初始值（79.54±1.26）%降为（58.65±5.13）%。2.为研究不同外源激素对星康吉鳗性腺发育以及形态学特征的影响,通过测量星康吉鳗外部形态特征以及从组织切片研究了卵细胞的发育阶段。本实验分为4组:对照组（无激素处理）,实验组A（CPE 2mg/kg）,实验组B（HCG 200IU/kg）,实验组C（CPE 1mg/kg;HCG 100IU/kg）。结果显示,与对照组相比,实验组星康吉鳗眼径指数上升,鱼鳍指数、肝脏指数下降;对照组鱼鳍指数、肝脏指数上升,变化均不明显。实验组星康吉鳗性腺发育指数显着上升（P<0.05）,其中实验组A性腺发育最佳,性腺指数为（6.80±1.72）%,对照组为（0.94±0.14）%。通过性腺的切片观察发现,对照组星康吉鳗性腺发育停留在Ⅱ期,实验组星康吉鳗性腺继续发育,达到Ⅲ期、Ⅳ期,实验组C性腺切片中甚至观察到Ⅴ期的卵母细胞。因此,外源激素注射能够引起星康吉鳗外部形态特征的变化,同时能够促进星康吉鳗的性腺发育。3.依据第二部分的实验方法,本次研究不同激素注射后,星康吉鳗的血清以及性腺中睾酮（Testosterone,T）,17α-羟基孕酮（17α-hydroxyprogesterone,17α-OHP）,17α,20β-二羟基-4-孕烯-3-酮（17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one,DHP）,雌酮（Estrone,E1）,雌二醇（Estradiol-17β,E2）,雌三醇（Estriol,E3）六种与性腺发育有关的类固醇激素。采用酶联吸附的方法（ELISA）检测激素含量水平。结果表明,实验组C血清中的E2、E3的含量与其它实验组相比具有的水平,分别为（50.86±6.34）ng/L、（125.11±12.47）ng/L,血清中的组间的其它激素含量无明显变化规律。性腺中的激素变化,与对照组相比,实验组的OHP含量呈现出上升趋势;第三次采样对照组和实验组C的OHP含量分别为（2.86±0.44）nmol/g、（4.57±0.85）nmol/g;实验结束后,实验组C星康吉鳗性腺中T含量[（217±31.76）ng/g],显着高于对照组[（123.24±21.05）ng/g,p<0.05]。与对照组相比,实验组星康吉鳗性腺中的OHP、E3、Estrone和T含量具有较高的浓度,有助于星康吉鳗的性腺发育。

潘昱辰^[6]（2019）在《BRINP1在OLs谱系细胞中的表达模式及功能研究》文中研究指明研究目的:髓鞘在神经系统中至关重要,具有绝缘、营养神经等作用。少突胶质细胞（OLs）,即在中枢神经系统（CNS）中形成髓鞘的细胞,在神经轴突周围包裹形成同心鞘样结构,可促进神经信号的传递,并为轴突提供重要的营养支持。形成髓鞘的OLs便是由少突胶质细胞前体细胞（OPCs）发育分化而来的。OPCs不但在哺乳动物的胚胎时期成簇发生,而且在成年时期的中枢神经系统中仍有新生。髓鞘在成年时期的新生与成熟有助于新的复杂技能的学习。同时,髓鞘重塑在整个哺乳动物的生命过程中也是一直持续不断的,这是一个动态平衡的过程,容易受到外在因素的影响。外在损伤或自身疾病都可造成严重的轴突脱髓鞘,影响正常的神经系统功能。而脱髓鞘损伤部位的髓鞘再生障碍便是许多神经系统脱髓鞘疾病发生发展的重要因素。因此,了解髓鞘形成过程中的分子机制,寻找促进再髓鞘化的因素,对制定神经系统髓鞘再生治疗策略至关重要。本课题所研究的BRINP1（BMP/RA-inducibleneural-specificprotein-1）是在用骨形成蛋白和视黄酸诱导胚胎大鼠神经元分化时发现的具有膜攻击复合物样结构域的蛋白,在神经系统整个发育中均有表达,对神经元正常发育十分重要。最近研究发现,BRINP1的转录受少突胶质细胞系特异性转录因子Olig2调控,且BRINP1还是经典的脱髓鞘疾病多发性硬化症的易感基因。目前,BRINP1在少突胶质细胞系中的表达模式和功能、特别是在脱髓鞘疾病中的功能尚无报道,亟待研究。研究方法:我们首先采用分子生物学、细胞生物学、形态学等研究手段,检测BRINP1在小鼠神经系统发育过程中生理情况下及体外培养的各种神经细胞里的表达,再在脱髓鞘小鼠模型中研究其表达模式。同时我们通过转染BRINP1过表达及干扰慢病毒来研究其对OPCs分化发育的影响。同时根据其蛋白结构线索探索它的其他功能。研究结果:我们研究发现,BRINP1在中枢神经系统中的少突胶质细胞谱系细胞,即PDGFRα+和CC1+细胞中特异性表达,而在小胶质细胞、星形胶质细胞中鲜有表达。在溶血卵磷脂（LPC）诱导的脊髓脱髓鞘病灶中,BRINP1的表达亦明显高于对照组。同时,我们在体外纯化培养的OPCs中上调BRINP1能促进OPCs的分化成熟,而下调BRINP1表达水平则会抑制OPCs的分化成熟,而且均不影响OPCs的增殖、凋亡和迁移水平。此外,我们还发现BRINP1可以分泌到胞外,在生理情况下主要由OPCs分泌。我们将OPCs上清加入到预先形成了膜攻击复合物的反应体系中,可见细胞的肿胀破裂数目明显减少,这很可能是因为BRINP1含有一段膜攻击复合物样结构域而参与了神经系统中的免疫反应。我们的工作表明,BRINP1在髓鞘发育和再髓鞘化过程中选择性地高表达在OLs谱系细胞中,并且对OPCs的分化和髓鞘形成起正向调控作用。我们发现BRINP1具有外分泌特性,其可能参与了神经系统中的免疫反应。基于以上结果,我们推测BRINP1很有可能在中枢神经系统髓鞘的发育过程中发挥重要作用。

张建斌^[7]（2018）在《可控表达pGH转基因小鼠制备及其功能研究》文中指出作为一个诱导基因表达调控系统,四环素（tetracycline,Tet）调控系统在基因工程中已开始应用于复杂的生物发生反应、机体的疾病及行为等。它已成为研究某一基因功能的有效工具,尤其在转基因小鼠的基因功能上,得到了广泛的应用。生长激素（growth hormone,GH）在不同物种中均具有促进性成熟,提高瘦肉率,改善饲料转化率等优点,但也存在副作用,在转生长激素基因的动物上尤为明显。这可能由于转GH基因动物,都是全身过表达GH基因,而且外源GH基因从胚胎期到成年都持续发挥生物学效应,其机体发育的异常很可能和GH在全身多个组织器官中的自分泌异常有关。在Tet调控系统中,诱导底物四环素的浓度与外源基因表达水平在一定范围内呈正相关,因此,可以通过控制四环素及其衍生物强力霉素（doxycycline,DOX）的有无、浓度高低来调控所导入的外源基因表达水平,进而认识所导入基因在不同水平及不同生长阶段的表达,了解其在动物生长发育中作用,进一步深入研究GH生物学功能。本研究采用分子生物学方法,构建了猪生长激素（porcine growth hormone,pGH）真核细胞可诱导表达载体,采用阳离子脂质体法转染到猪髋动脉内皮细胞（porcine iliac artery endothelial cells,PIEC）,在细胞水平上对Tet调控系统的诱导效率和表达水平进行了验证。然后利用该载体以原核显微注射方法,将外源基因片段（pTTGH）直接注射到原核期胚,制备转基因小鼠并用蛋白质组学的方法对其功能进行了研究。主要结果如下:（1）成功构建了重组表达载体（pTTGH）。在成功构建重组载体pTRE-GH12的基础上,应用PCR扩增出TRE-GH12基因序列片段。然后,通过酶（SalI）切位点将其连接到pCAGGS-rtTA载体上,构建pTTGH载体。通过对酶切、测序,结果证明构建的pTTGH载体符合要求。将构建好的载体用阳离子脂质体法转染到PIEC细胞。经遗传霉素（G418）抗性筛选后,将强力霉素添加到培养液中进行诱导。然后,通过荧光定量PCR在不同时间检测猪髋动脉内皮细胞内pGH mRNA的表达水平;配制不同浓度的强力霉素,将其加入细胞培养液内,在mRNA水平上测定猪生长激素的表达效率及表达水平。结果说明,将强力霉素添加到细胞培养液内,经过12、24、36、48和60h的检测,外源生长激素的mRNA表达水平分别比对照组高4.21、6.79、73.27、34.29和30.07倍。在培养基中添加不同浓度（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μg/mL）的强力霉素,pGHmRNA表达量分别是对照组的9.87、11.45、26.87、30.09、36.77、47.84、46.87、41.23、35.27和29.87倍,处理组与对照组差异极显着（P<0.01）。（2）将pTTGH质粒以原核显微注射方法制备转基因小鼠。以Southern鉴定为阳性的Founder鼠为基础扩繁培育,对转基因后代鼠在3～10周龄期间通过饮水中添加诱导底物DOX进行诱导实验。结果表明,转基因小鼠体重在诱导期内持续增加,生长速度高于转基因小鼠无药物诱导组和非转基因对照组,转基因组小鼠血清中pGH水平远远高于对照组小鼠,差异显着（P<0.05）。ELISA方法测定血清样本中内源IGF-1的表达水平,结果表明,转基因小鼠血清中胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）水平明显上升,说明外源GH通过调节IGF-1调节动物机体的生长。通过对转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌、腿肌等组织进行形态学变化及病理学观察。苏木精和伊红染色法（hematoxylin-eosin,HE）切片结果表明:转基因小鼠加DOX诱导之后与同窝非转基因小鼠加DOX诱导之后相比,功能性器官肝脏、脾脏、肺脏、肾脏都没有发生可见病变。（3）通过对转基因小鼠和对照组小鼠大脑、肝脏和肌肉共6个组织样本,采用同位素标记相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术进行质谱鉴定试验,再对获得的蛋白质组学数据进行生物信息分析,进而鉴定过表达GH转基因小鼠对机体的影响,进一步为GH高表达对大脑发育、能量代谢和生长性状的分子机制提供理论依据。转基因和对照组小鼠大脑组织共得到360个DEPs,转基因组高表达蛋白148个,低表达蛋白242个。肝脏组织共得到170个DEPs,转基因组高表达蛋白74个,低表达蛋白96个;肌肉组织比较共得到390个DEPs,转基因小鼠高表达蛋白156个,低表达蛋白234个。通过GO（Gene Ontology）注释和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway分析差异蛋白主要富集在RNA剪切过程、细胞间蛋白转运过程、mRNA加工过程及胰岛素信号通路、AMPK通路、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路等信号通路中。

马诗凝^[8]（2018）在《针刀干预对膝骨关节炎模型兔股直肌Akt/mTOR通路相关基因、蛋白表达的影响》文中认为[目的]本研究采用Videman后肢伸直位固定法制备膝骨关节炎兔模型,以股直肌损伤修复为切入点,运用Western blotting和实时荧光定量RT-PCR技术,通过观察KOA模型兔股直Akt、mTOR、4E-BP1、p70s6k的蛋白和基因表达的变化特点和规律,揭示针刀和电针干预治疗膝骨关节炎的股直肌mTOR通路的分子生物学机制,以期发现针刀和电针干预治疗KOA的不同作用途径和作用机制,为临床治疗方案提供实验依据,并揭示中医理论中关于“调筋治骨”的科学内涵。[方法]将36只6月龄清洁级新西兰大白兔通过excel（2016）软件运用随机区组的随机方法,将它们分为4组:正常组、模型组、针刀组和电针组,每组9只,其中1只用于造模成功与否的检验,其他8只用于各项指标的检测。通过采用改良后的Videman左后肢伸直位固定制动的方法造模,对实验性KOA模型兔分别采用针刀、电针两种不同的干预方法进行干预治疗,针刀选取实验性KOA兔左侧后肢股内侧肌、股外侧肌、股直肌、股二头肌等的起止点或肌腹上的条索或结节点进针,刀口线与肌肉肌腱方向平行,分别松解6次,每周2次;电针选取阳陵泉、阴陵泉、内膝眼和外膝眼疏密波,频率2/100Hz,强度3mA,每次10 min,1周3次,共4周对照。实验的第一部分通过观察KOA模型兔的体重、膝关节被动屈伸活动范围、步长、步频等方面进行行为学观察,以及股四头肌湿重和湿重比和大腿围度,并通过MRI对KOA兔膝关节系统整体情况进行影像学观察;通国HE染色在普通光学显微镜下观察KOA模型兔股直肌细胞的形态,肌纤维的粗细和异常的细胞情况,如细胞水肿等。在透射电镜下观察股直肌的超微结构之改变,来比较针刀与电针两种不同干预法之间的疗效区别。在本实验的第二部分Real-time PCR和Western blot技术检测Akt、mTOR、4E-BP1、p70s6k的蛋白表达和基因表达,用免疫组化法检测各组股直肌Akt、mTOR、4E-BP1、p70s6k蛋白相对表达水平,分析针刀干预对KOA模型兔股直肌细胞损伤修复作用机制与mTOR通路的之间的关系。[结果]（1）行为学检测:①LequesneMG评分:与正常组相比,模型组的改良后Lequesne MG评分出现明显的提高,（p<0.01）。与模型组比较,针刀和电针组的改良后LequesneMG评分均有显着性改善,且差异有极显着性统计学意义（p<0.01）。②膝关节被动活动度:和正常组比较,模型组的PROM有显着下降,（p<0.05）。与模型组比较,针刀组的PROM有统计学差异（p<0.05）。③步长:较正常组相比,模型组的步长显着减少有极显着性差异（P<0.01）,与模型组比较,针刀和电针组的步长均有恢复,并且均有极显着性改善（P<0.01）。④步频:与正常组比较,模型组的步频明显走低,有极显着差异（P<0.01）。与模型组相比,电针的步频表现出明显的提升,并具有极显着差异（P<0.01）。（2）体重、股四头肌湿重和大腿围度①治疗后体重:和正常组相比较,模型组的治疗后体重有极显着的统计学差异（P<0.01）,与模型组相比,针刀组的体重有显着提高,且有统计学差异（P<0.05）。②股四头肌湿重:各组之间股四头肌的湿重（绝对值）中,与正常组比较,模型组的股四头肌的湿重值显着低于正常组,（P<0.05）,与模型组比较,电针组的股四头肌湿重值明显上升,有统计学差异（P<0.05）。③大腿围度:在大腿最粗的地方测量差异性最大,与正常组比较,模型组围度明显变小,具有极显着差异（P<0.01）。与模型组比较,针刀组与模型组有显着性差异（P<0.05）,针刀的围度比模型组有所恢复。（3）形态学检测:①光镜观察:正常组肌束排列整齐有序整齐,大小均匀,细胞与细胞之间间隙匀称,间质未见水肿及炎细胞浸润;模型组肌束肌束排列紊乱,大小不一,多个肌纤维萎缩,细胞间质水肿,少量炎细胞浸润;针刀组及电针组较模型组均出现肌细胞的增大和再生,同模型组比较,骨骼肌纤维的横截面积明显增大,细胞间质水肿减轻。②肌纤维横截面积:较正常组相比,模型组的KOA模型兔的肌纤维横截面积缩小明显,具有极显着差异（p<0.01）。针刀组和电针组与模型组相比,肌纤维横截面有所恢复,具有极显着差异（p<0.01）。（4）各组实验兔股直肌透射电镜观察结果:正常组兔股直肌透射电镜下,显示易染色质和常染色质,肌筋膜肌浆网、血管、线粒体、肌板结构正常,正常组兔股直肌细胞核（未见位移）的位置正常,细胞核结构完整正常,肌丝（粗肌丝,细肌丝）、肌节结构正常,肌丝排列正常,易染色质和常染色质正常,肌筋膜,肌浆网（未见扩长）正常,血管结构正常,线粒体结构正常,糖原正常,肌板完整。模型组:肌糖原增多,线粒体嵴模糊不清,肌浆网明显减少（运动受影响）,线粒体形态不好,线粒体膜不完整,局部肌丝有破坏,肌丝有断裂（肌力受影响）,核周间隙扩张。肌筋膜凹陷出现锯齿样改变。Z线消失,肌节紊乱,线粒体增多,肌丝断裂缺失。线粒体浓缩,凝聚。线粒体在肌筋膜下增多,糖原也增多,出现肌萎缩,血管尚可,脂滴,肌丝、肌节破坏,线粒体嵴出现断裂,有损伤有代偿（糖原增多）。针刀组:肌丝有缺失,附近糖原增多聚集,肌筋膜有轻度锯齿样改变,筋膜下糖原增多形成糖原湖,粗细较均匀,肌节较清晰,明、暗带较明显,Z线结构较正常,少量线粒体水肿,筋膜下线粒体增多（代偿性修复）,线粒体嵴模糊。电针组:肌原纤维排列无序,粗细较均匀,肌丝断裂,在肌丝缺失的地方糖原增多集聚,出现糖原湖,肌节较清晰,明、暗带可辨,少量Z线排列异常,线粒体嵴模糊,线粒体肿胀且数目略增多。（5）造模后1周各组KOA兔左侧膝关节MRI显示结果:正常组可见实验兔膝关节周围软组织正常,关节面光滑关节间隙正常,半月板影清晰,没有赘生物;模型组KOA兔膝关节周围软组织如股直肌等出现明显萎缩,左侧膝关节关节腔内出现高密度影,滑膜增生改变,股骨关节面出现增生和变形,关节间隙内侧明显变窄,较正常组关节间隙明显降低,甚至出现了软骨的损伤;针刀组KOA兔膝关节周围软组织如股直肌的萎缩有所恢复,较模型组的股直肌更丰满些,关节腔内未见明显增生物,双侧的膝关节间隙比模型组宽,而且比较均匀,但是左侧膝关节关节腔内出现高密度影,滑膜增生改变,胫骨平台软骨关节面欠平滑;电针组KOA兔膝关节周围软组织如股直肌的萎缩有所恢复,比模型组的股直肌更饱满,左侧膝关节腔内出现高密度影（滑膜增生）改变,程度较模型组减轻,股骨关节面出现缺损,胫骨关节面出现唇样增生,较正常的关节间隙明显变窄。（6）用免疫组化法（IHC法）检测各组股直肌Akt、mTOR、4EBP1和P70s6k蛋白的表达水平,与正常组比较,模型组股直肌mTOR和P70S6K、Akt蛋白的表达水平低于正常组,差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较,针刀组和电针组的股直肌Akt、mTOR和P70s6k有显着的上升,有显着统计学意义（P<0.01）。与正常组比较,针刀组与电针组股直肌Akt、mTOR和P70s6k表达水平没有统计学差异。针刀组、电针组和模型组的股直肌4EBP1表达水平较正常组降低,但无统计学差异（P>0.05）;针刀组和电针组mTOR和Akt蛋白的表达水平均明显高于模型组,针刀组P70s6k蛋白的表达水平高于模型组,具有统计学差异（P<0.05）;而电针组股直肌P70s6k蛋白的表达水平与模型组相比,没有统计学差异（P>0.05）。说明针刀和电针刺激均能增加兔股直肌mTOR和AKT蛋白相对表达水平,针刀能增加兔股直肌P70S6K的蛋白表达水平。（7）Western blot检测结果:用Western blot法检测各组股直肌mTOR和p70s6k、Akt和4EBP1蛋白的表达水平,用目标蛋白条带光密度值/内参GAPDH蛋白条带光密度值作为相对表达量进行统计分析,结果如图所示:与正常组比较,模型组股直肌mTOR和P706s、AKT蛋白的表达水平显着降低（P<0.01）;与模型组比较,针刀组和电针组股直肌mTOR蛋白水平有明显的升高（P<0.01,P<0.05）。各组之间股直肌4EbP1表达水平无统计学差异（P>0.05）;说明针刀和电针刺激均能增加兔股直肌mTOR和AKT蛋白相对表达水平,针刀干预能增加兔股直肌p70s6k蛋白的表达水平。（8）Real-time PCR 检测各组股直肌 Akt、mTOR、p70s6k 和 4EBP1 的 mRNA 结果:（1）Akt的mRNA表达:与正常组比较,模型组极显着降低（p<0.01）;与模型组比较,针刀组有显着的升高（p<0.05）。（2）mTOR的mRNA表达:与正常组比较,模型组显着降低（p<0.01）;与模型组比较,针刀组和电针组均有极显着的升高（p<0.01）。（3）4EBP1的mRNA表达:正常组、模型组、针刀组和电针组各组间比较4EBP1的mRNA表达无统计学差异（p>0.05）。（4）p70s6k的mRNA表达:与正常组比较,模型组显着降低（p<0.01）;与模型组比较,针刀组和电针组均有极显着的升高（p<0.01）。[结论]（1）通过膝关节行为学评分,关节被动活动度测量,HE染色观察股直肌,透射电镜观察肌纤维的超微结构变化,大腿围度的测量,股四头肌湿重和湿重比,以及MRI均证明了:运用Videman左后肢制动的方法复制KOA模型不仅会造成膝关节周围股直肌、股四头肌、乃至整个大腿部的肌肉都出现了损伤和萎缩,还造成了软骨的损伤是成功的废用性KOA的模型。通过透射电镜观察,实验兔左后肢的股直肌超微结构提示本研究中KOA模型造成了兔股直肌的损伤,针刀和电针组均促进了股直肌的再生修复过程,相比较之下电针组的透射电镜结果更好一些。（2）针刀和电针干预的治疗方法均都对实验性KOA模型兔股直肌损伤有修复的作用,针刀组干预后肌纤维横截面积显着增加,关节的被动活动度,大腿围度增加、体重也增加,这些指标具有一致性,表现出来肌细胞的增大和肌纤维横截面积的增加。电针干预后表现出股四头肌湿重的增加,步长的显着增大和步频的明显加快,这些指标综合在一起可能说明电针干预后肌肉的肌力得到改善,运动功能和疼痛状况得到恢复。这些指标的不同,反应出来针刀和电针干预的作用机制并不相同。（3）针刀干预能够使得KOA模型兔的行为学评分明显得到提高,股直肌纤维横截面积增大,大腿围度增大,体重显着增加,同时Akt、mTOR和p70s6k的mRNA和蛋白高表达,都显示出针刀干预使得Akt/mTOR通路被激活,从而发挥对对受损萎缩的骨骼肌进行修复,从而发挥对骨骼肌的保护作用。（4）针刀干预能有效改善KOA临床症状其机制可能是通过激活Akt、mTOR和p70s6k的表达,进而使得Akt/mTOR信号通路发挥促进骨骼肌的增大和修复的作用,Akt/mTOR通路的激活可能是针刀发挥骨骼肌损伤修复作用的机制之一。

颜立冲^[9]（2018）在《长链非编码RNA H19在垂体瘤细胞中的作用及分子机制研究》文中进行了进一步梳理脑垂体瘤是一种常见的颅内肿瘤,约占所有颅内肿瘤的25%,近年来其发病率呈增多趋势。虽然垂体瘤是良性肿瘤,对患者的生命不构成威胁,但会引起视觉障碍以及由异常激素或肿瘤引起的不孕症和代谢综合症等严重临床综合征,严重影响患者的生活质量。由于缺乏有效的治疗靶点,且垂体瘤发生的机制较为复杂,这在临床上仍然是一个巨大的挑战。因此,从分子水平探索垂体瘤发生发展的机制,寻找特征性抗肿瘤靶点,可为临床预防和治疗垂体瘤开辟新的途径。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是近年来发现的一类长度超过200个核苷酸非编码蛋白质的RNA分子。现有研究发现,lncRNAs异常表达会影响机体的发育、细胞的凋亡、肿瘤细胞的生成等多种生物机能,从而导致疾病的发生,尤其是肿瘤的发生。H19是人类发现的第一个lncRNA,异常表达于多种肿瘤,在不同的肿瘤中兼具致癌和抑癌的双重功能。然而,H19在垂体瘤发生和发展中的作用及其作用机制目前仍然了解甚少。因此,本课题旨在研究H19在垂体瘤发生和发展中的作用及其涉及的分子生物学机制。我们的研究发现,H19在人垂体瘤组织中普遍低表达,其表达水平与肿瘤进展呈负相关。通过体内外研究证实,H19表达能够抑制体外垂体瘤细胞增殖和体内肿瘤生长。在分子机制上,H19可以通过选择性抑制mTORC1的功能而不是mTORC2来调节细胞及肿瘤生长。此外,H19可以特异性阻断m TORC1介导的4E-BP1的磷酸化而不影响S6K1的活化。进一步我们发现,H19特异性地作用于4E-BP1的TOS结构域,竞争性阻断4E-BP1与mTORC1复合体中Raptor蛋白的结合,从而选择性抑制mTORC1-4E-BP1的信号传导作用。综上,我们的研究揭示了lncRNA H19-mTORC1-4E-BP1在垂体肿瘤生长调节中的重要作用,有望为临床垂体肿瘤的治疗提供潜在靶标。

叶容晖,王春琳,郑荣泉^[10]（2018）在《中华鲟（Acipenser sinensis）脑垂体的形态和ACTH细胞定位》文中研究说明为研究中华鲟（Acipenser sinensis）神经内分泌系统的基本结构和功能,本文对中华鲟脑垂体的组织形态进行了观察,结果表明中华鲟的神经垂体较小,腺垂体可分为前、中和后腺垂体三部分,神经垂体形成分支插入后腺垂体。中华鲟垂体还有一个特点是有分支的垂体裂。前腺垂体位于垂体前侧,细胞间隙大,细胞分散呈窦状。中腺垂体细胞间隙小,细胞密集呈条索状,嗜酸性细胞和嗜碱性细胞区分明显。后腺垂体包围在神经垂体周围。腺垂体中有长且分支的垂体裂,腺垂体形成许多突起深入其中,垂体裂周围的细胞密集,染色深,排列成类似上皮组织的形态。免疫组化结果表明,中华鲟脑垂体ACTH细胞主要分布于后腺垂体。ACTH的前体基因是POMC,RT-PCR证明其主要分布在脑垂体中,在体内其他组织中基本检测不到。编码ATCH的片段位于POMC中最保守的区域。预测发现POMC基因有一个26氨基酸的信号肽,将不带信号肽的POMC基因插入表达载体。再转染HELA细胞POMC主要在细胞质中表达,而带有信号肽的POMC蛋白在细胞内很少,推测可能分泌到胞外,信号肽对POMC表达和功能发挥起重要作用,本研究结果可为该基因在中华鲟神经内分泌研究中提供参考。

二、人脑垂体三种细胞包埋及染色方法的改进（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人脑垂体三种细胞包埋及染色方法的改进（论文提纲范文）

（1）ING4、p53、p21在子宫内膜样癌中的表达及意义（论文提纲范文）

（2）Clusterin调控NIX介导的线粒体自噬在发育期惊厥脑损伤修复中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（3）NADPH氧化酶介导的氧化应激在脂联素减轻脑缺血—再灌注损伤中的作用和机制研究（论文提纲范文）

（4）TPPP3在鼻咽癌中的表达及生物学功能研究（论文提纲范文）

（5）星康吉鳗驯养及不同激素组合对人工诱导星康吉鳗性成熟效果的比较分析（论文提纲范文）

（6）BRINP1在OLs谱系细胞中的表达模式及功能研究（论文提纲范文）

（7）可控表达pGH转基因小鼠制备及其功能研究（论文提纲范文）

（8）针刀干预对膝骨关节炎模型兔股直肌Akt/mTOR通路相关基因、蛋白表达的影响（论文提纲范文）

（9）长链非编码RNA H19在垂体瘤细胞中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）

四、人脑垂体三种细胞包埋及染色方法的改进（论文参考文献）

• [1]ING4、p53、p21在子宫内膜样癌中的表达及意义[D]. 董杏. 郑州大学, 2020(02)
• [2]Clusterin调控NIX介导的线粒体自噬在发育期惊厥脑损伤修复中的作用及机制研究[D]. 金美芳. 苏州大学, 2019(04)
• [3]NADPH氧化酶介导的氧化应激在脂联素减轻脑缺血—再灌注损伤中的作用和机制研究[D]. 赵磊. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
• [4]TPPP3在鼻咽癌中的表达及生物学功能研究[D]. 黎小红. 广西医科大学, 2019(08)
• [5]星康吉鳗驯养及不同激素组合对人工诱导星康吉鳗性成熟效果的比较分析[D]. 李晓龙. 上海海洋大学, 2019(03)
• [6]BRINP1在OLs谱系细胞中的表达模式及功能研究[D]. 潘昱辰. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(11)
• [7]可控表达pGH转基因小鼠制备及其功能研究[D]. 张建斌. 山西农业大学, 2018(06)
• [8]针刀干预对膝骨关节炎模型兔股直肌Akt/mTOR通路相关基因、蛋白表达的影响[D]. 马诗凝. 北京中医药大学, 2018(08)
• [9]长链非编码RNA H19在垂体瘤细胞中的作用及分子机制研究[D]. 颜立冲. 上海交通大学, 2018
• [10]中华鲟（Acipenser sinensis）脑垂体的形态和ACTH细胞定位[J]. 叶容晖,王春琳,郑荣泉. 海洋与湖沼, 2018(02)