张华淼[1]（2021）在《基于侧链调控/修饰策略的细胞膜电位状态监测、线粒体长程追踪、细胞活性监测荧光探针》文中提出随着荧光学在基础理论和应用方面的稳步发展,荧光探针和荧光成像已经成为分子生物学,生物物理学,生物化学,临床诊断分析和环境化学不可或缺的工具。由于各个领域内技术的不断进步,从高压汞灯到能够稳定输出激光的激光器,从多层镀膜技术到衍射光栅,荧光显微镜在过去一个世纪以来经历了快速的发展,从早期宽场荧光显微镜到激光扫描共聚焦显微镜,再到如今打破了光学衍射极限的超分辨荧光显微镜。荧光显微镜的功能越来越强大,成像能力,分辨率越来越高。而荧光显微镜离不开荧光探针,荧光探针的开发和改良已经成为荧光成像技术发展的重中之重。早在上个世纪,就有人发现不同的侧链可以给荧光探针带来不同的透膜性,进而影响探针在细胞内的成像。但是侧链对荧光探针的影响并不止于此,调控/修饰侧链可以在不改变探针光物理性质的情况下,可控地改变荧光探针的亲脂亲水性,细胞内的交付能力以及靶向性等。而且侧链由于本身和细胞膜存在着疏水相互作用,也可以作为靶向基团来使用。本论文结合目前对于侧链的各种成功应用,以调控/修饰侧链作为荧光探针设计的主要手段开展了以下工作:（1）开发出了利用探针染色位置可视化区分细胞膜电位的正常状态和近零状态的探针。虽然细胞膜电位一般都维持在-60 mV左右,但是在某些特殊情况下,或者在某些特殊的细胞上,细胞膜电位会大幅度降低,趋近于零,这时的细胞膜电位被称为“近零膜电位”。目前区分这两种细胞膜电位状态的探针大都耗时耗力,需要繁琐的校准和复杂的数据处理。本论文通过在常用的咔唑荧光团上修饰以不同长度的烷基链,开发出了能够直接通过荧光图片点对点可视化区分细胞膜电位正常状态和近零状态的荧光探针。由于静电相互作用,它们在染色正常膜电位状态的细胞时染色细胞质,而在染色近零膜电位状态的细胞时染色细胞膜。该探针虽然是阳离子染料但是并不受线粒体膜电位的干扰。它们虽然不能和传统膜电位探针一样定量地检测细胞膜电位,但是它们避免了传统膜电位探针使用过程中的校准,数据处理等步骤。（2）大部分线粒体探针会在线粒体膜电位去极化时从线粒体上脱落,导致这些探针难以长程追踪线粒体。而目前的线粒体追踪探针都是利用化学反应将探针用共价键锚定到线粒体上。这样虽然可以长程追踪线粒体,但是会对线粒体内的蛋白质造成不可逆破坏,细胞毒性较大。本论文结合组内之前的研究通过侧链修饰策略,将NBD基团修饰在传统线粒体探针的侧链上,获得了能够不受线粒体膜电位影响的非反应型线粒体追踪荧光探针SP-NBD。NBD基团的引入显着增加了 SP-NBD的亲脂性,而且NBD的刚性平面结构增大了探针分子的整体刚性使得探针SP-NBD的透膜性大大下降。当线粒体膜电位降低甚至消失时,低的透膜性使得探针难以透过线粒体的双层膜结构,从而使其能够长程追踪线粒体。（3）目前设计细胞活性探针的策略已经有很多,其中最简单有效的设计策略就是监测细胞膜的通透性改变。因为不论在凋亡细胞还是坏死细胞上,细胞膜通透性都会大幅增加。这种设计策略的难点在于要调节探针的透膜性,使其无法穿过活细胞的细胞膜但是可以穿过死细胞的细胞膜。本论文通过侧链调控策略在化合物CPS的基础上进一步降低其透膜性得到了能够监测细胞活性的绿色荧光探针ECPS。该探针无法穿过活细胞的细胞膜;而在染色死细胞时,可以迅速穿过细胞膜同时染色细胞质与核仁。该探针的设计策略主要有两点:首先,正电荷与内负外正的细胞膜电位存在着相互作用,易使探针内在化进入细胞,为此,引入了可以中和正电荷并增加水溶性磺酸根。其次,长烷基链与细胞膜有着疏水相互作用,带有长烷基链的探针容易插入细胞膜,而细胞膜与细胞内部存在着物质交换,会导致探针的内在化。通过缩短长链,使得探针无法插入细胞膜内,只能游离在活细胞的外面避免了内在化。该探针可以在活细胞群落中快速标记出死细胞。随后,基于同样的设计策略,又设计合成了类似结构的红色细胞活性探针SQ。后续实验证明SQ有着和ECPS相同的性能,这一点又说明了该侧链调控策略的普适性。（4）目前的脂滴探针大都是通过提升探针亲脂性来靶向脂滴的脂质核心。但是在实验中本论文发现探针过高的亲脂性或许会适得其反。本论文在无靶向性的荧光染料BPAPY的基础上缩减了两个苯环并引入了一个羟基。最终得到了出色的脂滴探针BPANA。它的有机化合物疏水常数cLogP从BPAPY的7.13降到了 5.73。结合本课题组之前的工作,不难发现脂滴外膜是由单层的两亲性磷脂分子层构成,其中亲水端向外,所以过高的亲脂性可能会阻碍探针透过脂滴膜。此外,探针BPANA的荧光十分稳定,不受极性和粘度的影响,即便在水中,也不淬灭。这一特性意味着该探针点亮脂滴的原因只可能是它对脂滴出色的专一选择性。除此之外,BPANA的光稳定性好,细胞毒性低,是成像脂滴的有力工具。综上,本论文基于侧链调控/修饰策略设计并合成了一系列具备不同用途的功能性荧光探针。它们充分利用了侧链对荧光探针的亲脂亲水性,靶向性,透膜性的影响。这些探针虽然都是由传统的荧光探针改造而来,但是侧链的引入/修饰改变了它们的性质,使得它们可以在染色细胞时展现出区别于原型探针的性质。
付义林[2]（2021）在《利用超分辨成像研究非小细胞肺癌细胞膜Trop2蛋白分布及其调控机制》文中研究指明全球范围内,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）已成为癌症患者致死的首要原因。在酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）被引入治疗之前,大多数接受铂类联合化疗的晚期NSCLC患者的总生存期不到一年。上世纪70年代,患者的基线表现、疾病程度、体重减轻等是生存的主要预测指标,随着不断对导致肿瘤异常生长和存活的分子深入研究,现已极大的改变了NSCLC的治疗前景,进入了基于肿瘤分子特征的治疗时代,也使得个性化分子靶向治疗和临床应用成为可能。非小细胞肺癌是一个多阶段、多步骤的复杂发展过程,可能会持续数年到数十年,并且在这个过程中从基因到特异性的蛋白质常共同参与,随着异常表达的逐步积累,最终导致了肿瘤的发生。此外,单细胞层面的蛋白质正常或异常表达也会影响细胞的生长和存活,而后,每个从体细胞到癌细胞的转变都对癌症的发生发展产生影响。细胞膜是细胞生命的重要组成部分,是发生众多生化反应的场所,而细胞膜蛋白作为其中的重要组成部分,参与了大量的生理过程。因此,解析细胞膜表面蛋白在肺癌中的差异表达将为理解肿瘤的分子调控机制提供线索,进一步实现其在实体肿瘤治疗中的诊断和治疗潜力。近几十年对于细胞信号通路的研究在不断深入,虽然已经确定了很多重要信号通路中的蛋白质分子,但提高亚细胞层面上的生物过程认知,将有助于更加详细的描述细胞膜上发生的复杂生理变化和相互作用,帮助我们更加完整的理解肺癌机制。膜蛋白Trop2最初作为侵袭性滋养细胞的标志物被发现,随后发现其在多种肿瘤中发挥驱动作用,可以赋予癌细胞增殖、侵袭等能力,并参与癌症复发、转移。因此研究Trop2在NSCLC中表达情况及作用机制,将有助于拓宽NSCLC的潜在治疗靶点。由于膜蛋白的分子尺寸一般为数十纳米,远小于普通光学显微镜的衍射极限,无法对其进行直接解析。但是,近年来以直接随机光学重构显微镜（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,dSTORM）为代表的超分辨荧光显微技术突破了光学衍射极限,在便捷的前提下实现了纳米级尺度的超分辨成像,因此,我们利用超分辨成像研究NSCLC细胞膜表面Trop2蛋白的差异性分布及其相关调控机制,将为阐明肺癌中特异蛋白质的作用机制做出重要贡献。在实验准备阶段,首先确定dSTORM采集图像的原始帧数、超分辨率数据的重构、定位点密度计算方式等基础条件,随后采用Nano J-SQUIRREL及SR-Tesseler对超分辨重构图像进行评估及数据量化。实验一,首先利用dSTORM探究Trop2蛋白在3种主要NSCLC细胞系中的表面分布模式,并与对照组的HBE细胞系作比较,构建Trop2蛋白的亚细胞结构模型。发现相较于正常HBE细胞,Trop2蛋白在NSCLC细胞膜表面分布了更多的蛋白分子,并且Trop2蛋白的分布模式在不同细胞系之间存在差异,NSCLC细胞膜表面形成了更多、更大、更密集的蛋白簇,同时蛋白簇内的分子数也更密集。实验二,在人类原代肺癌细胞中予以验证。发现原代细胞也同样具有上述规律,提示Trop2蛋白在细胞膜的过度表达及簇状分布模式具有潜在肺癌诊断价值。实验三,应用dSTORM对Trop2在细胞膜上的分布机制进行探究。首先,探究细胞极性,也即细胞的顶-底极性,对Trop2分布特征的影响。Trop2蛋白在A549及HBE细胞的顶膜上均具有更高的表达分子点数,并且更容易形成大面积、多数目的蛋白簇,表明细胞极性会影响膜蛋白的不对称分布。随后,应用超分辨双色成像及脂筏竭耗实验,探究Trop2蛋白与细胞膜表面脂筏结构的关系。脂筏微区与Trop2蛋白在细胞膜表面具有高度的共定位效应,而脂筏结构的竭耗会破坏Trop2蛋白分布模式的稳定性,进一步改变Trop2蛋白的分布并导致成簇能力降低。此外,Trop2蛋白也与非小细胞肺癌细胞表面的肌动蛋白骨架存在联系,当破坏细胞肌动蛋白骨架时表现为Trop2蛋白的成簇受限,如簇数目及面积的减少,但其对Trop2成簇的影响要小于脂筏。最后,为了进一步探究NSCLC中的Trop2蛋白是否存在异常激活,我们选择IGF-1与Trop2相互作用,并探索了其激活状态与蛋白分布之间的联系。发现IGF-1对Trop2蛋白分子的刺激作用主要表现在正常支气管上皮细胞,可以促进其细胞膜表面的Trop2表达量增加及成簇聚集;而癌细胞膜表面仅有Trop2蛋白表达量的增加,因此我们推测Trop2蛋白在癌细胞膜表面成簇分布是激活/活跃状态的表现。实验四,探究Trop2蛋白在细胞膜的成簇分布被破坏后对于下游相关信号蛋白表达及细胞迁移侵袭的影响。发现NSCLC细胞膜表面的Trop2蛋白成簇分布被破坏后,下游信号蛋白包括ERK1/2、p ERK以及细胞周期蛋白Cyclin D1/Cyclin E1均有不同程度的表达减弱,并且相应的癌细胞迁移及侵袭能力均受到限制;而使用IGF-1刺激后上述信号蛋白表达上升,且相应的癌细胞迁移侵袭能力也增强。表明Trop2蛋白分子在肺癌细胞膜表面的成簇分布对下游信号蛋白及细胞表型具有重要影响。综上所述,本研究以NSCLC中的膜蛋白Trop2为研究对象,利用超分辨成像以及细胞生物学技术探究了Trop2蛋白的分布及调控机制,将Trop2蛋白的定位、分布特点和分子组成与它们行使的功能联系起来。帮助我们从纳米级尺度上更全面透彻地了解目标分子在肺癌中的结构特点、定位变化以及相互作用的关系,为进一步揭示复杂的信号转导通路的机制奠定了基础。
王方雨[3]（2020）在《反射式共聚焦与受激拉曼散射系统显微成像技术研究》文中认为在生物化学、工业材料、医学等基础科学领域,探寻物质的微观结构,越来越需要高分辨率（微米、纳米级）、大视场、视频级成像速度、实时、低成本、易搭建、可三维成像、生物免标记、生物活体成像等特点的光学显微镜。围绕这些问题,本文最终搭建了含有受激拉曼散射显微成像、荧光成像、共聚焦光谱采集的生物活细胞显微成像平台,本文开展的相关研究如下:1.研究了共聚焦显微镜系统结构组成,介绍了光学成像原理特点,研究了光路的4f结构,分析了系统光学放大倍数、光学分辨率、扫描角度、成像面积、针孔大小,各参数之间的关系与推导过程,简要描述了zemax的光学设计过程,同时在变尺度方法评价整机性能方向进行了理论探索与仿真。2.研究了共聚焦显微镜的二维扫描成像机制,以关键器件高频共振振镜和多面体转镜Polygon实现了两种方案。一种是共振振镜与检流计振镜组合完成x-y扫描成像,另一种是Polygon转镜与检流计振镜组合完成x-y扫描成像,并详细了数据采集卡的双触发工作模式（行信号+帧信号）的优点、时序同步关系。3.为了获取较大视场范围图像拼接,共聚焦显微镜中,在x-y面使用了两个步进电机扩大视场,受激拉曼散射显微镜中,x-y面使用了高精度位移台。4.研究了共聚焦显微镜系统中的高频噪声消除、激光器等特殊器件的散热等工程技巧问题。5.研究了受激拉曼散射显微镜,使用商业器件和开源软件二次开发完成了整套系统的搭建,实现了受激拉曼显微镜的活细胞长时间成像装置。本文共聚焦显微镜的研制与受激拉曼显微镜成像平台的搭建过程,在相关行业内具有一定的创新性和工程实用价值。
孟凡渝[4]（2020）在《基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究》文中进行了进一步梳理端粒是位于线状染色体两端的DNA-蛋白质帽子结构,能够保证遗传信息以及染色体正常的生理功能。端粒酶作为一类具有逆转录作用的酶,能够决定端粒的长短和活性大小。端粒与端粒酶在细胞衰亡、肿瘤发生以及干细胞能力维持等生命活动中都至关重要,而表达和调控机制的紊乱很可能导致癌症相关疾病的发生。在大部分恶性肿瘤细胞中端粒酶都会过表达,阻止端粒长度缩短和缺失,使癌细胞永生化。由此端粒酶可作为重要的肿瘤标志物,为癌症早期诊断提供依据和相应的治疗靶点,它的检测分析具有广泛的应用价值。本论文依据端粒酶扩增的基本原理,设计相应的核酸纳米结构和分子识别探针,构建基于功能化纳米材料介导的信号放大体系,以电化学和荧光技术作为关键检测手段,开发超灵敏生物传感器,开展针对端粒酶活性相关的定量检测和细胞内成像研究,具体内容如下:1.我们首先利用纳米材料作为信号分子,设计了无PCR参与的基于电化学传感技术的端粒酶活性分析方法。在这项研究里,使用未修饰的金纳米材料（AuNPs）和电化学伏安法定量分析从HeLa细胞中提取的端粒酶的活性。在金电极上,端粒酶可以利用硫醇修饰的端粒酶底物（TS）引物和脱氧核糖核苷酸（dNTPs）的混合物,特异性地促进含有重复核苷酸序列（TTAGGG）n的单链DNA（ssDNA）的延长。在TS引物与阻断剂DNA杂交后,纳米金粒子被ssDNA延伸部分暴露的含氮碱基捕获,并且通过差分脉冲伏安法（DPV）来具体量化端粒酶活性。在分析电化学信号后,获得20到2000个细胞的线性检测范围。这种简单的分析机制的检测极限是20个细胞。此方法无需PCR参与,快速且简单,非常适合在体外灵敏的评估细胞提取物中的端粒酶活性。2.我们接着开发了一种更稳定精确的双信号比率型电化学传感器,设计核酸的发夹结构用于端粒酶活性的超灵敏分析。发夹结构的DNA探针在其5’末端用亚甲基蓝（MB）分子标记后首先被结合在金电极界面上。然后与二茂铁标记（Fc）的端粒酶底物引物（Fc）进行杂交。随着端粒酶的催化反应,重复产生（TTAGGG）n的序列,能够与发夹DNA其余部分结合,进而触发探针的构象转导,打开发夹结构。因此,MB信号从电极表面释放,检测到的氧化峰值电流（IMB）降低。同时,Fc信号不受构象变化影响,保持相对稳定,峰值电流（IFc）可以用作内部对照,提高信号输出的稳定性和准确性。这种智能结构设计可以实现可靠的目标识别,获得的结果表现出出色的分析性能,非常适合低浓度目标物的检测。实验结果发现IMB/IFc与端粒酶浓度对数线性相关,检测限度极低。这种基于核酸结构变化和比率型信号输出的方法,可以成为一种强有力的分析端粒酶活性的实用工具,也可以作为开发其他核酸分析的多功能工具。3.端粒酶催化端粒延伸反应并添加DNA重复序列,诱发癌症或其他疾病,除了体外检测,其细胞内成像分析也具有重大应用价值。因此,开发可靠和方便的端粒酶原位监测方法对于恶性肿瘤的临床诊断至关重要。然而,大多数用于细胞内端粒酶活性测定的电流探针都面临不可避免的假阳性干扰。在这项研究中,我们设计了一种核酸四面体结构,并利用荧光共振能量转移（FRET）效应,来高灵敏度的监测和分析细胞内基于端粒酶表达的自由扩增程序。其中,由DNA四面体作为结构基底和发光DNA作为有效识别序列,构建DNA纳米探针,以实现端粒酶的体外传感检测和细胞内成像,并且避免假阳性干扰的问题。端粒酶可以使其底物引物延伸产生重复序列,发生链置换反应并改变核酸探针的构型,两端标记荧光团的发光DNA被释放游离出来,信号分子之间的距离增加导致荧光的恢复。此方法基于显着的FRET效应建立了简单比率传感器,检测限度可以达到单细胞水平。这种检测系统可以在端粒酶抑制剂的筛选分析中得到应用,在抗癌药物发现中发挥作用。4.端粒酶和miRNA在肿瘤细胞中含量较高,已被公认为常见的肿瘤检测标志物。我们又设计了基于miRNA触发的DNA酶步行器,与纳米金（AuNPs）探针结构相结合,用于端粒酶活性的逻辑门传感分析。通过链置换反应,目标miRNA打开两个发卡结构,循环扩增形成双足DNA酶步行器。在AND逻辑门实验中（实验A）,端粒酶的存在使引物（Tp）被延长,与锁定链结合。双足DNA酶和Mn2+与底物链结合,发生催化剪切作用,被AuNPs抑制的羧基荧光素信号（FAM）释放到溶液中,荧光恢复。在两种目标物或任何一种目标物不存在时,检测体系的荧光皆无法恢复。在OR逻辑门实验中（实验B）,miRNA触发的双足DNA酶可以单独打开AuNPs探针上的发卡结构,在Mn2+作用下,将荧光分子释放出来。端粒酶产生的延伸产物,可以与AuNPs探针上含有FAM的锁定链结合形成双链,释放到溶液中产生荧光。单一目标物存在下,荧光信号皆可恢复,两种目标物存在下,荧光强度增加。除此之外,含有信号分子的AuNPs探针复合物、载有DNA酶和TP引物的二氧化锰（MnO2）纳米片,可被细胞自主摄取,传递到细胞中,用于细胞内成像分析。该方法使用生物逻辑门和DNA酶步行器,极大地提高了荧光探针检测的适用性和灵敏度,已成功应用于端粒酶和miRNA的体外检测和细胞内成像研究,对于临床诊断来说具有重要意义。5.在更进一步的研究中,我们策略性地制造了多功能纳米结构TDNs-Flare探针,来同时灵敏地检测端粒酶和miR-21这两种肿瘤标志物,以及进行相应的细胞内生物成像研究。TDNs-Flare探针主要是由金纳米颗粒（AuNPs）修饰的四面体DNA纳米结构（TDNs）作为基质,包含Flarel（Cy5）和Flare2（CDg）两种不同的反应性应答信号。在存在靶标的情况下,不完全互补的DNA链Flare会竞争性地从四面体框架中被置换下来,从而导致荧光信号的恢复。CDg荧光对应的miR-21线性检测范围从1 fmol到100 pmol,而Cy5荧光可以完成低至10个HeLa细胞的端粒酶浓度分析,动态分析范围从10到5000个HeLa细胞。此外,抗癌药物（Dox）在插入DNA双链后,会随目标物的识别和结合,而释放到细胞中发挥作用。这项研究表明TDNs-Flare探针是定量测定癌症生物标志物的很好的选择,并且已成功在研究中用于响应性生物成像。该纳米结构不仅克服了在细胞水平上同时检测多种生物标志物的障碍,而且在DNA装载抗癌药物的细胞内传递方面有着广阔的应用前景。
荆莹莹[5]（2020）在《小分子荧光探针在超分辨成像中的应用》文中研究指明细胞膜作为细胞与外界的屏障,在维持细胞的稳定、物质运输、信号转导等过程中发挥着非常重要的作用。细胞膜结构和膜组成分子的异常化是许多疾病发生的关键因素。因此,解析细胞膜表面分子的分布及组装机理对于理解其生理功能及病理过程至关重要。为了在亚细胞结构内实现对生物分子分布的认知,直接观测是最有效便捷的方法。然而,这些分子的尺寸大多数在衍射极限以下,普通光学显微镜不能满足要求。近年来发展的超分辨荧光显微技术突破了光学衍射极限,在研究细胞膜分布、解析生物结构、揭示分子相互作用等方面做出了巨大贡献。其中,直接随机光学重构显微镜（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,dSTORM）由于较高的分辨率和便捷的操作而得到广泛应用。dSTORM技术基于单个荧光分子的定位,需要成千上万张原始图片来重构一张超分辨图像,因此,超分辨图像的质量与获得的定位点密度和定位精度密切相关。为了获得更准确的超分辨图像,需要探针的精确定位和高密度识别。理想的探针应该是小尺寸、单价态、高特异性以及对靶标较小的干扰。传统的探针,例如抗体,尺寸相对较大且为多价态,在识别目标分子时存在潜在的空间位阻与交联。近期出现的一些小分子探针为单分子标记开拓了一个新思路。我们利用dSTORM技术,结合小分子探针标记,对细胞膜上多种糖分子及膜蛋白的分布模式进行了研究,取得的主要研究结果如下:1.糖分子结构复杂且多样化,在标记时通常以凝集素作为探针,然而凝集素为多价态,在标记糖分子时容易引起交联。为了避免这一现象,我们选用适配体探针标记糖分子。以N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）为例,GalNAc是细胞膜上一种重要的O连接糖,传统识别GalNAc探针为大豆凝集素（SBA）,我们用一种特异性的适配体识别GalNAc,结合dSTORM技术,对GalNAc在细胞膜上的分布进行超分辨成像,并分别检测了适配体探针和凝集素的标记效率和识别特异性。结果表明,GalNAc在细胞膜上形成异质团簇,而且用适配体标记时形成的团簇比凝集素标记时具有更多的定位点,表明适配体在糖簇内具有更强的分子识别能力。此外,通过糖苷酶去除GalNAc,证明适配体比凝集素具有更好的特异性。这一工作表明适配体是标记膜糖分子的高效探针,可以提供更准确、更详细的糖分子的空间定位信息。2.Globo H是细胞膜上一种与癌症相关的糖分子,在多种癌症中过表达。目前为止,globo H在分子水平上的准确定位和详细分布形态仍不清楚。Globo H的抗体为一种IgM,不仅尺寸较大,而且较难获得。因此,我们利用适配体探针识别细胞膜上的globo H,并结合超分辨显微镜研究了 globo H的分布特征。通过分析发现globo H在癌细胞膜上形成大小不一的团簇,并且globo H的高表达和成簇分布是癌细胞上特有的,表明globo H可以作为潜在的癌症诊断标志物。另外,双色dSTORM成像显示globo H与另外两种癌症相关的糖分子唾液酸（sia）和N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）存在共定位关系,我们推测这些与癌症相关的糖分子可能在某些癌症过程中协同发挥作用。这一工作对以后研究细胞膜糖分子结构与功能的关系奠定了基础。3.上皮细胞粘附分子（EpCAM）是一种重要的I型跨膜蛋白,在细胞功能和肿瘤发生中起着至关重要的作用。然而关于EpCAM在细胞膜上的详细形态、分子化学计量学和组装机制的问题尚未阐明。我们利用一种小分子肽来识别EpCAM,并结合超分辨显微技术,研究了 EpCAM在细胞膜上的组装机理。与抗体标记相比较,肽标记的方法显示了高的标记效率和定位密度;同时我们发现EpCAM在细胞膜上组装成含有不同个数蛋白分子的团簇;双色dSTORM成像显示了 EpCAM在一定程度上与四跨膜蛋白CD9共定位,CD9基因沉默能明显削弱EpCAM的聚集程度,表明EpCAM可能定位在细胞膜上的四跨膜蛋白富集微结构域（TEM）;与此同时,通过细胞松弛素D和糖苷酶NAG处理证明细胞骨架和糖基化也是EpCAM成簇的关键因素。这一体系为以后膜蛋白纳米结构域的研究提供新的线索。4.核仁素（NCL）在细胞膜上作为一种受体蛋白,不仅在细胞膜上表达,而且广泛分布于细胞核与细胞质中。尽管NCL被发现具有多种生物功能,但是其在细胞各个组分中的分布形态尚未获得。此外,胞质内和核内的蛋白在用抗体标记时通常需要透化,透化这一过程对细胞膜和核膜都有一定程度的破坏,影响对蛋白的原位观察。因此,我们用一种特异性适配体AS1411标记NCL,利用dSTORM技术揭示了 NCL在核仁、核质和细胞质中的不同分布模式,并对NCL在癌细胞和正常细胞的不同细胞组分中的分布进行了比较。结果表明,AS1411可以渗透进细胞内识别胞质中和核内的蛋白,无需进行透化,并且定位点密度高于抗体;通过分析发现,NCL在核仁中定位密度最高,在细胞质中以簇形态分布;与正常细胞相比,NCL在癌细胞膜表面和胞质中表达上调并且形成更大的簇,暗示这种表达和分布的变化可能与细胞癌变过程密切相关。5.前列腺特异性膜抗原（PSMA）是细胞膜上一种重要的癌症标志物,不仅参与多种细胞活动,而且具有羧肽酶和叶酸水解酶的性质。因此,基于PSMA独特的酶性质发展出许多抑制剂。我们利用抑制剂具有高特异性的识别特点,发展了一种基于抑制剂的超分辨探针,用于PSMA的超分辨成像。小分子抑制剂探针显示出比抗体更高的标记密度和簇识别能力。通过数据分析,我们发现PSMA在细胞膜上以簇的形式分布;双色dSTORM成像显示出PSMA与叶酸受体的显着共定位,暗示了这两种蛋白可能在叶酸转运中起协同作用。这一研究有助于进一步理解PSMA的生物学功能。更重要的是,基于小分子抑制剂开发的荧光探针扩展了超分辨成像探针的领域。
谢晓冬[6]（2020）在《基于暗场成像的贵金属纳米颗粒与活细胞相互作用研究》文中指出得益于合成方法的进步和治疗策略的改进,纳米材料在生物医学、特别是诊断和治疗领域的应用日益深入。纳米材料的高效性和安全性是其临床转化应用的重要前提。为了深入了解纳米材料在复杂生物环境中,会与生物界面发生怎样的相互作用,需要对纳米颗粒与活细胞的作用进行精确到单细胞和单颗粒水平的、可定量的研究。通过成像手段,可以对这种互作过程进行直观而连续的监测。但是,常用的荧光成像方法具有诸如光漂白、光毒性等局限性,难以满足长时程、单颗粒分辨率成像分析的需求。借助于贵金属纳米颗粒独特的光学性质,利用暗场显微镜对这些纳米颗粒被细胞摄取、在细胞内的运动、聚集等动态过程进行实时观察,可以为了解“纳米-细胞”界面的互作和分子机制提供重要的可视化证据。本论文选择纳米金和纳米银的作为等离子体纳米探针,以暗场成像作为主要研究手段,通过三部分的工作研究了纳米颗粒与活细胞的相互作用和可能的调控机制。在第一部分的工作中,我们利用纳米金探针研究了细胞膜包裹的纳米颗粒的靶向机理。纳米颗粒表面直接包裹细胞膜的仿生策略,能赋予材料更好的生物相容性和靶向性,已经被证明能够促进包括肿瘤靶向治疗在内的医学应用。但细胞膜成分复杂,其调控纳米颗粒靶向摄取的机制尚不清晰。针对这一问题,我们构建了癌细胞膜包裹的纳米金探针（AuNP@CCM）,借助暗场显微镜定量研究了AuNP@CCM在单细胞水平的细胞摄取和细胞内行为。我们还开发了一套程序,可以基于暗场图像对单个细胞内的纳米颗粒进行定量分析。结果表明,细胞膜包裹后能将纳米金的细胞递送效率提高7倍,且细胞内纳米粒子的聚集速度加快90倍以上。此外,我们发现在肿瘤细胞中普遍较高表达的整联蛋白IntegrinαVβ3对于AuNP@CCM的细胞靶向性至关重要。这部分工作为包膜策略的调控机制提供了新的见解。在第二部分的工作中,我们利用纳米银探针研究了纳米材料在细胞内的运动和团聚。纳米颗粒普遍存在细胞内聚集现象,目前,由于缺乏可靠、灵敏的方法进行单颗粒、单细胞水平的定量监测,胞内纳米材料聚集的动态过程和生物学效应仍不清楚。我们以包含有纳米银核心的球形核酸作为多色等离子体探针（plas-SNA）,借助暗场成像手段,针对这个问题进行研究。该探针的颜色变化可以反映纳米粒子的不同聚集状态。我们开发了一套自动化的图像处理和数据分析程序,对原始的暗场图像中的等离子体信号进行识别、分类和统计,结果揭示了细胞内纳米团聚的动态过程。我们通过单颗粒示踪的方法分析了单颗粒,小聚集体和大聚集体的空间分布和运动模式。此外,我们发现,核酸修饰减弱了银纳米的聚集程度,同时减弱了其细胞毒性,这一发现揭示了纳米材料的胞内聚集与其生物学效应的相关性。这部分工作提供了纳米颗粒发生细胞内团聚的定量化信息,从而有助于进行更安全,更有效地纳米设计。在第三部分的工作中,我们利用纳米金探针对纳米材料的细胞外排途径进行了研究。了解纳米材料的细胞外排机制,对于其在临床医疗方面的应用转化至关重要。然而,对于纳米材料是否会在细胞迁移的过程中被清除,还缺乏直接的证据和结论。因此,本研究以纳米金作为成像探针,利用暗场显微镜实时地观察和分析了细胞迁移过程中,纳米金颗粒在收缩丝内的运动和外排过程。结果表明,部分被细胞摄取的纳米金颗粒存在于收缩丝内,且颗粒的运动速率随着与胞体距离的增大而减小,当收缩丝与胞体断开联系后,纳米金颗粒被遗留在胞外。这部分的工作证明外源性的纳米材料可以在细胞迁移过程中被外排,此研究结果有助于设计更安全高效的纳米材料,并应用于诊断和治疗。
田杨[7]（2020）在《生物检测物响应的荧光探针的构建及其生物医学中的应用》文中进行了进一步梳理生物体内的活性分子（即:生物检测物）在许多生命活动中发挥着重要作用。而它们的异常表达也与许多疾病息息相关。因此,对于活性分子的检测可以有助于疾病的研究以及治疗。本论文中,我们构建了四类新型的荧光探针,实现了对各种活性分子的检测,并且成功地应用于多种疾病的成像。1. 我们首先设计合成了一个基于半花菁染料的近红外荧光探针（Cy-Azo）用来检测溃疡性结肠炎（UC）疾病中的偶氮还原酶（Azo R）。该探针对Azo R具有高灵敏性和选择性。该探针首先在两个细胞系（HCT116细胞和Hep G2细胞）和三种细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）中实现了Azo R的检测。其次,该探针被用于监测急性和慢性UC小鼠中Azo R的活性。这为UC疾病的诊断和治疗提供了重要的信息。2. 在UC疾病研究的基础上,我们研究了UC疾病中出现的“肠-肝轴”机制。首先,我们合成了一种缺氧敏感型的探针（Cy-AP）。该探针在四个细胞系中（Hep G2、HCT116、He La和MCF-7细胞）实现了缺氧可视化。然后,该探针可以在肝纤维化小鼠和UC小鼠体内监测缺氧情况。最后,该探针可以通过监测缺氧变化来验证生物体内“肠-肝轴”的存在及其机制。这将为延缓肝纤维化的进展,从而促进肝脏疾病的治疗提供一些强有力的支持。3. 前两个工作的基础上,我们发现半花菁染料虽然具有近红外优势,但是它的斯托克斯位移较小,这是不利于荧光成像的。因此,我们开发了一系列具有大斯托克斯位移和长发射波长的新型近红外荧光染料（DDM-R）并构建了两个荧光探针（DDM-ONOO-和DDM-CO）。这两个探针分别显示了对ONOO-和CO的高灵敏性和选择性。探针DDM-ONOO-被应用在中毒性肝炎细胞和活体模型中ONOO-的检测。探针DDM-CO被应用在细胞水平和活体水平上CO的可视化。4. 基于Azo R的研究,我们发现NAD（P）H作为一类重要的还原型辅酶在生物体内发挥了重要的作用。因此,我们提出了一种新的NAD（P）H响应机制并合成了一个近红外荧光探针（Cy-N）来检测NAD（P）H。该探针对NAD（P）H具有较高的敏感性和良好的特异性。更重要的是,该探针已成功应用于监测活细胞中内源性NAD（P）H和验证糖酵解过程中NAD（P）H的行为。这个探针表现出了在检测生物体内NAD（P）H方面具有很大的应用潜力。这个新型的响应机制为NAD（P）H探针的设计提供了一种新的思路,有利于NAD（P）H探针的广泛开发。
熊佳[8]（2020）在《基于VSPI算法的STORM超分辨图像重构研究》文中进行了进一步梳理受光学系统衍射极限的影响,传统的光学显微镜无法分辨尺寸小于200 nm的生物结构。为了突破光学衍射极限,超分辨显微成像技术应运而生。近年来出现的超分辨成像技术可分为基于受激辐射损耗的显微成像技术、基于频域调制的结构光照明显微成像技术以及基于单分子定位的超分辨显微成像技术等,为研究尺寸在衍射极限之下的生物目标提供了强有力的手段,迅速引起研究者的极大关注。随机光学重构显微成像技术（stochastic optical reconstruction microscopy,STORM）作为单分子定位超分辨成像技术之一,通过调控荧光染料分子的开关态,定位精度可以达到20 nm,可实现超高的空间分辨率。在该成像技术中,除需要可以光致闪烁的新型荧光探针外,图像重构算法在高分辨图像数据的后处理中发挥重要作用。传统的单分子定位超分辨重构算法要求光学探针分子低密度标记目标,避免荧光探针分子的光斑重叠,这需要采集数千帧闪烁图像才能重构一副超分辨图像,图像采集和重构时间均较长,导致超分辨成像时间分辨率低,在活细胞超分辨成像应用中存在困难;针对该问题发展的多分子定位分析算法,可以进行多高斯拟合分析光斑重叠的数据,但当探针标记密度过高,达到多分子定位分析算法的所能处理的标记密度上限时,不仅无法获得理想的重构图像,图像分辨率反而会降低,限制了活细胞动态过程的超分辨成像。为了解决上述问题,研究人员先后开发了多种高密度数据的定位算法,但目前均还未成熟。本论文针对STORM超分辨图像的预处理算法开展了相关研究工作,将一种基于调制图像与虚拟图像的积分值等价关系的预处理算法,即虚拟单像素成像（virtual single pixel imaging,VSPI）算法应用到STORM数据预处理当中,该算法可以将荧光分子标记密度过高、间距过小（100 nm）的重叠光斑数据进行稀疏化预处理,然后结合多分子定位算法进行图像重构,比传统的K因子算法预处理并采用相同重构算法的结果更优。进而,将VSPI算法用于新型STORM荧光探针的闪烁数据预处理,结合现有的超分辨图像重构算法,开展活细胞线粒体超分辨图像重构研究,在保证空间分辨率不变的前提下通过提高标记密度减少图像的采集帧数,从而达到提高成像时间分辨率的目的,为活细胞的超分辨成像研究提供了一种有效工具。本论文的主要工作包括:1.将VSPI预处理算法用于高密度STORM超分辨数据的稀疏化预处理。首先将仿真数据和荧光珠实验数据用VSPI处理,验证其稀疏化处理效果,结果表明其处理效果优于K因子算法;其次,将VSPI算法与多分子定位算法Thunder STORM结合,用于分析仿真实验数据和固定细胞实验数据,并比较VSPI算法对数据进行预处理前后的超分辨重构结果,定量分析不同密度数据重构的超分辨结果的差异,为进一步将VSPI算法应用到活细胞数据处理当中做好准备。2.研究新型STORM荧光探针的光物理性质（包括吸收、发射光谱）、光致闪烁性质（包括饱和激发功率、平均闪烁时间、占空比、抗漂白性等）和细胞特异性标记,然后将其作为活细胞线粒体的STORM探针,采集活细胞STORM超分辨成像数据,为VSPI预处理算法提供活细胞数据支持。3.将VSPI算法用于活细胞实验数据处理,并用于多分子定位算法FALCON超分辨重构,并与未进行预处理的重构结果对比,研究VSPI算法在活细胞STORM超分辨成像中的应用。
崔美荣[9]（2020）在《多功能纳米探针的设计及其在细胞分析中的应用》文中研究指明细胞成像因可实时、实地、清晰地监测生物体内小分子而成为疾病诊疗领域的一种非常重要的分析方法。近几年,基于核酸功能化纳米材料的细胞成像方法已得到了广泛的研究,核酸纳米探针因具有独特的光学性质、良好的生物相容性和较强的负载能力,在细胞成像和疾病诊断等领域有广阔的应用前景。但是,因为复杂的生物体系具有组分多、含量低、分布复杂和多重屏障的弊端,仍需进一步设计多功能纳米探针用于时-空精准的细胞内检测和成像。为了达到这个目的,本论文通过将多功能的核酸纳米探针与荧光成像技术相结合,构建了一系列特异性强、灵敏度高、刺激-响应的纳米探针。主要研究内容如下:1.靶标诱导的自供能DNAzyme-MnO2纳米探针用于细胞内miRNA的成像自供能纳米探针因具有超小尺寸、环境友好、可持续供应、高效等优势而受到越来越多的关注。构建自供能的纳米探针对micro RNA（miRNA）进行灵敏的检测具有特别重要的意义。我们设计了多功能的DNAzyme-MnO2纳米探针,实现活细胞内miRNA的高灵敏成像。该纳米探针由MnO2纳米片和两个发卡DNA组成。MnO2纳米片作为运输载体和荧光淬灭剂,进入细胞后被细胞内GSH还原生成Mn2+。Mn2+可以作为后续DNA发卡催化扩增反应的辅酶因子,最终实现不同种类细胞中miRNA的超灵敏成像。该纳米探针整合了传递、荧光淬灭、目标识别、自供能和信号放大等多种功能,是一种非常有应用前景的自供能纳米传感器,可用于细胞或体内多种疾病相关分子的成像检测。2.靶标诱导、自供能DNA马达-MnO2纳米探针用于细胞内miRNA的原位放大成像DNA分子马达在近几年引起了人们的广泛关注并已应用到活细胞检测中,但是设计自供能、靶标诱导、一体化的DNA分子马达用于细胞内miRNA的检测仍面临挑战。我们设计了DNA马达-MnO2纳米探针,实现靶标诱导且自供能的miRNA放大检测。该纳米探针进入细胞后,MnO2纳米片被细胞内GSH（谷胱甘肽）还原为Mn2+,释放DNA马达。Mn2+可作为DNA马达后续催化扩增反应的辅酶因子,实现细胞内miRNA的放大成像。MnO2的还原消耗细胞内GSH,可以大大减少GSH对DNA马达破坏产生的假阳性信号。该纳米探针具有灵敏度高、背景荧光低、靶标诱导和自供能的优点,为生物分子的灵敏检测提供了新的方法。3.近红外光控的DSAP-Au NS纳米探针用于细胞内K+的原位成像尽管活细胞中重要生物分子的高灵敏和高选择性检测已经取得了很大成就,但开发智能可控的纳米传感器仍然具有很大挑战。为了解决这个问题,我们设计了近红外光控的DSAP-Au NS纳米探针用于细胞内K+的原位检测。该探针采用双链适体前驱体（DSAP）作为识别分子,SiO2基金纳米壳（Au NS）作为纳米载体,近红外光（NIR）进行远程刺激。近红外光照射时,Au NS的表面温度升高引起DSAP的去杂化,恢复适体活性。适体结合K+后发生构象改变产生FRET荧光信号,从而检测细胞内K+。利用该纳米探针,我们可以检测宫颈癌细胞（He La细胞）在药物刺激3 h内任意时间的K+的流出情况。此外,该探针为设计用于细胞研究的时间可控的纳米探针提供了新的思路。4.细胞内微环境响应型纳米探针用于细胞内Zn2+和Pb2+的同时成像金属离子型的脱氧核糖催化酶（DNAzyme）可以高选择性和高特异性识别金属离子,所以在金属离子的高灵敏检测中得到了广泛的应用。传统DNAzyme纳米探针中DNAzyme一直处于活性状态,易受细胞外金属离子的干扰,极大地限制了它们在复杂生环境中细胞内金属离子分析的应用。为了克服这一障碍,通过引入p H敏感的DNA纳米结构,我们设计了一种p H敏感的DNAzyme纳米探针。该纳米探针可以保证DNAzyme在细胞外时处于封闭的状态,但进入细胞后,在细胞内酸性细胞器中恢复其活性,实现细胞内Zn2+和Pb2+的同时成像。此外,该纳米探针在活细胞中多种生物分子或者离子的检测及成像领域有广阔的应用前景。5.基于MEA/TIRFM的类神经元PC12细胞动作电位和神经递质释放的同时监测随着脑科学的发展,神经系统信息传递引起了人们的广泛关注。神经系统信息传递的基本要素是电信号和化学信号的传递。我们基于超薄微电极阵列（MEA）与全内反射荧光显微镜（TIRFM）构建荧光和电化学耦合检测平台,实现了神经元的动作电位（AP）和神经递质释放的同时监测。神经递质的释放主要通过FFN102这种有机荧光小分子,其作为类神经递质,荧光强度随p H值发生变化,通过TIRFM可以在单囊泡水平上监测神经递质的释放情况,MEA系统用来捕获AP的变化情况,利用MEA/TIRFM平台证明了厌氧刺激下类神经元PC12细胞存在动作电位型和非动作电位型两种形式的神经递质释放,该工作为深入研究神经系统信息传递机制提供了新的平台。
白书连[10]（2020）在《基于链置换探针的肿瘤早期检测新方法研究》文中认为分子影像和体外分子诊断是最有望实现肿瘤早期微、无创检测的两大技术。与经典影像不同,分子影像例如荧光分子成像,能够探查肿瘤早期形成过程中细胞和分子水平的异常,即在尚无解剖学改变之前就能检查出异常,这对肿瘤早期检测有重要价值。然而分子影像学技术的发展还处于临床前实验阶段,大多分子探针的靶向性或特异性还有待提高。另一方面,循环肿瘤DNA（ctDNA）因含有丰富的肿瘤相关遗传信息或突变信息成为体外分子诊断研究热点之一。借助PCR技术和DNA杂交技术,一些ctDNA检测试剂已经用于临床肿瘤疾病的辅助诊断。由于ctDNA在标本中的含量非常少,并且丰度较低的肿瘤突变基因中往往伴随着大量的野生型基因,这对ctDNA检测技术的灵敏度有很高的要求。现有的ctDNA检测技术的灵敏度有限,检测相应的低丰度突变（<1%）ctDNA的肿瘤标本时会出现漏检的情况。无论是分子影像还是体外分子诊断都需要发展高特异性、高灵敏度的分子探针。本研究聚焦于分子影像和体外分子诊断领域在临床应用中共同存在的问题并以此为出发点,探究提高DNA链置换探针特异性的方法及其用于改善分子影像技术和分子诊断技术性能的可行性,具体研究内容如下:第2章报道了一种基于DNA四面体（TDN）纳米结构和金纳米颗粒（Au-NPs）的高识别因子（DF）核酸纳米传感器,检测活细胞中的miRNA-21。链置换反应是指单链DNA侵入链与双链DNA探针上的立足点相结合,进而将探针的保护链从互补链上置换下来的过程。仅依靠沃森-克里克碱基配对的特异性来识别miRNA-21及其单碱基变异类似物是不够的。因此,本章专门设计了链置换探针立足点的部分碱基,控制链置换反应之前的吉布斯自由能和链置换反应之后的吉布斯自由能变化趋于零,在这一条件下,单碱基错配引起的微小能量差异就可以引起明显的杂交效率改变。利用Au-NPs装载特殊设计的分子探针,再用TDN协同运输分子探针,构建了基于荧光共振能量转移的纳米传感器（Au-TDNNs）,用于活细胞内miRNA-21的快速检测。合理设计的TDN序列与探针序列之间互不干扰,因此可以实现传感器的简便、快速组装。该方法获得了较好的分析性能:通过测试单碱基改变的miRNA-21类似物,let-7d和miRNA-200b,特殊设计的分子探针在近端单碱基错配的DF为15.4。作为对照组,普通分子探针的DF仅达到2.4。使用肝癌细胞（HepG2）进一步证实了该传感策略的可行性。AuNPs和TDN的协同运输使细胞内最佳成像时间提前至1个半小时。因此,该研究为细胞内小分子快速、特异性原位成像提供了一种有效的方法。现有的一些检测方法灵敏度较低会造成对低丰度突变样本的漏检,这是肿瘤基因突变检测面临的最大问题之一。因此,建立高特异性、高灵敏度的突变基因检测方法十分重要。第3章使用Bulge-loop（BL）结构调节DNA链置换探针的特异性,获得了用于肿瘤相关突变基因检测的高特异性探针。在上一章中,通过调整链置换探针立足点部分的碱基组成从而最大限度地使链置换反应前后的能量产生和消耗趋于平衡,提高了链置换探针的特异性。但由于立足点碱基序列的变化程度有限,调节链置换探针反应的热力学平衡来提高探针特异性仍然是一个挑战。在本章中,通过将BL结构引入链置换探针来调节对SNV的识别能力。基于BL对反应自由能变化（ΔG）的可控调节,BL探针（BLP）获得比常规线性链置换探针高得多的特异性。为了降低野生型基因对点突变检测造成的影响,实验同步设计了竞争性阴影探针来封闭野生型基因。动力学检测结果证实,探针对L858R突变的检测限可以达到0.02%。通过BL结构的引入,本研究获得了更高特异性的链置换探针。第4章基于BLP建立核酸传感器,用于检测肿瘤样本中的低丰度点突变。许多分子检测方法在检测人工合成的DNA样本时性能良好,但在检测肿瘤临床样本时却无法直接使用。因为临床样本中突变基因的含量非常少,同时野生型基因会对检测结果造成干扰。另一方面,人工合成DNA片段为单链DNA,而在临床样本中多为双链DNA,没有杂交活性。因此,本章将重点解决点突变基因的扩增和单链靶基因的获取问题。PCR是分子诊断的最重要的扩增技术,不对称PCR可以直接扩增模板DNA并获得单链产物。然而,用5’磷酸基团修饰引物,再用λ核酸外切酶水解PCR产物同样可以获得单链靶标。为了找到更有效的扩增方法,联合BLP对比了这两种PCR技术的效果,发现λ核酸外切酶水解PCR产物的方法更有利于低丰度点突变的检测,这里简称酶切法。为了研究BLP检测血清中ctDNA的能力,使用标准添加法在10%的血清中配制一系列不同丰度的L858R突变样本。利用BLP联合酶切法检测血清样本,获得了0.1%的检测限。更重要的是BLP正确识别了商业PCR试剂盒或sanger测序无法检测到的低丰度L858R突变肺癌样本。该检测结果与液滴数字PCR检测结果对比具有高度的一致性。本研究为建立高灵敏分子诊断技术提供了新的方法。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 荧光简介 |
| 1.2 荧光显微镜 |
| 1.2.1 荧光显微镜的结构 |
| 1.2.2 激光扫描共聚焦显微镜 |
| 1.3 荧光探针识别机理 |
| 1.3.1 分子内电荷转移（Intramolecular Charge Transfer，ICT) |
| 1.3.2 光诱导电子转移（Photoinduced Electron Transfer，PET) |
| 1.3.3 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET) |
| 1.3.4 激发态分子内质子转移（Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT) |
| 1.3.5 激基缔合物/复合物（excimer/exciplex) |
| 1.3.6 聚集诱导发光（Aggregation Induced Emission, AIE) |
| 1.4 侧链调控对荧光探针的影响 |
| 1.4.1 侧链对荧光探针透膜性的影响 |
| 1.4.2 侧链可作为第二靶向基团 |
| 1.5 细胞膜电位探针 |
| 1.5.1 细胞膜电位 |
| 1.5.2 细胞膜电位探针的研究现状 |
| 1.6 线粒体追踪探针 |
| 1.6.1 线粒体 |
| 1.6.2 线粒体追踪探针的研究现状 |
| 1.7 细胞活性探针 |
| 1.7.1 细胞活性 |
| 1.7.2 细胞活性荧光探针的研究现状 |
| 1.8 脂滴探针 |
| 1.8.1 脂滴 |
| 1.8.2 脂滴探针的研究现状 |
| 1.9 本论文的主要内容与创新 |
| 参考文献 |
| 第二章 荧光探针的合成与表征 |
| 2.1 细胞膜电位状态监测荧光探针 |
| 2.2 线粒体长程追踪荧光探针 |
| 2.3 细胞活性监测荧光探针 |
| 2.4 脂滴探针 |
| 第三章 基于侧链调控策略的细胞膜电位状态监测荧光探针 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 探针设计 |
| 3.3 实验装置与方法 |
| 3.3.1 紫外吸收光谱与荧光发射光谱 |
| 3.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 3.3.3 细胞培养及染色 |
| 3.3.4 细胞毒性实验 |
| 3.3.5 荧光成像 |
| 3.4 探针的光物理性质 |
| 3.5 探针染色不同膜电位状态下的细胞 |
| 3.5.1 SiHa细胞的染色实验 |
| 3.5.2 Hela细胞与Fibroblast细胞的染色实验 |
| 3.5.3 其它染料染色不同膜电位状态下的细胞 |
| 3.6 与S-11348的复染实验 |
| 3.7 胞吞对探针染色跨膜运输的影响 |
| 3.8 对照分子CPS的染色实验 |
| 3.9 消除线粒体膜电位后的染色实验 |
| 3.10 与线粒体探针的复染实验 |
| 3.11 细胞膜电位恢复实验 |
| 3.12 探针染色条件的研究 |
| 3.13 光稳定性实验 |
| 3.14 细胞毒性实验 |
| 3.15 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于侧链修饰策略的线粒体长程追踪荧光探针 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 探针设计 |
| 4.3 实验装置与方法 |
| 4.3.1 紫外吸收光谱与荧光发射光谱 |
| 4.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 4.3.3 细胞培养及染色 |
| 4.3.4 细胞毒性实验 |
| 4.3.5 荧光成像 |
| 4.4 探针的光物理性质 |
| 4.5 探针SP-3的细胞染色实验 |
| 4.6 探针SP-NBD的细胞染色实验 |
| 4.7 探针SP-3染色消除线粒体膜电位的SiHa细胞 |
| 4.8 探针SP-NBD染色消除线粒体膜电位的SiHa细胞 |
| 4.9 探针SP-NBD动态监测线粒体自噬 |
| 4.10 光稳定性实验 |
| 4.11 细胞毒性实验 |
| 4.12 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于侧链调控策略的细胞活性监测荧光探针 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 探针设计 |
| 5.3 实验装置与方法 |
| 5.3.1 紫外吸收光谱与荧光发射光谱 |
| 5.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 5.3.3 细胞培养及染色 |
| 5.3.4 细胞毒性实验 |
| 5.3.5 荧光成像 |
| 5.4 探针的光物理性质 |
| 5.5 活细胞染色实验 |
| 5.6 固定细胞染色实验 |
| 5.7 探针ECPS同时染色活SiHa细胞与固定SiHa细胞 |
| 5.8 探针ECPS选择性染色活SiHa细胞群落中的死细胞 |
| 5.9 探针ECPS在活细胞与固定细胞上的跨膜运输 |
| 5.10 探针ECPS染色H_2O_2诱导的凋亡细胞 |
| 5.11 侧链调控策略的普适性 |
| 5.12 探针SQ同时染色活SiHa细胞与固定SiHa细胞 |
| 5.13 探针SQ在活细胞群落中选择性染色死细胞 |
| 5.14 探针SQ染色H_2O_2诱导的凋亡细胞 |
| 5.15 原位光谱 |
| 5.16 光稳定性实验 |
| 5.17 细胞毒性实验 |
| 5.18 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 通过官能团的简单修饰得到脂滴探针的初步探索 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 探针设计 |
| 6.3 实验装置与方法 |
| 6.3.1 紫外吸收谱与荧光发射谱 |
| 6.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 6.3.3 细胞培养及染色 |
| 6.3.4 细胞毒性实验 |
| 6.3.5 荧光成像 |
| 6.4 探针的光物理性质 |
| 6.5 探针的活细胞染色实验 |
| 6.6 探针的固定细胞染色实验 |
| 6.7 探针BPANA与尼罗红的复染实验 |
| 6.8 探针BPANA染色油酸处理的SiHa细胞 |
| 6.9 探针BPANA染色二甲苯处理的SiHa细胞 |
| 6.10 探针BPANA的适用性研究 |
| 6.11 原位光谱测试 |
| 6.12 光稳定性实验 |
| 6.13 细胞毒性实验 |
| 6.14 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 论文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 有待开展的工作 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文、专利、获奖情况 |
| 附录 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 肺癌概述 |
| 1.1.1 肺癌流行病学 |
| 1.1.2 癌症相关细胞膜蛋白 |
| 1.1.2.1 肿瘤相关钙信号转导蛋白2(Trop2) |
| 1.1.2.1.1 Trop2的发现 |
| 1.1.2.1.2 Trop2的属性和功能 |
| 1.1.2.1.3 Trop2在癌症中的作用 |
| 1.1.2.1.4 Trop2在干细胞生物学和其他疾病中的作用 |
| 1.1.2.1.5 以Trop2为靶点的临床前治疗进展 |
| 1.1.3 肺癌的靶向治疗 |
| 1.2 超分辨显微成像技术概述 |
| 1.2.1 超分辨成像技术发展与原理 |
| 1.2.2 基于单分子定位的超分辨显微镜——dSTORM |
| 1.2.3 基于超分辨成像技术的荧光探针 |
| 1.2.3.1 荧光染料 |
| 1.2.3.2 荧光蛋白 |
| 1.2.3.3 荧光探针的选择 |
| 1.3 超分辨成像技术的相关研究示例 |
| 1.4 超分辨成像技术的未来展望 |
| 1.5 本论文的研究目的和主要内容 |
| 第2章 dSTORM研究Trop2在NSCLC细胞膜上的分布 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要常规实验仪器及耗材 |
| 2.2.2 超分辨成像系统的搭建 |
| 2.2.3 主要成品实验试剂 |
| 2.2.4 主要实验试剂配制及贮存 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞系培养 |
| 2.3.2 玻片清洗 |
| 2.3.3 新鲜人类原代肺癌组织和癌旁组织细胞的提取 |
| 2.3.4 dSTORM细胞样品的制备 |
| 2.3.5 dSTORM荧光图像的采集 |
| 2.4 实验数据处理 |
| 2.4.1 超分辨数据的图像构建与定位点密度计算 |
| 2.4.2 超分辨图像的分辨率评估——NanoJ-SQUIRREL |
| 2.4.3 基于定位点的超分辨显微数据分割和量化方法——SR-Tesseler |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 dSTORM采集原始图像帧数的确定 |
| 2.5.2 确定dSTORM实验中Trop2 的最佳标记浓度 |
| 2.5.3 Trop2分布假象的避免 |
| 2.5.4 dSTORM超分辨图像的分辨率测定 |
| 2.5.5 Trop2在不同NSCLC细胞膜表面的超分辨成像 |
| 2.5.6 Trop2在不同细胞系表面分布的量化分析 |
| 2.5.7 Trop2在人类原代肺癌细胞上的分布特征 |
| 第3章 应用dSTORM研究Trop2在细胞膜上的分布机制 |
| 3.1 细胞极性对Trop2 分布特征的影响及差异 |
| 3.1.1 概述 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 实验结果及讨论 |
| 3.2 脂筏结构对Trop2蛋白分布的影响 |
| 3.2.1 概述 |
| 3.2.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 实验结果及讨论 |
| 3.2.4.1 Trop2蛋白与脂筏结构的共定位 |
| 3.2.4.2 脂筏结构竭耗影响Trop2蛋白簇的形成 |
| 3.3 肌动蛋白骨架对Trop2分布特征的影响及差异 |
| 3.3.1 概述 |
| 3.3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.3.3 实验方法 |
| 3.3.4 实验结果及讨论 |
| 3.4 IGF-1 刺激对不同细胞膜上Trop2蛋白分布的影响 |
| 3.4.1 概述 |
| 3.4.2 实验仪器与试剂 |
| 3.4.3 实验方法 |
| 3.4.4 实验结果及讨论 |
| 第4章 破坏Trop2在细胞膜成簇对信号蛋白及细胞表型的影响 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 实验仪器与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Western Blot实验流程 |
| 4.3.2 Transwell实验流程 |
| 4.3.3 细胞划痕实验流程 |
| 4.4 实验结果及讨论 |
| 第5章 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得学术成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题研究的背景意义 |
| 1.2 显微镜的发展概况 |
| 1.3 论文组织结构 |
| 第二章 显微镜的基础理论 |
| 2.1 光与生物组织的相互作用 |
| 2.2 激光共聚焦显微镜基本原理 |
| 2.3 国外竞品皮肤反射式共聚焦显微镜概况 |
| 2.4 皮肤组织疾病检测相关技术原理比较 |
| 2.4.1 皮肤镜成像 |
| 2.4.2 超声成像 |
| 2.4.3 光学相干断层成像OCT |
| 2.4.4 双光子成像与二次谐波 |
| 2.4.5 光声成像 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 皮肤共聚焦显微镜光学成像技术 |
| 3.1 共聚焦光路总体设计 |
| 3.1.1 基于共振振镜结构的光路设计 |
| 3.1.2 基于多面镜Polygon的光路设计 |
| 3.2 远心成像光路与照明光路设计 |
| 3.3 参数计算与光学设计仿真 |
| 3.4 变尺度评价方法 |
| 3.4.1 基本推导 |
| 3.4.2 数值仿真 |
| 3.4.3 试验验证 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 共聚焦显微镜的声热传导特性研究 |
| 4.1 结构组成与关键件力学特性分析 |
| 4.2 热特性分析 |
| 4.3 噪声分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 共聚焦显微镜扫描成像控制方法研究 |
| 5.1 组合振镜控制方法 |
| 5.2 数据信号采集模块 |
| 5.3 图像算法处理 |
| 5.3.1 图像畸变校正算法 |
| 5.3.2 图像重建与拼接算法 |
| 5.4 多面体转镜Polygon控制方法 |
| 5.5 成像试验 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 受激拉曼散射显微镜系统搭建研究 |
| 6.1 SRS原理 |
| 6.1.1 成像机制 |
| 6.1.2 高光谱与多色成像 |
| 6.1.3 灵敏度与可探测性 |
| 6.1.4 穿透能力 |
| 6.1.5 SRS在生物学领域的应用 |
| 6.2 生物光子显微镜系统平台设计与搭建 |
| 6.2.1 锁相放大器的基本原理 |
| 6.3 活细胞成像装置设计 |
| 6.4 活细胞成像试验 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 图表目录 |
| 致谢 |
| 作者简介及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 端粒和端粒酶概述 |
| 1.1.1 端粒和端粒酶的发现 |
| 1.1.2 端粒和端粒酶的组成结构 |
| 1.1.3 端粒和端粒酶的功能 |
| 1.1.4 端粒和端粒酶的研究应用 |
| 1.1.5 端粒酶的测定 |
| 1.2 基于生物传感器的检测方法 |
| 1.2.1 生物传感器的检测原理 |
| 1.2.2 电化学生物传感器检测 |
| 1.2.3 荧光生物传感器检测 |
| 1.2.4 其他生物传感器检测 |
| 1.3 核酸纳米结构在检测中的应用 |
| 1.3.1 核酸纳米结构的可控组装 |
| 1.3.2 核酸纳米结构在体外生物传感中的应用 |
| 1.3.3 核酸纳米结构在细胞内成像中的应用 |
| 1.4 本课题的研究意义 |
| 第2章 基于金纳米粒子的端粒酶直接电化学生物传感 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和化学品 |
| 2.2.2 细胞培养和端粒酶提取 |
| 2.2.3 凝胶电泳 |
| 2.2.4 AuNPs的制备和表征 |
| 2.2.5 工作电极预处理和实验条件优化 |
| 2.2.6 端粒酶延伸和AuNPs捕获 |
| 2.2.7 电化学测量 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 端粒酶活性测定的原理 |
| 2.3.2 AuNPs图像和实验优化 |
| 2.3.3 使用凝胶电泳检测端粒酶活性 |
| 2.3.4 生物传感器构建的表征 |
| 2.3.5 端粒酶活性的量化 |
| 2.3.6 传感器的评估 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于比率型电化学传感策略的端粒酶活性超灵敏检测 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料和试剂 |
| 3.2.2 二硫键的还原反应 |
| 3.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 3.2.4 端粒酶活性检测过程 |
| 3.2.5 电化学测量 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 端粒酶检测的原理 |
| 3.3.2 电极修饰过程的表征 |
| 3.3.3 比率传感器的表征 |
| 3.3.4 端粒酶活性的检测 |
| 3.3.5 端粒酶抑制剂的分析 |
| 3.3.6 不同细胞系端粒酶活性分析 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 基于荧光共振能量转移和DNA纳米探针的比率型传感器用于端粒酶活性分析 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和化学品 |
| 4.2.2 DNA四面体的制备 |
| 4.2.3 细胞培养及端粒酶的提取 |
| 4.2.4 凝胶电泳实验 |
| 4.2.5 DNA探针的毒性检测 |
| 4.2.6 端粒酶活性的体外定量 |
| 4.2.7 原位成像 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 传感原理 |
| 4.3.2 检测体系的适用性 |
| 4.3.3 检测体系的荧光定性分析 |
| 4.3.4 DNA纳米探针的毒性分析 |
| 4.3.5 荧光信号的浓度优化 |
| 4.3.6 端粒酶活性的体外分析 |
| 4.3.7 特异性调查 |
| 4.3.8 细胞内成像 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 基于miRNA触发的DNA酶步行器用于端粒酶活性的逻辑门传感检测 |
| 5.1 背景介绍 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和材料 |
| 5.2.2 AuNPs和MnO_2的合成 |
| 5.2.3 AuNPs探针和DNA酶的预处理 |
| 5.2.4 细胞培养和端粒酶提取 |
| 5.2.5 端粒酶和miRNA的体外检测和分析 |
| 5.2.6 检测体系的特异性和毒性测定 |
| 5.2.7 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 实验原理 |
| 5.3.2 检测体系的荧光表征 |
| 5.3.3 反应条件的优化 |
| 5.3.4 端粒酶和miRNA体外传感检测 |
| 5.3.5 检测体系的评估 |
| 5.3.6 细胞毒性实验 |
| 5.3.7 目标物的共聚焦成像 |
| 5.4 总结 |
| 第6章 基于核酸四面体和荧光探针介导的端粒酶与MiR-21的检测和细胞内成像 |
| 6.1 背景介绍 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 化学试剂和仪器 |
| 6.2.2 TDNs-Flare探针的制造 |
| 6.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 6.2.4 端粒酶和miR-21的体外评估 |
| 6.2.5 TDNs-Flare探针的细胞特异性和毒性测定 |
| 6.2.6 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 TDNs-Flare探针检测端粒酶和miR-21的原理 |
| 6.3.2 TDNs-Flare探针的结构和光学表征 |
| 6.3.3 端粒酶和miR-21的体外检测 |
| 6.3.4 检测方法的稳定性和细胞毒性 |
| 6.3.5 TDNs-Flare探针用于原位成像 |
| 6.4 结论 |
| 第7章 论文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与其他研究成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 超分辨荧光成像技术 |
| 1.1.1 普通光学显微镜的分辨极限 |
| 1.1.2 常见超分辨成像技术的类型 |
| 1.1.3 超分辨显微镜的应用及发展 |
| 1.2 常规超分辨成像的荧光探针 |
| 1.2.1 荧光蛋白 |
| 1.2.2 荧光染料 |
| 1.3 新型小分子荧光标记探针 |
| 1.3.1 基因表达探针 |
| 1.3.2 非基因表达探针 |
| 1.3.3 有机合成探针 |
| 1.4 小分子荧光标记在超分辨成像中的应用 |
| 1.4.1 生物正交反应 |
| 1.4.2 活细胞超分辨成像 |
| 1.4.3 单分子示踪 |
| 1.5 本论文研究目的和意义 |
| 第2章 适配体标记用于细胞膜糖分子GalNAc的超分辨成像 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 玻片清洗 |
| 2.2.3 凝集素连接荧光染料 |
| 2.2.4 适配体染色 |
| 2.2.5 超分辨样品的制备 |
| 2.2.6 超分辨成像 |
| 2.2.7 定位精度的测量 |
| 2.2.8 SR-Tesseler簇分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 适配体标记用于GalNAc的超分辨成像 |
| 2.3.2 适配体探针与凝集素探针的定位精度 |
| 2.3.3 SR-Tesseler方法分析GalNAc在细胞膜上形成的簇 |
| 2.3.4 适配体探针的特异性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 适配体标记用于研究癌症相关分子globo H的分布特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 凝集素与染料的连接 |
| 3.2.3 适配体标记 |
| 3.2.4 超分辨样品的制备 |
| 3.2.5 超分辨成像 |
| 3.2.6 Hopkins统计的随机性检验 |
| 3.2.7 基于坐标的共定位分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 适配体标记的globo H在MCF-7细胞膜上的超分辨成像 |
| 3.3.2 定量分析globo H形成的簇 |
| 3.3.3 Globo H在癌细胞和非癌细胞上的分布 |
| 3.3.4 Globo H与其他癌症相关糖分子的分布关系 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 小分子肽标记用于研究细胞膜EpCAM蛋白的组装机理 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 质粒构建与转染 |
| 4.2.3 siRNA敲除CD9 |
| 4.2.4 抗体和小分子肽标记 |
| 4.2.5 超分辨样品的制备 |
| 4.2.6 超分辨成像 |
| 4.2.7 图像重构 |
| 4.2.8 FRC分辨率测量 |
| 4.2.9 SR-Tesseler簇分析 |
| 4.2.10 簇到簇距离的测量 |
| 4.2.11 对相关函数分析 |
| 4.2.12 CBC共定位分析 |
| 4.2.13 互相关函数共定位分析 |
| 4.2.14 基于镶嵌的共定位分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 小分子肽标记用于EpCAM超分辨成像 |
| 4.3.2 定量分析EpCAM蛋白簇 |
| 4.3.3 EpCAM蛋白簇部分共定位于四跨膜蛋白CD9微区 |
| 4.3.4 肌动蛋白骨架与糖基化影响EpCAM蛋白的聚集 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 适配体AS1411用于核仁素的超分辨成像 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 抗体与染料的连接 |
| 5.2.3 适配体标记 |
| 5.2.4 抗体标记 |
| 5.2.5 超分辨样品的制备 |
| 5.2.6 超分辨成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 适配体AS1411用于超分辨成像 |
| 5.3.2 不同细胞组分NCL分布的差异 |
| 5.3.3 癌细胞和正常细胞NCL分布的比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 抑制剂探针用于研究PSMA在细胞膜上的分布模式 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 染料与抗体连接 |
| 6.2.3 样品制备 |
| 6.2.4 超分辨成像 |
| 6.2.5 图像重构 |
| 6.2.6 共定位分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 抑制剂探针用于PSMA的超分辨成像 |
| 6.3.2 抑制剂探针与抗体探针标记的比较 |
| 6.3.3 定量分析PSMA簇 |
| 6.3.4 PSMA簇与叶酸受体(FR)共定位关系 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 论文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 纳米贵金属活细胞成像 |
| 1.1.1 纳米贵金属探针 |
| 1.1.2 暗场成像技术与应用 |
| 1.1.3 暗场成像数据分析 |
| 1.2 纳米材料与诊疗 |
| 1.2.1 纳米载体 |
| 1.2.2 治疗策略 |
| 1.3 纳米材料与细胞相互作用 |
| 1.3.1 细胞摄取 |
| 1.3.2 胞内命运 |
| 1.3.3 细胞外排 |
| 1.4 总结与课题提出 |
| 第2章 包膜纳米金的细胞摄取和聚集 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 步骤 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 AuNP@CCMs的构建表征 |
| 2.3.2 AuNP@CCMs的成像定量 |
| 2.3.3 AuNP包不同膜的细胞摄取 |
| 2.3.4 AuNP@CCMs的摄取途径 |
| 2.3.5 IntegrinαVβ3对AuNP@CCMs的摄取的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 纳米银的胞内聚集与细胞毒性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验 |
| 3.2.1 材料与仪器 |
| 3.2.2 步骤 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 纳米金和纳米银光学性质比较 |
| 3.3.2 胞内plas-SNA信号与噪声的特征差异 |
| 3.3.3 刻蚀处理去除胞外plas-SNA |
| 3.3.4 plas-SNA胞内运动示踪 |
| 3.3.5 plas-SNA胞内聚集和分布 |
| 3.3.6 plas-SNA胞内聚集与毒性 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 纳米金在细胞迁移过程中的外排 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验 |
| 4.2.1 材料与仪器 |
| 4.2.2 步骤 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AuNP@CMVs探针的制备表征 |
| 4.3.2 细胞迁移收缩丝内AuNP的分布 |
| 4.3.3 细胞迁移时AuNP在收缩丝中的运动示踪 |
| 4.3.4 细胞迁移后AuNP的胞外残留 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 荧光探针的介绍 |
| 1.2.1 荧光探针的组成 |
| 1.2.2 荧光探针的响应机理 |
| 1.3 荧光探针在生物活性物种中的检测 |
| 1.3.1 偶氮还原酶的检测 |
| 1.3.2 缺氧的检测 |
| 1.3.3 过氧亚硝酰基的检测 |
| 1.3.4 一氧化碳的检测 |
| 1.3.5 还原型辅酶的检测 |
| 1.4 本论文的研究工作 |
| 第2章 一个检测偶氮还原酶近红外荧光探针在急性和慢性溃疡性结肠炎小鼠中的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 药品与仪器 |
| 2.2.2 探针Cy-Azo的合成 |
| 2.2.3 荧光探针的光谱测定方法 |
| 2.2.4 细胞培养和共聚焦荧光成像 |
| 2.2.5 细菌培养和共聚焦荧光成像 |
| 2.2.6 活体成像 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 探针Cy-Azo光谱性能的研究 |
| 2.3.2 选择性的研究 |
| 2.3.3 pH的研究 |
| 2.3.4 反应温度的研究 |
| 2.3.5 响应时间的研究 |
| 2.3.6 酶动力学的研究 |
| 2.3.7 抑制剂的研究 |
| 2.3.8 响应机理的研究 |
| 2.3.9 活细胞成像的研究 |
| 2.3.10 细菌成像的研究 |
| 2.3.11 急性和慢性结肠炎小鼠成像的研究 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 一个缺氧敏感型近红外荧光探针用于生物体内“肠-肝轴”的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 药品与仪器 |
| 3.2.2 探针Cy-AP的合成 |
| 3.2.3 荧光探针的光谱测定 |
| 3.2.4 细胞共聚焦荧光成像 |
| 3.2.5 活体成像 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 探针Cy-AP光谱性能的研究 |
| 3.3.2 选择性的研究 |
| 3.3.3 pH的研究 |
| 3.3.4 响应时间的研究 |
| 3.3.5 响应机理的研究 |
| 3.3.6 活细胞成像的研究 |
| 3.3.7 肝纤维化小鼠和溃疡性结肠炎小鼠缺氧的荧光成像研究 |
| 3.3.8 “肠-肝轴”的荧光成像研究 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 新型的近红外荧光平台的构建以及在生物研究中的应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 药品和仪器 |
| 4.2.2 新型染料DDM-R的合成 |
| 4.2.3 荧光探针DDM-ONOO-和DDM-CO的光谱测定 |
| 4.2.4 细胞共聚焦荧光成像 |
| 4.2.5 流式细胞术分析 |
| 4.2.6 活体成像 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DDM-R染料的合成及光学性能的研究 |
| 4.3.2 探针DDM-ONOO-的光谱研究 |
| 4.3.3 选择性的研究 |
| 4.3.4 响应时间的研究 |
| 4.3.5 pH的研究 |
| 4.3.6 响应机理的研究 |
| 4.3.7 探针DDM-CO的光谱研究 |
| 4.3.8 DDM-CO的选择性研究 |
| 4.3.9 DDM-CO的时间响应研究 |
| 4.3.10 DDM-CO的 pH响应研究 |
| 4.3.11 DDM-CO对 CO的响应机理研究 |
| 4.3.12 细胞荧光成像研究 |
| 4.3.13 中毒性肝炎小鼠中ONOO-的荧光成像研究 |
| 4.3.14 活体中CO的荧光成像研究 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 一个基于双键重排机理设计的近红外荧光探针对细胞中的NAD(P)H成像研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 药品和仪器 |
| 5.2.2 荧光探针Cy-N的合成 |
| 5.2.3 荧光探针Cy-N的光谱测定 |
| 5.2.4 细胞共聚焦荧光成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 新型响应机理的提出 |
| 5.3.2 探针Cy-N的光谱研究 |
| 5.3.3 选择性的研究 |
| 5.3.4 响应时间的研究 |
| 5.3.5 pH的研究 |
| 5.3.6 响应机理的研究 |
| 5.3.7 细胞荧光成像研究 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 实验药品 |
| 附录B 实验仪器 |
| 附录C 部分化合物谱图 |
| 个人简历、硕士期间研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 荧光显微成像及其分辨率极限 |
| 1.3 远场超分辨荧光显微成像技术 |
| 1.4 STORM重构算法的研究进展 |
| 1.5 本论文的研究内容 |
| 第二章 STORM原理及其重构算法 |
| 2.1 STORM成像原理 |
| 2.2 STORM成像系统 |
| 2.3 STORM重构算法 |
| 2.3.1 单分子定位算法 |
| 2.3.2 多分子定位算法 |
| 2.3.2.1 ThunderSTORM算法 |
| 2.3.2.2 DAOSTORM算法 |
| 2.3.2.3 压缩感知算法 |
| 2.3.2.4 快速无偏移算法 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 虚拟单像素成像算法原理及验证 |
| 3.1 高密度图像预处理算法 |
| 3.1.1 K因子算法 |
| 3.1.2 相位拉伸变换算法 |
| 3.1.3 虚拟单像素成像(VSPI)算法 |
| 3.1.3.1 积分值等量关系 |
| 3.1.3.2 VSPI算法原理 |
| 3.1.3.3 求解算法 |
| 3.2 VSPI算法与K因子算法的比较 |
| 3.2.1 仿真数据的处理 |
| 3.2.1.1 数据制备 |
| 3.2.1.2 结果分析与讨论 |
| 3.2.2 荧光珠实验数据的处理 |
| 3.2.2.1 数据制备 |
| 3.2.2.2 结果分析与讨论 |
| 3.3 VSPI预处理与STORM重构的结合 |
| 3.3.1 仿真图像数据的处理 |
| 3.3.1.1 数据来源 |
| 3.3.1.2 结果分析与讨论 |
| 3.3.2 固定细胞实验数据的处理 |
| 3.3.2.1 数据来源 |
| 3.3.2.2 结果分析与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 VSPI算法的STORM活细胞应用 |
| 4.1 活细胞实验数据采集 |
| 4.1.1 新荧光探针性能分析 |
| 4.1.1.1 光物理性质分析 |
| 4.1.1.2 光致闪烁测试 |
| 4.1.1.3 共定位实验 |
| 4.1.2 活细胞STORM成像及分析 |
| 4.1.2.1 样品制备及数据采集 |
| 4.1.2.2 实验数据分析 |
| 4.2 VSPI算法的活细胞应用 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 指导教师对研究生学位论文的学术评语 |
| 答辩委员会决议书 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间获得的研究成果 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文主要创新点 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 功能核酸分子结构及其生物传感应用 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 催化型功能核酸 |
| 1.2.3 适体核酶 |
| 1.3 核酸功能化纳米探针 |
| 1.3.1 纳米载体 |
| 1.3.2 放大型核酸纳米探针 |
| 1.3.2.1 基于非共价DNA催化反应的原位信号放大策略 |
| 1.3.2.2 基于DNAzyme调控的原位信号放大策略 |
| 1.3.2.3 基于DNA马达的原位信号放大策略 |
| 1.4 刺激-响应型纳米探针的构建及应用 |
| 1.4.1 内源性刺激-响应型纳米探针 |
| 1.4.2 外源性刺激-响应型纳米探针 |
| 1.5 本论文的出发点和主要研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 靶标诱导的自供能纳米探针用于细胞内miRNA的成像 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 MnO_2 纳米片的制备 |
| 2.2.4 DNAzyme-MnO_2 纳米探针的制备 |
| 2.2.5 溶液中miR-21 的检测 |
| 2.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 细胞活力测定 |
| 2.2.9 活细胞中miR-21 的成像 |
| 2.2.10 RT-PCR定量细胞中miR-21 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 纳米探针的制备与表征 |
| 2.3.2 纳米探针用于miR-21 检测的可行性 |
| 2.3.3 实验条件优化及miR-21 的灵敏检测 |
| 2.3.4 纳米探针的细胞毒性 |
| 2.3.5 MCF-7 细胞内miR-21 的成像分析 |
| 2.3.6 不同细胞内miR-21 的成像分析 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 靶标诱导、自供能DNA马达-MnO_2 纳米探针用于细胞内miRNA的原位放大成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 纳米探针的制备 |
| 3.2.4 纳米探针的稳定性实验 |
| 3.2.5 溶液中miR-21 的检测 |
| 3.2.6 细胞培养 |
| 3.2.7 活细胞中miR-21 的成像 |
| 3.2.8 细胞活力测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 纳米探针的制备与表征 |
| 3.3.2 实验条件优化 |
| 3.3.3 纳米探针稳定性 |
| 3.3.4 miR-21 的灵敏检测 |
| 3.3.5 纳米探针的细胞毒性 |
| 3.3.6 MCF-7 细胞内miR-21 的成像分析 |
| 3.3.7 不同细胞内miR-21 的成像分析 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 近红外光控的DSAP-AuNS纳米探针用于细胞内K~+的原位成像 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 胺基化二氧化硅纳米粒子(SiO_2-NH_2)的制备 |
| 4.2.4 金种子修饰的SiO_2-NH_2 纳米粒子的制备 |
| 4.2.5 金纳米壳(Au NS)的制备 |
| 4.2.6 DSAP-Au NS的制备 |
| 4.2.7 单个Au NS上 DNA量的测量 |
| 4.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.2.9 溶液中K~+的检测 |
| 4.2.10 细胞培养和细胞活力测定 |
| 4.2.11 活细胞中K~+的成像 |
| 4.2.12 近红外激光设置和温度测量 |
| 4.2.13 PBFI-AM方法测量细胞内K~+含量 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 纳米探针的制备和表征 |
| 4.3.2 Au NS的光热性质 |
| 4.3.3 K~+检测的可行性 |
| 4.3.4 K~+的灵敏检测 |
| 4.3.5 纳米探针的细胞摄取能力 |
| 4.3.6 纳米探针的细胞毒性 |
| 4.3.7 HeLa细胞中K~+的成像分析 |
| 4.3.8 HeLa细胞中K~+外流监测 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 细胞内微环境响应型纳米探针用于细胞内Zn2+和Pb2+的同时成像 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验内容 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 纳米探针的制备 |
| 5.2.4 pH-DS的pH响应特性验证 |
| 5.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 5.2.6 细胞培养 |
| 5.2.7 共定位实验 |
| 5.2.8 细胞活力测定 |
| 5.2.9 活细胞中的Zn~(2+)和 Pb~(2+)成像分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 pH-DS的 pH响应特性 |
| 5.3.2 纳米探针的表征 |
| 5.3.3 纳米探针用于Zn~(2+)和 Pb~(2+)检测的可行性 |
| 5.3.4 纳米探针的胞吞过程 |
| 5.3.5 纳米探针的细胞毒性 |
| 5.3.6 活细胞内Zn~(2+)成像 |
| 5.3.7 不同细胞内Zn~(2+)成像 |
| 5.3.8 活细胞中Zn~(2+)和 Pb~(2+)同时成像 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 基于MEA/TIRFM的类神经元PC12 细胞动作电位和神经递质释放的同时监测 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 MEA预处理 |
| 6.2.4 细胞培养 |
| 6.2.5 PC12 细胞内神经递质成像 |
| 6.2.6 AP变化和神经递质释放的监测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 MEA上神经元的培养及自发AP的获取 |
| 6.3.2 厌氧刺激下PC12 细胞AP的变化 |
| 6.3.3 FFN102 的表征及在PC12 细胞中的分布 |
| 6.3.4 厌氧刺激下PC12 细胞神经递质的释放 |
| 6.3.5 厌氧刺激下AP和神经递质释放的同时监测 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 结论与展望 |
| 附录:英文缩写符号 |
| 攻读博士学位期间已发表及待发表的论文 |
| 致谢 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 绪论 |
| 1 肿瘤细胞内分子成像 |
| 1.1 分子成像简介 |
| 1.2 金纳米颗粒与分子成像 |
| 1.3 DNA折纸与分子成像 |
| 2 肺癌分子诊断 |
| 2.1 肺癌早期诊断 |
| 2.2 液体活检 |
| 2.3 ctDNA检测技术 |
| 3 高特异性分子检测技术 |
| 3.1 酶依赖的特异性分子检测 |
| 3.2 肽核酸和锁核酸依赖的特异性分子检测 |
| 3.3 温度依赖的特异性分子检测 |
| 3.4 链置换探针依赖的特异性分子检测 |
| 4 本论文的研究构想和研究内容 |
| 第二章 基于DNA四面体和金纳米颗粒搭载的高特异性荧光探针建立活细胞内miRNA-21分析新方法 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 Au-TDNN的检测原理 |
| 3.2 设计双链检测探针 |
| 3.3 探针的特异性评估 |
| 3.4 Au-TDNNs的结构表征 |
| 3.5 Au-TDNNs检测miRNA-21 的可行性分析 |
| 3.6 纳米传感器的分析性能评估 |
| 3.7 MCF-7 细胞总RNA提取液中miRNA-21 的检测 |
| 3.8 硫代磷酸酯修饰的Au-TDNNs的抗酶切能力 |
| 3.9 Au-TDNNs的细胞摄取和活细胞miRNA-21 传感 |
| 4 小结 |
| 第三章 Bulge-loop DNA探针的构建及其对EGFR基因三种点突变合成样本的检测性能评估 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 BL结构的长度对探针特异性的影响 |
| 3.2 靶标杂交长度对探针特异性的影响 |
| 3.3 BL结构的位置对探针特异性的影响 |
| 3.4 使用BLP检测L858R突变 |
| G和T790M突变'>3.5 使用BLP检测1676A>G和T790M突变 |
| 4 小结 |
| 第四章 建立基于Bulge-loop DNA探针的L858R突变临床样本检测新方法及其应用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 基于asyPCR联合BLP检测L858R的可行性 |
| 3.2 asyPCR联合BLP检测低丰度L858R突变 |
| 3.3 酶消化PCR产物获得单链靶标的可行性 |
| 3.4 PCR实验条件优化 |
| 3.5 酶消化PCR产物法联合BLP检测低丰度L858R突变 |
| 3.6 BLP检测肺癌组织基因组DNA中的L858R突变 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:肿瘤分子成像技术及分子诊断技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| B 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
