熊如月[1]（2020）在《猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体检测方法建立及免疫抗体消长规律测定》文中提出猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的猪呼吸系统传染病,急性发病时死亡率高,传染性强,给全世界养猪业造成了重大经济损失。疫苗防治仍然是预防该病的重要手段,也能减少抗生素的使用从而降低耐药性的产生。APP分泌的ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ毒素属于脂酰化蛋白质,同时是APP最主要的毒力因子和保护性抗原。本实验室已将三种重组的非脂酰化Apx毒素蛋白（rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA）与灭活的血清1型APP菌体抗原混合,制备出“猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗”,免疫猪产了生良好的多血清型交叉免疫保护力,且无明显副反应。本研究通过建立针对rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的三种ELISA抗体检测方法,进行猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗的免疫试验,测定了其免疫后的抗体消长规律,为评价该疫苗的免疫效果及免疫程序的制定提供科学依据。主要研究结果如下:1.rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA间接ELISA方法的建立将实验室保存的重组质粒pQE-ApxⅠA、pQE-ApxⅡA和pQE-ApxⅢA分别转化入大肠杆菌M15感受态细胞,诱导表达了rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA重组蛋白,用纯化后的重组蛋白分别建立三种ELISA抗体检测方法,并进行了条件优化,重复性较好。rApxⅠA间接ELISA检测方法中,rApxⅠA抗原包被浓度22.57μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释40倍,37℃孵育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min。在最佳反应条件下,阴阳临界值为0.267。rApxⅡA抗原包被浓度为39.88μg/m L,4℃过夜包被;1%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍后37℃温育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光室温显色30min;阴阳临界值为0.447的间接ELISA检测方法。rApxⅢA间接ELISA检测方法中,抗原稀释到11.10μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍,37℃孵育30min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min;阴阳临界值为0.283。2.疫苗抗体消长规律的测定在猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫试验中,共购入9头50日龄仔猪,3头为空白对照组、6头为疫苗组,分别耳后肌肉注射本实验室制备的PBS对照和亚单位-灭活菌苗,免疫后28天加强免疫一次。首免后0、14、21、28、60、68、75、82、89、96、110天前腔静脉采血分离血清。ELISA检测结果显示,疫苗组免疫后rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体变化趋势基本一致:首免0天至28天的变化不明显,二次免疫后显着上升,疫苗组rApxⅠ抗体在首免后75天达到峰值（效价230倍）,rApxⅡ抗体在首免后60天达到峰值（效价483倍）,rApxⅢ抗体在首免后68天达到峰值（效价73倍）,而后抗体水平逐渐下降。一免后110天rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体仍维持在较高水平。本研究建立了三种间接ELISA抗体效价检测方法,重复性较好。猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫后的抗体消长规律表明该疫苗能刺激机体产生rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA的特异性抗体,建议50日龄首免,首免后28天进行二免为宜。
程素芳[2]（2019）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的以急性肺脏出血或慢性纤维素性胸膜粘连等为特征的一种呼吸道传染性疾病。Apx外毒素是APP最重要的致病因子,且有ApxI、ApxII、ApxⅢ和ApxⅣ4种毒素因子,其中ApxⅠ可引起疾病出现肺部典型病变,也是引起猪传染性胸膜肺炎的最强毒力因子,而ApxⅣ毒力相对较弱,但可由所有的APP分泌,且只有APP在动物体内时ApxⅣ才会被诱导表达,因此当ApxI、ApxⅣ两种毒素因子同时存在时,则会对猪传染性胸膜肺炎的诊断具有十分重要的临床价值。通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和ApxIVA基因组DNA,建立双重PCR方法检测并扩增ApxIA和ApxIVA基因片段,并采用TA克隆技术获得重组质粒,然后进行生物信息学分析目的基因片段特性并进筛选,再进一步的蛋白表达、纯化及多克隆抗体制备。试验结果如下:1、成功建立了毒素ApxIA和ApxⅣA基因双重PCR体系,ApxIA和ApxⅣA在DNA模板浓度为240μmol/L和150μmol/L、引物浓度为2ng/mL、Tm值55℃条件下可同时获得两条较亮目的条带,且特异性和稳定性检测效果极佳。2、成功获得了pMD18–ApxIA、pMD18–ApxIVA重组质粒,通过基因生物信息学分析筛选出了基因片段长度为1 209 bp的ApxIA和目的基因片段长度为972bp的ApxⅣA的两段蛋白表达强基因片段。与NCBI上的基因序列进行同源性比较发现相似度均有90%以上。3、获得高效价的ApxIA和ApxⅣA多克隆抗体,经ELISA检测的效价分别可高达1:200000和1:50000;在此效价经Western Blot检测为阳性。结论:成功建了ApxI A和ApxⅣA基因双重PCR方法,其特异性、稳定性较强;获得了ApxI A和ApxⅣA基因的多克隆抗体,效价分别可高达1:200000和1:50000,为今后猪传染性胸膜肺炎的诊断防控提供了参考。
郭坤,高晓娜,罗军荣,王天成,郭小权,胡国良,刘平[3]（2017）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的研究进展》文中提出猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌引起,以肺脏出血、坏死和纤维素性渗出为主要病理变化,是一种高度接触性急性呼吸道传染病,其发病率和死亡率常在20%以上,其中最急性型的死亡率可高达80%100%。近年来,此病在我国多地爆发,其阳性检测率高达40%。因此,该病给畜牧业带来了严重的经济损失。在这种情况下,文章从病原学、流行病学、主要症状、实验室诊断及该病的防治等方面进行阐述。
姜宏泽,李英,文心田,黄小波,伍锐,文翼平,张俊,杨瑞晨,曹三杰[4]（2015）在《胸膜肺炎放线杆菌抗体ApxⅣ-Dot-PPA-ELISA检测方法的建立》文中研究指明本研究构建了胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素ⅣA（ApxⅣA）的原核表达质粒pET-28a（+）-ApxⅣ,并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出分子质量约为48ku的ApxⅣ蛋白,经Western-blot分析表明该重组ApxⅣ蛋白具有反应原性。试验进一步用纯化的重组ApxⅣ蛋白作为抗原,建立了胸膜肺炎放线杆菌抗体的Dot-PPA-ELISA检测方法,该方法诊断膜片上点样ApxⅣ抗原质量为0.737μg,该方法检测灵敏度高,可检测到胸膜肺炎放线杆菌标准阳性血清IgG的最低含量为8.374×10-9 g;检测特异性好,不与副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪链球菌2型、多杀性巴氏杆菌、日本脑炎病毒的阳性血清发生交叉反应。应用建立的诊断方法对446份临床血清样品进行检测,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性检出率为25.37%。结果表明,该方法具有操作方便、灵敏、结果易于判读等优点,可应用于猪场猪传染性胸膜肺炎的血清学诊断。
方礼禄,王朝军,徐利,沈君,虞桂平,严彩虹,杨光[5]（2013）在《应用ELISA检测我国猪病的研究进展》文中研究指明ELISA技术具有操作简便、快速准确、易于标准化、特异性强、敏感性高、重复性好、经济实用等优点,已被广泛应用于畜牧业、临床医学、环境污染控制、食品安全监测、生物、化学等领域。文章综述了应用ELISA检测我国猪病的研究进展。
朱岩昆[6]（2013）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析》文中研究表明猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。该致病菌引起的主要病症为肺出血、坏死和纤维素性渗出等。该病于1957年首次报道，自报道以来该病已在世界范围内广泛流行，并给许多国家的养猪产业造成了严重的经济损失。针对该病治疗的越早，经济损失也越少的特点，建立一种快速、灵敏、高效的诊断方法已成为新的研究热点。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分别设计一对引物，可以特异性扩增出637bp和431bp的目的片段。运用多重PCR技术，建立一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。结果显示，已知的胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能扩增出特异性的目的片段。特异性检验时，血清型5a能扩增出目的片段，而其他对照细菌均未扩增出相应的目的片段；根据该多重PCR方法对临床分离的通过生理生化分析鉴定的5株疑似猪胸膜肺炎放线杆菌进行了分子鉴定，其中有4株鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。以血清5a型作为待检菌进行灵敏性验证时，发现最低检出菌量为50个。表明通过表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA建立的多重PCR方法灵敏度高，特异性强。该PCR方法的建立，为猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了一种快捷高效的方法。为了指导临床用药，筛选出合适的临床药物，对以前分离的通过生理生化分析等鉴定和本次多重PCR确认的App进行了药敏试验和最小抑菌浓度（Minimum InhibitoryConcentration, MIC）试验，确认的4株App仅对10种临床常用药物中的头孢噻呋、阿米卡星、左旋氧氟沙星敏感，其它7种药物不敏感。对敏感药物进行MIC分析发现，左旋氧氟沙星对xx-1、xx-2、xx-3、xx-5四株菌株的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/23、6.25/23，阿米卡星的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/22、6.25/23，头孢噻呋的MIC值分别为37.5/22、37.5/22、37.5/23、37.5/24。通过药敏试验和最小抑菌浓度试验给临床用药及防治提供参考。App的毒力因子主要包括外毒素（Apx）、荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（TBp）等，近年的研究热点主要集中在外毒素，所以本研究克隆并构建了pMD-ApxⅠA、pMD-ApxⅡA、pMD-OmpD15载体，为序列分析及其后续研究奠定基础。ApxⅠA和ApxⅡA蛋白结构分析发现，ApxⅠA毒素蛋白α螺旋存在于1647aa，251269aa，344358aa，530546aa，β折叠分布较均匀，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为1185aa，407979aa；ApxⅡA毒素蛋白α螺旋存在于7090aa，172190aa，248275aa，207431aa，446469aa，812834aa，β折叠除在361406aa有较大折叠外其他折叠较小，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为418918aa。毒力因子Omp D15（Omp D15）是App一个重要的的表面抗原蛋白，蛋白结构分析表明其存在的抗原表位比较多，具有一定免疫原性，适合作为抗原抗体检测的重要靶标。因此本文以构建的pMD-D15载体为基础，构建了pET32a-OmpD15表达载体并在Rostta细胞中得到了表达，重组蛋白以包涵体的形式存在，通过梯度透析法获得纯化的重组蛋白。用初步纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以破碎的App作为抗原用ELISA方法检测抗血清，结果显示抗OmpD15血清能识别App，且3号免疫小鼠效价最高；Western-blot分析发现该重组蛋白可与抗App血清型5a血清中的抗体发生特异性反应，结果表明本实验所获得的D15重组蛋白具有良好的抗原性。用最小致死量App攻毒Balb/c小鼠，以D15重组蛋白作为抗原，ELISA方法监测小鼠体内抗体水平变化，发现攻毒后第三天即可在小鼠体内检测到OmpD15抗体的存在。通过OmpD15的原核表达、纯化及抗原性分析等的研究，为以表面抗原蛋白OmpD15开发亚单位疫苗、建立猪胸膜肺炎的ELISA诊断方法提供了理论基础及实验依据。
杜军,张强,李树清,王巧全,刘俊平,王艳,岳城[7]（2009）在《双夹心ELISA检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体方法的建立》文中进行了进一步梳理用胸膜肺炎放线杆菌血清2型（1536）菌液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后免疫大白兔,制备兔高免血清,提纯抗体,建立检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的双夹心ELISA方法。方阵滴定确定最佳反应条件:包被纯化的兔抗App血清2型抗体为9.375μg/mL,抗原稀释度为1∶1 600,HRP-兔抗猪IgG稀释度为1∶20 000。特异性与敏感性试验结果表明,双夹心ELISA方法特异性好、敏感性高,与猪O型口蹄疫、猪传染性胃肠炎、蓝耳病等阳性血清以及App其他血清型阳性血清无交叉反应。检测样品结果与阻断ELISA比较,其相符率为99.54%,表明双夹心ELISA可用于猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的检测。
贾付从[8]（2009）在《猪胸膜肺炎放线杆菌抗体ELISA检测试剂盒的研制及应用》文中认为猪传染性胸膜肺炎（ine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的高度接触性、致死性呼吸道疾病。研究表明,与病原菌毒力相关的因子很多,包括毒素、荚膜多糖、外膜蛋白、脂多糖等,其中毒素既是主要的毒力因子,也是主要的免疫原。APP可产生4种毒素,其中Apx Ⅱ除血清型10外,其余血清型都能分泌此毒素；所有血清型的APP都能分泌ApxⅣ, ApxⅣ只有在APP感染宿主时才产生,而在体外培养条件下不表达。一、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA反应条件的优化及试剂盒的研制重组蛋白Apx Ⅱ表达和纯化经过改进,即在37℃,用0.8mM IPTG诱导4h；对早期建立的检测猪胸膜肺炎放线杆菌抗体的ApxⅡ-ELISA检测方法的反应条件进行优化,确定了最佳反应条件,抗原最适包被浓度为2.23μg/mL,包被时间为37℃1h后4℃过夜,封闭液为1%BSA/PBST,在37℃封闭lh。酶标二抗最适稀释浓度为1：20000。在此基础上研制成试剂盒,对其敏感性、特异性、重复性及稳定性进行测试。该试剂盒的批内和批间变异系数分别为2.52%～7.41%和2.96%-7.16%。与IHA试剂盒进行比较,符合率为86.7%。结果表明该试剂盒具有良好的特异性和敏感性,可快速准确的检测猪传染性胸膜肺炎。二、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA试剂盒的研制重组ApxⅣ蛋白表达和纯化经过改进,即在30℃,用0.6mM IPTG诱导6h；在早期建立的猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测方法的基础上,本研究对抗原酶标板制备工艺,酶标二抗、阴阳性血清和试剂盒的保存条件进行了测试,并组装成试剂盒。该试剂盒的批内和批间的变异系数分别为2.65%-8.40%和2.69%-11.3%；试剂盒置于-20℃至少保存9个月,4℃保存3个月。与科前ApxⅣ-ELISA检测试剂盒比较,两者的符合率为67.5%。该试剂盒能区分野毒感染和疫苗免疫猪产生的抗体。三、ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒的应用利用研制的ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒检测了不同日龄猪血清样品和大量临床血清样品。发现在同一批猪不同日龄采集的血清中,两种毒素抗体阳性率均呈现先降后升的趋势,用ApxⅡ-ELISA试剂盒检测时,50-60日龄猪抗体阳性率降到最低,而用ApxⅣ-ELISA检测时,90-110日龄猪抗体阳性率达到最低水平。ApxⅡ-ELISA试剂盒检出了临床样品阳性血清288份,阳性率为34.3%；ApxⅣ-ELISA试剂盒检出了阳性血清191份,阳性率为22.8%。
李健华[9]（2009）在《猪胸膜肺炎放线杆菌检测及其ApxⅣ基因克隆与表达》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）感染引起猪的一种以急性出血性和慢性纤维素性胸膜肺炎病变为特征的呼吸道传染病。本病呈世界性分布,在欧洲、北美洲、南美洲、大洋洲及亚洲等地区养猪国家均有病例报道,特别是养猪业的规模化与集约化发展,危害程度日趋严重,已成为影响现代养猪业健康发展的重要传染病之一。1987年我国首次报道本病,1996年蔡一鸣等通过流行病学调查、临床症状观察、大体病理学检查和病原学鉴定等首次证实本病在我省的存在。本研究开展了以下几个方面的工作:1.贵州省猪传染性胸膜肺炎血清学调查:采用间接凝集试验对2007年841份和2008年1056份猪血清样本进行猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测,结果显示:2007年免疫猪群和非免疫猪群抗体阳性率分别为63.6%和50.3%,其中种猪场、规模养猪场、养殖小区、散养户和屠宰场猪群相应为45.4%、60.2%、44.4%、25.0%和46.8%,而在哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和种猪中的血清抗体阳性率分别为47.6%、30.3%、62.2%和60.0%。2008年免疫猪群和非免疫猪群抗体阳性率分别为78.5%和38.0%,其中种猪场、规模养猪场、养殖小区、散养户和屠宰场猪群相应为36.2%、52.2%、28.6%、12.5%和41.8%,而在哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和种猪中的血清抗体阳性率分别为37.1%、23.5%、47.4%和42.7%。这些结果表明,该病的免疫预防效果良好,在贵州省不同饲养方式猪场以及不同生长阶段猪群已普遍存在猪传染性胸膜肺炎感染。2.猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测技术研究:根据Genebank收录的猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂白A基因保守序列,设计合成了1对引物,对猪胸膜肺炎放线杆菌参考菌株和其它种属菌株进行PCR检测,并比较了不同的模板提取方法,结果显示:建立的PCR方法对9个血清型猪胸膜肺炎放线杆菌菌株均能扩增出与预期大小相一致的339bp特异性条带,而对支气管败血波氏杆菌、奇异变形杆菌、都柏林沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等均呈阴性反应,且其模板最小检出量可达到0.14ng;同时SDS-蛋白酶K法、煮沸法和枪尖法提取的DNA模板对该PCR方法的扩增效果影响不明显。这些结果表明,本实验成功建立了特异、敏感的猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法,为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断提供了技术支持。3.猪胸膜肺炎放线杆菌PCR分群研究:根据Genebank收录的不同血清型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂白A基因序列的差异,设计合成了4对引物（即相同上游引物与不同下游引物）,对猪传染性胸膜肺炎疫苗菌株、其它参考菌株和不同血清型猪胸膜肺炎放线杆菌进行PCR检测,结果显示:建立的PCR分群方法对猪传染性胸膜肺炎疫苗菌株可扩增出983bp、666bp和382bp大小的三条DNA带,与该疫苗所含血清型（Ⅰ、Ⅱ和Ⅶ血清型）预期扩增条带大小相一致;对上述其它种属参考菌株均呈阴性反应;对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ等9个血清型猪胸膜肺炎放线杆菌均能扩增出相应的目的条带（983bp、666bp、382/415bp和591bp）。这些结果表明,本实验建立的多重PCR方法,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌血清群的划分。4.猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因克隆与序列测定:根据Genebank收录的猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因保守序列,设计合成1对引物,对血清Ⅰ型猪胸膜肺炎放线杆菌进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pMD-18T,经转化与鉴定后,送至大连宝生物公司测序,结果显示:该引物对血清Ⅰ型猪胸膜肺炎放线杆菌可扩增出与预期大小相一致（约为620bp）的特异性DNA条带;对扩增产物的重组pMD-18T载体进行PCR和双酶切鉴定结果均正确（分别约为624bp和624bp/2700bp）;经测序,扩增片段大小为624bp,该片段序列与Genebank上参考菌株相应序列的同源性达100%。5.猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因原核表达及其初步鉴定:将上述扩增ApxⅣ基因片段克隆至pET32a载体,转化BL21（DE3）大肠杆菌进行诱导表达,并对表达产物进行免疫反应性鉴定,结果显示:经蓝白斑菌落筛选和PCR反应证实本实验成功构建了猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因片段的重组pET32a-ApxⅣ载体;经转化BL21（DE3）大肠杆菌进行诱导表达,该基因片段的表达蛋白量达到全菌蛋白的22%,最佳表达时间为4.5h,最佳IPTG诱导剂量为1.0mmol/L;Western Blotting证实该表达蛋白能与猪传染性胸膜肺炎阳性血清发生特异性反应,具有较好的免疫活性,为猪传染性胸膜肺炎血清学诊断技术研究奠定了基础。
张瑞平[10]（2008）在《猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的分离提纯及特性研究》文中指出猪传染性胸膜肺炎（Porcine Pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种常见的呼吸道传染病,各年龄的猪只均可感染。猪群感染胸膜肺炎放线杆菌后,当遇到气候环境突变,通风不良等应激因素时,猪只抵抗力下降,可诱发本病,主要表现为精神沉郁,体温升高,呼吸困难等临床症状,并出现特征性的出血性肺炎和胸膜炎。本病在世界各养猪国家普遍存在,近年来,流行日趋严重,成为世界规模化养猪的五大重要疫病之一,造成了巨大的经济损失。构成APP致病性的毒力因子包括溶血毒素（Apx）、荚膜多糖（CP）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（Tbp）、渗透因子、脲素酶（Urase）、蛋白酶（Protease）等。然而,关于细菌的增殖和组织降解的很多问题都还没有解决。蛋白酶很可能通过降解不同的宿主底物（如IgA、IgG）来促进呼吸器官粘膜表面组织的损伤,加快APP的进一步侵入。Negrete Abascal E（1994）等已分离到能分泌切割免疫球蛋白蛋白酶的APP。在本研究中我们检测了APP在体外培养时分泌的蛋白酶的一些生化特性。这些蛋白酶在宿主组织内也能分泌,且促进了组织的损伤和细菌的增殖（Negrete Abascal E et al. ,2000;Negrete Abascal E et al. ,1998）。因此,研究APP蛋白酶的生化特性,对有效预防和控制猪传染性胸膜肺炎,保护和促进养猪业的健康发展具有重要意义。本研究共分两部分:第一部分:猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的分离、纯化及特性分析将血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）山东分离株接种于含0.2%NAD的LB液体培养基,37℃培养48h后,经硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换层析、葡聚糖凝胶分子筛层析,从其培养上清液中分离纯化了一种蛋白酶。SDS-PAGE显示,APP蛋白酶含有分子量约为45 kD的亚单位。以酪蛋白为底物测得该酶的最适pH值为7.5,最适温度为45℃;该酶对热有一定稳定性,80℃加热30min仍保留部分活性;乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制其活性,而苯甲基磺酰氟（PMSF）对其无影响。第二部分:猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的免疫保护研究将提纯的APP蛋白酶制备成亚单位油乳剂疫苗,分不同剂量（10μg/只、20μg/只、30μg/只、40μg/只、50μg/只、100μg/只和200μg/只）免疫小白鼠,然后进行同源性保护试验。结果显示蛋白酶在100μg/只以上的免疫剂量下对小白鼠产生较强的保护作用。用同源菌株攻毒后,对照组未经免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡,肺脏严重出血,肝脏肿大出血;10μg免疫组的小白鼠全部死亡,肺脏严重出血;20μg、30μg、40μg、50μg、100μg、200μg免疫组的小白鼠死亡率随免疫剂量的增加依次呈下降趋势,肺脏出血程度也依次减轻。在最佳免疫剂量下免疫30日龄小白鼠,间隔2周加强免疫一次。每次免疫后采血检测蛋白酶的抗体,第二次免疫2周后用猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型、7型菌株进行攻毒。结果发现第二次免疫后抗体水平较高,用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为37.5%和62.5%,并从死亡小鼠体内分离到了攻毒菌株。初步的动物试验结果表明,该蛋白酶具有一定的免疫原性及保护力,但其诱导的免疫反应对同型及异型菌株的攻击只能提供部分保护。研究表明该蛋白酶在猪传染性胸膜肺炎的免疫保护过程中起一定的作用,该研究为APP亚单位疫苗的研制及应用提供了理论依据。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎及其危害 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.1.4 治疗和防控 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的检测与诊断 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 分子生物学诊断 |
| 1.2.3 血清学诊断 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 亚单位疫苗 |
| 1.3.3 弱毒活疫苗 |
| 1.3.4 菌影疫苗 |
| 2 目的和意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株和血清 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 3.1.3 主要培养基及溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 试验动物 |
| 3.1.6 疫苗 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒的转化 |
| 3.2.2 重组质粒的提取 |
| 3.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.5 包涵体蛋白的纯化 |
| 3.2.6 蛋白浓度的测定 |
| 3.2.7 重组蛋白的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.2.8 重组蛋白的Western-Blot检测 |
| 3.2.9 Apx毒素间接ELISA方法的建立 |
| 3.2.10 免疫血清的制备 |
| 3.2.11 抗体消长的测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 重组质粒的鉴定 |
| 4.2 重组蛋白的SDS-PAGE及 Western-blot验证 |
| 4.3 Apx毒素间接ELISA方法的建立 |
| 4.3.1 rApxIA间接ELISA检测方法 |
| 4.3.2 rApxIIA间接ELISA检测方法 |
| 4.3.3 rApxIIIA间接ELISA检测方法 |
| 4.4 猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体消长规律 |
| 4.4.1 rApxIA-ELISA抗体消长规律 |
| 4.4.2 rApxIIA-ELISA抗体消长规律 |
| 4.4.3 rApxIIIA-ELISA抗体消长规律 |
| 5 讨论 |
| 5.1 间接ELISA抗原的选择 |
| 5.2 rApxIA、rApxIIA和 rApxIIIA重组蛋白的纯化 |
| 5.3 间接ELISA的建立 |
| 5.4 疫苗免疫消长规律对免疫程序的建议 |
| 5.5 实验动物对实验的影响 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文章综述 |
| 1 概述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害及流行病学特点 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的诊断 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎的防治 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌的特征 |
| 2 生物学特性 |
| 2.1 外毒素 |
| 2.2 ApxⅠ相关特性 |
| 2.3 ApxⅣ相关特性 |
| 2.4 荚膜多糖 |
| 2.5 脂多糖 |
| 2.6 外膜蛋白 |
| 2.7 转铁结合蛋白 |
| 3 研究目的意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA基因双重PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基、酶、试剂盒及其它试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 细菌的培养及DNA的提取 |
| 2.3 单重PCR体系的建立 |
| 2.4 双重PCR特异性和灵敏性检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 单重PCR实验结果 |
| 3.2 双重PCR实验结果 |
| 3.3 特异性和稳定性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 试验二 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIA基因克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 ApxIA基因DNA的提取 |
| 1.2.2 ApxI A 基因的 PCR 扩增 |
| 1.2.3 PCR产物经胶回收纯化 |
| 1.2.4 ApxIA基因片段与pMD18–T的连接 |
| 1.2.5 连接产物转化感受态细胞 |
| 1.2.6 p MD18–ApxIA的鉴定 |
| 1.2.7 测序分析 |
| 1.2.8 ApxIA基因的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ApxIA基因的扩增和T-A克隆与鉴定 |
| 2.2 ApxIA基因的生物信息学分析 |
| 2.2.1 ApxIA基因测序 |
| 2.2.2 ApxIA蛋白的理化性质分析 |
| 2.2.3 ApxIA蛋白磷酸化、糖基化位点的分析 |
| 2.2.4 ApxIA蛋白抗原肽与信号肽预测 |
| 2.2.5 ApxIA蛋白的亲/疏水性预测及跨膜结构域分析 |
| 2.2.6 ApxIA蛋白的二三级结构预测 |
| 3 讨论 |
| 试验三 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病菌来源 |
| 1.1.2 酶及其试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 细菌培养 |
| 2.3 p MD18-T-ApxⅣA重组质粒构建 |
| 2.3.1 ApxⅣA DNA提取 |
| 2.3.2 ApxⅣA基因序列的PCR扩增 |
| 2.3.3 PCR反应条件及电泳检测 |
| 2.3.4 胶回收以及重组质粒 |
| 2.3.5 ApxⅣA基因的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ApxⅣA基因片段PCR扩增、克隆与鉴定 |
| 3.2 基因测序 |
| 3.3 ApxⅣA片段基因信号肽测定 |
| 3.4 ApxⅣA基因稀有密码子的分析 |
| 3.5 ApxⅣA基因疏水性与亲水性的分析 |
| 3.6 Coil区分析 |
| 3.7 二级结构预测 |
| 4 讨论 |
| 试验四 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA多克隆抗体制备 |
| 1 试验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 ApxIA和 ApxⅣA特征性抗原肽段的合成 |
| 2.2 合成多肽的溶解和分装 |
| 2.3 抗原与佐剂的乳化 |
| 2.4 免疫兔子制备 |
| 2.5 免疫前后采血 |
| 2.6 ELISA检测抗体 |
| 2.7 Western b Iot检测抗体 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 附录 |
| 1 病原 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状 |
| 4 病理变化 |
| 5 诊断 |
| 5.1 细菌分离鉴定 |
| 5.2 血清学鉴定 |
| 5.2.1 CFT |
| 5.2.2 ELISA |
| 5.2.3 IHA |
| 5.3 类别鉴定 |
| 6 防治 |
| 6.1 加强饲养管理与猪场的生物安全问题 |
| 6.2 免疫疫苗的接种 |
| 6.3 药物预防与治疗 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、载体、酶、血清和其他试剂 |
| 1.2 APP ApxⅣ基因的扩增及产物鉴定 |
| 1.3 原核表达载体pET-28a(+)-ApxⅣ的构建 |
| 1.4 重组菌的构建 |
| 1.5 重组菌的诱导 |
| 1.6 重组ApxⅣ蛋白的纯化 |
| 1.7 重组ApxⅣ蛋白的Western-blot分析 |
| 1.8 Dot-PPA-ELISA的建立 |
| 1.8.1 Dot-PPA-ELISA最佳工作条件的选择 |
| 1.8.2 特异性试验 |
| 1.8.3 重复性试验 |
| 1.8.4 灵敏性试验 |
| 1.8.5 符合率试验 |
| 1.9 Dot-PPA-ELISA的临床应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 ApxⅣ基因的扩增以及重组表达质粒的构建 |
| 2.2 重组ApxⅣ蛋白的表达及纯化 |
| 2.3 重组ApxⅣ蛋白的Western-blot分析 |
| 2.4 Dot-PPA-ELISA的最佳工作条件 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 重复性试验 |
| 2.7 灵敏性试验 |
| 2.8 符合率试验 |
| 2.9 Dot-PPA-ELISA的临床应用 |
| 3 讨论 |
| 1 ELISA的原理 |
| 2 ELISA技术在猪病检测中的应用 |
| 2.1 猪病毒性传染病的诊断 |
| 2.1.1 猪繁殖与呼吸障碍综合征 |
| 2.1.2 猪伪狂犬病毒 |
| 2.1.3 猪瘟 |
| 2.1.4 猪戊型肝炎病毒 |
| 2.1.5 口蹄疫病毒 |
| 2.1.6 猪日本乙型脑炎病毒 |
| 2.1.7 其他 |
| 2.2 猪细菌性传染病的诊断 |
| 2.2.1 猪链球菌 |
| 2.2.2 副猪嗜血杆菌 |
| 2.2.3 猪源支气管败血波氏杆菌 |
| 2.2.4 猪胸膜肺炎放线杆菌 |
| 2.2.5 猪水肿毒素 |
| 2.2.5 猪附红细胞体 |
| 2.3 猪支原体性传染病的诊断 |
| 2.4 猪衣原体性传染病的诊断 |
| 2.5 猪寄生虫疾病的诊断 |
| 3 小结 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 致病机理及其危害 |
| 1.4.1 致病机理 |
| 1.4.2 猪传染性胸膜肺炎的危害 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子 |
| 1.5.1 溶血毒素（Apx） |
| 1.5.2 外膜蛋白（Omp） |
| 1.5.3 荚膜多糖（CPS） |
| 1.5.4 脂多糖（LPS） |
| 1.5.5 其他毒力因子 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 病原学方法 |
| 1.6.2 血清型方法 |
| 1.6.3 分子学诊断方法 |
| 1.7 猪传染性胸膜肺炎的防制 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR 检测方法的建立、药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.1.1 培养基及菌株 |
| 2.1.2 酶类及主要试剂 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 App 基因组提取 |
| 2.1.5 PCR 扩增 |
| 2.1.6 App PCR 特异性检测 |
| 2.1.7 App PCR 敏感性检测 |
| 2.1.8 重复性试验 |
| 2.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.2.1 培养基及实验菌株 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 试验用药及药敏片制备 |
| 2.2.4 药品原液制备及保存 |
| 2.2.5 菌株的活化及菌液制备 |
| 2.2.6 药敏试验 |
| 2.2.7 MIC 的测定 |
| 2.2.8 结果判定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 App 标准菌株 PCR 扩增 |
| 2.3.2 App PCR 扩增特异性试验 |
| 2.3.3 App 的敏感性试验 |
| 2.3.4 重复性试验 |
| 2.3.5 建立的 PCR 方法对临床分离菌株的鉴定 |
| 2.3.6 药敏试验 |
| 2.3.7 MIC 的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.4.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 第三章 毒力因子 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 基因片段的克隆 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 仪器及试剂 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂配制 |
| 3.2 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 片段的扩增与克隆 |
| 3.2.1 基因组 DNA 的提取 |
| 3.2.2 基因的扩增 |
| 3.2.3 PCR 产物电泳及纯化 |
| 3.2.4 PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接 |
| 3.2.5 感受态细胞制备 |
| 3.2.6 连接产物的转化和阳性菌落的鉴定 |
| 3.2.7 阳性克隆质粒的提取 |
| 3.2.8 阳性克隆质粒序列测定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 ApxⅠC、ApxⅡA、 OmpD15 基因片段的克隆结果 |
| 3.4.2 测序结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 OmpD15 的原核表达及其抗原性分析 |
| 4.1 OmpD15 基因的原核表达 |
| 4.1.1 工具酶及主要试剂配制 |
| 4.1.2 OmpD15 的基因扩增 |
| 4.1.3 目的片段和载体的酶切、电泳及回收 |
| 4.1.4 基因 OmpD15 的连接与转化 |
| 4.1.5 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.1.6 pET32a-OmpD15 重组表达质粒的诱导表达 |
| 4.1.7 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.1.8 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.1.9 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.2 动物实验 |
| 4.2.1 实验材料及实验动物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.2.4 抗体的监测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 OmpD15 基因的扩增 |
| 4.3.2 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.3.3 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.3.4 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.3.5 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.3.6 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.3.7 抗体的监测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 1 材 料 |
| 1.1 试 剂 |
| 1.2 ELISA反应板 |
| 1.3 血清及抗原 |
| 1.4 样品来源 |
| 2 方 法 |
| 2.1 App血清2型多糖抗原的制备 |
| 2.2 兔抗App血清2型高免血清的制备及纯化 |
| 2.3 双夹心ELISA方法的建立 |
| 2.3.1 双夹心ELISA操作程序 |
| 2.3.2 最佳试验条件的确定 |
| 2.3.3 双夹心ELISA阴阳性临界值 (Cutoff值) 的计算 |
| 2.3.4 双夹心ELISA特异性检测 |
| 2.3.5 双夹心ELISA敏感性检测 |
| 2.3.6 双夹心ELISA方法的初步应用 |
| 2.4 阻断ELISA |
| 3 结 果 |
| 3.1 纯化的兔抗App血清2型高免血清蛋白含量的测定 |
| 3.2 双夹心ELISA方法的建立 |
| 3.2.1 最佳试验条件的确定 |
| 3.2.2 双夹心ELISA阴阳性临界值 (Cutoff值) 的确定 |
| 3.2.3 双夹心ELISA特异性测定 |
| 3.2.4 双夹心ELISA敏感性测定 |
| 3.2.5 双夹心ELISA方法的初步应用 |
| 4 讨 论 |
| 4.1 兔抗App血清2型高免血清的纯化 |
| 4.2 双夹心ELISA |
| 4.3 对后续研究的帮助 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 毒力因子 |
| 4 致病机理 |
| 5 病理变化 |
| 6 临床症状 |
| 7 检测技术的研究进展 |
| 8 防治策略 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅱ-ELISA反应条件的优化及试剂盒的研制 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA试剂盒的研制 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 Apx Ⅱ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒的应用 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 实验一 贵州省猪传染性胸膜肺炎血清学调查 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测试剂 |
| 1.2 猪血清样本 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清学调查结果 |
| 3.2 非免疫猪群不同饲养方式检测 |
| 3.3 非免疫猪群不同年龄阶段检测 |
| 4 讨论 |
| 实验二 猪胸膜肺炎放线杆菌检测技术研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验菌株 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物合成 |
| 2.2 菌种复苏 |
| 2.3 PCR反应体系及条件 |
| 2.4 不同DNA提取方法比较 |
| 2.5 不同血清型APP的PCR |
| 2.6 PCR特异性、敏感性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同DNA提取方法比较 |
| 3.2 不同血清型APP的PCR |
| 3.3 PCR特异性试验 |
| 3.4 PCR敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 实验三 猪胸膜肺炎放线杆菌PCR分群研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验菌株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 DNA提取 |
| 2.2 OmLA同源性分析 |
| 2.3 引物设计 |
| 2.4 多重PCR扩增 |
| 2.5 特异性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重PCR扩增 |
| 3.2 多重PCR特异性 |
| 4 讨论 |
| 实验四 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因克隆与序列测定 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 工具酶及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 培养基的制备 |
| 2.2 DNA的提取 |
| 2.3 质粒提取试剂 |
| 2.4 ApxⅣ引物设计 |
| 2.5 ApxⅣ的PCR扩增 |
| 2.6 PCR产物的回收 |
| 2.7 T载体的连接 |
| 2.8 感受态细胞制备 |
| 2.9 重组质粒转化与酶切 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增 |
| 3.2 双酶切 |
| 3.3 序列测定 |
| 4 讨论 |
| 实验五 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因原核表达及其初步鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 SDS-PAGE配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒提取 |
| 2.2 质粒双酶切 |
| 2.3 表达 |
| 2.4 制备感受态细胞及转化 |
| 2.5 重组质粒PCR |
| 2.6 诱导表达 |
| 2.7 表达条件优化 |
| 2.8 Western Blotting分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒转化 |
| 3.2 重组质粒PCR |
| 3.3 重组载体BL21表达 |
| 3.4 表达条件优化 |
| 3.5 Western Blotting |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 主要参考文献 |
| 附录一 发表文章 |
| 附录二 本文用到的部分英文缩写及含义说明 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的病原生物学特征 |
| 1.1 病原特征 |
| 1.2 毒力因子的分子生物学特征 |
| 2 猪传染性胸膜肺炎的流行病学 |
| 3 猪传染性胸膜肺炎的诊断 |
| 3.1 微生物学诊断 |
| 3.2 血清学诊断 |
| 3.3 分子生物学诊断 |
| 4 猪传染性胸膜肺炎的预防 |
| 4.1 改善饲养环境 |
| 4.2 加强卫生管理 |
| 4.3 减少应激因素 |
| 4.4 严把检疫关 |
| 4.5 淘汰阳性猪 |
| 4.6 疫苗免疫 |
| 试验一 猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的分离提纯及特性分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 最佳产酶条件的优化 |
| 1.5 APP 的扩大培养 |
| 1.6 蛋白酶的提取及纯化 |
| 1.7 酶活力的测定 |
| 1.8 蛋白含量的测定 |
| 1.9 蛋白酶的检测 |
| 1.10 蛋白酶的理化性质 |
| 1.11 致病性试验 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 最佳产酶条件的优化 |
| 2.2 最佳硫酸铵饱和度的确定 |
| 2.3 蛋白酶的提取及纯化 |
| 2.4 蛋白酶的检测 |
| 2.5 蛋白酶的理化性质 |
| 2.6 致病性试验 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶对小白鼠的免疫保护研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 试验动物 |
| 1.5 细菌培养及计数 |
| 1.6 蛋白酶亚单位油乳剂疫苗的制备 |
| 1.7 免疫保护力试验 |
| 1.8 抗体的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 最佳免疫剂量的确定 |
| 2.2 蛋白酶 ELISA 最佳反应条件测定的结果 |
| 2.3 两次免疫后小鼠抗体的检测结果 |
| 2.4 攻毒结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
