宁为民[1]（2021）在《一株几丁质降解菌的分离鉴定、酶基因克隆表达及对凡纳对虾生长和肠道菌群影响》文中研究表明本研究首先从凡纳对虾（Penaeus vannamei）肠道分离和筛选具有几丁质酶活性的潜在益生菌;接着,在对一株目标菌的基因组测序和分析基础上,克隆表达其几丁质酶基因;最后通过养殖实验,评估目标菌株对凡纳对虾的生长和肠道菌群等影响。本文为几丁质降解菌在对虾养殖中的潜在应用提供了参考,主要研究内容与结果如下:1.利用选择培养基从湛江地区凡纳对虾肠道分离几丁质降解菌,并通过16S r DNA测序鉴定,根据胞外酶活性和对卤虫幼体安全性等测试筛选潜在益生菌株。结果显示,在初步鉴定的36株产几丁质酶细菌中,弧菌（Vibrio）最为优势,其次为气单胞菌（Aeromonas）,而假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）C923和希瓦氏菌（Shewanella）C813均具有较高安全性和较强几丁质酶活性等优点,可作为潜在的对虾益生菌株。2.通过Prometh ION平台对菌株C923进行全基因组测序,对其基因组序列进行注释和分析;对C923几丁质酶基因A（chi A）和D（chi D）进行克隆表达,并对酶结构域进行分析。结果显示,C923基因组大小为5.37 Mb,GC含量为43.34%,平均核苷酸同源性与杀鱼假交替单胞菌（Pse.piscicida）模式菌株相似度最高,并被鉴定为该种。C923基因组共编码4576个完整的CDS,其中包含10个几丁质降解相关基因。克隆表达的chi A和chi D序列分别有2484 bp和3036 bp,编码蛋白大小分别为108 k Da和129 k Da,均属于糖苷水解酶18家族。3.自制分别含0%、4%和8%的几丁质配合饲料,通过8周养殖实验研究假交替单胞菌C923与几丁质对凡纳对虾生长、酶活力和肠道菌群的影响。结果表明:与对照组相比,饲料中加入几丁质和/或C923均能显着降低饲料系数,且4%几丁质添加组与C923添加组可显着提高对虾增重率和特定生长率（P<0.05）,而4%几丁质与C923组合处理组的综合作用效果最佳。饲料中添加4%和8%的几丁质可分别显着提高对虾肝胰腺几丁质酶和血清酸性磷酸酶活力,C923则能显着提高肝胰腺超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力。连续8周添加4%几丁质或C923增加了各组对虾肠道菌群结构间的差异,其中,C923可显着提高假交替单胞菌科的相对丰度;与对照相比,4%几丁质组对虾肠道弧菌科丰度明显增加,但4%几丁质与C923组合使用时弧菌科丰度无显着变化。
李博旭[2]（2020）在《一株不动杆菌ZJU-1的分离、功能鉴定及其对蔬菜生长的影响》文中进行了进一步梳理几丁质及其衍生物多种多样的结构组成,赋予了它多种应用价值。我国海洋资源丰富,为农业生产提供大量的几丁质材料已成为可能,同时对虾、蟹等废弃物回收再利用也符合当前垃圾分类、资源再回收的国家政策,一举多得。通过对可分解几丁质菌株的筛选,获得了一株不动杆菌（Acinetobacter）ZJU-1,对不动杆菌ZJU-1进行了功能鉴定,分析了其对蔬菜生长的影响,主要研究结果如下:1、以虾壳中所附着的微生物为初始菌源,对可分解几丁质的菌株进行筛选、分离与种属鉴定,得到了一株生长良好、几丁质酶活力较高的不动杆菌ZJU-1。2、以普通虾壳、蟹壳、粗制几丁质为材料,以分解后产生的几丁寡糖含量为标准,研究了不动杆菌ZJU-1对虾、蟹壳等材料的分解效果,试验结果显示不动杆菌ZJU-1对虾、蟹壳具有良好的分解能力。3、以尖孢镰刀菌番茄专化型（F.oxysporum f.sp.lycopersici）和黄瓜专化型（F.oxysporum f.sp.cucumerinum）为材料,研究了不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对尖孢镰刀菌生长的影响,试验结果显示不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对尖孢镰刀菌的生长表现出良好的抑制活性。4、以番茄和黄瓜为材料,以植株茎粗、株高、鲜重为指标,研究了不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对蔬菜生长的影响,试验结果显示不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液可以促进蔬菜生长。
齐明明,李建洋,刘宪华,邵宗泽[3]（2020）在《近海沉积物与水体中天然大分子聚合物降解菌的原位富集与多样性分析》文中指出本研究选取5种海洋动植物大分子高聚物或其天然组织,包括虾壳、鱼鳞、海带叶片、几丁质和壳聚糖,分别在海水表层和沉积物环境中进行富集,定期取样,通过高通量测序分析菌群多样性。结果发现,不同有机物原位富集的细菌多样性存在较大的差异,而且同种底物在海水表层与沉积物中的降解菌菌群差异较大。从物种多样性看,在海水表层环境中富集的鱼鳞样品种群最丰富,而沉积物环境中富集的海带叶片样品菌群多样性最低,除其优势菌群为热袍菌门外,其他所有富集物中优势菌均为变形菌门。其中脱硫杆菌科、黄杆菌科、脱硫弧菌科和弧菌科占有较大比例,脱硫杆菌科在所有样品中优势较大,黄杆菌科在海水表层环境样品中为优势菌群,弧菌科在沉积物样品几丁质和壳聚糖样品中占比较高。本研究通过对同种海洋环境中不同富集样品之间以及同种底物不同环境中富集菌群之间的比较,分析结果得到了原位条件下参与大分子聚合物降解的菌群种类,但有待于在更多不同的海域富集物中进行验证。
王艳君[4]（2020）在《海洋假交替单胞菌属细菌降解几丁质的特性及新型几丁质酶的表征》文中提出海洋是地球上最大的生态系统,海洋微生物在海洋生态系统和地球生物化学循环中起着极其重要的作用。几丁质是海洋中含量最丰富的有机碳,海洋微生物对几丁质的降解代谢,是海洋物质循环的重要推动力。海洋中能够降解几丁质的微生物有很多,但绝大多数海洋微生物降解几丁质的机制仍不清楚。假交替单胞菌属是海洋特有细菌,其广泛分布于全球海洋中,并具有相对较高的丰度。最近,基于生物信息学分析,有研究表明较高比例的假交替单胞菌中含有几丁质降解基因簇（CDC）,预示着假交替单胞菌属可能是海洋中重要的几丁质降解细菌类群。但是,到目前为止,关于假交替单胞菌的几丁质降解能力的研究还较少,缺少在属水平开展假交替单胞菌降解几丁质的系统研究,假交替单胞菌在海洋几丁质降解中的贡献还不清楚。假交替单胞菌降解几丁质的机制也不清楚。几丁质酶等糖苷水解酶在海洋几丁质的微生物降解中发挥重要作用,其能将几丁质水解成几丁寡糖或单糖。GH18家族几丁质酶因其分布广泛及对结晶几丁质的高效降解,一直以来是该领域的研究热点。GH18家族中,相比于对外切几丁质酶的广泛研究,对内切几丁质酶的研究还较少,GH18家族内切几丁质酶的催化机制到目前为止还不清楚。本文较为系统地在属水平分析了假交替单胞菌对几丁质的降解,揭示出假交替单胞菌在海洋几丁质的降解中发挥重要作用,并对其中一株几丁质降解菌P.flavipulchra DSM 14401T中参与胞外几丁质降解的关键酶基因进行了鉴定和表征。此外,本文还从几丁质降解菌P.aurantia DSM 6057T中鉴定出一个属于GH18家族的新型内切几丁质酶Chi23,并解析了它的晶体结构,阐明了其催化机制。对海洋假交替单胞菌及其几丁质酶的研究,将有助于阐明海洋微生物降解海洋几丁质的机制。一、假交替单胞菌属的几丁质降解能力分析及其在海洋几丁质降解中的作用为了研究假交替单胞菌属在海洋几丁质降解中的作用,本文对来自全球不同海域的假交替单胞菌的26个模式种以及从黄海海域不同样品中筛选到的139株假交替单胞菌进行了几丁质降解能力的分析。基于16S rRNA基因分析,这165株测试菌至少涵盖了假交替单胞菌属中的35个种。同时,本文还分析了两株深海假交替单胞菌菌株SM9913和CF6-2的几丁质降解能力。通过分析这167株假交替单胞菌（涵盖了假交替单胞菌74%的种）的几丁质降解能力,揭示出超过20%的菌株能够降解胶体几丁质且能以胶体几丁质及其降解产物——几丁二糖等寡糖为唯一碳源进行生长,并且这些几丁质降解菌多数分离自表层海水和藻类样品,表明假交替单胞菌是海洋环境中重要的几丁质降解类群,尤其在上层海水几丁质的降解中发挥着重要作用。随后,通过检测以胶体几丁质为唯一碳源培养的几丁质降解菌的胞外粗酶液的几丁质酶活性,揭示出几乎所有的几丁质降解菌均具有胞外几丁质酶和N-乙酰葡萄糖胺酶活性,这表明几丁质酶等糖苷水解酶在假交替单胞菌对几丁质的降解中发挥重要作用。本文还以几丁五糖作为唯一碳源培养几丁质降解菌株来模拟假交替单胞菌对自然界中几丁质的降解情况。所有测试菌株在几丁五糖中的产几丁质酶曲线趋势与菌株的生长曲线相一致,胞外几丁质酶活力随着细胞浓度的增加而升高,当细胞达到稳定期时酶活力也达到最大值,为0.4-3.2 U/mL。此外,通过基因组分析,找到了假交替单胞菌中参与几丁质降解的潜在关键酶基因。具有几丁质降解活性的假交替单胞菌至少含有一个CDC几丁质降解基因簇以及多个位于CDC基因簇以外的几丁质酶基因和LPMO基因,多个几丁质降解酶基因的存在可能有助于假交替单胞菌降解海洋环境中多种不同形式的几丁质。基于dbCAN和Pfam分析,假交替单胞菌中的几丁质酶大多数属于GH18家族,所有的LPMO均属于AA10家族。二、Pseudoalteromonas flavipulchra DSM 14401T中几丁质降解酶基因的鉴定及其功能分析Pseudoalteromonas flavipulchra DSM 14401T是一株分离自法国尼斯表层海水的模式菌株,该菌株能快速利用胶体几丁质和结晶几丁质,表现出高效的几丁质降解能力。为了研究假交替单胞菌降解几丁质的机制,本文对P.flavipulchra DSM 14401T中的几丁质降解酶基因进行了鉴定及功能分析。基因组分析表明该菌株含有4个潜在GH18家族几丁质酶基因（pflab0431、pflab0434、pflaa4287和pflaa2822）、1个潜在的GH19家族几丁质酶基因（pf;ab0889）和2个潜在AA10家族 LPMO 基因（pflab0432和pflab1147）。其中,pflab0431、pflab0432 和pflab0434构成了 CDC几丁质降解基因簇。比较转录组分析表明,除了pflab1147以外,其它6个几丁质降解酶基因均只在结晶几丁质或者N-乙酰葡萄糖胺为唯一碳源的培养基中培养DSM 14401时显着上调表达,这些基因编码的蛋白均能在以结晶几丁质为唯一碳源培养的胞外蛋白组中被检测到且具有较高的丰度,表明这些基因共同参与了菌株P.flavipulchra DSM 14401T对结晶几丁质的降解。随后,本文对这6个几丁质降解酶基因进行了异源表达和分离纯化,以研究其功能。除了LPMO基因外,其余5个预测为几丁质酶基因均成功实现了表达。生化性质分析表明,PfChib0889和PfChia2822只能降解胶体几丁质,而PfChia4287和位于CDC基因簇的PfChib0431和PfChib0434对结晶几丁质和胶体几丁质均具有降解活性,这表明几丁质酶 PfChib0431、PfChib0434 和 PfChia4287在P.flavipulchra DSM 14401T对结晶几丁质的降解中发挥着关键作用。几丁质酶PfChib0431、PfChib0434和PfChia4287均为中温酶,最适反应温度在50-60℃间,并且具有很好的热稳定性,表明它们能够稳定地存在于海洋环境中,通过不断降解海洋环境中的几丁质,为其来源菌及其他海洋细菌的生长提供营养物质。三、Pseudoalteromonas aurantia DSM 6057T中 GH18 家族新型内切几丁质酶Chi23的催化特性分析通过分析多株具有几丁质降解活性的假交替单胞菌的基因组以及对P.flavipulchra DSM 14401T中关键几丁质降解酶基因进行功能分析揭示出,类似于其他的几丁质降解细菌,GH18家族几丁质酶在假交替单胞菌对几丁质的降解中发挥着重要作用。根据序列相似性,GH18家族几丁质酶又分为A、B和C三个亚家族。目前,相较于对A亚家族外切几丁质酶的广泛研究,对B和C亚家族内切几丁质酶的研究则较少。本文从具有几丁质降解活性的模式菌株Pseudoalteromonas aurantia DSM 6057T 中鉴定出一个 GH18 家族内切几丁质酶Chi23。系统发育分析表明,Chi23属于GH18家族的B亚家族。在已表征的酶蛋白中,Chi23与来源于植物Parkia platycephala种子的几丁质酶PPL2最相似,序列相似性仅为30%,这表明Chi23可能是一个新型的GH18家族几丁质酶。序列分析表明,Chi23可能是单结构域酶蛋白,只含有一个催化结构域。随后,我们对Chi23进行了异源表达和分离纯化。凝胶过滤层析分析表明,重组酶Chi23在溶液中以单体形式存在。生化分析表明,Chi23对结晶几丁质和胶体几丁质均具有降解活性,降解产物主要为几丁二糖和几丁三糖。通过薄层色谱法分析了Chi23对几丁六糖的水解产物随反应时间的变化,揭示出Chi23是一个内切几丁质酶。不同于已报道的内切几丁质酶,Chi23是GH18家族中目前唯一报道的具有结晶几丁质降解活性的单结构域酶。几丁质酶Chi23的最适反应温度为60℃,且在60℃非常稳定,在70℃保温1 h后,仍保留40%的酶活力,最适反应pH为5.0,且能稳定存在于4.5 MNaCl中,是一个耐热、耐盐的酸性几丁质酶。四、Pseudoalteromonas aurantia DSM 6057T 中 GH18 家族新型内切几丁质酶Chi23降解几丁质及其热稳定性的结构基础尽管GH18家族内切几丁质酶的结构已经被报道,但由于缺乏相关的突变与功能分析,GH18家族内切几丁质酶的催化机制到目前为止还不清楚。为了阐明GH18家族内切几丁质酶的催化机制,本文解析了新型内切几丁质酶Chi23的晶体结构,分辨率为1.8 A。Chi23只含有一个催化结构域,其结构呈GH18家族典型的（β/α）8“TIM”桶结构。不同于其他细菌来源的GH18内切几丁质酶,Chi23不含几丁质结合结构域（CBD）和β发夹亚结构域且拥有较短的柔性loop,在结构上与真核来源的内切几丁质酶更为相似。随后,通过分子对接模建了 Chi23结合几丁五糖的结构,通过结构、突变和生化分析,揭示出Chi23中参与底物结合和催化的关键氨基酸残基。进一步的比较结构分析表明,Asn9、Asp229和Gln261是Chi23特有的底物结合残基,在Chi23催化的几丁质降解中发挥着重要作用。这3个残基在底物结合和催化中的正向累积作用促成了单结构域几丁质酶Chi23对结晶几丁质和可溶几丁质的降解,使其具有和多结构域内切几丁质酶相当的结晶几丁质降解效率。此外,首次分析了底物结合关键残基在维持GH18家族内切几丁质酶热稳定上的作用。结果表明,-1和-2位的底物结合残基（Tyr189、Asn190、Asp229、Trp260和Gln261）在维持Chi23热稳定方面发挥着重要作用。结构分析表明Asp229和Gln261通过侧链与周围残基形成氢键网络来稳定Chi23蛋白的结构。本文对GH18家族内切几丁质酶Chi23开展的研究将有助于阐明海洋几丁质酶降解几丁质的分子机理,也为几丁质酶的后续工业应用奠定了基础。
齐明明[5]（2019）在《近海海洋天然高分子有机物降解菌的筛选及多样性分析》文中提出海洋细菌在有机物矿化与地球碳循环中起着重要作用。而近海是陆地与大洋的连接带,但由于人类活动的影响以及河流径流不断向其输入丰富的营养物质,其发生的生物地球化学过程远比大洋复杂。当海洋动植物死亡后,难降解的组织成分最终埋藏于沉积物中,而在这个过程中哪些类群的细菌参与了它们在海洋原位环境中的降解是人们迫切需要解决的问题。为解答这个问题,我们选取五种海洋动植物大分子高聚物或其天然组织,分别为虾壳、鱼鳞、海带叶片、几丁质和壳聚糖。在海水表层和沉积物中进行富集,定期取样,经过对有机物降解菌的筛选,得到近海细菌资源丰富并且新种比例较高;通过高通量测序分析发现不同有机物原位富集的细菌多样性存在较大的差异,并且相同底物在海水表层与沉积物中的菌群差异较大。当样品富集30天后,在物种多样性水平上水面环境鱼鳞样品种群最丰富,而沉积物中海带样品菌群多样性最低;其中除海带优势菌群为热袍菌门外,剩余样品均以变形菌门为主,并且脱硫杆菌、黄杆菌、脱硫弧菌和弧菌占有较大比例。脱硫杆菌在全部样品中丰度较高,黄杆菌在海水表层环境样品中为优势菌群,弧菌在沉积物样品几丁质和壳聚糖中丰度最高,分别为26.3%和7.5%。研究还对不同富集时间的鱼鳞样品之间菌群结构进行比较,发现Marinifilum属在鱼鳞样品中丰度最高,并随着富集时间增加丰度逐渐减小。鱼鳞样品在不同阶段菌群结构和丰度差异明显,其中β-变形杆菌随富集时间增加丰度增加,而梭菌纲丰度减小。同时我们还将有机物作为唯一碳源在实验室条件下进行富集分析其菌群结构,得到实验室富集结果同原位富集差异明显。本研究通过对富集样品中可培养细菌的筛选,丰富了近海细菌资源。利用高通量测序分析结果反应了参与有机物降解的菌群特征,将有助于我们认识难降解大分子天然有机物在近海环境下的细菌矿化过程,研究结果为评估有机物矿化与海洋碳循环中的作用提供参考。
李飞[6]（2019）在《裂解性多糖单加氧酶产生活性氧驱动木质素生物降解》文中认为裂解性多糖单加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO）是一类广泛存在于真菌、细菌中的单铜氧化酶。当外源电子供体及氧存在时,LPMO活性中心可形成Cu-氧中间体,氧化断裂纤维素或半纤维素。但是木质素抗性屏障通常会限制酶与纤维素或半纤维素的结合,当LPMO结合受阻时,Cu-氧中间体则释放出活性氧并产生与木质素生物降解密切相关的H2O2。如果LPMO能够通过产生H2O2或者其他途径参与并促进木质素生物降解,将在木质素的生物降解以及解除碳素循环的限制因素方面意义重大,然而目前对LPMO是否参与木质素降解及其机制知之甚少。因此本论文针对LPMO是否参与木质素的生物降解及其机制如何这一科学问题,基于功能基因组学研究了LPMO与木质素降解修饰过氧化物酶（lignin-degrading and-modifying peroxidase,LDMPE）之间的可能关联。在此基础上,通过体内外实验揭示了以木质素降解真菌—白腐菌为主的LPMO参与降解木质素的途径和机制。论文主要研究结论如下:（1）真菌、细菌LPMO和LDMPE之间共发生具有普遍性对71株木质纤维素降解菌进行功能基因组比较分析结果显示:88.7%的基因组中都存在LPMO。基因组中的LPMO与木质素降解修饰酶（lignin-degrading and-modifying enzyme,LDME）之间普遍存在共发生现象,且主要发生在LPMO和LDMPE之间。98.2%的真菌基因组中LPMO和LDME共发生,其中白腐菌基因组中的LPMO和LDPME之间的共发生性具有普遍性占83.9%。细菌基因组中LPMO和LDME之间的共发生性为46.7%,主要存在于细菌,尤其放线菌门为主的LPMO与关键LDMPE—染料脱色过氧化物酶（dye-decolorizing peroxidase,DyP）之间。真菌和细菌基因组中的LPMO与LDMPE在数量上均具有较强相关性（r>0.6）,其中在具有较强木质素降解能力的白腐菌（真菌）和放线菌门（细菌）中相关性最高。表明LPMO与LDMPE在基因组层面上存在关联,尤其是在木质素降解能力最强的白腐菌中相关性最高,达到0.807,可能与木质素降解相关。（2）揭示了白腐菌LPMO介导木质素降解的不同途径及机制异源表达获得了来源于白腐真菌Pleurotus ostreatus BP3的且具有生物活性的PoLPMO9A,并且从其电子供体等方面明确了其反应特征。基于此进一步从体外驱动的LDMPE反应和增强醌-氢醌氧化还原循环所诱导的芬顿反应途径等2个方面研究了LPMO介导的木质素降解新机制。结果表明,当存在Ⅱ型过氧化物酶PsVP（真菌LDMPE）及相应的还原剂时,还原型LPMO产生的H2O2优先被PsVP利用,驱动PsVP实现单体、二聚体木质素模型化合物和木质素高分子的降解。碱木素和天然木质素高分子被LPMO-PsVP体系降解后木质素衍生物总相对丰度分别下降了17.1%和6.3%。另一方面,LPMO与漆酶等木质素酶类似,可以氢醌为电子供体将其氧化为半醌自由基,同时产生H2O2并促进Fe3+还原参与并增强醌氧化还原循环诱导的芬顿反应,显着促进羟自由基（HO·）产生。LPMO介导的芬顿反应机制是半醌驱动的芬顿反应机制。H2O2的产生和Fe3+的还原与氢醌种类、氢醌的含量及LPMO的含量有关。在500?M 2,6-二甲氧基-1,4-对苯二酚（DBQH2）条件下,HO·含量较无LPMO的氢醌氧化还原体系提高了2.77倍。由此揭示LPMO可作为辅助酶,通过驱动LDMPE反应和增强醌氧化还原循环诱导的芬顿反应等2条途径,参与木质素的降解。（3）利用链霉菌验证了LPMO体内外介导木质素降解功能以Streptomyces coelicolor M145（ScM145）为对象,从体外和体内两个方面证实了LPMO参与了生物体对木质素的降解。克隆和同源表达了2条在木质素基质存在条件下相对转录水平上调最显着（311倍）的LPMO基因Sclpmo10B和Sclpmo10D,通过接合转移获得了同源过表达LPMO的重组链霉菌Sc M145-ΔLPMO10B（+）和ScM145-ΔLPMO10D（+）。体外实验表明链霉菌来源的LPMO也能够通过驱动LDMPE反应和芬顿反应途径参与木质素降解。体内功能验证表明,较野生型链霉菌ScM145相比,过表达LPMO链霉菌ScM145-ΔLPMO10B（+）和ScM145-ΔLPMO10D（+）对木质素的降解能力显着增强,降解木质素9天后,木质素衍生物总丰度分别下降25.4%和31.0%,较野生型ScM145分别增强了2.65和3.23倍,同时过表达菌株的铁还原能力和木质素解聚释放的总酚含量也显着提高。由此证实了来自于白腐菌等的LPMO在木质素降解中可能发挥作用,且分属于不同门中的实验菌株LPMO具有同样的机制参与木质素降解途径。综上所述,本研究首次发现并揭示了LPMO以不同的反应途径及机制介导白腐菌等的木质素生物降解。相关研究结果不仅拓展LPMO的生物学功能,明晰了LPMO在木质纤维素腐朽中的新作用,也为进一步明晰木质纤维素生物降解的机制奠定了理论基础。
傅嘉敏,刘腾飞,韩晓阳[7]（2018）在《山东茶园土壤几丁质降解菌的分离、鉴定及产酶特性研究》文中进行了进一步梳理为了筛选到适合山东茶园土壤环境的几丁质降解菌,以提高土壤几丁质的降解速率,本试验以胶状几丁质为唯一碳源,从山东省泰安市茶园土壤中筛选出两株高活性几丁质降解菌,命名为J4、J17。通过生理生化、形态观测和分子鉴定,确定J4属于鞘氨醇杆菌属,J17属于芽孢杆菌属。产酶特性研究表明,最优产酶条件菌株J4为培养温度30℃、pH值7.0、转速200 r/min,J17为培养温度25～30℃、pH值7.0、转速180 r/min;混合菌株J4+J17的产酶能力比J4、J17单一菌株的产酶能力高,分别高出9%和23%。本研究结果可为后续菌剂的制备及工厂化发酵研究奠定基础。
张立阳,张幸怡,张薇,林聪,张永根[8]（2017）在《产几丁质酶菌株的筛选、鉴定及其对玉米秸秆中优势霉菌的抑制作用》文中提出本试验旨在研究利用产几丁质酶菌株抑制玉米秸秆中优势霉菌的生长,为提高秸秆利用率提供理论依据。利用胶体几丁质培养基从玉米秸秆样品中筛选出一株产几丁质酶菌株BS-1,同时将优势霉菌进行分离、纯化。通过对BS-1菌株和优势霉菌形态学观察以及16 S r DNA或18 S r DNA序列测定进行菌种鉴定。利用3,5-二硝基水杨酸比色法测定BS-1菌株发酵24、48、72、96、120、144、168 h的几丁质酶活性,以及牛津杯法检测BS-1菌株发酵液对玉米秸秆中优势霉菌的抑制作用。结果显示,玉米秸秆样品中分离出的BS-1菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,4株优势霉菌分别为卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉（Aspergillus niger）。BS-1菌株在37℃下培养120 h产几丁质酶活性达到最高值3.23 U/m L。BS-1菌株发酵液对玉米秸秆中4株优势霉菌均有明显抑制作用,抑菌圈直径分别为18.13、18.48、17.55、15.68 mm。由此可见,筛选到的产几丁质酶枯草芽孢杆菌BS-1能够有效抑制玉米秸秆中的卷枝毛霉、尖孢镰刀菌、米曲霉、黑曲霉4株优势霉菌生长。
王晓辉[9]（2016）在《海洋细菌DL-6几丁质酶和几丁质结合蛋白的生化性质与功能研究》文中研究表明几丁质是海洋环境中含量最丰富,自然界中仅次于纤维素的第二大生物质资源。微生物几丁质酶（chitinase, chi, EC3.2.1.14）降解体系可协同作用几丁质制备高附加值几丁寡糖、几丁单糖及其衍生物等,具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、降血压和降低胆固醇等生物活性,在医药、农业、工业和食品等领域具有巨大的应用潜力。海洋具有低温、高盐、低光照及寡营养等极端环境,海洋微生物为了适应海洋环境,进化了与之相适应的特点,其基因组中蕴含有价值的基因资源。因此,研究产几丁质酶系海洋微生物及其分泌几丁质酶系的生化性质及几丁质降解机制等有助于阐明海洋环境几丁质降解代谢途径,开发利用新的几丁质酶资源。本论文以胶体几丁质为唯一碳源,从大连渤海湾底泥样品中分离到高产低温几丁质酶的海洋细菌。菌株形态特征结合16SrDNA系统发育分析,鉴定该菌株属于假交替单胞菌属,命名为Pseudoalteromonas sp.DL-6。酶谱分析与荧光底物酶活性检测推测Pseudoalteromonas sp.DL-6分泌不同作用类型的几丁质酶系。通过PCR技术成功克隆Pseudoalteromonas sp.DL-6的两个几丁质酶基因chiA和chiC,一个几丁质结合蛋白基因CBP58。构建了原核表达载体pET28a-ChiA、 pET28a-ChiC与pET23b-CBP58,在大肠杆菌中实现这些基因的可溶性表达。重组蛋白ChiA、CBP58和ChiC通过Ni-NTA亲和层析,1L培养基上清液中分别纯化获得33.74mg ChiA、19.04 mg ChiC和11.90mg CBP58, ChiA和ChiC的纯化倍数和回收率为7.32和7.18及63.25%和79.37%。酶学性质研究表明几丁质酶ChiA和ChiC具有适冷特性,最适作用温度分别为20℃和30℃,在4℃以胶体几丁质为底物的Kcat/Km分别为0.56和1.83。ChiC表现出较强的耐盐特性,在5 M NaCl下仍保持最高酶活的60%以上。除几丁质外,ChiA和ChiC还可以降解Chitosan和Avicel等,具有广泛的底物适应性。酶解产物分析表明ChiA为随机作用底物释放聚合度2-6几丁寡糖的内切几丁质酶,ChiC为持续作用底物生成几丁二糖的外切几丁质酶。扫描电子显微镜观察表明CBP58对几丁质多糖链产生剥离和松解等破坏作用。底物结合实验表明CBP58对α-chitin和collodial chitin结合能力最强,β-chitin及其nano-whiskers次之,对icel具有较弱结合能力。海洋耐冷细菌Pseudoalteromonas sp.DL-6几丁质酶系统通过协同降解机制作用几丁质,不仅为生物转化生产几丁寡糖提供了新途径,也有助于进一步阐明海洋环境几丁质代谢机制。
赵洋[10]（2014）在《渐狭蜡蚧菌对南方根结线虫卵孵化抑制及其几丁质酶基因LACHI1的克隆》文中提出根结线虫（Meloidogyne spp.）病是世界范围内发生的一种重要植物寄生线虫病害。传统的化学杀线剂会对环境造成严重污染且对人畜有害,化学药剂的大量使用使植物寄生性线虫抗药性随之加强,降低其防治效果。利用天敌真菌进行防治是植物根结线虫病害可持续治理的理想途径之一。食线虫真菌是土壤中能够抑制植物寄生性线虫种群数量的重要微生物。本研究自黑龙江大豆孢囊线虫孢囊上分离到一株真菌CGMCC5328,通过形态学特征及ITS序列比较分析,鉴定该菌株为渐狭蜡蚧菌Lecanicillium attenuatum,该菌具有产生几丁质酶特性。利用NAG法测定渐狭蜡蚧菌CGMCC5328的几丁质降解酶系的活性在第4d达到酶活高峰,为16.90U/mL;利用pNP法测定其外切几丁质酶活性显示该菌在第6d达到酶活高峰,为0.59U/mL,直到第14d一直保持较高活性。活性电泳测定其几丁质酶分子量分别为79.6kDa、65.6kDa、54.1kDa、42.1kDa和32.9kDa。渐狭蜡蚧菌CGMCC5328不同浓度几丁质酶粗酶液处理南方根结线虫卵,其中第7d100%浓度的几丁质酶粗酶液对卵孵化抑制率最大,可达83.17%。该菌接种南方根结线虫卵第6d的寄生率为85.10%。克隆渐狭蜡蚧菌几丁质酶基因,为进一步明确该菌产生的几丁质酶对定居性根结类和孢囊类线虫卵孵化抑制作用提供理论依据。通过简并引物设计和RACE技术,克隆得到渐狭蜡蚧菌中的几丁质酶基因,利用生物学软件分析该基因序列及其编码的氨基酸序列。本研究首次从渐狭蜡蚧菌中克隆得到一个几丁质酶基因LACHI1,该基因DNA序列长1743bp,含3个内含子,包含1272bp开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9kD,等电点5.90。LACHI1基因编码的几丁质酶,属于糖基水解酶18家族几丁质酶。同源性比对表明该菌产生的几丁质酶与昆虫寄生真菌和食线虫真菌产生的几丁质酶有很高的同源性。以上结果表明渐狭蜡蚧菌CGMCC5328具有高效产几丁质酶特性且能够寄生南方根结线虫卵,对南方根结线虫的生物防治具有重大应用潜力。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 几丁质概述 |
| 1.1.1 几丁质介绍 |
| 1.1.2 几丁质结构及降解方法 |
| 1.2 几丁质酶(chtinase)概述 |
| 1.2.1 几丁质酶来源及理化特性 |
| 1.2.2 几丁质酶的分类 |
| 1.2.3 几丁质酶基因及结构功能 |
| 1.2.4 几丁质降解菌 |
| 1.2.5 几丁质酶的应用 |
| 1.3 益生菌的筛选 |
| 1.3.1 益生菌的定义 |
| 1.3.2 益生菌的标准及筛选 |
| 1.3.3 水产益生菌的应用 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 2 凡纳对虾肠道几丁质降解菌的分离、鉴定及筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 对虾肠道产几丁质酶菌株分离 |
| 2.2.3 菌株鉴定 |
| 2.2.4 溶血性及胞外酶活性检测 |
| 2.2.5 抗生素敏感性 |
| 2.2.6 卤虫幼体试验 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 产几丁质酶细菌分离鉴定 |
| 2.3.2 菌株酶活性检测结果 |
| 2.3.3 药敏结果 |
| 2.3.4 卤虫幼体安全性试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 假交替单胞菌 C923 基因组测序分析及几丁质酶基因克隆表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料及方法 |
| 3.2.1 菌株和培养基 |
| 3.2.2 基因组DNA提取和测序 |
| 3.2.3 基因组组装注释与分析 |
| 3.2.4 几丁质酶基因的克隆表达 |
| 3.2.5 重组蛋白的诱导和表达 |
| 3.2.6 几丁质酶基因结构分析及酶结构同源建模 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 C923 基因组测序组装信息 |
| 3.3.2 平均核苷酸同源性(ANI)分析 |
| 3.3.3 比较基因组圈图 |
| 3.3.4 chi A与 chi D基因克隆表达 |
| 3.3.5 SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.6 chi A和 chi D结构分析 |
| 3.3.7 Chi A和 Chi D蛋白三维模型 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 C923 基因组特征 |
| 3.4.2 C923 几丁质酶基因结构分析 |
| 3.5 小结 |
| 4 C923 对凡纳对虾的生长、酶活力及肠道菌群影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和培养基 |
| 4.2.2 C923 细胞菌液制备 |
| 4.2.3 试验饲料制作 |
| 4.2.4 对虾养殖试验 |
| 4.2.5 样品采集及生长指标测定 |
| 4.2.6 酶活力测定 |
| 4.2.7 几丁质酶活力测定 |
| 4.2.8 肠道菌群基因组提取及PCR扩增 |
| 4.2.9 高通量测序和测序数据分析 |
| 4.2.10 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 生长指标 |
| 4.3.2 血清免疫酶活力 |
| 4.3.3 肝胰腺酶活力 |
| 4.3.4 肝胰腺几丁质酶活力 |
| 4.3.5 肠道菌群多样性分析 |
| 4.3.6 几丁质及C923 对肠道菌群结构组成影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 几丁质及C923 对凡纳对虾生长和酶活力的影响 |
| 4.4.2 几丁质和C923 对凡纳对虾肠道菌群影响 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 1.1 几丁质的研究历程 |
| 1.1.1 几丁质 |
| 1.1.2 几丁质酶 |
| 1.1.3 几丁寡糖 |
| 1.1.4 虾、蟹壳等水产废弃物 |
| 1.2 尖孢镰刀菌 |
| 1.3 本文研究的目的和意义 |
| 2.可分解几丁质菌株的筛选、分离与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 相关试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胶体几丁质的制备 |
| 2.2.2 制备相关几丁质培养基 |
| 2.2.3 从虾壳中获取待筛选的混合菌株 |
| 2.2.4 对获取的混合菌株进行初筛 |
| 2.2.5 对几丁质固体培养基上生长的菌株进行复筛 |
| 2.2.6 对复筛的优势菌株进行液体培养基发酵培养 |
| 2.2.7 测定优势菌株的几丁质分解能力 |
| 2.2.8 对筛选出的优势菌株进行种属鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 从虾壳中获取的混合菌株的筛选情况 |
| 2.3.2 3 株菌株对几丁质的分解能力 |
| 2.3.3 ZJU-1种属鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3.不动杆菌ZJU-1对虾、蟹壳分解效果的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株ZJU-1培养 |
| 3.2.2 制备虾、蟹壳、粗制几丁质、几丁质液体培养基 |
| 3.2.3 测定不动杆菌ZJU-1对虾、蟹壳的分解能力 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 不动杆菌ZJU-1对虾、蟹壳的分解能力 |
| 3.4 讨论 |
| 4.不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对尖孢镰刀菌生长的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 制备相关培养基 |
| 4.2.2 相关菌株培养 |
| 4.2.3 制备相关不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液 |
| 4.2.4 制备含不同浓度不动杆菌 ZJU-1 几丁质发酵液的 PDA 培养基 |
| 4.2.5 测定不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对两种专化型尖孢镰刀菌生长的影响 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 尖孢镰刀菌番茄专化型的生长情况 |
| 4.3.2 尖孢镰刀菌黄瓜专化型的生长情况 |
| 4.4 讨论 |
| 5.不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对番茄和黄瓜生长的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验设计 |
| 5.2.2 制备不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液 |
| 5.2.3 种植管理方法 |
| 5.2.4 测定番茄和黄瓜茎粗、株高、鲜重 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对番茄茎粗、株高、鲜重的影响 |
| 5.3.2 不动杆菌ZJU-1几丁质发酵液对黄瓜茎粗、株高、鲜重的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 6.总结和展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 近海原位培养 |
| 1.2 富集菌群的基因组DNA提取和16S rRNA基因的高通量测序 |
| 1.3 数据分析与处理 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 天然有机物原位富集样品30 d后表观描述 |
| 2.2 天然有机物原位富集降解菌群的细菌α-多样性分析 |
| 2.3 各种原位富集物的细菌群落组成 |
| 2.4 不同有机物富集菌群群落间相似性分析 |
| 2.5 不同环境下细菌群落差异性分析 |
| 2.6 讨论 |
| 3 结论 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景和立题依据 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 几丁质 |
| 1.1.2 海洋微生物对几丁质的降解 |
| 1.1.3 假交替单胞菌属 |
| 1.1.4 几丁质降解酶 |
| 1.1.5 GH18家族几丁质酶 |
| 1.1.6 GH19家族几丁质酶 |
| 1.1.7 多糖裂解单加氧酶(LPMO) |
| 1.1.8 几丁质酶的应用 |
| 1.2 立题依据与研究内容 |
| 1.2.1 立题依据 |
| 1.2.2 研究内容 |
| 第二章 假交替单胞菌属的几丁质降解能力分析及其在海洋几丁质降解中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 样品和菌株 |
| 2.2.2 培养基的配制 |
| 2.2.3 主要试剂与试剂盒 |
| 2.2.4 主要仪器与耗材 |
| 2.2.5 数据库与分析软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 海洋细菌菌株的分离与鉴定 |
| 2.3.2 胶体几丁质的制备 |
| 2.3.3 假交替单胞菌几丁质降解能力的分析 |
| 2.3.4 几丁质酶活的测定 |
| 2.3.5 薄层色谱法(TLC)分析酶解产物 |
| 2.3.6 生长曲线与产酶曲线的测定 |
| 2.3.7 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析 |
| 2.3.8 假交替单胞菌株中与几丁质降解相关基因的分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 中国黄海样品中假交替单胞菌的分离与鉴定 |
| 2.4.2 假交替单胞菌的16S rRNA基因序列分析 |
| 2.4.3 假交替单胞菌属模式菌株几丁质降解能力的分析 |
| 2.4.4 假交替单胞菌属非模式菌株几丁质降解能力的分析 |
| 2.4.5 假交替单胞菌的胞外酶液的几丁质酶活性分析 |
| 2.4.6 几丁质降解菌对胶体几丁质的降解产物 |
| 2.4.7 假交替单胞菌对几丁寡糖的利用能力 |
| 2.4.8 假交替单胞菌中几丁质降解相关基因 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 菌株Pseudoalteromonas flavipulchra DSM 14401~T中几丁质降解基因的鉴定及其功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验菌株、载体与引物 |
| 3.2.2 培养基的配制 |
| 3.2.3 主要试剂与试剂盒 |
| 3.2.4 主要仪器与耗材 |
| 3.2.5 数据库与分析软件 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株的培养与保藏 |
| 3.3.2 胶体几丁质的制备 |
| 3.3.3 转录组测序 |
| 3.3.4 胞外蛋白组分析 |
| 3.3.5 基因克隆及表达质粒构建 |
| 3.3.6 重组蛋白的异源表达及分离纯化 |
| 3.3.7 变性蛋白电泳(SDS-PAGE) |
| 3.3.8 蛋白浓度的测定 |
| 3.3.9 酶活测定 |
| 3.3.10 酶的最适反应温度及最适pH测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 菌株P.flavipulchra DSM 14401~T对结晶几丁质的降解能力 |
| 3.4.2 菌株P.flavipulchra DSM 14401~T的转录组分析 |
| 3.4.3 菌株P.flavipulchra DSM 14401~T的胞外蛋白组分析 |
| 3.4.4 菌株P.flavipulchra DSM 14401~T中几丁质酶基因的异源表达及酶学性质 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 GH18家族新型内切几丁质酶Chi23的催化特性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.2.1 实验菌株、载体与引物 |
| 4.2.2 培养基的配制 |
| 4.2.3 主要试剂与试剂盒 |
| 4.2.4 主要仪器与耗材 |
| 4.2.5 主要分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 基因克隆 |
| 4.3.2 重组蛋白的异源表达与纯化 |
| 4.3.3 SDS-PAGE检测 |
| 4.3.4 几丁质酶活性电泳 |
| 4.3.5 蛋白浓度的测定 |
| 4.3.6 酶学性质分析 |
| 4.3.7 薄层色谱法(TLC)分析Chi23对不同几丁质底物的降解产物 |
| 4.3.8 凝胶过滤色谱分析Chi23对几丁六糖的降解产物 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Chi23的序列分析 |
| 4.4.2 Chi23的异源表达及分离纯化 |
| 4.4.3 Chi23的酶学性质 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 GH18家族新型内切几丁质酶Chi23降解几丁质及热稳定性的结构基础 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料、试剂与仪器 |
| 5.2.1 实验菌株、载体与引物 |
| 5.2.2 主要试剂与试剂盒 |
| 5.2.3 主要仪器与耗材 |
| 5.2.4 主要分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 Chi23突变体的构建 |
| 5.3.2 蛋白的异源表达与纯化 |
| 5.3.3 蛋白浓度的测定 |
| 5.3.4 酶的动力学参数的测定 |
| 5.3.5 Chi23及突变体二级结构的比较分析 |
| 5.3.6 Chi23及突变体的T_m值的测定 |
| 5.3.7 蛋白的结晶及数据收集 |
| 5.3.8 晶体结构的解析及分子对接 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Chi23的结晶和整体结构分析 |
| 5.4.2 Chi23与底物(GlcNAc)_5的分子对接 |
| 5.4.3 Chi23中关键氨基酸残基的突变分析 |
| 5.4.4 Chi23与其他GH18家族内切几丁质酶的结构比较分析 |
| 5.4.5 Chi23热稳定性的结构基础 |
| 5.4.6 Chi23及其同源蛋白代表了一类新的GH18家族内切几丁质酶 |
| 5.5 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 一、本文取得的创新性结果 |
| 二、本论文的不足之处与研究展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 海洋微生物资源 |
| 1.2 海洋微生物重要性 |
| 1.3 海洋细菌多样性 |
| 1.4 近海可培养细菌 |
| 1.5 细菌的鉴定与分类 |
| 1.6 细菌多样性分析方法 |
| 1.7 本文研究的目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 使用的培养基与仪器 |
| 2.1.3 常用溶液与引物 |
| 2.1.4 序列分析处理软件与网址 |
| 2.2 基本方法 |
| 2.2.1 细菌单菌落基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 16S rRNA基因组序列PCR反应扩增体系与程序 |
| 2.2.3 环境样品基因组DNA的提取 |
| 2.2.4 细菌群落多样性分析流程 |
| 2.3 近海可培养细菌的多样性分析方法 |
| 2.3.1 近海可培养细菌的富集和分离鉴定 |
| 2.3.2 近海可培养细菌系统发育树构建 |
| 第3章 厦门近海有机物降解菌的分离纯化 |
| 3.1 实验室有机物降解菌获取情况 |
| 3.1.1 总菌株资源获取情况 |
| 3.1.2 潜在新种的分析鉴定 |
| 3.2 分离菌株功能性验证 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 近海有机物原位富集菌群多样性分析 |
| 4.1 不同有机物原位富集30天多样性分析 |
| 4.1.1 样品DNA提取和16S rRNA基因高通量的测序 |
| 4.1.2 原位富集菌群的α-多样性分析 |
| 4.1.3 原位富集样品菌群的Beta多样性分析 |
| 4.1.4 原位富集样品的细菌群落组成分析 |
| 4.1.5 不同有机物富集菌群群落间相似性分析 |
| 4.1.6 不同生境下细菌群落差异性分析 |
| 4.2 不同富集时间鱼鳞样品菌群结构分析 |
| 4.2.1 样品DNA提取和16S rRNA基因高通量的测序 |
| 4.2.2 鱼鳞样品原位富集后菌群α-多样性分析 |
| 4.2.3 鱼鳞样品原位富集细菌群落组成 |
| 4.2.4 不同富集时间鱼鳞样品群落组成差异性分析 |
| 4.2.5 鱼鳞样品细菌群落演替分析 |
| 4.3 本章小结 |
| 第5章 实验室条件下有机物富集菌群多样性分析 |
| 5.1 样品DNA提取和16S rRNA基因高通量的测序 |
| 5.2 实验室条件下富集样品菌群的α-多样性分析 |
| 5.3 实验室条件下富集样品细菌群落组成分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文主要缩略语 |
| 1 绪论 |
| 1.1 裂解性多糖单加氧酶 |
| 1.1.1 裂解性多糖单加氧酶功能多样性 |
| 1.1.2 裂解性多糖单加氧酶结构特点及催化机制 |
| 1.1.3 裂解性多糖单加氧酶电子供体及与氧化还原酶之间的相互作用 |
| 1.1.4 裂解性多糖单加氧酶过氧化氢产生机制 |
| 1.2 木质素的生物降解 |
| 1.2.1 木质素降解修饰酶系 |
| 1.2.2 小分子活性氧反应 |
| 1.3 木质纤维素基质中真菌LPMO的分泌和表达 |
| 1.4 LPMO的比较基因组学研究 |
| 1.5 课题研究的目的、研究思路和研究内容 |
| 2 木质纤维素降解菌比较基因组研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 基因组数据来源 |
| 2.2.2 基因功能注释 |
| 2.2.3 LPMO和木质素降解修饰过氧化物酶进化树构建 |
| 2.2.4 数据分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 木质纤维素降解菌的选择及生物多样性系统分类 |
| 2.3.2 碳水化合物活性酶CAZyme比较 |
| 2.3.3 基因组纤维素、半纤维素水解酶比较 |
| 2.3.4 基因组辅助活性家族蛋白(AA)比较 |
| 2.3.5 裂解性多糖单加氧酶和木质素降解修饰酶比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 白腐菌LPMO的表达及性质 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.2.4 引物设计 |
| 3.2.5 RNA的提取及cDNA的合成 |
| 3.2.6 RNA的检测 |
| 3.2.7 Polpmo9A全长基因的克隆 |
| 3.2.8 重组表达载体pPICzαA-Polpmo9A的构建 |
| 3.2.9 PoLPMO9A蛋白在毕赤酵母中的异源表达 |
| 3.2.10 重组蛋白PoLPMO9A的纯化 |
| 3.2.11 重组蛋白PoLPMO9A活性鉴定 |
| 3.2.12 重组蛋白PoLPMO9A电子供体的筛选 |
| 3.2.13 PoLPMO9A与纤维素酶协同对多糖的氧化降解 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 裂解性多糖单加氧酶Polpmo9A基因克隆及载体构建 |
| 3.3.2 PoLPMO9A蛋白序列分析及比对 |
| 3.3.3 PoLPMO9A在毕赤酵母中的表达及纯化 |
| 3.3.4 MALDI-TOF/TOF MS分析重组PoLPMO9A活性 |
| 3.3.5 PoLPMO9A芳香族酚类化合物电子供体的筛选 |
| 3.3.6 PoLPMO9A与纤维素酶协同对多糖的氧化降解 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 白腐菌LPMO驱动的木质素体外降解机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 多功能过氧化物酶PsVP的表达、纯化及酶活力测定 |
| 4.2.5 抗坏血酸及PoLPMO9A浓度对抗坏血酸氧化和过氧化氢产生的影响 |
| 4.2.6 PoLPMO9A驱动PsVP活性对木质素的降解及分析 |
| 4.2.7 微晶纤维素对LPMO的吸附试验 |
| 4.2.8 重组酶底物动力学研究 |
| 4.2.9 PoLPMO9A对氢醌的氧化及含量测定 |
| 4.2.10 过氧化氢含量的测定 |
| 4.2.11 螯合Fe~(3+)还原的测定 |
| 4.2.12 HO·含量的测定 |
| 4.2.13 PoLPMO9A增强的芬顿反应对木质素模型化合物的氧化 |
| 4.2.14 电子顺磁共振(EPR)光谱测定半醌自由基 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PoLPMO9A驱动的多功能过氧化物酶对木质素的降解 |
| 4.3.2 LPMO驱动的多功能过氧化物酶对木质素降解机制 |
| 4.3.3 LPMO介导氢醌氧化的芬顿反应 |
| 4.3.4 LPMO增强醌-氢醌氧化还原循环诱导的芬顿反应机制 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 链霉菌LPMO驱动的木质素体内外降解功能验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 试剂 |
| 5.2.4 天蓝色链霉菌基因组中裂解性多糖单加氧酶信息分析 |
| 5.2.5 天蓝色链霉菌裂解性多糖单加氧酶相对转录水平 |
| 5.2.6 天蓝色链霉菌DNA及裂解性多糖单加氧酶基因的PCR扩增 |
| 5.2.7 重组链霉菌表达载体的构建 |
| 5.2.8 大肠杆菌-天蓝色链霉菌属间接合转移 |
| 5.2.9 过表达LPMO天蓝色链霉菌的诱导培养、蛋白纯化及SDS-PAGE分析 |
| 5.2.10 ScLPMO10D活性鉴定 |
| 5.2.11 ScLPMO10D体外增强醌-氢醌氧化还原循环诱导的芬顿反应 |
| 5.2.12 ScLPMO10D驱动染料脱色过氧化物酶对木质素的降解 |
| 5.2.13 过表达链霉菌总木质素降解修饰过氧化物酶活力及还原力测定 |
| 5.2.14 过表达链霉菌对可溶性碱木素的降解及表征 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 天蓝色链霉菌基因组裂解性多糖单加氧酶分析 |
| 5.3.2 木质素存在条件下天蓝色链霉菌裂解性多糖单加氧酶相对转录水平 |
| 5.3.3 天蓝色链霉菌Sclpmo10B和 Sclpmo10D基因获取及表达载体构建 |
| 5.3.4 天蓝色链霉菌Sclpmo10B和 Sclpmo10D蛋白的表达及纯化 |
| 5.3.5 ScLPMO10D体外增强醌-氢醌氧化还原循环诱导的芬顿反应 |
| 5.3.6 ScLPMO10D体外驱动染料脱色过氧化物酶对木质素的降解 |
| 5.3.7 过表达LPMO链霉菌对木质素的降解 |
| 5.3.8 过表达链霉菌总木质素降解修饰过氧化物酶和还原力的测定 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 全文总结 |
| 6.1 主要研究结论 |
| 6.2 主要创新性 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录2 PoLPMO9A核苷酸序列及蛋白质序列 |
| 附录3 ScLPMO10B核苷酸序列及蛋白质序列 |
| 附录4 ScLPMO10D核苷酸序列及蛋白质序列 |
| 附录5 基因组碳水化合物活性酶数量及分布 |
| 附录6 基因组纤维素和半纤维素酶数量及分布 |
| 附录7 基因组辅助活性蛋白数量及分布 |
| 附录8 LPMO和 LDME基因的相关性分析数据 |
| 附录9 PoLPMO9A驱动PsVP活性对照试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 土样采集 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 菌株的初筛 |
| 1.2.2 菌株的复筛 |
| 1.2.3 菌落形态及生理生化鉴定 |
| 1.2.4 分子鉴定 |
| 1.2.5 SDS-PAGE蛋白聚类 |
| 1.2.6 产酶条件优化 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株的筛选 |
| 2.1.1 初筛 |
| 2.1.2 复筛 (1) |
| 2.2 菌株的鉴定 |
| 2.2.1 菌落形态鉴定 |
| 2.2.2 菌株生理生化鉴定 |
| 2.2.3 菌株分子鉴定 |
| 2.3 菌株产酶特性研究 |
| 2.3.1 pH值对终选菌株产酶能力的影响 |
| 2.3.2 温度对终选菌株产酶能力的影响 |
| 2.3.3 转速对终选菌株产酶能力的影响 |
| 2.3.4 混合菌株对几丁质产酶能力的影响 |
| 3 讨论与结论 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 玉米秸秆及菌株 |
| 1.2 主要培养基及试剂配制 |
| 1.3 拮抗菌株及优势霉菌的分离、纯化 |
| 1.4 产几丁质酶菌株的筛选 |
| 1.5 霉菌的形态学观察 |
| 1.6 优势霉菌、产几丁质酶菌株的分子生物学鉴定 |
| 1.7 几丁质酶活性的测定 |
| 1.7.1 NAG标准曲线的建立 |
| 1.7.2 几丁质酶活性测定 |
| 1.8 抑菌能力的测定 |
| 1.8.1 产几丁质酶菌发酵上清液及霉菌孢子液的制备 |
| 1.8.2 抑菌试验 |
| 1.9 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 几丁质酶高产菌筛选鉴定 |
| 2.1.1 PCR扩增结果 |
| 2.1.2 测序结果及同源性分析 |
| 2.2 优势霉菌的筛选鉴定 |
| 2.2.1 优势霉菌的分离纯化及形态学观察 |
| 2.2.2 优势霉菌的18 s r DNA序列测定 |
| 2.2.3 测序结果及同源性分析 |
| 2.3 几丁质酶高产菌酶活性测定 |
| 2.3.1 NAG标准曲线的建立 |
| 2.3.2 不同培养时间几丁质酶活性 |
| 2.4 几丁质酶高产菌抑制霉菌效果测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 产几丁质酶菌株BS-1的筛选、鉴定 |
| 3.2 BS-1产几丁质酶活性的测定 |
| 3.3 BS-1发酵液对玉米秸秆中优势霉菌的抑制效果 |
| 4 结论 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 几丁质 |
| 1.1.1 几丁质的结构 |
| 1.1.2 几丁质的降解 |
| 1.2 几丁质酶 |
| 1.2.1 几丁质酶的来源和分类 |
| 1.2.2 几丁质酶的空间结构与催化机制 |
| 1.2.3 几丁质酶酶活测定方法 |
| 1.2.4 酶解产物的检测分析 |
| 1.2.5 几丁质酶的应用 |
| 1.3 几丁质结合蛋白(CBP)的研究 |
| 1.3.1 CBP的定义与分类 |
| 1.3.2 CBP结构与功能 |
| 1.4 海洋环境几丁质酶研究进展 |
| 1.5 论文的研究思路和内容 |
| 2 产低温几丁质酶菌株的筛选与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 胶体几丁质和培养基的配制 |
| 2.2.5 产酶菌株的筛选 |
| 2.2.6 产酶菌株的鉴定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 产酶菌株的筛选结果 |
| 2.3.2 产酶菌株16S rDNA序列分析与系统发育树的构建 |
| 2.3.3 产酶菌株最适温度的研究 |
| 2.3.4 产酶菌株生长曲线与产酶曲线的测定 |
| 2.3.5 菌株DL-6粗酶液最适反应温度和温度稳定性的测定 |
| 2.3.6 SDS-PAGE及酶谱分析 |
| 2.3.7 菌株DL-6几丁质酶系的初步研究 |
| 2.4 小结 |
| 3 几丁质酶系基因的克隆与序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.2.5 几丁质酶系基因的克隆 |
| 3.2.6 几丁质酶系基因的生物信息学分析 |
| 3.2.7 同源模建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 几丁质酶系基因全序列的克隆 |
| 3.3.2 几丁质酶系基因及其编码氨基酸序列分析 |
| 3.3.3 chiA和chiC基因编码氨基酸序列与保守氨基酸残基的分析 |
| 3.3.4 同源模建ChiA和ChiC的三维结构分析保守的催化氨基酸 |
| 3.3.5 CBP58编码氨基酸序列保守氨基酸残基的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 几丁质酶系蛋白的重组表达与纯化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 质粒 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 几丁质酶系基因表达质粒的构建 |
| 4.2.6 重组质粒的菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定 |
| 4.2.7 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 chiA/chiC/CBP58基因表达质粒的构建 |
| 4.3.2 ChiA/ChiC/CBP58在大肠杆菌内的重组表达 |
| 4.3.3 ChiA/ChiC/CBP58的Ni-NTA亲和纯化 |
| 4.3.4 重组蛋白的酶谱分析 |
| 4.3.5 4-甲基伞形酮荧光底物检测ChiA和ChiC酶活性 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 几丁质酶ChiA和ChiC的生化性质表征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 4-甲基伞形酮荧光底物测定酶活 |
| 5.2.4 铁氰化钾法(Schales法)测定还原糖含量 |
| 5.2.5 酶学性质表征 |
| 5.2.6 酶动力学参数的测定 |
| 5.2.7 底物特异性 |
| 5.2.8 高效液相色谱(HPLC)分析酶的作用方式 |
| 5.2.9 酶的降解产物分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组蛋白ChiA和ChiC酶学性质研究 |
| 5.3.2 酶动力学参数的测定 |
| 5.3.3 ChiA和ChiC的底物特异性 |
| 5.3.4 ChiA和ChiC的降解模式 |
| 5.3.5 ChiA和ChiC降解产物的分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 几丁质结合蛋白CBP58底物结合与协同降解作用研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 CBP58的功能研究 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 扫描电子显微镜(SEM)观察CBP58底物结合 |
| 6.3.2 CBP58与不同底物结合活性测定 |
| 6.3.3 几丁质酶系协同降解机制研究 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A Pseudoalteromonas sp.DL-6的16S rDNA序列 |
| 附录B 几丁质酶chiA的序列 |
| 附录C 几丁质酶chiC的序列 |
| 附录D 几丁质结合蛋白CBP58的序列 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 根结线虫的习性与危害 |
| 2 根结线虫病害传统防治 |
| 2.1 农业防治 |
| 2.2 物理化学防治 |
| 3 根结线虫生物防治研究 |
| 4 渐狭蜡蚧菌L.attenuatum的研究进展 |
| 5 几丁质酶与根结线虫卵作用的研究 |
| 5.1 几丁质酶 |
| 5.2 几丁质酶基因 |
| 5.3 几丁质酶对根结线虫卵的影响 |
| 第二章 渐狭蜡蚧菌CGMCC5328的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 渐狭蜡蚧菌CGMCC5328的形态学鉴定 |
| 2.2 菌株rDNA-ITS序列分子鉴定和系统发育分析 |
| 3 结论 |
| 第三章 渐狭蜡蚧菌CGMCC5328对南方根结线虫卵孵化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 渐狭蜡蚧菌对南方根结线虫卵的寄生 |
| 2.2 几丁质降解酶系活性测定 |
| 2.3 几丁质外切酶活性测定 |
| 2.4 几丁质酶活性染色 |
| 2.5 培养滤液对南方根结线虫卵孵化抑制的影响 |
| 3 结论 |
| 第四章 渐狭蜡蚧菌几丁质酶基因的克隆和系统发育分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 LACHI1基因全序列的获得 |
| 2.2 LACHI1基因的生物信息学分析 |
| 2.3 不同真菌来源几丁质酶的系统发育分析 |
| 3. 结论 |
| 第六章 讨论与展望 |
| 1 讨论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文 |
