何如怡[1]（2021）在《基于Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的核酸检测方法研究》文中研究说明核酸检测是分子诊断的主要手段之一,在卫生保健、环境监测、生物安全以及食品分析等许多领域发挥了重要的作用,开发操作简单成本低的高灵敏度、高特异性核酸检测技术具有重要意义。近年来,基于CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system）系统发展的一系列高灵敏度和高专一性的核酸检测技术在临床诊断上取得了显着的进展,然而Cas效应蛋白需要使用RNA作为向导,并且依赖特殊序列,比如PAM（Protospacer adjacent motif）或者PFS（Protospacer flanking site）,来识别靶位点,这在一定程度上限制了其应用。与Cas效应蛋白类似,Argonaute（Ago）也是一类以核酸作为向导的核酸内切酶。PfAgo（Pyrococcus furiosus Argonaute）是一种来源于古生菌的原核Ago蛋白质,可以利用具有5’磷酸基团的单链DNA（大于15 nt）作为向导,从向导的5’端开始的第10和11个核苷酸之间的位点切割互补的单链DNA。本研究发现PfAgo切割产生的单链DNA能够作为向导引发新的酶切反应。基于此发现,我们建立了一种具有高灵敏度、高特异性和多重检测能力的核酸检测方法,通过对临床核酸样本的检测证明了该方法的可行性和应用潜力。随后,我们将该方法加以改进并用于SARS-CoV-2的核酸检测。同时,本研究利用向导的长度对PfAgo切割活性的影响,将极短PCR技术与PfAgo结合起来开发了另一种简单快速的核酸检测方法。综上,本研究通过深入探究PfAgo的酶学性质开发了三种高灵敏度、高特异性、高准确性的核酸检测技术,为分子诊断提供了新的方法选择,并为Ago蛋白的应用提供了新的思路。本论文的具体内容如下:1.PfAgo蛋白质的表达纯化及性质研究。根据PfAgo耐高温的性质,利用80°C水浴处理和Ni-NTA亲和纯化获得了高纯度PfAgo蛋白质。对PfAgo性质的进一步研究发现向导DNA（guide DNA,g DNA）与靶DNA（target DNA,t DNA）的单碱基不匹配会显着影响PfAgo对靶的切割效率。此外,g DNA 3’端的突出对PfAgo的切割活性没有影响,5’端突出会影响PfAgo的切割活性和切割位点。本研究发现PfAgo切割单链DNA产生的具有5’磷酸基团的单链DNA可以作为新的g DNA介导PfAgo靶向切割与之互补的单链DNA,表明PfAgo的切割反应可以传递。2.结合PfAgo切割反应可传递的特点和PCR技术开发基于PfAgo的核酸检测方法（PAND）。设计三条分别靶向待检测双链DNA不同位置的g DNAs（输入g DNAs）介导PfAgo切割双链DNA靶,并从中释放出一条单链DNA,作为新的g DNA（生成g DNA）与PfAgo蛋白结合,靶向切割互补的分子信标,从而产生荧光信号,实现检测的目的。该方法检测灵敏度可以达到1.6 a M、能够识别单碱基突变和实现五通道检测。对模拟样本和临床样本的检测结果表明该方法可以应用于16S r DNA、结核杆菌和乙肝病毒耐药性突变、BRAC1基因的单核苷酸位点多态性位点、循环肿瘤DNA以及人乳头瘤病毒（HPV）多亚型分型的检测。3.结合逆转录PCR技术和PfAgo切割反应开发了基于PfAgo的SARS-CoV-2检测（SARS-CoV-2 PAND）。通过筛选最佳的PfAgo/g DNA复合物,仅利用单条输入g DNA建立了高灵敏度、高专一性、高准确度的SARS-CoV-2核酸诊断方法,检测下限可以达到1拷贝每反应。该方法缩短了荧光定量PCR仪的使用时间,能够有效解决大规模检测时荧光定量PCR仪不足的问题。对44例新冠病毒疑似感染者的咽拭子核酸提取物的检测结果与荧光定量逆转录PCR（RT-q PCR）一致,同时对36例阳性样品进行了D614G突变检测,证明SARS-CoV-2 PAND可以用于SARS-CoV-2及其突变体的检测。4.基于PfAgo的切割活性只能由长度大于15 nt的g DNA触发的性质开发了结合极短PCR技术和PfAgo的核酸检测方法（USPCRP）。利用具有5’磷酸基团的短引物启动的极短PCR的扩增产物作为g DNA来介导PfAgo切割分子信标,进行DNA检测,该方法无需额外加入g DNA,具有100 a M的检测灵敏度和序列特异性。利用该方法成功对临床样本的HPV16E6基因和SARS-CoV-2 ORF1ab基因进行了检测,表明该方法能够用于临床诊断。
王素华[2]（2020）在《HBsAg阳性孕妇绒毛组织中HBV标记物和载脂蛋白H关系探讨》文中认为目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）宫内感染机制较为复杂,有研究表明,载脂蛋白H（apolipoprotein H,Apoh）参与并介导了HBV感染肝细胞,在病毒复制期与乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen,HBsAg）的结合力更强。本研究通过检测HBsAg阳性孕妇血液和早期流产绒毛组织的乙肝标志物水平,明确HBsAg阳性孕妇早期胎儿的乙肝感染情况,调查HBV宫内感染的风险因素,并探讨Apoh的表达与宫内感染的关系。方法选取2017年1月至2018年5月在深圳市第三人民行早期流产的41例HBsAg阳性孕妇为研究对象,留取孕妇绒毛组织和血液样本。应用荧光探针法检测绒毛组织和血浆中的HBV DNA水平及HBV血清学标记物,通过免疫组化方法检测绒毛组织中神经胶质细胞缺失蛋白1（glial cells missing 1,GCM1）、HBsAg、Apoh的表达,所得数据采用统计软件进行比较分析。结果绒毛组织HBV DNA的阳性率为29.27%（12/41）,显着低于血液中HBV DNA的阳性率（53.66%,22/41）,差异具有统计学意义（X2=5.025,P=0.043）;绒毛组织HBV DNA阳性孕妇血液中的HBsAg、HBe Ag和HBV DNA含量均显着高于绒毛组织HBV DNA阴性组的孕妇,差异均具有统计学意义（P值分别为0.002、0.001、0.000）;绒毛组织中,HBsAg和Apoh阳性率分别为17.07%（7/41）和19.51%（8/41）;Apoh在绒毛组织HBsAg阳性组的表达率显着高于HBsAg阴性组,差异具有统计学意义（X2=14.487,P=0.000）,但Apoh在绒毛组织HBV DNA阳性组的表达率与HBV DNA阴性组差异不显着（X2=0.325,P=0.568）;Apoh在血浆HBV DNA阳性孕妇中的表达率显着高于血浆HBV DNA阴性组,差异具有统计学意义（X2=4.578,P=0.032）,但Apoh在血浆HBe Ag阳性和血浆HBe Ag阴性孕妇中的表达率差异不显着（X2=0.577,P=0.448）。结论HBsAg阳性孕妇早期流产的绒毛组织可检测出HBV DNA、HBsAg和Apoh的表达;Apoh的表达与绒毛组织HBsAg阳性和血浆HBV DNA阳性密切相关;绒毛组织HBV DNA阳性孕妇血液中的HBsAg、HBe Ag和HBV DNA含量显着升高。
李鑫娜[3]（2020）在《重组酶介导扩增技术检测EV71、CVA16及结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究》文中研究指明重组酶介导扩增（RAA）技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术,具有我国自主知识产权,因其具有快速、灵敏、特异、高效、仪器设备要求低、测试成本低、操作简单的特点,非常适合于偏远地区和现场的快速筛查。RAA技术从发明至今,已经应用于多种病原微生物的检测,主要检测病原体的特异性序列,但是缺乏内部扩增质控。探针介导的重组酶扩增（PDRA）是基于RAA技术的改良,利用单探针和单引物进行SNP位点识别,利用该方法检测了 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）A1298C的SNP位点,证明该技术具有检测SNP位点和点突变的潜力。规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白13a（Cas13a）系统,是一种新的RNA靶向系统,Cas13a具有RNase活性,当crRNA与Cas13a蛋白形成复合物,然后识别靶标RNA,特异性切割靶标RNA,同时激活Cas13a的非特异性切割活性,CRISPR-Cas13a系统被开发为一种核酸检测工具,尤其与RPA技术结合后,可以检测单拷贝核酸以及单碱基突变。手足口病是由肠道病毒感染引起的儿童急性传染病,已经成为我国的一个重要的公共卫生问题,肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CVA16）是引起手足口病的两种主要病原体,因此建立病原体的快速检测方法,对疾病的早发现、早诊断和早治疗以及对疫情防控具有重要意义。结核病特别是耐药结核病给我国造成了极大的疾病负担,而利福平在结核治疗中非常重要,如果结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）发生利福平耐药,会增加治疗难度和治疗费用,增加结核传播风险。有许多关于结核分枝杆菌利福平耐药的机制研究,最主要的是利福平作用靶标基因rpoB基因发生突变,从而造成细菌耐药。因此,需要建立一种快速检测rpoB基因突变的方法。本文基于RAA技术,PDRA技术,CRISPR-Cas13a技术,建立检测EV71和CVA16的RT-RAA方法并进行评价,建立检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变的PDRA方法、RAA-Cas13a方法并进行评价。第一部分逆转录重组酶介导扩增方法应用于肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测目的:本研究基于RAA技术分别建立肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CVA16）的两种灵敏、特异的快速检测方法。第一种是基于恒温荧光检测系统的含内参的双重实时荧光RT-RAA方法（real time RT-RAA）,第二种是结合侧流层析试纸条的RT-RAA 方法（LFSRT-RAA）。方法:（1）从GenBank数据库下载EV71和CVA16的基因序列,序列比对后选择VPI基因的保守区作为RAA引物和探针的设计区域,根据设计原则设计数对引物对,通过实时荧光法筛选最佳引物对,建立实时荧光RAA方法。（2）加入内参探针和内参质粒,建立含内参的双重实时荧光RT-RAA方法。（3）进行逆转录酶、反应温度的优化从而确定最佳反应条件。（4）依据实时荧光法筛选的最佳引物和探针序列,按照试纸条法要求进行修饰,建立侧流层析试纸条RT-RAA方法。（5）采用含EV71、CVA16的VP1保守基因的重组质粒标准品分析两种方法的灵敏性,采用其他肠道病毒分析特异性。（6）采用已建立的双重实时荧光RT-RAA方法、侧流层析试纸条RT-RAA方法和文献报道的实时荧光RT-qPCR方法检测445份手足口病疑似病例的临床标本,对方法的检测效能进行评价。结果:建立了 EV71和CVA16的含内参的双重实时荧光RT-RAA方法,在荧光检测仪中42℃反应30分钟。检测EV71和CVA16的检测限为47拷贝/反应和38拷贝/反应,特异性好,与其他肠道病毒无交叉反应。检测445份临床标本,与RT-qPCR相比,双重实时荧光RT-RAA检测EV71和CVA16的诊断灵敏度分别为92.3%和99.0%,诊断特异性分别为99.7%和100%。建立了可视化的EV71和CVA16的侧流层析试纸条RT-RAA方法,42℃反应30分钟,采用侧流层析试纸条对产物进行检测,检测EV71和CVA16的检测限均为91拷贝/反应,特异性好,与其他肠道病毒无交叉反应。检测445份临床标本,与RT-qPCR相比,侧流层析试纸条RT-RAA检测EV71和CVA16的诊断灵敏度分别为90.1%和94.9%,诊断特异性分别为99.7%和100%。结论:建立的EV71和CVA16双重实时荧光RT-RAA方法和侧流层析试纸条RT-RAA方法具有在偏远地区或者现场应用的潜力。第二部分探针介导的重组酶扩增应用于结核分枝杆菌rpoB基因突变检测目的:本研究基于探针介导的重组酶扩增（PDRA）建立快速检测结核分枝杆菌（MTB）rpoB基因突变的检测方法。方法:（1）针对rpoB基因的3个常见突变位点（516、526、531）分别设计野生型和突变型的exo探针,以及共同的反向引物,然后分别构建检测体系,在39℃条件下恒温扩增40min。（2）采用野生型和突变型的重组质粒进行方法的特异性和灵敏度评估。通过某一种检测体系检测不同类型的重组质粒,确定该体系的特异性;通过某一种检测体系检测系列稀释的对应重组质粒,确定该体系的灵敏度。（3）应用建立的PDRA方法检测6株MTB利福平耐药菌株,35份MTB培养阳性的痰标本,并与一代测序结果进行比较。结果:（1）初步建立了 516位点的PDRA方法,该方法包含4种检测体系（TB-516-W、TB-516-GGC、TB-516-GTC和TB-516-TAC）,4种检测体系平行检测标本,根据阳性阈值时间早晚判断该位点的碱基类型。4种检测体系的特异性良好,探针与靶序列完全匹配时,阳性阈值时间早;探针与靶序列不完全匹配时,阳性阈值时间晚,具有稳定的阳性阈值时间差值。该方法检测对应重组质粒的灵敏度为103拷贝/μ1。检测6株MTB耐药菌株、35份MTB培养阳性痰标本的PDRA结果与测序结果一致。（2）虽然针对526位点和531位点设计了特异性exo探针,但无法区分野生型和突变型。结论:本研究初步建立了可应用于MTB rpoB基因516突变点检测的PDRA方法,具有一定的实验室应用价值。第三部分RAA结合CRISPR-Cas13a应用于结核分枝杆菌rpoB基因突变检测目的:将重组酶介导的扩增（RAA）技术与规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a（CRISPR-Cas13a）系统相结合,建立一种快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变点的方法（RAA-Cas13a）。方法:（1）针对rpoB基因设计用于扩增的RAA引物,同时在其中一条引物的5’端增加T7启动子序列,用于后续的体外转录RNA。（2）针对516位点、526位点、531位点分别设计特异性的野生型和突变型crRNA,构建CRISPR-Cas13a检测体系。（3）采用野生型和突变型的重组质粒评估其特异性和灵敏度。（4）选择结核分枝杆菌利福平耐药菌株、临床标本对方法进行评估,并与一代测序结果比较。结果:确定了 516位点、526位点和531位点特异性的crRNA,两步和一步RAA-Casl3a方法检测重组质粒的灵敏度为106拷贝/μl、107拷贝/μl,采用菌株初步评估了 516位点和531位点的检测方法,结果与测序结果一致。结论:RAA-Cas13a方法可以识别MTB rpoB基因突变,但还需进行方法优化。
刘贺[4]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中提出目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
王海荣[5]（2020）在《母体孕晚期外周血细胞因子和TLR9在HBV宫内传播中的作用研究》文中研究表明研究背景目前在我国约9300万乙型肝炎病毒（HBV）携带者中[1],HBV母婴传播占50%[2],其中既往研究报道HBV宫内感染的发生率可达9.4%～44.4%[3]。当前有系列研究[4]对传统HBV宫内感染进行了拓展与修订,形成了新的HBV宫内传播定义,同时近年来研究提示HBs Ag阳性母亲所生子代乙肝疫苗免疫应答率仅为73.26%[5],故该部分人群更易发生HBV母婴传播。如何早期筛检和预警HBV母婴传播的高危人群是目前研究的空白领域。由于HBV感染机体可以诱导Thl/Th2细胞不平衡免疫应答是HBV感染慢性化的主要原因,TLR是目前病毒免疫中的热点,因此,本研究在HBV宫内传播的新内涵基础上,采用巢式病例对照和队列研究方法,通过描述HBs Ag阳性孕妇妊娠晚期外周血中Thl/Th2细胞因子和TLR 9的水平,筛选出子代HBV宫内传播和乙肝疫苗免疫无应答的早期血清学预警指标,为HBV宫内传播的预防与控制奠定理论基础。研究目的1、获取HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血Th1/Th2细胞因子水平的表达特征,筛选与子代发生HBV宫内传播相关的Th1/Th2细胞因子。2、获取HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血TLR 9水平的表达特征,掌握其对子代发生HBV宫内传播的作用。3、基于随访HBs Ag阳性孕产妇所生幼儿在完成乙肝疫苗全程计划免疫接种后HBV感染状态及乙肝疫苗免疫应答情况,获取母体孕晚期细胞因子和TLR 9水平与其幼儿HBV感染和乙肝疫苗免疫应答情况的关联性。研究对象与方法1、研究对象（1）Th1/Th2细胞因子的巢式病例对照研究:采集陕西省西北妇女儿童医院住院分娩的341例HBs Ag阳性孕产妇和344例新生儿（双胎3例）及74例健康孕产妇和新生儿孕晚期外周血及其流行病学调查信息。以24小时内子代外周血（未注射乙肝高效价免疫球蛋白,未接种乙肝疫苗及卡介苗）HBs Ag阳性者为发生HBV宫内显性感染;HBs Ag阴性而HBV-DNA定量≥200IU/ml为发生HBV宫内隐匿性感染。二者合称为发生HBV宫内传播[5]。（2）TLR 9的巢式病例对照研究:采集陕西省西北妇女儿童医院住院分娩的290例HBs Ag阳性孕产妇和新生儿291例（双胎1例）及45例健康孕产妇及新生儿孕晚期外周血及其流行病学调查信息。（3）队列研究:以陕西省西北妇女儿童医院住院分娩的HBs Ag阳性孕产妇及幼儿在本院完成乙肝疫苗全程计划免疫接种、签署知情同意者91例,通过调查问卷随访并成功采集其外周血,最终纳入随访队列幼儿为83例。2、流行病学调查（1）流行病学基线调查:孕产妇孕产期的一般情况和新生儿一般情况;（2）流行病学随访调查:新生儿喂养情况和疫苗接种情况。3、实验室检测（1）采集孕产妇孕晚期外周血和新生儿外周血,采用ELISA法检测血清乙型肝炎5项指标;（2）采用实时荧光定量PCR检测孕产妇及新生儿血清中HBV-DNA水平;（3）采用流式液相芯片法检测孕产妇血清中Th1/Th2细胞因子水平,其中Th1细胞因子包括:IL-2、IL-12、IL-18、INF-γ,Th2细胞因子包括IL-4、IL-6、IL-10;（4）采用ELISA法检测孕产妇血清中TLR 9水平。4、数据统计分析方法采用Epi Data建立数据库,数据运用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验,两组比较方差齐者采用t检验,方差不齐者采用Mann-Whitney U检验;多组比较方差齐者采用方差分析,方差不齐者采用非参Kruskai-Wallis检验;计数资料采用χ2检验。单因素与多因素采用Logistic回归分析。诊断效能采用ROC曲线下面积,所有的检验显着性标准均设置为0.05。研究结果一、母体孕晚期Th1细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究1、研究人群发生HBV宫内显性感染率（DBI）、HBV宫内隐匿性感染率（OBI）、HBV宫内传播率（BIT）、HBV宫内未传播率（NBIT）分别为11.34%（39/344）、36.63%（126/344）、47.97%（165/344）、52.03%（179/344）。2、HBs Ag阳性孕产妇及各宫内传播分组外周血中Th1细胞因子水平的研究（1）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、NBIT组、DBI组、OBI组外周血的IL-2水平与HBs Ag阴性对照组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。（2）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、NBIT组、DBI组、OBI组外周血的IFN-γ水平均显着高于HBs Ag阴性对照组（P<0.0001;P<0.0001;P<0.0001;P=0.021;P<0.0001）。（3）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、NBIT组、OBI组外周血的IL-12水平均显着低HBs Ag阴性对照组（P<0.0001;P<0.0001;P=0.002;P<0.0001）,其中NBIT组IL-12水平显着高于OBI组（P=0.047）。（4）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、OBI组外周血的IL-18组水平显着高于HBs Ag阴性对照组（P=0.022;P=0.014;P=0.007）。3、HBs Ag阳性孕产妇不同HBV感染状态下Th1细胞因子水平状况（1）HBe Ag阳性组IFN-γ、IL-18水平均显着高于HBs Ag阴性对照组（P<0.0001;P<0.0001）,但是HBe Ag阳性组孕产妇的IL-12水平显着低于HBs Ag阴性对照组（P=0.015）。（2）按103IU/ml、106IU/ml为截点分3个层次,母体HBV-DNA载量103～106IU/ml组中IL-18水平增加,子代发生DBI的风险增加（P=0.045）。4、HBs Ag阳性孕产妇孕期干预情况与Th1细胞因子水平的关系（1）注射乙肝免疫球蛋白组中,DBI组母体IFN-γ水平显着低于NBIT组（P=0.008）,OBI组母体IL-12水平显着低于NBIT组（P=0.008）;在NBIT组中注射乙肝免疫球蛋白母体IFN-γ水平显着高于未注射乙肝免疫球蛋白组（P=0.006）;注射乙肝免疫球蛋白组其体内IL-18水平显着高于未注射组（P=0.040）。（2）抗病毒治疗组和注射乙肝疫苗组IFN-γ水平呈现组内分化现象,OBI组母体IFN-γ水平显着低于NBIT组（P=0.027,P=0.029）;在未注射乙肝疫苗组和注射乙肝免疫球蛋白组中OBI组母体的IL-18水平均显着高于NBIT组（P=0.047,P=0.036）。5、Th1细胞因子与HBV宫内传播做单因素分析,未筛选出显着相关因素。6、Th1细胞因子和多种变量因素与HBV宫内传播做多因素Logistic回归分析,未筛选出显着相关因素。二、母体孕晚期Th2细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究1、Th2细胞因子中,HBs Ag阳性孕产妇及其NBIT组、DBI组、OBI组外周血的IL-4、IL-6、IL-10水平均显着高于HBs Ag阴性者对照组（P<0.05）。2、HBs Ag阳性孕产妇不同HBV感染状态下Th2细胞因子水平状况（1）HBe Ag阴性组孕产妇和HBe Ag阳性组孕产妇IL-4、IL-6、IL-10水平显均着高于HBs Ag阴性对照组（P<0.05）;（2）母体HBV-DNA含量<103IU/ml组中,DBI组母体IL-4水平显着高于OBI组（P=0.011）和NBIT组（P=0.007）;HBV-DNA>106IU/ml组中,OBI组母体IL-10水平显着低于NBIT组（P=0.031）;DBI组母体IL-4水平在HBV-DNA>106IU/ml组者显着低于HBV-DNA<103IU/ml组（P=0.016）。3、在未抗病毒治疗组和未注射乙肝疫苗组中,OBI组母体IL-6水平均显着高于DBI组（P=0.008;P=0.012）。4、单因素分析发现,IL-4与HBV宫内传播显着相关,IL-4高水平者其子代发生BIT的概率是NBIT的1.003倍（OR=1.003,95%CI:1.000-1.006,P=0.046）。5、多因素分析发现,随着孕产妇外周血IL-4水平增加,DBI风险增加。孕产妇IL-4高水平者其子代发生DBI的概率是发生NBIT的1.005倍（OR=1.005,95%CI:1.001-1.010,P=0.025）。三、母体孕晚期TLR 9在子代HBV宫内传播中的作用研究1、研究人群发生DBI、OBI和BIT率分别为9.28%（27/291）、40.21%（117/291）和49.48%（144/291）。2、HBs Ag阳性孕产妇及其NBIT组、OBI组外周血的TLR 9水平显着低于HBs Ag阴性者对照组（P<0.0001;P<0.0001;P<0.0001）,其中NBIT组TLR 9水平显着低于BIT组（P=0.015）,DBI组的TLR 9水平显着高于NBIT组和OBI组（P=0.001;P<0.0001）。3、HBs Ag阳性孕产妇不同HBV感染状态下TLR 9水平状况（1）HBe Ag阴性组孕产妇的TLR 9水平显着低于HBs Ag阴性对照组（P<0.0001）;按BIT程度由重至轻分为:DBI组、OBI组和NBIT组,均随着BIT程度的加重,孕产妇TLR 9含量呈增加趋势（P<0.05）;无论HBe Ag阴性和阳性组,DBI组TLR 9水平均显着高于OBI组和NBIT组（P<0.01）;（2）按103IU/ml、106IU/ml为截点分3个层次,每层均随BIT程度的加重,TLR 9水平呈增加趋势（P<0.05）,每层中DBI组TLR 9水平均显着高于OBI组和NBIT组（P<0.05）。4、无论抗病毒治疗与否,注射乙肝免疫球蛋白与否和未注射乙肝疫苗组,均随着BIT程度的加重,孕产妇外周血TLR 9含量呈增加趋势,孕产妇外周血TLR 9含量DBI组显着高于OBI组和NBIT组（P<0.0001;P<0.0001）。5、单因素分析发现,孕产妇外周血TLR 9水平增加,发生DBI的风险增加。孕产妇TLR 9表达高水平者其子代发生DBI的概率是NBIT的1.39倍（OR=1.392,95%CI:1.224-1.582,P<0.0001）,发生DBI的概率是OBI的1.36倍（OR=1.360,95%CI:1.195-1.549,P<0.0001）。6、多因素分析发现:（1）孕产妇外周血TLR 9表达高水平者其子代发生DBI的概率是NBIT的1.44倍（OR=1.442,95%CI:1.247-1.667,P=0.000）。HBV-DNA载量在103～106 IU/ml组中,发生DBI的概率是NBIT的0.14倍（OR=0.135,95%CI:0.023-0.781,P=0.025）。（2）TLR 9表达高水平者其子代发生DBI的概率是OBI的1.43倍（OR=1.434,95%CI:1.237-1.663）。乙肝免疫球蛋白未注射组中,子代发生DBI的概率是OBI的0.13倍（OR=0.131,95%CI:0.043-0.399）。四、母体孕晚期细胞因子及TLR 9表达与其幼儿预后的队列研究1、本次调查共随访到83例幼儿及其母亲,随访幼儿中发生HBV隐匿性感染27例（32.53%）,未感染56例（67.47%）。总体幼儿乙肝免疫应答率为72.29%;DBI组、OBI组和NBIT组乙肝疫苗应答率分别为81.82%（9/11）、80.00%（28/35）、62.16%（23/37）;随访幼儿隐匿性感染组和未感染组中发生乙肝疫苗免疫应答率为88.89%（24/27）、64.29%（36/56）。2、母体孕晚期外周血IL-2高水平者其幼儿转归中HBV感染的风险呈降低趋势（P=0.014）。3、随访幼儿乙肝疫苗无免疫应答组其母亲孕晚期IL-2水平显着高于抗体阳性组幼儿组（P=0.013）。4、将本研究中检测的Th1/Th2细胞因子与TLR 9纳入HBV宫内传播进行ROC曲线分析,结果显示TLR 9灵敏度为43.90%,特异度为76.20%,约登指数为0.201。曲线下面积为0.582（95%CI:0.516-0.649）,TLR 9的临界值为1.690pg/ml。因此当TLR9高于此临界值时,提示可能已发生HBV宫内传播。5、将本研究中检测的Th1/Th2细胞因子及TLR 9纳入幼儿HBV感染进行ROC曲线分析,结果显示IL-2灵敏度为92.30%,特异度为52.40%,约登指数为0.447。曲线下面积为0.755（95%CI:0.592-0.917）,IL-2的临界值为2.275pg/ml。因此当孕晚期母体低于此临界值时,随访幼儿发生HBV感染的风险增加。6、将Th1/Th2细胞因子及TLR 9水平与幼儿HBV免疫应答进行ROC曲线分析,结果发现IL-2灵敏度为80.90%,特异度为61.10%,约登指数为0.420。曲线下面积为0.677（95%CI:0.521-0.833）,IL-2的临界值为2.490pg/ml。因此当孕期母体低于此临界值时,其随访幼儿产生乙肝疫苗免疫应答的能力降低。结论基于HBV宫内传播的新内涵,通过巢式病例对照研究和队列研究筛选出HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血的IL-12、IL-18、IL-4、TLR 9可以作为早期预测HBV宫内传播发生的监测指标,HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血的IL-2可作为预测子代发生HBV感染和乙肝疫苗免疫无应答的参考指标。1、HBs Ag阳性孕产妇机体内IL-12、IL-18水平降低,而IL-4、TLR 9高表达者发生HBV宫内传播的可能性增加,可一定程度上作为HBV宫内传播预警指标的细胞因子。一定程度上IL-10水平减少易于发生HBV宫内传播,可作为预测HBV宫内传播有效的参考指标。2、注射乙肝免疫球蛋白可以刺激母体IFN-γ、IL-12及IL-18水平增加,及时纠正HBV引起的免疫紊乱,降低发生HBV宫内传播的几率,为HBV宫内阻断提供了有效干预指标。3、HBV会抑制孕产妇体内TLR 9的表达,但随着HBV感染病情的加重,TLR 9呈现代偿性上调,呈现组内分化现象,TLR 9可为HBs Ag阳性孕产妇监测管理提供参考。4、妊娠晚期孕产妇的IL-2水平可以预测幼儿转归过程中发生HBV感染的风险,孕产妇IL-2分泌能力可能参与幼儿HBs Ab产生的应答。5、孕晚期母体内TLR 9水平高于1.690pg/ml时,提示可能已发生HBV宫内传播;母体孕晚期IL-2水平低于2.275pg/ml时,随访幼儿中发生HBV感染的风险增加;其IL-2水平低于2.490pg/ml时,幼儿产生乙肝疫苗免疫应答的能力降低。
杨秀涵[6]（2020）在《感染HBV孕妇妊娠中晚期抗病毒治疗效果及其影响因素研究》文中研究表明研究背景慢性乙型病毒性肝炎已然成为危害全球的健康问题。母婴传播是其主要传播方式。目前,对高病毒载量的孕妇,推荐孕期接受抗病毒治疗,但在启动时间上仍有争议。同时,识别抗病毒治疗应答的优势和劣势人群,为个性化治疗提供参考方向。研究方法前瞻性分析我院门诊就诊的HBsAg阳性且进行抗病毒治疗孕妇的临床资料,将孕中、晚期开始抗病毒治疗患者分为孕中期（孕13-27周）组和孕晚期（孕28周及以后）组,观察两组患者在抗病毒治疗前后HBV DNA水平,以及新生儿HBsAg等,进一步探索影响孕妇抗病毒治疗结束时和早期应答的相关因素。根据数据类型和研究设计选择相应的统计描述和分析方法。结果2015年7月至2019年12月,前来我院门诊阻断乙肝母婴传播孕妇共331例,其中,孕中、晚期开始抗病毒治疗分别为90例和41例。69例婴儿HBsAg均为阴性,乙肝母婴传播率为0。孕中、晚期接受抗病毒治疗的孕妇在治疗第4、8、12周、分娩时和产后6-8周,HBV DNA水平和<2×105 IU/mL 比例差异均无统计学意义（P≥0.05）。以孕妇分娩时血清HBV DNA较基线水平的下降幅度作为抗病毒治疗结束时应答情况的评价指标,分析可得其影响因素有抗病毒治疗前HBV DNA载量（P<0.001）和抗病毒药物种类（LdT或TDF）（TDF为参照,B值=-0.255,P=0.013）。对治疗前HBV DNA以≥6 log10 IU/mL为界进行亚组分析,有统计学差异（P=0.001）。以抗病毒治疗第4周HBV DNA较基线水平的下降幅度作为抗病毒治疗早期应答情况的评价指标,分析可得其影响因素有抗病毒治疗前HBV DNA载量（P<0.001）、HBeAg 阴性（P=0.006）、ALT 水平（P=0.003）和 AST 水平（P=0.008）。治疗前HBV DNA以6 log10 IU/mL为界进行亚组分析,有统计学差异（P=0.002）。结论1.所有婴儿HBsAg均为阴性,乙肝母婴传播率为0,乙肝母婴传播阻断率均为100%。2.孕中、晚期启动抗病毒治疗,均可明显降低孕妇HBV DNA水平,并且阻断母婴传播的效果相似。3.孕期抗病毒治疗结束时应答情况与抗病毒治疗前HBV DNA水平和药物种类相关,且抗病毒治疗前HBV DNA≥6 log1(0IU/mL和使用TDF（相比于LdT）孕妇应答效果更好。4.抗病毒治疗早期应答情况与抗病毒治疗前HBV DNA、HBeAg、ALT和AST相关,且治疗前HBV DNA≥6 log10IU/mL,低ALT,高AST,HBeAg阴性孕妇应答效果更好。
陈桥[7]（2016）在《基于几种纳米材料的生物传感新方法探索及其在检测HBV DNA和葡萄糖中的应用》文中认为在科学技术飞速发展的21世纪,检测和分析手段的多元化让人们对自身以及环境有了越来越多的认识,也使得人们对自身和环境的重视程度越来越高。过去许多的检测手段和分析方法由于无法满足人们的要求而逐渐被淘汰。随着时代的发展和科技的进步,越来越多的新型检测手段应运而生,生物传感器就是其中的代表。生物传感器就是利用生物活性物质作为敏感单元,来对目标物进行特异性的识别响应,然后通过换能器将响应信号转换为物理化学信号来对目标物进行分析和检测。由于生物传感器的这种识别专一性强、特异性好,抗干扰能力也强,所以这就使得生物传感器可以在很复杂的环境下对目标物进行高灵敏检测,而且生物传感器在检测时所需时间短,操作简单,不需要专业人员操作,这也使得生物传感器可以应用在生活的方方面面。纳米材料的出现使得生物传感技术有了更加广阔的发展,让生物传感技术有了无穷无尽的想象。纳米材料具有很高的比表面积,表面许多的不饱和键让它可以吸附多种目标分子,不同类型的纳米材料性能各异,本文利用不同的纳米材料从而可以设计出一系列不同种类的生物传感器。而且由于有纳米结构的出现,所以传感器的反应时间也被大大缩短。本文正是利用纳米材料的优异的性能来设计实验,对乙肝病毒DNA、双氧水和葡萄糖进行灵敏检测。具体内容如下:（1）本文利用二氧化硅纳米粒子的放大作用及银纳米簇优异的荧光特性对乙肝病毒DNA进行高灵敏检测。在实验中设计了两条DNA链:一条稳定银纳米簇的荧光探针链,另一条是生物素修饰的富含鸟嘌呤的DNA辅助链。本文在合成的纳米二氧化硅粒子表面修饰链霉亲和素,链霉亲和素和生物素的相互作用使得DNA辅助链连接在二氧化硅表面。在没有病毒DNA出现时,单独的一条银纳米簇荧光探针链单独存在,其荧光偏振值很弱。当加入目标物病毒DNA时,银纳米簇荧光探针链、DNA辅助链、病毒DNA链相互作用,碱基互补配对使得三条DNA链之间形成夹心结构,此时荧光分子由之前的银纳米簇荧光探针链变为由三条链组成的大分子,使得分子体积大大增加。荧光偏振值与分子的体积成正比,所以荧光偏振值也就会大大增加,从而可以根据荧光偏振的增加来高灵敏的定量检测乙肝病毒的DNA。当HBV DNA的浓度在1-800nM的范围变化时,△FP的变化呈现出线性相关。该方法的检测限达到了 0.65nM,这比荧光共振能量转移模式的传感器的检测限至少要低一个数量级,而且其检测的动态范围要比其他检测方法更宽,同时该方法也为其他核酸物质的检测提供了一个新的思路。（2）本文通过湿化学法简单的制备了血红素功能化的二硫化钨纳米片（hemin/WS2-NSs）,对制得的hemin/WS2-NSs进行了表征,考察了其过氧化物模拟酶的催化活性,并利用其对双氧水和葡萄糖进行了比色检测。利用TMB（3’3’5’5’-四甲基联苯胺）和双氧水作为检测基质来检验hemin/WS2-NSs的过氧化酶催化活性,将hemin/WS2-NSs加入到一定浓度的TMB和双氧水溶液中后发生典型的颜色反应,说明它可以在双氧水存在的情况下氧化TMB,使得溶液变色。Hemin/WS2-NSs的催化行为符合典型的Michaelis-Menten动力学模型,其催化机理遵循乒乓机理,与天然的辣根过氧化酶相比展示出更高的催化活性,具有更好的稳定性,适用范围更广。与单纯的二硫化钨纳米片及血红素相比,其催化活性高于单纯的二硫化钨纳米片及血红素。最后本文利用hemin/WS2-NSs作为比色传感器来检测葡萄糖旳线性范围和检测限为0.5×10-5-2.0×10-4 M,1.5×10-6 M,该法已成功用于血液中葡萄糖的测定。（3）本文制备了 g-C3N4-Fe3O4纳米复合物,并对其进行探究发现其具有过氧化酶催化活性,能够催化氧化底物产生颜色反应。利用TMB和双氧水来检验g-C3N4-Fe3O4纳米复合物的过氧化酶催化活性,加入后发生典型的颜色反应,说明在双氧水存在的情况下g-C3N4-Fe3O4纳米复合物可以氧化TMB,使得溶液变色。该溶液的紫外吸收光谱在369 nm和652 nm处有最大的特征吸收,其催化活性与温度、pH、时间有关。在对其催化条件进行优化之后,可以对双氧水和葡萄糖进行比色检测,检测限分别为0.3×10-6M、2.5×10-7M。同时本文在复杂的环境中考察了其选择性,该方法依旧可以很好的对双氧水和葡萄糖进行检测,因此该方法可以用于血液中葡萄糖的测定。综上所述,本文在设计传感新方法时引入纳米材料,对大分子目标DNA及葡萄糖等小分子进行了高灵敏度的检测,表现出良好的特异性。本工作为纳米材料提供了更广泛的用途,为设计新型传感器提供了更加广阔的思路。
倪红霞[8]（2013）在《乙肝病毒母婴传播的病毒变异规律与乙肝疫苗免疫保护效果研究》文中进行了进一步梳理乙肝病毒（HBV）慢性感染是我国主要公共卫生问题。在HBV流行区，慢性乙肝主要由于母婴传播引起。婴儿期感染HBV90%发展成慢性感染，最终约25%又进展为肝硬化和肝细胞癌。1992年开始我国将乙肝疫苗接种纳入计划免疫管理。由于疫苗免疫的普及和降低婴幼儿HBV暴露等干预措施的实施，人群HBsAg阳性率明显下降。我国目前在新生儿中推行的乙肝免疫方案为：新生儿出生后24小时内尽早接种乙型肝炎疫苗，按照0、1、6月程序全程需接种3针；对HBsAg阴性母亲的新生儿可用5μg或10μg酵母或10μg中国仓鼠卵母细胞（CHO）乙型肝炎疫苗免疫；对HBsAg阳性母亲的新生儿，在出生后24小时内尽早接种乙型肝炎高效价免疫球蛋白（HBIG），剂量不小于100IU，同时接种10μg重组酵母或20μg CHO乙型肝炎疫苗，在1个月和6个月时再各接种1剂乙型肝炎疫苗，可显着提高母婴传播阻断的效果。与大多数国家不同，多年来我国只生产5μg（啤酒酵母）重组乙肝疫苗，我国大部分地区还一直使用低剂量的5μg重组酵母乙肝疫苗，国际上对低剂量疫苗的免疫保护效果较为争议。近年来我国有自主研发的高剂量重组乙肝疫苗上市，局部地区已在所有新生儿中推广使用，但对新剂型疫苗的总体免疫保护效果还缺乏科学的现场考核。现有资料表明，即使是接种高剂量乙肝疫苗或联合接种HBIG，仍有5%左右的HBsAg阳性母亲的新生儿感染HBV。HBV母婴传播途径主要为产前传播（即宫内感染）、产时传播和产后传播，一般认为主动和被动免疫措施对HBV产时传播和产后传播的阻断效果较满意，但对宫内已发生感染的婴儿效果较差。宫内传播是当前乙肝病毒母婴传播的最主要途径，但我们对宫内传播及乙肝疫苗免疫阻断失败的原因和内在机制仍不十分清楚。报道较多的危险因素是母亲HBeAg阳性和HBV DNA高滴度。此外，还可能与疫苗的免疫原性、机体对疫苗的反应性、遗传易感性和病毒变异等多种因素相关。在控制乙肝病毒母婴传播方面还有很多科学问题未得到确切答案。本课题从乙肝病毒宫内传播、病毒变异、新生儿接种不同剂量乙肝疫苗的免疫保护效果三个角度进行研究，为进一步控制乙肝病毒母婴传播提供科学依据。第一部分乙肝病毒宫内感染是母婴传播的主要途径，可能是导致高风险新生儿（母亲HBsAg阳性）出生后乙肝疫苗免疫阻断失败，从而发生HBV慢性感染的主要原因。在上海浦东区的医院产科，对入院生产的HBsAg阳性产妇进行问卷调查，同时采集产妇静脉血及新生儿脐静脉血，并预期随访至儿童完成乙肝疫苗基础免疫（7月龄）后，采集的血标本检测乙肝血清学标志物和HBV DNA定量，并检测母子乙肝病毒全基因序列，明确HBV宫内传播发生率及相关危险因素。对362对入院分娩的HBsAg阳性产妇及其新生儿调查显示，新生儿HBV感染率为8.0%。 HBsAg+/HBeAg+双阳性母亲的新生儿， HBV感染率为20.3%；HBsAg+/HBeAg-单阳性母亲的新生儿，HBV感染率为2.0%，差异有统计学意义（2=36.104, P=0.000）。分析显示，母亲HBV DNA水平与新生儿HBV感染率有剂量反应关系，当母亲HBV DNA大于106copies/mL时，新生儿HBV感染率为23.3%，显着高于母亲HBV DNA小于106copies/mL者的1.9%，差异有统计学意义（2=45.670，P=0.000）。母亲HBeAg与HBV DNA106copies/mL的Kappa一致性为0.864，两指标间存在较强相关性。单因素分析显示，母亲HBeAg阳性新生儿的HBV感染风险OR为12.2（4.5-32.9），母亲HBV DNA高水平（106copies/mL）新生儿的HBV感染风险OR为15.4（5.7-41.7），不同分娩方式与新生儿HBV感染无相关性（P=0.246）。小样本量随访结果显示，完成乙肝疫苗基础免疫后，3例宫内感染新生儿，1例免疫阻断失败（HBsAg阳性）；1例对疫苗无应答（抗-HBs阴性）。而39例非宫内感染新生儿均免疫成功。提示HBV宫内感染是疫苗免疫失败的重要原因。23对发生HBV宫内感染母婴的乙肝病毒全基因序列分析显示，各母子对病毒全基因序列同源性在99.4%-100%，15对母子（65.2%）病毒序列完全一致。按不同基因型分别与B2和C2野生型乙肝病毒株序列进行比较，母亲感染的B和C基因型突变株与野生株乙肝病毒均可通过宫内传播，未发现有宫内传播优势的特异突变位点。第二部分对我国获批准用于新生儿免疫的两种重组乙型肝炎疫苗，10μg/0.5mL剂型重组（汉逊酵母）乙肝疫苗和5μg/0.5mL剂型重组（啤酒酵母）乙肝疫苗，在2760名新生儿基础免疫中应用的免疫原性及保护效果进行社区为基础的观察研究。HBsAg阴性母亲所生的（低风险）新生儿分别按0-1-6程序全程接种5μg重组乙肝疫苗（A组，共1299例）和10μg重组乙肝疫苗（B组，共1122例），及HBsAg阳性母亲所生的（高风险）新生儿按0-1-6程序全程接种10μg重组乙肝疫苗，并在出生时自愿联合接种HBIG（C组，339名），在乙肝疫苗全程免疫后1-2个月，3组的抗-HBs阳转率分别为99.61%，99.73%和97.34%，抗-HBs抗体的几何平均浓度（GMC）分别为714.79mIU/mL，2422.47mIU/mL和1271.77mIU/mL。两种剂量重组乙肝疫苗在低风险新生儿中使用的抗-HBs抗体阳转率相当，但接种10μg重组疫苗较5μg重组疫苗的抗-HBs抗体应答水平高。随访观察至免后2年，3组抗-HBs阳性率出现差异（2=40.470，P=0.000），分别为72.98%（A组），85.90%（B组）和79.54%（C组）。3组抗-HBs抗体水平在免疫后1-2月达到高峰，此后均以指数水平快速下降，免后2年3组抗-HBs抗体的几何平均滴度均在50mIU/mL以下。339例母亲HBsAg阳性的新生儿，其中89.4%（303/339）选择10μg乙肝疫苗联合HBIG接种；全程免疫后1-2个月共有7名儿童HBsAg阳性，乙肝疫苗母婴阻断失败率为2.06%；免疫失败儿童均为HBeAg阳性母亲所生，母亲HBsAg+/HBeAg+双阳性新生儿的免疫失败率为6.67%；母亲HBsAg+/HBeAg-单阳新生儿均未发生免疫失败；两组差异有统计学意义（Fisher’s P=0.000）。母亲HBsAg阳性新生儿乙肝疫苗免疫阻断失败危险因素的单因素分析显示，产妇孕期晚期进行HBIG干预是疫苗免疫失败的危险因素（P=0.013）；母亲HBsAg阳性新生儿单独接种10μg乙肝疫苗的免疫失败率是2.79%，10μg乙肝疫苗联合HBIG接种者的免疫失败率是1.98%，差异无统计学意义（Fisher’s P=0.548），而母亲HBsAg阳性新生儿采用10μg乙肝疫苗联合HBIG接种的抗-HBs抗体GMC为1184.09IU/mL，低于单独接种10μg疫苗者的2331.72mIU/mL，差异有统计学意义（2=6.779，P=0.010）。接种5μg疫苗的低风险儿童，在免疫后2年的抗-HBc阳性率为2.85%，高于接种10μg疫苗组的0.98%（P=0.008）；母亲HBsAg阳性的儿童，免后2年抗-HBc阳转率为4.54%，HBeAg阳性母亲的儿童抗-HBc阳转率更高，提示突破感染与暴露机会和疫苗保护能力均有关。分析6名乙肝疫苗免疫失败儿童及其母亲的的乙肝病毒基因全序列，显示基因型B和C乙肝病毒均可由母婴传播，母子全基因序列同源性为99.38-100%。第三部分对15岁以下HBsAg持续阳性的母子进行问卷调查，同时采集母子配对血清，检测乙肝两对半和HBV DNA定量，用nested-PCR方法分段扩增乙肝病毒全基因序列，直接测序失败样本经TA克隆后再测序，MEGA5.0软件进行序列同源性、基因型和突变分析。59对7月龄至15岁经母婴传播的乙肝病毒慢性感染儿童与母亲，其中B基因型26对（44.0%），C基因型33对（56.0%），母子病毒全基因序列同源性在96.1～100%之间，平均为99.4%。儿童“”抗原决定簇突变率为33.8%，母亲为22.0%，儿童G145R免疫逃逸突变发生率为5.1%，母亲为0%，差异均无统计学意义（P>0.05）。preS区缺失突变仅在HBV慢性感染母亲中发现，发生率为13.5%（8/59），儿童中未检测到此类缺失突变（P=0.001）。位于BCP区与肝癌和肝硬化相关的突变在母婴中发生率均较低，未发现母婴传播优势。母亲和儿童均可检测到BCP/PreC/Core区的缺失突变，但突变未出现在配对母子中。综上所述，母亲HBeAg阳性和HBV DNA高水平（106copies/mL）是乙肝病毒母婴传播的危险因素；野生型和突变型乙肝病毒均可通过母婴垂直传播，未观察到突变病毒株有母婴传播优势；我国目前推荐的乙肝免疫方案能有效保护新生儿，阻断乙肝病毒母婴传播；乙肝疫苗普种后出生的HBV慢性感染儿童，以G145R突变为代表的免疫逃逸突变发生率很低，尚未构成公共卫生问题。
柯彩萍[9]（2012）在《乙型肝炎病毒胎盘感染与宫内传播》文中提出目的：1.探讨孕妇HBV感染对胎儿及胎盘生长发育的影响。2.利用组织学实验方法探讨HBV感染对胎盘形态和功能的影响。3.利用体外实验研究HBV在胎盘滋养细胞的感染状况，初步探讨HBV感染胎盘滋养细胞后能否在滋养细胞内复制。方法：1.第一部分：回顾性分析194例HBsAg阳性的孕妇及其新生儿的临床资料，并随机选取296例HBsAg阴性的孕妇及其新生儿作为对照组，分析这两组的妊娠并发症，围产儿结局及胎儿-胎盘发育指标和HBV宫内感染的关系。2.第二部分：收集血清HBsAg阳性孕妇足月胎盘组织25例作为病例组，血清HBsAg阴性孕妇足月胎盘组织10例作为正常对照组，免疫组化PV-6002二步法检测病例组胎盘组织HBsAg的表达；荧光定量PCR检测胎盘组织HBVcccDNA的表达；免疫组化抗CD34标记绒毛血管，体视学方法定量分析绒毛微血管长度密度和体积密度的改变； TUNEL法检测胎盘细胞的凋亡指数。3.第三部分：收集HBV携带孕妇足月胎盘12例，采用密度梯度离心法联合反复贴壁法分离、纯化滋养细胞，提取滋养细胞进行培养；流式细胞术检测滋养细胞CK-7的表达，进行细胞纯度鉴定，免疫双标法结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测滋养细胞CK-7及间质Vimentin的表达，进行细胞形态学鉴定；PCR-荧光探针法检测体外培养24、48、72h滋养细胞上清HBV DNA的表达；微粒子酶免疫分析技术检测体外培养24、48、72h滋养细胞上清HBsAg和HBeAg的表达；流式细胞分选技术分选出纯度98%以上的滋养细胞，荧光定量PCR检测滋养细胞中HBVcccDNA的表达。结果：1.第一部分：1)临床资料分析显示，HBsAg阳性孕妇孕产次较HBsAg阴性孕妇高（P<0.05）；HBsAg阳性孕妇新生儿出生体重和胎盘体积较HBsAg阴性孕妇小（P<0.05）；孕妇HBV-DNA阳性组的胎盘体积较HBV-DNA阴性组小； ALT异常组的胎盘体积大于ALT正常组（P<0.05）；2)新生儿HBsAg阳性组的出生体重、身长，胎盘体积均较阴性组低，FGR发生率较阴性组高（P<0.05）；新生儿HBeAg阳性组FGR发生率较阴性组高，胎盘体积较阴性组小（P<0.05）；新生儿HBsAb阳性组胎盘体积较阴性组大（P<0.05）；3)胎盘体积为HBV宫内感染的保护因素（OR=0.996，p=0.005），母血HBV DNA为宫内感染的危险因素（OR=1.396，p=0.004）。2.第二部分：1)免疫组化结果显示，25例HBV感染胎盘中有13例胎盘HBsAg阳性，阳性率为52.0%，阳性信号主要分布于滋养细胞（TC），绒毛间质细胞（VMC）和绒毛毛细血管内皮细胞（VCMC）；2)20例胎盘中，有7例胎盘组织HBV cccDNA阳性，阳性率为35.0%，表达量（copies/ml）分别为：6.04×105、3.82×103、8.94×103、2.91×104、7.02×103、5.28×102、1.12×104；胎盘HBV cccDNA （+）组的肝功能异常率高于胎盘HBVcccDNA（-）组，孕次较胎盘HBVcccDNA（-）组多（P<0.05）；母血HBV DNA滴度与胎盘HBV cccDNA滴度呈明显的正相关（r=0.994，P=0.000）；孕次和胎盘HBsAg阳性是胎盘HBV cccDNA阳性的危险因素，OR值分别为4.85和16.02；3)胎盘绒毛微血管体视学结果显示，CD34几乎标记所有血管，绒毛血管内皮细胞在乙肝胎盘和正常胎盘均为阳性表达；乙肝组的微血管Lv较正常组小，微血管Vv较正常组大，但两者比较均无统计学差异（P>0.05）；微血管Vv与胎盘HBV cccDNA滴度呈明显正相关（r=0.944，P=0.001）；4)凋亡结果显示，HBV感染胎盘及正常胎盘组织均可检出凋亡细胞，凋亡细胞在胎盘不同类型的细胞均有表达；HBV感染胎盘滋养细胞和绒毛间质细胞的凋亡指数比正常胎盘的凋亡指数高，且两组间的比较具有明显统计学差异（P<0.05）；母血HBV DNA滴度和AI呈中度正相关（r=0.422，p=0.045）；微血管Lv与AI呈中度负相关（r=-0.464，p=0.022）。3.第三部分：1)12例HBV携带孕妇胎盘滋养细胞体外培养24、48、72h，上清均可检测到HBV DNA和HBsAg、HBeAg的阳性表达，HBV–M滴度在24h表达量最高，随着时间的推移，HBV DNA滴度逐渐下降，而HBsAg和HBeAg滴度呈先下降后上升的趋势，但3个时间点均无统计学差异（P>0.05）；3个时间点上清HBsAg和HBeAg的表达量有良好的相关性（P<0.05）；2)12例HBV胎盘滋养细胞标本，有4例检测出HBV cccDNA阳性，阳性率33.3%，表达量（copies/ml）分别为：5.67×103、2.12×104、1.72×104、4.90×104；母血HBV DNA滴度和滋养细胞HBV cccDNA滴度呈良好的正相关（r=0.997，p=0.023）。结论：1. HBV感染可影响胎儿-胎盘的生长发育，导致胎盘体积缩小，出生体重降低。2.胎盘体积是HBV宫内感染的保护因素，新生儿HBsAb阳性者的胎盘体积大于新生儿HBsAb阴性者；母血高病毒载量及转氨酶升高是HBV宫内感染的高危因素。3.孕次和胎盘HBsAg阳性是胎盘HBV cccDNA阳性的危险因素。随着母血HBV DNA滴度的升高，胎盘HBV cccDNA滴度增加，微血管体积密度增大。4.胎盘HBV感染者，胎盘滋养细胞和绒毛间质细胞的凋亡指数增高。5. HBV可以感染胎盘滋养细胞并在滋养细胞内繁殖复制。
郭婷婷[10]（2010）在《孕晚期注射乙肝免疫球蛋白对孕妇T淋巴细胞亚群的影响》文中进行了进一步梳理目的分析乙肝病毒携带孕妇孕晚期注射高效价乙肝免疫球蛋白（Hepatitis B Immunoglobulin, HBIG）前后体内的T淋巴细胞亚群的变化,评价高效价乙肝免疫球蛋白在临床上的应用价值。资料与方法收集2009年7月～2010年4月在暨南大学附属第一医院门诊正规产检的乙肝表面抗原（HBsAg）阳性的孕妇共69例作为实验对象,将同期正规产检的夫妻双方乙肝表面抗原均为阴性的正常孕妇51例作为正常对照。将HBsAg阳性的孕妇按知情同意原则分为两组,①于孕28、32、36周左右注射高价HBIG200IU的乙肝病毒携带孕妇为实验组,共32例；②未注射HBIG的归为乙肝病毒携带孕妇对照组共37例。按HBeAg的情况将所有HBsAg阳性的孕妇分为HBeAg阳性组30例和HBeAg阴性组39例；在本次研究中,将HBV-DNA>103copies/ml的定为HBV-DNA阳性,HBV-DNA<103copies/ml定为HBV-DNA阴性,把所有HBsAg阳性的孕妇按照HBV-DNA的情况分为HBV-DNA阳性组37例和HBV-DNA阴性组32例。所有HBsAg阳性的孕妇于孕28周和36周左右两次采集外周静脉血,用ELISA检测HBV-Markers,荧光定量PCR（FQ-PCR）检测两次抽血的HBV-DNA,同期采集所有参加实验的孕妇外周血用流式细胞仪（FCM）检测T淋巴细胞亚群中的CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+T淋巴细胞百分率以及CD4+/CD8+的比值等相关指标。结果1.乙肝病毒携带孕妇体内的CD3+, CD4+T淋巴细胞亚群以及CD4+/CD8+的比值较正常孕妇的低,而CD8+T淋巴细胞比值较正常孕妇高（P<0.05）2.乙肝病毒携带者孕妇中,HBV-DNA（+）的孕妇体内CD4+, CD4+/CD8+比值高于HBV-DNA（-）的孕妇,而CD8+的百分率低于HBV-DNA（-）的孕妇（P<0.05）。3.HBeAg（+）和（-）的乙肝病毒携带者孕妇体内的各T淋巴细胞亚群之间没有明显的统计学差异（P>0.05）。4.乙肝携带孕妇体内的HBV-DNA的拷贝数由注射HBIG前的6.53±1.14降低为注射HBIG之后的5.12±1.14,差异有统计学意义（P<0.05）。5.乙肝病毒携带孕妇注射完HBIG后,与未注射HBIG的孕妇相比,体内的各淋巴细胞亚群中除CD3+之外,余均有明显的统计学差异（P<0.05）。HBV-DNA（+）孕妇注射完HBIG后,与正常孕妇相比,除了CD4+外,余值均与正常孕妇无明显统计学差异（P>0.05）。6.正常孕妇孕36周左右与孕28周左右正常孕妇相比,体内的CD4+/CD8+比值较低,有统计学意义（P<0.05）,而CD3+,CD4+以及CD8+值,两者没有显着的统计学差异（P>0.05）。结论1.乙肝病毒携带孕妇体内的T淋巴细胞免疫功能较正常孕妇体内的T淋巴细胞免疫功能低下。2.乙肝病毒携带者孕妇体内的细胞免疫功能与HBV-DNA的拷贝数有关。3.HBeAg的状态与乙肝病毒携带者孕妇体内的T淋巴细胞亚群之间未见显着相关性。4.孕晚期注射HBIG能降低乙肝病毒携带孕妇体内的病毒复制量。5.孕晚期注射HBIG能改善乙肝病毒携带孕妇体内的细胞免疫功能,这种作用对于HBV-DNA阳性的孕妇尤为明显。6.孕36周左右孕妇体内的细胞免疫调节功能较孕28周左右孕妇体内的细胞免疫功能低下。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 核酸检测应用简介 |
| 1.2 核酸扩增技术 |
| 1.2.1 聚合酶链式反应技术 |
| 1.2.2 等温扩增技术 |
| 1.2.3 小结 |
| 1.3 核酸杂交技术 |
| 1.4 高通量测序 |
| 1.5 可编程核酸酶技术 |
| 1.5.1 基于CRISPR/Cas9 的核酸检测方法 |
| 1.5.2 基于CRISPR/Cas13 的核酸检测方法 |
| 1.5.3 基于 CRISPR/Cas12 的核酸检测方法 |
| 1.5.4 基于 CRISPR/Cas14 的核酸检测方法 |
| 1.5.5 小结 |
| 1.6 原核Argonaute |
| 1.6.1 原核Argonaute简介 |
| 1.6.2 原核Argonaute的体外应用 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第2章 Pyrococcus furiosus Argonaute蛋白质的表达纯化及性质研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 寡核苷酸 |
| 2.2.4 本实验所用的培养基 |
| 2.2.5 主要缓冲液 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 重组PfAgo蛋白质表达载体的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌常规转化 |
| 2.3.3 重组PfAgo蛋白质的表达与纯化 |
| 2.3.4 考马斯亮蓝G250 法测定蛋白质浓度 |
| 2.3.5 SDS-PAGE电泳实验 |
| 2.3.6 TBE-PAGE电泳实验 |
| 2.3.7 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 2.3.8 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 2.3.9 不同长度的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.10 不同匹配区的g DNA介导PfAgo切割单链DNA靶的实验 |
| 2.3.11 PfAgo单碱基专一性探究的实验 |
| 2.3.12 验证PfAgo切割产生的ss DNA也能介导PfAgo酶切的实验 |
| 2.4 实验结果和分析 |
| 2.4.1 PfAgo基因的优化与合成 |
| 2.4.2 PfAgo的表达与纯化 |
| 2.4.3 PfAgo切割活性验证 |
| 2.4.4 g DNA与靶 DNA 的互补区域对PfAgo切割靶 DNA 的影响 |
| 2.4.5 g DNA与靶DNA的单碱基不匹配对PfAgo切割效率的影响 |
| 2.4.6 PfAgo切割信号传递活性验证实验 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于PfAgo的核酸检测方法 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 双链DNA |
| 3.2.4 寡核苷酸 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 待检测模拟靶DNA的制备 |
| 3.3.2 TBE-PAGE电泳实验 |
| 3.3.3 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 3.3.4 PfAgo切割单链DNA的实验 |
| 3.3.5 DNA扩增反应 |
| 3.3.6 PfAgo介导的核酸检测(PAND)实验 |
| 3.3.7 反应产物的荧光值测定实验 |
| 3.3.8 HEK293T细胞的培养和基因组DNA提取 |
| 3.3.9 PfAgo介导的核酸检测(PAND)的灵敏度验证实验 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.3.11 临床样品来源 |
| 3.4 实验结果和分析 |
| 3.4.1 探究不同商品化的PCR Mix体系对PfAgo切割靶DNA的影响 |
| 3.4.2 PfAgo介导的核酸检测方法的原理验证 |
| 3.4.3 输入gDNAs与PfAgo的摩尔比对 PAND 的影响 |
| 3.4.4 gn的序列对PfAgo介导的核酸检测的影响 |
| 3.4.5 PfAgo介导的核酸检测的灵敏度探究 |
| 3.4.6 PfAgo介导的核酸检测的专一性探究 |
| 3.4.7 PfAgo介导的核酸检测的应用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 PfAgo介导的新型冠状病毒核酸检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 主要缓冲液 |
| 4.2.3 寡核苷酸 |
| 4.2.4 TBE-PAGE电泳实验 |
| 4.2.5 具有5’端磷酸基团的g DNA的制备 |
| 4.2.6 最佳输入gDNA的筛选 |
| 4.2.7 构建模拟靶质粒 |
| 4.2.8 筛选检测D614G突变的gDNAs |
| 4.2.9 SARS-CoV-2 PAND检测方法的构建 |
| 4.2.10 RT-qPCR实验 |
| 4.2.11 验证SARS-CoV-2 PAND的检测下限 |
| 4.2.12 临床样品来源 |
| 4.3 实验结果和分析 |
| 4.3.1 输入g DNA的优化和SARS-CoV-2 PAND的建立 |
| 4.3.2 SARS-CoV-2 PAND的优化 |
| 4.3.3 探究SARS-CoV-2 PAND的检测灵敏度 |
| 4.3.4 SARS-CoV-2 PAND对实际样本的检测 |
| 4.3.5 SARS-CoV-2 D614G突变体的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结合极短PCR和 PfAgo的核酸检测技术 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 |
| 5.2.2 主要缓冲液 |
| 5.2.3 TBE-PAGE电泳实验 |
| 5.2.4 寡核苷酸 |
| 5.2.5 构建含有VP72 基因和HPV16E6 基因的质粒 |
| 5.2.6 USPCRP核酸检测方法的初步验证实验 |
| 5.2.7 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.2.8 USPCRP检测灵敏度探究的实验 |
| 5.2.9 USPCRP检测特异性验证实验 |
| 5.2.10 USPCRP检测RNA的实验 |
| 5.2.11 USPCRP临床样品检测实验 |
| 5.3 实验结果和分析 |
| 5.3.1 USPCRP核酸检测方法的初步验证 |
| 5.3.2 USPCRP核酸检测条件的优化 |
| 5.3.3 USPCRP检测灵敏度探究 |
| 5.3.4 USPCRP检测特异性验证 |
| 5.3.5 USPCRP检测模拟的DNA病毒基因 |
| 5.3.6 USPCRP检测临床样品 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结和展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 中英文缩写对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 研究方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 HBV DNA定量检测标准曲线图的建立 |
| 3.2 绒毛组织和血液中HBV DNA的比较分析 |
| 3.3 绒毛组织HBV DNA与血液HBV标志物的关系分析 |
| 3.4 绒毛组织中抗原表达的检测 |
| 3.5 Apoh与孕妇血液HBV标志物的相关性分析 |
| 3.6 Apoh与绒毛组织中HBV标志物的相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 国内外文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录二 攻读研究生期间发表的学术论文 |
| 附录三 绒毛中HBsAg阳性表达免疫组化图 |
| 附录四 个人简介 |
| 致谢 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 逆转录重组酶介导扩增方法应用于EV71和CVA16的检测 |
| 1 引言 |
| 1.1 手足口病 |
| 1.2 重组酶介导的扩增(Recombinase aided amplification,RAA)技术 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 本研究的内容 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 标本来源 |
| 2.2 主要设备和仪器 |
| 2.3 主要试剂和耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 核酸提取 |
| 3.2 实时RT-qPCR方法 |
| 3.3 EV71和CVA16质粒制备 |
| 3.4 内参质粒制备 |
| 3.5 RT-RAA引物和探针设计 |
| 3.6 EV71-RT-RAA方法的建立 |
| 3.6.1 EV71单重实时荧光RAA反应体系的建立及引物筛选 |
| 3.6.2 EV71含内参的贼实时荧光RAA反应体系的建立 |
| 3.6.3 EV71实时荧光RT-RAA反应体系的优化 |
| 3.6.4 EV71侧流层析试纸条RT-RAA方法建立 |
| 3.6.5EV71-RT-RAA方法的特异性 |
| 3.6.6EV71-RT-RAA方法的灵敏度 |
| 3.7 CVA16-RT-RAA方法的建立 |
| 3.8 临床样本验证 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 EV71单重实时荧光法RAA体系的建立和引物筛选 |
| 4.2 EV71含内参的双重实时荧光RAA反应体系的建立 |
| 4.3 EV71实时荧光RT-RAA反应条件优化 |
| 4.4 EV71侧流层析试纸条RT-RAA方法的建立与优化 |
| 4.5 实时荧光及侧流层析试纸条RT-RAA方法检测EV71的特异性 |
| 4.6 实时荧光及侧流层析试纸条RT-RAA方法检测EV71的灵敏度 |
| 4.7 CVA16实时荧光RAA体系的建立和引物筛选 |
| 4.8 CVA16侧流层析试纸条RT-RAA方法的建立及优化 |
| 4.9 实时荧光侧流层析试纸条RT-RAA方法检测CVA16的特异性 |
| 4.10 实时荧光及侧流层析试纸条RT-RAA方法检测CVA16的灵敏度 |
| 4.11 临床标本评价 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 探针介导的重组酶扩增应用于结核分枝杆菌rpoB基因突变检测 |
| 1 引言 |
| 1.1 结核病 |
| 1.2 耐药结核病 |
| 1.3 结核分枝杆菌耐药机制 |
| 1.4 结核病诊断 |
| 1.5 探针介导的重组酶扩增 |
| 2 研究目的和内容 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 标本来源 |
| 3.2 主要试剂和耗材 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 CTAB法提取细菌基因组 |
| 4.2 标准质粒制备 |
| 4.3 PCR方法 |
| 4.4 PDRA方法 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 516位点PDRA方法优化 |
| 5.2 516位点PDRA方法特异性分析 |
| 5.3 516位点PDRA方法灵敏度 |
| 5.4 516位点PDRA方法检测结果示例 |
| 5.5 测试结果 |
| 5.6 526位点PDRA方法特异性分析 |
| 5.7 531位点PDRA方法特异性分析 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 第三部分 RAA结合CRISPR-Cas13a应用于结核分枝杆菌rpoB基因突变检测 |
| 1 引言 |
| 1.1 CRISPR概述 |
| 1.2 CRISPR-Cas13a概述 |
| 1.3 CRISPR-Cas13a应用 |
| 2 研究目的与内容 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 标本来源 |
| 3.2 主要试剂和耗材 |
| 3.3 CRISPR-Cas13a检测试剂 |
| 3.4 主要仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 细菌基因组提取 |
| 4.2 质粒标准品制备 |
| 4.3 crRNA制备及纯化 |
| 4.4 RAA引物设计及筛选 |
| 4.5 含T7启动子的靶标DNA的制备 |
| 4.6 CRISPR-Cas13a检测 |
| 4.7 516位点、526位点和531位点crRNA的筛选及特异性确定 |
| 4.8 两步法RAA-Cas13a体系的建立及优化 |
| 4.9 一步法RAA-Cas13a体系的建立及优化 |
| 4.10 两步法及一步法RAA-Cas13a检测体系的灵敏度 |
| 4.11 RAA-Cas13a检测方法评估 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 RAA引物筛选 |
| 5.2 crRNA引物序列 |
| 5.3 crRNA筛选及特异性分析 |
| 5.4 两步法RAA-Cas13a检测方法优化 |
| 5.5 RAA-Cas13a检测方法的灵敏度 |
| 5.6 RAA-Cas13a检测方法评估 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 细胞因子在HBV宫内传播与儿童乙肝疫苗应答的研究进展 |
| 第二部分 Toll样受体在HBV宫内传播的研究进展 |
| 第一部分 母体孕晚期Th1细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 母体孕晚期Th2细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 母体孕晚期TLR9 在子代HBV宫内传播中的作用研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 母体孕晚期细胞因子及TLR9表达与其幼儿预后的队列研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方案 |
| 3 统计方法 |
| 4 相关概念 |
| 结果 |
| 1 入组情况和随访结果 |
| 2 孕中、晚期启动抗病毒治疗孕妇基线情况 |
| 3 妊娠中、晚期启动抗病毒治疗疗效比较 |
| 4 妊娠期抗病毒治疗应答情况影响因素统计结果 |
| 讨论 |
| 1 妊娠中、晚期抗病毒治疗对阻断乙肝母婴传播结果分析 |
| 2 妊娠期抗病毒治疗结束时应答影响因素分析 |
| 3 妊娠期间抗病毒治疗早期应答影响因素分析 |
| 4 研究中不足之处与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 生化分析和生物传感器的概述 |
| 1.2 几种经典的生物传感检测方法 |
| 1.2.1 电化学生物传感器 |
| 1.2.2 荧光生物传感器 |
| 1.2.3 比色生物传感器 |
| 1.3 纳米材料在生物传感器中的应用 |
| 1.3.1 纳米材料性质 |
| 1.3.2 纳米材料在生物传感中的应用 |
| 1.4 本论文研究目的与意义、主要研究内容及技术路线 |
| 1.4.1 研究目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第2章 基于SiO_2纳米粒子-DNA/银纳米簇荧光偏振法检测乙肝病毒DNA |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器和试剂 |
| 2.2.2 二氧化硅纳米粒子的合成 |
| 2.2.3 二氧化硅纳米粒子的修饰及功能化 |
| 2.2.4 荧光偏振法检测HBV DNA |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 荧光偏振法检测HBV DNA的原理 |
| 2.3.2 实验条件的优化 |
| 2.3.3 检测HBV DNA |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 血红素功能化的二硫化钨纳米片的制备及其在可视化检测血液中葡萄糖的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与仪器 |
| 3.2.2 血红素功能化的二硫化钨纳米片(hemin/WS_2-NSs)的制各 |
| 3.2.3 检测双氧水和葡萄糖 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 二硫化钨纳米片的表征 |
| 3.3.2 Hemin/WS_2-NSs的形成 |
| 3.3.3 血红素功能化的二硫化钨纳米片的过氧化酶催化活性 |
| 3.3.4 实验条件优化 |
| 3.3.5 动力学反应实验 |
| 3.3.6 检测双氧水和葡萄糖 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 g-C_3N_4-Fe_3O_4过氧化物模拟酶的催化性能及其应用研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器与材料 |
| 4.2.2 g-C_3N_4-Fe_3O_4纳米复合物的制备 |
| 4.2.3 检测双氧水和葡萄糖 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 g-C_3N_4的表征 |
| 4.3.2 g-C_3N_4-Fe_3O_4的表征 |
| 4.3.3 g-C_3N_4-Fe_3O_4的过氧化酶催化活性 |
| 4.3.4 实验条件优化 |
| 4.3.5 检测双氧水和葡萄糖 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文及参与科研项目 |
| 摘要 Abstract 缩略词表 前言 第一部分 |
| 乙肝病毒母婴宫内传播研究 第一章 |
| 材料与方法 第二章 |
| 研究结果 第三章 |
| 讨论 第二部分 |
| 乙肝疫苗免疫效果观察研究 第一章 |
| 材料与方法 第二章 |
| 研究结果 第三章 |
| 讨论 第三部分 |
| 经母婴传播的 |
| HBV |
| 慢性感染母子病毒变异分析 第一章 |
| 材料和方法 第二章 |
| 研究结果 第三章 |
| 讨论 结论 参考文献 附录 综述 参考文献 博士学习期间发表的论文 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HBV 感染对胎儿及胎盘生长发育的影响 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HBV 感染对胎盘形态的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HBV 在原代胎盘滋养细胞内复制的初步探讨 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 图表附录 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 1. 前言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 HBV感染人体后体内的免疫学变化 |
| 1.3 乙肝病毒e抗原与体内细胞免疫的关系 |
| 1.4 HBV-DNA的状态与体内细胞免疫的关系 |
| 1.5 HBV母婴传播的途径及机制 |
| 1.6 HBIG阻断HBV母婴垂直传播的应用现状 |
| 2. 研究对象和方法 |
| 2.1 实验对象及分组 |
| 2.2 资料的收集及标本处理 |
| 2.3 实验技术路线 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 各组孕妇一般资料的比较 |
| 3.2 第一次抽血各组孕妇T淋巴细胞亚群的比较 |
| 3.3 HBV携带者孕妇注射HBIG对体内HBV-DNA含量的影响 |
| 3.4 孕晚期注射HBIG对孕妇体内T淋巴细胞亚群的影响 |
| 3.5 不同HBV-DNA状态的HBV携带孕妇孕晚期应用HBIG对T淋巴细胞亚群的影响 |
| 3.6 不同HBeAg状态的HBV携带孕妇孕晚期应用HBIG对T淋巴细胞亚群的影响 |
| 3.7 各组孕妇不同孕期T淋巴细胞亚群变化 |
| 3.8 孕晚期注射HBIG对HBV携带孕妇T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 乙肝病毒携带者孕妇体内的T淋巴细胞亚群变化 |
| 4.2 乙肝病毒携带孕妇的HBV-DNA的状态与T淋巴细胞亚群的关系 |
| 4.3 乙肝病毒携带孕妇HBeAg的状态与体内T淋巴细胞亚群的关系 |
| 4.4 孕期注射HBIG对乙肝病毒携带孕妇HBV复制量的影响 |
| 4.5 乙肝病毒携带孕妇注射HBIG对T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.6 正常孕妇孕28周与36周前后体内的T淋巴细胞亚群变化 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 附图 |
| 硕士研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
