吕威[1]（2019）在《转AhDREB1基因毛白杨田间苗性状对比分析和安全性评价》文中指出土壤盐渍化是一个全球性生态问题,并持续危及着人类生存所必需的生态资源,治理、利用盐渍化土壤迫在眉睫。我国杨树人工林的栽培面积世界第一,培育耐盐杨树新品种将对治理我国的盐碱地具备重要意义。本试验室已成功将AhDREB1基因转入三倍体毛白杨杂种[（Populus tomentosa ×P.bolleana）×Pmt.toenosa]中,并于2005年开展转基因环境释放中间试验。利用多种繁育方式扩大繁殖规模以及评估转基因毛白杨的生态安全性问题对于加快转AhDREB1基因毛白杨新品种审定和商品化进程具有重要的现实意义。本研究以四个不同地区种植的转基因毛白杨自根苗和嫁接苗为材料,对转基因自根苗和嫁接苗的表型性状、生理生化指标和外源基因表达量进行检测分析,以评估嫁接繁殖是否会影响转基因毛白杨外源基因的表达和耐盐能力。此外,本研究以田间种植12年的转基因因毛白杨T-46为材料,系统性的探究了转基因毛白杨的安全性问题。研究内容主要有转基因毛白杨外源基因通过花粉逃逸的可能性、外源基因的水平转移问题,转基因毛白杨枯落物中外源基因的自然降解周期问题,转基因毛白杨对不同土壤层的土壤可培养微生物数量造成的影响,以及转基因毛白杨对内生细菌群落多样性的影响,研究为转基因林木育种的安全性问题提供了更加全面的理论依据。主要研究结果如下:（1）对田间种植的转基因毛白杨自根苗和嫁接苗表型性状对比分析。2017年和2018年对自根苗的测量统计结果表明,在土壤盐碱度正常或轻微（0.2%）情况下转基因毛白杨自根苗与对照在树高和地径的年增长率差异不大,而在盐碱胁迫（0.4-0.6%）条件下转基因杨树的树高和地径的年增长量显着高于对照。2018年对嫁接苗的测量统计结果表明:在土壤盐碱度正常或轻微（0.2%）情况下转基因杨树嫁接苗的树高和地径与对照和砧木相比差异不大,而在盐碱胁迫（0.4-0.6%）条件下转基因杨树的树高和地径显着高于对照和砧木。（2）对田间种植的转基因毛白杨自根苗和嫁接苗生理生化指标和外源基因表达量进行对比分析。2018年对不同繁殖方式（自根和嫁接）的转基因毛白杨田间苗的生理指标检测结果表明:无论是自根繁殖还是嫁接繁殖,转基因毛白杨叶片中的SOD活力,POD活力和PRO含量均显着高于对照非转基因毛白杨（受体）,对照741杨以及砧木小叶杨,而MDA含量均显着低于对照。2018年对不同繁殖方式（自根和嫁接）的转基因毛白杨田间苗根、茎和叶的外源基因表达量检测结果表明:不同系号间和同系号不同植株间转基因毛白杨外源基因表达量均存在差异,但差异不显着。同植株不同器官间外源基因表达量不同,外源基因在叶片的表达量最高,嫁接繁殖与自根繁殖的毛白杨外源基因表达量存在差异,但差异无规律可寻。（3）试验系统性的评价了多年生转基因毛白杨对环境可能造成的影响。A外源基因漂移的研究。2018年对田间种植13年的转基因毛白杨花粉活力和杂交结实率检测结果表明转基因毛白杨花粉几乎没有活力,杂交结实率极低。此外,分别于2017年和2018年对田间种植12年、13年的转基因毛白杨林下土壤微生物基因水平转移情况进行PCR检测,连续两年的试验结果表明:我们暂未检测到外源基因水平转移到土壤微生物基因组中。B转基因毛白杨枯落物外源基因自然降解周期的研究。2017年5月、7月、9月开展转基因毛白杨枯落物中外源基因在自然环境中的降解周期试验,试验结果表明:转基因毛白杨的外植体（枝、茎和叶）无论是埋在土里、飘落在地表、飘落在草坪上,其外源基因均能在3个月后自然降解。C种植12年的转基因杨树对土壤可培养微生物影响的研究结果表明种植12年的转基因杨树暂未对林下根际土壤可培养微生物（细菌、真菌和放线菌）数量造成显着影响。D转基因杨树对其内生细菌群落多样性影响的研究结果表明:转基因毛白杨与对照非转基因毛白杨根和茎内生细菌群落结构无显着差异,而叶片内生细菌群落结构存在显着差异,差异显着的菌属主要有蓝藻菌属（Cyanobacteria）、分支杆菌属（Mycobacterium）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、假单胞菌属（Pseudomonas）和伯克氏菌属（Burkholderia-Paraburkholderia）。
李卓[2]（2018）在《气候变化下固氮菌调控Bt玉米生长及其靶标害虫粘虫发育与营养利用研究》文中认为当前,气候变化已成为全球性环境“热点”问题。统计报告显示,全球CO2浓度已从工业革命前的280ppm增长至2017年的406ppm;此外,全球温度也自19世纪末工业革命后逐渐变暖,1990-2005年全球平均温度增幅约为每十年0.15℃-0.3℃,未来全球气候将持续变暖。随着全球气候变化问题逐渐凸显,转Bt作物也将面临着众多生态风险。研究表明,大气CO2浓度升高在提高作物产量、生物量积累的同时,可显着降低转Bt棉花和转Bt水稻外源Bt蛋白含量,进而表现对外源Bt蛋白的“稀释效应”及其基因表达“沉默”现象,致使其面临靶标抗虫性降低的生态风险。另一方面,转Bt作物的N素代谢生理水平可以影响Bt蛋白的合成和表达。因此,我们设想对N肥进行优化管理是提高转Bt作物的氨基酸合成及硝酸还原酶等氮素代谢关键酶活性的一种重要手段,由此来促进植物蛋白质（包括Bt蛋白）的合成及表达。在大气温度和CO2浓度升高环境条件下,转Bt作物对其靶标鳞翅目害虫会有怎样的影响?不同固氮菌处理下转Bt作物的肥效利用及抗虫表达存在何种差异?这些问题的明确有助于我们充分利用固氮菌来优化管理肥料达到增强作物抗虫能力和减肥增效的效果,有利于保证气候变化下我国转Bt作物的生产安全和生态可持续利用。本研究紧密联系我国主要的粮食作物（玉米）的生产实际,以转Bt玉米为研究对象,结合温度CO2浓度升高这一全世界气候变化热点问题,接种筛选出的两种高效固氮的固氮菌（巴西固氮螺菌和圆褐固氮菌）处理下,从昆虫生理学、植物营养学和生理生化等角度入手研究气候变化下固氮菌调控转Bt玉米生长和产量情况,及其靶标害虫粘虫的生长发育和繁殖以及取食营养利用等,主要研究结果如下:1.气候变化下固氮菌调控Bt玉米生长及其产量评估本研究以转Bt玉米为研究对象,结合温度和CO2浓度两个关键环境因子,在不同固氮菌处理下,就转Bt玉米及其亲本对照的生长势、产量、植株营养水平及其土壤肥力进行了系统研究和比较。试验结果显示,就植株生理指标来看,倍增CO2显着提高了玉米的生长势（如茎粗、株高、根冠比及植物干重）和产量（百粒重、单株干籽粒重）;接种巴西固氮螺菌（AB）和圆褐固氮菌（AC）都显着增加了玉米的生长势（茎粗、株高、根冠比及植物干重）和产量指标（百粒重、单株干籽粒重）,结果表明倍增CO2浓度和固氮菌处理均显着增加了玉米植株生物量积累,有利于玉米的生长。就植株营养生化指标来看,倍增CO2显着增加了植株全碳含量及少数必须氨基酸（如苏氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸）的含量,并显着降低了植株全氮含量、全磷含量、全钾含量及部分氨基酸（如天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和酪氨酸）含量;接种巴西固氮螺菌（AB）和圆褐固氮菌（AC）均显着增加了植株全氮含量、全磷含量及大部分氨基酸（如天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸和组氨酸）的含量,同时降低了植株全碳含量、全钾含量以及丝氨酸和精氨酸的含量,研究结果表明倍增C02有利于植株C素利用和积累,可见,通过固氮菌处理缓解了环境倍增CO2对玉米营养水平的不利影响,提高了植株N素利用和营养水平,充分利用固氮菌来优化管理肥料达到减肥增效、增产具有指导性意义。2.气候变化下固氮菌调控Bt玉米植物保护酶和外源Bt毒素表达研究本研究以转Bt玉米和亲本玉米为研究对象,结合温度和C02浓度以及接菌固氮菌处理,从植物生理生化学入手详细描述、比较了玉米保护酶和外源Bt毒素表达的差异。实验结果显示,倍增CO2浓度显着增加了植株自身保护酶活性和与次生防卫（JA）息息相关的5种氨基酸（缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸）的含量;两种固氮菌侵染也显着提高了植株自身保护酶活性和5种氨基酸的含量,结果表明环境压力促进了植株自身防御系统,固氮菌侵染提高了植物自身的诱导抗性;从ELISA和Western实验结果得出,倍增CO2浓度显着降低了转Bt玉米外源Bt毒蛋白表达;接种巴西固氮螺菌和圆褐固氮菌均显着提高了转Bt玉米外源Bt毒蛋白表达,其中圆褐固氮菌效果更好,研究结果表明倍增CO2抑制了转Bt玉米外源毒蛋白表达,而通过固氮菌侵染则缓解了这一不利影响,并提高了转Bt玉米应对未来环境压力所带来的靶标抗虫性降低这一生态风险的应变能力,促进了玉米自身防卫的同时也提高了转Bt玉米组成抗性的表达,通过固氮菌侵染来优化管理肥料达到减施增效的效果,有利于保证气候变化下我国转Bt作物的生产安全和生态可持续利用。3.气候变化下固氮菌调控Bt玉米对其靶标害虫粘虫生长发育、繁殖和取食营养利用的影响研究本研究以转Bt玉米为研究对象,结合温度和C02浓度两个关键环境因子,在不同固氮菌处理下,就靶标害虫粘虫Mythimna separata（Lepidoptera:Noctuidae）的生长发育、繁殖及营养利用进行了系统研究。结果显示,倍增CO2显着增加了粘虫幼虫历期、蛹期、相对取食速率RCR和近似消化率AD,显着降低了化蛹率、蛹重、成虫寿命、繁殖力、相对生长速率RGR、消化食物转化率ECD和摄取食物转化率ECI,实验表明倍增CO2浓度通过降低寄主植物的营养水平,间接对植食性害虫的生长发育和取食利用产生了消极影响,靶标害虫粘虫增加了取食量来满足自身生长需要来应对此类消极影响,从而预测未来气候变化下玉米将面临靶标害虫粘虫暴发为害风险;另一方面,喂食固氮菌侵染后的转Bt玉米会显着增加幼虫历期、蛹期、RCR与AD,缩短了成虫寿命,同时显着降低了化蛹率、蛹重、成虫繁殖力、RGR、ECD和ECI,与侵染后的亲本玉米呈相反规律,研究结果表明固氮菌侵染增加了转Bt玉米的毒素表达,靶标害虫粘虫的生长发育及取食利用受到阻碍甚至致死。综合考虑,高CO2浓度会导致粘虫取食量增加,田间危害加重,同时高C02浓度存在对外源Bt蛋白的“稀释效应”,施加根际固氮菌有利于缓解此现象,对转Bt玉米的抗虫效果也有增效作用。正如预期的那样,连续两年的实地研究数据并没有显着的年际变化,温度因素也无显着影响。从整体趋势上看倍增CO2浓度降低了玉米植株的营养水平,抑制了转Bt玉米的毒蛋白表达,也间接导致了粘虫取食量增加田间危害加重;通过增施固氮菌缓解了环境压力对植株营养利用和抗性表达的不利影响,也提高了玉米植株自身防卫和营养品质。本研究系统的阐明了气候变化下（C02、温度）固氮菌调控Bt玉米生长及其靶标抗虫性的变化并从生理学、营养学和生理生化多角度进行验证,明确了气候变化下粘虫的发生为害规律,并提供了行之有效的生物调控手段来优化管理肥料达到减施增效、增产的效果,有利于保证气候变化下我国转Bt作物的生产安全和生态可持续利用。
方盼[3]（2011）在《高效工程菌对水体中类固醇污染物的降解研究》文中认为本研究以采自27个不同地区的河水（溪水）及3个商品饮用水作为材料,以高效液相色谱（HPLC）与固相萃取相结合的方法进行环境水体中五种主要类固醇激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、胆固醇、睾酮）的测定；同时选用4个地点（福州段）的闽江水作为代表,研究其类固醇污染物含量的周年变化；并应用具有降解多种难降解化合物、能利用类固醇化合物为唯一碳源和能源并将其消耗的睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）,及其改良工程菌株（P8、Ca3）对污染水体中类固醇激素进行降解,以期为工程菌在环境污染生物修复中的应用提供理论依据。主要研究结果如下：1.利用HPLC-SPE方法检测各水样品中类固醇物质主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮、胆固醇）的含量结果表明：27不同地点的河水（溪水）及其底泥中均有类固醇化合物残留,经方差分析表明含量差异极显着；商品饮用水：市售纯净水、矿泉水中均未检测出该类物质。2.福州段闽江及城市内河选取四个地点检测水中类固醇物质主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮）含量的动态测定,结果表明：上述各物质含量变化趋势并不完全一致,各雌情化物质中对环境最具潜在影响的雌二醇在1月、11月的含量相对较高,而5月、8月含量相对较低,经方差分析显示各月份含量存在显着差异；类固醇物质主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮）的总含量在5月份最低,经方差分析显示与其他3个月份存在显着差异。3.利用野生型睾丸酮丛毛单胞菌（C.t.）及基因改造菌株P8、Ca3,对水体中残留的类固醇化合物及其主要成分（雌酮、雌二醇、雌三醇、睾酮）的降解试验结果表明：不同采集水样、菌株、月份各因子水平上都存在显着差异。基因改造菌株P8、Ca3对类固醇化合物的降解能力优于野生型菌株C.t.；不同地点水体中,P8菌株在48±1h后对类固醇化合物的降解率比C.t.高出1.13-1.33倍,可以达到68.32%～70.22%。降解过程中接种的各工程细菌（P8、Ca3）密度呈指数衰减而后趋于稳定,之后随着时间的推移细菌的活细胞数量越来越少,最终可达10-100 cfu/L,各菌株活细胞数量比较为：C.t>P8>Ca3,即工程菌最终残留密度均低于野生型菌株C.t.。
冯珊珊[4]（2008）在《嗜线虫致病杆菌对非靶标生物的安全性评价》文中提出嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophila）HB310菌株是从河北省土壤中的小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocaposae）肠道内所分离到的共生细菌,该菌株对多种昆虫具有口服杀虫活性。为探索该菌株作为杀虫制剂或杀虫基因应用于生产的可行性,本研究以赤眼蜂、中红侧沟茧蜂、异色瓢虫和家蚕为主要试虫,研究了HB310菌液及其蛋白毒素对非靶标生物的安全性,同时研究了HB310菌株对甘蓝田生物多样性的影响。主要研究结果如下:1.嗜线虫致病杆菌HB310菌液和蛋白毒素粗提物对寄生麦蛾卵的甘蓝夜蛾赤眼蜂和螟黄赤眼蜂的羽化率无影响。饲喂含HB310菌液、细胞以及上清液的蜂蜜能明显缩短甘蓝夜蛾赤眼蜂和螟黄赤眼蜂成蜂的寿命,并且浓度越大,寿命越短。饲喂含HB310毒素Ⅱ的浓度低到1μg/mL的蜂蜜时对两种赤眼蜂寿命没有影响。2.嗜线虫致病杆菌HB310菌液和蛋白毒素对中红侧沟茧蜂发育茧和滞育茧的羽化率无不良影响。中红侧沟茧蜂成蜂直接饲喂含HB310菌液和蛋白粗提物的蜂蜜,其寿命随浓度增大而缩短,但HB310蛋白毒素粗提物浓度降低到100.00μg/mL时中红侧沟茧蜂的寿命与饲喂蜂蜜的无差别,饲喂20μg/mL HB310毒素Ⅱ,寿命显着短于对照。中红侧沟茧蜂接种5日龄的棉铃虫后,改饲喂毒素处理的饲料,对中红侧沟茧蜂的一系列生理指标都无显着影响,而从棉铃虫初孵幼虫开始,持续饲喂处理饲料,直至中红侧沟茧蜂出茧,HB310菌液对中红侧沟茧蜂的各项生育指标无显着影响,但是,寄生于持续取食227.04μg/mL HB310蛋白毒素粗提物的棉铃虫,中红侧沟茧蜂的卵-幼虫期显着长于对照,而茧重、出茧率、羽化率以及成蜂寿命与对照无显着差别。3.以HB310菌液和蛋白毒素粗提物处理的桃蚜和小菜蛾饲喂异色瓢虫,对异色瓢虫的捕食功能无不良影响。HB310菌液短时间（72 h）或低浓度蛋白毒素粗提物（10.00μg/mL）的处理的桃蚜对异色瓢虫的各生育指标无显着影响,但一直取食HB310菌液处理的桃蚜对异色瓢虫的幼虫期、蛹重、成蛹率、羽化率和存活率有影响。而高浓度的蛋白毒素粗提物（100.00μg/mL）对异色瓢虫的蛹重、成蛹率有影响。取食HB310蛋白毒素粗提物饲喂的小菜蛾,异色瓢虫的各生育指标与对照无显着差别,但是,取食3.73×103 CFU/mL HB310菌液饲喂的小菜蛾的异色瓢虫化蛹率和15d的存活率显着低于对照。4.HB310菌液对家蚕的急性毒力很低,即使在处理后120h,仍然不能测定出其LC50。家蚕对嗜线虫致病杆菌HB310菌液和蛋白毒素粗提物均表现出一定的拒食性。家蚕5龄幼虫对2.24×106CFU/mL HB310原菌液和567.60μg/mL蛋白毒素粗提物的48 h拒食率分别达到24.90%和23.05%。HB310菌液及蛋白毒素粗提物对家蚕各龄幼虫体重均有明显的抑制作用,并且随龄期而增大。从蚁蚕开始一直饲喂含HB310原菌液人工饲料的幼虫各龄历期均明显延长,存活率显着下降,到4龄全部死亡。幼虫取食含原菌液人工饲料72 h后改饲喂正常饲料,1龄和2龄的历期明显长于对照,但以后各龄历期、化蛹率、羽化率、蛹重和茧层量等各项生物学指标均与对照无显着差异。1.12×104 CFU/mL HB310菌液和113.52μg/mL蛋白毒素粗提物对家蚕的生长发育无显着影响。综合分析认为,HB310菌株对家蚕毒性较低。5.甘蓝田喷施嗜线虫致病杆菌HB310菌液,其对小菜蛾的防效与（Bacillusthuringiensis,Bt）HD-1差异不显着。6月1日施药后6月6日调查,对小菜蛾防效分别为49.43±22.05%和59.24±20.05%。但嗜线虫致病杆菌HB310防治菜青虫的田间效果低于Bt HD-1,6月1日第3次喷药后,6月6日调查对菜青虫的防效HB310为52.10±2.33%,Bt HD-1为72.73±1.60%。与对照区相比,HB310防治区与Bt防治区的天敌数量、节肢动物种类丰富度和个体丰富度没有显着不同,即HB310菌在杀死甘蓝田害虫的同时对天敌有较明显的保护作用,对节肢动物群落的结构和多样性没有影响。
曹伟平,王金耀,冯书亮,王容燕,杜立新,张杰,贾艳华[5]（2006）在《转Bt基因工程菌BioP8在环境中的消长动态及生物学效应》文中进行了进一步梳理20012004年,在河北省保定市对转Bt基因荧光假单胞菌工程菌BioP8进行了环境释放,并跟踪调查该工程菌在田间的定殖、扩散、田间防效以及对田间节肢动物群落的影响.结果表明,BioP8在甘蓝叶、根及土壤中均能定殖、存活,在植物根部存活能力较强.在施药后d3,BioP8菌密度均达最高值,之后趋于衰减;BioP8对甘蓝田中天敌有较明显的保护作用,对田间节肢动物群落物种丰富度有一定的影响,BioP8防治区的节肢动物个体总量介于化防区和空白对照区的个体总量.图2表1参7
周琳[6]（2006）在《荧光假单胞菌工程菌环境释放后的分子生态学分析和安全性评价》文中研究指明本研究中通过比较四种土壤样品总DNA的提取方法,确定了以提取成本较低、提取效率较高（3.15 mg DNA/g土）、提取质量最适于偶联后续DGGE技术的土壤样品总DNA的提取方法作为本研究中土总DNA的提取方法:即土壤样品预处理,土壤样品总DNA的粗提取,土壤样品总DNA的纯化;然后以纯化后的土壤总DNA为模板进行细菌16S rDNAV3区扩增;接下来采用微生物分子生态学手段的变性梯度凝胶电泳技术（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）结合DGGE图谱直接观察法和DGGE图谱聚类分析的方法对荧光假单胞菌工程菌株BioP8和分别在基因组和质粒上带有红色荧光蛋白标记（rfp）的荧光假单胞菌8’P303和12P303在进入土壤中后的微生态行为进行了跟踪监测和分析。研究中未发现荧光假单胞菌工程菌株BioP8和分别在基因组和质粒上带有红色荧光蛋白标记（rfp）的荧光假单胞菌8’P303和12P303对土壤中细菌群落组成和结构产生明显的可检测得到的影响。从DGGE图谱上几乎观察不到空白对照土壤样品与喷施了相应菌液的土壤样品有差别;结合ImageJ,Mathworks Matlab V7.1以及PAST软件对DGGE图谱进行聚类分析:在喷施了荧光假单胞菌工程菌株BioP8的处理土壤的DGGE图谱上,第7天、第15天和第45天的空白对照土壤样品和经荧光假单胞菌工程菌BioP8处理的土壤样品分别聚在一起,细菌群落组成相似性大约在88%左右;而第0天与第1天的4份土壤样品聚在一起,第30天与第45天的4份土壤样品聚在一起,第60天与第90天的4份土壤样品聚在一起。由此可以看出,取样时间相对应的空白对照土壤样品与喷施了荧光假单胞菌工程菌BioP8的土壤样品细菌群落组成相似性在85%左右;而纵向时间上的差别也不是很大,其相似性程度也在70%以上;在8’P303的处理的DGGE图谱上,主要有三个cluster:第一个cluster主要包括第0天到第15天的空白对照土壤样品和喷施了基因组带有红色荧光蛋白标记的荧光假单胞菌8’P303的土壤样品,各个样品之间的细菌群落组成相似性均在80%左右;第二个cluster主要包括第30天和第45天的土壤样品,其细菌群落组成相似性在90%左右;第三个cluster主要包括第60天和第90天的土壤样品,其细菌群落组成相似性在80%左右,所有土壤样品细菌群落组成相似性也可达到60%以上;在12P303的处理的DGGE图谱上,第0天到第15天的包括空白对照土壤样品和喷施了带有红色荧光蛋白质粒标记的荧光假单胞菌12P303的土壤样品均聚在一起,细菌群落组成相似性约为80%;第30天和第45天的样品聚在一起,细菌群落组成相似性约为85%;第60天和第90天的样品聚在一起,细菌群落组成相似性也达到80%。由此可见,对于荧光假单胞菌工程菌以及带有红色荧光蛋白标记的荧光假单胞菌,从微生物分子生态学角度评价,二者均具有良好的生态安全性,可以进行大规模的环境释放和田间应用。本研究采用微生物分子生态学手段为荧光假单胞菌工程菌的产业化和生产应用提供直接的科学依据,具有重要的理论意义和实践价值。
蒋建东[7]（2006）在《多功能农药降解基因工程菌的构建及其环境释放安全评价研究》文中研究指明农药污染的微生物修复被认为是最具有前景的修复方法之一，然而，由于农药污染种类复杂，迫切需要构建多功能的农药降解工程菌来满足生物修复的需求。工程菌实际应用于农药污染的修复必须具有遗传稳定、不含外源抗性等特点，将外源基因通过同源重组的方法整合到受体菌染色体上是一种理想的方法。另一方面，由于转基因微生物（基因工程菌）的复杂性和不确定性，其环境释放的安全性受到广泛关注，因此，工程菌在应用前必须进行环境释放安全性评价。本研究构建了以sacB基因为反筛选标记的同源重组载体，将外源甲基对硫磷水解酶基因mpd整合到呋喃丹降解菌Sphingomonas agrestis CDS-1的16S rRNA基因（rDNA）位点，构建了遗传稳定、不含外源抗性的能同时降解甲基对硫磷（MP）和呋喃丹的工程菌株，并通过PCR和Southern杂交的方法验证了同源重组事件的发生。mpd基因插入失活一个rrn操纵元对受体菌生理活性和农药降解特性没有负面影响。基因工程菌遗传稳定，经过120代的无选择压力培养，外源mpd基因不丢失。mpd基因整合于rrn位点受到16S rRNA基因强启动子的影响，能增加转录与表达水平，工程菌各个时期内的比酶活均大于出发菌株DLL-1。工程菌即使在外加碳源情况下，能在广泛起始pH、温度、通气量和不同接种量条件下完全降解100mg／kg的MP和呋喃丹农药。构建的基因工程菌株获得农业转基因生物安全管理委员会批准在江苏省进行环境释放的中间试验（农基安办字2003-T285）。为了研究Sphingomonas这类具有重要工业用途和广阔环境修复应用前景菌株的同源重组关键参数，以mpd基因为外源报告基因，不同长度同源臂的同源重组载体为供体DNA和具有不同同源性的Sphingmonas菌株的16S rDNA片段为受体DNA，研究同源重组指导序列的长度和差异性对同源重组效率的影响。结果表明同源臂长度对同源重组的效率影响显着，同源臂最长时同源重组的效率最高，达到5.0±2.10×10-7，当两端的同源臂缩短时，同源重组的效率呈指数下降，Sphingomonas菌株16S rRNA基因位点同源重组的最小片段长度（MEPS）需大于100bp。在Sphingomonas中，发生有效同源重组的供体和受体DNA序列同源性须高于96％。同源重组效率受到序列差异性的显着影响，当供、受体DNA之间存在3-4％的差异性时，同源重组效率相对于100％同源性序列之间下降了3.3到35.7倍。P.putida KT2440菌株中受体DNA与供体DNA之间的同源性为79％，但能在2.8×10-9水平上发生有效同源重组，表明同源重组的效率受到同源性、打靶位点拷贝数和转化效率等多种因素的影响。λRed重组系统能显着提高短同源臂载体的同源重组效率，以99bp的保守16S rDNA序列为同源臂的λRed同源重组载体能够在Sphingomonas agrest CCDS-1、BHC-A和P．putida KT2440中以5.1×10-10～1.1×10-11水平发生有效重组。为提高甲基对硫磷水解酶（MPH）的表达水平，以P．putida KT2440染色体上多拷贝16S rDNA位点为同源重组整合位点，将外源mpd基因多拷贝整合到不同的rDNA位点，分别获得到整合了1-4个mpd基因的重组子。KT2440中7个rrn拷贝中的1-4个被失活，其生长速率与出发菌株相比没有显着差异。同样受rrn位点启动子的影响，mpd基因在rrn位点的整合能提高转录与表达水平，随着mpd基因拷贝数的增加，酶活和比酶活显着增加，KT2440-4mpd最高比酶活达到12.9 mU／μg蛋白，比出发菌株DLL-1提高3.2倍。为延长农药降解基因工程菌剂的货架期，研究了不同载体对菌剂保藏效果，表明草炭的保藏效果最好，可以将液体剂型的20d的保藏期延长到120d，并能维持在109CFU／g载体水平。蛭石的保藏效果较好，是一种比较理想的替代载体。经过120d保藏，在灭菌与未灭菌土壤中投加7.1×107CFU／g干土工程菌均能良好降解50mg&gMP和25mg&g的呋喃丹，MP的降解速率均高于呋喃丹；在灭菌土壤中，两种农药的降解效率快于未灭菌土壤，工程菌数量的下降也较未灭菌土壤慢，在两种土壤中20d和15d后分别检测不到工程菌。为评价基因工程菌的环境释放安全性，在江苏大丰进行了中间试验水平上的安全评价研究。投加1.01×107CFU／g干土的工程菌株在30d时均能完全降解10.71mg／kg的MP和1.29mg／kg的呋喃丹。平板计数表明工程菌在土壤中快速下降；MPN-PCR检测结果显示每克混合土壤中（0-10cm）靶标工程菌在4d，15d和30d的数目分别为2.15±0.98×106，3.70±4.66×104和检测不出。MPN-PCR计数灵敏度要比平板计数法高出1-2个数量级。构建了工程菌Sphingomonas sp.CDS-mpd的特异性荧光原位杂交（FISH）探针，可以专一性的检测到土壤中的靶标工程菌株。三种工程菌检测方法的计数结果表明工程菌在土壤中逐渐消亡，不会成为优势菌，也不会逃逸到释放区外。从土壤可培养微生物三大菌群的计数结果看，工程菌的投加不会对土壤微生物数量产生显着影响。基于通用引物扩增的细菌16S rDNA V3区的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析结果表明农药的施加对细菌菌落结构有显着影响，到60d时细菌群落结构逐渐恢复。工程菌释放在前期对细菌群落结构有一定影响，在工程菌释放后的4d后，相对空白的相似性只有49.57％。在60d时，空白、施药和施菌小区的图谱相似性都在90％以上，表明工程菌释放不会长期影响微生物群落结构，工程菌的释放是安全的。
邓欣[8]（2006）在《转基因抗虫棉叶围细菌种群动态及nptⅡ基因漂移研究》文中认为本研究以转基因抗虫棉33B、SGK321、GK12及其受体棉33、石远321、泗棉3号6个棉花品种为材料，在棉花整个生育期运用常规微生物学技术和分子生物学技术相结合分析了转基因抗虫棉叶围细菌的种群动态变化，并监测了卡那霉素抗性标记基因nptⅡ漂移到叶围细菌的情况。 采用常规培养的方法，分析6个棉花品种的叶围细菌在整个生育期的数量及群落多样性变化，叶围细菌的总数量随着时间的变化有着显着的变化，但同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间的差异较小。叶围细菌群落多样性指数的研究表明，同一品种叶围细菌多样性指数随着时间的变化而存在显着差异。但同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间的差异较小。根据形态特征将分离的叶围菌株分为104类，对17个主要菌株的ITS序列进行克隆测序，与数据库的序列进行比对鉴定细菌，17个ITS序列都被GenBank收录（登陆号为DQ447751-DQ447767），分为10类，涉及9个细菌属，4个酵母菌属。占优势的为Bacillus芽孢杆菌属、Pseudomonas假单孢菌属。 采用RISA法研究了6个棉花品种的叶围细菌群落多样性，比较不同棉花品种间叶围细菌群落结构的差异。用RISA法分析棉花叶围细菌群落结构，能够得到清晰的指纹图谱，表明叶围细菌群落结构复杂，多样性丰富。聚类分析结果表明，棉花叶围细菌的构成无论从时间还是棉花品种上看，都呈现极大的不均匀性和随机性。认为环境及气候等因素对叶围细菌的生长影响较大，转基因抗虫棉对叶围细菌的群落结构变化无显着影响。 研究了6个棉花品种叶围卡那霉素抗性细菌的数量及群落多样性变化。同一品种的叶围卡那霉素抗性细菌的总数量在不同采样时间之间差异显着，但同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间的差异较小。对不同时间的6个棉花品种的叶围卡那霉素抗性细菌群落多样性指数的研究表明，叶围卡那霉素抗性细菌多样性指数在不同采样时间也存在显着差异，但同一采样时间抗虫棉和对应的受体棉间无显着差异。同时，以质粒pBI121为对照，根据卡那霉素抗性基因设计的特异性引物，对分离的叶围卡那霉素抗性细菌采用菌落PCR方法监测ntpⅡ基因的漂移，在转基因抗虫棉品种SKG321，GK12及受体棉泗棉3号的叶围细菌中发现阳性片段，认为转基因抗虫棉中的卡那霉素抗性标记基因能够向叶围细菌漂移。
张振宇[9]（2005）在《苏云金芽胞杆菌新异杀虫晶体蛋白基因的克隆与基因工程菌WG-001的安全评估》文中研究指明新的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的克隆对于控制害虫对苏云金芽胞杆菌杀虫剂的抗性和研究晶体蛋白对苏云金芽胞杆菌的生物学意义等理论研究都具有重要意义。在本文第一部分中，在以往从“无毒”菌株中发现其晶体蛋白对特定生物体具有毒杀作用的诸多实例的启发下，以实验室保藏菌种材料中部分晶体蛋白成分较新异且未发现杀虫活性的菌株为研究对象，进行了晶体蛋白基因的克隆，并成功的从华中亚种的标准菌株YBT978中成功的克隆到cry7Ba1，为cry7群中新亚群，其表达产物对小菜蛾具有高效杀虫活性；这为寻找新异杀虫晶体蛋白基因开辟了新的思路。本文第二部分进行了苏云金芽胞杆菌基因工程菌WG-001的安全评估，包括工程菌WG-001的定植能力、传播扩散能力、对土着微生物的影响、遗传变异能力以及特异基因cry1Aa和cry1Ac水平转移能力五个方面的内容，初步证明其对南方蔬菜地土壤环境有很高的安全性，为其推广应用提供了安全性实验数据支持。 具体结果如下： 1．筛选出BMB1518、YBT978、L60、NXP15-04、PBt53、HZ39-04、LT1L-57、NARCBt17、EA15196、EA14696、T70。其中，BMB1518、YBT978、L60、NXP15-04、EA15196的晶体蛋白已转至PVDF膜，BMB1518的45kD晶体蛋白、YBT978的130kD晶体蛋白、EA15196的42kD晶体蛋白已测得N-末端15个氨基酸序列。 2．构建了YBT978的基因组BAC文库。同时根据YBT978的130kD晶体蛋白N-末端15个氨基酸序列，采用结合接头的PCR扩增方法获得了此130kD晶体蛋白对应基因N-端的DNA序列，据此设计了引物130A1-2和130S1-2，用于从YBT978的基因组BAC文库中筛选含有130kD晶体蛋白基因的克隆子。对得到的阳性克隆子进行亚克隆，最终获得了3465bp的130kD晶体蛋白基因编码区，并预测了RBS序列和BtⅠ、BtⅡ重叠双启动子，终止子，以及全部的8个保守区。此多肽与其它已知的Cry与Cyt蛋白的氨基酸序列比较结果表明它与Cry7Ab2最相似，identity达到了58.2％；其中，其C-端序列非常相似，identity为87.9％，而N-端序列的相似度较低，identity为37.1％。此晶体蛋白已被杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为Cry7Ba1，为Cry7群的新亚群。将cry7Ba1转入无晶体突变株CryB，能形成晶体蛋白与野生菌株YBT978形状和大小相似的双金字塔形伴胞晶体，其晶体蛋白成分为预期的130kD大小。生测结果表明，伴胞晶体无毒的YBT978表达的Cry7Ba1蛋白在体外溶解后对小菜蛾具有高毒力。由于Cry的N-端为其毒力核心区域，因此根据Cry7Ba1的N-端与已知Cry的相似度很低的特点，推测此晶体蛋白识别昆虫中肠上皮细胞上新异的受体，具有很高的开发价值。cry7Ba1的发现从一定程度上预示在众多被认为“无毒”的苏云金芽胞杆菌中蕴藏着丰富的杀虫晶体蛋白基因资源，为寻找杀虫晶体蛋白提供了新的思路。
贾艳华[10]（2005）在《红色荧光蛋白基因标记荧光假单胞菌的研究》文中认为转基因微生物（Genetically modified microorganism, GMM）在农业生产中具有重要作用,其在环境中的安全性问题倍受关注。分子生态学技术的发展为探明细菌的微生态行为提供了有效手段与技术支持。荧光假单胞菌作为重要的生防细菌,起着越来越重要的作用,因而构建良好的荧光假单胞杆菌标记系统是非常重要的。 本研究重组荧光假单胞菌工程菌BioP8的环境生态安全性结果显示:工程菌BioP8在甘蓝叶片上的总菌落密度维持在108CFU/cm2左右,抗性菌落维持在103 CFU/cm2左右;土壤中总菌落密度维持在108 CFU/g左右,抗性菌落约为102 CFU/g;喷洒工程菌BioP8前后叶片上的芽孢杆菌数维持在106CFU/cm2;工程菌BioP8在田间的扩散情况实验结果表明,防治后30天后土壤中的总细菌数为108 CFU/g,超过5米的土样中没有分离出Rif/Km/Spc抗性菌落,说明BioP8的扩散能力很弱;BioP8在甘蓝植株根部的定殖实验显示抗性菌落在浸根后1天和9天各出现一高峰值,之后逐渐恢复到浸根前的水平,30天后,其在根部的密度为103 CFU/g;BioP8悬浮剂防治小菜蛾田间实验调查结果表明,工程菌BioP8速效性比化学农药对照差,防治后7、15天,BioP8防治区对小菜蛾的防效逐步增加,分别达46.4%和85.7%,其防治效果高于灭多威防治区;工程菌BioP8对甘蓝田中天敌种群的影响调查结果表明几种主要天敌昆虫数量和对照区相当。而化防区天敌昆虫数量显着降低,施药后3、7、15天分别比对照减少68.7%、62.5%和36.7%。处理对甘蓝田节肢动物群落存在不同的影响,调查区甘蓝田节肢动物物种个体丰富度有所不同,害虫丰富度依次为空白对照区>化防区>工程菌BioP8防治区;天敌个体丰富度依次为工程菌BioP8防治区>空白对照区>化防区,化学农药对天敌的影响较大,而生防区害虫的数量保持在较低的水平,蜘蛛和天敌均高于化防区;工程菌对甘蓝的生长发育及其它病害发病情况调查结果表明,工程菌BioP8在甘蓝田中不会诱发霜霉、软腐等甘蓝常见病害,也不会对甘蓝产生致病性药害,对甘蓝的生长发育也无不良影响,其长势和化学农药区相当,明显好于空白对照区。 用昆虫消化液处理RFP（red fluorescent protein, RFP）结果表明RFP在昆虫消化液中能抵抗蛋白酶的作用,RFP在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中非常稳定,仍发出正常的红色荧光。这也证明了RFP稳定性很强,这些特性将能很好的应用于Cry蛋白在害虫中肠的定位和作用机理等方面的研究。 构建了含有红色荧光蛋白基因表达盒的质粒载体pJH3。将rfp基因表达盒分别插入Mini-Tn5转座子和插入到大肠杆菌—荧光假单胞菌穿梭载体pSPCPα-1ac中,得到质粒载体pJH4和pJH5。之后将rfp基因整合到荧光假单胞菌P303和其工程菌BioP8中,分别得到8’P303,8’BioP8;将pJH5转入P303中得到转化子12P303。质粒标记工程菌在366nm紫外光下发出强烈的
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 植物的耐盐机制研究进展 |
| 1.1.1 植物在组织器官水平上的耐盐机制 |
| 1.1.2 植物在分子细胞水平的耐盐机制 |
| 1.2 杨树耐盐转基因研究进展 |
| 1.3 转基因植物安全性评价 |
| 1.3.1 外源基因的漂移 |
| 1.3.2 转基因植物对目标和非目标生物的影响 |
| 1.3.3 转基因植物对土壤微生物的影响 |
| 1.4 研究内容与拟解决的主要问题 |
| 1.4.1 研究问题的提出 |
| 1.4.2 研究的内容 |
| 1.4.3 拟解决的主要问题 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 转基因毛白杨田间苗性状对比分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 田间种植的转基因毛白杨自根苗和嫁接苗表型性状对比分析 |
| 2.1.3 田间种植的转基因毛白杨自根苗和嫁接苗生理生化指标对比分析 |
| 2.1.4 转基因毛白杨自根苗和嫁接苗外源基因表达量对比分析 |
| 2.1.5 数据统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 田间种植的转基因毛白杨自根苗和嫁接苗表型性状分析结果 |
| 2.2.2 田间种植的转基因毛白杨自根苗与嫁接苗生理生化指标分析结果 |
| 2.2.3 转基因毛白杨自根苗和嫁接苗外源基因表达量分析结果 |
| 2.3 小结 |
| 3 转基因林木安全性评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 田间多年种植后转基因毛白杨外源基因逃逸研究 |
| 3.1.3 田间种植多年的转基因毛白杨对根际土壤可培养微生物的影响 |
| 3.1.4 转基因毛白杨对植物内生细菌群落多样性的影响 |
| 3.1.5 数据统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 转基因毛白杨外源基因逃逸研究结果与分析 |
| 3.2.2 转基因毛白杨枯落物中外源基因降解周期的研究结果与分析 |
| 3.2.3 转基因毛白杨对根际土壤可培养微生物的影响结果与分析 |
| 3.2.4 转基因毛白杨对植物内生细菌群落多样性的影响结果与分析 |
| 3.2.4.1 测序数据统计 |
| 3.2.4.2 样本群落组成分析结果 |
| 3.2.4.3 Alpha多样性分析结果 |
| 3.2.4.4 Beta多样性分析结果 |
| 3.2.4.5 不同样本间差异显着性分析结果 |
| 3.3 小结 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 田间种植多年的转基因毛白杨外源基因漂移 |
| 4.1.2 转基因毛白杨对土壤微生物和内生细菌群落多样性的影响 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 气候变化趋势概述 |
| 2. CO__2浓度与温度升高对植物的影响 |
| 2.1 CO__2浓度升高对植物的影响 |
| 2.2 温度升高对植物的影响 |
| 2.3 CO__2浓度与温度升高对植物的影响 |
| 3. CO__2浓度与温度升高对昆虫的影响 |
| 3.1 CO__2浓度升高对昆虫的影响 |
| 3.2 温度升高对昆虫的影响 |
| 3.3 CO__2浓度与温度升高对昆虫的影响 |
| 4. 转基因作物研究和应用现状 |
| 4.1 转基因作物发展历程 |
| 4.2 转Bt玉米发展历程 |
| 4.3 CO__2浓度与温度对Bt作物的影响 |
| 5. 生物固氮研究 |
| 5.1 生物固氮的原理及意义 |
| 5.2 生物固氮的类型 |
| 5.3 植物内生固氮菌 |
| 6. 主要靶标害虫粘虫的生物学特性简述 |
| 6.1 粘虫形态特征 |
| 6.2 粘虫生活习性 |
| 6.3 粘虫发生规律 |
| 7. 本研究的目的、意义和技术路线 |
| 7.1 研究目的和意义 |
| 7.2 技术路线 |
| 第二章 气候变化下固氮菌调控Bt玉米生长及其产量评估 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 环境条件控制 |
| 1.2 供试玉米 |
| 1.3 固氮菌处理 |
| 1.4 玉米生长指标的测定 |
| 1.5 玉米产量指标的测定 |
| 1.6 玉米植株元素含量的测定 |
| 1.7 植株必须氨基酸测定 |
| 1.8 玉米根际土壤指标测定 |
| 1.9 固氮菌筛选及含量测定 |
| 1.10 数据处理与分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对玉米生长指标的影响 |
| 2.2 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对玉米产量的影响 |
| 2.3 CO__2与固氮菌侵染交互作用对玉米生长指标的影响 |
| 2.4 CO__2与固氮菌侵染交互作用对玉米产量的影响 |
| 2.5 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对玉米植株营养水平的影响 |
| 2.6 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对植株必须氨基酸的影响 |
| 2.7 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对玉米根际土壤肥力的影响 |
| 2.8 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对土壤固氮菌含量的影响 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第三章 气候变化下固氮菌调控Bt玉米植物保护酶和外源Bt毒素表达研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 环境条件控制 |
| 1.2 供试玉米 |
| 1.3 固氮菌处理 |
| 1.4 玉米外源Bt毒素表达测定 |
| 1.5 玉米植物保护酶测定 |
| 1.6 植株次生防卫相关氨基酸测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对外源Bt毒素表达的影响 |
| 2.2 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对玉米保护酶的影响 |
| 2.3 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对次生防卫相关氨基酸的影响 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第四章 气候变化下固氮菌调控Bt玉米对其靶标害虫粘虫生长发育、繁殖和取食营养利用的影响研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 环境条件控制 |
| 1.2 供试玉米 |
| 1.3 固氮菌处理 |
| 1.4 供试虫源 |
| 1.5 粘虫生长发育及繁殖测定 |
| 1.6 粘虫取食利用测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对粘虫生长发育及繁殖的影响 |
| 2.2 CO__2、温度、转基因处理与固氮菌侵染对粘虫幼虫取食利用的影响 |
| 2.3 CO__2、转基因处理与固氮菌侵染交互作用对粘虫生长发育及繁殖影响 |
| 2.4 CO__2、转基因处理与固氮菌侵染交互作用对粘虫幼虫取食利用的影响 |
| 3. 结论与讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 期刊论文 |
| 会议论文 |
| 授权专利 |
| 荣誉奖励 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 概述 |
| 1.1 水环境污染 |
| 1.1.1 水污染的含义及其特征 |
| 1.1.2 水环境雌激素及其危害 |
| 1.1.3 水体中类固醇化合物污染 |
| 1.2 水环境中类固醇化合物的检测 |
| 1.2.1 水样品的前处理方法 |
| 1.2.1.1 溶剂萃取 |
| 1.2.1.2 固相萃取 |
| 1.2.1.3 超临界萃取 |
| 1.2.2 类固醇化合物检测方法 |
| 1.2.2.1 化学分析方法 |
| 1.2.2.2 生物方法 |
| 1.3 环境污染的生物修复 |
| 1.3.1 生物修复的种类及国内外研究现状 |
| 1.3.2 工程菌在生物修复中的应用 |
| 1.3.2.1 基因工程菌的国内外研究现状 |
| 1.3.2.2 基因工程菌在生物修复中存在的问题 |
| 1.4 微生物对类固醇化合物的转化 |
| 1.4.1 类固醇化合物的结构与种类 |
| 1.4.2 微生物对类固醇化合物的降解与转化 |
| 1.5 睾丸酮丛毛单胞菌的研究现状及在生物修复中的应用 |
| 1.6 本课题的研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.1.1 供试水样品的来源 |
| 2.1.1.2 供试底泥样品的来源 |
| 2.1.1.3 用于周年含量变化检测的水样 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 高效液相色谱-固相萃取法对水体中痕量类固醇化合物的检测 |
| 2.2.1.1 样品的固相萃取 |
| 2.2.1.2 底泥的甲醇超声萃取 |
| 2.2.1.3 五种类固醇化合物的高效液相测定方法 |
| 2.2.1.4 回收率和精密度试验 |
| 2.2.1.5. 萃取样品体积对回收率的影响 |
| 2.2.2 取样 |
| 2.2.2.1 不同地区河水(溪水)中类固醇化合物含量分析的样品 |
| 2.2.2.2 河水(溪水)类固醇化合物含量周年变化分析的样品 |
| 2.2.3 采集水样品的预处理方法 |
| 2.2.3.1 水样品的预处理 |
| 2.2.3.2 底泥样品的预处理 |
| 2.2.4 工程菌对水体中类固醇化合物的降解能力的测定 |
| 2.2.4.1 细菌培养 |
| 2.2.4.2 细菌悬浮液的制备 |
| 2.2.4.3 工程菌投放量的优化 |
| 2.2.4.4 工程菌降解时间的确定 |
| 2.2.4.5 水体中类固醇污染物降解试验设计 |
| 2.2.5 降解过程工程菌菌种密度测定试验 |
| 2.3 数据分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同地区河水中主要类固醇化合物含量测定 |
| 3.1.1 不同地区河水中主要类固醇化合物含量分析 |
| 3.1.2 不同地区河水中雌酮含量差异分析 |
| 3.1.3 不同地区河水中雌二醇含量差异分析 |
| 3.1.4 不同地区河水中雌三醇含量差异分析 |
| 3.1.5 不同地区河水中睾酮含量差异分析 |
| 3.1.6 不同地区河水中类固醇化合物总含量差异分析 |
| 3.1.7 闽江福州段底泥中类固醇物质的含量 |
| 3.2 闽江福州段及城市内河河水中类固醇化合物含量的周年变化分析 |
| 3.2.1 不同月份河水中四种类固醇物质含量分析 |
| 3.2.2 闽江福州段河水中雌酮的含量季节变化分析 |
| 3.2.3 闽江福州段河水中雌二醇的含量季节变化分析 |
| 3.2.4 闽江福州段河水中雌三醇的含量季节变化分析 |
| 3.2.5 闽江福州段河水中睾酮的含量季节变化分析 |
| 3.2.6 闽江福州段河水中类固醇物质的总含量季节变化分析 |
| 3.3 工程菌对水体中类固醇化合物的降解能力测定 |
| 3.3.1 适宜细菌投加量的确定 |
| 3.3.2 降解时间的确定 |
| 3.3.3 工程菌对水体中类固醇物质的降解 |
| 3.3.3.1 工程菌对水体中各种类固醇物质降解的差异分析 |
| 3.3.3.2 工程菌对水体中雌酮的降解分析 |
| 3.3.3.3 工程菌对水体中雌二醇的降解分析 |
| 3.3.3.4 工程菌对水体中雌三醇的降解分析 |
| 3.3.3.5 工程菌对水体中睾酮的降解分析 |
| 3.4 降解过程工程菌种群的数量变化 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 样品的前处理 |
| 4.1.2 流域水量时空差异对河水(溪水)中类固醇化合物含量的影响 |
| 4.1.3 睾丸酮丛毛单胞菌不同基因改造型的降解能力 |
| 4.1.4 工程菌对水体中类固醇化合物降解的影响因素 |
| 4.1.4.1 生物因素对睾丸酮丛毛单胞菌的影响 |
| 4.1.4.2 非生物因素对睾丸酮丛毛单胞菌的影响 |
| 4.1.5 工程菌株在水环境中的适应能力 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 昆虫病原线虫-共生菌-昆虫的关系 |
| 1.2 昆虫病原线虫共生菌杀虫毒素及其杀虫基因的研究进展 |
| 1.3 昆虫病原线虫共生菌生物安全性研究现状 |
| 1.4 对非靶标生物的安全性评价 |
| 1.4.1 对寄生性天敌的安全性评价 |
| 1.4.2 对捕食性天敌的安全性评价 |
| 1.4.3 对有益昆虫的安全性评价 |
| 1.4.4 对生物多样性的影响 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 供试植物，实验地土壤、肥力及周围情况 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器及透析袋 |
| 2.2 嗜线虫致病杆菌及其蛋白毒素粗提物对天敌昆虫和非靶标生物的安全性评价方法 |
| 2.2.1 HB310菌液的制备 |
| 2.2.2 HB310蛋白毒素的提取 |
| 2.2.3 HB310菌液和蛋白毒素对赤眼蜂的安全性评价 |
| 2.2.4 HB310菌液和蛋白毒素对中红侧沟茧蜂的安全性评价 |
| 2.2.5 HB310菌液和蛋白毒素粗提物对异色瓢虫的安全性评价 |
| 2.2.6 HB310菌液和蛋白毒素粗提物对家蚕的安全性评价 |
| 2.2.7 HB310菌液对小菜蛾和菜青虫的田间防效及对非靶标生物的安全性评价 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HB310菌液和蛋白毒素对赤眼蜂的安全性评价 |
| 3.1.1 对赤眼蜂羽化率的影响 |
| 3.1.2 对赤眼蜂成蜂寿命的影响 |
| 3.2 HB310菌液和蛋白毒素对中红侧沟茧蜂的安全性评价 |
| 3.2.1 对中红侧沟茧蜂羽化率的影响 |
| 3.2.2 对中红侧沟茧蜂成虫寿命的直接影响 |
| 3.2.3 通过棉铃虫对中红侧沟茧蜂生长发育的影响 |
| 3.3 HB310菌液和蛋白毒素粗提物对异色瓢虫的安全性评价 |
| 3.3.1 取食HB310菌液和蛋白毒素粗提物处理的桃蚜对异色瓢虫生长指标的影响 |
| 3.3.2 取食HB310菌液和蛋白毒素粗提物处理的小菜蛾对异色瓢虫生长发育的影响 |
| 3.3.3 异色瓢虫对HB310菌液和蛋白毒素粗提物处理的桃蚜、小菜蛾捕食功能反应 |
| 3.4 HB310菌液和蛋白毒素粗提物对家蚕的安全性评价 |
| 3.4.1 对家蚕幼虫的毒力和体重抑制作用 |
| 3.4.2 对家蚕的拒食作用 |
| 3.4.3 对家蚕发育历期的影响 |
| 3.4.4 对家蚕幼虫存活率的影响 |
| 3.4.5 对家蚕产茧量及蛹和成虫的影响 |
| 3.5 HB310菌液对小菜蛾和菜青虫田间防效及对非靶标生物安全性评价 |
| 3.5.1 供试药剂对靶标害虫的防治效果调查 |
| 3.5.2 供试药剂对其它非靶标昆虫的影响调查 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嗜线虫致病杆菌对寄生性天敌的安全性评价 |
| 4.2 嗜线虫致病杆菌对捕食性天敌的安全性评价 |
| 4.3 嗜线虫致病杆菌对家蚕等有益昆虫的安全性评价 |
| 4.4 嗜线虫致病杆菌对生物多样性的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试菌株及制剂 |
| 1.2 菌株培养及抗生素使用浓度 |
| 1.3 环境释放 |
| 1.4 工程菌BioP8田间消长动态的调查方法 |
| 1.5 工程菌在甘蓝根部的定殖、存活及消长 |
| 1.6 供试药剂对小菜蛾的防治效果调查 |
| 1.7 供试药剂对昆虫及节肢动物群落的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 工程菌BioP8在甘蓝田中的消长动态 |
| 2.2 工程菌BioP8防治小菜蛾的田间小区试验结果 |
| 2.3 工程菌BioP8对甘蓝田中天敌种群的影响 |
| 2.4 工程菌BioP8对节肢动物群落结构的生物学效应 |
| 3 结 论 |
| 1 引言 |
| 1.1 荧光假单胞菌概述 |
| 1.1.1 荧光假单胞菌的特性 |
| 1.1.2 荧光假单胞菌的遗传改良 |
| 1.1.3 荧光假单胞菌在农业方面的应用 |
| 1.1.4 荧光假单胞菌工程菌的监测 |
| 1.2 微生物生态学概述 |
| 1.2.1 微生物生态学研究的基本方法 |
| 1.2.2 研究微生物生态学的意义 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试材料及仪器 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 供试作物及实验田 |
| 2.1.3 试剂和溶液 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 土壤样品的采集和处理 |
| 2.2.2 土壤样品总DNA的提取 |
| 2.2.3 细菌16S rDNAV3区扩增(touch-down PCR) |
| 2.2.4 荧光假单胞菌纯菌16S rDNA V3区扩增(touch-down PCR) |
| 2.2.5 变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophpresis，DGGE) |
| 2.2.6 图谱分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 土壤样品总DNA提取方法比较 |
| 3.1.1 土壤样品预处理效果 |
| 3.1.2 土壤样品总DNA提取方法的确定 |
| 3.2 荧光假单胞菌工程菌生态安全性的分子生态学检测 |
| 3.2.1 土壤样品总DNA的提取 |
| 3.2.2 细菌165 rDNA V3区 PCR扩增 |
| 3.2.3 荧光假单胞菌纯菌16S rDNA V3区 PCR扩增 |
| 3.2.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE) |
| 3.2.5 DGGE指纹图谱聚类分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 土壤样品总DNA提取方法比较 |
| 4.1.1 土壤样品预处理 |
| 4.1.2 土壤样品总DNA提取方法 |
| 4.2 荧光假单胞菌工程菌安全性评价 |
| 4.2.1 DGGE指纹图谱直接观察 |
| 4.2.2 DGGE指纹图谱聚类分析 |
| 4.3 DGGE技术与土壤细菌结构群落分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 农药污染的微生物修复研究进展 |
| 1 农药污染的微生物修复背景 |
| 2 降解农药的微生物及其研究 |
| 2.1 降解农药的微生物 |
| 2.2 农药微生物降解的代谢途径与降解基因 |
| 2.3 农药微生物修复的影响因素 |
| 3 农药污染土壤的微生物修复研究 |
| 4 农药污染土壤的微生物修复的产业化 |
| 5 农药污染土壤的微生物修复的前景与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)细菌综述 |
| 1 鞘氨醇单胞菌属的分类和系统发育分析 |
| 2 鞘氨醇单胞菌属的生境 |
| 3 鞘氨醇单胞菌的分离 |
| 4 鞘氨醇单胞菌的培养 |
| 5 鞘氨醇单胞菌的鉴定 |
| 6 鞘氨醇单胞菌的保藏 |
| 7 鞘氨醇单胞菌对化合物的代谢 |
| 8 鞘氨醇单胞菌胞外生物多聚物 |
| 9 鞘氨醇单胞菌膜结构 |
| 10 鞘氨醇单胞菌寡营养类型 |
| 11 鞘氨醇单胞菌的遗传学 |
| 12 鞘氨醇单胞菌基因组学 |
| 13 鞘氨醇单胞菌的生态学 |
| 14 鞘氨醇单胞菌的致病性 |
| 15 鞘氨醇单胞菌的生物技术应用 |
| 参考文献 |
| 第三章 同源重组研究进展 |
| 1 同源重组的类型 |
| 2 参与同源重组的蛋白和功能 |
| 3 同源重组模型 |
| 3.1 Holliday模型 |
| 3.2 Meselson-Radding模型 |
| 3.3 双链断裂修复模型 |
| 3.4 单链退火模型 |
| 4 基因打靶实验设计策略 |
| 5 同源重组的方式 |
| 6 整合载体的整合位点 |
| 7 基因打靶技术发展的三个阶段 |
| 7.1 自身可作选择标记的特殊基因的同源重组 |
| 7.2 采用正负选择(Positive and Negative Selection)系统的同源重组 |
| 7.3 对靶位点进行精细操作的同源重组 |
| 8 二步选择法中的双交换的反筛选标记(Counter selectable marker) |
| 8.1 镰孢酸(fusaric acid)敏感系统 |
| 8.2 链霉素敏感系统(Streptomycin sensitivity system) |
| 8.3 蔗糖敏感系统(The sucrose sensitivity system) |
| 9 同源重组效率的影响因素 |
| 9.1 同源重组指导序列(HRDS)长度对重组效率的影响 |
| 9.2 同源重组指导序列(HRDS)的同源性对重组效率的影响 |
| 9.3 打靶位点的拷贝数与染色体位置 |
| 10 Red同源重组系统 |
| 参考文献 |
| 第四章 转基因微生物及其安全评价研究进展 |
| 1 转基因生物的发展概况 |
| 2 转基因生物的安全性 |
| 2.1 生态环境方面 |
| 2.2 生物多样性方面 |
| 2.3 影响人体健康方面 |
| 3 转基因微生物的安全性评价 |
| 3.1 转基因微生物的检测与监控 |
| 3.2 微生物群落结构与多样性研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第一章 遗传稳定多功能农药降解基因工程菌的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株质粒及培养基 |
| 1.2 培养基与培养条件 |
| 1.3 试剂与材料 |
| 1.4 菌体总DNA的提取 |
| 1.5 16S rDNA的PCR扩增 |
| 1.6 mpd基因的扩增 |
| 1.7 PCR产物的T/A克隆 |
| 1.8 E. coli DH5α普通感受态细胞的制备 |
| 1.9 DNA酶切反应体系的建立 |
| 1.10 质粒DNA的小量提取 |
| 1.11 酶切片段回收 |
| 1.12 载体脱磷 |
| 1.13 酶连 |
| 1.14 转化 |
| 1.15 16S rDNA的序列系统进化树建立 |
| 1.16 二亲接合 |
| 1.17 同源重组事件的PCR验证 |
| 1.18 同源重组事件的Southern杂交验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 受体菌Sphingomonas agrestis CDS-1基本生物学特性 |
| 2.2 CDS-1染色体总DNA的提取及16S rRNA基因的PCR扩增 |
| 2.3 同源重组载体的构建 |
| 2.4 同源重组子的筛选策略 |
| 2.5 同源重组子的获得及同源重组事件的PCR、Southern杂交验证 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 影响同源重组效率的关键参数研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 含不同长度同源臂的同源重组载体的构建 |
| 1.3 λRed同源重组载体的构建 |
| 1.4 λRed同源重组中的二亲接合 |
| 1.5 基因序列登录号(Nucleotide sequence accession numbers) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 同源片段长度对同源重组效率的影响 |
| 2.2 同源重组指导序列差异性对同源重组效率的影响 |
| 2.3 λRed重组系统对同源重组效率的影响 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基因工程菌株的生物学和降解特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 菌体生长量的测定 |
| 1.5 农药提取和检测方法 |
| 1.6 菌株生长和降解条件试验 |
| 1.7 农药降解影响因素研究 |
| 1.8 农药降解广谱性实验 |
| 1.9 mpd基因在Sphingomonas agrestis CDS-1染色体上的随机插入 |
| 1.10 细胞的高压压榨破碎 |
| 1.11 甲基对硫磷水解酶(MPH)酶活测定 |
| 1.12 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 |
| 1.13 MPH的酶谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 mpd基因在Sphingomonas sp菌株rrn位点的重组对受体菌的影响 |
| 2.2 基因工程菌的遗传稳定性 |
| 2.3 甲基对硫磷水解酶MPH在工程菌中的表达 |
| 2.4 农药降解与菌株生长的关系 |
| 2.5 接种量对农药降解的影响 |
| 2.6 通气量对农药降解的影响 |
| 2.7 温度对农药降解的影响 |
| 2.8 初始pH对降解农药的影响 |
| 2.9 外加碳源对农药降解的影响 |
| 2.10 工程菌Sphingomonas sp. CDS-mpd的农药降解谱 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 mpd基因在Pseudomonas putida KT2440 16S rDNA位点的多拷贝重组 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 酶活初测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 mpd基因在16S rDNA位点的多拷贝重组 |
| 2.2 多次位点重组的同源重组效率 |
| 2.3 多次重组对菌株生长能力的影响 |
| 2.4 多拷贝重组子的稳定性 |
| 2.5 不同mpd基因拷贝数重组子的酶活比较 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 多功能农药降解基因工程菌剂保藏条件研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 载体及来源 |
| 1.3 工程菌计数方法 |
| 1.4 单一载体吸菌量的测定 |
| 1.5 不同剂型保藏试验 |
| 1.6 不同接种量保藏试验 |
| 1.7 保护剂选择试验 |
| 1.8 工程菌剂降解农药的盆钵试验 |
| 1.9 土壤中农药的提取和测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单一载体最大吸菌量试验 |
| 2.2 不同剂型的菌剂保藏试验 |
| 2.3 工程菌剂接种量对保藏效果的影响 |
| 2.4 添加保护剂对保藏效果的影响 |
| 2.5 工程菌株降解两种农药的土壤盆钵试验 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 工程菌环境释放农药降解效果及定殖动态研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌剂与农药 |
| 1.2 试验条件 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 工程菌的平板计数 |
| 1.5 土壤总DNA的提取 |
| 1.6 土壤中特异靶标DNA的PCR检测灵敏度 |
| 1.7 Most Probable Number-PCR(MPN-PCR)方法 |
| 1.8 荧光原位杂交(FISH) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 工程菌株对两种农药的降解 |
| 2.2 基因工程菌株的平板计数 |
| 2.3 土壤总DNA的直接法和间接法提取 |
| 2.4 土壤中特异基因的检测灵敏度分析 |
| 2.5 环境释放区基因工程菌的MPN-PCR计数 |
| 2.6 荧光原位杂交探针的特异性验证 |
| 2.7 环境释放区中基因工程菌的FISH检测 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 工程菌释放对土壤微生物群落结构的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基 |
| 1.2 土壤中可培养细菌、放线菌和真菌的平板计数 |
| 1.3 PCR-DGGE实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 工程菌释放对土壤中可培养三大菌群数量的影响 |
| 2.2 基于土壤总DNA的16S rDNA V3区的DGGE分析 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文研究的主要创新点 |
| 附录 |
| 附录1 实验用培养基及分子生物学试剂 |
| 附录2 转基因微生物环境释放相关资料 |
| 附录3 DGGE图谱聚类分析的相似性矩阵 |
| 附录4 相关载体序列 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 第一章 引言 |
| 1 转基因作物的生物安全性评价 |
| 1.1 全球转基因作物的种植情况 |
| 1.2 转基因作物的生物安全评价 |
| 2 转基因抗虫棉的生物安全评价研究进展 |
| 2.1 转基因抗虫棉的发展现状 |
| 2.2 转基因抗虫棉的生物安全评价研究进展 |
| 3 环境微生物的研究方法 |
| 3.1 环境微生物 |
| 3.2 环境微生物的研究方法 |
| 4 研究的目的意义与研究内容 |
| 4.1 研究的目的与意义 |
| 4.2 研究内容 |
| 第二章 转基因抗虫棉叶围细菌种群动态变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 气候条件 |
| 2.2 田间棉花叶围细菌群落结构变化 |
| 2.3 叶围主要细菌类群的形态分类和分子鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 RISA法分析转基因抗虫棉叶围细菌群落多样性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 叶围细菌总DNA的获取 |
| 2.2 ITS-PCR扩增 |
| 2.3 RISA的结果及分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 转基因抗虫棉叶围卡那霉素抗性细菌监测及nptⅡ基因漂移研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 棉花叶围卡那霉素抗性细菌数量及种类变化 |
| 2.2 nptⅡ基因漂移监测结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 第五章 结论和创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的克隆与分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌的简介 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其基因 |
| 1.1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的命名与分类 |
| 1.1.4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的杀虫机制 |
| 1.1.5 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.1.6 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达与调控 |
| 1.1.7 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白之间以及与其他晶体蛋白之间的相互作用 |
| 1.1.8 目标昆虫对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的抗性以及防治措施 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 材料与方法 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.2 实验方法 |
| 1.4 结果与分析 |
| 1.4.1 新型杀虫晶体蛋白基因克隆材料的筛选 |
| 1.4.2 对BMB1518与EA15196晶体蛋白N-末端氨基酸序列的分析和基因的克隆 |
| 1.4.2.1 BMB1518的45kD晶体蛋白N-末端氨基酸序列的分析和基因克隆 |
| 1.4.2.2 EA15196的42kD晶体蛋白N-末端氨基酸序列的分析和基因克隆 |
| 1.4.3 YBT978的130kD晶体蛋白的克隆 |
| 1.4.3.1 YBT978的130kD晶体蛋白基因N-末端片断的PCR扩增与测序 |
| 1.4.3.2 YBT978基因组BAC文库的构建与筛选 |
| 1.4.3.3 YBT978基因组BAC文库阳性克隆子的亚克隆 |
| 1.4.4 YBT978的130kD晶体蛋白基因序列的分析 |
| 1.4.5 cry7Bal在无晶体突变株中的表达 |
| 1.4.6 生物测定的结果以及分析 |
| 1.4.6.1 生物测定的结果 |
| 1.4.6.2 cyt类基因的检测 |
| 1.4.6.3 YBT978晶体蛋白的溶解特性 |
| 1.5 结果与讨论 |
| 1.5.1 本部分的实验结果总结如下： |
| 1.5.1.1 对实验室保藏菌株筛选的结果 |
| 1.5.1.2 BMB1518的研究结果 |
| 1.5.1.3 EA15196的研究结果 |
| 1.5.1.4 YBT978基因组BAC文库的构建和筛选 |
| 1.5.1.5 cry7Bal基因的克隆及分析 |
| 1.5.2 讨论 |
| 2.苏云金芽胞杆菌基因工程菌WG-001的安全性评估 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫剂的发展现状 |
| 2.1.2 苏云金芽胞杆菌转基因工程菌的研究现状 |
| 2.1.3 转基因生物的安全性问题 |
| 2.1.4 植物用转基因微生物的安全性问题 |
| 2.1.5 转基因微生物生物安全研究方法 |
| 2.1.6 植物用转基因微生物安全性评价的主要内容 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 2.3 材料和方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 工程菌WG-001和1125BG在喷药区的消长动态 |
| 2.4.1.1 工程菌WG-001在农田叶面上的消长动态 |
| 2.4.1.2 工程菌WG-001在农田土壤中的消长动态 |
| 2.4.1.3 工程菌WG-001和1125BG在盆栽土壤中的消长动态 |
| 2.4.2 工程菌WG-001的水平扩散 |
| 2.4.2.1 工程菌WG-001在空气中的水平扩散 |
| 2.4.2.2 工程菌WG-001在农田叶面上的水平扩散 |
| 2.4.2.3 工程菌WG-001在农田土壤中的水平扩散 |
| 2.4.2.4 工程菌WG-001在农田地下水中的水平扩散 |
| 2.4.3 工程菌WG-001在农田土壤中的垂直扩散 |
| 2.4.4 工程菌WG-001和1125BG对土壤中土着微生物群落的影响 |
| 2.4.4.1 工程菌WG-001对农田土壤中土着微生物群落的影响 |
| 2.4.4.2 工程菌WG-001和1125BG对盆栽土壤土着微生物群落的影响 |
| 2.4.5 工程菌WG-001的遗传稳定性 |
| 2.4.6 工程菌WG-001和1125BG的特异基因对土着微生物的水平扩散 |
| 2.5 讨论与结论 |
| 2.5.1 讨论 |
| 2.5.1.1 工程菌WG-001和1125BG的生存能力 |
| 2.5.1.2 工程菌WG-001的传播扩散能力 |
| 2.5.1.3 工程菌WG-001和1125BG对土着微生物的影响 |
| 2.5.1.4 工程菌WG-001和1125BG特异基因对土壤土着微生物和盆栽作物的水平转移 |
| 2.5.1.5 应用gfp报告基因的效果 |
| 2.5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 1 引言 |
| 1.1 荧光假单胞杆菌概述 |
| 1.1.1 荧光假单胞杆菌特性 |
| 1.1.2 荧光假单胞菌的遗传改良 |
| 1.2 转基因微生物的安全性研究 |
| 1.2.1 基于培养的监测方法 |
| 1.2.2 免培养检测方法 |
| 1.3 基因标记技术 |
| 1.3.1 荧光蛋白的结构和性质 |
| 1.3.2 荧光蛋白标记方式 |
| 1.3.3 荧光蛋白基因的应用 |
| 1.4 荧光假单胞菌工程菌的监测 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试材料及仪器 |
| 2.1.1 供试材料、培养基与抗生素 |
| 2.1.2 供试作物、试验地气象资料土壤、条件及周围环境 |
| 2.1.3 试剂和溶液 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 重组杀虫防病工程菌BioP8环境生态安全性研究 |
| 2.2.2 荧光假单胞菌P303的遗传标记 |
| 2.2.3 荧光假单胞菌工程菌Biop8的遗传标记 |
| 3实验结果 |
| 3.1 重组杀虫防病工程菌BioP8环境生态安全性研究 |
| 3.1.1 工程菌BioP8在甘蓝叶片上及土壤中的消长动态 |
| 3.1.2 BioP8与土壤中天然芽孢杆菌的相互关系 |
| 3.1.3 工程菌BioP8在田间的扩散情况 |
| 3.1.4 BioP8防治小菜蛾的田间测试 |
| 3.1.5 工程菌BioP8对甘蓝田中天敌种群的影响 |
| 3.1.6 工程菌BioP8对节肢动物群落结构的生物学效应 |
| 3.1.7 工程菌BioP8对甘蓝的生长发育及安全性 |
| 3.2 荧光假单胞菌的遗传标记 |
| 3.2.1 非变性样品的SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.2 昆虫消化液对RFP的作用 |
| 3.2.3 红色荧光蛋白基因rfp标记系统的构建 |
| 3.2.4 红色荧光蛋白基因rfp染色体标记P303 |
| 3.2.5 红色荧光蛋白基因rfp染色体标记工程菌BioP8 |
| 3.2.6 红色荧光蛋白基因rfp质粒标记P303 |
| 3.2.7 8’P303，12P303和8’BioP8的菌体形态观察 |
| 3.2.8 8’P303，12P303的分子检测 |
| 3.2.9 生长曲线及稳定性测定 |
| 3.2.10 室内平板抑菌试验结果 |
| 3.2.11 温室自然土壤中的消长动态 |
| 4 讨论 |
| 4.1 安全性评价 |
| 4.2 RFP的稳定性 |
| 4.3 荧光蛋白在荧光假单胞菌中的表达 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
