周林,李瀚,赵阳,汪京,贾亚男,张欣雪,李先亮,郎韧,贺强[1]（2021）在《CD4+CD45RClowTreg在大鼠肝移植免疫耐受中的调节作用研究》文中提出目的探讨CD4+CD45RClow调节性T细胞（Treg）在肝移植免疫耐受诱导中的作用。方法建立急性排斥反应（AR）[Lewis→Brown Norway（BN）,AR组]与自发耐受（BN→Lewis,耐受组）大鼠肝移植模型,每组6只。并设立假手术组（对照组）,Lewis大鼠和BN大鼠各3只。对各组大鼠肝组织进行病理学检查;检测各组大鼠外周血、移植肝、脾脏T细胞亚群和浆细胞样树突状细胞（p DC）的表达情况,分析pDC与CD4+CD45RClowTreg的相关性;检测各组大鼠移植肝和脾脏CD4、CD45RC、CD103的表达情况。结果 AR组大鼠病理学主要表现为移植肝炎症细胞浸润和组织结构紊乱。与AR组大鼠比较,耐受组大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD8+Treg表达水平均升高（均为P<0.05）。外周血CD4+CD25+Treg与CD8+Treg表达水平呈正相关（r=0.742,P=0.022）。AR组大鼠外周血CD4+CD45RChighT细胞水平高于耐受组和对照组大鼠（均为P<0.05）。与AR组大鼠比较,耐受组大鼠脾脏CD4+CD45RClowTreg表达水平升高,外周血、移植肝、脾脏CD8+CD45RClowTreg表达水平均升高（均为P<0.05）。与对照组和AR组大鼠比较,耐受组大鼠外周血CD8+CD45RClowTreg/CD8+T比值升高,外周血、移植肝、脾脏中p DC的表达水平均升高（均为P<0.05）;且CD4+CD45RClowTreg与p DC表达水平的变化呈正相关（r=0.506,P=0.016）。耐受组大鼠移植肝和脾脏CD4、CD45RC、CD103的表达均增多;而AR组大鼠移植肝CD4、CD45RC的表达增多,CD103表达降低。结论 CD4+CD45RClowTreg是具有负向免疫调控作用的细胞亚群,与CD8+CD45RClowTreg及pDC等构成免疫耐受诱导的调节性细胞网络。
张甲倩,张升校,乔军,邱梦婷,李小峰[2]（2021）在《风湿性疾病患者外周血CD4+T细胞亚群特征及其对免疫调节联合治疗的反应》文中提出目的测定风湿性疾病患者外周血CD4+ T细胞亚群水平,探讨免疫调节联合方案治疗前后的变化。方法回顾性分析了6 395例风湿性疾病患者和206名健康者外周血CD4+ T细胞亚群水平,包括RA、SLE、AS、PsA、SSc、pSS、白塞病、PM/DM、痛风和血管炎患者,其中一部分患者接受了低剂量IL-2、雷帕霉素、二甲双胍、维甲酸、辅酶Q10等免疫调节药物治疗。用流式细胞术检测受试者外周血辅助细胞（Th）1、Th2、Th17和调节性T细胞的绝对计数。采用独立样本t检验和配对样本t检验分别比较患者与健康对照组、治疗前后外周血CD4+ T细胞亚群水平,P<0.05为差异有统计学意义。结果与健康对照组相比,患者的调节性T细胞水平明显偏低[（31±15）个/μl与（27±17）个/μl,t=3.407,P<0.01;t=3.407,P<0.01],Th17/Treg显着升高[（0.3±0.2）与（0.4±0.7）,t=-9.508,P<0.01]。其中,AS[（10±8）个/μl,t=-5.403,P<0.01]、PsA[（11±11）个/μl,t=-3.829,P<0.01]、SSc[（7±6）个/μl,t=3.114,P<0.01]、BD[（11±9）个/μl,t=-4.774,P<0.01]和痛风[（11±9）个/μl,t=-4.604,P<0.01]患者的Th17高于健康对照组[（8±5）个/μl,RA[（28±15）个/μl,t=3.032,P<0.01]、SLE[（21±21）个/μl,t=6.836,P<0.01]、AS[（28±15）个/μl,t= 2.216,P<0.05]、SSc[（27±16）个/μl,t=3.698,P<0.05]、BD[（27±17）个/μl,t=2.502,P<0.05]、DM/PM[（27±22）个/μl,t=2.974,P<0.01]和痛风[（28±15）个/μl,t=2.079,P<0.05]患者调节性T细胞均低于正常[（31±15）个/μl]。经过免疫调节联合治疗后,患者的CD4+ T细胞亚群明显改变,尤其以调节性T细胞的增加为着,因调节性T细胞的增长速率快于其他效应T细胞,致使相应细胞如Th17/调节性T细胞回降,其中SLE较为显着[（0.6±1.0）与（0.5±0.4）,t= 3.157,P<0.01]。结论风湿性疾病是一类以淋巴细胞亚群失衡为主要特征的自身免疫紊乱的炎症,其中以调节性T细胞相对不足最为显着。免疫调节药物（IMiDs）治疗的免疫疗法可相对特异地促进调节性T细胞增殖,诱导和恢复患者的自身免疫耐受,有望为风湿性疾病的治疗提供新思路。
杨景[3]（2021）在《老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究》文中研究说明季节性流感病毒（Seasonal Influenza Viruses）感染引起的患病和死亡,极其容易发生在老年人群和慢性肺部疾病患者。60岁及以上老年流感患者具有较高并发症风险,譬如脑炎、肺炎甚至恶化慢性心肺疾病相关的基础疾病。世界范围流行的季节性人流感是由A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒引起的。流感病毒基因组包含八个RNA片段,其中两个RNA片段编码两个包膜蛋白,分别为血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。国内目前上市的常用抗流感病毒药物如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦,均属于神经氨酸酶抑制剂。然而,最为安全长效、公共卫生获益最大的抗病毒防御,需要各年龄人群按时接种季节性流感病毒疫苗,特别是具有高感染风险的老年人群。流感病毒疫苗的免疫原性和有效性评价采用血清学检测血凝素抑制实验（Hemagglutinin Inhibition Test,HAI）,特异性抗体的评价标准低估了流感病毒疫苗在老年人群中的获益情况。老年人群接种流感病毒疫苗将流感发病率降低,同时降低了住院率、减少了并发症和死亡率。然而,季节性流感疫苗虽然每年更新和接种,疫苗保护效果不如预期。一方面,流行季循环野毒株和疫苗株的不匹配;同时,老年人群疫苗接种率低;另一方,老年人群因免疫衰老出现免疫系统对流感疫苗的免疫反应下降。目前,国家人口统计局数据显示中国在迅速老龄化,截止2020年1月,有2.5388亿名60岁及以上老年人占国家总人口数的18.1%,预计在2030年老龄人口占比将达到26%。这将使流感病毒感染在老年人中造成极其沉重的疾病负担,但可以通过接种疫苗来减轻或防控。然而,在国内老年人群流感病毒疫苗接种率远低于2010年世界卫生大会提出的75%的疫苗接种覆盖率目标,仅有4%。较多因素造成老年人群疫苗接种率较低,包括政策、个人经济水平、受教育程度和健康意识等。此外,老年人群疫苗免疫后产生的流感病毒特异性抗体水平较18～60岁的成年人低,记忆B细胞和长寿浆细胞也出现显着减少。免疫衰老（Immunosenescent）,成为针对60岁及以上老年人群开发新的或更有效的流感病毒疫苗的主要挑战。免疫衰老表现出免疫功能的下降和各种传染性疾病的风险增加。因此,了解免疫衰老的老年人群免疫灭活四价季节性流感病毒裂解疫苗（QIVs）免疫机制,涉及外周血转录组、T淋巴细胞、主要细胞因子和免疫球蛋白在QIVs免疫前后动态特征,有助于发现老年人群免疫中与年龄、性别相关的变化是如何导致这种风险以及出现针对流感疫苗的弱体液免疫反应。事实上,现在人们普遍认为,疫苗接种后测定HAI滴度并不能全面反映老年人群的疫苗保护效果。此外,抗体反应弱或无的老年受试者每年接种疫苗,对流感的保护效果也出现提高,这表明细胞免疫机制可能对老年人的保护也很重要。最早的,2009年Querec等研究人员将系统生物学的方法应用于黄热病毒疫苗的机制研究中,并由此衍生出系统疫苗学的概念。鉴于传统疫苗研究基于体液免疫反应,缺乏对疫苗细胞免疫的认识。此外,QIVs疫苗免疫机制是网络化、多维度的,本研究采用系统生物学研究的方法,将从多个维度,借助高通量检测手段和计算机生物信息学分析关联传统疫苗学研究的特征指标,鉴定QIVs疫苗接种后在老年人群中建立有效免疫保护的重要生物分子和信号途径,筛选出与疫苗有效性、免疫反应性和持久性相关的枢纽基因,以期寻找疫苗有效性评价的替代生物标志物,加速疫苗临床研究进展。因机体免疫机制的复杂性,将从多个维度剖析老年人群QIVs免疫机制。本研究首先采用高通量测序RNA-Seq手段获取16名人口学和免疫特征具有显着差异老年受试者的转录组数据,随后进行整合关联分析。并采用不同生物信息学分析手段,首先通过基于生物学特征驱动（Biology-Driven）的配对比较聚类分析,老年女性和老年男性在QIVs免疫过程中因性别差异化表达基因和信号通路。随后,通过基于数据驱动（Data-Driven）的权重基因共表达网络分析（WGCNA）,将差异化表达基因按表达模式聚类,并将聚类的基因集关联性状特征（受试者人口学及免疫反应特征）分析,最终鉴定出影响性状特征的关键核心基因（Hub Gene）。此外,通过荧光定量qRT-PCR验证枢纽基因的表达特征与转录组结果一致。鉴于转录组RNA-Seq仅是从RNA分子水平阐明老年人群免疫QIVs的机制,为了解细胞介导QIVs免疫的动力学特征,本研究接着采用高通量多色流式细胞术分析了人口学性状及QIVs免疫反应特征明显的17名60周岁以上老年受试者的外周血PBMC标本详细的T细胞亚群免疫表型,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVsrelated reactogenicity）。最后,我们使用高通量多重细胞因子检测技术分析了以上老年受试者的外周血血浆样本中具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig,同样将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。确定了不同性状特征老年受试者QIVs免疫前后细胞因子网络及主要免疫球蛋白Ig的动力学特征,以期了解细胞因子在细胞免疫中发挥的作用。第一部分:通过RNA-Seq获得老年人群QIVs免疫前后转录组数据进行生物信息学分析1.性别因素对老年人群QIVs免疫效果的影响临床数据显示,流感疫苗免疫应答存在性别差异,该研究旨在鉴定出差异表达基因（DEGs）造成老年人群接种四价灭活流感疫苗出现免疫相关的性别偏倚。以60～80岁的健康成年人为对象,对接种前后的基因表达情况进行分析。受试者体液免疫水平采用血凝抑制实验检测特异性抗体滴度HAI,并分析两个性别群体差异基因表达谱与体液免疫的相关性。在老年女性中,参与I型干扰素信号通路和经典通路补体激活的DEGs在流感疫苗接种3天内出现上调。在第28天,显示老年男性偏倚模式的免疫反应与调控蛋白质加工处理以及补体活化的经典途径相关。通过生物特征驱动聚类方法确定了与老年女性和男性对QIVs接种不同反应相关的一系列DEGs。老年女性对QIVs具有更强的免疫反应,但抗体半年后出现迅速下降,而老年男性具有维持持久反应的优势。此外,我们还发现了可能导致老年人接种流感疫苗性别变异的基因。我们的研究结果强调了开发个性化季节性流感疫苗的重要性。2.枢纽基因MCEMP1和SPARC分别驱动QIVs免疫不良反应事件发生与维持有效抗体深入了解潜在的候选中心基因可能有助于产生安全有效的季节性流感免疫,以及开发针对流感病毒感染高危老年人群的个性化流感疫苗。本研究旨在通过加权基因共表达网络分析,确定与2018/19季节四价灭活流感病毒疫苗免疫诱导过程相关的潜在中枢基因。从16名老年人的63份全血样本中,共获得13345个基因,分为8个共表达模块,其中两个模块与疫苗诱导的免疫应答显着相关。功能富集分析后,利用GO条件下的疫苗相关免疫基因构建hub基因的子网络,进行hub基因的鉴定和功能验证。MCEMP1和SPARC被证实是影响QIVs诱导免疫的中心基因。在接种后7天内,MCEMP1的表达量与QIVs相关的反应性呈负相关,CXCL8/IL-8可抑制MCEMP1的表达,颗粒酶-B细胞毒介质可加剧MCEMP1的表达量。同时,SPARC的表达增加了对QIVs的免疫应答,并有助于持续的保护性体液抗体滴度。这两个基因可用于预测QIVs诱导的不良反应、免疫反应的强度以及体液抗流感抗体的持续时间。这项工作为进一步研究开发个性化的QIVs提供了线索,这些QIVs具有适当的免疫反应和对即将到来的季节性流感的持久免疫。第二部分:老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征衰老产生的细胞免疫损伤,表现为胸腺退化及T淋巴细胞输出减少为主的免疫系统随年龄变化特征。然而,缺乏老年人群接种QIVs前后外周血T淋巴细胞亚群的详细分布特征研究。本研究旨在确认老年人群T淋巴细胞分布特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的T细胞亚群动力学特征差异。本研究随机筛选的60名老年受试者中,分析受试者性状涉及人口学基线特征和免疫前预存流感病毒抗体水平,其中17名受试者具有显着性状差异被选取用于鉴定老年人群外周血T淋巴细胞衰老表型的特征。通过10色高通量流式细胞术检测分析外周血T细胞亚群的详细分布特征。计算各T细胞亚群占亲本比例,并进行不同性状和免疫状态分组比较,包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应。受试者人口学特征和基线特征基本一致,血常规检测淋巴细胞数量在正常范围。按照年龄分组比较T细胞亚群分布差异,CD8+PD1-CD57-T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高,而CD8+PD1+CD57+T细胞亚群显着低于低龄组。CD8+CD27-CD28+T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高但频数在免后两年龄组均出现显着降低,而两年龄组中CD27+CD28+/-T细胞在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着增加。两年龄组中TCMs在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着减少,而TNs则在QIVs免后显着增加。按照性别分组比较T细胞亚群分布差异,总T（CD3+）和CD4+T细胞的比例在老年女性受试者中较老年男性高,其中CD4+在免后Day180具有显着性别差异免后Day180,CD27+CD28+T细胞比例在老年女性受试者中显着高于老年男性。在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中,不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间差异较小。然而,更详细的通过耗竭表型分子（PD-1）、衰老表型分子（CD57）、共刺激分子（CD27和CD28）以及T细胞效应记忆表型分子（CD45RA和CCR7）,发现QIVs免疫前后不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间存在显着差异。第三部分:老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征细胞因子（Cytokines）和趋化因子（Chemokines）是具有生长、分化和激活功能的冗余分泌型蛋白,调节并决定免疫反应的性质,控制免疫细胞的迁移以及免疫器官中细胞的排列。最初针对免疫损伤产生的细胞因子种类,便决定了免疫反应的发生,甚至随后的免疫反应发展结局特征是细胞毒性的、体液免疫、细胞介导的免疫还是过敏性的。因此,本研究旨在确认老年人群免疫反应相关主要细胞因子、免疫球蛋白Ig的水平特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的主要细胞因子、免疫球蛋白Ig动力学特征差异。在本研究中,我们使用高通量多重细胞因子检测技术,针对人口学特征及QIVs免疫反应特征明显的18名60周岁以上老年受试者的血浆样本,定量检测具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig浓度,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。受试者人口学特征和基线特征基本一致,常规体检显示身体状况良好。按照年龄分组比较,IL-5在免前高龄组M65yrs Group中显着高于低龄NM65yrs Group,并在免后出现显着减少。Granzyme-B在免后低龄NM65yrs Group中显着高于高龄组M65yrs Group,免后两年龄组均出现显着增加。按照性别分组比较,IL-6在免后Day3,Female Group组中显着高于Male Group,随后Day28显着减少。IL-2在免后Day180,老年女性Female Group中显着高于老年男性组Male Group。按照免疫QIVs有无不良反应分组比较,免前,IL-12分泌在GR Group显着高于NGR Group。IL-18和IFN-alpha在QIVs免疫后Day 28,均在GR Group具有显着更高的表达。此外,Granzyme-B在免后Day 03,GR Group表达显着高于NGR Group。许多细胞因子同时具有促炎和抗炎潜能,观察到哪种活性取决于存在的免疫细胞及其对细胞因子的反应状态。体液免疫相关细胞因子IL-5和细胞毒作用相关Granzyme-B具有明显的年龄差异。同时,在QIVs免疫后,显着高表达的细胞因子IL-6和IL-2,证明了老年女性组具有更高的流感病毒特异性的细胞毒性CD8+T细胞以及CD4+记忆T细胞。
湛梦茹[4]（2021）在《激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究》文中认为背景与目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种慢性传染性疾病,全球疾病负担重,其中大部分慢性乙肝病毒携带者均在5岁之前被感染。目前没有能够彻底清除HBV的治疗方法。免疫治疗能够实现CHB患者的功能性治愈,是具有前景的乙肝治疗策略之一。慢性HBV感染时免疫系统往往是免疫耐受或衰竭状态。免疫检查点是表达在免疫细胞表面对免疫反应起活化或抑制作用的分子,通过对他们的调节能够打破这种耐受状态。共刺激分子OX40/OX40L、4-1BB是肿瘤坏死因子（受体）超家族（tumor necrosis factor（receptor）superfamily,TNF（R）SF）的成员,在免疫反应的活化尤其是T细胞的活化中起到了重要作用。而程序性死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）是免疫球蛋白受体CD28亚家族的成员,作为抑制性的信号分子与免疫系统的耐受或衰竭有关。然而目前为止,这些免疫检查点能否作为免疫调节的靶点治疗CHB尚不能明确。相对于婴幼儿,成人对HBV可以产生更强的更有效的免疫反应从而清除病毒,其中发挥年龄依赖性作用的免疫分子尚不清楚。本研究立足于慢性乙型肝炎感染的背景下,通过对OX40/OX40L、PD-1、4-1BB在CHB患者中的表达特点的研究,从而明确其临床意义,及其与年龄的关系。接着我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40,研究其对HBV复制的影响及相关机制,以期为以OX40为靶点治疗CHB的策略提供更多的理论依据。材料与方法:本研究首先收集人的样本用以检测免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。外周血样本来自我们从2018年9月到2019年6月在吉林大学白求恩第一医院纳入的64名慢性乙肝患者和另外招募的37名健康志愿者。其中慢性乙肝患者包括52名未进行抗病毒治疗的患者和12名应用恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗的患者,健康志愿者包括24名成人和13名儿童。从外周血中分离出血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。肝脏组织病理标本来自18名进行肝脏穿刺的患者和6名进行肝脏血管瘤手术的成人患者。其中18名慢性乙肝患者包括9名慢性乙型肝炎发作的患者和9名慢性乙型病毒感染未发作的患者。在收集的人的样本中我们先后检测了OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。为了研究OX40/OX40L在人群中的表达特点,我们应用流式细胞术检测PBMCs中膜形式的OX40和OX40L（membrane-bound OX40,m OX40;membrane-bound OX40L,m OX40L）的表达;应用酶联免疫吸附试验检测血浆中可溶性形式的OX40和OX40L（soluble OX40,s OX40;soluble OX40L,s OX40L）水平;应用免疫组化的方法对肝组织中OX40和OX40L的表达量进行检测。之后为了研究PD-1和4-1BB在CHB患者中表达特点,我们应用前期检测OX40/OX40L的人群样本外加从我院病理科另申请到的6名儿童的肝组织样本,对PD-1和4-1BB在CHB患者中的表达情况进行了检测。我们应用磁珠分选的方法将PBMCs中的CD4+和CD8+T细胞分选出来,应用q RT-PCR的方法检测了各个T细胞亚群PD-1和4-1BB mRNA的水平;应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中可溶性的PD-1和4-1BB（soluble PD-1,s PD-1;soluble 4-1BB,s4-1BB）的水平;应用免疫组化的方法检测了肝组织中关于PD-1和4-1BB的表达情况。最后我们将以上检测结果与CHB患者的疾病特点及临床指标进行相关性分析从而探究他们在慢性乙肝感染中的临床意义,及与年龄的关系。基于前期临床样本的结果,我们应用尾静脉注射腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）的方法构建了rAAV/1.3HBV小鼠模型,首次将OX40激动性的单抗应用于该模型以观察其产生的作用。为了明确激活免疫检查点OX40对HBV复制的作用,我们应用全自动电化学发光分析仪检测血清内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）的水平,用q RT-PCR法检测HBV DNA定量,用免疫组化法检测小鼠肝组织内HBs Ag和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBc Ag）的表达水平。为了明确激活OX40靶点对HBV复制的作用的同时产生的肝脏炎症变化,我们应用微孔板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平,应用HE染色的方法观察小鼠肝脏炎症病理变化。为了观察这个过程中伴随的免疫变化,我们分离了小鼠肝脏内浸润的淋巴细胞,应用流式细胞术对其中T细胞亚群的比例进行了检测,同时我们应用流式微球检测法（cytometric bead array,CBA）对该过程中小鼠血清中Th1、Th2、Th17相关的细胞因子进行了评估。期间我们还对小鼠脾脏的长度和重量进行了评估与检测。为了探究上述过程的机制,我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型的基础上将CD4+和CD8+T细胞进行分别剔除,构建了CD4+和CD8+T细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型,连同安慰剂组小鼠同时给予OX40激动剂。应用上述检测方法分别对模型中病毒学变化和血清转氨酶变化进行了检测。同时为了进一步从mRNA水平研究激活OX40靶点对HBV复制的作用过程中基因表达的变化,我们分离了小鼠肝内的淋巴细胞对其进行mRNA转录组测序（mRNA sequencing,mRNA-seq）。测序所得的差异表达的mRNAs（differentially expressed mRNAs,DEmRNAs）分别纳入火山图和聚类热图,并分别应用Go功能富集及KEGG、Reactome通路富集的方法对这些DEmRNAs所富集的功能和通路进行初步探索。研究结果:关于OX40/OX40L在人的样本中的表达结果显示在外周血PBMCs中表达OX40+T细胞的百分比在CHB患者中是减少的,其中在高病毒载量组和肝炎发作组中这种减少的趋势尤其明显,且OX40+T细胞的百分比与血清病毒学指标呈负相关。而OX40L+B细胞和单核细胞的百分比在CHB患者的PBMCs中是增多的,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作的组中也比较明显,且他们主要与肝脏炎症指标呈正相关。同时我们还发现慢性乙肝患者外周血中s OX40/OX40L表达明显升高,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组比较明显,且s OX40/OX40L的水平与病毒复制及肝脏炎症指标均呈正相关。另外ETV治疗前后血浆中s OX40水平没有明显变化。同时我们发现肝组织中OX40/OX40L的表达趋势与血浆中s OX40/OX40L表达趋势相似,即在CHB患者中是表达升高的,且在肝炎发作的患者中升高的趋势更明显。最后我们发现在健康人外周血中总T细胞中OX40+细胞的百分比,CD4+T细胞中的OX40+细胞的百分比,CD14+单核细胞中OX40L+细胞的百分比及血浆中s OX40的水平与年龄呈正相关,具有年龄依赖性。其次关于PD-1和4-1BB在人群中表达的相关研究结果显示在CHB患者中无论是PBMCs中CD4+T细胞还是CD8+T细胞中PD-1 mRNA的水平与健康组相比均是升高的,这与CHB患者肝脏组织中PD-1的表达趋势是一致的。在CHB患者血浆中s PD-1也是升高的,且这种升高的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组也比较明显,ETV治疗前后s PD-1水平没有明显变化。另外血浆中s PD-1的水平不仅与HBV的病毒学指标呈正相关还与肝脏炎症指标呈正相关。4-1BB在CHB患者中的表达特点大致与PD-1相似,简单来讲血浆中的s4-1BB的水平在CHB患者中也是异常升高的,且在高病毒载量组和肝炎发作组升高趋势比较明显,ETV治疗前后s4-1BB水平没有明显变化。血浆中s4-1BB水平主要与血清病毒学指标呈正相关。肝组织中4-1BB的表达趋势与血浆中s4-1BB的趋势相似,即与健康对照组相比,CHB患者的肝脏组织中4-1BB的表达水平更高。而在总PBMCs、CD4+T细胞以及CD8+T细胞中4-1BB mRNA的水平在CHB患者中均有升高的趋势但无统计学差异。最后我们观察到在健康人群中无论是PD-1还是4-1BB的表达在不同年龄组均无明显差异。通过对上述免疫检查点的表达特点及临床意义的分析,我们选择将OX40靶点激动剂应用于已经构建成功的rAAV8/1.3HBV小鼠模型中。我们发现小鼠血清中HBs Ag和肝内HBV DNA水平均有所下降,且血清中HBs Ag的水平在第8天达到最低值。同时我们观察到小鼠肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达与安慰剂组相比也有减少的趋势。但激活OX40靶点似乎对血清HBV DNA及HBe Ag水平没有影响。在HBV小鼠模型中激活OX40靶点HBV被抑制的同时还伴随着肝脏炎症的产生,表现为血清中ALT和AST不同程度的升高,肝脏组织内炎症细胞的浸润。除此之外,小鼠肝脏内T细胞亚群比例及血清中免疫细胞因子也发生了变化,表现为CD8+T细胞比例的升高及Th1、Th2及Th17相关的细胞因子升高,且相关细胞因子的水平均表现为先升高再下降的趋势,与病毒清除的过程一致。另外我们发现使用OX40激动剂能够引起小鼠脾脏的增大。同时我们还发现在该模型中应用OX40激动剂的效应呈剂量依赖性,主要表现在血清HBs Ag、肝内HBV DNA的下降水平,CD8+T细胞比例升高的水平以及脾脏增大的程度上。在应用OX40激动剂抑制HBV过程相关机制的探索中,我们发现CD4+/CD8+T细胞缺陷和免疫正常的rAAV8/1.3HBV小鼠同时给予OX40激动剂后,在给药第8天和第12天CD4+T和CD8+T细胞缺陷的小鼠血清中HBs Ag水平与免疫正常组HBV小鼠相比均是升高的,其中以CD8+T细胞缺陷的小鼠升高趋势更明显。与免疫正常组的小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝内HBV DNA水平没有明显变化,而CD8+T细胞缺陷小鼠则有轻度升高趋势。对于小鼠血清ALT水平,免疫正常的和CD4+T细胞缺陷的HBV小鼠给予OX40激动剂后转氨酶均有所升高,而CD8+T细胞缺陷的HBV小鼠则没有明显升高。关于应用OX40激动剂和安慰剂的HBV小鼠肝内淋巴细胞基于mRNA水平的转录组学测序结果显示,经过OX40激动剂处理后小鼠肝内淋巴细胞表达上调的mRNAs有3008个,下调的有2269个,并可聚类成簇。经Go功能富集分析后,我们发现在生物进程方面这些DEmRNAs主要富集到了白细胞的分化,染色质及组蛋白的修饰调节等过程;在细胞成分方面他们主要富集到了核内的染色质、异染色质及中心体等细胞组成成分上;而在分子功能方面他们主要富集在转录、翻译及小分子GTP酶的结合、Ras GPT酶结合等功能上。经KEGG通路富集分析我们发现这些GEmRNAs主要富集在HBV、人类嗜T淋巴细胞白血病病毒（human T-cell leukemia virus,HTLV）、EB病毒感染相关通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、趋化因子及NF-kapa B等信号通路。而经Reactome分析这些GEmRNAs主要富集在中性粒细胞脱颗粒,细胞因子,白细胞介素,转录调控等相关信号通路。研究结论:免疫检查点OX40/OX40L、PD-1及4-1BB在人的样本中的表达特点向我们提示这几个免疫检查点可能均与慢性HBV感染相关。但其中只有OX40的表达与HBV病毒学指标呈负相关,考虑其与病毒清除密切相关,且只有OX40/OX40L表达呈年龄依赖性。因此我们将OX40激动剂首次应用于rAAV8/1.3HBV小鼠模型,发现激活OX40靶点对HBV复制具有抑制作用,是一个具有前景的治疗CHB的免疫检查点,但激活OX40靶点不能完全清除HBV因此未来可能还需要联合其它治疗方式。对于激活OX40靶点抑制HBV复制的机制显示该过程相对依赖CD4+T细胞似乎更依赖于CD8+T细胞,CD4+T细胞的重要性不可否认,但未来对于HBV的免疫治疗我们也许应该将更多的关注点放在CD8+T细胞上。
韩盼盼[5]（2021）在《低剂量地西他滨调控Treg细胞和抑制CTLs功能恢复ITP免疫耐受的机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分:低剂量地西他滨通过调节Treg细胞恢复ITP的免疫耐受的机制研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Primary Immune Thrombocytopenia,ITP）是一种病因未明的获得性自身免疫性出血性疾病,约占所有出血性疾病的1/3。由于长期接受激素等药物治疗并伴随高出血风险等原因,慢性ITP患者身体乏力,情绪焦虑,兴趣丧失,其生活质量甚至不如癌症患者。ITP发病机制尚未完全阐明,主要原因是患者对自身血小板抗原免疫失耐受,体液免疫和细胞免疫紊乱介导血小板破坏过多和/或血小板生成不足。免疫耐受是机体对自身抗原不产生反应,而对其他抗原发挥免疫应答能力,重建并维持免疫耐受是自身免疫性疾病的重要治疗策略。近年来,虽有血小板生成素受体激动剂、利妥昔单抗等新药出现,但仍有约1/3的患者对各种治疗反应不佳。因此,深入研究ITP免疫失耐受的机制、探寻重建免疫耐受的策略对于ITP的诊治、改善患者生活质量和预后具有重要意义。调节性T细胞（regulatory T cells,Treg cells）在介导免疫耐受,维持免疫稳态,控制自身免疫疾病及抑制过度免疫反应中发挥关键作用。大量研究结果表明,ITP患者体内Treg细胞的数量和功能较正常人显着下降,导致自身反应性效应性T（Teff）细胞过度增殖和激活。通过恢复Treg细胞的功能,抑制Th1和Th17细胞的增殖,恢复ITP患者的免疫耐受,是目前ITP特异性治疗方案的重要机制。地西他滨是DNA甲基化转移酶抑制剂,主要用于治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome,MDS）。地西他滨去甲基化可促进巨核细胞成熟和血小板释放,因此在升高血小板方面具有显着疗效。课题组前期实验室研究证实低剂量地西他滨能够有效改善ITP患者血浆诱导的巨核细胞成熟、凋亡障碍及血小板生成不足。在此基础上,课题组牵头组织的多中心前瞻性临床研究证实,低剂量地西他滨治疗难治性ITP患者耐受性良好,总有效率约50%,部分患者获得超过1年的长期疗效。然而,低剂量地西他滨促进巨核细胞成熟和血小板生成的作用无法完全解释ITP患者获得长期疗效的原因和机制。近年来,有研究报道地西他滨在诱导和维持自身免疫耐受中发挥重要作用。同种异体小鼠骨髓单个核细胞多次输注诱导免疫耐受的基础上,联合地西他滨可显着增加Treg细胞数量、抑制CD4+T细胞增殖、提高小鼠皮肤移植成功嵌合率。我们猜想地西他滨在ITP中能够通过诱导Treg细胞生成,增强Treg细胞抑制功能,恢复Treg细胞和Teff细胞的平衡,从而对ITP起到治疗作用。研究目的:（1）探究低剂量地西他滨在体内和体外对ITP中Treg细胞生成和功能的影响,探明地西他滨是否通过Treg细胞重新平衡CD4+T细胞亚群。（2）阐明干预STAT3等关键分子对地西他滨诱导Treg细胞生成和功能的影响,进一步验证地西他滨的作用靶点和通路。（3）揭示地西他滨在ITP治疗中获得长期疗效的原因,为地西他滨用于ITP患者的治疗提供准确详实的数据,为ITP患者的诊治提供新靶点和新策略。研究方法:（1）ITP患者及对照:分别收集符合诊断标准的ITP患者及年龄、性别匹配的健康对照者的外周血样本。同时收集地西他滨治疗前、后ITP患者的外周血样本。（2）构建主动ITP小鼠模型:用野生型C57BL/6小鼠的血小板免疫同源CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61KO）小鼠,再将CD61敲除小鼠的脾脏细胞输注给辐照后的联合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficient,SCID）。（3）体外细胞培养:分离ITP患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）并分选CD4+T细胞。加入rh-IL-2,anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养。加入不同浓度地西他滨（0,1 nM,10nM,100nM,1μM,10μM）孵育72小时。（4）流式细胞术检测:地西他滨处理后Annexin-V和PI染色检测PBMCs的凋亡水平,并检测 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞,CD4+IFN-γ+Th1 细胞,CD4+IL4+Th2细胞,CD4+IFN-γ-IL17+Th17 细胞和 CD4+IFN-γ-IL22+Th22 细胞的数量。（5）Treg细胞抑制功能实验:磁珠分选CD4+CD25-Teffs细胞,加入CFSE染色后,与分选的CD4+CD25+CD127-Treg细胞按照比例为4:1的比例共培养。6天后,流式细胞术检测CD4+T细胞增殖。（6）靶向去除Treg细胞:免疫磁珠从CD61敲除小鼠的脾细胞中删除CD4+CD25+Treg细胞后输注给SCID小鼠、或给SCID小鼠腹腔注射单克隆抗小鼠CD25（IL-2Rα）抗体来耗尽Treg细胞。（7）细胞因子检测:使用V-PLEX人促炎Panel 1试剂盒与V-PLEX人IL17A试剂盒检测ITP患者治疗前后的血清样品中的11种细胞因子,使用ELISA检测TGF-β水平。（8）转录组测序:提取地西他滨治疗前和治疗后的ITP患者PBMCs样本中的RNA,并在Illumina Hiseq平台上测序。（9）蛋白免疫印记（Western blot）:收集ITP患者治疗前后的PBMCs样本,检测AKT和STAT3蛋白水平的改变。（10）STAT3和AKT抑制实验:在体外细胞培养实验及ITP主动模型中应用STAT3和AKT抑制剂,检测其STAT3和AKT抑制剂对地西他滨治疗的影响。研究结果:（1）低剂量地西他滨促进Treg细胞的体外分化并增强其免疫抑制功能在体外研究中,低剂量地西他滨（10 nM和100 nM）显着提高了 ITP患者PBMCs中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例,而未改变CD4+T细胞的百分比。通过分选CD4+T细胞排除其他细胞干扰,低剂量地西他滨（100 nM）仍显着增加了 ITP中Treg细胞的数量。我们分选ITP患者和健康对照组的CD4+CD25+CD127-Treg细胞与自身Teff细胞共孵育,100nM地西他滨可以显着提高Treg细胞对Teff细胞增殖的抑制功能。地西他滨本身对Teff细胞增殖无明显影响。这些结果表明,低剂量地西他滨在ITP中显着增强了 Treg细胞的免疫抑制功能。（2）低剂量地西他滨改善主动模型ITP小鼠血小板减少并促进脾脏Treg细胞扩增我们通过建立ITP主动模型来研究地西他滨的体内作用。照射和脾细胞输注7天后,小鼠血小板计数明显下降。与对照组相比,0.03 mg/kg的地西他滨组在第21天和28天血小板显着增加。给药3周后,流式细胞术分析显示,地西他滨处理组小鼠脾脏CD4+T细胞中Treg细胞的数量显着增加。同时,与对照相比,地西他滨组CD4+T细胞中Th1、Th17细胞明显减少,而Th22细胞无明显差异。（3）靶向去除Treg细胞能够部分抵消低剂量地西他滨的治疗作用通过脾细胞输注前磁珠分选删除的Treg细胞或注射抗-CD25抗体耗尽主动模型ITP小鼠中的Treg细胞来靶向去除Treg细胞,我们发现低剂量地西他滨在ITP小鼠中提高血小板计数的作用明显减弱。同时,靶向去除Treg细胞后,低剂量地西他滨对ITP模型小鼠的脾Th1、Th7细胞也无明显影响（4）低剂量地西他滨恢复ITP患者CD4+T细胞亚群的平衡通过分析纳入低剂量地西他滨临床实验ITP患者的外周血样本,我们发现地西他滨治疗后,患者体内CD4+T细胞中Treg细胞数量显着增加。同时,地西他滨显着降低了 ITP患者CD4+T细胞群中Th1和Th17细胞的比例。我们还观察到地西他滨治疗后,ITP患者的Treg细胞的抑制功能明显增强。（5）低剂量地西他滨对ITP患者T细胞分化相关细胞因子的影响通过对ITP患者在地西他滨治疗前后的外周血清分析,我们发现低剂量地西他滨显着降低了 ITP患者血清中TNF-α、IFN-y、IL-17a、IL-6、IL-8和IL-12的水平,而TGF-β与IL-2水平在地西他滨治疗后显着升高。血清IL-1β、IL-4、IL-10和IL-13水平在治疗前后无显着差异。（6）转录组测序分析ITP患者地西他滨治疗后基因表达变化为了评估低剂量地西他滨对ITP患者基因表达的影响,我们对4例治疗有效和3例治疗无效ITP患者进行了转录组测序分析。结果显示,有效患者在地西他滨治疗后共有301个基因有显着表达差异。治疗无效患者在地西他滨治疗后有43个基因表达水平发生明显变化。根据KEGG分析,治疗有效患者的表达差异基因与IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化通路、Th17细胞分化通路、Jak-STAT信号通路等相关。（7）低剂量地西他滨通过抑制STAT3调节Treg细胞Western blot分析ITP患者地西他滨治疗后PBMCs的蛋白水平变化发现,与治疗前相比,STAT3磷酸化水平明显降低。在体外培养中,ITP患者和健康对照组CD4+T细胞中Treg细胞比例在STAT3抑制剂+地西他滨组与STAT3抑制剂组无明显差异。在ITP小鼠研究中,STAT3抑制剂+地西他滨组的小鼠的血小板计数与STAT3抑制剂组的没有显着差异。研究结论:（1）低剂量地西他滨可以增加ITP患者PBMCs中Treg细胞的数量并增强Treg细胞的免疫抑制功能。（2）低剂量地西他滨通过调节脾脏Treg细胞从而显着提高ITP主动模型小鼠的血小板数目,恢复CD4+Th细胞亚群比例。（3）低剂量地西他滨恢复ITP患者的CD4+T细胞比例和Treg细胞抑制功能,并通过抑制STAT3调节ITP患者Treg数量和功能,从而恢复ITP患者的免疫耐受。第二部分:低剂量地西他滨在ITP中通过调节PD-1甲基化降低CTLs诱导的血小板凋亡研究背景:原发免疫性血小板减少症（Primary immune thrombocytopenia,ITP）是一种以血小板计数持续减低和出血为特征的获得性自身免疫性疾病。目前,ITP的发病机制尚未完全阐明,其中心学说为“免疫失耐受”,免疫异常介导机体对自身血小板表面抗原失耐受从而加速血小板的破坏,并导致巨核细胞的发育和成熟障碍,血小板生成减少,从而形成机体血小板持续减低的状态。在血小板自身抗体基础上,异常的T细胞免疫,特别是CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTLs）在ITP的发病机制中发挥重要作用。研究发现,CTLs可以通过直接杀伤自身血小板和诱导血小板凋亡参与ITP的发病。程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）是CD28/CTLA-4家族成员之一,主要表达在外周血活化的T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞和树突状细胞上。PD-1与其配体PD-L1结合,可以启动T细胞程序性死亡,在减少自身反应性T细胞增殖和降低CTLs对靶细胞的细胞毒性方面具有至关重要的作用。前期研究发现,ITP患者外周血单个核细胞（PBMCs）和CD4+T细胞中PD-1和PD-L1的表达减低,PD-L1-Fc重组融合蛋白通过激活PD-1/PD-L1通路增加了 ITP中T细胞的凋亡,抑制了 T细胞的激活和增殖。这些结果表明PD-1通路在ITP的发病机制中发挥重要作用,但是PD-1/PD-L1通路是否参与了 CTLs对血小板的杀伤尚无明确的研究。地西他滨是特异的DNA去甲基化药物（hypomethylating agent,HMA）,广泛应用于治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndrome,MDS）。研究发现,低剂量地西他滨可以通过去甲基化作用促进巨核细胞成熟和血小板释放。此外,在治疗MDS的过程中,去甲基化药物可以导致PD-1 CpG岛去甲基化和PD-1表达增加。我们猜测低剂量地西他滨通过调节ITP病人的PD-1抑制CTLs细胞毒性,从而对ITP起到治疗作用。研究目的:（1）探究PD-1在ITP中的表达及甲基化水平及其在ITP发病中的作用机制。（2）探究PD-1/PD-L1通路在抑制CTLs毒性及恢复ITP免疫耐受中的作用。（3）探究低剂量地西他滨对PD-1甲基化和表达的调控作用,阐明地西他滨对CTLs杀伤血小板的影响以及对ITP的治疗价值。研究方法:（1）ITP患者及对照:分别收集符合诊断标准的ITP患者65例及年龄、性别匹配的健康对照者43例的外周血。（2）构建主动ITP小鼠模型;用野生型C57BL/6小鼠的血小板免疫同源CD61基因敲除（CD61 knockout,CD61KO）小鼠,再将后者的脾脏细胞输给辐照后的联合免疫缺陷小鼠（severe combined immunodeficient,SCID）。（3）体外细胞培养:分离ITP患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）并分选CD8+T细胞。加入rh-IL-2、anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养。加入地西他滨、PD-L1-Fc或抗人PD-1抗体孵育72小时。（4）流式细胞术检测:通过流式细胞术检测CD4+T、CD8+T细胞和血小板表面PD-1和PD-L1的表达。（5）荧光定量PCR（q-PCR）:检测ITP患者和健康对照PD-1的mRNA表达水平。（6）CTL诱导的血小板凋亡检测:健康对照血小板与CD8+T细胞按照106/mL:105/mL的比例混合,加入rh-IL-2,anti-CD3抗体和anti-CD28抗体进行体外培养,体外共培养4小时。应用线粒体膜电位检测试剂盒（Mitochondria Staining Kit）检测血小板调亡。（7）DNA甲基化测序:检测PD-1基因启动子区甲基化水平。（8）蛋白免疫印记（Western blot）:检测ITP患者地西他滨处理后的CD8+T细胞PI3k/AKT通路的的变化。研究结果:（1）PD-1和PD-L1在ITP患者CD8+T细胞中表达降低ITP患者PBMCs中PD-1的mRNA表达水平与健康对照组无显着差异。流式分析发现ITP患者外周血中CD8+T细胞和CD4+T细胞上的PD-1及PD-L1的表达明显低于健康对照组。ITP患者血小板上PD-L1表达水平与健康对照组无差异。此外,通过相关性分析发现ITP患者CD8+T细胞上的PD-1和PD-L1表达与血小板计数无关。（2）PD-L1-Fc抑制ITP患者CTLs对血小板的杀伤在CD8+T细胞培养体系中加入PD-L1-Fc融合蛋白后,我们发现PD-L1-Fc融合蛋白可显着降低ITP患者CTLs介导的血小板凋亡。而PD-L1-FC自身对血小板的凋亡无明显作用。这些结果提示PD-L-Fc融合蛋白能显着抑制ITP患者CTLs对血小板的杀伤。（3）ITP患者CD8+T细胞中PD-1甲基化水平增高通过DNA甲基化测序,我们发现ITP患者的PD-1启动子CpG甲基化比例显着高于健康对照组。因此,ITP患者CD8+T细胞的低PD-1水平有可能由于CD8+T细胞中PD-1的基因启动子区的甲基化水平升高导致的。（4）低剂量地西他滨显着增加CD8+T细胞PD-1表达在CD8+T细胞培养体系中加入100nM地西他滨孵育72小时后,我们发现地西他滨显着提高了 ITP患者CD8+T细胞的PD-1表达。为了评估我们的体外结果在体内可重复性,我们建立了 ITP主动模型。在第21天和28天,地西他滨治疗组小鼠的血小板计数显着升高。与对照组相比,地西他滨处理ITP小鼠脾脏CD8+T细胞的PD-1表达水平升高。此外,ITP患者在接受地西他滨治疗后血小板计数显着增加,同时CD8+T细胞PD-1表达显着增加。（5）低剂量地西他滨显着降低ITP中PD-1启动子甲基化ITP患者的CD8+T细胞用100 nM地西他滨培养。DNA甲基化测序检测PD-1基因甲基化。与对照组相比,处理后的细胞甲基化CpG残基显着降低。（6）低剂量地西他滨有效抑制ITP中CTLs介导的血小板凋亡低剂量地西他滨处理的CTLs和血小板共培养体系中,CTLs介导的血小板凋亡显着减少。我们进一步检测了接受地西他滨治疗的ITP患者CTLs细胞毒性,发现在地西他滨给药12周后,CTLs介导的血小板凋亡明显降低。（7）低剂量地西他滨抑制PI3K和AKT的磷酸化Western blot检测100nM地西他滨培养的CD8+T细胞裂解液中总PI3K和AKT的表达水平,发现并无明显变化。然而,低剂量地西他滨显着下调了 PI3K和AKT的磷酸化水平。（8）阻断PD-1可部分抵消地西他滨对CTLs介导的血小板凋亡的抑制作用为了确定地西他滨的作用机制是否依赖于PD-1通路,我们进行了体外和体内的PD-1阻断试验。体外实验发现,CTLs介导的血小板凋亡在地西他滨+抗人PD-1组和对照组之间没有显着差异。在ITP小鼠中,地西他滨+抗鼠PD-1组的血小板计数与对照组小鼠没有明显差异。这些结果表明地西他滨对CTLs杀伤功能的抑制作用可部分被阻断PD-1所抵消。研究结论:（1）PD-1在CD8+T细胞的甲基化水平升高及表达降低在ITP的发病机制中起作用。通过激活PD-1/PD-L1通路可抑制CTLs介导的血小板的凋亡。（2）低剂量地西他滨能够恢复ITP患者CD8+T细胞PD-1的表达并降低CD8+T细胞PD-1启动子区甲基化水平。（3）低剂量地西他滨通过上调PD-1通路抑制CTLs介导的血小板的凋亡,恢复ITP患者免疫耐受。
李志[6]（2021）在《IL-28B通过下调调节性T细胞抗肝癌的机制研究》文中研究指明研究背景与目的2020年世界卫生组织公布的癌症数据显示,肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）发病率在世界癌症中占第6位,死亡率占第3位。肝癌的治疗目前仍是全球医疗的一大挑战,迫切需要新的治疗方法。调节性T细胞（regulatory T cells,Treg cells）具有抑制抗肿瘤免疫的作用,因此抑制Treg成为HCC免疫治疗的潜在策略。IL-28B是IFN-λ成员之一,已报道IL-28B具有抗肿瘤作用且下调Treg,但目前仍不清楚其抗肿瘤的免疫机制。因此本文评价IL-28B下调Treg对小鼠肝癌的治疗效应,阐明其对免疫微环境中T细胞亚群和细胞因子的影响,并研究IL-28B在体外对Treg生成的影响。研究方法（1）利用HEK 293细胞扩增腺病毒载体rAd-mIL-28B,PCR鉴定目的基因,TCID50法测定病毒滴度。（2）MTT法检测IL-28B体外对宫颈癌TC-1细胞增殖的抑制效应。（3）第0天BALB/c雌性小鼠皮下注射1 × 106个小鼠肝癌H22细胞,分别于第4、7和10天瘤内注瘤组织、脾脏、肺脏、肝脏和胸腺湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第1 1天处死小鼠,称量肿分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,流式细胞术（flow cytometer,FCM）检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清及制备肿瘤组织匀浆,蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。（4）分离BALB/c小鼠脾细胞,利用CD3单抗/CD28单抗、IL-2、TGF-β诱导生成iTreg细胞,在此诱导条件下加入IL-28B培养3天后,FCM检测CD4、CD25 和 Foxp3 分子,RT-PCR 检测 Foxp3 和 PD-1 mRNA 水平,ELISA 检测细胞培养上清IL-10水平。（5）构建H22荷瘤小鼠,每天给予E2-a灌胃治疗,剂量为100 mg/kg/day并于第4、7和10天瘤内注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第11天处死小鼠,称量肿瘤组织湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,FCM检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。研究结果（1）PCR法鉴定扩增的腺病毒载体rAd-mIL-28B含有IL-28B基因,TCID50法检测 rAd-mIL-28B 滴度为 1 × 1010.6 PFU/ml,rAd-EGFP 滴度为 1 X 109.55 PFU/ml。（2）MTT试验证明50 μg/ml IL-28B和100 μg/ml IL-28B作用宫颈癌TC-1细胞72h后,OD值分别为0.80±0.09和0.85±0.08,低于阴性对照组（0.92±0.06）（p<0.05）。（3）在肝癌皮下移植瘤小鼠模型中,rAd-mIL-28B组肿瘤体积为796.74 ±447.58 mm3,低于 rAd-EGFP 组（1415.27±513.37 mm3）（p<0.05）;rAd-mIL-28B组平均肿瘤重量为 0.63±0.30 g,低于 rAd-EGFP 组（1.16±0.34 g）（p<0.05）,抑瘤率为 45.69%;肿瘤组织HE染色后,rAd-mIL-28B组可见肿瘤细胞坏死;rAd-mIL-28B 组的肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中 CD8+T 细胞占淋巴细胞的比例（8.65±5.49%）高于未治疗组（3.21±1.45%）（p<0.05）;与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组 TME 中 Foxp3+T 和 CD4+Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例无统计学差异（p>0.05）;rAd-mIL-28B组脾脏CD4+Foxp3+占CD4+T 细胞的比例为 16.78±2.93%,低于 rAd-EGFP 组（21.47±4.17%）（p<0.05）;rAd-mIL-28B组脾脏中CD4+PD-1+T细胞占淋巴细胞比例为1.46±0.08%,明显低于 rAd-EGFP 组（2.40±0.31%）（p<0.05）;与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组血清 CXCL13,ICAM-1,MCP-5 和 IL-7 水平降低（p<0.05）,rAd-mIL-28B肿瘤组织内IL-15和sFasL的表达降低（p<0.05）。（4）与未刺激的脾细胞相比,脾细胞刺激组（500 ng/ml CD3单抗/CD28单抗、5 ng/ml IL-2和1.25 ng/ml TGF-β）培养三天后,Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例增加（p<0.05）。与脾细胞刺激组相比,加入50 ng/ml IL-28B后,Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例下降,Foxp3 mRNA的水平显着降低（p<0.05）,PD-1 mRNA的水平无明显差异（p>0.05）,细胞培养上清IL-10的水平显着降低（p<0.05）。（5）E2-a联合rAd-mIL-28B作用于H22荷瘤小鼠后抑制了肿瘤体积（p<0.05）;与未治疗组相比,E2-a 联合 rAd-mIL-28B 组 TME 中 Foxp3+、CD4+Foxp3+、CD8+Foxp3+和PD-1+Foxp3+细胞比例明显增加（p<0.05）;血清细胞因子IL-1α、IL-12p40、TNFRI 明显降低,而 MIP-1γ 明显升高（p<0.05）。研究结论（1）rAd-mIL-28B可通过下调H22荷瘤小鼠Treg抑制肿瘤生长。（2）rAd-mIL-28B可影响H22荷瘤小鼠肿瘤免疫微环境。（3）IL-28B具有体外直接抑制Treg细胞生成的作用。（4）rAd-mIL-28B联合E2-a未增强E2-a的抗肿瘤作用。
申晨[7]（2021）在《BTBR T+Itpr3tf自闭症小鼠不同发育阶段T细胞亚群变化研究》文中研究指明[目的]孤独谱系障碍（ASD）是一组以语言和社交缺陷、重复刻板行为为核心特征的神经发育障碍性疾病,被WHO列为儿童精神病第一位,至今发病机制不清、无有效治疗方法,成为严重影响儿童健康的全球公共卫生问题。研究发现T淋巴细胞异常与ASD发病相关,免疫干预可改善ASD症状,但具体机制不清。BTBR T+Itpr3tf自闭症小鼠伴随明显的免疫异常,是研究自闭症与免疫异常关系的理想动物模型,但由于对不同年龄BTBR小鼠的免疫状况不清楚,影响了利用该模型进一步探索免疫干预策略的进一步研究。本课题探讨了不同年龄BTBR小鼠T细胞亚群及其相关炎性细胞因子变化与自闭症行为学特征的关系,为进一步阐述自闭症发病机制、寻找干预新策略提供了坚实的实验基础。[方法]随机选取4周龄、8周龄和12周龄的雄性BTBR小鼠（n=15）分成三组,与其年龄匹配的C57小鼠作为对照组（n=15）。分别通过眼眦取血,分离血浆和全血的单细胞悬液;脱颈椎处死后,取小鼠胸腺和脾脏组织,利用红细胞裂解法制备单细胞悬液,通过流式细胞技术检测小鼠胸腺、脾脏和外周血中Th1、Th2、Th17、Tc1、Tc2、Tc17、Tfh 和 Treg 细胞在不同年龄段 BTBR 小鼠和C57小鼠体内的变化,筛选出差异性表达的T细胞亚群;利用LEGENDplex多因子检测技术检测BTBR小鼠和C57小鼠血浆中IFN-γ、TNF-a、IL-2、I1-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-17f 和IL-22的表达,筛选出差异性表达的细胞因子;所有小鼠均完成三箱实验、理毛实验和埋珠实验等行为评估,并分析其行为学表现和T细胞亚群及细胞因子间的相关性。[结果]1.相同年龄阶段,4周龄（p<0.001）、8周龄（p<0.001）、12周龄（p<0.05）BTBR小鼠社交时间明显减少;4周龄（p<0.05）、8周龄（p<0.001）、12周龄（p<0.001）BTBR小鼠独处时间明显增多,且随BTBR小鼠年龄增长独处偏好有加重趋势。2.相同年龄阶段,4周龄（p<0.05）、12周龄（p<0.001）BTBR小鼠理毛行为时间明显增加;8周龄（p<0.01）、12周龄（p<0.05）BTBR小鼠埋珠数量明显增加,BTBR小鼠重复刻板行为从幼年一直持续到成年。3.脾脏和外周血可以反应外周免疫情况,BTBR小鼠相较C57小鼠促炎T细胞亚群增加,抑炎T细胞减少,8周龄时BTBR小鼠T细胞亚群异常改变更明显。4.相同年龄阶段,4周龄BTBR小鼠较C57小鼠血浆IFN-γ（p<0.05）含量降低,IL-17F（p<0.01）升高;8 周龄（p<0.001）BTBR 小鼠 IL-5（p<0.05）和IL-10（p<0.05）;12 周龄 BTBR 小鼠 IL-17F（p<0.05）含量降低。[结论]1.青春期和成年期BTBR自闭症小鼠较幼年期小鼠更适合用于自闭症与免疫异常关系研究的模型。2.脾脏和外周血免疫指标均可反映BTBR自闭症小鼠的免疫状况。3.外周免疫异常激活状态提示自闭症患者可能存在自身免疫性脑炎,但大脑免疫状况究竟如何需进一步研究。
胡欣彤[8]（2020）在《巨噬细胞及T细胞亚群在肺癌患者中的变化及意义》文中进行了进一步梳理背景:中国国家癌症中心发布的《2019年中国最新癌症报告》中指出肺癌位居我国恶性肿瘤发病首位,结果显示:2015年我国新发肺癌病例约为78.7万例,发病率为57.26/10万,中标率为35.96/10万,其中男性发病率和死亡率均高于女性,城市发病率和死亡率高于农村,且年龄别死亡率变化趋势和发病相似,随年龄增加逐渐上升。肺癌已成为对我国国民健康威胁最大的恶性肿瘤之一。加深对肺癌发病和进展机制的认识,有助于加快攻克肺癌的预防、早期发现和相关治疗的脚步。已知的肺癌类型包括非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）两大类。NSCLC约占所有肺癌的85%,与SCLC相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。而SCLC具有恶性程度高、倍增时间短、转移早等特点,虽对化疗、放疗敏感,但易复发,且多数确诊时已经广泛转移,故SCLC往往很难治愈,其死亡率居高不下。SCLC与NSCLC在病理、临床特点、治疗方案等方面存在显着差异。大量的研究表明异常的免疫应答与肺癌的发生发展密切相关,深入了解SCLC和NSCLC的免疫应答的差异,将有助于肺癌的个体化诊疗。肿瘤浸润的巨噬细胞在肺肿瘤的发生和发展中起着关键的作用。巨噬细胞传统定义为经典活化型（M1型）和替代活化型（M2型）巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要分泌白介素（interleukin,IL）-12等促炎因子来清除细菌和肿瘤细胞。M2型巨噬细胞,主要分泌IL-10,参与组织修复、促进肿瘤生长和转移。Ang Yuan等在2015年揭示了M1型和M2型巨噬细胞对肺癌细胞具有相反的作用,提示M1/M2极化可能作为肺癌免疫治疗的潜在靶点。Almatroodi S A等人的研究表明,巨噬细胞的异常极化与NSCLC患者的预后相关。随后,Iriki团队研究发现肿瘤相关巨噬细胞通过激活STAT3与SCLC细胞相互作用从而促进肿瘤进展。肺组织中的巨噬细胞多数来源于外周循环血液中的单核细胞,然而巨噬细胞和单核细胞在SCLC和NSCLC中的分布差异及其潜在的临床意义尚不清楚。T细胞为主的适应性免疫在肺癌免疫中也发挥重要的作用。传统标记为CD4+CD25+Foxp3+的Treg是一类控制体内自身免疫反应的T细胞亚群,在维持免疫稳态和预防自身免疫中发挥重要作用。既往研究表明,NSCLC患者的疾病进展与外周循环血液中明显增多的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞相关。此外,近年来基于T细胞检查点抑制剂的免疫治疗在肿瘤治疗中显示出良好的前景。大量研究表明程序性死亡受体（Programmed cell death protein,PD）-1细胞在癌症免疫逃避中起着重要作用。2015年美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准了NSCLC相关的抗PD-1免疫治疗药物的临床应用。滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cells,Tfh）形成于生发中心,在体液免疫中发挥重要作用。外周循环血液辅助性T细胞（Peripheral helper T cells,Tph）与Tfh细胞功能类似,同样表达PD-1表面分子,能够辅助诱导浆细胞分化,在体液免疫中发挥重要作用。研究表明Tph细胞与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关。然而,Treg细胞、PD-1+Tfh细胞以及Tph细胞在肺癌中的变化及潜在的临床意义尚不清楚。目的:研究SCLC和NSCLC患者的支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）和外周循环血液中的巨噬细胞/单核细胞、Treg细胞、PD-1+Tfh细胞及Tph细胞的频数变化、相关细胞因子的水平,探究上述细胞亚群的变化与疾病的进展或预后的潜在相关性。以期为肺癌的个体化诊疗提供新的思路。方法:所有SCLC和NSCLC患者的诊断是依据2015年中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会发布的《中国原发性肺癌诊疗规范》中的诊断标准。并按照2012年国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）临床实践指南中提出的TNM分期系统进行分期。1.纳入32例SCLC和35例NSCLC患者以及年龄和性别相匹配的14例支气管扩张患者作为对照组（control subjects,CS）。同时采集受试者的肺泡灌洗液及外周血。通过单个核细胞提取技术和流式细胞技术检测受试者外周血、肺泡灌洗液中的单核细胞/巨噬细胞标记物CD14/CD206/IL-10/IL-12的表达水平。采用微量样本多指标流式蛋白定量技术（Cytometric bead array,CBA）检测血清和灌洗液上清中的细胞因子IL-10的含量,并分析上述细胞和因子在实验组内与对照组之间的差异及其与临床指标之间的关系。2.与方法1为同一批受试者。通过单个核细胞提取技术和流式细胞技术检测受试者外周血、肺泡灌洗液中的Treg细胞标记物CD3/CD4/CXCR5/CD25/Foxp3的表达水平。并分析上述细胞在实验组与对照组之间的差异及其与临床指标之间的关系。3.由于应用流式细胞术检测外周血单个核细胞中各细胞亚群的频数和表型时,所需要外周血的数量较多,不符合伦理要求。因此,我们第三部分实验纳入的患者及对照组与前两部分实验不同。纳入26例SCLC和26例NSCLC患者以及年龄和性别相匹配的20例肺炎患者及20例健康志愿者作为对照组。同时采集受试者的肺泡灌洗液及外周血。通过单个核细胞提取技术和流式细胞技术检测患者外周血、肺泡灌洗液中的PD-1+T细胞亚群标记物PD-1/CXCR5/CD4/CD8的表达水平。并进一步分析上述细胞亚群频数在实验组内与对照组之间的变化差异及其与临床指标之间的关系。结果:1.结果显示,与NSCLC患者相比,SCLC患者的BALF中CD14+、CD206+CD14+、IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞的频数明显升高并伴随IL-10水平升高,而在两组患者外周血中并没有观察到CD14+、CD206+CD14+、IL-10+CD206+CD14+M2样单核细胞的频数差异;SCLC患者BALF中升高的IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞频数及IL-10浓度与肿瘤进展呈正相关,与生存时间呈负相关;SCLC患者BALF上清中IL-10水平与IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞频数呈正相关;化疗后SCLC患者循环IL-10+CD206+CD14+M2样单核细胞水平明显升高。2.无论是BALF还是外周血样本,SCLC和NSCLC患者中的Foxp3+CD25+CXCR5-CD4+Treg细胞频数都显着高于对照组,且SCLC组显着高于NSCLC组,并与肿瘤进展显着正相关;SCLC患者BALF中IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞频数与Foxp3+CD25+CXCR5-CD4+Treg细胞频数呈正相关。3.SCLC患者外周血循环PD-1+Tfh细胞频数明显高于NSCLC、肺炎及健康对照组,且与SCLC肿瘤进展相关;SCLC患者外周血循环Tph细胞频数明显高于NSCLC、肺炎及健康对照组;SCLC患者的BALF中Tph细胞的频数明显低于NSCLC和肺炎组;未观察到Tph细胞与肺肿瘤进展的相关性;SCLC患者循环PD-1+CXCR5+Tfh/PD-1+CXCR5-Tph细胞比率显着低于健康对照组,且与肿瘤进展相关;此外,SCLC患者循环PD-1+Tfh细胞和Tph细胞频数在化疗后显着下降。结论:1.SCLC患者BALF中IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞频数增多,且IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞与肿瘤的进展和预后密切相关,提示IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞频数的变化可作为SCLC进展和预后的评估指标及治疗的潜在靶点。2.SCLC患者Foxp3+CD25+CXCR5-CD4+Treg细胞频数增多,且与肿瘤的进展显着相关。SCLC患者BALF中IL-10+CD206+CD14+M2样巨噬细胞的增多与活化的Treg细胞相关。研究证明了Treg细胞在SCLC发病机制中的重要作用。3.SCLC外周血循环PD-1+Tfh细胞频数显着增高,并与肿瘤进展相关。依托泊苷和顺铂联合化疗对SCLC患者外周血PD-1+CXCR5+Tfh和PD-1+CXCR5-Tph细胞有影响。表明循环PD-1+Tfh细胞可能参与了SCLC肿瘤的发生和发展。
赵媛媛[9]（2020）在《T细胞亚群及其免疫检查点分子在妊娠过程中的表达及意义》文中研究说明目的:1.全面分析不同来源（外周血、宫腔血、脐血）以及不同妊娠并发症如子痫前期（Pre-eclampsia,PE）和妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）中T细胞亚群,特别是调节性T（Regulatory T,Treg）细胞,及其免疫检查点分子的表达及意义。2.全面分析正常妊娠、原因不明复发性流产（Unexplained recurrent pregnancy loss,URPL）和GDM中外周血T细胞亚群,特别是Treg细胞,及其免疫检查点分子的表达及意义。方法:1.选择2019年3月至2019年9月烟台毓璜顶医院妇产科住院分娩的正常产妇28例,PE产妇25例和GDM产妇28例,采用流式细胞术检测研究对象外周血、宫腔血和脐血中T细胞亚群（CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+Treg和CD8+Treg细胞）百分比,以及这些细胞上程序化细胞死亡受体1（Programmed cell death receptor1,PD-1）、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（Glucocorticoid-inducible tumor necrosis factor receptor,GITR）、人白细胞抗原G（Human leucocyte antigen-G,HLA-G）和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4）的表达水平。2.选择2019年3月至2019年9月烟台毓璜顶医院妇产科就诊的正常早期妊娠妇女43例,正常中期妊娠妇女33例,正常晚期妊娠妇女35例,URPL妇女21例,中期妊娠GDM妇女25例,及同期我院查体中心进行体检的正常非妊娠妇女57例,采用流式细胞术检测研究对象外周血中T细胞亚群百分比,以及这些细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4的表达水平。结果:1.（1）与正常产妇相比,PE和GDM产妇外周血、宫腔血和脐血CD4+Treg细胞百分比降低,CD8+Treg细胞百分比升高（P<0.001）;外周血T细胞亚群中PD-1和GITR及宫腔血T细胞亚群中PD-1表达水平降低（P<0.001）。（2）正常、PE和GDM产妇中,宫腔血CD4+Treg和CD8+Treg细胞百分比低于外周血和脐血（P<0.01）;脐血PD-1+CD4+Treg和PD-1+CD8+Treg细胞百分比低于外周血和宫腔血（P<0.01）;外周血GITR+CD4+Treg和GITR+CD8+Treg细胞百分比高于宫腔血和脐血（P<0.01）;外周血T细胞亚群中HLA-G的表达低于宫腔血和脐血（P<0.01）。2.（1）与非妊娠妇女相比,早、中和晚期妊娠妇女外周血CD4+Treg细胞百分比以及中、晚期妊娠妇女外周血CD8+Treg细胞百分比升高（P<0.01）。晚期妊娠妇女外周血CD4+Treg和CD8+Treg细胞中PD-1和GITR表达高于早、中期妊娠和非妊娠妇女（P<0.01）。（2）与正常早期妊娠妇女相比,URPL妇女外周血CD4+Treg细胞百分比降低（P=0.04）,CD8+Treg细胞百分比升高（P=0.003）;PD-1+CD4+Treg（P=0.02）、GITR+CD4+Treg（P=0.03）和HLA-G+CD4+Treg细胞百分比（P=0.02）降低。与正常中期妊娠妇女相比,中期妊娠GDM妇女外周血CD4+Treg细胞百分比降低,CD8+Treg细胞百分比升高（P<0.001）;HLA-G+CD4+Treg（P=0.008）、PD-1+CD8+Treg（P=0.005）、GITR+CD8+Treg细胞百分比（P=0.006）降低。结论:1.正常妊娠过程中,外周血CD4+Treg细胞和CD8+Treg细胞百分比增加,可能在妊娠免疫耐受中可能发挥重要作用。2.PE和GDM患者外周血、宫腔血和脐血CD4+Treg细胞百分比降低,CD8+Treg细胞百分比升高,可能与PE和GDM的发生有关。3.正常妊娠情况下,脐血和宫腔血T细胞亚群中HLA-G表达升高,可能在维持母胎免疫耐受中起一定作用。4.PE和GDM患者外周血、宫腔血和脐血CD4+Treg和CD8+Treg细胞,URPL患者外周血CD4+Treg细胞以及中期妊娠GDM患者外周血CD8+Treg细胞上PD-1和GITR表达降低,可能与URPL、PE和GDM的发生有关。
罗雅煊[10]（2020）在《不同临床阶段慢性HBV感染患者外周血T细胞免疫状态的研究》文中指出背景:慢性HBV感染（Chronic HBV infection,CHI）是一种由HBV感染引起的机体免疫反应介导肝损伤的慢性疾病,其可导致肝硬化和肝癌,严重危害人的身体健康。近年来,免疫治疗方法在抗病毒、抗肿瘤领域治疗效果显着。按照CHI患者临床症状可将其划分为免疫耐受组（Immune tolerant,IT）、免疫活动组（Immune active,IA）、免疫控制组（Immune control,IC）和再活动组（Reactivation,RA）。处于不同临床阶段的CHI患者机体免疫功能状态不同,导致了疾病的多样化。T细胞免疫反应在抗HBV免疫应答过程中发挥重要作用,影响疾病的发生发展及转归。目的:探讨不同临床阶段CHI患者外周血T细胞特征,包括T细胞亚群、亚型及T细胞表面抑制性分子PD-1的表达量。结合患者临床检验数据,综合分析患者外周血T细胞免疫状态与HBV DNA载量的关系,推测机体T细胞免疫功能。为临床对CHI患者的疾病分期诊断以及预测预后和转归提供科学依据,同时为开展合理的免疫治疗以干预疾病的发展提供新方向。方法:本研究收录CHI患者,根据患者的临床检验数据,将CHI患者分为IT组、IA组、IC组、RA组,健康志愿者（Healthy donor,HD）为对照组。收集患者的静脉血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）。使用多色流式细胞术检测患者外周血T细胞亚群和CD4+T、CD8+T细胞亚型。根据CD45RA、CCR7的表达情况将CD4+T、CD8+T细胞亚型分为:初始T细胞（Na?ve T cell,Tn）、中枢记忆T细胞（Central memory T cell,Tcm）、效应记忆T细胞（Effector memory T cell,Tem）和效应T细胞（Effector T cell,Te）;使用CD4+CD25+CD127-标记Treg。同时检测患者外周血CD4+T和CD8+T细胞表面PD-1的表达量。并综合分析外周血CD4+T和CD8+T细胞亚型与HBV DNA载量的关系。结果:与HD相比,CHI组T细胞及亚群变化无显着差异;按照患者临床症状,将CHI患者分为IT、IA、IC、RA组。RA组CD3+T细胞百分比显着下降,IT、IA、IC组CD3+T细胞百分比无明显变化。对于CD4+T细胞亚型,与HD相比,CHI中各组CD4+Tn、CD4+Tem、CD4+Te无明显变化;IT和RA组CD4+Tcm频率增高（P<0.05）,IA和IC组CD4+Tcm频率无明显变化;各组Treg频率均呈上升趋势,IA组Treg频率显着增高（P<0.05）,Treg频率与ALT呈正相关（r=0.7436,P=0.0036）。CHI中各组CD4+T细胞亚型,两两之间比较,均无显着性差异。对于CD8+T细胞亚型,与HD组相比,IC和RA组CD8+Tn频率降低（P<0.05）,IT和IA组CD8+Tn频率无明显变化;各组CD8+Tcm频率无明显变化;IT组CD8+Tem频率降低（P<0.05）,其他三组CD8+Tem频率无明显变化;IC组CD8+Te频率显着增高（P<0.05）,其他三组CD8+Te频率无明显变化。相较于高HBV DNA载量组（IT）,低HBV DNA载量组（IC）CD8+Tn频率降低,CD8+Te频率增高（P<0.05）。IT组CD4+T细胞PD-1表达量最高,其次是RA组（P<0.05）;IA组CD8+T细胞PD-1表达量最高,其次是IC组（P<0.05）。结论:不同临床阶段CHI患者外周血T细胞亚型有显着性差异,低病毒载量的IC组CD8+Te细胞频率显着增高,提示疾病的良好预后转归。CHI中CD8+T细胞表面PD-1的表达量增加,提示机体两种不同的免疫状态,预测疾病不同的免疫转归。Treg频率与机体ALT水平呈正相关,提示可用于预测肝炎疾病的严重程度。临床诊断指标联合CHI患者T细胞亚型频率变化及免疫抑制功能检测,对慢性HBV感染疾病的分期诊断和治疗以及预测预后转归具有重要参考意义。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 模型构建与标本收集 |
| 1.4 检测指标及方法 |
| 1.4.1 肝组织病理学检测 |
| 1.4.2 大鼠外周血T细胞亚群和p DC分析 |
| 1.4.3 移植肝和脾脏T细胞亚群和p DC分析 |
| 1.4.4 p DC与CD4+CD45RClowTreg相关性分析 |
| 1.4.5 移植肝和脾脏CD4、CD45RC、CD103表达情况 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠移植肝组织病理学检查结果 |
| 2.2 各组大鼠外周血T细胞亚群表达情况 |
| 2.3 各组大鼠外周血、移植肝、脾脏CD4+CD45RClow Treg和CD8+CD45RClowTreg表达情况 |
| 2.4 各组大鼠外周血、移植肝、脾脏p DC的表达及其与CD4+CD45RClowTreg的相关性分析 |
| 2.5 大鼠移植肝和脾脏CD4、CD45RC、CD103的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 武汉生物制品研究所博士学位论文创新点概述 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1. 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 2. 第一章60周岁及以上老年人群免疫QIVs前后外周全血Total mRNA表达谱研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3. 第二章60周岁及以上老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4. 第三章 老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5. 全文创新性总结 |
| 6. 文献综述--老年人群流感病毒疫苗有效性评价所面临的挑战 |
| 6.1 影响流感病毒疫苗有效性评价的混杂因素 |
| 6.2 流感病毒免疫史对流感病毒疫苗有效性评价的影响 |
| 6.3 流行病学研究提升针对老年人群开发下一代流感病毒疫苗 |
| 6.4 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录a. 受试者入选、排除标准及提前终止实验标准 |
| 附录b. 实验组和对照组QIVs疫苗株 |
| 附录c. 63 份老年人外周全血转录组测序原始数据Raw-Data存储于GEO公共数据库 |
| 附录d. Supplementary Materials (Figure S and Table S) |
| Figure S |
| Table S |
| References |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性HBV感染的自然史 |
| 1.2 慢性HBV感染的免疫应答 |
| 1.2.1 慢性HBV感染中固有免疫反应 |
| 1.2.2 慢性HBV感染中适应性免疫反应 |
| 1.3 慢性乙型肝炎免疫治疗进展 |
| 1.3.1 靶向固有免疫的治疗策略 |
| 1.3.2 靶向适应性免疫的治疗策略 |
| 1.3.3 其它免疫治疗策略 |
| 1.4 免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB研究现状 |
| 1.4.1 OX40/OX40L相关研究进展 |
| 1.4.2 PD-1 相关研究进展 |
| 1.4.3 4-1BB相关研究进展 |
| 第2章 OX40/OX40L及其可溶性分子在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人的样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血采集及血浆分离与保存 |
| 2.2.2 外周血单个核细胞提取 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.4 免疫组化检测肝组织内OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆中sOX40/OX40L水平 |
| 2.2.6 统计处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 2.3.2 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的表达 |
| 2.3.3 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的水平与临床的相关性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 PD-1、4-1BB分子及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 人的样本来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 复苏外周血单个核细胞和准备血浆 |
| 3.2.2 磁珠分选人外周血T细胞亚群 |
| 3.2.3 PBMCs中总RNA的提取 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测PBMCs中PD-1和4-1BB mRNA水平 |
| 3.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆sPD-1和s4-1BB |
| 3.2.6 免疫组化检测肝脏内PD-1和4-1BB的表达 |
| 3.2.7 统计处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 3.3.2 慢性乙肝患者中PD-1及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.3.3 慢性乙肝患者中4-1BB及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建及在HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响的相关研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和r AAV8/1.3HBV病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 建立经尾静脉注射腺相关病毒的HBV模型 |
| 4.2.2 检测小鼠血清内HBsAg、HBe Ag水平 |
| 4.2.3 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝脏组织全基因组DNA提取 |
| 4.2.5 qRT-PCR法检测小鼠HBV DNA定量 |
| 4.2.6 流式细胞术检测小鼠肝内T细胞亚群比例 |
| 4.2.7 CBA法检测小鼠血清内细胞因子 |
| 4.2.8 检测小鼠血清ALT,AST水平 |
| 4.2.9 处理小鼠肝脏组织和制备切片 |
| 4.2.10 小鼠肝脏组织HE染色 |
| 4.2.11 免疫组化检测小鼠肝组织内HBsAg和HBcAg |
| 4.2.12 数据统计处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 rAAV8/1.3 HBV小鼠模型的构建 |
| 4.3.2 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制同时伴随着肝脏炎症的产生 |
| 4.3.3 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制的同时伴随着T细胞亚群比例及免疫细胞因子的变化 |
| 4.3.4 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制具有药物剂量依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制相关机制的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠体内CD4~+和CD8~+T细胞的剔除 |
| 5.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血的T细胞 |
| 5.2.3 小鼠血清HBsAg和肝脏组织内HBV DNA的检测 |
| 5.2.4 小鼠血清ALT水平检测 |
| 5.2.5 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 5.2.6 小鼠肝脏内淋巴细胞mRNA的提取及文库构建测序 |
| 5.2.7 数据统计处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CD4~+T和CD8~+T 细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建 |
| 5.3.2 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程相对于CD4~+ T细胞似乎更依赖于CD8~+ T细胞的作用 |
| 5.3.3 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程中基于mRNA测序的小鼠肝内浸润淋巴细胞的转录组学研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 低剂量地西他滨通过调节Treg细胞恢复ITP的免疫耐受的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 一、附图 |
| 二、附表 |
| 三、附加图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低剂量地西他滨在ITP中通过调节PD-1甲基化降低CTLs诱导的血小板凋亡 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 英文论着Ⅰ |
| 英文论着Ⅱ |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文及参与学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌概况及其免疫治疗进展 |
| 1.1.1 肝癌概况 |
| 1.1.2 肝脏的免疫系统和HCC诱导的免疫耐受导致了疾病的进展 |
| 1.1.3 肝癌的免疫治疗 |
| 1.2 IL-28B的研究进展 |
| 1.2.1 IL-28B结构 |
| 1.2.2 IL-28B单核酸多态性 |
| 1.2.3 IL-28B信号转导 |
| 1.2.4 IL-28B及IL-28Rα表达 |
| 1.2.5 IL-28B抗感染作用 |
| 1.2.6 IL-28B免疫调节作用 |
| 1.2.7 IL-28B对Treg细胞的调节作用 |
| 1.2.8 IL-28B对肿瘤生长的影响及机制 |
| 1.3 Treg细胞的研究进展 |
| 1.3.1 Treg细胞的发育 |
| 1.3.2 Treg细胞的抑制机制 |
| 1.3.3 Treg细胞成为肿瘤免疫治疗的潜在靶点 |
| 1.3.4 Treg细胞对TME的影响 |
| 1.3.5 TME中Treg细胞富集的机制 |
| 1.3.6 Treg细胞抑制肿瘤免疫的机制 |
| 1.4 本课题立项依据 |
| 1.5 技术路线图 |
| 第二章 重组腺病毒rAd-mIL-28B的制备及体外抑制肿瘤细胞生长的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 验证重组腺病毒rAd-mIL-28B |
| 2.3.2 TCID50法检测腺病毒滴度 |
| 2.3.3 IL-28B体外对TC-1细胞生长的作用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 rAd-mIL-28B抗肝癌效应及免疫机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤体积的影响 |
| 3.3.2 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠瘤重的影响 |
| 3.3.3 肝癌组织HE染色后细胞形态改变 |
| 3.3.4 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏、肺脏、肝脏及胸腺重量的影响 |
| 3.3.5 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏、肺脏、肝脏及胸腺脏器指数的影响 |
| 3.3.6 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏T细胞亚群的影响 |
| 3.3.7 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 3.3.8 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏PD-1~+T细胞的影响 |
| 3.3.9 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织T细胞亚群的影响 |
| 3.3.10 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 3.3.11 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织PD-1~+T细胞的影响 |
| 3.3.12 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 3.3.13 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞因子的影响 |
| 3.3.14 rAd-mIL-28B在H22荷瘤小鼠血清和肿瘤组织中细胞因子的差异表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 IL-28B对调节性T细胞分化的体外研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料和仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 体外脾脏Treg细胞不同时间CD4、CD25和Foxp3分子表达情况 |
| 4.3.2 IL-28B体外抑制i Treg细胞生成的研究 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 rAd-mIL-28B联合生物碱对肝癌抑制作用实验研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料和仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤体积变化的影响 |
| 5.3.2 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤重量变化的影响 |
| 5.3.3 HE染色观察肝癌组织细胞形态 |
| 5.3.4 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏T细胞亚群的影响 |
| 5.3.5 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 5.3.6 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏PD1~+T细胞的影响 |
| 5.3.7 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织T细胞亚群的影响 |
| 5.3.8 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 5.3.9 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织PD-1~+T细胞的影响 |
| 5.3.10 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 自闭症中T细胞及相关细胞因子的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 肺癌概述 |
| 1.1.2 肺癌的免疫学研究进展 |
| 第2章 巨噬细胞亚群在肺癌中的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器与试剂 |
| 2.2.3 外周循环血液单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 2.2.4 肺泡灌洗液单个核细胞(BALFMC)的分离 |
| 2.2.5 细胞计数 |
| 2.2.6 巨噬细胞/单核细胞表型测定 |
| 2.2.7 巨噬细胞/单核细胞功能测定 |
| 2.2.8 微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)检测IL-10水平 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 SCLC患者、NSCLC患者及对照组的一般信息和临床特征 |
| 2.3.2 SCLC患者、NSCLC患者和对照组BALF中巨噬细胞的变化 |
| 2.3.3 SCLC患者、NSCLC患者和对照组外周循环血液中单核细胞的变化 |
| 2.3.4 SCLC患者、NSCLC患者和对照组BALF中 M1、M2样巨噬细胞的变化 |
| 2.3.5 SCLC患者、NSCLC患者和对照组外周循环血液中M1、M2样单核细胞的变化 |
| 2.3.6 CBA法检测BALF中及PBMC中 IL-10 的水平 |
| 2.3.7 SCLC肿瘤分期与巨噬细胞亚群及IL-10 相关性分析 |
| 2.3.8 SCLC生存时间与巨噬细胞亚群及IL-10 相关性分析 |
| 2.3.9 完整随访SCLC患者和NSCLC患者的一般信息和临床特征 |
| 2.3.10 化疗后SCLC、NSCLC患者外周循环血液M2 样单核细胞及IL-10水平的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 调节性T细胞在肺癌中的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象与样本采集 |
| 3.2.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2.3 外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 3.2.4 肺泡灌洗液单个核细胞(BALFMC)的分离 |
| 3.2.5 细胞计数 |
| 3.2.6 流式细胞术检测Treg细胞 |
| 3.2.7 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 SCLC患者、NSCLC患者及对照组的一般信息和临床特征 |
| 3.3.2 SCLC 患者、NSCLC 患者和对照组 BALF 中 Treg 的变化 |
| 3.3.3 SCLC 患者、NSCLC 患者和对照组 PBMC 中 Treg 的变化 |
| 3.3.4 SCLC肿瘤分期、生存时间与BALFMC中 Treg细胞频数的相关性分析 |
| 3.3.5 SCLC肿瘤分期、生存时间与PBMC中 Treg细胞频数的相关性分析 |
| 3.3.6 SCLC患者BALF中 IL-10~+CD206~+CD14~+M2 样巨噬细胞与Treg细胞及IL-10 的相关性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 PD-1~+T细胞亚群在肺癌中的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器与试剂 |
| 4.2.3 外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 4.2.4 肺泡灌洗液单个核细胞(BALFMC)的分离 |
| 4.2.5 细胞计数 |
| 4.2.6 流式细胞术检测PD-1~+T细胞亚群 |
| 4.2.7 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 受试者的一般信息和临床特征 |
| 4.3.2 SCLC患者、NSCLC患者、肺炎患者和对照组循环PD-1~+T细胞亚群的变化 |
| 4.3.3 SCLC患者、NSCLC患者、肺炎患者BALF中 PD-1~+T细胞亚群的变化 |
| 4.3.4 SCLC肿瘤分期与PD-1~+T细胞亚群频数的相关性分析 |
| 4.3.5 化疗前后SCLC患者一般信息和临床特征 |
| 4.3.6 化疗后SCLC患者外周血PD-1~+T细胞亚群变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 全文结论 |
| 第6章 主要创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 正常、子痫前期和妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群及其免疫检查点分子的表达及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象与标本收集 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 2 主要试剂与仪器 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 3 实验方法与步骤 |
| 4 统计性分析 |
| 结果 |
| 1 正常产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群百分比 |
| 2 正常产妇外周血、宫腔血和脐血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 3 正常产妇外周血、宫腔血和脐血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 4 子痫前期产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群百分比 |
| 5 子痫前期产妇外周血、宫腔血和脐血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 6 子痫前期产妇外周血、宫腔血和脐血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 7 妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血T细胞亚群百分比 |
| 8 妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 9 妊娠期糖尿病产妇外周血、宫腔血和脐血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和 CTLA-4 的表达水平 |
| 讨论 |
| 第二部分 正常妊娠、原因不明复发性流产和妊娠期糖尿病妇女外周血T细胞亚群及其免疫检查点分子的表达及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象与标本收集 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本收集 |
| 2 主要试剂与仪器 |
| 3 实验方法与步骤 |
| 4 统计性分析 |
| 结果 |
| 1 正常妊娠妇女外周血T细胞亚群百分比 |
| 2 正常妊娠妇女外周血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 3 正常妊娠妇女外周血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4的表达水平 |
| 4 原因不明复发性流产妇女外周血T细胞亚群百分比 |
| 5 原因不明复发性流产妇女外周血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 6 原因不明复发性流产妇女外周血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 7 妊娠期糖尿病妇女外周血T细胞亚群百分比 |
| 8 妊娠期糖尿病妇女外周血CD3~+T 细胞、CD4~+T 细胞和CD8~+T 细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 9 妊娠期糖尿病妇女外周血CD4~+Treg细胞和CD8~+Treg细胞上PD-1、GITR、HLA-G和CTLA-4 的表达水平 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表（附录） |
| 致谢 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 临床资料的收集及标本采集 |
| 1.2.3 试剂配制 |
| 1.2.4 分离外周血PBMC |
| 1.2.5 流式细胞术检测外周血CD4~+T细胞亚型 |
| 1.2.6 流式细胞术检测外周血CD8~+T细胞亚型 |
| 1.2.7 流式细胞术检测外周血CD4~+PD-1~+T和 CD8~+PD-1~+T细胞 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 研究对象一般临床特征 |
| 2.2 不同临床阶段CHI患者外周血T细胞亚群分析 |
| 2.3 不同临床阶段CHI患者外周血CD4~+T细胞亚型分析 |
| 2.4 不同临床阶段CHI患者外周血CD8~+T细胞亚型分析 |
| 2.5 CHI患者外周血CD4~+T细胞亚型与病毒载量的相关性分析 |
| 2.6 CHI患者外周血CD8~+T细胞亚型与病毒载量的相关性分析 |
| 2.7 不同临床阶段CHI患者外周血CD4~+PD-1~+T细胞分析 |
| 2.8 不同临床阶段CHI患者外周血CD8~+PD-1~+T细胞分析 |
| 3 全文讨论 |
| 4 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性HBV感染不同临床阶段患者外周血T细胞特征的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 慢性HBV感染疾病的临床分期 |
| 3 慢性HBV感染期间的T细胞免疫反应 |
| 3.1 慢性HBV感染患者外周血CD4~+T细胞反应 |
| 3.2 慢性HBV感染患者外周血CD8~+T细胞反应 |
| 4 慢性HBV感染患者外周血T细胞亚型特征 |
| 5 慢性HBV感染患者外周血T细胞耗竭 |
| 6 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
