高映雪[1]（2020）在《2016～2018年江西部分地区猪瘟抗体水平调查及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建》文中研究说明猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classic Swine Fever virus,CSFV）引起的高度接触性热性传染病,是影响养猪业的主要传染病之一,疫苗接种是该病的主要的防控手段,对猪群猪瘟抗体水平的监测反映猪群的免疫保护水平。本研究对2018～2018年江西省部分地区猪群的猪瘟抗体水平进行了血清学检测,旨在了解不同阶段猪群的猪瘟免疫保护水平。猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒的一种结构蛋白,是猪瘟病毒的主要保护性抗原,目前已有商品化猪瘟E2蛋白亚单位疫苗应用于猪瘟的免疫防控。本研究构建了表达猪瘟E2蛋白的重组猪痘病毒,成功表达猪瘟E2蛋白,为猪瘟亚单位疫苗的研发打下基础。1.江西省猪瘟抗体水平的调查利用IDEXX公司猪瘟抗体检测试剂盒对2016～2018年来自江西省部分地区猪场共计16424份猪血清进行了猪瘟抗体水平检测（其中种猪10238份、哺乳仔1107份、保育猪2745份、育肥猪2289份）。结果显示,2016～2018年的猪瘟抗体阳性率分别为82.53%、83.21%、82.88%;春、夏、秋、冬猪瘟抗体阳性率分别为83.19%、81.41%、83.53%和83.27%,不同季节之间抗体阳性率差异不明显;不同阶段猪群的猪瘟抗体阳性率差异较大:种猪阳性率为90.16%、哺乳仔猪阳性率为73.23%、保育猪阳性率为59.20%、育肥猪阳性率为82.96%,其中保育猪的猪瘟抗体水平最低,究其原因可能为哺乳仔猪阶段的母源抗体衰减,免疫程序的不合理或机体还没有足够的时间产生良好的免疫应答;南昌、九江、赣州、宜春、上饶、吉安、抚州、景德镇、萍乡、新余、鹰潭共11个地区的猪瘟抗体阳性率分别为86.23%、82.94%、87.55%、82.35%、79.23%、82.87%、82.49%、87.70%、75.29%、86.21%、79.42%,不同地区的猪瘟抗体阳性率差异不大。2.表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建以猪瘟病毒江西分离株CSFV-JXNC01-2015（NCBI登录号:KX064281.1）基因组为模板合成E2基因全长,设计引物扩增E2基因（3’端加标签蛋白6×his）,采用In-fusion Clone方法将E2基因连接到本实验室已构建的p SWE101转移载体上,构建重组质粒p SWE101-P28-E2-His。猪痘病毒江西分离株SWPV-JX20G为亲本病毒,TK基因为外源基因的插入位点,痘苗病毒启动子P28启动外源基因,经转染及5轮重组病毒纯化得到纯的重组猪痘病毒r SWPV-P28-E2-His,重组病毒大量增殖后进行SDS-PAGE电泳验证,结果表明重组病毒成功表达可溶性E2蛋白。
庄金秋,梅建国,张颖,王艳,李峰[2]（2018）在《ELISA方法在猪瘟抗原抗体检测上的应用》文中研究指明本文总结了猪瘟抗原检测,包括双抗体夹心ELISA、竞争ELISA、抗原捕获ELISA和NASBAELISA,以及猪瘟抗体检测方法,包括间接ELISA、竞争ELISA、液相阻断ELISA和斑点ELISA方面的研究进展。
胡国彬,雷玲玲,毛娉婷,肖欣戈,唐进波[3]（2015）在《诊断猪瘟常用的方法》文中提出猪瘟是一种流行广泛,发病率和死亡率均高的传染病,严重危害养猪业的健康发展。及时、准确地对猪瘟进行鉴别诊断显得尤为必要。本文主要从临床诊断、抗原及抗体检测的角度对常见的诊断方法,如病毒的分离与鉴定、猪体回归感染试验、家兔级别交互免疫试验、ELISA、FAT、IHA、中和试验、免疫酶测定技术或酶标记抗体诊断法做了简明的阐述,为猪瘟的诊断提供参考。
李娇,王金良,沈志强[4]（2013）在《猪瘟抗体的几种常用检测方法概述》文中提出近年来,我国猪瘟免疫失败常有发生,给养猪业带来较大的经济损失。猪瘟抗体检测能准确掌握猪群的猪瘟抗体水平,对猪瘟疫苗免疫效果评价、猪瘟免疫程序制定、猪瘟流行状态监测均具有重要意义。文章就猪瘟抗体中和试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫技术等常用检测方法的研究与应用现状及其优缺点进行全面论述,为各级兽医部门及养殖户寻找和建立适合自身的抗体检测方法提供参考。
方礼禄,王朝军,徐利,沈君,虞桂平,严彩虹,杨光[5]（2013）在《应用ELISA检测我国猪病的研究进展》文中研究指明ELISA技术具有操作简便、快速准确、易于标准化、特异性强、敏感性高、重复性好、经济实用等优点,已被广泛应用于畜牧业、临床医学、环境污染控制、食品安全监测、生物、化学等领域。文章综述了应用ELISA检测我国猪病的研究进展。
李娇,沈志强,祖立闯,王金良,谢金文[6]（2012）在《间接ELISA在猪瘟抗体检测上的应用》文中进行了进一步梳理间接ELISA以其灵敏、特异、简单、快速、稳定、高通量及易于操作等优点,在猪瘟免疫猪群抗体水平监测、猪瘟的快速诊断与流行病学调查中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就间接ELISA方法及其在猪瘟诊断上的应用概况做一综述,以期为我国猪瘟的综合防控提供参考。
郭小玲[7]（2012）在《河南省猪瘟、高致病性禽流感疫苗临床应用效果调查评估》文中研究指明猪瘟、高致病性禽流感等病是目前严重危害我国养殖业的主要疫病，是我国重点防控的动物疫病，被农业部列为实施强制免疫的重大动物疫病。当前，对该类动物疫病尚无有效的治疗方法，疫苗免疫是其主要防控手段。但疫苗免疫后的免疫保护效果并不都能达到100%，疫苗的免疫效果受到很多因素的影响，诸如疫苗本身的质量、疫苗的储存和运输条件、免疫程序、接种途径、接种对象的个体差异等。因此，及时开展免疫效果监测，评估其免疫保护效果，是重大动物疫病强制免疫工作的重要手段。河南省目前在全省范围内开展了猪瘟、高致病性禽流感强制免疫，为更好地了解2011-2012年度河南省猪瘟、高致病性禽流感的强制免疫保护效果及招标疫苗的临床应用效果，本课题做了以下调查研究：1、采用问卷调查、现场调查相结合的方法对河南省18个省辖市、63个县（市、区）、728个养殖场（户）开展了猪瘟疫苗使用效果流行病学调查，填写《猪瘟疫苗临床应用效果流行病学调查表》，并随机抽检血清样品进行抗体检测。共采集养殖场（户）数131个，采集样品2773份，其中规模场59个，血清样品2596份，散养户72户，血清样品177份。对采集来的血清样品分离血清，采用阻断ELISA试验检测抗体水平。对不同厂家生产的疫苗临床应用效果，不同饲养模式的养殖场、不同饲养阶段猪群猪瘟疫苗免疫抗体合格率进行差异性统计分析。结果表明：5个招标疫苗生产厂家生产的猪瘟疫苗免疫效果差异显着，其中A、B、C厂家（抗体合格率分别为78.16%、76.55%、75.38%）疫苗免疫效果明显好于D和E厂家（抗体合格率分别为70%、69.07%）；全省母猪、仔猪与育肥猪抗体合格率分别为83.81％、68.79％、75.93％，表明母猪的免疫抗体水平高于仔猪和育肥猪，差异显着（P<0.01）；规模场抗体合格率为76.23％（1979/2596），散养户抗体合格率为54.24％（96/177），平均抗体合格率为65.24％。总之，河南省规模场的猪瘟免疫抗体合格率虽然达到国家规定的标准，但全省整体免疫合格率并不高，加上毒株变异等因素，猪瘟的防控形势不容乐观。2、采用问卷调查、现场调查相结合的方法对河南省18个省辖市、104个县（市、区）、1132个养殖场（户）开展了高致病性禽流感疫苗使用效果流行病学调查，填写《禽流感疫苗临床应用效果流行病学调查表》，并随机抽检鸡、鸭、鹅等禽血清进行抗体检测。共采集养殖场（户）数588个，采集样品8549份，其中种禽场24个，血清样品702份，商品代禽场203个，血清样品6039份，散养户361户，血清样品1808份。对采集来的血清样品分离血清，采用血凝试验和血凝抑制试验检测抗体滴度。对不同厂家生产的疫苗临床应用效果，不同类别禽群、不同禽种高致病性禽流感疫苗免疫抗体合格率进行差异性统计分析。结果表明：招标的6个疫苗厂家生产的疫苗质量总体较好，平均合格率均在90％以上，其中B厂家疫苗免疫抗体合格率最高，为96.34％，但不同厂家疫苗免疫后抗体水平有差异，其中B、C、D厂家生产疫苗免疫抗体滴度多集中在8log2-10log2之间，E、F厂家抗体滴度相对较低，多集中在6log2-8log2之间。统计不同禽种免疫效果，鸡、鸭、鹅抗体合格率分别为93.23％、90.32％、86.48％，鸡的抗体水平比水禽高，差异显着（P<0.01）；统计不同类别禽群免疫效果，种禽场的抗体合格率最高，达98.15％（689/702）；商品代禽场抗体合格率达94.2％（5689/6039）；散养户抗体合格率较低，为86.51％（1528/1808）；三者差异显着（P<0.01）。高致病性禽流感疫苗临床应用效果表明河南省禽群整体抗体免疫合格率均在85％以上，抗体保护水平较高，国家强制免疫政策在河南省执行情况良好。
张平[8]（2010）在《猪瘟病毒（CSFV）Erns基因在毕赤酵母中的高效表达及其间接ELISA的初步建立》文中研究说明猪瘟（Swine Fever, SF）是猪瘟病毒（Classical Swime Fever Virus,CSFV）引起的一种猪的高度接触性烈性传染病,死亡率极高,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。大范围接种猪瘟弱毒疫苗能够控制猪瘟的大面积流行,但会加大区分野毒感染和接种疫苗猪的难度。表达猪瘟病毒保护性抗原Erns蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗（Marker vaccine）的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于检测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用。Erns蛋白能够区分标记疫苗和野毒感染产生的抗体,使用标记疫苗并提供配套的诊断方法即可更好地解决这一问题,本实验目的是采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达具有生物学活性的Erns蛋白,为建立大规模化筛查猪瘟特异性抗体的血清学ELISA诊断方法提供试验材料,也为E2蛋白标记疫苗的推广应用打下基础。本研究提取猪瘟弱毒疫苗总RNA,根据Genbank报道的编号为Z46258的序列设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到猪瘟病毒囊膜蛋白基因Erns,与pGM-T载体连接后测序,pGM-T-Erns序列测定结果在生物分析软件DNAstar上用MegAlign分析比较,结果表明,Erns基因编码序列与文献报道的序列同源性为99.0%,该基因全长768bp,编码227个氨基酸,其中有8个核苷酸与报道序列存在差异,2个氨基酸序列有差异,将Erns基因与真核表达载体pPIC9K连接,构建了pPIC9K-Erns分泌型酵母表达质粒,电转化毕赤酵母菌GS115,利用G418抗性筛选多拷贝重组菌株,并利用菌落PCR和MM板确定酵母甲醇利用型。水平摇瓶进行诱导表达,利用SDS-PAGE进行检测,在48kDa左右处有免疫印迹条带,再进行Western-Blotting,在48kDa左右处有特异性条带。结果证明Erns蛋白得到表达,而且能被特异性抗体所识别,具有生物学活性。使用阴离子交换层析柱对重组酵母分泌上清进行纯化,以纯化的Erns蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清Erns抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体诊断试剂盒奠定了新的基础。
熊丁杰[9]（2010）在《猪瘟抗体阻断ELISA检测方法的建立和对猪瘟活疫苗免疫效果的评价》文中提出本研究将含有编码猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的重组杆状病毒接种于SF9昆虫细胞中,经复壮和悬浮培养后收集细胞上清,过滤后用镍柱做亲和层析纯化E2蛋白,经SDS-PAGE鉴定,在约53Kda处有一特异表达的蛋白带,同猪瘟病毒E2蛋白的大小基本一致；Western-blot印迹表明,该蛋白带能与猪瘟阳性血清发生特异反应。将猪瘟单克隆抗体WH303株的杂交瘤细胞从液氮中取出复苏,培养增殖后接种于BALB/C小鼠腹腔,5天后收获含有单抗的腹水,并测定其效价。腹水处理后用ProteinG亲和层析纯化单克隆抗体,经SDS-PAGE鉴定后用过碘酸钠法进行标记,测定酶标抗体的浓度,并于-20°C冻存。以纯化的E2蛋白和制备的酶标单抗为基础,建立了猪瘟抗体阻断ELISA检测方法。通过对ELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件：E2蛋白的最佳包被浓度为0.09μg/ml,最适包被条件为4℃16h；最佳封闭液为PBST+10%脱脂奶粉+Proclin300+5%海藻糖,封闭条件为4°C 16h；最佳血清稀释液为PBST+5%奶粉,稀释倍数为2倍,血清孵育时间为37℃1h；酶标单抗的最佳工作浓度为0.37μg/ml,最佳酶标单抗稀释液为Peroxidase Conjugate Stabilizer,工作条件为25℃30min。采用优化好的ELISA反应条件,检测了猪瘟抗体血清盘,将OD值用ROC曲线法进行分析,得到本方法的阴阳血清判定值为：36%的抗体阻断率,检测灰区介于32%-40%的抗体阻断率之间。对建立的猪瘟抗体阻断ELISA法进行了性能评估,结果表明：本方法和常见的猪病毒抗体没有交叉反应；与IDEXX试剂盒相比较,其特异性和敏感性分别为：94.2%和98%；用本方法检测“欧盟实验室质控品”,结果同IDEXX猪瘟抗体试剂盒的检测结果一致；用免疫猪的血清评估本方法,显示本方法和IDEXX试剂盒的相关性高于0.8。根据本方法的检测结果,对猪瘟弱毒疫苗的免疫剂量和免疫保护期进行了研究。用1200RID、6000 RID和24000 RID三种不同剂量的猪瘟弱毒活疫苗免疫30日龄断奶仔猪,检测其抗体水平的变化,并用猪瘟强毒感染试验猪,观察抗体对猪的保护。结果表明：不同组试验猪的抗体水平没有显着差异,接种疫苗后的前3个月,免疫猪的抗体水平迅速升高,70后天抗体水平趋于稳定,12个月后的猪瘟抗体仍保持在很高的水平,且能完全抵御猪瘟石门强毒的攻击。
王异民[10]（2009）在《猪瘟病毒E2蛋白主要免疫显性抗原多肽原核表达及初步应用》文中研究说明猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV ）引起,主要侵袭家养的猪及野猪,引起高发病率、高死亡率的烈性传染病。近20年,世界各国的猪瘟流行形式和发病特点都发生了很大的变化。美国,加拿大,欧洲的几个国家先后消灭了猪瘟,但是野猪中还是存在有猪瘟病毒。我国猪瘟状况也不例外,普遍出现了长期持续存在多点散发性猪瘟,临床上表现为非典型、温和型、亚临床和无症状的隐性感染。定期实行的猪瘟免疫抗体水平监测是针对我国控制和消灭猪瘟的最有效的辅助方法。本研究就是表达猪瘟病毒E2基因蛋白的主要抗原区,来作为抗原检测猪瘟抗体。本研究根据GeneBank中公布的猪瘟病毒C-株的E2基因序列设计了一对特异性引物,构建E2基因的原核表达载体pGEX-6P-1-E2,转化到宿主菌BL21（plys）内经IPTG诱导表达得到目的蛋白,经过Western-blot方法检测表达的目的猪瘟E2蛋白具有良好的与抗体结合的反应原性。在此基础上进行了初步应用。采用Dot-ELISA的方法检测了某猪场的猪只猪瘟抗体,结果与所送检的结果一致。本实验的结果可以为今后进一步建立准确、特异、敏感、快速的猪瘟病毒诊断方法奠定基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪瘟的防控 |
| 1.1.1 猪瘟的流行 |
| 1.1.2 猪瘟的实验室诊断 |
| 1.1.2.1 兔体交互试验 |
| 1.1.2.2 动物回归试验 |
| 1.1.2.3 抗体检测 |
| 1.1.2.4 分子诊断 |
| 1.2 CSFV的研究进展 |
| 1.2.1 CSFV的基因组 |
| 1.2.2 CSFV的主要蛋白 |
| 1.2.2.1 Erns蛋白 |
| 1.2.2.2 E2蛋白 |
| 1.3 CSFV疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 1.3.2.1 亚单位疫苗 |
| 1.3.2.2 合成肽疫苗 |
| 1.3.2.3 核酸疫苗 |
| 1.3.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3.2.5 基因标记疫苗 |
| 1.4 SWPV载体研究进展 |
| 第二章 江西省猪瘟抗体水平调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂盒及主要仪器 |
| 2.1.2 猪血清样品的采集 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪瘟抗体检测方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 猪瘟抗体检测结果 |
| 2.3.2 不同年份猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.3 不同季节猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.4 不同阶段猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.5 不同地区猪瘟抗体结果分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 CSFVE2蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、毒株和细胞 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 P28启动子序列 |
| 3.2.2 引物设计与合成 |
| 3.2.3 P28-E2-His基因的PCR扩增 |
| 3.2.4 PCR产物胶回收 |
| 3.2.5 转移载体p SWE101-P28-E2-His的构建 |
| 3.2.5.1 pSWE101质粒的提取 |
| 3.2.5.2 pSWE101质粒的单酶切 |
| 3.2.5.3 p SWE101与P28-E2-his的连接及转化 |
| 3.2.5.4 阳性克隆筛选及双酶切验证 |
| 3.2.5.5 质粒的构建流程及测序 |
| 3.2.5.6 重组质粒的提取及浓度测定 |
| 3.2.6 转染 |
| 3.2.6.1 细胞准备 |
| 3.2.6.2 细胞接毒 |
| 3.2.6.3 转染 |
| 3.2.7 重组病毒的纯化与增殖 |
| 3.2.7.1 重组病毒感染及蚀斑挑取 |
| 3.2.7.2 病毒增殖 |
| 3.2.8 重组病毒r SWPV-P28-E2-His的 PCR鉴定 |
| 3.2.9 重组病毒的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.2.9.1 样品处理 |
| 3.2.9.2 制胶及电泳 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 P28-E2-His基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组菌菌落PCR结果 |
| 3.3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3.4 转染结果 |
| 3.3.5 重组病毒的纯化与增殖 |
| 3.3.6 重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.3.7 P28-E2-His蛋白的表达方式鉴定 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 1 猪瘟抗原检测 |
| 1.1 双抗体夹心ELISA |
| 1.2 竞争ELISA |
| 1.3 抗原捕获ELISA (AC-ELISA) |
| 1.4 依赖核酸序列的扩增技术 (Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) |
| 2 猪瘟抗体检测 |
| 2.1 间接ELISA |
| 2.1.1 基于CSFV全病毒的猪瘟抗体间接ELISA |
| 2.1.2 基于E2蛋白的猪瘟抗体间接ELISA |
| 2.1.3 基于E0蛋白的猪瘟抗体间接ELISA |
| 2.1.4 基于NS3蛋白的猪瘟抗体间接ELISA |
| 2.2 竞争ELISA |
| 2.3 液相阻断ELISA |
| 2.4 斑点ELISA (Dot-ELISA) |
| 3 讨论 |
| 1 临床诊断 |
| 2 抗原检测方法 |
| 2.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.2 猪体回归感染试验 |
| 2.3 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 3 抗体检测方法 |
| 3.1 间接血凝试验 (IHA) |
| 3.2 免疫酶测定技术或酶标记抗体诊断法 |
| 4 展望 |
| 1 间接血凝试验 (IHA) |
| 2 中和试验 |
| 3 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 3.1 间接ELISA |
| 3.2 阻断 (竞争) ELISA |
| 3.3 斑点ELISA (Dot-ELISA) |
| 4 胶体金技术 |
| 4.1 斑点免疫金渗滤法 (DIGFA) |
| 4.2 胶体金免疫层析法 (GICA) |
| 5 结语 |
| 1 ELISA的原理 |
| 2 ELISA技术在猪病检测中的应用 |
| 2.1 猪病毒性传染病的诊断 |
| 2.1.1 猪繁殖与呼吸障碍综合征 |
| 2.1.2 猪伪狂犬病毒 |
| 2.1.3 猪瘟 |
| 2.1.4 猪戊型肝炎病毒 |
| 2.1.5 口蹄疫病毒 |
| 2.1.6 猪日本乙型脑炎病毒 |
| 2.1.7 其他 |
| 2.2 猪细菌性传染病的诊断 |
| 2.2.1 猪链球菌 |
| 2.2.2 副猪嗜血杆菌 |
| 2.2.3 猪源支气管败血波氏杆菌 |
| 2.2.4 猪胸膜肺炎放线杆菌 |
| 2.2.5 猪水肿毒素 |
| 2.2.5 猪附红细胞体 |
| 2.3 猪支原体性传染病的诊断 |
| 2.4 猪衣原体性传染病的诊断 |
| 2.5 猪寄生虫疾病的诊断 |
| 3 小结 |
| 1 间接ELISA的基本原理与特点 |
| 2 间接ELISA在猪瘟抗体检测中的应用 |
| 2.1 基于E2蛋白的猪瘟抗体间接ELISA检测方法 |
| 2.2 基于E0蛋白的猪瘟抗体间接ELISA检测方法 |
| 2.3 基于NS3蛋白的猪瘟抗体间接ELISA检测方法 |
| 3 结语 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 猪瘟 |
| 1.1 猪瘟概述 |
| 1.2 猪瘟病毒 |
| 1.2.1 猪瘟病毒的形态和结构 |
| 1.2.2 猪瘟病毒的基因组结构及功能 |
| 1.3 猪瘟的预防 |
| 1.3.1 加强和完善重大动物疫病监测预警体系，重视免疫监测 |
| 1.3.2 净化种猪群 |
| 1.3.3 坚持自繁自养、全进全出 |
| 1.3.4 加强饲养管理，搞好卫生和消毒工作 |
| 1.3.5 重视生物安全，做到生态养殖 |
| 1.3.6 疫苗免疫 |
| 1.4 猪瘟疫苗 |
| 1.4.1 传统猪瘟疫苗 |
| 1.4.2 新型猪瘟疫苗 |
| 1.5 国内、外猪瘟检测方法研究进展 |
| 1.5.1 病原学检测 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子生物学检测技术 |
| 1.5.4 基因芯片检测技术 |
| 2 禽流感 |
| 2.1 禽流感概念、分类及危害 |
| 2.1.1 禽流感概念及分类 |
| 2.1.2 禽流感的危害 |
| 2.2 禽流感病毒 |
| 2.2.1 病毒粒子特征 |
| 2.2.2 禽流感病毒的致病机理 |
| 2.3 禽流感的预防 |
| 2.3.1 严格的生物安全措施 |
| 2.3.2 药物治疗 |
| 2.3.3 疫苗免疫 |
| 2.4 禽流感疫苗 |
| 2.4.1 全病毒灭活疫苗 |
| 2.4.2 重组活载体疫苗 |
| 2.4.3 亚单位疫苗 |
| 2.4.4 核酸疫苗 |
| 2.5 国内、外禽流感检测技术研究现状 |
| 2.5.1 病毒的分离培养 |
| 2.5.2 血清学检测 |
| 2.5.3 分子生物学技术检测 |
| 2.5.4 基因芯片技术 |
| 2.5.5 禽流感快速检测器 |
| 3 目的意义 |
| 第一章 河南省猪瘟、高致病性禽流感疫苗强制免疫执行情况 |
| 1 强制免疫疫苗 |
| 1.1 疫苗的选择 |
| 1.2 疫苗的采购、运输与保存 |
| 2 免疫保证措施 |
| 2.1 规范免疫操作 |
| 2.2 建立免疫档案 |
| 2.3 落实防疫责任 |
| 3 免疫程序 |
| 3.1 免疫程序的制定依据 |
| 3.2 免疫程序 |
| 3.2.1 猪瘟免疫程序 |
| 3.2.2 高致病性禽流感免疫程序 |
| 第二章 猪瘟脾淋苗临床应用效果调查评估 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 疫苗临床应用调查 |
| 1.1.1 调查范围 |
| 1.1.2 调查方法 |
| 1.2 实验室抗体检测 |
| 1.2.1 样品来源 |
| 1.2.2 采样比例和时间 |
| 1.2.3 样品处理 |
| 1.2.4 检测试剂及仪器 |
| 1.2.5 抗体检测方法 |
| 1.2.6 判定标准 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 疫苗临床应用调查结果 |
| 2.1.1 养殖场基本情况 |
| 2.1.2 疫苗临床应用安全性调查 |
| 2.1.3 养殖场（户）使用效果满意度调查 |
| 2.2 实验室检测结果 |
| 2.2.1 抗体水平分布 |
| 2.2.2 抗体合格率 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 高致病性禽流感疫苗临床应用效果调查评估 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 疫苗临床应用调查 |
| 1.1.1 调查范围 |
| 1.1.2 调查方法 |
| 1.2 实验室检测 |
| 1.2.1 样品来源 |
| 1.2.2 采样比例和时间 |
| 1.2.3 样品处理 |
| 1.2.4 主要试剂及配制 |
| 1.2.5 主要仪器设备 |
| 1.2.6 检测方法 |
| 1.2.7 判定标准 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 疫苗临床应用调查结果 |
| 2.1.1 疫苗临床应用安全性调查 |
| 2.1.2 养殖场（户）使用效果满意度调查 |
| 2.2 实验室检测结果 |
| 2.2.1 抗体滴度分布 |
| 2.2.2 抗体合格率 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 发表论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 猪瘟的病原学研究 |
| 1.1.1 CSFV 病毒粒子的形态结构及理化特征 |
| 1.1.2 CSFV 的抗原性、毒力和分型 |
| 1.1.3 CSFV 的致病机理 |
| 1.1.4 CSFV 的侵入与复制 |
| 1.2 猪瘟的流行病学 |
| 1.2.1 CSFV 的传播方式 |
| 1.2.2 CSF 的流行情况 |
| 1.3 CSF 的病理变化 |
| 1.4 CSFV 主要基因与功能的研究 |
| 1.4.1 猪瘟病毒的基因组结构 |
| 1.4.2 C 蛋白 |
| 1.4.3 E~(rns) 蛋白 |
| 1.4.4 E1 蛋白 |
| 1.4.5 E2 蛋白 |
| 1.4.6 CSFV 非结构蛋白 |
| 1.5 猪瘟实验室诊断研究进展 |
| 1.5.1 病毒抗原检测 |
| 1.5.2 动物试验 |
| 1.5.3 血清学诊断方法 |
| 1.5.4 分子生物学方法 |
| 1.6 猪瘟疫苗研究进展 |
| 1.6.1 传统疫苗 |
| 1.6.2 新型疫苗 |
| 1.7 猪瘟防制研究进展 |
| 1.8 毕氏酵母表达系统在动物传染病防治中的应用 |
| 1.8.1 巴斯德毕氏酵母表达体系的特点 |
| 1.8.2 巴斯德毕氏酵母表达体系在动物传染病中的应用 |
| 1.8.3 甲醇酵母系统应用前景 |
| 1.9 本课题的研究目的与意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 细菌、质粒载体与血清 |
| 2.2 试验所需主要试剂 |
| 2.3 主要仪器与耗材 |
| 2.4 试验所需培养基与主要溶液配制 |
| 2.4.1 培养基的配置 |
| 2.4.2 RNA 提取所用溶液 |
| 2.4.3 质粒提取溶液的配置 |
| 2.4.4 发酵产物处理溶液的配置 |
| 2.4.5 琼脂糖凝胶电泳所用溶液 |
| 2.4.6 SDS-PAGE 蛋白电泳所用缓冲液 |
| 2.4.7 Western-Blotting 所用溶液 |
| 2.4.8 蛋白纯化所需溶液的配制 |
| 2.4.9 间接ELISA 所用溶液的配制 |
| 3 方法 |
| 3.1 猪瘟病毒基因E~(rns) 的克隆 |
| 3.1.1 引物设计与合成 |
| 3.1.2 猪瘟病毒总RNA 提取 |
| 3.1.3 猪瘟E~(rns) 片段cDNA 的扩增 |
| 3.1.4 PCR 扩增猪瘟E~(rns) 片段 |
| 3.1.5 PCR 产物凝胶回收纯化 |
| 3.2 克隆载体的构建与鉴定 |
| 3.2.1 目的片段E~(rns)与pGM-T 载体的连接 |
| 3.2.2 感受态细胞E.coli DH5α的制备 |
| 3.2.3 连接产物转化感受态细胞D5Hα |
| 3.2.4 阳性质粒提取鉴定 |
| 3.2.5 酶切鉴定 |
| 3.3 表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3.1 酶切回收目的片段E~(rns) |
| 3.3.2 酶切回收表达载体pPIC9K |
| 3.3.3 目的片段E~(rns) 与表达载体pPIC9K 的连接 |
| 3.3.4 连接产物转化 |
| 3.3.5 阳性表达载体的鉴定 |
| 3.3.6 目的片端插入方向的鉴定 |
| 3.4 重组酵母的构建与筛选 |
| 3.4.1 重组酵母载体pPIC9K-E~(rns) 的线性化 |
| 3.4.2 酵母感受态G5115 的制备 |
| 3.4.3 酵母细胞的电转化 |
| 3.4.4 重组酵母G5115 的G418 筛选 |
| 3.4.5 重组酵母G5115 的菌落PCR 筛选 |
| 3.4.6 利用MM 板筛选酵母甲醇利用型Mut~+与Mut~s |
| 3.4.7 酵母中目的基因序列的鉴定 |
| 3.5 重组酵母的发酵 |
| 3.6 表达产物的SDS-PAGE 和Western-Blotting |
| 3.6.1 重组酵母表达上清处理 |
| 3.6.2 重组酵母表达菌体的处理 |
| 3.6.3 表达产物的SDS-PAGE 及含量分析 |
| 3.6.4 表达产物的Western-Blotting |
| 3.7 重组蛋白E~(rns) 的纯化及SDS-PAGE 纯度鉴定 |
| 3.7.1 蛋白的大量表达 |
| 3.7.2 重组蛋白纯化预处理 |
| 3.7.3 E~(rns) 蛋白纯化 |
| 3.7.4 纯化后的E~(rns) 蛋白进行SDS-PAGE 纯度鉴定 |
| 3.7.5 纯化E~(rns) 蛋白浓度的测定 |
| 3.8 间接ELISA 方法的建立 |
| 3.8.1 抗原包被浓度、抗体稀释倍数的确定 |
| 3.8.2 临界值的确定 |
| 3.8.3 特异性阻断试验 |
| 3.8.4 交叉反应试验 |
| 3.8.5 重复性试验 |
| 3.8.6 灵敏度试验 |
| 3.8.7 抗原包被板保存期的测定 |
| 3.8.8 E~(rns)-ELISA 与CSFV Blocking-ELISA 试剂盒的符合率试验 |
| 3.8.9 抗原包被板保存期的测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 猪瘟病毒E~(rns) 基因的克隆 |
| 4.2 E~(rns) 基因的T 克隆 |
| 4.3 序列结果分析 |
| 4.4 E~(rns) 基因密码子偏爱性分析 |
| 4.5 E~(rns) 基因重组真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 4.6 pPIC9K-E~(rns) 整合到酵母基因组的方向鉴定 |
| 4.7 重组酵母的构建与筛选 |
| 4.8 菌落PCR 的鉴定 |
| 4.9 酵母中目的基因的鉴定 |
| 4.10 表达产物E~(rns) 蛋白的SDS-PAGE 分析 |
| 4.11 表达产物的免疫印迹Western-Blotting 分析 |
| 4.12 E~(rns) 蛋白纯化纯度结果 |
| 4.13 纯化后E~(rns) 蛋白浓度 |
| 4.14 E~(rns) 蛋白纯化收集图谱 |
| 4.15 ELISA 最佳工作条件的确定 |
| 4.15.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 4.15.2 重组E~(rns) 蛋白抗原的包被条件的确定 |
| 4.15.3 酶标抗体工作浓度的确定 |
| 4.15.4 血清和酶标二抗反应时间的确定 |
| 4.15.5 间接 ELISA 方法阴阳性临界值的确定 |
| 4.15.6 ELISA 特异性阻断试验 |
| 4.15.7 ELISA 交叉反应试验 |
| 4.15.8 间接ELISA 的重复性 |
| 4.15.9 符合性试验 |
| 4.15.10 保存性试验 |
| 5 讨论 |
| 5.1 猪瘟病毒E~(rns) 基因的克隆与表达 |
| 5.1.1 E~(rns) 蛋白 |
| 5.1.2 毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K |
| 5.1.3 基因整合方式和筛选方式 |
| 5.2 毕赤酵母真核表达系统 |
| 5.3 猪瘟E~(rns) 蛋白在毕氏酵母中的表达 |
| 5.4 蛋白的表达形式 |
| 5.5 Western-Blotting 分析 |
| 5.6 E~(rns) 蛋白的纯化 |
| 5.7 E~(rns)-ELISA 的建立和优化 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1、猪瘟病毒的概述 |
| 2、猪瘟病毒的流行和分布 |
| 3、猪瘟病毒的病原学概述 |
| 3.1 猪瘟的经典病原学 |
| 3.2 猪瘟的分子病原学 |
| 4、单克隆抗体在猪瘟抗体诊断中的应用价值 |
| 5、猪瘟抗体检测技术的研究进展 |
| 5.1 动物和病毒的体内试验 |
| 5.2 猪瘟抗体细胞中和试验 |
| 5.3 猪瘟正相间接血凝试验(IHA) |
| 5.4 猪瘟抗体免疫金标快速检测试验 |
| 5.5 猪瘟抗体的ELISA检测方法 |
| 第二章 研究的目的意义、内容和技术路线 |
| 1 本研究的意义和目的 |
| 2 研究内容和技术路线 |
| 2.1 研究内容 |
| 2.2 技术路线 |
| 第三章 猪瘟抗体阻断ELISA方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 杂交瘤细胞株和重组杆状病毒 |
| 1.2 猪的血清 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 主要试剂和耗材 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪瘟E2蛋白的获得 |
| 2.2 标记HRP的单克隆抗体制备 |
| 2.3 猪瘟抗体阻断ELISA方法的建立 |
| 2.4 猪瘟抗体阻断ELISA的性能评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪瘟E2蛋白的获得 |
| 3.2 标记HRP的单克隆抗体制备 |
| 3.3 猪瘟抗体阻断ELISA方法的建立 |
| 3.4 猪瘟抗体阻断ELISA的性能评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪瘟E2蛋白的获得 |
| 4.2 酶标单克隆抗体的制备 |
| 4.3 猪瘟抗体阻断ELISA方法的建立 |
| 5 小结 |
| 第四章 不同剂量的猪瘟细胞活疫苗单次免疫的效果监测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 人工感染 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 样品检测 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫猪抗体水平的检测 |
| 2.2 免疫猪体内猪瘟疫苗毒的带毒检测 |
| 2.3 免疫猪人工感染的试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论与创新 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 猪瘟病毒的研究进展 |
| 1 CSFV 的分类、地位、形态结构 |
| 2. CSFV 的基因结构 |
| 3. CSFV 的流行病学 |
| 4. 临床症状 |
| 5. 致病机理 |
| 6. 病理变化 |
| 第2章 猪瘟病毒诊断概述 |
| 1. 抗原检测 |
| 2. CSFV 抗体的检测 |
| 3. 预防与控制 |
| 第二篇 实验内容 |
| 第1章 猪瘟病毒E2 基因重组和E2 基因优势抗原表位分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 猪瘟病毒 E2 基因在 E.coli BL-21 中的表达与活 性的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 猪瘟病毒E2 蛋白主要免疫显性抗原多肽的初步应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
