崔英丽[1]（2021）在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究》文中研究说明癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年全球癌症确诊患者1930万例,1000万人因癌症死亡。其中卵巢癌发病率和死亡率均居女性癌症发病率和死亡率的第八位。卵巢位于盆腔深部,早期病变不易被发现,一经发现,多为晚期,目前针对卵巢癌的治疗以手术与化疗相结合的方式为主,但化疗副作用大,易产生耐药。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。当前随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的快速进步和不断发展,基因治疗已经逐渐发展成为一种新型治疗卵巢癌的治疗手段,其中新型溶瘤腺病毒已充分显示表现出了一种不可替代治疗优势,发挥了病毒治疗和基因治疗的双重重要作用及其功能,有望尽快使其发展成为一种治疗卵巢癌的有效治疗手段。Apoptin是一种源自于鸡贫血病毒（CAV）的凋亡诱导蛋白,在正常细胞中没有细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡。人端粒酶逆转录酶（h TERT）的长度和生存能力与细胞衰老和永生化有关。由于端粒酶逆转录酶（h TERT）基因的限速和催化成分的紧密转录抑制作用,大多数正常人体细胞缺乏端粒酶活性。然而,在高达90%的人类恶性肿瘤中观察到h TERT表达和端粒酶激活,使其具有无限的增殖能力。本课题组前期已构建了含有凋亡素（apoptin）蛋白和h TERTp启动子的人五型腺病毒Ad-Apoptin-h TERTp-E1a（Ad-VT）,该病毒具有只在肿瘤细胞中复制并特异性杀伤多种肿瘤细胞的能力。本研究利用本课题组自行构建的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT以及其对照病毒Ad-T、Ad-VP3和Ad-MOCK进行了对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的体内外抑制作用研究。研究目的:通过体内外多种实验分析Ad-VT对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的抑制作用。研究方法:1.利用pGL4.51转染卵巢癌A2780和SKOV3细胞,并用G418加压筛选稳定表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并进行生物学特性分析检测。2.通过结晶紫染色和WST-1检测等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的杀伤作用。3.通过Hoechst染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法分析Ad-VT杀伤人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的主要方式。4.通过细胞划痕、Transwell小室侵袭等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞迁移和侵袭能力的影响。5.用人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞分别建立裸鼠荷瘤模型,并每周观测肿瘤发光强度、肿瘤大小以及小鼠生存情况来分析Ad-VT在体内对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的抑制作用。研究结果:1.构建成功了表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并筛选出稳定表达的细胞系,且所构建的细胞与原始细胞没有明显的生物学差异。2.通过结晶紫染色和WST-1实验,显示了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有杀伤作用,且杀伤作用具有剂量效应和时间效应关系。3.通过Hochest染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法表明,Ad-VT主要通过内源性凋亡途径杀伤人卵巢癌A2780-LUC和人卵巢癌SKOV3-LUC细胞。4.细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验等方法表明,Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。5.通过构建表达荧光素酶的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的裸鼠肿瘤模型,Ad-VT也可以在体内显着抑制人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC,并延长裸鼠生存期。研究结论:本研究成功构建了人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并通过多种体内外实验证实了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有显着的细胞杀伤作用,表明,Ad-VT具有成为卵巢癌治疗药物的潜力。
李世军[2]（2020）在《牛PLIN1基因转录调控机制及其对前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢的作用研究》文中认为脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN1）是一种在真核生物中由PLIN1基因编码的蛋白质。PAT家族是与脂滴表面蛋白相关的蛋白质家族。PLIN1的磷酸化对脂肪组织中脂肪代谢有重要作用,在脂肪细胞中调节脂肪分解和脂肪储存起重要作用。PLIN1包被在脂滴外层,可阻止体内脂肪酶进入脂滴,如激素敏感性脂肪酶（HSL）和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）。PLIN1基因对脂肪分解具有双向调控作用:基础状态下,PLIN1包被于脂滴表面,阻止脂肪酶接触到脂滴内的甘油三酯,从而抑制脂肪分解;能量需求增加时,c AMP-PKA信号通路被激活,PLIN1磷酸化促进脂解。为了探究牛PLIN1基因对牛脂肪细胞增殖分化和脂类代谢的调控作用,本研究以秦川肉牛初生犊牛前体脂肪细胞为实验材料,通过腺病毒介导过表达和干扰PLIN1基因的方法,来探讨PLIN1基因在调控牛前体脂肪细胞增殖分化过程及脂类代谢中作用,主要研究内容如下:1、PLIN1基因多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析检测PLIN1基因在秦川肉牛12个不同组织部位中的表达量,牛PLIN1基因在皮下脂肪组织中表达量显着高于其它组织（p<0.01）。在510头秦川肉牛样本中,通过直接测序检测到PLIN1基因上存在5个SNP位点,分别是g.3579T>C、g.3897G>A、g.8332G>A、g.10516T>C和g.10537G>T。关联分析显示,这5个SNP位点与秦川肉牛部分生长发育性状和肉质性状紧密关联。单倍型组合型H2H4可作为有效分子标记用于秦川肉牛育种。2、转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用克隆得到PLIN1基因5’端上游序列1978bp,通过逐段缺失及双荧光素酶活检测确定PLIN1基因核心启动子区位于-209～-17bp之间。在核心启动子区域预测并筛选得到C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等重要转录因子。通过定点突变和干扰试验,C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子在维持PLIN1基因启动子活性中起到重要作用。进一步通过EMSA实验,在体外验证C/EBPβ、E2F1、PLAG1和SMAD3等转录因子是PLIN1基因的关键转录因子,验证了PLIN1基因在牛脂肪细胞中有重要调控作用。3、PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用通过构建牛PLIN1基因腺病毒过表达和干扰载体,并包装获得过表达重组腺病毒Ad-PLIN1和干扰重组腺病毒sh-PLIN1。在牛前体脂肪细胞中,过表达PLIN1基因在m RNA水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4、DGAT2和C/EBPβ等基因的表达,抑制了PLIN2和ATGL等脂肪代谢基因的表达,在蛋白水平上促进PLIN1、FASN、PPARγ、ACC、LPL、FABP4和DGAT2等基因的表达,抑制了ATGL基因的表达;类似地在牛前体脂肪细胞中干扰PLIN1基因则会有相反的结果。在过表达PLIN1基因后,油红O染色结果显示脂肪细胞中脂滴数目增加且体积增大,甘油三酯检测含量也增加;干扰PLIN1基因后,脂肪细胞中脂滴的数目减少且体积变小,甘油三酯含量减少,说明PLIN1基因能够促进牛前体脂肪细胞甘油三酯积累,在脂肪代谢中有重要调节作用。4、基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘通过转录组测序（RNA-seq）对过表达腺病毒Ad-PLIN1和Ad-NC（空载病毒）处理后的牛前体脂肪细胞差异表达基因进行分析。通过转录组测序分析,共检测到1923个差异表达基因,对差异基因GO分析和KEGG信号通路分析,部分差异基因富集在与脂肪增殖分化相关的AMPK信号通路、Wnt信号通路和PPAR信号通路上,在转录水平说明PLIN1基因对脂肪增殖和代谢有重要调节作用。测序结果也筛选了新的与脂肪代谢相关通路的差异基因,为秦川肉牛的分子育种提供理论支持。5、基于小RNA测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘进一步研究PLIN1基因对脂类代谢的影响,对转录组测序个体进行small RNA测序。对测序结果分析,共鉴定到719个已知mi RNAs和112个新的mi RNAs,发现34个差异表达mi RNA,其中18个mi RNA上调,16个mi RNA下调,对差异表达mi RNA靶基因进行预测共得到6000个靶基因。对差异表达mi RNA靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,其中部分富集在MAPK信号通路、c GMP-PKG信号通路和m TOR信号通路等脂肪代谢、蛋白质代谢和细胞免疫信号通路。通过m RNA-seq与small RNA-seq整合分析,依据mi RNA与其靶基因间的对应关系对差异表达mi RNA的靶基因进行GO富集和KEGG通路分析,主要富集在Wnt信号通路、氨基酸的生物合成、p53信号通路和MAPK信号通路。综上所述,本研究通过构建逐段缺失载体和EMSA实验对牛PLIN1基因的转录调控机制初步研究,运用高通量测序RNA-seq和small RNA-seq运用多组学分析从m RNA-mi RNA水平研究PLIN1基因在脂类代谢中的作用。
袁陶燕[3]（2019）在《绍兴鸭端粒酶逆转录酶基因表达调控及内源性激活的研究》文中认为端粒酶逆转录酶基因（TERT）编码的蛋白是组成端粒酶的三个主要成分之一,是端粒酶活性的限速单位。端粒酶通过在端粒末端补充“TTAGGG”重复序列阻止细胞复制性衰老。本研究检测了鸭TERT（dTERT）,相对端粒酶活性（RTA）和相对端粒长度（RTL）在鸭早期发育阶段的时空分布特点。克隆了鸭TERT 5’-侧翼序列,研究了表观遗传特别是DNA甲基化对dTERT表达的调控作用。最后,基于双荧光素酶活性检测和生物信息学分析,选择靠近转录起始位点的近端调控区作为靶序列,利用CRISPR-Cas9技术内源性激活了鸭小肠上皮细胞中的TERT。结果如下:1.鸭TERTmRNA,相对端粒酶活性（RTA）和相对端粒长度（RTL）的时空分布特点在出生后7天雏鸭的所有8个测试组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠、腿肌、性腺和胰腺）中均检测到了TERTmRNA的表达。其中,TERT在小肠和肾脏中的表达水平最高,其次依次是心脏、腿肌、脾脏、胰腺,在性腺和肝脏中的表达水平最低。在肝脏发育过程中,dTERT的表达趋势先从E13（胚胎期13天）到E19增加,然后从E19到E26急剧下降,并在D7（出生后7天）达到最低水平。而在腿肌中,dTERT的表达水平从E13到E19变化不大,从E19到E26显着增加,从E26到D7明显减少。在所有测试的雏鸭（D7）组织中均检测到了相对端粒酶活性（RTA）,其中小肠中的端粒酶活性特别高,肾脏、心脏和胰腺中的端粒酶活性相对较低,端粒酶活性表现最低的是肝脏和腿肌。随着胚胎的发育,肝脏和腿肌中的RTA水平均显着下降。此外,雏鸭（D7）腿肌中的相对端粒长度（RTL）最长,其次是肾脏、小肠、肝脏、心脏和胰腺。从胚胎发育到出生阶段,肝脏中的RTL从E13到E26相对稳定,到D7时明显缩短。在腿肌中,RTL从E13到E26有小幅度的增加,而到D7时也显着缩短。2.鸭TERT 5’-侧翼序列的克隆及DNA甲基化调控研究克隆获得了2,413bp长的dTERT 5’-侧翼序列,并提交给GenBank（GenBank No.MH910094）。5’-RACE将转录起始位点定位到了-93bp处,定义为新的转录起始位点（+1）。生物信息学分析显示,鸭TERT5’调控区有三个CpG岛（S1,S2和S3）。亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）结果表明,与小肠（D7）或肝脏（E19）相比,dTERTmRNA表达量显着较低的肝脏（D7）在S1区具有更高的甲基化水平。荧光定量PCR结果显示,DNA甲基转移酶DNMT1表达水平在肝脏（D7）中显着高于其他两个组织。体外细胞实验表明,经过甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine（5-aza-dC）处理后,鸭胚成纤维细胞（DEFs）和小肠上皮细胞（DIECs）中dTERT表达均显着增加,同时S1区的甲基化水平显着降低,上述实验进一步证明了dTERT受到DNA甲基化的表观遗传调控。此外,用组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatinA（TSA）处理DEFs和DIECs后,也导致dTERT表达显着增加,提示组蛋白乙酰化也可能参与鸭TERT的转录调控。3.利用CRISPR-Cas9技术内源性激活鸭TERT双荧光素酶实验表明转录起始位点（+1）上游541bp是鸭TERT的核心启动子区,结合潜在转录因子位点的生物信息学分析,将-370/-150作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列。用慢病毒法将10种Cas9-sgRNAs混合质粒转染DIECs后继续培养细胞,当培养到编辑后第5代时（CRISPR 5P）鸭TERT的表达有轻微上调。随着传代的进行,dTERT转录逐渐增强,直到在CRISPR13P时维持一个稳定的水平。当未编辑的DIECs进入衰老停滞时,CRISPR编辑的DIECs依然具有良好的细胞形态和增殖活性。Sanger测序显示,CRISPR 5P DIECs中所有sgRNAs都成功整合进鸭基因组,靶区域呈现出不同形式的基因突变。当培养到编辑后18代时,存活的CRISPR 18PDIECs中的优势突变是靶序列上74bp的缺失,而优势sgRNAs是sgRNAs2,sgRNAs7和sgRNAs9。检测RTA和RTL发现,CRIPSR编辑的DIECs中RTA被成功激活,但是并没有阻止端粒的缩短。荧光定量TERT潜在的靶基因表明,dTERT可能以一种端粒非依赖方式通过抑制衰老凋亡相关基因来维持细胞生长。最后,用LPS和poly（I:C）处理表明,CRISPR编辑的TERT被成功激活的鸭小肠上皮细胞依然具有正常的免疫反应功能。
唐波[4]（2016）在《人端粒酶逆转录酶（hTERT）促胃癌侵袭转移的分子机制研究》文中指出研究背景细胞染色体末端含有一个TTAGGG的重复序列,这些末端DNA重复序列被命名为端粒,生理稳态时随着细胞分裂次数的增加,染色体端粒长度会逐渐缩短最终导致细胞的衰老。端粒酶是维持端粒延伸和长度稳定的关键酶,肿瘤细胞端粒酶持续高表达和活化而导致细胞具有无限增殖及永生化的特性。端粒酶是一种核糖核蛋白,包含有RNA及端粒酶逆转录酶,通过RNA模板合成特异性的TTAGGG重复序列以维持端粒的长度的稳定。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,h TERT）作为端粒酶的催化亚单位,在端粒酶的活化中发挥决定性的作用,h TERT的表达即可代表端粒酶的活化。hTERT在90%以上的人类恶性肿瘤中高水平表达,可通过发挥其经典的逆转录酶活性促进肿瘤的无限增殖,而越来越多的研究表明,hTERT亦可通过非依赖逆转录酶活性而参与多种基因的表达调控。我国作为胃癌的高发国家,胃癌发病率在男性和女性分别列第二和第三位,而致死率已跃居所有恶性肿瘤的第二位。早期侵袭转移是胃癌患者死亡的重要原因,但目前针对胃癌侵袭转移的机制并不十分清楚。我们知道,肿瘤侵袭转移是一个复杂的过程,主要包括细胞粘附能力改变、细胞外基质的降解、EMT及肿瘤血管生成等。肝素酶（Heparanase）作为唯一能降解细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的内切酶,可破坏细胞外基质屏障并促进锚定的多种细胞因子释放,从而参与多种肿瘤侵袭转移的调控。肝素酶在肿瘤组织及患者血清中高表达,与肿瘤的侵袭转移及新生血管密度密切相关,抑制肝素酶表达可明显抑制肿瘤侵袭转移,提示肝素酶是具有潜在价值的抗肿瘤靶标。过去的研究主要关注于hTERT在肿瘤细胞无限增殖中的作用,随着研究的深入,hTERT在肿瘤侵袭转移中的作用及调控机制亦逐渐被揭示。我们课题组前期研究发现,过表达hTERT可明显增强细胞的体外侵袭能力,并且胃癌组织hTERT的表达与胃癌大小、淋巴结及远处转移密切相关,提示hTERT可能参与了胃癌侵袭转移的调控,然而具体的调控机制不清。本研究拟阐明hTERT调控胃癌细胞肝素酶表达进而促进胃癌侵袭转移的作用及分子机制,为以htert为靶点的胃癌诊断及治疗提供新的理论依据。研究方法1.体外侵袭及体内转移实验,证实htert对胃癌细胞侵袭转移的调控作用;2.采用双荧光素酶、qpcr及westernblot检测htert对肝素酶启动子活性、mrna及蛋白表达的影响,证实htert可调控肝素酶的转录表达;3.生物信息学及qpcr实验筛选确定介导htert调控肝素酶表达的核转录因子;4.双荧光素酶及westernblot实验检测过表达或干扰c-myc对肝素酶启动子活性和蛋白表达的影响,并利用chip实验检测c-myc与肝素酶启动子结合情况,证实c-myc可通过结合肝素酶启动子而调控肝素酶转录表达;5.突变肝素酶启动子的c-myc结合位点或干扰c-myc表达,分别用双荧光素酶及westernblot实验检测htert对肝素酶启动子活性和蛋白表达的影响,进一步证实c-myc可介导htert对肝素酶的表达调控;6.采用免疫共沉淀（co-ip）、免疫荧光共定位、chip及re-chip实验,证实htert可与c-myc形成复合物并通过c-myc结合于肝素酶启动子区;7.分别干扰或过表达htert及c-myc,通过双荧光素酶及westernblot实验检测肝素酶启动子活性和蛋白表达,证实两者是肝素酶转录表达激活的必须调控分子;8.采用top/fop实验、免疫荧光及westernblot实验证实htert可促进β-catenin核转位和转录活化,进一步通过wnt/β-catenin信号通路促进c-myc的表达上调,证实htert与c-myc存在相互调控的反馈通路;9.体外侵袭及体内动物实验检测干扰肝素酶表达对htert调控胃癌细胞生物学行为的影响,证实htert通过上调肝素酶表达促胃癌侵袭转移的作用;10.免疫组化检测htert、c-myc及肝素酶在胃癌及癌旁组织的表达情况,分析三者表达的相关性及与患者临床病理特征和预后的关系。研究结果1.体外侵袭及体内动物实验发现,过表达或抑制胃癌细胞htert表达可促进或抑制胃癌细胞的侵袭转移;2.双荧光素酶、qpcr及westernblot实验发现,过表达或抑制htert表达可上调或抑制htert的启动子活性及转录表达,提示htert可调控肝素酶表达并与肝素酶的转录活性密切相关;3.生物信息学预测、双荧光素酶及qpcr初步筛选发现,抑制核转录因子c-myc表达可抑制htert诱导的肝素酶启动子活性和mrna的表达上调,提示c-myc可能参与了hTERT对肝素酶的转录表达调控;4.ChIP实验证实c-Myc可直接与肝素酶启动子结合,而突变肝素酶启动子区的c-Myc结合位点,可明显抑制hTERT对肝素酶启动子活性的上调作用,提示hTERT通过c-Myc结合肝素酶启动子而调控肝素酶转录表达;5.Co-IP及免疫荧光实验证实hTERT与c-Myc在胃癌细胞核中存在共定位和相互作用,ChIP及re ChIP实验表明,hTERT与c-Myc形成的复合物可通过c-Myc与肝素酶启动子结合,并且过表达hTERT可促进复合物的形成及复合物与肝素酶启动子的结合,从而促进肝素酶的转录表达上调;6.在过表达hTERT或c-Myc同时分别干扰c-Myc或hTERT的表达,可明显抑制过表达hTERT或c-Myc诱导的肝素酶启动子活性及蛋白表达,而同时过表达hTERT和c-Myc可促进更高的肝素酶启动子活性和蛋白表达水平,提示hTERT与c-Myc形成的完整复合物在肝素酶转录激活中发挥关键作用;7.hTERT可促进β-catenin的转录活性和核转位,进一步研究发现,hTERT可通过Wnt/β-catenin信号通路促进下游基因c-Myc的表达上调。既往研究表明,c-Myc可直接结合于hTERT的启动子而促进hTERT的转录表达,提示hTERT与c-Myc间存在相互调控而形成正向反馈调控通路维持两者在胃癌细胞的高表达和肝素酶的持续表达上调;8.干扰c-Myc或肝素酶表达可明显抑制hTERT促胃癌侵袭转移能力,提示hTERT可通过与c-Myc协同促胃癌细胞肝素酶表达上调进而促进胃癌的侵袭转移;9.胃癌组织免疫组化实验发现,hTERT、c-Myc及肝素酶在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织,并且三者在胃癌中的表达存在明显的正相关,生存分析发现,表达水平与胃癌患者的不良预后密切相关。研究结论通过以上研究,我们证实了hTERT在胃癌侵袭转移中的重要调控作用,并发现hTERT可通过上调胃癌细胞肝素酶表达而促进胃癌的侵袭转移。进一步的机制研究发现,hTERT可作为辅助活化因子与核转录因子c-Myc结合形成转录复合物,该复合物可通过c-Myc直接与肝素酶启动子结合促进肝素酶的转录表达。在该调控机制中,hTERT可通过活化Wnt/β-catenin信号通路促进c-Myc的表达上调,而c-Myc亦可作用于hTERT启动子调控hTERT的表达,从而形成一种正向反馈调控机制促进肝素酶的表达和胃癌的侵袭转移。
林桂渺[5]（2012）在《Egr-hTERTC27联合5-FU治疗鼻咽癌及TCF3抑制小鼠胚胎癌生长的实验研究》文中研究指明1Egr-hTERTC27联合5-FU治疗鼻咽癌的实验研究研究背景鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是一种发生于鼻咽部粘膜的恶性肿瘤。多发区主要在中国的广东、广西、福建等地。发病年龄范围较广，主要为中年人，也有青少年患病者。鼻咽癌恶性程度很高，常常伴有局部淋巴结转移或远处转移。发病因素较为复杂，包括遗传因素、EB病毒因素和环境致癌因素。目前鼻咽癌的治疗主要以局部放射治疗和化学疗法为主。但是，对于晚期鼻咽癌和早期切除但预后不良的鼻咽癌患者，目前仍然没有有效的治疗方式。因此，寻找一种新的治疗方式迫在眉睫。5-氟尿嘧啶（5-Fluroracil，5-FU）是一种常用的治疗鼻咽癌的化疗药物，它是尿嘧啶5位上的氢被氟取代的一种衍生物，能够抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，干扰DNA和蛋白质的合成。然而，5-FU毒性作用较大，患者常常因为耐受不了高剂量5-FU引起的不良反应而被迫终止治疗。因此，寻求新型的生物治疗方式来联合杀伤肿瘤细胞，协同减低化疗药物的使用剂量，提高患者的耐受能力，增强肿瘤化疗的治疗效果是目前急需解决的问题之一。早期生长反应基因1（early growth response gene，Egr-1）启动子中有6个CArG[CC（A+T-rich）6GG]血清反应元件，在电离辐射或化学药物的诱导下可以被激活，从而启动下游基因的表达，这种作用是通过ROIs（reactive oxygen intermediates，ROIS）介导的。科学家利用Egr-1启动子作为桥梁，提出了肿瘤的基因-化学治疗设想。将同时具有诱导特性的Egr-1启动子和肿瘤杀伤基因或是免疫治疗基因转入体内，在对肿瘤进行化疗的同时诱导目的基因的高表达，从而达到化学治疗和基因治疗的双重肿瘤杀伤作用，降低等效化疗药物的治疗剂量，缓解正常组织的损伤，降低毒副作用，提高治疗效果。利用Egr-1启动子的桥梁作用，联合治疗基因如CD、TK、CDglyTK、endostatin等治疗胃肠道癌、脑神经胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤已取得了令人瞩目的成绩。端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的一个催化亚单位，对于保持端粒长度和延长细胞寿命具有重要作用。端粒酶逆转录酶在大多数肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中几乎很少表达。因此，端粒酶逆转录酶可作为比较理想的肿瘤检测诊断的标志和肿瘤基因治疗的靶点。hTERTC27，是人端粒酶逆转录酶C-末端一个27kDa的多肽，该片段保留了端粒酶RNA结合域而去除了逆转录结构域，2002年香港大学Huang JJ与Lin MC教授利用基因重组技术构建了hTERTC27多肽片段。体外实验研究证实在人宫颈癌HeLa细胞中过表达hTERTC27可以引起端粒的功能异常，促使染色体末端快速融合，并且增强细胞对过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激反应。此外，hTERTC27过表达可以诱导HeLa细胞出现凋亡和老化，对于接种HeLa细胞的宫颈癌裸鼠模型也具有明显的抑瘤效果。除了HeLa之外，进一步研究表明腺病毒载体装载的hTERTC27多肽片段对于接种U87-MG人脑胶质细胞瘤的裸鼠模型也产生了同样明显的抑瘤效果。因此，hTERTC27做为新型构建的抗肿瘤多肽，具有良好的应用前景。但是，hTERTC27是否对人鼻咽癌C666具有抗肿瘤效应，目前国内外尚未见相关研究报道。本研究以Egr-1启动子作为桥梁，将hTERTC27片段构建在Egr-1启动子下游，通过5-FU诱导hTERTC27高表达。观察5-FU诱导Egr-1启动子驱动的hTERTC27（简称Egr-hTERTC27）联合5-FU对鼻咽癌的体内外抑瘤效应，并初步探讨其作用机制。本研究首次以Egr-1启动子作为桥梁，以5-FU作为诱导剂，将hTERTC27片段联合5-FU对鼻咽癌进行基因-化疗双重治疗，为鼻咽癌肿瘤治疗提供一种新的治疗方案。方法采用脂质体转染法建立稳定细胞株，采用荧光显微镜、流式细胞术和Western blot方法观察5-FU对Egr-1启动子的诱导效应。采用MTT法、细胞克隆形成实验、AnnexinV/PI双染法结合流式细胞术，以及Tunel技术观察Egr-hTERTC27联合5-FU对鼻咽癌C666-1细胞的体外协同抑瘤效应。采用稳定细胞株建立鼻咽癌皮下移植瘤模型，通过肿瘤生长曲线、瘤重和HE染色观察二者体内协同抑瘤效应。采用Western blot分析观察凋亡激活相关蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9的表达以及Bcl-2抑凋亡蛋白的表达。结果体外实验结果表明，5-FU可以成功诱导Egr-1启动子下游目的基因hTERTC27的高表达，5-FU诱导后的hTERTC27蛋白表达较对照组最多可增加7倍左右。过表达的hTERTC27能够提高鼻咽癌C666-1细胞对5-FU的敏感性，并且进一步抑制细胞增殖达20%。Egr-hTERTC27（Egr-1启动子诱导过表达的hTERTC27）联合5-FU可以协同抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡，联合治疗组的细胞凋亡率是hTERTC27单独治疗组的4.8倍，是5-FU单独治疗组的1.8倍。体内实验结果表明，Egr-hTERTC27联合5-FU协同地抑制肿瘤生长速度、肿瘤重量，并且降低肿瘤的局部浸润。此外，联合治疗组凋亡激活相关蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9蛋白表达增加，抑凋亡Bcl-2蛋白表达减少。结论Egr-1启动子介导的hTERTC27过表达（Egr-hTERTC27）联合化疗药物5-FU能够协同抑制鼻咽癌的生长并促进其凋亡，对鼻咽癌具有很好的治疗效果。这些结果提示我们，Egr-hTERTC27联合5-FU可能作为鼻咽癌治疗的一种新途径。2TCF3抑制小鼠胚胎癌生长的实验研究研究背景胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）来源于囊胚发育的内层细胞团（InnerCell Mass），是一种高度未分化的干细胞。ES细胞可以自我更新、无限增殖并且具有多分化潜能，能够分化成体内所有组织和器官。ES细胞的发现为生物发育调控的研究以及组织生物学工程的研究带来深远的影响。但是由于ES细胞研究受到伦理和道德的约束，很大程度上限制ES细胞的研究。胚胎癌（Embryonic carcinoma，EC）细胞是一种高度恶性的肿瘤细胞，是一种来源于恶性畸胎瘤的干细胞。它既属于一种肿瘤干细胞，又与ES细胞类似，具有相近的组织学起源以及生物学特性。由于EC细胞与肿瘤干细胞以及ES细胞之间存在许多相似性，EC细胞越来越受到广大干细胞研究者的青睐。ES细胞的调控机制错综复杂，其具体机制尚不清楚晰，进一步探索EC细胞的调控机制，对于正确理解EC及ES细胞的发育生物学特性及其应用具有重要的意义。Wnt信号通路途径在ES细胞中扮演重要角色，它可以调节多种ES细胞的自我更新能力和分化潜能。它能够调节Oct-3/4、Nanog等重要干性基因的表达，调节ES细胞在皮肤、神经系统、血液系统的命运决定。此外，Wnt能够上调BMP家族蛋白的表达，抑制ES细胞向神经的分化等。T细胞因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）家族蛋白是Wnt家族蛋白最终的效应分子，它具有一个保守的HMG结构域和与β-连环蛋白（β-catenin）相互作用的结构域。Wnt信号途径的活化促使β-连环蛋白在细胞质中积累，并且进入细胞核，与TCF/LEF家族蛋白相互作用，进一步调节靶基因如c-Myc、Cyclin D1等的表达。TCF/LEF是一类具有双向调节功能的转录因子。一方面，它可以和CtBP以及Groucho蛋白结合从而抑制基因转录。另一方面，它可以结合β-catenin从而促进基因转录。TCF家族蛋白有四种，包括TCF1-4，其中TCF3在ES细胞中表达含量最高。最近研究表明TCF3在ES细胞中可以和TLE2形成抑制复合物，共定位在干性基因Oct4，Nanog的启动子上，是Oct4和Nanog核心调节网络中非常重要的组成部分。TCF3的缺失可以增加Oct4和Nanog等其他ES转录因子的表达，并且使ES细胞具有抵抗分化的潜能。正常情况下，体外培养的小鼠ES细胞需要在外源性白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的作用下才能保持自我更新的能力，将TCF3去除可以使小鼠ES细胞在没有LIF的条件下也可以进行自我更新，并且在分化刺激条件下出现分化迟缓。多项研究表明TCF3在维持ES细胞的增殖和自我更新能力中意义重要，但是其在EC细胞中的作用以及具体机制尚不明确。本研究目的在于观察TCF3在EC肿瘤发生和发展的作用并初步探讨其作用机制。本研究首次探讨TCF3在EC中的作用，为进一步理解干细胞和EC的调控机制提供了一定的理论依据。方法采用分子克隆技术构建逆转录病毒重组载体，利用逆转录病毒包装感染技术建立TCF3稳定过表达的F9胚胎癌细胞株。Western blot和RT-PCR分析鉴定稳定细胞株的建立。应用TCF3过表达的F9胚胎癌细胞株进行体外研究，细胞计数法、MTT比色法以及软琼脂克隆形成实验观察TCF3过表达对F9细胞增殖能力的影响。细胞迁移实验观察TCF3过表达对F9细胞迁移能力的影响。采用稳定细胞株建立小鼠胚胎癌皮下移植瘤模型，通过肿瘤生长曲线、瘤重、生存率以及HE染色观察TCF3过表达对胚胎癌生长的影响。采用细胞免疫荧光和Western blot法观察Oct4在F9细胞中的表达。采用RT-PCR和Western blot分析法观察TCF3过表达对Oct4基因mRNA转录和蛋白表达的影响。采用RNAi技术观察TCF3干涉沉默后对Oct4表达的影响。结果体外实验结果表明TCF3过表达显着抑制F9细胞株的增殖、克隆形成和迁移能力，抑制率分别达到约30%、45%和30%。体内小鼠移植瘤模型结果表明TCF3过表达显着抑制肿瘤体积大小（36.4%）、肿瘤重量（34.8%）、肿瘤恶性程度进程和肿瘤局部浸润，以及延长了荷瘤小鼠的生存时间。F9胚胎癌中TCF3的过表达能够下调Oct4蛋白的表达。相反，siRNA干涉TCF3的表达能够上调Oct4的表达。结论TCF3过表达能够抑制小鼠F9胚胎癌的生长，其机制可能是因为下调Oct4蛋白的表达。本研究所采用的技术路线及实验结果在国内外均未见报道。
刘磊[6]（2012）在《基于hTERT启动子表达Apoptin基因溶瘤腺病毒对胃癌的抑制作用》文中研究表明胃癌严重威胁着人类的健康，其治法极其有限并且75%的患者在确诊时已经到不能通过手术治疗的阶段。即使实施根治性切除并联合放化疗也有近60％的致死率。并且在治疗过程中疗效与副作用间的矛盾也令医者进退两难。基于腺病毒的基因治疗已广泛的进入到临床前及临床研究。溶瘤病毒治疗为那些传统方法治疗无效的患者重然生机。如条件性增殖腺病毒（conditional replication-competent adenovirus, CRCA）等方法已在临床前及临床实验中开展并得到越来越多的关注，其主要原因为这种载体右以选择在癌细胞中启动并且有能力在临近的肿瘤细胞复制及扩散。此外感染CRCA后可产生抗肿瘤免疫应答，这也可对放疗及化疗产生互补。更重要的是CRCA还可以通过携带相应的治疗基因对原发和转移癌同时奏效。然而这种疗法并不足够的效力及相对缺乏的特异性靶向癌症基因治疗中的一大难题及开发抗癌新疗法的关注重点。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）启动子在永生化细胞及超过85%的人类癌症细胞中高度活跃，因此被广泛的应用于CRCA的构建中。在本研究中所采用的早期区1A基因（early region1A，E1A）是腺病毒构建中应用最广泛也是病毒本身复制所必需的基因，它担任着病毒感染后调节病毒复制和细胞周期的重要角色。研究中，我们关注描述双特异性抗癌溶瘤腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin的抗肿瘤效果，这种重组腺病毒其复制由hTERT启动子启动，可选择性的在肿瘤细胞中复制及选择性的将肿瘤细胞诱导凋亡。其抗肿瘤作用在体外感染肿瘤细胞24小时后开始奏效。在感染人胃癌SGC7901细胞4天后采用1MOI剂量的影响较小，但采用10MOI及100MOI剂量组则完全抑制了细胞生长。与之相对，人胃黏膜上皮细胞GES-1在采用Ad-hTERT-E1a-Apoptin治疗后的任何剂量均未观察到明显的生长抑制。这一结果表明Ad-hTERT-E1a-Apoptin可在SGC7901癌症细胞中特异性复制并抑制生长且对正常细胞无明显作用。癌症的治疗中有效性与特异性同等重要。凋亡素（Apoptin）是源于鸡贫血病毒（chicken anemia virus, CAV）VP3基因质量为13.6kDa的蛋白，可以选择性的诱导多种肿瘤细胞凋亡，如肝癌细胞、淋巴癌细胞、肝管上皮癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、口腔癌细胞和结肠癌细胞等。初步研究已经证实超过超过70种不同的人类转移癌及恶性肿瘤细胞对Apoptin所诱导的凋亡敏感。然而，Apoptin对正常的人类细胞如成纤维细胞、平滑肌细胞、T细胞、肝细胞、造血干细胞、角化细胞和内皮细胞等非转化细胞并没有相应作用。此外，有研究表明在正常人类成纤维细胞中Apoptin的长期表达并没有产生毒性及转录活性。也有研究显示Apoptin对非癌细胞也存在细胞毒性，但在这项研究中表明细胞死亡仅在胎儿细胞型中产生。此外Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡并不依赖p53。因此在p53缺乏及表达野生或突变型p53的肿瘤细胞中Apoptin同样有较强的杀伤作用。Apoptin诱导凋亡中抗凋亡分子的机制目前任是个争论问题。在某些肿瘤细胞系中Apoptin介导的细胞死亡并不依赖bcl-2而且对bcr-Abl和bcl-xL也不敏感。因此Apoptin可用于放、化疗的补充方法。所有这此因素使得Apoptin在癌症的基因治疗中倍受关注并且许多研究中已经证实Apoptin插入不同载体后可有效限制肿瘤生长。染色质凝聚及核碎裂是细胞凋亡的标志。使用荧光显微镜可对如AO/EB染色等不同方式的DNA染色进行方便快捷的检测。本研究中利用AO/EB染色法将感染重组腺病毒的SGC7901细胞生存、凋亡及坏死比例进行量化。结果显示，感染重组腺病毒后部分SGC7901细胞的生长抑制可能源于细胞坏死。因此我们推测Apoptin基因可能还有另外一些尚不明确有作用。然而Apoptin基因诱导凋亡的作用依旧明显，在感染Ad-hTERT-E1a-Apoptin重组腺病毒48小时后38.6%的细胞产生凋亡而坏死细胞比例为27.1%。相反，感染Ad-hTERT-E1a重组腺病毒48小时后尽管也有24.3%的细胞凋亡，但坏死比例占25.5%。这种结果表明尽管感染复制型重组腺病毒的细胞会产生坏死但相对于肿瘤细胞对Apoptin基因所产生的凋亡作用并不明显。细胞死亡分类的形态学检测经常联合应用两种以上的检测方法，因此研究中还应用了其他染色。Apoptin基因在人类多种癌症细胞上诱导的凋亡也是经由经典的凋亡通路。Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7是Caspase家族中的重要成员它可以在凋亡细胞中裂解主要的细胞底物并经由内在或外在途径扩大这种作用。在本项研究中采用Western blot分析检测到感染重组腺病毒SGC7901细胞中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7的活性增高。糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glycolytic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）做为参照。所有的结果证明了Ad-hTERT-E1a-apoptin溶瘤腺病毒可以在肿瘤细胞中特异性凋亡诱导作用。研究中还对重组腺病毒在人源性胃癌裸鼠皮下荷瘤模型中的抗肿瘤作用进行评估以进一步证实及拓展体外的研究结果，实验中荷瘤人胃癌SGC7901细胞BALB/c裸鼠感染不同种的重组腺病毒。结果显示所有的重组腺病毒都有着抗肿瘤效果，但复制缺陷型腺病毒只能相对更少部分的抑制肿瘤。瘤内注射重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin的荷瘤鼠瘤体明显减小，而感染Ad-hTERT-Apoptin、 Ad-CMV-apoptin、Ad-hTERT-E1a或Ad-CMV-E1a的荷瘤鼠的抑瘤效果则相对不明显。这显示就用复制型腺病毒可以扩散到动物的任何瘤体组织中并且表达Apoptin基因的腺病毒也增强了溶瘤作用。当感染方式为尾静脉注射时，重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin虽然没有完全导致肿瘤消退，但肿瘤的增长也被明显的延迟了。瘤内注射方式的抑制作用可能也与继发CRCA感染相关。尾静脉注射重组腺病毒Ad-hTERT-Apoptin、Ad-CMV-Apoptin、Ad-hTERT-E1a和Ad-CMV-E1a的溶瘤活性相对有限，其结果与瘤内注射接近。尾静脉注射腺病毒Ad-mock及生理盐水组裸鼠未能观查到肿瘤抑制作用。另外在整个体内实验过程中并未观察到用重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin治疗的实验动物出现明显的毒副作用。因此数据表明重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin是一个安全有效的载体，可广泛应用于肿瘤治疗。总之，Apoptin基因治疗展现出其特有的肿瘤治疗优势如：（1）Apoptin基因的凋亡诱导作用不依赖p53基因；（2）Apoptin基因的凋亡诱导作用不受bcl-2或bcr-abl等凋亡抑制因子影响；（3）Apoptin基因能够激活多种下游凋亡程序因子；（4）Apoptin基因对多种类型肿瘤具有作用，以上这些优点都都表明Apoptin将会广泛应用于肿瘤治疗。另外在本研究中所应用的CRCA可选择性的诱导多种肿瘤细胞凋亡且对正常细胞无不良反应。体内外的研究数据表明在hTERT启动子驱动下表达Apoptin基因的CRCA有明显的抑瘤效果并且有更少的不良作用，这些结果都可为进一步的临床研究提供有价值线索。
吴蓓[7]（2011）在《hTERT启动子的克隆及其启动效率的研究》文中进行了进一步梳理目的：克隆人端粒酶逆转录酶启动子片段,并证明hTERT启动子可以引导目的基因在肿瘤细胞中表达。方法：使用RT-PCR和荧光定量PCR检测多种肿瘤细胞及正常细胞中的hTERT表达活性；Western Blot检测hTERT在多种肿瘤细胞中的蛋白表达；通过PCR及pMD-18T质粒载体对hTERT核心启动子进行扩增和克隆；以pGL3-Basic为载体构建含hTERT启动子和hNIS基因的重组质粒,并通过荧光素酶活性实验检测hTERT启动子在不同细胞中的启动效率结果：1、RT-PCR的结果显示在H460、U251、U87、ARO及FRO等细胞中均存在hTERT mRNA的表达,只是活性的高低不一；而在正常细胞MRC-5中无表达。荧光定量PCR的结果显示在胶质瘤细胞U251内存在hTERT的高活性表达,与内参基因P-actin对照,其相对含量为0.18%。2、Western Blot结果显示在120 kD处可见阳性反应条带,为表达的hTERT目的蛋白。3、成功构建并鉴定了含3种不同长度hTERT启动子序列（260 bp、456 bp及1453bp）的pMD-18T和pGL3重组质粒,并成功构建并鉴定了含260bp hTERT启动子及hNIS基因的重组质粒pGL3-204-hNIS。4、荧光素酶活性实验结果显示,在上述肿瘤细胞中,3种hTERT启动子片段均可诱导荧光蛋白的表达,但其启动效率存在差异,其中pGL3-204中的启动子片段（260bp）在FRO、H460、U251和U87中启动效率最强,可以达到SV40启动子的80%。结论：在多种肿瘤细胞中均存在hTERT不同活性的表达,因此可以应用hTERT启动子引导治疗基因在多种肿瘤细胞中的特异性表达。而且hTERT核心启动子具有较高的启动效率,可以替代全长启动子引导hNIS基因表达。
熊杰[8]（2010）在《新型嵌合启动子在肿瘤治疗中的应用》文中认为第一部分可放射诱导的肿瘤特异性嵌合启动子的构建及活性检测目的：将放射敏感性的CArG元件与肿瘤特异性的人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）基因启动子相结合,构建新型的嵌合启动子,并检测嵌合启动子的放射诱导性和肿瘤特异性,以探讨其在基因治疗中的作用。方法：分别构建含有4、6、8、10个CArG元件的增强子,插入肿瘤特异性的hTERT核心启动子上游,构建成新型的嵌合启动子质粒,分别为pC4-hTERT-luc, pC6-hTERT-luc, pC8-hTERR-luc, pC10-hTERT-luc,同时以包含SV40启动子的质粒（pControl-luc）为对照。将构建的质粒转染至人宫颈鳞癌HeLa细胞、人肺腺癌A549细胞、人肝癌MHCC97细胞和正常细胞人胚肺细胞hEL中,在不同剂量放射线诱导下,利用荧光素酶报告基因检测嵌合启动子在肿瘤及正常细胞中的活性。同时我们还比较了不同照射方式,即单剂量照射（一次6Gy）与分割照射（3×2Gy）对嵌合启动子诱导效果的影响。结果：包含6个CArG元件的嵌合启动子较含其他数量CArG元件的嵌合启动子显示了更好的放射诱导性,甚至高于阳性对照质粒pControl-luc（P<0.05）,并在4-6Gy时达到顶峰,而构建的嵌合启动子在正常的hEL细胞中活性很低。比较单剂量和分割照射剂量对嵌合启动子活性诱导差别时,3次2Gy与单次6Gy剂量照射相比较,报告基因的表达无统计学差异（P>0.05）。结论：包含6个CArG元件的肿瘤特异性嵌合启动子具备很好的放射反应性,这种嵌合的启动子系统具有相当的肿瘤基因治疗的潜力。第二部分新型的嵌合启动子介导的自杀基因治疗的体外研究目的：检测利用新型的嵌合启动子介导的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）/吲哚乙酸（indole-3-acetic,IAA）自杀基因系统,与放射治疗相结合,对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。方法：我们筛选出含有6个CArG元件的hTERT嵌合启动子做后续基因治疗研究,将HRP基因表达片段插入嵌和启动子的下游,构建新的表达载体pC6-hTERT-HRP,同时构建phTERT-HRP为单启动子对照质粒,pControl-HRP为阳性对照质粒,和pControl-luc为阴性对照质粒。将构建的质粒瞬时转染至肿瘤细胞（HeLa, A549, MHCC97）和正常细胞（hEL）后,在6Gy放射线诱导下,利用Western blotting检测HRP的表达。利用MTS实验、Annexin V-FITC染色检测此嵌合启动子质粒系统联合前药IAA,对细胞的生长抑制及凋亡诱导效应,利用克隆形成实验检测此系统对肿瘤细胞放射敏感性的影响。结果：三种肿瘤细胞经转染后,可见明显的HRP蛋白表达,并且在6Gy放射线诱导下,HRP表达量明显增多。而在人胚肺细胞hEL中,仅pControl-HRP可见HRP表达。在放射线诱导下,嵌和启动子介导的自杀基因HRP/IAA系统显示了较对照更强的对肿瘤细胞增殖抑制和凋亡诱导效应,甚至高于阳性对照质粒（P<0.05）。而在正常hEL中,C6-hTERT-HRP/IAA与放射相联合,引起的生长抑制和凋亡效应明显低于阳性对照质粒（P<0.05）。克隆形成实验显示嵌合启动子系统对肿瘤细胞的放射增敏比值也更高,甚至高于阳性对照质粒,嵌合启动子系统对三种肿瘤细胞（HeLa、A549、和MHCC97）的放射增敏比分别为3.35,3.45,3.45。结论：体外研究表明这种嵌合的启动子系统提供了新的肿瘤治疗模式,具有相当的肿瘤治疗的潜力。第三部分新型的嵌合启动子介导的自杀基因治疗的体内研究目的：构建包含嵌和启动子的复制缺陷型腺病毒载体,在放射线诱导下,检测其对肝癌裸鼠种植瘤的杀伤作用。方法：构建含有嵌合启动子调控自杀基因表达的复制缺陷型腺病毒载体Ad-C6-hTERT-HRP,以阴性病毒载体Ad-CMV-GFP为对照载体。将人肝癌细胞MHCC97接种至裸鼠BALB/C左侧腋下皮下,建立肝癌裸鼠移植瘤模型。种植后第11d,14d,17d瘤内注射腺病毒液,第13d至27d腹腔注射前药IAA。同时在瘤内注射的次日给与或不给放射处理,检测裸鼠皮下移植瘤体积,及观察荷瘤裸鼠生存期。种植后8周处死所有老鼠,取正常器官（肺、肝脏、肾脏、小肠）的进行常规病理学HE染色,取肿瘤组织进行TUNEL检测细胞凋亡。结果：包含嵌和启动子的腺病毒载体联合放疗对移植瘤生长抑制作用最强,并且在种植后第5周,Ad-C6-hTERT-HRP联合放疗组的相对肿瘤体积明显小于对照病毒组（P<0.05）。Ad-C6-hTERT-HRP联合放疗组较其他对照组能明显延长裸鼠中位生存期（P<0.05）,其中位生存期为54.2天。TUNEL结果显示嵌合启动子联合放疗所致移植瘤的凋亡率高于其他对照组（P<0.05）。光镜下观察各治疗正常器官组织,未发现治疗相关毒性副反应改变。结论：复制缺陷型腺病毒介导的靶向自杀基因治疗联合放疗能有效抑制肝癌皮下移植瘤生长,延长裸鼠生存期,为肝癌的治疗提供了新的途径,具有良好的应用前景。
杨应斌[9]（2010）在《人骨髓干细胞源性恶性转化细胞的靶向清除》文中研究说明背景:人类骨髓干细胞（human bone marrow stem cells, hBMSC）移植给许多病人带来了希望的同时也带来了风险。干细胞治疗所带来的所有风险中,最严重而且最引人注目的是干细胞植入体内后发生恶性转化而致肿瘤的形成。因而制定一个干细胞植入后的可控制策略就成了各干细胞研究团队和临床医学研究者迫在眉睫要解决的问题。然而,制定这样的策略却不可避免地面临着许多挑战,包括高效肿瘤组织特特异性启动子的设计、获取大量hBMSC源性恶转细胞用于启动子的功能验证及体内外细胞毒性实验、恶性转化细胞异种移植成活率较低等。迄今为止仍然没有一个切实可行的方法来预防移入hBMSC发生致瘤性转化。目的:1.提高端粒酶启动子在hBMSC源性恶性转化细胞靶向转录活性的顺式修饰探讨,获取一种在端粒酶阳性细胞中具有高特异性和较强转录活性的hTERT启动子,为下一步预防干细胞发生恶性转化及靶向清除植入hBMSC源性恶性转化细胞打下基础;2.探寻一个在体外获取足够数量hBMSC源性恶性转化细胞的方法;3.建立一个为预防植入hBMSC发生恶性转化以及靶向清除发生恶性转化研究模型。方法:1. c-Myc结合元件对hTERT启动子的修饰:用化学合成方法在野生型hTERT（WThTERT）核心启动子片段（编码蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp）的3′端接入三个E-box序列,构建成修饰型hTERT（Mod1hTERT）启动子;分别用WThTERT和Mod1hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白（EGFP）及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS（端粒酶阴性）、以及人骨髓干细胞（hBMSC）中表达,比较并分析不同启动子在端粒酶阳性与阴性细胞中的表达强度。2.源于hBMSC的恶性转化细胞的体外扩增:从骨髓中分离培养人骨髓干细胞,并用流式细胞仪进行表型鉴定;然后用慢病毒转染和致瘤化学诱导剂BPDE处理共同诱导骨髓干细胞发生恶性转化;用PALA进行IC50筛选纯化瘤变细胞克隆;最后再用PCR、RT-PCR、Western blot等方法对慢病毒转染、细胞周期调控相关基因表达进行分析。3.下调hTERT启动子在hBMSC中转录活性的修饰:在Mod1hTERT启动子的上游接入4个骨髓锌指蛋白-2（MZF-2）转录因子结合元件,形成新的修饰型启动子命名为Mod2hTERT启动子;分别从大肠杆菌K12和质粒pEGFP-N3中通过聚合酶链式反应合成胞嘧啶转氨酶（CD）基因和绿色荧光蛋白（EGFP）基因;用化学合成法分别制备野生型hTERT、Mod1hTERT及Mod2hTERT启动子;将EGFP和荧光素酶（luciferase）报告基因分别亚克隆入慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOP中;将各启动子片段取代pLenti6/V5-D-TOPO中的CMV启动子片段;将重组慢病毒载体包装成病毒颗粒后转染正常人骨髓间充质干细胞（hBMSC）、慢病毒转染及化学致瘤剂BPDE处理后的人骨髓间充质干细胞（BR-hBMSC） ,以及PALA抗性的BR-hBMSC（PBR-hBMSC）;通过荧光相差显微镜观察EGFP表达和荧光素酶分析kit检测荧光素酶活性（luciferase activity）。4. 5-FC对hBMSC源性恶性转化细胞的细胞毒性实验:分别用不同浓度梯度的5-FC来处理体外培养的转入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod1hTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、CMV-luciferase-IRES-CD及prmoter（lack）-luciferase-IRES-CD融合基因的各组PBR-hBMSC细胞;用MTT法在体外测定不同浓度梯度5-FC对各组PBR-hBMSC的细胞毒性;转入WThTERT-luciferase-IRES-CD、Mod2hTERT-luciferase-IRES-CD、以及CMV-luciferase-IRES-CD的转基因PBR-hBMSC植入裸鼠的皮下一周后,腹腔注射5-FC 5㎎/天,并用活体荧光成像系统对植入细胞的生长状况进行观测。结果:1. c-Myc结合元件对hTERT启动子的修饰:在Mod1hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及hBMSC细胞组中没有观测到EGFP的表达;进一步用荧光素酶活性对启动子的转录活性进行定量分析表明,在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ、SGC7901和U2OS细胞株中,Mod1hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WThTERT启动子组（P<0.01）,而在端粒酶阴性的原代人成纤维细胞hBMSC及骨肉瘤细胞U2OS细胞中,Mod1hTERT启动子与WThTERT启动子的转录活性无显着性差别（P>0.05）。2.源于hBMSC恶性转化细胞的体外扩增: PCR结果表明,hBMSC在慢病毒介导下可以获得外源的遗传性表型;RT-PCR检测结果表明,细胞周期调控相关基因c-myc、bcl-2表达显着上调（p<0.01）,p53及mzf-2则显着下调（p<0.01）。3.下调hTERT启动子在hBMSC中转录活性的修饰:通过荧光相差显微镜观察结果表明,启动子Mod1hTERT和Mod2hTERT在PBR-hBMSC（慢病毒转染、BPDE处理后,具有PALA抗性的hBMSC）中的表达较强而在hBMSC和BR-hBMSC（慢病毒转染hBMSC）中只有微弱的表达;启动子CMV驱动的EGFP基因在所有的细胞中都有很强的表达; Luciferase activity分析结果表明,在293FT及PBR-hBMSC细胞中,Mod1hTERT及Mod2hTERT启动子的转录活性要显着高于WT-hTERT启动子的转录活性（Sig.<0.05）,而在hBMSC及BR-hBMSC（慢病毒转染hBMSC）中,Mod2hTERT的转录活性得到了有效的抑制（Sig.<0.05）。4. 5-FC对hBMSC源性恶性转化细胞的细胞毒性实验: MTT实验结果表明,当5-FC浓度100μM时,在Mod1hTERT细胞组中存活细胞占5.79%,Mod2hTERT细胞组中占6.53%, CMV细胞组中只有1.97%的细胞存活;而在相同条件下实验阴性对照组prmoter（lack）-luciferase-IRES-CD中,存活的细胞达到96.27%;活体荧光成像系统检测结果表明,在给药时间为O周时WThTERT-luciferase-IRES-CD细胞组的最大荧光信号比Mod2-luciferase-IRES-CD细胞组及CMV-luciferase-IRES-CD细胞组低4.33及5.29倍;而给药2至此周后,各组间的荧光信号强度差异不显着。给药4至周后,Mod2-luciferase-IRES-CD细胞组及CMV-luciferase-IRES-CD细胞组的荧光信号基本消失,WThTERT-luciferase-IRES-CD细胞组的荧光信号仍然存在。结论:1.在hTERT核心启动子的3′端增加E-box元件的数量可以提高hTERT核心启动子序列的肿瘤靶向转录活性。2. hBMSC在BPDE和慢病毒共同诱导后,用PALA的IC50筛选可以得到瘤变细胞克隆。3.野生型hTERT启动子经过c-Myc作用元件E-box进行修饰后,可以有效提高hTERT启动子在端粒酶阳性细胞中的转录活性.而经过修饰MZF-2结合位点修饰后,可以有效降低hTERT启动子在MZF-2表达阳性的正常hBMSC中的转录活性。4. c-Myc及MZF-2结合元件修饰的Mod2hTERT启动子在恶性转化的骨髓干细胞中有较强的靶向转录活性,同时该启动子驱动CD及luciferase表达的PBR-hBMSC在体内外能被5-FC特异性清除。终上所述,本研究不仅为骨髓干细胞源性的恶性转化细胞清除提供了一个实验方法,而且也为以后的干细胞临床移植研究提供了一个安全性研究策略。
王澎[10]（2010）在《hTERT启动子调控hNIS和hTPO基因联合转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究》文中研究表明研究背景与目的基因治疗技术是当前肿瘤研究中的热点,但面临着如何提高治疗基因的疗效和解决其靶向性表达的问题,而放射性碘对分化型甲状腺癌细胞则具有着高效、特异性的杀伤效果,其摄碘和贮碘的分子基础在于细胞膜上存在着人钠碘转运体（hNIS）和人甲状腺过氧化物酶（hTPO）。因此,本研究拟构建并应用重组腺病毒作为基因转移载体,将hNIS和hTPO基因联合转染入胶质瘤细胞,评估转染后细胞的摄碘能力,以及放射性碘在细胞内的代谢动力学变化,并进一步评价放射性碘对胶质瘤细胞的杀伤效果。同时在腺病毒载体中引入人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子,通过实验分析其靶向性引导hNIS在胶质瘤细胞中特异性表达的作用。方法1、使用RT-PCR和荧光定量PCR检测多种肿瘤及正常细胞中的hTERT表达活性；通过PCR及pMD-18T质粒载体对hTERT核心启动子进行扩增和克隆；以pGL3-Basic为载体构建含hTERT启动子和hNIS基因的重组质粒,并通过荧光素酶活性实验检测hTERT启动子在不同细胞中的启动效率2、应用Adeasy系统构建含目的基因的重组腺病毒载体,并对病毒进行滴度测定和转染细胞后表达产物的鉴定。3、使用重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS单独转染,及与Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞U251和U87,确定最适感染复数；进行摄125Ⅰ实验、125Ⅰ内、外流实验分析放射性碘在胶质瘤细胞内的代谢动力学变化；通过NaC104抑制实验和有机化测定实验验证hNIS和hTPO的作用；并进行克隆形成实验评估放射性131Ⅰ对不同转染组的细胞的杀伤效果。结果1、RT-PCR的结果显示在H460、U251、U87、ARO及FRO等细胞中均存在hTERT mRNA的表达,只是活性的高低不一；而在正常细胞MRC-5中无表达。荧光定量PCR的结果显示在胶质瘤细胞U251和U87内存在hTERT的高活性表达,与内参基因β-actin对照,其相对含量分别为0.18%和0.12%。2、成功构建并鉴定了含3种不同长度hTERT启动子序列（260 bp、456 bp及1453bp）的pMD-18T和pGL3重组质粒,并成功构建并鉴定了含260 bp hTERT启动子及hNIS基因的重组质粒pGL3-hNIS。3、荧光素酶活性实验结果显示,在上述肿瘤细胞中,3种hTERT启动子片段均可诱导荧光蛋白的表达,但其启动效率存在差异,其中pGL3-204中的启动子片段（260 bp）在FRO、H460和U251中启动效率最强,可以达到SV40启动子的80%。4、构建并纯化了重组腺病毒Ad-CMV-hTPO,空斑形成实验测定其滴度约为1.0×109pfu/ml,感染293细胞后行Western blot结果显示在110 kD处可见阳性反应条带,为表达的hTPO目的蛋白。5、摄碘实验结果显示,单独转染组（Ad-hTERT-hNIS）的胶质瘤细胞U251和U87均具有了较强的摄碘能力,分别提高了30.76倍和29.66倍；而联合转染组（Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO）的摄碘能力又均有轻度增高,分别为35.55倍和32.88倍。6、125Ⅰ的内、外流实验显示单独转染组的胶质瘤细胞能够快速的摄碘,峰值均出现在约40 mmin时；但碘的流出也较迅速,Te约为11-12 min；而联合转染组则可以在一定程度上延缓125Ⅰ的外流,Te约为18-20 mmin。7、过氯酸盐抑制实验结果显示,不同浓度的NaC104均可抑制转染后胶质瘤细胞对125Ⅰ的摄取,抑制率约为93.50-94.48%。有机化测定实验结果显示,联合转染组细胞内与蛋白结合的125Ⅰ量高于单独转染组,约为后者的3倍。8、克隆形成实验结果显示经131Ⅰ治疗后,联合转染组的克隆形成率降低得最为明显,U251和U87分别降低了11.37和14.52倍；其次为单独转染组,分别降低了5.52和6.05倍（P均<0.01）。结论1、在胶质瘤U251和U87等多种肿瘤细胞中均存在hTERT不同活性的表达,因此可以应用hTERT启动子引导治疗基因在胶质瘤细胞中的特异性表达。而且hTERT核心启动子具有较高的启动效率,可以替代全长启动子引导hNIS基因表达。2、携带hTERT启动子和hNIS基因,hTPO基因的重组质粒及腺病毒载体构建成功,应用Ad-hTERT-hNIS单独转染胶质瘤细胞后可以使其获得较强的摄碘能力,从而能够介导放射性碘杀伤肿瘤细胞。3、在单独转染hNIS基因的胶质瘤细胞中碘会快速的外流,与Ad-CMV-hTPO联合转染后可以增加与蛋白结合的碘量,使碘在细胞内的停留时间有所延长,从而提高放射性碘对胶质瘤细胞的杀伤效果。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.卵巢癌概述 |
| 2.溶瘤腺病毒 |
| 2.1 腺病毒的细胞进入、复制和免疫原性 |
| 2.2 肿瘤选择性复制腺病毒的研究现状 |
| 2.3 溶瘤腺病毒的临床发展 |
| 2.4 改造溶瘤腺病毒 |
| 3 凋亡素 |
| 3.1 凋亡素的序列和结构 |
| 3.2 凋亡素的IDP性质允许与细胞蛋白进行广泛的相互作用 |
| 3.3 凋亡素与DNA的相互作用 |
| 3.4 几种激酶介导凋亡素的细胞毒活性 |
| 3.5 通过细胞周期检查点感知细胞增殖状态 |
| 3.6 细胞是如何死亡的 |
| 3.7 凋亡素的传递方式 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 荧光素酶标记的人卵巢癌细胞的构建与鉴定 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的抑制作用和抑制途径的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的体内抑制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脂肪细胞分化研究进展 |
| 1.1.1 脂肪组织和脂肪细胞概述 |
| 1.1.2 脂肪代谢研究进展 |
| 1.1.3 研究脂肪细胞增殖分化的模型 |
| 1.2 PAT家族研究进展 |
| 1.2.1 PLIN1基因研究进展 |
| 1.2.2 PLIN2基因研究进展 |
| 1.2.3 TIP47基因研究进展 |
| 1.2.4 S3-12基因研究进展 |
| 1.2.5 非哺乳动物PAT家族蛋白研究进展 |
| 1.3 分子标记辅助育种 |
| 1.4 真核生物转录调控及重要转录因子研究进展 |
| 1.4.1 C/EBPs家族C/EBPβ |
| 1.4.2 E2F家族E2F1 |
| 1.4.3 PLAG基因家族PLAG1 |
| 1.4.4 Smads家族Smad3 |
| 1.5 多组学高通量测序研究进展 |
| 1.5.1 转录组测序研究进展 |
| 1.5.2 small RNA测序研究进展 |
| 1.5.3 miRNA-mRNA联合分析研究进展 |
| 1.6 脂质代谢的重要通路研究进展 |
| 1.6.1 AMPK信号通路的组成及调控机制 |
| 1.6.2 Wnt信号通路的组成及调控机制 |
| 1.6.3 PPAR信号通路的组成及调控机制 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PLIN1基因表达模式及其多态位点与秦川肉牛生长性状和肉质性状的关联分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 2.2.2 组织样品及血液采集与冷冻保存 |
| 2.2.3 血样DNA的提取、组织样品总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.2.4 实时荧光定量qRT-PCR检测 |
| 2.2.5 数据采集 |
| 2.2.6 多态位点检测 |
| 2.2.7 多态位点分型 |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 组织总RNA电泳检测 |
| 2.3.2 PLIN1 基因mRNA表达谱分析 |
| 2.3.3 牛PLIN1基因序列分析 |
| 2.3.4 PLIN1基因序列同源性分析 |
| 2.3.5 PLIN1基因系统进化树 |
| 2.3.6 PLIN1基因多态性位点遗传分析 |
| 2.3.7 PLIN1 基因SNP位点对秦川肉牛肉质和生长性状的影响 |
| 2.3.8 PLIN1基因的连锁不平衡和单倍型关联分析 |
| 2.3.9 PLIN1 基因SNP单倍型组合对秦川肉牛肉质和生长性状的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转录因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3对PLIN1基因的转录调控作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 3.2.2 启动子双荧光素酶报告载体的构建 |
| 3.2.3 细胞培养和报告载体的转染 |
| 3.2.4 转录因子的定点突变与基因干扰 |
| 3.2.5 凝胶阻滞试验(EMSA) |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PCR扩增牛PLIN1 基因启动子区域 |
| 3.3.2 重组质粒pGL3-PLIN1 Promoter的鉴定 |
| 3.3.4 双荧光素酶报告系统检测牛PLIN1基因启动子逐段缺失片段活性 |
| 3.3.5 PLIN1基因核心启动子区域关键转录因子的预测和分析 |
| 3.3.6 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 结合位点突变对PLIN1 基因启动子活性影响 |
| 3.3.7 siC/EBPβ,siE2F1,siPLAG1和siSMAD3 对各转录因子和PLIN1 基因表达量的影响 |
| 3.3.8 干扰C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 表达对PLIN1 基因的启动子活性的影响 |
| 3.3.9 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 转录因子特异结合PLIN1 基因启动子 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛PLIN1基因重组过表达腺病毒和干扰腺病毒包装、对牛脂肪细胞增殖、分化和脂类代谢作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要仪器与试剂耗材 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR分析 |
| 4.2.3 PLIN1基因过表达腺病毒的包装 |
| 4.2.4 PLIN1基因干扰腺病毒的包装 |
| 4.2.5 细胞免疫荧光 |
| 4.2.6 流式细胞技术分析细胞周期 |
| 4.2.7 细胞edu染色 |
| 4.2.8 蛋白质免疫印迹分析 |
| 4.2.9 油红O染色 |
| 4.2.10 甘油三酯(TG)测定 |
| 4.2.11 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 牛PLIN1 基因CDS区克隆与鉴定 |
| 4.3.2 牛PLIN1基因过表达腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装 |
| 4.3.3 牛PLIN1基因干扰腺病毒载体的构建与重组腺病毒包装 |
| 4.3.4 PLIN1基因细胞免疫荧光 |
| 4.3.5 PLIN1基因过表达和干扰腺病毒的效率检测 |
| 4.3.6 干扰和过表达PLIN1基因对牛前体脂肪细胞增殖的影响 |
| 4.3.7 过表达和干扰PLIN1基因对牛脂肪细胞分化的影响 |
| 4.3.8 过表达和干扰PLIN1 对牛脂肪代谢相关基因的mRNA表达水平的影响 |
| 4.3.9 过表达和干扰PLIN1对牛脂肪代谢相关基因的蛋白表达水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于转录组测序分析PLIN1基因对脂类代谢影响及关键基因挖掘 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 5.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存 |
| 5.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化 |
| 5.2.4 转录组测序(RNA-Seq)研究 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR分析 |
| 5.2.6 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 牛前体脂肪细胞总RNA质量检测 |
| 5.3.2 转录组测序数据质量评估 |
| 5.3.3 转录组测序的可变剪切(AS)事件分析 |
| 5.3.4 基因表达水平及RNA-Seq相关性分析 |
| 5.3.5 转录组差异表达基因筛选 |
| 5.3.6 转录组测序差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 5.3.7 转录组差异基因GO富集分析 |
| 5.3.8 转录组差异基因KEGG富集分析及调控通路 |
| 5.3.9 转录组差异基因与脂类代谢相关的KEGG通路分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 秦川肉牛脂肪细胞small RNA测序及转录组测序关联分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要仪器设备与试剂耗材 |
| 6.2.2 牛前体脂肪细胞的分离培养及冷冻保存 |
| 6.2.3 牛前体脂肪细胞的复苏、培养及诱导分化 |
| 6.2.4 small RNA测序(small RNA-Seq)研究 |
| 6.2.5 small RNA测序数据处理及生物信息学分析 |
| 6.2.6 数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 small RNA测序结果分析 |
| 6.3.2 参考序列比对结果 |
| 6.3.3 miRNA碱基偏好性 |
| 6.3.4 已知miRNA、新mi RNA预测、ncRNA和 sRNA分类注释统计的分析 |
| 6.3.5 miRNA表达及差异分析 |
| 6.3.6 整合分析RNA-seq与 small RNA-seq |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 实验结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 常见英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 端粒和端粒酶 |
| 1.1 端粒和端粒酶的研究历史 |
| 1.2 端粒 |
| 1.3 端粒酶 |
| 2 端粒酶逆转录酶基因(TERT) |
| 2.1 TERT作用机制 |
| 2.2 TERT调控机制 |
| 2.3 TERT外源性调控 |
| 3 CRISPR-Cas9基因组编辑技术 |
| 3.1 细菌获得性免疫系统 |
| 3.2 CRISPR-Cas9介导的基因组编辑 |
| 3.3 CRISPR-Cas9用于非编码元件筛选 |
| 3.4 CRISPR-Cas9技术在禽类上的研究进展 |
| 4 本文主要研究内容及意义 |
| 4.1 研究目的和意义 |
| 4.2 主要研究内容 |
| 第二章 鸭TERT基因,相对端粒酶活性和相对端粒长度的时空分布特点 |
| 1 引言 |
| 2 试验仪器与材料 |
| 2.1 鸭组织样品 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要试验仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 鸭各组织样品总RNA提取 |
| 3.2 RNA反转录成cDNA |
| 3.3 实时荧光定量PCR检测鸭TERT表达 |
| 3.4 鸭相对端粒酶活性(RTA)检测 |
| 3.5 鸭各组织DNA提取 |
| 3.6 鸭相对端粒长度(RTL)检测 |
| 3.7 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 TERT在鸭发育早期阶段的时空表达分布 |
| 4.2 相对端粒酶活性(RTA)在鸭发育早期阶段的时空分布 |
| 4.3 相对端粒长度(RTL)在鸭发育早期阶段的时空分布 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 鸭TERT基因5'-侧翼序列克隆和DNA甲基化调控 |
| 1 引言 |
| 2 试验仪器与材料 |
| 2.1 细胞 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要试验仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 鸭TERT 5'-侧翼序列克隆 |
| 3.2 5'-RACE确定转录起始位点 |
| 3.3 鸭TERT 5'-侧翼序列CpG岛预测 |
| 3.4 细胞组织DNA提取 |
| 3.5 亚硫酸氢盐测序法检测DNA甲基化 |
| 3.6 细胞培养及处理 |
| 3.7 基因的定量检测 |
| 3.8 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 鸭TERT基因5'侧翼序列扩增 |
| 4.2 5'-RACE鉴定新的转录起始位点 |
| 4.3 鸭TERT启动子区CpG岛预测 |
| 4.4 鸭组织TERT启动子区DNA甲基化分析 |
| 4.5 DNA甲基转移酶差异表达分析 |
| 4.6 鸭胚成纤维细胞分离及dTERT定量 |
| 4.7 甲基转移酶抑制剂诱导鸭TERT表达 |
| 4.8 组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导鸭TERT表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 CRISPR-Cas9技术内源性激活鸭TERT表达 |
| 1 引言 |
| 2 试验仪器与材料 |
| 2.1 细胞系及质粒 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要试验仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 EGFP表达载体构建 |
| 3.2 质粒转染 |
| 3.3 5’端系列缺失双荧光素酶载体构建 |
| 3.4 转录活性区域生物信息学分析 |
| 3.5 sgRNAs设计 |
| 3.6 LentiCRISPR v2-sgRNA表达载体构建 |
| 3.7 嘌呤霉素最适筛选浓度确定 |
| 3.8 慢病毒包装 |
| 3.9 慢病毒感染鸭小肠上皮细胞 |
| 3.10 TERT,RTA,RTL分析 |
| 3.11 CRISPR靶区域Sanger测序 |
| 3.12 sgRNA富集分析 |
| 3.13 LPS,Poly(I:C)细胞处理 |
| 3.14 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 启动子驱动的EGFP表达载体构建及在293T细胞中的活性检测 |
| 4.2 鸭TERT启动子双荧光素酶载体构建及转录活性检测 |
| 4.3 鸭TERT启动子转录活性区域生物信息学分析 |
| 4.4 LentiCRISPR v2-sgRNAs表达载体小库的构建 |
| 4.5 鸭小肠上皮细胞嘌呤霉素筛选浓度确定 |
| 4.6 荧光定量PCR检测基因编辑后鸭TERT表达 |
| 4.7 CRISPR靶区域Sanger测序分析 |
| 4.8 sgRNA富集分析 |
| 4.9 相对端粒酶活性(RTA)和相对端粒长度(RTL)分析 |
| 4.10 细胞表型和相关基因定量 |
| 4.11 LPS和Poly(I:C)处理诱导免疫反应 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 论文创新点及后续研究展望 |
| 1 创新点 |
| 2 后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 读博期间发表（录用）论文 |
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 人端粒酶逆转录酶（hTERT）可参与胃癌侵袭转移的调控 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 hTERT通过核转录因子c-Myc介导胃癌细胞肝素酶的表达上调 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 hTERT通过c-Myc促胃癌细胞肝素酶表达上调的分子机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 hTERT通过上调肝素酶的表达而促胃癌侵袭和转移 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 胃癌组织中hTERT、c-Myc和肝素酶的表达相关性及与预后的关系 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 端粒酶逆转录酶（TERT）：抗肿瘤治疗的新靶点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及获奖情况 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 治疗鼻咽癌的实验研究 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1节 文献综述 |
| 1.1 Egr-1 启动子在肿瘤基因治疗研究进展 |
| 1.2 端粒酶与肿瘤治疗的研究进展 |
| 1.3 hTERTC27 与肿瘤治疗研究进展 |
| 第2节 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第3节 结果 |
| 3.1 5-FU 对 pEgr-hTERTC27-GFP 的诱导效应 |
| 3.2 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对鼻咽癌 C666-1 的体外抑瘤实验 |
| 3.3 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对鼻咽癌的体内抑瘤实验 |
| 第4节 讨论 |
| 4.1 pEgr-hTERTC27-GFP 重组质粒的化学诱导表达特性 |
| 4.2 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对人鼻咽癌 C666-1 细胞的生长抑制作用及可能机制 |
| 4.3 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对鼻咽癌小鼠移植瘤生长的影响及可能机制 |
| 第5节 结论 |
| 参考文献 |
| 第2章 TCF3 抑制小鼠胚胎癌生长的实验研究 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1节 文献综述 |
| 1.1 诱导多潜能干细胞 iPS 研究进展 |
| 1.2 Wnt 信号通路与肿瘤关系研究进展 |
| 1.3 TCF3 的研究进展 |
| 第2节 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第3节 结果 |
| 3.1 TCF3 逆转录病毒载体构建以及稳定细胞株的建立 |
| 3.2 TCF3 过表达抑制小鼠 F9 胚胎癌细胞的体外研究 |
| 3.3 TCF3 过表达抑制小鼠胚胎癌移植瘤生长的体内研究 |
| 3.4 F9 胚胎癌 TCF3 过表达对 Oct4 表达的影响 |
| 第4节 讨论 |
| 4.1 TCF3 在逆转录病毒载体的克隆表达及意义 |
| 4.2 TCF3 对胚胎癌细胞生物学行为的影响及可能机制 |
| 第5节 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 细胞凋亡在肿瘤发病及治疗中的作用 |
| 2.1.1 凋亡概述 |
| 2.1.2 凋亡与癌症 |
| 2.1.3 癌症的凋亡靶向治疗 |
| 2.1.4 结论 |
| 2.2 腺病素介导的癌症基因治疗和病毒治疗 |
| 2.2.1 概述 |
| 2.2.2 组织特异性启动系统 |
| 2.2.3 癌症特异性启动子 |
| 2.2.4 转录调控的溶瘤腺病毒 |
| 2.2.5 癌症靶向载体的主要挑战 |
| 2.2.6 问题与展望 |
| 2.3 细胞死亡分析对药物的发现 |
| 2.3.1 概述 |
| 2.3.2 细胞自杀机制 |
| 2.3.3 细胞死亡检测 |
| 2.3.4 细胞凋亡检测 |
| 2.3.5 自噬检测 |
| 2.3.6 高通量筛选 |
| 2.3.7 非哺乳动物系统 |
| 2.3.8 上游调控通路 |
| 2.3.9 有丝分裂灾变死亡检测 |
| 2.3.10 问题与展望 |
| 第3章 研究内容 |
| 3.1 重组腺病毒的制备及对胃癌细胞 SGC7901 的抑制作用 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 重组腺病毒对胃癌细胞 SGC7901 的抑制方式 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 重组腺病毒对胃癌细胞 SGC7901 的抑制途径 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.3.3 讨论 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 重组腺病毒的体内抑瘤作用研究 |
| 3.4.1 材料与方法 |
| 3.4.2 结果 |
| 3.4.3 讨论 |
| 3.4.4 小结 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 hTERT启动子靶向性介导肿瘤基因治疗的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、引言 |
| 四、正文 |
| 第一部分 可放射诱导的肿瘤特异性嵌合启动子的构建及活性研究 |
| 第二部分 新型的嵌合启动子介导的自杀基因治疗的体外研究 |
| 第三部分 新型的嵌合启动子介导的自杀基因治疗的体内研究 |
| 参考文献 |
| 五、综述 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 六、博士期间文章 |
| 七、后记 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词注释 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出及研究意义 |
| 1.1.1 干细胞的概念 |
| 1.1.2 干细胞移植应用存在的问题 |
| 1.1.3 本论文研究的内容及意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 干细胞的致瘤性 |
| 1.2.2 肿瘤细胞的靶向转录 |
| 1.2.3 hTERT 启动子及自杀基因在基因治疗研究中的应用 |
| 1.2.4 肿瘤模型及细胞毒性实验 |
| 2 c-Myc 结合元件对hTERT 启动子的修饰 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 质粒、菌株和细胞 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 相关工具酶 |
| 2.2.4 主要实验设备与仪器 |
| 2.2.5 试剂配制 |
| 2.2.6 修饰型hTERT 启动子设计与合成 |
| 2.2.7 载体构建 |
| 2.2.8 感受态大肠秆菌的制备 |
| 2.2.9 质粒的转化 |
| 2.2.10 质粒扩增提取 |
| 2.2.11 细胞培养 |
| 2.2.12 脂质体介导细胞转染 |
| 2.2.13 EGFP 表达的激光共聚焦显微镜观察 |
| 2.2.14 Luciferase 表达活性检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 EGFP 在端粒酶阳性细胞中的表达 |
| 2.3.2 荧光素酶活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 c-Myc 元件修饰对hTERT 启动子转录活性的影响 |
| 2.4.2 脂质体介导外源基因转导 |
| 2.4.3 本章小结 |
| 2.4.4 研究中存在的不足与展望 |
| 3 源于hBMSC 恶性转化细胞的扩增 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 细胞及细胞株 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 hBMSC 表型鉴定 |
| 3.3.3 慢病毒转染和BPDE 诱导恶性转化 |
| 3.3.4 BR-hBMSC 筛选培养 |
| 3.3.5 PCR 检测 |
| 3.3.6 PALA 抗性细胞筛选培养 |
| 3.3.7 RT-PCR 测定 |
| 3.3.8 Western blot 分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 hBMSC 细胞形态观察及表型鉴定 |
| 3.4.2 慢病毒转染与BPDE 共同诱导hBMSC 恶性转化 |
| 3.4.3 恶性转化细胞相关癌基因表达的检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 P53 功能缺失与细胞恶性转化 |
| 3.5.2 慢病毒转染与细胞恶性转化 |
| 3.5.3 BPDE 诱导P53 突变 |
| 3.5.4 关于P53 突变的鉴定 |
| 3.6 本节研究的不足之处 |
| 3.7 本章小结 |
| 4 下调hTERT 启动子在hBMSC 中转录活性的修饰 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 荧光相差显微镜观察EGFP 表达 |
| 4.3.2 荧光素酶活性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 c-Myc 元件修饰及hTERT 启动子的转录活性 |
| 4.4.2 hTERT 启动子在骨髓间充质干细胞中的转录抑制修饰 |
| 4.4.3 关于本研究的不足之处及待研究问题 |
| 4.4.4 本章小结 |
| 5 体外及体内细胞毒性检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞或细胞株 |
| 5.2.2 实验动物 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.2.4 试剂及培养基 |
| 5.2.5 MTT 检测 |
| 5.2.6 细胞移植 |
| 5.2.7 活体荧光检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 细胞毒性体外实验(MTT) |
| 5.3.2 恶变细胞移植存活率 |
| 5.3.3 活体荧光体内检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 MTT 比色与细胞毒性检测 |
| 5.4.2 关于细胞移植的动物模型 |
| 5.4.3 活体荧光成像技术 |
| 5.4.4 不足之处 |
| 5.5 本章节小结 |
| 5.6 本章附表 |
| 6 结论与工作展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 6.2.1 hTERT 启动子的修饰的进一步研究 |
| 6.2.2 临床治疗模式的研究 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 作者在攻读博士学位期间所发表的论文 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、人端粒酶逆转录酶启动子的克隆及其启动效率的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 端粒酶活性检测结果 |
| 1.2.2 hTERT基因启动子序列的扩增和克隆 |
| 1.2.3 18T-hTERT重组质粒的鉴定 |
| 1.2.4 pGL3-hTERT重组荧光报告质粒的鉴定 |
| 1.2.5 pGL3-204-hNIS重组质粒测序结果 |
| 1.2.6 检测重组pGL3-hTERT质粒的启动效率 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 hTERT启动子和肿瘤 |
| 1.3.2 hTERT启动子和基因治疗 |
| 1.3.3 pMD~(TM) 18-T载体与TA克隆 |
| 1.3.4 阳离子脂质体转染细胞 |
| 1.3.5 荧光素酶与双荧光素酶报告基因技术 |
| 1.4 小结 |
| 二、重组腺病毒载体的构建及其鉴定 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 穿梭质粒pAdTrack-CMV-hTPO的构建 |
| 2.2.2 穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的同源重组 |
| 2.2.3 重组腺病毒Ad-CMV-hTPO的包装、扩增及纯化 |
| 2.2.4 重组腺病毒的纯化和滴度测定 |
| 2.2.5 重组腺病毒目的基因表达的检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 重组腺病毒基因载体 |
| 2.3.2 Adeasy腺病毒载体系统 |
| 2.3.3 腺病毒质粒的同源重组 |
| 2.3.4 重组腺病毒的分离、纯化 |
| 2.3.5 腺病毒滴度的不同表述方法及测定 |
| 2.3.6 Western blot检测中融合标签技术的应用 |
| 2.4 小结 |
| 三、hTERT启动子调控hNIS和hTPO基因联合转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 实时荧光定量PCR测定胶质瘤细胞中hTERT基因含量 |
| 3.2.2 重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS单独转染的最适MOI |
| 3.2.3 重组腺病毒Ad-CMV-hTPO与Ad-hTERT-hNIS联合转染的最适MOI |
| 3.2.4 Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞的摄~(125)I能力 |
| 3.2.5 Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞的~(125)I内流实验 |
| 3.2.6 Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞的~(125)I外流实验 |
| 3.2.7 Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞的NaClO_4抑制情况 |
| 3.2.8 Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞的 ~(125)I有机化测定实验 |
| 3.2.9 Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞的克隆形成实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 胶质瘤的治疗现状和放射性~(131)I治疗途径 |
| 3.3.2 hNIS和hTPO基因及其在肿瘤治疗中的应用 |
| 3.3.3 恶性胶质瘤细胞系与细胞培养 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测目的基因含量 |
| 3.3.5 腺病毒感染细胞与最适感染复数 |
| 3.3.6 hNIS及hTPO基因转染对胶质瘤细胞摄碘能力的影响 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 钠碘转运体的分子特征及其在肿瘤学中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
