张宁[1]（2021）在《猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸和荧光免疫层析试纸检测方法建立及初步应用》文中认为弓形虫是原生动物寄生虫的一种。据统计,全球已有三分之一的人口感染弓形虫。其中猫科动物是弓形虫的终末宿主。本研究通过对原核表达SAG1、GRA1-GRA7和GRA6-GRA2三种蛋白,利用ELISA方法选择敏感性高的蛋白,用于制备猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸和荧光免疫层析试纸。本研究通过分子生物学方法,根据大肠杆菌的偏爱性和方便蛋白纯化,优化合成了p ET28a-GRA1-GRA7、p ET28a-SAG1和p ET28a-GRA6-GRA2重组质粒。将其质粒分别转化至ER2566感受态细胞中进行表达,并优化表达条件以得到高表达量的蛋白,确定GRA1-GRA7蛋白大小约50 ku,在加入终浓度为1 mmol/L的IPTG和25℃时的条件下进行诱导表达可获得蛋白的高表达;SAG1蛋白大小约56 ku,在加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG和25℃时的条件下进行诱导表达可获得蛋白的高表达;GRA6-GRA2蛋白大小约64 ku,在加入终浓度为1 mmol/L的IPTG和25℃时的条件下进行诱导表达可获得蛋白的高表达。表达产物经纯化、Western Blot鉴定、ELISA法检测,最终确定GRA6-GRA2蛋白敏感性最高。猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸方法的建立本实验标记抗原为GRA6-GRA2蛋白、检测线为SPA蛋白、质控线为兔抗GRA6-GRA2,制备胶体金试纸主要用于检测猫弓形虫抗体。当1 m L的胶体金加入12μL 0.2 mol/L K2CO3为最适p H值;GRA6-GRA2蛋白标记量为3.75μg/m L。试纸条敏感性为1:256,并对已知的猫杯状病毒、猫细小病毒、猫疱疹病毒阳性血清进行检测,发现无交叉反应,进行重复试验时,重复性良好。此试纸对临床289份样本血清进行检测,结果并与间接血凝试剂盒进行对比,试纸条的阳性检出率为2.42%,间接血凝试剂盒的阳性检出率为2.07%,二者符合率为99.5%。猫弓形虫感染的荧光免疫层析试纸方法的建立本研究选用纯化后的GRA6-GRA2蛋白作为标记抗原。经优化后确定,100μL的荧光微球的GRA6-GRA2抗原最佳标记量为90μg;1 mg/m LSPA+1 mg/m L兔抗GRA6-GRA2抗体的包被比例为最佳包被比例;结果显示上样后5 min为最佳检测时间;此试纸条的敏感性达1:1024;并与已知的猫杯状病毒、猫细小病毒、猫疱疹病毒阳性血清进行检测,发现无交叉反应,进行重复试验时,重复性良好。荧光免疫层析试纸与弓形虫抗体间接血凝法对289份临床血清进行对比检测,阳性率分别为2.42%和2.07%,符合率为99.5%。
李璐[2]（2020）在《活性氧介导的NLRP3炎症小体在新孢子虫感染中的作用》文中研究说明犬新孢子虫（Neospora caninum）,简称新孢子虫,是一种寄生于细胞内的原虫,其能够引起中间宿主牛、羊等动物生殖障碍等疾病和终末宿主犬及犬科动物神经系统紊乱等疾病。新孢子虫感染呈世界性流行,每年给世界养牛业造成严重的经济损失。目前为止,市面上没有预防和治疗新孢子虫病的商品化疫苗和特效药,主要原因是人们对宿主与新孢子虫感染之间的免疫机制仍不清楚。近年来在宿主与新孢子虫感染之间的先天免疫机制研究上取得一定的成果。先天免疫系统通过宿主细胞表达的模式识别受体（PRR）识别入侵微生物的病原相关分子模式（PAMP）,随后介导机体发生先天免疫防御反应,如通过炎性反应释放细胞因子和趋化因子等过程对入侵的病原快速识别和清除。本实验室前期研究发现新孢子虫感染腹腔巨噬细胞显着上调NOD样受体中NLRP3基因,并激活NLRP3炎症小体来发挥抗新孢子虫的作用。NLRP3炎症小体激活能够分泌细胞因子IL-1β和IL-18,并介导其释放到细胞外以发挥下游的免疫效应,但新孢子虫感染是如何诱导腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化并不清楚。新孢子虫感染犬中性粒细胞能够诱导活性氧（ROS）依赖的胞外陷阱产生,因此我们猜想新孢子虫、ROS和NLRP3炎症小体之间是否存在联系,本研究探讨了新孢子虫感染对腹腔巨噬细胞ROS释放的影响,并通过干预ROS来研究其对NLRP3炎症小体活化及虫体增殖的影响,以阐明新孢子虫感染诱导的ROS对NLRP3炎症小体活化和虫体增殖的调控,从而以ROS介导NLRP3通路为靶标,寻找一种新型的抗新孢子虫感染的潜在药物,为新孢子虫病的治疗提供新的思路。主要研究内容如下:新孢子虫诱导腹腔巨噬细胞中ROS升高:分离小鼠原代腹腔巨噬细胞及纯化新孢子虫建立感染模型,然后检测胞内ROS水平。通过ROS抑制剂NAC预处理和不同数量的新孢子虫感染,经荧光染料DCFH-DA标记细胞内ROS。结果发现新孢子虫感染腹腔巨噬细胞后显着上调胞内ROS的释放,并与虫体感染数量呈正相关。ROS调控NLRP3炎症小体和巨噬细胞中新孢子虫增殖:首先经ROS抑制剂NAC预处理感染新孢子虫的巨噬细胞,通过检测IL-1β释放、NLRP3表达、细胞死亡释放的LDH和胞内荷虫量评估ROS对NLRP3炎症小体和胞内虫体增殖的影响。然后检测ROS诱导剂Pyrogallol（PG）和Piperlongumine（PL）对细胞中ROS释放和IL-1β分泌的调控,从中找到激活NLRP3炎症小体的ROS诱导剂PG。随后,进一步研究ROS诱导剂PG介导的NLRP3炎症小体对胞内虫体的调控。结果发现ROS抑制剂NAC降低LDH,IL-1β和NLRP3的产生,但增加细胞内荷虫量;通过ROS抑制剂NAC可得知新孢子虫诱导ROS调控NLRP3炎症小体和胞内虫体的增殖。在新孢子虫感染腹腔巨噬细胞中,ROS诱导剂PL随浓度升高反而抑制细胞ROS产生和IL-1β分泌。但是ROS诱导剂PG能够随剂量促进ROS和IL-1β的释放,并发现30μM PG对IL-1β、caspase-1、NLRP3表达和LDH的释放的促进最显着,同时细胞荷虫量显着降低,由此得到PG诱导ROS产生来调控腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化和抑制胞内新孢子虫增殖。NLRP3调控ROS介导的炎症小体及虫体增殖:通过ROS抑制剂NAC、ROS诱导剂PG和NADPH Oxidase抑制剂Diphenyleneiodonium chloride（DPI）分别处理WT和Nlrp3-/-巨噬细胞,检测其对WT和Nlrp3-/-细胞中ROS、IL-1β以及LDH的调控,再检测ROS抑制剂NAC、ROS诱导剂PG对WT和Nlrp3-/-细胞内荷虫量的影响。结果发现在WT细胞中,相比于新孢子虫感染组,抑制剂组NAC和DPI处理均降低ROS、IL-1β和LDH的释放,但诱导剂PG处理促进ROS、IL-1β和LDH的释放。而在Nlrp3-/-细胞中,DPI、NAC和PG在调控ROS释放的趋势同WT细胞时,却均未影响IL-1β分泌,表明新孢子虫可通过诱导NADPH依赖性ROS激活NLRP3炎症小体。在WT细胞中,NAC增加胞内荷虫量,PG降低胞内荷虫量;而在Nlrp3-/-细胞中,NAC处理也未改变胞内荷虫量,PG处理轻微降低胞内荷虫量,但仍显着高于PG处理的WT型组。因此表明NLRP3参与调控ROS介导的炎症小体和胞内虫体增殖,并且PG通过诱导ROS调控NLRP3炎症小体活化来发挥较好的抗新孢子虫作用。ROS诱导剂PG介导NLRP3炎症小体在宿主体内抗新孢子虫作用:建立新孢子虫感染WT和Nlrp3-/-小鼠模型,感染两天后向小鼠腹腔注射PG,对血清中IL-18和腹腔灌洗液细胞中荷虫量进行检测;进一步研究PG治疗新孢子虫感染的效果,将PG作用于WT小鼠,对小鼠体重、存活率、组织荷虫量及病理变化进行检测。结果发现在WT组中,PG显着上调血清中IL-18和降低腹腔灌洗液细胞中荷虫量;而在Nlrp3-/-组中,与仅感染组相比,PG处理未导致IL-18升高,腹腔灌洗细胞中荷虫量仅轻微降低,但仍显着高于PG处理的WT组。在进一步的动物试验中发现PG可显着降低新孢子虫感染引起的体重丢失,提高小鼠生存率,减少心、肝、脾、肺、肾和脑组织中的荷虫量和病理损伤。以上结果表明PG诱导宿主NLRP3炎症小体的活化来发挥抗新孢子虫作用,ROS-NLRP3通路能够成为寻找治疗新孢子虫病的药物靶标。综上所述,新孢子虫诱导的ROS在NLRP3炎症小体活化和控制寄生虫中起重要作用,并且ROS诱导剂PG介导NLRP3炎症小体活化来控制宿主内外新孢子虫感染,ROS-NLRP3通路能够成为寻找治疗新孢子虫病的潜在药物靶标。
朱雯苹,陈明华,马骥,竺狄芳,沈雁[3]（2019）在《桦褐孔菌多糖治疗小鼠弓形虫感染的疗效》文中研究指明目的观察免疫平衡调理剂（桦褐孔菌多糖）治疗小鼠弓形虫感染的疗效。方法雄性BALB/c小鼠40只,随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组以及对照组,每组10只。除对照组外,其余各组腹腔接种弓形虫速殖子,4 d后应用桦褐孔菌多糖治疗。对比各组小鼠免疫平衡调理剂治疗有效率、不良反应发生情况、肝功能指标以及T淋巴细胞水平。结果三组治疗有效率比较差异有统计学意义（P=0.015）,中等剂量组治疗有效率最高;各组小鼠肝功能指标ALT和AST水平比较差异有统计学意义（P<0.05）,中剂量组小鼠ALT和AST水平最低;各组小鼠脾脏CD4+和CD8+细胞水平比较差异有统计学意义（P<0.05）,中剂量组小鼠脾脏CD4+和CD8+细胞水平高于高剂量组和低剂量组;小鼠不良反应主要包括体温升高、肺炎、厌食和呕吐。结论免疫平衡调理剂桦褐孔菌多糖可改善免疫功能,治疗弓形虫感染有效,以中等剂量组疗效最为显着。
刘桂波[4]（2019）在《Dectin-1通过MAPK信号通路调控真菌性角膜炎巨噬细胞表型相关因子的研究》文中指出目的:研究在烟曲霉菌性角膜炎中,Dectin-1通过MAPK信号通路调控巨噬细胞表型相关因子的表达变化。方法:1、用烟曲霉菌刺激SPF级C57BL/6小鼠后,建立真菌性角膜炎1天、3天、5天模型,采用PCR检测M1型（TNF-ɑ、INOS、IL-6、IL-12）细胞因子和M2型（Arg-1、IL-10）细胞因子的表达变化。2、小鼠结膜下注射Dectin-1激动剂Curdlan和抑制剂laminaran,预处理1天,然后建立SPF级C57BL/6小鼠烟曲霉菌性角膜炎的动物模型,通过裂隙灯观察小鼠角膜炎炎症反应情况,并且记录其临床评分结果,采用免疫荧光法观察各组小鼠角膜中巨噬细胞数量变化;PCR检测巨噬细胞M1型细胞因子和M2型细胞因子mRNA水平表达变化。3、MAPK通路抑制剂（P38、JNK、ERK抑制剂）预处理RAW264.7细胞2h后,用烟曲霉菌刺激12h,PCR检测巨噬细胞M1型细胞因子和M2型细胞因子mRNA水平表达变化。结果:1、烟曲霉菌感染小鼠角膜1d、3d、5d后与对照组相比,M1型细胞因子和M2型细胞因子的mRNA水平表达明显升高（p<0.01）;2、Dectin-1激动剂Curdlan预处理组与PBS对照组相比,真菌感染后3天的角膜溃疡面积明显增大,炎症评分增高（p<0.01）,角膜组织中M1型细胞因子mRNA水平表达升高（p<0.01）,M2型细胞因子mRNA水平表达降低（p<0.01）;而Dectin-1抑制剂laminaran预处理组与PBS组相比,角膜溃疡面积明显减少,炎症评分降低（p<0.01）,M1型细胞因子mRNA水平表达降低（p<0.01）,M2型细胞因子mRNA水平表达明显升高（p<0.01）。3、MAPK通路抑制剂预处理组RAW264.7细胞与对照组相比,M1型细胞因子mRNA水平表达降低（p<0.01）,M2型细胞因子mRNA水平表达升高（p<0.01）。结论:在小鼠真菌性角膜炎中,Dectin-1可影响小鼠角膜巨噬细胞募集,通过MAPK信号通路调控巨噬细胞表型相关因子进而调节炎症反应。
王晶[5]（2019）在《基于“助脾散精”法探讨半夏泻心汤对T2DM患者肠道菌群及细胞免疫的影响》文中认为目的:观察2型糖尿病患者肠道菌群和细胞免疫功能的变化,探讨以半夏泻心汤为代表的助脾散精法对肠道菌群、细胞免疫功能的影响,并阐述助脾散精法纠正T2DM的可能作用机制。方法:本研究采用随机平行对照试验,收集符合纳入标准的2型糖尿病患者66例,随机分为试验组33例,对照组33例,由于出现病例脱落、剔除（试验组1例,对照组3例）,实际完成病例总数62例,其中试验组32例,对照组30例。试验组用半夏泻心颗粒组治疗,对照组用半夏泻心颗粒模拟剂治疗,两组患者均接受糖尿病饮食、运动调整等基础治疗及胰岛素皮下注射。以12周为疗程,评估两组患者在治疗前后临床症状和体征以及相关指标（包括FPG、2hPG、HbA1c、HOMA-β、HOMA-IR、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、肠道菌群）的变化,并记录治疗过程中出现的不良反应。所有数据用SPSS23.0软件进行统计学分析。结果:（1）中医证候积分比较:经治疗后,两组证候积分均有所下降,但治疗组患者症状明显改善,总有效率90.63%;对照组总有效率16.67%;治疗组总有效率优于对照组,差异有显着统计学意义（P<0.01）。（2）血糖指标比较:与治疗前相比,两组治疗后患者的FPG、2hPG、HbA1c较前均有明显下降,差异均有显着统计学意义（P<0.01）;治疗后两组间相比,FPG、2hPG差异有显着统计学意义（P<0.01）,HbA1c差异有统计学意义（P<0.05）。（3）胰岛功能方面比较:与治疗前相比,治疗组治疗后HOMA-β、HOMA-IR明显改善,差异均有显着统计学意义（P<0.01）,对照组治疗后HOMA-β、HOMA-IR改善不明显,差异不具有统计学意义（P>0.05）;与对照组相比,治疗组HOMA-IR明显改善,差异有显着统计学意义（P<0.01）,HOMA-β差异有统计学意义（P<0.05）。（4）细胞免疫:与治疗前相比,两组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均上升,CD8+均下降,差异均有显着统计学意义（P<0.01）;与对照组相比,治疗组CD4+、改善明显,差异有显着统计学意义（P<0.01）,CD3+、CD4+/CD8+差异有统计学意义（P<0.05）,CD8+无明显改善,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（5）肠道菌群:实验发现,从菌群多样性来看:与治疗前及对照组相比,治疗组治疗后肠道菌群多样性明显升高;从菌群丰度水平来看:在门水平上,治疗组可增加厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）的比例,降低变形菌门（Proteobacteria）比例;在目水平上,治疗组可使拟杆菌目（Bacteroidales）、乳杆菌目（Lactobacillales）比例增多,肠杆菌目（Enterobacteriales）、双歧杆菌目（Bifidobacteriales）比例减少;在属水平上,治疗组可使拟杆菌属（Bacteroides）、瘤胃球菌属（RuminococcaceaeUCG-002）、乳杆菌属（Lactobacillus）比例增多,埃希氏菌属（Eschenchia-shigella）比例减少。（6）安全性评价:治疗前后两组的三大常规、肝肾功能、心电图等指标均在正常范围内,整个研究过程无不良反应及不良事件发生,说明使用半夏泻心汤治疗2型糖尿病安全可靠。结论:（1）脾弱胃强是2型糖尿病的病机关键,亦是糖尿病患者免疫低下、肠道菌群紊乱的重要病机;（2）以半夏泻心汤为代表的助脾散精法治疗2型糖尿病可显着缓解患者的的临床症状,并且在降低患者血糖的同时,还可以改善患者的胰岛功能及胰岛素抵抗,提高患者的免疫功能,调节患者的肠道菌群,比单纯使用胰岛素治疗,更具有优势;（3）提高患者免疫功能,调节患者肠道菌群可能是半夏泻心汤治疗2型糖尿病新的作用机制,值得进一步探讨研究;（4）半夏泻心汤治疗2型糖尿病安全且无毒副作用。
张晓[6]（2018）在《雌二醇和孕酮对弓形虫侵染的影响及其机制》文中认为龚地弓形虫（Toxoplasma gondii）为细胞内寄生原虫,其宿主种类极为广泛。作为机会性病原,孕妇或妊娠动物由于其特殊的生理变化,更易感染弓形虫导致流产、死胎或胎膜早破等繁殖障碍性病状。雌激素能够调节生命体的多种生理机能,我们推测妊娠期宿主雌激素水平的波动可能是诱发弓形虫高感染性和致病性重要因素之一。因此,我们选取妊娠期分泌水平显着升高的雌二醇和孕酮,明确两种激素对弓形虫侵染细胞的影响及其机制。首先,雌二醇能够促进弓形虫Pru（Ⅱ型）株和VEG（Ⅲ型）株入侵多种宿主细胞,并增强了弓形虫对小鼠的致病性,而雌激素拮抗剂能够抑制这一效应,提示弓形虫中可能存在雌二醇的效应分子。进一步研究发现雌二醇可以进入弓形虫胞质并迅速通过cGMP依赖性蛋白激酶G（PKG）和磷酸肌醇磷脂酶C（PI-PLC）引起弓形虫胞内钙离子波动,促使微线体蛋白2（Tg-MIC2）分泌,提升弓形虫胞外运动和逸出能力,这可能是导致弓形虫的致病性增强的重要原因。此外,我们发现弓形虫基因组中存在性激素催化基因—羟类固醇脱氢酶（HSD）,Tg-HSD能够催化雌酮生成雌二醇。Tg-HSD过表达虫株对小鼠致病性增强,并提高了感染小鼠的雌二醇水平。其次,孕酮并不能促进弓形虫的入侵,反而明显抑制了虫体的生长,降低了弓形虫对小鼠的致病性。进一步的研究发现,孕酮虽然也能诱发弓形虫胞内钙离子释放并促进逸出,但孕酮抑制了 Tg-MIC2的分泌,并降低弓形虫的运动能力,使虫体逸出后难以侵入新细胞,最终降低了弓形虫的入侵和繁殖能力。除此之外,孕酮还诱发弓形虫分裂异常及内膜复合体形成异常、自噬相关蛋白8（Tg-ATG8）聚集等非正常现象,最终致使弓形虫凋亡率升高。随后,我们鉴定出弓形虫的孕酮膜受体（Tg-PGRMC）,敲除该受体基因降低了弓形虫（Pru）对小鼠的致病性,一定程度上减弱了孕酮对弓形虫的生长抑制作用。在此基础上,我们发现了Tg-PGRMC的互作蛋白—细胞色素P450（Tg-P450）,敲除该基因对弓形虫的生长及致病无显着影响,但过表达Tg-P450的弓形虫（GT1和Pru）对小鼠的致病性显着增强。这是由于Tg-P450具有微弱的CYP3A和CYP2B酶活性,这种特性使弓形虫在一定程度上能抵抗外源性药物的杀伤作用,使其生存能力更强。此外,还发现孕酮能降低Tg-P450的表达及酶活性,这可能是孕酮抑制弓形虫生存的另一重要原因。综上所述,雌二醇、孕酮以不同方式和机制影响弓形虫的入侵、增殖及致病。两种激素均能诱发弓形虫胞内钙离子的释放,影响弓形虫黏附、运动及逸出过程,从而改变了弓形虫的入侵、繁殖和致病力。随后,鉴定出的弓形虫孕酮膜受体Tg-PGRMC,与孕酮诱发的弓形虫生长抑制显着相关,其互作蛋白Tg-P450的表达及酶活性可被孕酮所抑制,继而降低弓形虫对外界的不宜生存因素的抵抗性。
于艳辉[7]（2017）在《C/EBPβ蛋白在小鼠抗弓形虫感染中的作用及分子机制》文中进行了进一步梳理弓形虫病是由刚地弓形虫胞内寄生引起的原虫病,是一种全球传播性的人畜共患病,目前全世界范围内约有三分之一人口被弓形虫感染。极强的传播性和高感染率,使其对世界范围内的人类和畜牧业的健康与发展产生了严重负面影响。宿主自身应对弓形虫感染的相关防御机制较为复杂,其具体的免疫应答反应及相应防御清除措施并不完全清楚。通常认为,凋亡、自噬等程序性细胞死亡过程是宿主细胞应对细菌、寄生虫等病原体的重要防御应答方式。借助这一“自杀”过程,多细胞生物体内的先天免疫系统便可自主应对病原生物的感染,通过细胞程序性死亡,降解并清除宿主细胞内的细菌、寄生虫等病原体。然而,有研究发现细菌、寄生虫等病原体会干扰凋亡、自噬通路相关蛋白的识别聚集,影响自噬体、凋亡小体等的形成,进而抑制宿主细胞的降解破坏。因此,宿主细胞自主降解与病原体对宿主细胞自主死亡的抑制之间存在着竞争关系,这一竞争关系的强弱影响着宿主自身对病原体感染防御应答能力。而目前关于宿主细胞程序性死亡与弓形虫感染之间具体的竞争机制所知甚少。因此,对弓形虫感染以及宿主自身防御应答反应等相关机制的进一步探讨为有效地预防和治疗弓形虫病提供重要的理论基础。CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）是一种重要的转录因子,属于转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPs）家族成员。C/EBPβ蛋白具有高度同源性,在人、牛、猪、鼠等多个物种的各部位组织器官中几乎均有表达,通过对目标靶基因的转录进行调控,在细胞生长、分化、凋亡以及机体代谢、免疫应答等发面发挥作用。已有研究表明,C/EBPβ的异常表达与机体炎症、内质网应激等病理改变相关,并且参与人类疾病的发生过程。同时C/EBPβ也参与细胞自噬的调节。在正常生理条件下,C/EBPβ可调节相应细胞自噬过程以维持机体营养和代谢的平衡。而在病理条件下,C/EBPβ可介导自噬的发生进而影响机体对于病原体的防御应答反应,参与炎症、肝纤维化、癌症等病理事件的发生。那么,C/EBPβ在弓形虫感染的宿主体内是否发生表达水平的变化?是否参与宿主对弓形虫感染的防御应答过程?其分子机理是否与受感染宿主细胞的程序性死亡有关?这些问题的回答对于进一步理解弓形虫感染及其预防机制具有重要意义。基于上述推测,以弓形虫感染小鼠模型及细胞模型为对象,分析C/EBPβ在弓形虫感染小鼠0体内及体外细胞中的表达情况,研究C/EBPβ表达变化对弓形虫感染与宿主机体抗感染反应的影响,以及C/EBPβ是否对弓形虫感染宿主细胞凋亡、自噬过程存在作用。以此进一步分析C/EBPβ是否对p38 MAPK、m TOR等细胞凋亡、自噬过程相关信号通路具有调控作用,研究其可能分子机制,为深入理解宿主机体抗弓形虫感染的应答机制提供新的依据。第一部分弓形虫感染宿主细胞对C/EBPβ表达的影响1.弓形虫感染细胞C/EBPβ的表达情况通过RH株、ME49株弓形虫与脑微血管内皮细胞、脐静脉内皮细胞、视网膜色素上皮细胞共培养构建弓形虫感染细胞模型,以q RT-PCR、Western blot法,分别于弓形虫感染再培养24 h后,检测受感染细胞中C/EBPβ分子的表达水平。结果表明,与未感染对照相比,受感染细胞中C/EBPβm RNA及蛋白表达水平均升高,且ME49株感染C/EBPβ表达水平升高明显。2.弓形虫感染小鼠组织中C/EBPβ的表达情况通过ME49株弓形虫感染小鼠构建弓形虫感染小鼠模型,以正常小鼠组织为对照,采用q RT-PCR、Western blot法,分别于弓形虫感染后2d、4d、6d后检测模型小鼠腹腔液、脑组织、眼部组织中C/EBPβ表达水平;分析C/EBPβ分子的表达差异与弓形虫感染小鼠时间变化相关性。结果表明,与对照相比,弓形虫感染小鼠腹腔液、脑组织、眼部组织中C/EBPβ的m RNA及蛋白表达水平均显着升高,且其表达变化与弓形虫感染小鼠时间呈现出一定正相关性。第二部分C/EBPβ在小鼠抗弓形虫感染中的作用1.C/EBPβ表达变化对小鼠细胞中弓形虫感染的影响构建重组Ad-C/EBPβ腺病毒及C/EBPβsi RNA,过表达或抑制弓形虫感染模型细胞中C/EBPβ的表达水平,分析其对弓形虫感染及受感染细胞中弓形虫速殖子增殖的影响。结果表明,转染Ad-C/EBPβ腺病毒及C/EBPβsi RNA后,弓形虫感染细胞模型中C/EBPβ的表达水平被显着上调或抑制。弓形虫感染再培养24 h后,C/EBPβ过表达组受感染细胞的比例较对照组显着降低,同时细胞中弓形虫速殖子数目也较对照组明显减少;相反,与对照组相比,C/EBPβsi RNA组受感染细胞比例及细胞中弓形虫速殖子数目都明显增加。2.C/EBPβ表达变化对小鼠弓形虫感染的影响构建C/EBPβ特异性si RNA,以腹腔注射法使弓形虫感染小鼠模型体内的C/EBPβ表达受到抑制,通过体征观察与显微镜检等方法,观察C/EBPβ表达抑制后弓形虫感染小鼠模型的病症变化及腹腔液中假包囊、速殖子变化情况。结果表明,C/EBPβ特异性si RNA处理弓形虫感染小鼠模型后,小鼠腹腔液中C/EBPβ的表达水平显着抑制。与对照相比,弓形虫感染后,C/EBPβ沉默组小鼠表现竖毛症状加重、行动能力、精神状态、腹泻症状等均更加严重;腹腔液中假包囊破裂加剧,游离速殖子数目急剧增加,弓形虫感染小鼠的总体病症有加重趋势。第三部分C/EBPβ在抗弓形虫感染中细胞凋亡与自噬的作用过表达或抑制弓形虫感染细胞模型中C/EBPβ的表达水平,分析其对弓形虫感染细胞增殖、细胞周期进程、细胞凋亡、细胞自噬的影响;通过自噬抑制或诱导分析宿主细胞自噬对弓形虫感染及弓形虫速殖子增殖的影响。结果表明,与对照相比,过表达或抑制C/EBPβ对受感染细胞的增殖及细胞周期进程尚未有显着影响。而C/EBPβ过表达组受感染细胞的凋亡及自噬水平均明显增加。相反C/EBPβ抑制组受感染细胞的凋亡与自噬则显着降低。此外,C/EBPβ过表达对受感染细胞比例与弓形虫速殖子数目的降低作用被自噬抑制剂3-MA所影响,而在C/EBPβ抑制组中受感染细胞比例与弓形虫速殖子数目的增长作用则被自噬诱导剂雷帕霉素所抑制。第四部分C/EBPβ调控细胞凋亡与自噬相关信号通路在抗弓形虫感染中的机制过表达或抑制C/EBPβ表达后,检测弓形虫感染细胞模型中mTOR、ERK、p38 MAPK、JNK等信号分子的活化水平。以m TOR、p38 MAPK等信号通路抑制剂或激活剂处理细胞,检测上述信号通路在C/EBPβ介导的弓形虫感染的调控过程中发挥的作用。结果表明,与对照相比,C/EBPβ过表达组受感染细胞中p38MAPK磷酸化水平显着上调,m TOR磷酸化水平明显降低;而C/EBPβ抑制组细胞中p38 MAPK磷酸化水平显着下调,m TOR磷酸化水平明显升高;两组中ERK1/2、JNK磷酸化水平均无明显变化。此外,C/EBPβ过表达对受感染细胞比例与弓形虫速殖子数目的降低作用被m TOR抑制剂加强,被m TOR激活剂与p38MAPK抑制剂所抑制。综上所述,弓形虫感染发生后,宿主机体主要组织内C/EBPβ的表达水平逐渐上调,C/EBPβ表达的变化能引起宿主细胞内p38 MAPK信号通路的活化,同时抑制m TOR信号分子的磷酸化水平,两种信号通路的激活与抑制,对宿主细胞的凋亡及细胞自噬过程均有促进作用,上述过程与C/EBPβ介导的抗弓形虫作用有关。以上研究表明,C/EBPβ通过调控下游信号通路的变化,促进宿主细胞凋亡与自噬的发生,进而抑制弓形虫对宿主细胞的感染,加速弓形虫体的清除
王丽娟[8]（2017）在《雌激素对Treg细胞凋亡和PD-1表达的影响及其与孕早期感染弓形虫致不良妊娠结局的关系》文中进行了进一步梳理刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种人畜共患的细胞内寄生原虫,能够感染几乎所有温血动物的有核细胞。免疫力正常的人感染弓形虫后大多无明显的症状,但免疫缺陷病人感染后易导致严重的弓形虫病甚至死亡。孕妇在妊娠早期初次感染弓形虫会导致流产、胎盘细胞凋亡等;而孕晚期感染一般不引起流产,但发生垂直传播的概率达到80%。妊娠期胎儿对于母体来说相当于一种半同种异体的移植,胎儿能够成功躲避来自母亲的免疫攻击,这得益于妊娠期母亲免疫环境中耐受机制的形成,其中抑制性免疫细胞和分子发挥着重要的调节作用,这有助于母亲全身和局部免疫耐受的形成。调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）是CD4+T细胞中发挥负性调节作用的一群细胞,在维持正常妊娠中起着重要作用。以往研究表明,正常妊娠后小鼠的Treg细胞增多,流产小鼠的Treg细胞数目减少,将正常妊娠小鼠的Treg细胞过继转移给有流产倾向的小鼠,可有效降低流产率。本实验室前期研究发现,弓形虫排泄-分泌抗原（Excreted-Secreted Antigens,ESA）可诱导孕鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞凋亡,减少了 Treg细胞数目,从而促进流产的发生。程序性死亡分子（Programmed death-1,PD-1）是主要表达在T、B淋巴细胞上的负性协同刺激分子,在维持正常妊娠中起着重要的作用。有研究表明,Treg细胞是通过表达免疫抑制分子PD-1和分泌细胞因子TGF-β、IL-10来发挥免疫抑制作用。此外,Treg细胞上PD-1表达增加会加强其抑制淋巴细胞活化的能力,从而起到保护胎儿的作用。封闭PD-1,Treg细胞的保护性作用消失,小鼠的流产率增高。有报道雌激素可以抗细胞凋亡并且促进Treg细胞上PD-1的表达,而PD-1+Treg具有更强的免疫负调控能力。雌激素受体敲除鼠体内PD-1的表达和Treg细胞的抑制功能都降低。在弓形虫致病中一个有趣的现象就是:弓形虫感染导致不良妊娠结局与母亲妊娠期间感染弓形虫的时间点有关,孕妇在妊娠早期初次感染弓形虫会导致流产等严重的不良妊娠结局;而孕晚期感染弓形虫一般不会引起流产。但是,其具体的机制尚未阐明。由于Treg细胞的数目和PD-1的表达在维持正常妊娠中具有重要作用,我们希望了解孕鼠在孕早期和孕晚期这两个不同的时间点感染弓形虫后,Treg细胞的数目和PD-1分子表达的变化,以及这种变化是否因为感染的时间点不同而存在差异,同时希望揭示造成这种差异的原因。本研究从体内和体外两方面分别设计实验,希望从Treg细胞的角度入手阐明孕早期、孕晚期感染弓形虫造成不同妊娠结局的原因。具体的实验结果如下:1.小鼠孕早期初次感染弓形虫易诱发流产分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,感染3天后剖杀,发现孕早期感染弓形虫的小鼠子宫胎儿吸收和出血现象明显,而孕晚期并没有观察到此现象。HE染色结果显示:孕早期感染弓形虫后母胎界面有明显的充血和炎症细胞浸润现象,而孕晚期感染组母胎界面则无明显变化。2.小鼠孕早期感染弓形虫后母胎界面上Foxp3的表达低于孕晚期分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,观察感染3天后其母胎界面上Foxp3的表达。我们观察到孕早期小鼠感染弓形虫后母胎界面上Foxp3的表达低于孕晚期感染小鼠。此外,感染组小鼠母胎界面上Foxp3的表达低于未感染组。3.小鼠孕早期感染弓形虫后CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率比孕晚期高,Treg细胞上PD-1的表达前者低于后者分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,观察感染3天后其脾脏和腹股沟淋巴结CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡率以及PD-1的表达。结果发现:孕早期和孕晚期感染弓形虫后,小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡率均升高,但孕早期明显高于孕晚期。此外,在未感染和感染孕鼠中,孕晚期Treg细胞上PD-1的表达都高于孕早期。4.小鼠怀孕后其体内的雌激素水平逐渐增高正常小鼠经过配种、检栓后,在孕早期、孕中期和孕晚期分别摘眼球取血,检测血清中雌二醇的含量,发现随着妊娠的进程,小鼠的雌激素水平逐渐增高,到分娩前达到高峰。这与人在正常妊娠时雌激素的变化趋势一致。5.雌激素在体外具有拮抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和诱导Treg上PD-1表达的作用用不同浓度的雌激素刺激小鼠脾脏组织单个核细胞,当雌激素浓度达到10-10 M时,CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率下降,Treg细胞上PD-1表达上升。此外,当雌激素受体激动剂浓度达到10-6 M时,其抗ESA诱导的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡作用最明显并且Treg细胞上PD-1的表达最高;而雌激素受体阻断剂能有效地封闭雌激素抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和诱导Treg细胞上PD-1表达的作用。6.通过向非妊娠小鼠皮下连续注射雌激素,可有效抑制弓形虫感染后CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡,同时上调PD-1+Treg的比例非妊娠小鼠经过两周雌激素注射后,其体内的雌激素水平达到了孕中期的水平。小鼠感染弓形虫后,脾脏和腹股沟淋巴结中的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率注射雌激素组比未注射雌激素组低,而PD-1+Treg 比例前者比后者高。此外,感染小鼠注射雌激素后脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2比例增高,促凋亡蛋白Caspase-3比例降低。这些结果提示,雌激素具有抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和促进PD-1在Treg细胞上表达的作用。综上所述,孕早期和孕晚期初次感染弓形虫会导致不同的妊娠结局,可能与不同孕期雌激素作用下调节性T细胞的数目和PD-1的表达差异有关。研究结果初步揭示了孕早期感染弓形虫更易发生流产的免疫学机制,即CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率更高,调节性T细胞数目更少,具有免疫抑制功能的PD-1+Treg细胞比例更低。这有助于认识弓形虫感染导致流产的原因及机制,为临床预防和治疗弓形虫导致的不良妊娠结局提供一定的参考。
常乐[9]（2013）在《犬新孢子虫NCLIV019770蛋白抗新孢子虫与弓形虫交叉保护效果的研究》文中提出新孢子虫病（Neosporiasis）是一种主要感染牛和犬由犬新孢子虫（?）（Neospora caninum）寄生于宿主体内所引起的致死性原虫病。新孢子虫可造成母畜的频繁流产、死胎,并可在家畜及伴侣宠物中进行垂直传播。全世界至少40%的奶牛流产是由新孢子虫引起的,因此该病被认为是世界性奶牛流产的主要病因之一。弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性寄生于细胞内的一种人畜共患寄生虫,可引起弓形虫病（Toxoplasmosis）。弓形虫病呈世界性分布,可感染大多数的哺乳动物及鸟类,且几乎能入侵所有宿主的有核细胞,并在其内进行增值。如怀孕期间感染弓形虫,则会引起流产或胎儿的发育不全。弓形虫感染免疫功能低下者后,如不及时治疗通常是致命性的。新孢子虫与弓形虫无论从结构特点还是在生物学特性上都有很多相似的地方,且这两种寄生虫都呈世界性分布,宿主范围广,两者均可感染牛、犬、猫等哺乳动物。其临床症状极为相似,都可引起家畜的繁殖功能障碍,导致母畜流产、产死胎或产弱胎。有实验表明,新孢子虫和弓形虫的共同宿主可同时感染这两种寄生虫。因此,有必要研发一种新孢子虫及弓形虫交叉保护疫苗。本研究用抗新孢子虫多克隆抗体筛选新孢子虫cDNA表达文库,获得了NCLIV019770基因,然后对该基因进行了原核表达,表达出的蛋白通过Ni亲和层析柱进行纯化得到NCLIV019770重组蛋白。将该蛋白三次免疫小鼠后分别测定血清中抗体滴度、细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平。而后分别进行新孢子虫和弓形虫攻虫试验,通过小鼠存活时间和脑组织包囊数量来评价该蛋白抗新孢子虫与弓形虫的交叉保护效果。结果表明,生物信息学分析NCLIV019770基因含有876bp的目的片段,可编码292个氨基酸。与新孢子虫hypothetical protein NCLIV019770同源性达到99%,与弓形虫AY223538.1同源性达到78%。用原核表达系统成功表达重组NCLIV019770蛋白（34kDa）；产物主要以包涵体形式表达,可被抗新孢子虫速殖子多抗识别。Western blotting检测进一步确定了该蛋白与抗弓形虫抗体具有交叉反应。用新孢子虫NCLIV019770重组蛋白免疫小鼠后,随免疫次数增加,血清中抗体滴度也逐渐增加,与对照组相比差异显着（P<0.05）。血清中IFN-γ含量有所升高,与对照组相比差异显着（P<0.05）,细胞因子IL-4水平没有明显变化,与对照组相比差异不显着（P>0.05）。感染新孢子虫小鼠脑组织荧光定量PCR结果显示NCLIV019770重组蛋白组与对照组相比差异显着（P<0.05）。减虫率为41.4%,活性虫体率为31.7%。观察40天三组小鼠无死亡。感染弓形虫后,NCLIV019770重组蛋白组与PBS对照组相比小鼠存活时间可延长8.8h。综上所述,新孢子虫NCLIV019770重组蛋白免疫可诱导小鼠产生较强的体液免疫和Thl型细胞免疫应答,对新孢子虫与弓形虫都有一定保护效果。
葛以跃[10]（2013）在《NK细胞的TLR/MyD88信号通路在刚地弓形虫感染早期IFN-γ产生过程中的作用研究》文中研究表明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是人畜共患细胞内寄生原虫,所致的弓形虫病呈世界性分布。刚地弓形虫感染所诱导的免疫应答比较复杂,免疫应答的结果与疾病的发生、发展密切相关。在机体免疫功能正常时,刚地弓形虫感染一般仅造成隐性感染状态,但在宿主免疫功能低下时可造成严重后果。妇女在妊娠期间感染刚地弓形虫可引起流产、胎儿先天性异常等多种不良妊娠结局。近年来,随着肿瘤患者、艾滋病人及宠物饲养爱好者的逐渐增多,刚地弓形虫的危害也日益突出,但至今仍无治疗弓形虫病的安全有效药物,因此,深入了解刚地弓形虫感染的免疫应答机制对于弓形虫病的防治具有重要意义。研究表明,NK细胞是刚地弓形虫感染早期IFN-γ的主要来源,在机体抵抗弓形虫感染的天然免疫应答中发挥着重要作用,而抗原提呈细胞（APCs）分泌的IL-12对NK细胞产生IFN-γ起关键性作用。进一步研究发现,髓样分化因子88（MyD88）依赖的Toll样受体（TLR）信号通路对APCs产生IL-12尤为重要,在IFN-y依赖的宿主抗弓形虫感染过程中发挥着非常重要的作用。一般认为,MyD88缺陷（MyD88-/-）、鼠对刚地弓形虫易感主要是由MyD88缺陷导致APCs分泌IL-12减少所致,但是最近有研究发现,MyD88-/-小鼠在刚地弓形虫感染后给予IL-12治疗并不能阻止其急性死亡。而树突状细胞MyD88-/-（DC-Myd88-/-）小鼠虽然在弓形虫感染后同样不能产生IL-12,但短期的IL-12治疗却可以使其NK细胞恢复产生IFN-y,阻止其急性死亡的发生。这些研究结果提示,在刚地弓形虫感染早期,除了APCs的TLR/MyD88信号外,NK细胞自身的TLR/MyD88信号通路在IL-12依赖的IFN-γ产生过程中可能发挥重要作用。为了验证这一假说,我们首先研究了在IL-12存在的情况下,刚地弓形虫抗原能否在体外直接刺激NK细胞活化并分泌IFN-γ,同时对NK细胞的杀伤功能进行了评估；其次,我们探讨了NK细胞的TLR/MyD88信号在刚地弓形虫抗原组合IL-12诱导NK细胞分泌IFN-γ过程中的作用,并对MyD88接头蛋白下游多个信号通路进行了分析；再次,我们研究了小鼠NK细胞的TLRs表达情况,并对刚地弓形虫抗原组份中能够诱导NK细胞分泌IFN-γ的效应分子进行了鉴定；最后,通过NK细胞过继转移试验建立NK细胞MyD88-/-小鼠模型,进一步证实NK细胞的TLR/MyD88信号通路在刚地弓形虫感染早期IL-12依赖的IFN-γ的产生过程中的作用。本研究获得如下主要结果：1.刚地弓形虫抗原和IL-12能够协同诱导高度纯化的NK细胞活化并分泌IFN-γ免疫磁珠结合流式细胞术从小鼠脾脏分选NK细胞（细胞纯度>99%）,采用刚地弓形虫抗原（排泄分泌抗原/可溶性虫体抗原,ESA/STAg）和IL-12进行刺激培养。培养上清的ELISA检测结果显示,刚地弓形虫ESA和STAg均能够诱导NK细胞分泌低水平的IFN-γ,加入外源性IL-12可显着提高NK细胞的IFN-γ分泌水平,且IFN-γ的分泌与刚地弓形虫抗原之间呈浓度依赖性。NK细胞II FN-γ mRNA检测结果亦表明,刚地弓形虫抗原和IL-12能够协同诱导NK细胞产生IFN-γ。然而与IFN-γ的产生情况不同,无论是否存在外源性IL-12,刚地弓形虫抗原均只能诱导NK细胞产生低水平的TNF-α。除了检测细胞因子的分泌情况外,我们同时还分析了NK细胞的活化状态,采用流式细胞仪检测NK细胞表面活化分子CD69和CD25的表达水平,结果表明,刚地弓形虫抗原和IL-12刺激均能够增加NK细胞表面活化分子CD69和CD25的表达水平,当刚地弓形虫抗原和IL-12联用时,CD69和CD25活化分子的表达水平最高。2.刚地弓形虫抗原处理不增加NK细胞的杀伤活性因为刚地弓形虫抗原组合IL-12能够诱导NK细胞活化并分泌大量IFN-γ,所以我们进一步评估了刚地弓形虫抗原处理对NK细胞杀伤活性的影响。结果显示,未刺激的NK细胞对小鼠淋巴瘤YAC-1细胞具有轻度杀伤作用,而刚地弓形虫抗原处理并不能进一步增加NK细胞对YAC-1细胞的杀伤功能,而且,刚地弓形虫抗原和IL-12在诱导NK细胞杀伤活性方面不存在协同效应。与杀伤功能试验结果相一致,流式细胞仪检测结果表明,刚地弓形虫抗原和IL-12处理同样不能增加NK细胞活化性受体NKG2D的表达水平。3.NK细胞的TLR/MyD88信号在刚地弓形虫抗原诱导其产生IFN-γ的过程中发挥关键性作用NK细胞MyD88接头蛋白阻断试验结果显示,在培养体系中加入MyD88接头蛋白抑制肽能够显着降低NK细胞的IFN-γ mRNA表达水平。我们进一步从MyD88-/-小鼠脾脏分选NK细胞,采用刚地弓形虫抗原组合IL-12进行刺激培养,结果发现,MyD88-/-的NK细胞在刚地弓形虫抗原刺激后其IFN-γ mRNA和蛋白表达水平均显着低于对照组水平。这些研究结果表明,MyD88接头蛋白在诱导NK细胞分泌IFN-γ的信号级联反应中发挥重要的作用。除了TLRs外,IL-1R/IL-18R家族同样为MyD88依赖性受体,为了评估NK细胞产生IFN-γ是否可能为流式细胞仪分选细胞中的少量污染细胞所产生的IL-1或IL-18所介导,我们在刚地弓形虫抗原组合IL-12对NK细胞进行刺激培养的同时,在培养体系中加入了抗小鼠IL-α、IL-1β和IL-18中和抗体,进一步评估NK细胞的IFN-γ分泌水平。结果发现：在培养体系中加入抗小鼠IL-1α、IL-1β或IL-18中和抗体并不能降低NK细胞的IFN-y分泌水平,提示刚地弓形虫抗原诱导NK细胞分泌IFN-γ并不依赖IL-1R/IL-18R家族信号,而是由TLR/MyD88信号通路所介导的.4. p38 MAPK、ERK、JNK和NF-κB多个信号通路参与了NK细胞IFN-γ的产生MyD88介导的信号通路可以活化多个蛋白激酶和转录因子,为了进一步明确哪些途径参与了刚地弓形虫抗原诱导的NK细胞IFN-γ产生,我们进行了信号通路抑制试验。结果发现,在培养体系中加入p38 MAPK、ERK、JNK和NF-κB抑制剂均可显着抑制刚地弓形虫抗原诱导的NK细胞IFN-γ产生,且具有浓度依赖效应。其中以NF-κB抑制剂的抑制效果最为明显,在较低的使用浓度（0.5～1μM）下即可产生将近100%的抑制效果。5.刚地弓形虫profilin和热休克蛋白70 （HSP70）组合IL-12诱导NK细胞分泌IFN-γ为了鉴定刚地弓形虫抗原组份中能够诱导NK细胞分泌IFN-γ的效应分子（TLR配体）,我们首先研究了NK细胞的TLRs表达情况,发现除了TLR5之外,C57BL/6小鼠脾脏NK细胞表达所有TLR1～4、TLR6-9和TLR11～13的mRNA。TLR s在发挥生物学效应时可能通过改变自身表达水平来调节其效应功能,为了鉴定在弓形虫抗原诱导NK细胞分泌IFN-γ过程中可能发挥作用的TLRs,我们分析了NK细胞在弓形虫抗原刺激后TLRmRNA表达水平的变化,结果显示,TLR1～9、TLR11～13的mRNA表达水平在抗原刺激前后均无显着变化。已有许多研究报道了其它免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞等）中的TLRs在弓形虫感染免疫应答中的作用,而且对应的虫源性配体已经明确。所以我们克隆表达了刚地弓形虫profilin和HSP70,并提取刚地弓形虫糖基磷脂酰肌醇（GPIs）,进一步研究这些已经明确的虫源性TLR配体能否诱导NK细胞分泌IFN-γ。结果表明,刚地弓形虫profilin和HSP70组合IL-12能够诱导NK细胞分泌大量IFN-γ,而刚地弓形虫GPIs不能刺激NK细胞产生IFN-γ。从MyD88-/-小鼠脾脏分选NK细胞进行刺激试验发现,刚地弓形虫profilin和HSP70同样通过NK细胞的TLR/MyD88信号通路来诱导其分泌IFN-γ。最后,通过制备profilin和HSP70多克隆抗体,对弓形虫抗原进行Western blot鉴定发现,profilin仅存在于STAg,而HSP70则同时存在于ESA和STAg中。6.NK细胞的TLR/MyD88信号通路在机体抗弓形虫感染的天然免疫应答中发挥重要作用我们通过NK细胞体内过继转移试验进一步证实NK细胞的TLR/MyD88信号通路在刚地弓形虫感染早期IFN-γ产生过程中的作用。结果显示,与过继野生型（WT）NK细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠（T、B、NK联合免疫缺陷）相比,过继MyD88-/- NK细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠在刚地弓形虫感染后,其血清IFN-γ水平显着降低,脾脏寄生虫荷也更高。同时,过继MyD88-/-N K细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠比过继野生型（WT）NK细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠在一定程度上更容易发生死亡。这些研究结果说明,NK细胞的MyD88信号在刚地弓形虫感染早期IFN-γ的产生过程中发挥重要作用。而已有研究结果表明,IL-1R/IL-18R信号在IFN-γ依赖的宿主抗弓形虫感染过程中并不发挥关键性作用,这就提示,NK细胞的TLR/MyD88信号通路在机体抗弓形虫感染的天然免疫应答,特别是早期IFN-γ的产生过程中发挥重要作用。综上所述,本研究通过体外、体内试验证实了NK细胞的TLR/MyD88信号通路在刚地弓形虫感染早期IFN-γ的产生过程中发挥重要作用。因为除了刚地弓形虫外,NK细胞产生IFN-γ在其它多种病原体感染的天然免疫应答中都发挥重要作用,所以,本研究结果将有助于我们从一个新的角度去认识这些病原体感染的天然免疫应答过程。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1 弓形虫诊断研究进展 |
| 2 弓形虫病诊断方法的研究进展 |
| 2.1 病原学诊断 |
| 2.2 免疫学诊断 |
| 2.3 分子生物学诊断 |
| 3 免疫层析试纸技术的研究进展 |
| 4 本实验研究的意义 |
| 第2章 弓形虫SAG1、GRA1-GRA7及GRA6-GRA2 基因的原核表达与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液的配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组质粒的表达 |
| 2.2.3 蛋白的纯化 |
| 2.2.4 ELISA检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组载体的鉴定 |
| 2.3.2 IPTG诱导剂的最佳使用量的确定 |
| 2.3.3 诱导温度的确定 |
| 2.3.4 GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2 蛋白纯化 |
| 2.3.5 ELISA检测蛋白敏感性结果 |
| 第3章 胶体金免疫层析试纸检测猫弓形虫抗体方法的建立及初步应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液的配制方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胶体金的制备 |
| 3.2.2 金标GRA6-GRA2 蛋白的制备 |
| 3.2.3 兔抗GRA6-GRA2 多克隆抗体的制备及其抗体的提纯 |
| 3.2.4 胶体金试纸条的制备 |
| 3.2.5 胶体金试纸条的评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胶体金透射电镜检测结果 |
| 3.3.2 兔抗GRA6-GRA2 多克隆抗体的提纯 |
| 3.3.3 胶体金最适p H的确定 |
| 3.3.4 胶体金最适蛋白标记量的确定 |
| 3.3.5 敏感性检测 |
| 3.3.6 特异性检测 |
| 3.3.7 临床样本检测结果 |
| 第4章 荧光免疫层析试纸检测猫弓形虫抗体方法的建立及初步应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要溶液的配制方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 微球垫的制备 |
| 4.2.2 NC膜的制备 |
| 4.2.3 荧光免疫层析试纸条的组装及结果判定 |
| 4.2.4 荧光免疫层析试纸方法的优化 |
| 4.2.5 荧光免疫层析试纸的评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抗原标记量的确定 |
| 4.3.2 抗体包被量的确定 |
| 4.3.3 最佳检测时间的确定 |
| 4.3.4 试纸条线性标准曲线的建立 |
| 4.3.5 荧光免疫层析试纸的敏感性 |
| 4.3.6 荧光免疫层析试纸的特异性 |
| 4.3.7 荧光免疫层析试纸的重复性 |
| 4.3.8 临床样本检测结果 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 论文中提出的新方法和新思路 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新孢子虫病的研究进展 |
| 1.1 病原学和生活史 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 致病性与临床症状 |
| 1.4 诊断与防治 |
| 1.5 新孢子虫感染与宿主先天免疫应答 |
| 第2章 NLRP3 炎症小体的免疫防御机制 |
| 2.1 NLRP3 炎症小体及其在抗感染中的研究 |
| 2.2 NLRP3 炎症小体活化的分子机制 |
| 2.3 活性氧的作用 |
| 2.4 活性氧介导的NLRP3 炎症小体在抗感染中的作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 新孢子虫诱导腹腔巨噬细胞中ROS产生 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂与耗材 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 新孢子虫与细胞 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养 |
| 1.2.2 VERO细胞的复苏、培养及传代 |
| 1.2.3 新孢子虫的复苏、培养和收集 |
| 1.2.4 多功能酶标仪检测ROS释放情况 |
| 1.2.5 流式细胞仪检测ROS释放情况 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞ROS水平的变化 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 ROS介导新孢子虫感染巨噬细胞诱导的NLRP3 炎症小体调控胞内虫体增殖 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、虫株与实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂配方 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ROS抑制剂NAC试验 |
| 2.2.2 ROS诱导剂对细胞毒性的检测 |
| 2.2.3 ROS诱导剂对NLRP3 炎症小体及胞内虫体增殖的影响 |
| 2.2.4 NLRP3在ROS介导的炎症小体及胞内虫体增殖中的作用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ROS抑制剂NAC对 NLRP3 炎症小体和虫体增殖的影响 |
| 2.3.2 ROS诱导剂对细胞活力的影响 |
| 2.3.3 ROS诱导剂对NLRP3 炎症小体的影响 |
| 2.3.4 NLRP3在ROS介导的炎症小体及胞内虫体增殖中的作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ROS诱导剂PG对宿主抗新孢子虫感染的调控 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、虫株与实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂与耗材 |
| 3.1.3 主要设备 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 NLRP3 炎症小体参与PG调控宿主抗新孢子虫的作用 |
| 3.2.2 PG在宿主体内抗新孢子虫感染的作用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PG介导NLRP3 炎症小体调控宿主抗新孢子虫的作用 |
| 3.3.2 PG在宿主体内抗新孢子虫的作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫平衡调理剂的制备 |
| 1.2.2 弓形虫感染模型的制备[12] |
| 1.2.3 实验动物分组和治疗 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结 果 |
| 2.1 免疫平衡调理剂治疗有效率 |
| 2.2 各组小鼠肝功能指标 |
| 2.3 各组小鼠脾脏T淋巴细胞水平对比 |
| 2.4 免疫平衡调理剂不良反应 |
| 3 讨 论 |
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验的动物 |
| 1.1.2 真菌的菌种 |
| 1.1.3 主要实验仪器和设备 |
| 1.1.4 实验的试剂和耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 烟曲霉菌的培养与菌丝抗原刺激液的制备 |
| 1.2.2 建立烟曲霉菌性角膜炎小鼠模型 |
| 1.2.3 小鼠角膜炎Dectin-1 激动剂Curdlan和抑制剂laminaran预处理实验 |
| 1.2.4 小鼠角膜炎MAPK通路抑制剂组预处理 |
| 1.2.5 小鼠烟曲霉菌性角膜炎临床评分 |
| 1.2.6 灭活菌丝刺激巨噬细胞实验 |
| 1.2.7 RT-qPCR实验步骤 |
| 1.2.8 免疫荧光染色观察小鼠角膜巨噬细胞数量变化 |
| 1.3 统计学处理 |
| 结果 |
| 2.1 Dectin-1 对小鼠真菌性角膜炎的炎症反应程度以及其临床评分的影响 |
| 2.2 Dectin-1 对小鼠真菌性角膜炎巨噬细胞募集的影响 |
| 2.3 Dectin-1 对小鼠真菌性角膜炎巨噬细胞表型相关因子的影响 |
| 2.4 MAPK信号通路对小鼠真菌性角膜炎巨噬细胞表型相关因子的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1.研究目的 |
| 2.临床资料 |
| 2.1 病例来源 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 2.5 终止试验标准 |
| 2.6 剔除标准 |
| 2.7 脱落标准 |
| 3.研究方法 |
| 3.1 样本量计算 |
| 3.2 分组设计 |
| 3.3 治疗方案 |
| 3.4 技术路线 |
| 3.5 观察指标 |
| 3.6 疗效判定标准 |
| 3.7 不良事件观察 |
| 3.8 统计方法 |
| 4.研究结果 |
| 4.1 基线结果比较分析 |
| 4.2 治疗结果分析 |
| 4.3 安全性指标 |
| 5.讨论 |
| 5.1 2型糖尿病从脾胃论治探微 |
| 5.2 以脾胃功能为中心,肠道菌群与糖尿病之间的关系 |
| 5.3 以脾胃功能为中心,免疫功能与糖尿病之间的关系 |
| 5.4 肠道菌群与细胞免疫之间的关系 |
| 5.5 助脾散精是治疗消渴病核心法则 |
| 5.6 研究结果分析 |
| 6.结论 |
| 7.问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1 半夏泻心汤在糖尿病中的应用 |
| 1.1 与胰岛素抵抗相关的外周因素 |
| 1.2 与胰岛素抵抗相关的中枢因素 |
| 1.3 半夏泻心汤对胰岛素抵抗的改善 |
| 2 半夏泻心汤对肠道菌群的影响 |
| 2.1 肠道菌群概述 |
| 2.2 单味药及半夏泻心汤复方对肠道菌群的影响 |
| 3 半夏泻心汤对细胞免疫的影响 |
| 3.1 细胞免疫的概述 |
| 3.2 单味药及半夏泻心汤复方对细胞免疫的影响 |
| 参考文献 |
| 附录--临床观察表 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 引言 |
| 研究意义 |
| 研究内容 |
| 1. 激素对弓形虫入侵、增殖及小鼠致病性的影响 |
| 2. 雌二醇和孕酮诱发的弓形虫胞内钙离子信号传导 |
| 3. 孕酮膜受体的鉴定及功能 |
| 4. Tg-P450的鉴定及功能 |
| 研究目标 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 性激素与弓形虫的致病性 |
| 2. 性激素通过调控宿主免疫影响弓形虫的致病性 |
| 3. 性激素与寄生虫的直接作用 |
| 4. 寄生虫对宿主性激素水平的调控 |
| 第二章 雌二醇和孕酮对弓形虫的入侵、增殖的影响 |
| 1. 摘要 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 雌二醇对弓形虫入侵、增殖及小鼠致病性的影响 |
| 3.2 孕酮对弓形虫入侵、增殖及小鼠致病性的影响 |
| 3.3 弓形虫Tg-HSD的鉴定及功能研究 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 雌二醇和孕酮对弓形虫胞内钙离子释放的影响 |
| 1. 摘要 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 雌二醇和孕酮诱发弓形虫胞内钙离子释放 |
| 3.2 雌二醇和孕酮影响弓形虫的运动、释放及微线体蛋白的分泌 |
| 3.3 雌二醇和孕酮影响弓形虫NO和ROS的产生 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 弓形虫Tg-PGRMC的鉴定及功能 |
| 1. 摘要 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Tg-PGRMC的鉴定与功能分析 |
| 3.2 Tg-PGRMC基因敲除虫株 |
| 3.3 Tg-PGRMC与孕酮诱导的弓形虫分裂异常 |
| 3.4 Tg-PGRMC与孕酮诱导的弓形虫自噬及凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第五章 弓形虫细胞色素P450的鉴定及功能 |
| 1. 摘要 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Tg-P450的鉴定及功能分析 |
| 3.2 Tg-P450基因调控虫株的构建 |
| 3.3 Tg-P450具有代谢外源药物的功能 |
| 3.4 孕酮影响Tg-P450表达及其酶活性 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 弓形虫病相关研究概况 |
| 1.1.1 弓形虫 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史 |
| 1.1.3 弓形虫的传播 |
| 1.1.4 弓形虫病与临床表现 |
| 1.1.5 弓形虫病的临床诊断 |
| 1.1.6 宿主对弓形虫的应答反应 |
| 1.2 C/EBPβ |
| 1.2.1 C/EBPβ 概述 |
| 1.2.2 C/EBPβ 表达的调控 |
| 1.2.3 C/EBPβ 功能 |
| 第2章 弓形虫感染宿主细胞对C/EBPβ 表达的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 弓形虫株 |
| 2.1.4 仪器和试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 弓形虫的获得与保存 |
| 2.2.2 弓形虫感染细胞模型的建立及分组 |
| 2.2.3 弓形虫感染动物模型的建立及分组 |
| 2.2.4 C/EBPβ 基因表达水平的检测 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 C/EBPβ在弓形虫感染细胞模型中的表达情况 |
| 2.3.2 弓形虫感染小鼠模型中C/EBPβ的表达情况 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 弓形虫感染小鼠模型 |
| 2.4.2 C/EBPβ 在弓形虫感染模型中表达的变化 |
| 第3章 C/EBPβ在小鼠抗弓形虫感染中的作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 弓形虫株 |
| 3.1.4 仪器和试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 构建C/EBPβ 沉默载体 |
| 3.2.2 构建C/EBPβ 过表达载体 |
| 3.2.3 弓形虫感染动物模型的分组与转染 |
| 3.2.4 弓形虫感染细胞模型的建立及分组 |
| 3.2.5 C/EBPβ 基因表达水平的检测 |
| 3.2.6 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 C/EBPβ表达变化对弓形虫感染小鼠细胞中的影响 |
| 3.3.2 C/EBPβ表达变化对弓形虫感染小鼠模型的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 C/EBPβ在抗弓形虫感染中细胞凋亡与自噬的作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 弓形虫株 |
| 4.1.3 仪器和试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 弓形虫感染细胞模型的分组与处理 |
| 4.2.2 细胞增殖检测 |
| 4.2.3 细胞凋亡检测 |
| 4.2.4 细胞自噬检测 |
| 4.2.5 细胞自噬对弓形虫感染宿主细胞变化的检测 |
| 4.2.6 C/EBPβ 基因表达水平的检测 |
| 4.2.7 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 C/EBPβ 对弓形虫感染细胞增殖的影响 |
| 4.3.2 C/EBPβ 对弓形虫感染细胞周期进程的影响 |
| 4.3.3 C/EBPβ 对弓形虫感染细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 C/EBPβ 对弓形虫感染细胞自噬的影响 |
| 4.3.5 细胞自噬对弓形虫感染宿主细胞变化的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 C/EBPβ调控细胞凋亡与自噬相关信号通路在抗弓形虫感染中的机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞 |
| 5.1.2 弓形虫株 |
| 5.1.3 仪器和试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 弓形虫感染细胞模型的分组与处理 |
| 5.2.2 C/EBPβ 基因表达水平的检测 |
| 5.2.3 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 C/EBPβ 表达对弓形虫感染细胞模型中信号分子的影响 |
| 5.3.2 信号通路参与C/EBPβ 对弓形虫感染的调控 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Treg和PD-1在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 主要英文缩写词 |
| 硕士期间参与的课题及发表的文章 |
| 致谢 |
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新孢子虫概述 |
| 1.1 新孢子虫发现史 |
| 1.2 新孢子虫生活史 |
| 1.3 新孢子虫传播途径 |
| 1.4 新孢子虫病临床症状 |
| 1.5 新孢子虫病病理变化 |
| 1.6 新孢子虫病诊断方法 |
| 1.7 新孢子虫的流行及控制 |
| 1.8 新孢子虫造成的经济影响 |
| 1.9 新孢子虫对人的感染 |
| 1.10 新孢子虫与弓形虫的比较 |
| 第二章 新孢子虫疫苗的研究进展 |
| 2.1 新孢子虫免疫学研究： |
| 2.2 新孢子虫疫苗研究进展 |
| 2.3 疫苗佐剂、免疫剂量及免疫方式 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新孢子虫cDNA表达文库筛选 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 新孢子虫NCLIV_019770基因原核表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 NCLIV_019770重组蛋白诱导小鼠免疫应答及对新孢子虫保护效果 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NCLIV_019770重组蛋白与抗弓形虫抗体交叉反应及对弓形虫保护效果 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 刚地弓形虫抗原组合IL-12对NK细胞的直接活化作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料和试剂 |
| 1.1. 主要材料 |
| 1.2. 主要试剂及溶液配制 |
| 1.3. 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 刚地弓形虫排泄分泌抗原(ESA)和可溶性虫体抗原(STAg)的制备 |
| 2.2 刚地弓形虫profilin和HSP70的克隆表达与纯化 |
| 2.3 刚地弓形虫糖基磷脂酰肌醇(GPIs)的提取 |
| 2.4 NK细胞的分选与培养 |
| 2.5 ELISA检测NK细胞培养上清中的细胞因子水平 |
| 2.6 流式细胞术(FCM)检测NK细胞表面分子 |
| 2.7 PCR、RT-PCR和Real-time RT-PCR检测 |
| 2.8 NK细胞杀伤功能试验 |
| 2.9 MyD88接头蛋白阻断试验和下游信号通路试验 |
| 2.10 刚地弓形虫profilin和HSP70多克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.11 刚地弓形虫抗原中profilin和HSP70的Western blot鉴定 |
| 2.12 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 刚地弓形虫抗原和IL-12处理对NK细胞细胞因子分泌的影响 |
| 2. 刚地弓形虫抗原和IL-12处理对NK细胞活化分子表达的影响 |
| 3. 刚地弓形虫抗原组合IL-12处理对NK细胞杀伤功能的影响 |
| 4. NK细胞的TLR/MyD88信号在弓形虫抗原诱导其产生IFN-γ过程中的作用 |
| 5. MyD88接头蛋白下游信号通路试验 |
| 6. 刚地弓形虫抗原组份中诱导NK细胞分泌IFN-γ的效应分子鉴定 |
| 第二部分 NK细胞的TLR/MyD88信号通路在机体抗弓形虫感染天然免疫应答中的作用研究 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料和试剂 |
| 1.1. 主要材料 |
| 1.2. 主要试剂及溶液配制 |
| 1.3. 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 NK细胞过继转移及弓形虫感染小鼠模型的建立 |
| 2.2 ELISA检测血清IFN-γ水平 |
| 2.3 免疫组化检测脾脏速殖子分布 |
| 2.4 Real-time PCR检测脾脏刚地弓形虫虫荷 |
| 2.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 不同NK细胞过继转移小鼠在刚地弓形虫感染后的血清IFN-γ分泌水平 |
| 2. 脾脏速殖子的分布情况 |
| 3. 脾脏刚地弓形虫虫荷定量 |
| 4. NK细胞的MyD88信号通路对刚地弓形虫感染小鼠存活的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
