抗体捕获ELISA检测IgM抗体在新疆出血热患者早期诊断中的应用

一、抗体捕获ELISA检测IgM抗体在新疆出血热病人早期诊断中的应用（论文文献综述）

闫芳域^[1]（2018）在《出血热相关病毒核酸检测技术研究》文中研究指明病毒性出血热（Viral hemorrhagic fevers,VHFs）是一组病毒性疾病,主要以出血、突起发热和休克为特征。出血热相关的病毒性疾病起病急,随着全球经济一体化及现代交通运输方式的快速发展,传染病跨境传播的风险不断加大,对相应病毒性传染病的组合检测技术提出了更高的要求。目前,实验室主要是通过病毒分离,检测病毒核酸、抗原以及特异性抗体等方法进行实验室诊断。病毒分离被认为是诊断病毒感染的金标准,但是由于耗费时间长,需要标本量大,无法进行多元的检测。本科室已建立了按照症候群和科属分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法,在分地区组合的检测方法上还有待完善。本实验的主要内容是针对按地区分组的出血热及其相关病毒病分组的核酸检测方法,包括实时荧光定量PCR法和液相芯片法。实时荧光定量PCR技术是一种定量分析的方法,这种方法在PCR反应体系中加入荧光基团,并同时利用荧光积累,实时监测整个PCR进程,最后通过绘制标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术的灵敏度高且特异性强,特点是省时、便利和快捷,并可以进行绝对或相对定量分析,是实验室常用的检测方法。液相芯片技术是1995年美国Lutminex公司开发的一种高通量检测平台,它可以定性或定量的在一个反应体系中检测100种不同分析物,其优点是节省时间、节省标本,高通量。目前较多应用于蛋白质和核酸的检测研究,如细胞因子的活动水平检测、肿瘤标记物、激素水平和PCR产物的检测等。为了满足出血热相关病毒性疾病跨境传播检出的需要,本研究拟建立按照地区分组的病毒核酸检测方法。首先将纳入病毒按照高发地区进行分组后,分别设计病毒的引物和探针。针对实时荧光定量PCR方法使用的探针为TaqMan探针,针对液相芯片技术的探针5’端添加12C连接臂后进行氨基修饰。使用体外转录得到的各个病毒RNA参考品对两种方法进行灵敏度的评价。1.利用RNA参考品进行分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各个检测的灵敏度,检出限在101～103拷贝/μl。利用50份未感染人血清和所有纳入病毒的模拟标本进行特异性评价,未见有扩增,表明此方法具有良好的特异性。最后通过重复性实验验证各组检测方法的稳定性,显示组内变异系数小于6.84%,组间变异系数小于8.33%。2.将探针偶联到羧基荧光微球后对RNA参考品分组进行的Tem-PCR扩增产物进行检测,评价检测方法的灵敏度和稳定性。利用50份健康人血清标本和30份未感染纳入疾病的病人血清进行特异度检测。结果显示所建立的基于荧光微球的核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102～106拷贝/μl,特异性为100%,组内变异系数均在18%以下,组间变异系数在25%以下,稳定性尚可。本研究建立了出血热及其相关病毒病的快速组合核酸检测技术,并对其进行了初步评价,对纳入病毒病的出入境检测和临床诊断具有积极意义。

邢骁跃^[2]（2017）在《基孔肯雅病毒免疫学检测方法的建立与初步评价》文中指出基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus,CHIKV）是单股正链RNA病毒,为披膜病毒科,甲病毒属;病毒颗粒呈T=4正二十面体结构,直径约60-70nm,在电镜下呈圆形。病毒主要有五个结构蛋白（C、E2、E3、6K、E1）,E1与E2形成异二聚体,每三个E1/E2异二聚体形成一个微小的凸起,每个病毒颗粒的表面共有80个相同的凸起。在包膜之下E1/E2异二聚体同C蛋白构成的衣壳相连。除结构蛋白外,还有四个非结构蛋白（NS1、NS2、NS3、NS4）主要在病毒复制过程中起辅助调节作用。人感染CHIKV后可引起以关节痛、发热、皮疹为主要症状的基孔肯雅热。大多数患者症状轻,其他症状数周之内可以自行痊愈,但关节痛往往持续存在,影响正常的生活、产生经济负担。少数患者会并发脑炎等重症危及生命。CHIKV通过伊蚊传播,伊蚊分布范围广泛;在2014年CHIKV传入美洲大陆后,在全球大部分地区均有流行报道。同我国临近的东南亚地区一直是基孔肯雅热的主要流行地区之一。我国于1986年首次成功分离CHIKV,2008年首次报道输入性基孔肯雅热,2010年首次由于输入性病例导致的本土基孔肯雅热的暴发流行。随着CHIKV在全球范围内扩大流行,我国仍有再次暴发基孔肯雅热的可能性。在疾病流行的预防控制工作当中,早期诊断十分重要,本研究基于以上目的拟建立血清CHIKV抗原检测的方法。通过杆状病毒表达系统生产CHIKV病毒样颗粒（VLP）,该VLP包含CHIKV的全部结构蛋白,在电镜下可以见到圆形颗粒。VLP与灭活的CHIKV有一致的抗原性,可以与抗CHIKV抗体良好结合。VLP由于不含有核酸不具有感染性,相比灭活病毒更加安全,可以在生物安全一级实验室中进行操作,降低了研究的生物安全风险。使用VLP免疫小鼠和家兔制备抗CHIKV的鼠免疫腹水和兔免疫血清。通过免疫荧光方法检测,显示抗体与病毒结合良好;通过ELISA方法检测抗体效价均在1:10万以上。1、以纯化鼠免疫腹水作为包被抗体,兔免疫血清作为捕获抗体,建立了检测CHIKV抗原的双抗体夹心ELISA方法。,该方法法具有较好的特异性和敏感性,在0.1ml中含50TCID50以上CHIKV的样本均可以用本方法检测出;模拟病人血清可被成功检出;登革热、肾综合征出血热病人及健康人血清进行CHIKV抗原检测,均为阴性;重复性良好板间变异小于10%,板内变异小于5%。2、用VLP为抗原建立了检测抗CHIKV IgG抗体的间接法ELISA,VLP拥有的良好抗原性可以替代灭活病毒作为抗原对IgG进行捕获检测。完善抗CHIKV IgM抗体的捕获法ELISA,检测病人急性期血清检测均呈阳性。两种方法重复性良好板间变异小于10%,板内变异小于5%。本研究建立了 CHIKV抗原和抗体检测方法,并进行初步评价,对于临床诊断以及流行病学调查有积极意义。

林方^[3]（2012）在《六种虫媒病毒蛋白芯片检测方法的建立》文中研究表明虫媒病毒（Arthropod viruses）是一大类通过嗜血节肢动物传播的病毒，通常引起人类发热性和脑炎样疾病，流行病学呈现明显的季节性与地域性，多爆发于蚊虫、蜱类等大量孽生的夏秋季节，严重危害人类健康与公共安全。由于一些虫媒病毒还能通过气溶胶途径传播，也是重要的病毒性生物战剂。虫媒病毒包括披膜病毒科、布亚病毒科、黄病毒科在内的多种病毒，其中以黄病毒属病毒感染的危害最大，在我国境内主要流行的虫媒病毒病包括流行性乙型脑炎、森林脑炎、登革热、新疆出血热，多是由黄病毒属病毒感染所致的传染病。虫媒病毒的致病机制尚不清楚，目前亦无有效的疫苗和抗病毒药物。早期、快速鉴定病原体是有效预防和控制虫媒病毒病的基础。由于虫媒病毒感染的临床表现与流行病学特点相似，因此，准确检测与鉴定病原体显得尤为重要。目前，对于虫媒病毒抗体的临床检测技术仍以传统的免疫荧光（IFA）和ELISA检测为主，一次反应只能检测一种病原体。本研究以黄病毒属的流行性乙型脑炎病毒（JEV）、森林脑炎病毒（TBEV）、登革病毒（DENV）、西尼罗病毒（WNV）和甲病毒属的西部马脑炎病毒（WEEV）、东部马脑炎病毒（EEEV）为研究对象，建立能同时检测六种虫媒病毒抗体的蛋白芯片检测方法，为虫媒病毒病的临床诊断提供新的手段。检测原理是将病毒特异性诊断抗原作为捕获抗原点样制备蛋白芯片，利用抗原抗体反应的原理检测血清中的病毒特异性抗体，再通过与荧光标记的二抗反应进行结果的分析与判定。目前，国内外尚未见到蛋白芯片同时检测多种虫媒病毒抗体的报道。本课题的主要研究结果如下：1、虫媒病毒候选诊断抗原的表达、纯化及鉴定本课题选择含有诱导中和抗体的抗原表位的重组抗原作为蛋白芯片检测技术的候选诊断抗原。研究表明，黄病毒属病毒的EDⅢ蛋白只包含诱导中和抗体的型与亚型特异性抗原表位，不含有诱导产生交叉反应抗体的抗原表位，NS1蛋白可诱导中和抗体，是目前疫苗研究与病毒免疫诊断的研究热点，PrM蛋白和NS3蛋白在黄病毒属中保守稳定，具有良好免疫原性，这两个蛋白均有作为病毒诊断抗原的报道。甲病毒属的E1蛋白含有中和性抗原决定簇，至少有4个非重叠的抗原表位，具有良好的免疫原性，是甲病毒属病毒免疫学检测的重要抗原之一。依据国内外对这两类病毒诊断抗原的研究进展，并结合我国病毒流行株的特点，本课题使用DNAstar与Primer5软件进行引物设计并添加适当的酶切位点，共设计了针对TBEV、JEV、DENV1、DENV2、DENV3、DENV4、YFV、WEE、EEE、WNV的17对PCR扩增引物。通过构建并鉴定重组表达质粒，在大肠杆菌中共表达了17个重组抗原，并采用镍离子亲和层析的方法进行了抗原的纯化。另外，利用灭活病毒免疫大白兔制备动物免疫血清，在完成其效价及特异性鉴定的基础上，采用ELISA方法通过动物免疫血清鉴定所表达的重组抗原的检测特异性，共获得12个具有良好特异性的诊断抗原，为进一步建立虫媒病毒蛋白芯片检测方法奠定了基础。2、蛋白芯片检测方法的建立及条件优化采用SpotArrayTM24点样仪将纯化后的17个候选诊断抗原作为捕获抗原点制于晶芯高分子三维基片上制备蛋白芯片，以兔IgG作为阳性对照，以含15%甘油的PBS为阴性对照，每个样本重复3点，点样后，玻片室温下自然风干4h。首先采用兔免疫血清与蛋白芯片进行反应，筛选可用于蛋白芯片检测方法的特异性良好的诊断抗原。通过分析，共筛选出12个特异性较好的重组抗原，与ELISA法筛选的结果一致，表明将不同病毒的诊断抗原在一张芯片上反应并不影响彼此的检测特异性。在此基础上，进行蛋白芯片检测条件的优化，优化结果显示，抗原点样浓度在0.125～0.6mg/ml之间可获得良好的检测特异性，血清检测范围可达到1：100～1：1000。蛋白芯片的最佳反应条件芯片封闭时间为2h、Cy3标记的羊抗兔IgG使用效价为1：1000、第二抗体反应时间为45min，蛋白样本稀释液中甘油的浓度为15%。在条件优化之后，再次用兔免疫血清进行蛋白芯片的验证，证明用优化后的反应条件及筛选到的12个诊断抗原可获得良好的检测特异性。3.蛋白芯片检测方法的考核与验证建立虫媒病毒蛋白芯片检测方法的最终目的是将其应用于虫媒病毒感染患者的临床诊断，为虫媒传染病的诊断和治疗提供重要的病原学依据。因此，在建立蛋白芯片检测方法之后，采用临床血清标本对芯片的实际检测效果进行了考核与验证。共收集了33份疑似森林脑炎病毒感染血清、8份疑似乙型脑炎病毒感染血清、22份疑似登革病毒感染血清，以及20份正常人血清作为阴性对照。首先，采用以灭活全病毒作为抗原的IFA方法对样本进行了检测，然后用筛选出的12个诊断抗原作为包被或捕获抗原，采用ELISA方法和优化后的蛋白芯片方法进行了平行检测，以比较其检测效果。在33份疑似森林脑炎病毒感染血清中，IFA方法检测结果为21份IgG抗体阳性，23份IgM抗体阳性；在重组抗原的平行检测中，ELISA和蛋白芯片的检测结果均为16份IgG抗体阳性、17份IgM抗体阳性，检测符合率达到100%；对8份疑似乙型脑炎病毒感染血清的检测中，IFA检测到8份IgG抗体阳性，6份IgM抗体阳性，ELISA法检测到4份IgG抗体阳性、5份IgM抗体阳性，而蛋白芯片法检测到5份IgG抗体阳性和5份IgM抗体阳性，检出率稍高于ELISA法；对22份疑似登革病毒感染血清的检测结果为：ELISA检测13份IgG抗体阳性，15份IgM抗体阳性，而蛋白芯片法检出14份IgG抗体阳性，15份IgM抗体阳性，检出率稍高于ELISA法。ELISA与蛋白芯片方法检测出的阳性血清标本编号一致，而且均在IFA检测的阳性标本范围中。经Kappa检验后,证明蛋白芯片与ELISA具有良好的一致性。正常人血清样本检测结果均为阴性。蛋白芯片法在检测出DENV抗体阳性的基础上，可以同时对标本进行血清学分型。以重组抗原为捕获抗原的蛋白芯片与ELISA法的阳性检出率均低于以全病毒为抗原的IFA方法。为提高蛋白芯片方法的敏感性，以TBEV为例，用EDⅢ与NS1抗原组合作为诊断抗原进行检测，共检出18份IgG阳性血清和18份TBEV IgM阳性血清，比单一TBE-EDⅢ抗原多检出IgG抗体阳性标本2份，IgM阳性标本1份，证明应用组合抗原可提高抗体阳性标本的检出率。通过对诊断抗原的鉴定与筛选以及对蛋白芯片检测条件的优化，本研究建立的6种虫媒病毒蛋白芯片检测方法获得了较好的检测特异性与敏感性，对临床血清标本的检测特异性达到100%，敏感性稍高于传统的ELISA法。进一步的研究结果表明，采用组合的诊断抗原，可以提高蛋白芯片的阳性检出率。与传统的IFA和ELISA抗体检测方法相比，蛋白芯片除具有检测通量高的优势外，还可以节约检测成本、缩短检测时间以及减少对抗原和临床样本的需求量。本课题首次建立了可用于同时检测6种不同虫媒病毒抗体的蛋白芯片方法，并可对DENV的不同血清型进行分型，为虫媒病毒病的临床诊断提供了新的技术手段。

杭小同^[4]（2010）在《登革病毒感染诊断方法的研究》文中认为登革病毒（Dengue virus）是登革热（Dengue fever, DF）、登革出血热（Dengue haemorrhagic fever, DHF）和登革休克综合症（Dengue shock syndromc, DSS）的病原体,其中以登革热最为常见。登革热广泛流行于热带和亚热带地区,是分布最广,发病最多,危害较大的一种传染病。近几十年来,登革病毒的传播方式由具有较长间歇期的间歇性短暂的一种型别登革病毒流行演变为每年多个地区暴发流行并且持续流行多种血清型的登革病毒感染,登革病毒的流行区域呈不断扩大趋势,对非洲、美洲、地中海东部、东南亚及西太平洋等热带和亚热带地区100多个国家的25亿人口构成威胁。我国,具有较高密度伊蚊等蚊媒地区十分广大,每年都至少有数百例病例报告,输入性病例每年在大部分省份都有发生,有效控制登革疫情传播和登革病毒本土化的任务艰巨。实验室诊断,尤其是对登革病毒感染的早期诊断是疾病监测和有效预防控制重要前提。目前有限的商业化抗登革病毒IgM/IgG检测试剂仍然存在敏感性和特异性问题,而且价格昂贵,不适宜我国及周边发展中国家使用,基于核酸的检测方法也存在规范化和标准化的问题,因此,用于登革热检测和监测的有效的病毒核酸和蛋白诊断试剂及标准操作程序已成为我国当前登革热预防控制任务需要迫切解决的问题。本研究主要目,的建立基于病毒核酸的检测方法、基于检测病毒抗原的检测方法和基于病毒特异性抗体的检测方法等。一,建立登革病毒RT-PCR核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品,规范基于核酸的检测方法。将筛选确定的登革病毒核酸检测靶基因序列间引入与登革病毒无关基因序列构建内参照检测靶靶标,使之与登革病毒检测靶标片段大小明显不同,易于区分,可作为内参照品形式存在,同时,为了方便对内参照品的定量分析,在内参照品检测靶标的下游通过核糖体内部进入位点基因介导的荧光蛋白报告基因,形成内参照品靶标定性定量指示盒。通过慢病毒包装系统,将参照品靶标定性定量指示盒包装成有包膜的假RNA病毒颗粒,靶标下游报告基因的存在,使内参照照品制备过程中的定性指示和初步的定量分析,十分方便。收获假病毒颗粒,定量分析后加入到到待检样本和模拟样本中一起进行评价和应用。结果显示所构建的登革病毒病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品能够充当RT-PCR法检测不同型别登革病毒的内参照品,与登革病毒十分接近,扩增片段大小和病毒目的扩增片段明显不同,易于区别,能够监测反应的整个过程。本研究所建立的登革病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照系统,容易制备,保存简单,易于改造为多种RNA病毒的核酸检测的内参照。二,建立登革病毒一步法多重实时定量RT-PCR分型检测方法通过对Genbank所能获取的登革病毒全基因序列和部分序列使用Bioedit软件进行比对,每个型别病毒设计3组登革病毒分型TaqMan探针及各型相应的引物,以标定好效价的登革病毒上清进行梯度稀释作为评价检测限的模拟样本。经比较研究确定了最佳探针引物,其对1-4型革病毒上清的检测限分别是0.1TCID50/ML,0.01 TCID50/ML,0.001TCID50/ML,0.001TCID50/ML。特异性分析证明该套探针和引物具有型特异性,各型病毒之间没有交叉反应,对于汉坦病毒和乙脑病毒等其他科属病毒也未出现非特异扩增。三,建立基于重组登革病毒EⅢ蛋白的登革病毒特异性IgM抗体检测方法。血清中登革病毒特异性IgM／IgG检测试剂的敏感性和特异性一直是困扰目前商业化登革病毒特异性抗体检测试剂的难题。本研究中通过将4型登革病毒E蛋白Ⅲ结构的重组交联,形成融合抗原rEⅢ蛋白。在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功表达1-4型登革病毒融合rEⅢ蛋白,SDS-PAGE可溶性分析结果显示表达形式为包涵体。包涵体复性采用稀释复性的方法,复性后蛋白依次经金属螯合层析柱和弱阴离子交换柱纯化,SDS-PAGE结果显示目的蛋白有较高的纯度。Western bolt结果显示表达的重组蛋白均能于登革热感染病人血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。采用改良过碘酸盐氧化法rEⅢ融合蛋白进行辣根过氧化物酶（HRP）标记,酶标抗原经分子筛纯化后,初步建立了IgM捕获ELISA的诊断方法,通过棋盘法确定最佳的酶标抗原稀释度和血清稀释度后,rEⅢ-ELISA法与panbio公司MAC-ELISA试剂盒检测结果的符合率为91.11%。使用自研方法检测5份乙脑IgM阳性血清、20份流行出血热病人及20份健康人血清结果均为阴性,说明自研方法的特异性均较好。

吕志^[5]（2009）在《新疆蚊传虫媒病毒调查 ——Tahyna病毒的分离及当地人群感染调查》文中进行了进一步梳理新疆位于中国西北边陲,是中国面积最大的省级行政区。新疆陆地边境线长,周边与俄罗斯、印度、蒙古等八个国家接壤。自北向南,阿勒泰山脉、天山山脉和昆仑山脉将新疆分隔成北疆和南疆,使新疆在气候、地理、生境和物种等方面存在多样性并与内地差异明显。新疆蚊虫媒介种类较多,与人畜关系密切。近年来在新疆进行的虫媒病毒调查中从蚊和蜱中分离到辛德毕斯、东方马脑炎、西方马脑炎等多种虫媒病毒。然而,这些病毒多分离自气候温润、蚊虫密度较大的北疆,南疆地区虫媒病毒调查情况少有报道。然而,南疆地区病毒性脑炎流行病学监测结果显示,在蚊虫活动高峰的夏秋季节,当地存在病因不明的发热和病毒性脑炎的流行。然而,我国其他地区流行的在夏季引起病毒性脑炎的乙脑病毒在新疆尚未发现。这些信息提示当地流行的虫媒病毒及相关疾病可能与内地存在较大差异。因此,对新疆地区进行系统的虫媒病毒病原学的调查及相关病毒的人群感染的血清流行病学研究对于预防和控制当地虫媒病毒病均具有重要意义。本课题分别对我国新疆南,北疆地区连续3年开展虫媒病毒调查,在采集的蚊虫标本中分离到大量虫媒病毒,其中首次在我国分离到布尼亚病毒科Tahyna病毒,并证明当地不明原因发热患者中存在该病毒IgM抗体阳性,文章发表在Emerg Infect Dis.2009,15（2）:306-309。1.新疆蚊传虫媒病毒调查2006年、2007年和2008年7～8月在新疆地区喀什地区的伽师县、和田地区的民丰县、巴音郭楞蒙古自治州的尉犁县和博湖县、伊犁哈萨克自治州的伊宁县、阿勒泰地区的阿勒泰市和布尔津县、塔城地区的沙湾县以及哈密地区哈密市采集蚊虫标本21405只,绝大多数为背点伊蚊标本,分222批进行研磨和捕痉掷搿＠米橹嘌赴ǚ掷氩《?结果分离到50株阳性分离物,均来自背点伊蚊标本。经过系统鉴定。共得到3株Tahyna病毒（Tahyna virus,TAHV）、41株辽宁病毒（Liaoning virus,LNV）和6株待鉴定阳性分离物。2.新疆新分离病毒的分子生物学特征研究本次研究对分离自喀什地区伽师县,巴音郭楞蒙古自治州的尉犁县的3株TAHV进行序列测定和分子特征分析,测定了这3株（XJ30625、XJ0708和XJ0710）的全基因组序列（L、M和S节段编码区序列）。对TAHV病毒系统进化分析和核苷酸与氨基酸差异分析结果显示,TAHV各节段中S节段编码区同源性最商,中国株之间核苷酸同源性99.2-99.6%,氨基酸同源性为100%,与国外毒株相比,核苷酸同源性为92.2-92.9%,氨基酸同源性均为98.3%;L节段序列分析显示,中国株之间核苷酸同源性为96.3-97.4%,氨基酸同源性均为100%,与国外毒株相比核苷酸同源性81-82.5%,氨基酸同源性97.8%,提示多为同义突变:对于病毒M节段,我国新疆分离株之间核苷酸同源性80.7-96.1%,氨基酸同源性92.6-99%:与国外分离株核苷酸同源性80.1-82.1%,氨基酸同源性92.6-94.2%。S和L节段中国株之间各节段同源性较高,而与欧洲流行株Bardos 92同源性较低,体现了病毒的地域分布特征。M节段中国株之间存在较大变异,提示中国分离株可能存在多个亚型。结合噬斑滴定试验结果,推测这一节段的变异可能会影响TAHV噬斑形态及病毒生物学行为。本次试验对41株分离自喀什地区、巴音郭楞蒙古自治州和阿勒泰地区的LNV的第10和第12节段的进行序列测定、系统进化分析和核苷酸、氨基酸差异分析。结果显示,新疆地区分离的LNV毒株同源性较高,第十节段核苷酸同源性均大于94%,而与该病毒东北原型株核苷酸同源性仅75%左右。依据第10节段核苷酸序列信息可以将LNV分成四个亚型。南疆地区LNV属于基因Ⅰ型,而北疆阿勒泰地区分离到Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅱ型LNV与东北地区原型株Ⅲ和Ⅳ型存在着许多特征性核苷酸改变,说明Ⅱ型和Ⅲ、Ⅳ型病毒之间可能存在传播关系。并且,推测在这两个地区之间的省区同样存在LNV流行的可能。而且,流行的病毒型别应该介于Ⅱ型和Ⅲ型之间。本研究对蚊虫标本中分离的6株引起C6/36细胞病变的病毒分离物进行了鉴定,结果显示,分离物对多种虫媒病毒组特异性免疫血清不产生反应,应用甲病毒、黄病毒、布尼亚病毒以及呼肠孤（环状病毒、Seadonavirus等）病毒属特异性引物的基因扩增反应也呈阴性,提示新分离病毒可能不属于以上病毒属,进一步的鉴定工作正在进行中。3.新疆夏季不明原因发热及脑炎患者虫媒病毒感染调查为了明确TAHV与当地人群疾病的关系,本研究连续2年在新疆采集不明原因发热病人急性期血清标本964例,应用IFA方法进行血清TAHV感染调查。其中,喀什地区采集不明原因发热患者742例,检测IgM抗体阳性率5.26%（39/742）,IgG抗体阳性率18.27%（59/323）;在北疆地区的伊犁哈萨克自治州察布查尔锡伯自治县采集不明原因发热患者标本222例,并未发现TAHV IgM抗体阳性者。这些结果提示,新疆南疆喀什地区不明原因发热人群中存在该病毒的感染。结合TAHV病毒分离结果,认为南疆多个地区存在TAHV循环及人群感染。对2007年伽师县采集的10例TAHV IgM抗体阳性血清及恢复期血清进行中和试验。结果发现,所有标本中和抗体指数介于1:10-1:80之间,提示当地人群中存在该病毒的感染,但是未能发现恢复期较急性期血清抗体呈现4倍增长,因此尚不能证实TAHV是这些IgM抗体阳性病例发热疾病的病因。本研究还发现,应用IFA检测血清TAHV抗体时所得到的抗体滴度与中和试验检测时得到的抗体滴度基本相符,提示IFA方法可以用来进行TAHV病毒抗体的初筛。本研究还对新疆南疆伽师县2004年夏季发生的一起乙型脑炎流行的病因开展了进一步研究。结果显示疫情期间采集的6对急性期和恢复期血清标本的乙型脑炎病毒（JEV）IgM抗体均呈阳性,但是只有两对标本存在低滴度JEV中和抗体4倍增高（5:20和5:40）,其余4对标本JEV中和抗体呈阴性反应,根据此结果认为该起疫情为乙脑流行尚显证据不足。对以上标本开展了多种虫媒病毒抗体筛查,结果发现这些标本JEV、登革病毒（DENV）、西尼罗病毒（WNV）、圣路易斯脑炎病毒（SLEV）等多种黄病毒IgM和IgG抗体均呈现阳性（TAHV及其它甲病毒属虫媒病毒抗体阴性）,考虑到黄病毒之间存在血清学交叉反应,这些结果仅提示当地可能存在某种黄病毒的感染,但对其真正病因尚无法判断。建议今后有条件时开展多种黄病毒中和试验以进一步确定病因。此外,本研究对2008年新疆南北疆地区采集的641例不明原因发热患者血清进行了WNV、DENV和JEV虫媒病毒IgM抗体的筛查。结果发现11例患者血清WNV抗体阳性,19例患者血清DENV抗体阳性和4例患者血清JEV抗体阳性。这些结果提示,新疆地区存在多种蚊传黄病毒属虫媒病毒,并有可能引起夏季人群不明原因发热等疾病。综上所述,本研究利用3年时间在我国新疆地区开展了虫媒病毒系统调查,分离到多种虫媒病毒,首次证明新疆南疆地区存在Tahyna病毒感染,这些数据不但丰富了我国和新疆维吾尔自治区虫媒病毒的种类,而且为了解当地传染病病因以及积极预防和控制相关虫媒病毒疾病提供了重要的信息。进一步工作应该侧重于新疆当地及全国范围内Tahyna病毒感染的病例发现,临床表现,疾病负担以及该病在新疆以及我国其他地区的流行范围等。

马红霞^[6]（2009）在《戊型肝炎病毒ORF2和ORF3多肽的抗原性及ORF3多肽的免疫原性研究》文中提出戊型肝炎是全世界范围内的一个公共卫生问题,在发展中国家尤甚。本论文从3例戊型肝炎患者和1例感染戊型肝炎病毒的猪的粪便悬液中克隆4株HEV的基因组,并将其基因构建成cDNA克隆。序列分析显示该4株HEV中有1株为基因1型,3株为基因4型。在此基础上,本论文构建了18个分别表达1型和4型HEV ORF2和ORF3蛋白片段的克隆,进行原核表达和纯化。将纯化后的各多肽分别制备成HEV IgM和IgG抗体EIA检测试剂。使用制备的抗体检测试剂分别检测实验感染了不同基因型HEV的猴系列血清及临床HE患者的系列血清,比较不同基因型HEV对应位置多肽的抗原性差异、同一基因型HEV不同位置多肽之间的抗原性差异。结果显示,对于HEV IgM试剂,ORF2 N端和C端抗原组合使用可以取得最佳的检测效果;对于HEV IgG试剂,主要抗原位点集中在ORF2蛋白的两末端:N端多肽主要参与HE急性期抗体反应,且持续时间较短,C端多肽对应抗体出现也较早,但是持续时间相对较长,该多肽和恢复期血清有很强的结合能力;ORF2蛋白的抗原性在不同基因型之间无明显差异;ORF3蛋白的抗原位点主要集中在C端,且其抗原性在不同基因型之间存在差异。以上结论为优化HEV抗体检测试剂提供了数据支持。本论文还将原核表达的4型HEV ORF3抗原免疫恒河猴,并分别用1型和4型HEV毒株攻击免疫的恒河猴,以考察原核表达的HEV ORF3蛋白的免疫原性。结果显示,原核表达的ORF3蛋白可以部分保护试验动物免于HEV感染。这部分工作为HEV ORF3的功能研究及HE疫苗的开发提供了数据参考。

相大鹏,师永霞,李小波^[7]（2009）在《新疆出血热的研究进展》文中指出克里米亚-刚果出血热（Crimean Congo hemorrhagic fever,CCHF）于1944年发现于俄国的克果米亚,它是由克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV）引起的,是一种流行于中国新疆南部、俄国北部、中东、南部欧亚大陆及非洲撒哈拉地区的烈性传

鲍晓伟,黄勇,李乙江,洪雪花,张泉鹏,王意银,郑钧丰,杜强,王伟,李刚山,邱薇,郑颖,张富强,范泉水,李作生^[8]（2008）在《登革热病毒的实验室诊断研究进展》文中研究指明

鲍晓伟,黄勇,李乙江,洪雪花,张泉鹏,王意银,杜强,王伟,李刚山,邱薇,郑颖,张富强,范泉水,李作生^[9]（2008）在《登革热病毒的实验室诊断研究进展》文中研究指明登革热是由登革病毒（Dengue virus,DV）所致的一组虫媒性传染病,传播媒介主要是埃及伊蚊。病毒感染后可发生登革热、登革出血热、登革休克综合征。DV引起的感染广泛流行于全球热带和亚热带地区,特别是东南亚、西太平洋、中南美洲和非洲的100多个国家和地区。世界卫生组织估计,全世界25亿人受到登革热的威胁,每年约有500～1000万人感染DV,25～50万人的DHF病例,2.4万人死亡,登革热已成为全

陆鹏^[10]（2008）在《登革病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及其在登革热血清学早期诊断中的初步应用》文中研究表明登革病毒（Dengue virus,DV）属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）,分为四个血清型。可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。登革病毒通过伊蚊传播,主要在热带、亚热带地区流行,在流行区域其发病率和病死率均较高。目前登革的预防主要依赖于切断蚊媒传播,尚无有效的疫苗用于其预防。登革热病毒的早期诊断,对于该病的治疗和控制有相当重要的意义。登革病毒基因组长约11kb,共编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白。其中E蛋白是DV最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白,构成病毒颗粒表面的突起。研究表明E蛋白有三个结构域,即结构域Ⅰ、Ⅱ和结构域Ⅲ,第三结构域含有多个抗原表位和宿主细胞受体识别位点,在疫苗,药物及诊断中有良好的应用前景。本研究利用大肠杆菌表达系统分别制备了1-4型DV的E蛋白第三结构域（EⅢ）蛋白,并将1-4型DV的EⅢ蛋白基因串联后融合表达纯化;制备了1-4型抗EⅢ抗原的抗血清,并初步研究了上述重组蛋白在登革热血清学早期诊断中的应用。本研究主要分两个部分:一.重组登革病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达、功能鉴定及抗血清制备提取病毒RNA并逆转录获得cDNA,PCR扩增1-4型DV的EⅢ基因片段,并通过融合PCR的方法将1-4型DV的EⅢ基因片段连接后获得融合基因rEⅢ,分别将1-4型登革病毒的EⅢ基因编码序列及rEⅢ融合基因克隆至原核表达载体pET30a。在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达1-4型登革病毒的EⅢ重组蛋白及融合的rEⅢ蛋白,SDS-PAGE可溶性分析结果显示表达形式为包涵体。包涵体复性采用稀释复性的方法,复性后蛋白依次经金属螯合层析柱和弱阴离子交换柱纯化,SDS-PAGE结果显示目的蛋白有较高的纯度。Western bolt结果显示表达的重组蛋白均能于登革热感染病人血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。1-4型EⅢ重组蛋白抑制DV2型病毒感染BHK-21细胞实验结果显示四型重组E蛋白结构域Ⅲ均能够阻断2型DV感染,但2型EⅢ重组蛋白阻断能力高于其他3型。将1-4型EⅢ重组蛋白免疫新西兰大白兔,所得到的抗血清可以与DV感染的C6/36抗原片反应,1-4型重组蛋白的免疫血清均产生中和2型DV的中和抗体。二.重组登革病毒EⅢ蛋白在血清学早期诊断中的初步应用IgM捕获ELISA（IgM antibody capture ELISA,Mac-ELISA）是世界卫生组织推荐的早期血清学诊断方法,其操作简便且敏感性高。本研究采用改良过碘酸盐氧化法分别将1-4型DV的EⅢ重组蛋白及rEⅢ融合蛋白进行辣根过氧化物酶（HRP）标记,酶标抗原经分子筛纯化后,初步建立了两种IgM捕获ELISA的诊断方法,即以HRP标记的1-4型重组EⅢ蛋白为检测抗原的EⅢ-ELISA法和以rEⅢ融合蛋白为检测抗原的rEⅢ-ELISA法。通过棋盘法确定最佳的酶标抗原稀释度和血清稀释度后,以IFA和panbio试剂盒串联检测的结果为参照,EⅢ-ELISA的灵敏度、特异度、约登指数、阳性预测和阴性预测值分别为86.21%,98.21%,0.8442,96.15%和93.22%,rEⅢ-ELISA法分别为93.10%,100%,0.9310,100%,96.55%。EⅢ-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符合率分别为91.95%和88.50%,rEⅢ-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符合率分别为95.40%和90.80%。使用自研两种方法检测5份乙脑IgM阳性血清、20份流行出血热病人及70份健康人血清结果均为阴性,说明两种自研方法的特异性均较好。rEⅢ-ELISA法各项统计指标值均优于EⅢ-ELISA法。

二、抗体捕获ELISA检测IgM抗体在新疆出血热病人早期诊断中的应用（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、抗体捕获ELISA检测IgM抗体在新疆出血热病人早期诊断中的应用（论文提纲范文）

（1）出血热相关病毒核酸检测技术研究（论文提纲范文）

（2）基孔肯雅病毒免疫学检测方法的建立与初步评价（论文提纲范文）

（3）六种虫媒病毒蛋白芯片检测方法的建立（论文提纲范文）

（4）登革病毒感染诊断方法的研究（论文提纲范文）

（5）新疆蚊传虫媒病毒调查 ——Tahyna病毒的分离及当地人群感染调查（论文提纲范文）

（6）戊型肝炎病毒ORF2和ORF3多肽的抗原性及ORF3多肽的免疫原性研究（论文提纲范文）

（7）新疆出血热的研究进展（论文提纲范文）

（8）登革热病毒的实验室诊断研究进展（论文提纲范文）

（10）登革病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及其在登革热血清学早期诊断中的初步应用（论文提纲范文）

四、抗体捕获ELISA检测IgM抗体在新疆出血热病人早期诊断中的应用（论文参考文献）

• [1]出血热相关病毒核酸检测技术研究[D]. 闫芳域. 中国疾病预防控制中心, 2018(05)
• [2]基孔肯雅病毒免疫学检测方法的建立与初步评价[D]. 邢骁跃. 中国疾病预防控制中心, 2017(01)
• [3]六种虫媒病毒蛋白芯片检测方法的建立[D]. 林方. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(10)
• [4]登革病毒感染诊断方法的研究[D]. 杭小同. 中国疾病预防控制中心, 2010(12)
• [5]新疆蚊传虫媒病毒调查 ——Tahyna病毒的分离及当地人群感染调查[D]. 吕志. 中国疾病预防控制中心, 2009(05)
• [6]戊型肝炎病毒ORF2和ORF3多肽的抗原性及ORF3多肽的免疫原性研究[D]. 马红霞. 吉林大学, 2009(11)
• [7]新疆出血热的研究进展[J]. 相大鹏,师永霞,李小波. 中国医药生物技术, 2009(01)
• [8]登革热病毒的实验室诊断研究进展[J]. 鲍晓伟,黄勇,李乙江,洪雪花,张泉鹏,王意银,郑钧丰,杜强,王伟,李刚山,邱薇,郑颖,张富强,范泉水,李作生. 中国卫生检验杂志, 2008(11)
• [9]登革热病毒的实验室诊断研究进展[A]. 鲍晓伟,黄勇,李乙江,洪雪花,张泉鹏,王意银,杜强,王伟,李刚山,邱薇,郑颖,张富强,范泉水,李作生. 第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集, 2008
• [10]登革病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及其在登革热血清学早期诊断中的初步应用[D]. 陆鹏. 中国疾病预防控制中心, 2008(02)