陈妍妍[1]（2019）在《溶藻弧菌定植因子AcfA的功能及其对SOD、Flg和Dct的调控》文中认为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种全球性分布的条件致病细菌,能致使鱼、虾、贝等各种海洋生物出现不同程度的发病,尤其近年来养殖水质环境频繁出现污染、水体富营养化的现象,由溶藻弧菌引起的弧菌病呈现流行范围广,暴发频繁的趋势,给水产养殖业造成巨大的损失并影响其健康发展。在宿主肠道上成功定植并进行繁殖是弧菌感染宿主和引起疾病的关键第一步。其中附属定植因子Acf A是弧菌重要毒力蛋白之一,Acf A可以使致病菌有效地与宿主黏膜粘附,而关于溶藻弧菌Acf A相关功能的研究较少。本研究以溶藻弧菌HY9901为野生株,利用同源重组技术构建溶藻弧菌acf A基因缺失株?acf A。利用16S r DNA高通量测序技术研究溶藻弧菌野生株WT和缺失株?acf A在石斑鱼肠道的定植情况。通过转录组测序研究Acf A对鞭毛组装、能量代谢等相关基因的调控。根据转录组测序和荧光定量PCR分析,敲除溶藻弧菌sod B基因,研究sod B基因的缺失是否影响溶藻弧菌的生物学特征和毒力。并利用β-半乳糖苷酶报告基因和细菌单杂交实验验证溶藻弧菌Acf A对SOD、Flg和Dct基因的调控作用。主要结果如下:1、溶藻弧菌缺失株?acf A的构建及其生物学特性研究以溶藻弧菌HY9901为野生株,利用同源重组技术构建溶藻弧菌缺失株?acf A。根据生物学特性分析,acf A基因的缺失会降低溶藻弧菌的泳动能力、粘附能力和毒力,但不影响细菌的遗传稳定性、外部形态、生长、胞外酶活力和生物膜形成能力。2、溶藻弧菌野生株WT和缺失株?acf A在石斑鱼肠道菌群分析珍珠龙胆石斑鱼肠粘膜菌群Alpha多样性指数结果表明,样本的测序深度均在0.99以上。acf A组和WT组的Chao1和ACE指数随时间的推移出现下降的趋势。并且acf A组在第1、2和3天的Chao1和ACE指数分别比WT组第1、2和3天的Chao1和ACE指数高,表明石斑鱼经野生株WT灌胃后降低了肠粘膜菌群的丰度。acf A组和WT组的Simpson和Shannon指数没有明显差异。WT组的弧菌丰度几乎维持不变,而acf A组的弧菌丰度从0.07%下降至0.01%。肠道定植实验也发现在细菌灌胃后48h,缺失株?acf A在石斑鱼肠道定植的数量仅为野生株WT在石斑鱼肠道定植的数量的8.40%。3、溶藻弧菌野生株WT与缺失株?acfA的转录组测序分析通过溶藻弧菌野生株WT与缺失株?acf A的转录组测序分析,共筛选得到329个差异表达基因,其中157个基因转录上调,172个基因转录下调。KEGG分析发现野生株WT与缺失株?acf A差异表达基因主要集中定位在双组分系统、微生物适应不同环境的代谢途径和碳代谢途径,其中鞭毛组装、能量代谢、硫胺代谢、碳水化合物与氨基酸代谢、信号转导相关20个基因显着下调,表明Acf A参与调控鞭毛组装、能量代谢等相关基因的表达。4、溶藻弧菌缺失株?sod B的构建及其生物学特性研究根据转录组测序和荧光定量PCR分析,以溶藻弧菌HY9901为野生株,利用同源重组技术构建溶藻弧菌缺失株?sod B。根据生物学特性分析,sod B基因的缺失会增强生物膜形成能力和胞外酶活力,降低溶藻弧菌的泳动能力、粘附能力、毒力、SOD酶活力和抗氧化能力,但不影响细菌的遗传稳定性、外部形态和生长。5、Acf A调控SOD、Flg和Dct基因的功能验证采用β-半乳糖苷酶报告基因和细菌单杂交实验来检测溶藻弧菌Acf A与sod B、flg F、flg G、flg I和dct Q基因启动子区的结合作用。结果发现,Acf A对sod B、flg G和dct Q具有正调控关系,对flg F和flg I具有负调控关系。Acf A可直接与flg F和flg I基因启动子区结合,但未与sod B、flg G和dct Q基因启动子区相结合,表明Acf A对其调控是间接的。
唐梦灵[2]（2019）在《NR1D2介导的脂噬在类鼻疽菌胞内持续性感染中的作用机制研究》文中指出类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌）感染引起的一种热带医学疾病,广泛流行分布于东南亚和澳洲北部等地,我国海南、台湾、香港等地也为主要的疫源地。类鼻疽临床表现形式多样,除了引起亚临床感染、局部的脓肿外,还可导致重症肺炎和急性败血症等,死亡率高达40%。由于类鼻疽菌耐药性强,培养易等特点,早在2006年美国CDC就将其列为I类生物战剂。随着研究的深入,大量的证据表明类鼻疽可能是一种人畜共患疾病。尤其是近些年一些非疫源地也相继出现了类鼻疽病例的报道,如南非、中东等地,我国2008年在北京奥运会期间和2014年在江苏镇江分别发生过一起输入性的类鼻疽病例。再加上国际交流和合作的更加频繁,“一带一路”的建设,海南国际旅游岛的开发以及南海海洋利益维护和主权安全保障已上升至国家战略要求,因此迫切需要深入研究类鼻疽菌感染致病的机理,寻找临床治疗的新策略。类鼻疽菌作为一种胞内寄生、严重危害公共安全的细菌,其逃逸宿主免疫造成的持续性感染是其致病的关键。类鼻疽菌能够快速地侵入宿主体内各类细胞,并使感染细胞发生融合,为自身的复制和传播创造条件,这些被感染的细胞不仅是类鼻疽菌的寄居场所,还给其提供能量和营养物质。近年来,一些研究发现在病原菌感染与免疫过程中,宿主脂质代谢和病原菌相互作用,并为病原菌感染和复制提供能量。在结核杆菌感染早期宿主细胞甘油三酯释放的脂肪酸和甾醇是结核杆菌休眠期间的唯一碳源;在肝炎病毒装备和复制进程中脂质代谢是其必不可少的能量来源。近期课题组在类鼻疽菌感染肺上皮细胞A549逃逸宿主清除机制中观察到宿主细胞脂肪代谢发生明显异常变化,脂质严重蓄积。但是这种脂质代谢的异常表现与类鼻疽菌的感染有什么关系、在其逃逸免疫中发挥什么作用、对其致病有什么生物学意义等问题尚不清楚。众所周知,脂质代谢参与细胞许多重要的生命活动,为各种细胞器形成、扩展、收缩等动态改变以及细胞内质网蛋白质降解等提供所需能量。而近年来研究发现细胞内的脂质还可以通过自噬体转运至溶酶体进行分解,此过程称为脂噬作用。脂噬作为自噬的一种亚进程,被报道与多种细菌、病毒等微生物的致病和感染密切相关。李倩博士2015年在Autophagy上曾报道过类鼻疽菌感染A549细胞早期,通过诱导MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的上调,进而实时、连续地抑制其靶基因ATG10表达,负性调控自噬,从而影响宿主细胞的免疫清除,促进其胞内存活。那么,脂质代谢的异常与类鼻疽菌感染引起的自噬过程受抑有什么关系呢?而类鼻疽菌是否是通过自噬作用调节脂质代谢,从而影响细菌在胞内的增殖复制,并导致持续性感染的呢,仍有待阐明。为了探究类鼻疽菌感染过程中,自噬对脂质代谢的调控作用对类鼻疽菌胞内生存的影响,我们首先建立了类鼻疽菌感染A549细胞模型,通过透射电镜、Western Blot、激光共聚焦检测了类鼻疽菌感染的A549细胞脂质代谢和自噬水平变化情况,发现类鼻疽菌感染肺上皮细胞A549后脂质严重蓄积,脂滴堆积,脂质代谢关键分解酶活性降低;同时细胞内AKT-mTOR自噬通路明显受抑。其次,我们进一步验证了自噬与脂质代谢的关系。在药物激活或抑制自噬、siRNA干扰等条件下,通过Western Blot、激光共聚焦观察A549细胞脂质代谢情况,发现激活自噬会明显促进细胞内脂质代谢;细菌胞内计数实验发现A549细胞清除胞内类鼻疽菌的能力明显增强。接着,为了找寻类鼻疽菌是如何通过自噬调控脂质代谢的线索,我们通过类鼻疽菌感染A549细胞后表达谱芯片的筛选,利用生物信息学分析软件Cluster3.0和Tree View对脂质代谢相关基因进行了聚类分析和预测,结果发现NR1D2mRNA表达明显上调。NR1D2（Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2）是孤儿核受体家族成员,具有配体激活的功能。已有文献报道NR1D2不仅能够调节参与代谢功能的基因,如脂质代谢和炎症反应相关基因,还能可以作为诱导自噬的重要信号,与自噬信号通路中关键蛋白LC3、Beclin-1等相互作用,实现对自噬的调节。因此,为了探究在类鼻疽菌感染A549细胞过程中NR1D2是否介导自噬调节了脂质代谢,我们首先利用RT-PCR和Western Blot实验分析确证在类鼻疽菌感染A549细胞后NR1D2的表达水平明显升高。其次,我们构建了NR1D2干扰质粒,发现类鼻疽菌感染宿主细胞后干扰NR1D2的表达明显减少A549细胞中脂滴的蓄积,促进宿主细胞脂质代谢和β-氧化的速率;同时我们还观察到自噬信号通路的关键分子LC3、Beclin-1也伴随NR1D2的抑制而上调。进一步,在抑制自噬水平的条件下,干扰NR1D2表达,通过共聚焦实验发现即使干扰NR1D2的表达,相比于对照组（control+DMSO）宿主细胞脂质代谢水平也无明显改变,表明在类鼻疽菌感染A549细胞进程中,NR1D2介导了自噬调节脂质代谢。考虑到宿主脂质代谢在病原感染进程中发挥重要作用,因此我们外源补充三醋酸甘油酯,促进胞内脂质代谢速率,通过细菌胞内载量计数实验表明激活宿主细胞脂质代谢速率可以增强宿主细胞对类鼻疽菌的胞内清除能力。综上所述,本课题从脂质代谢的角度探讨了类鼻疽菌与宿主的相互作用在其感染致病中的意义,其创新性主要在于首次提出了“类鼻疽菌、脂噬、持续性感染”的作用模式。本文以脂噬为切入点,初步阐明了类鼻疽菌感染宿主细胞后,诱导核受体因子NR1D2的表达上调,干扰细胞自噬,导致宿主细胞脂质蓄积,从而逃避宿主免疫清除而发生持续性感染。该研究一方面揭示了脂噬是如何在类鼻疽菌的胞内持续性感染中发挥作用的机制,另一方面也为寻找抗类鼻疽感染的新方案提供理论依据和思路借鉴。
高菽蔓[3]（2019）在《甲型和乙型流感病毒的型特异性启动子序列影响型间病毒复制机制的研究》文中指出甲型和乙型流感病毒是威胁人类健康的主要病原体,其基因组结构及编码的蛋白都非常相似。甲型和乙型流感病毒分别能够在型内或谱系间发生重配,但不能发生型间重配。甲型和乙型流感病毒的启动子序列高度保守,但它们在核苷酸构成上存在明显差异,这些差异元素的生物学意义尚不清楚。因此,本研究拟从甲型和乙型流感病毒启动子的差异元素入手,探索它们在型间病毒复制中的生物学意义。本研究中,我们分别对甲型和乙型流感病毒各基因片段的启动子序列进行了大规模的生物信息学分析,全面展示了甲型和乙型流感病毒启动子区的序列特征,发现了型特异性启动子元素的存在,分别为甲型流感病毒vRNA启动子中的5U、6’A和乙型流感病毒vRNA启动子中的5C、6’U。我们建立了甲型（A/WSN）和乙型（B/Yam）流感病毒的小型复制子系统,并比较了甲型和乙型流感病毒聚合酶对同型和异型vRNA模板的偏好性,结果表明,在小型复制子系统中,甲型和乙型流感病毒聚合酶都更偏好同型模板。随后,我们利用该系统,深入地研究了型特异性启动子元素互换对甲型和乙型流感病毒RNA合成和蛋白表达的影响,通过这些实验,我们首次发现型特异性启动子元素——vRNA启动子3’端第5个核苷酸是关键的启动子元素,它能够特异性地识别甲型和乙型流感病毒聚合酶。另外,我们通过体内、体外聚合酶活性试验,深入地探索了甲型和乙型流感病毒vRNA启动子3’端第5个核苷酸的特性在调节体内、体外聚合酶活性中的作用,结果表明,甲型和乙型流感病毒型特异性的启动子元素——vRNA启动子3’端第5个核苷酸的特性直接决定了聚合酶活性,它能够在RNA合成的起始和延伸的多个环节起作用。随后,我们利用反向遗传学技术,研究了这些启动子元素突变对病毒复制的影响。我们在病毒感染水平上确认了甲型和乙型流感病毒vRNA启动子3’端第5个核苷酸是调节型特异性的关键位点。有趣的是,甲型和乙型流感病毒对型特异性启动子元素互换突变的表现不同,其中在甲型流感病毒A/WSN中,将甲型特异性U5替代为乙型特异性C5,传代2-3次后,该位点能迅速地发生回复突变,而在乙型流感病毒B/Yam中,将乙型特异性C5替代为甲型特异性U5,经连续传代后,仍然能够保留该突变,但明显降低了病毒的复制效率。这些结果强调了甲型和乙型流感病毒对核苷酸突变的容忍度及其聚合酶的纠错能力存在明显差异。总之,本研究首次发现并揭示了甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素3’端第5个核苷酸是决定型特异性的关键位点。这表明甲型和乙型流感病毒启动子的变化会引起核糖核蛋白复合物的不匹配,对进一步阐明甲型和乙型流感病毒不能发生型间重配的机制具有重要的指导意义,也丰富了我们对流感病毒型特异性以及启动子生物学意义的认识。本课题还揭示了甲型和乙型流感病毒聚合酶在转录机制上存在的细微差异,这些功能差异将为甲型和乙型流感病毒聚合酶结构的研究提供重要素材。
胡涛[4]（2017）在《双生病毒卫星编码的βC1蛋白与寄主MAPK途径中MKK2和MPK4蛋白的互作机制研究》文中提出植物双生病毒是一类在世界范围内广泛发生,造成经济作物产量严重损失的单链DNA病毒。本课题利用菜豆金色花叶病毒属双生病毒,中国番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）作为研究对象,通过遗传学、生物化学和分子生物学等手段对其卫星DNA（Tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB）编码的βC1蛋白在病毒侵染植物过程中的功能进行深入的探究。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-acticvated protein kinase,MAPKs）是一类真核生物中普遍存在的丝/苏氨酸蛋白激酶,由此形成的MAPK级联途径是真核生物中保守的信号传导方式,其主要作用是将外界刺激信号传入细胞内,使细胞及时作出有效的应答反应。本课题首先利用免疫沉淀的方法富集在本氏烟中瞬时表达的βC1蛋白并进行质谱分析,在βC1蛋白复合物中检测到7条匹配本氏烟MAPK激酶NbSIPKK的肽段序列,覆盖蛋白6个区域共14.4%的序列。以NbSIPKK在模式植物拟南芥中的同源物MKK2进行进一步分析,通过酵母双杂交、双分子荧光互补、免疫共沉淀和互补荧光素酶的方法鉴定并验证了 βC1与MKK2蛋白的互作,互作区域为MKK2的激酶功能域。体外磷酸化实验发现MKK2不能够磷酸化βC1,而βC1能够抑制MKK2的激酶活性。同样的,也利用酵母双杂交、双分子荧光互补、免疫共沉淀和互补荧光素酶的方法鉴定到βC1能和MKK2下游的MPK4蛋白互作,并也能够在体外实验中抑制MPK4的激酶活性。此外,利用细菌鞭毛蛋白的保守肽段flg22处理过表达βC1转基因拟南芥后发现,βC1能够抑制flg22诱导的MAPK激活,胼胝质积累和下游报告基因的转录。同时,转录组结果也显示,βC1在总体上对flg22诱导上调和下调的基因转录均存在负调控的作用。在mkk2突变体拟南芥里βC1便不能够再进一步影响flg22诱导的MAPK激活和下游报告基因的转录,说明靶标MKK2蛋白对于βC1抑制flg22诱导的MAPK激活是必须的。另一方面,TYLCCNV的侵染能诱导本氏烟MAPK途径中SIPK的激活,利用三种不同双生病毒感染本氏烟的病毒粒子粗提液处理拟南芥也能够激活拟南芥MAPK途径中MPK3和MPK6的磷酸化,说明MAPK途径参与对双生病毒侵染的防御。对野生型拟南芥和mkk2突变体拟南芥进行TYLCCNV+TYLCCNB侵染实验后发现mkk2突变体拟南芥的病毒侵染率要高于野生型。利用Crispr/cas9 技术敲除本氏烟 NBSIPKK 和 NBMPK4 基因的nbsipkk-crispr、nbmpk4-crispr突变体植株对TYLCCNV+TYLCCNB侵染均表现出更高的病毒积累量和更明显的病毒表型,说明MKK2和MPK4参与了对双生病毒的防御过程,TYLCCNV单独侵染后nbsipkk-crispr、nbmpk4-crispr表现出典型的卷叶、矮化的症状,说明βC1蛋白通过靶标MAPK途径中MKK2和MPK4来抑制MAPK介导的防御有助于病毒在植物体内的积累。本研究成果揭示了一种新的植物抗病毒的机制,也发现了双生病毒诱导症状产生的新的分子机理,为农业生产中有效准确的防控双生病毒提供了新的理论基础。
刘昕[5]（2013）在《HIV-1整合酶抑制剂筛选及其活性检测方法研究》文中进行了进一步梳理自从1981年首次发现艾滋病患者以来，艾滋病在全球范围迅速传播，已经严重威胁人类的健康，对社会造成巨大的破坏。艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV-1）引起，病毒复制周期中特异性的活性位点和关键酶为抗病毒化学治疗提供了潜在的靶标。其中，HIV-1编码的整合酶（IN）将HIV-1反转录后的产物cDNA整合入宿主基因组，它是病毒复制过程中不可缺少的酶。由于人类宿主的正常细胞中并不存在IN的功能类似物，使得特异性作用于IN的抑制剂对于正常细胞毒性较小；同时，IN采用单一的活性位点去适应两种不同的DNA底物，这在一定程度上限制了HIV-1产生对IN抑制剂的耐药株，因此是研发抗HIV-1药物的一个非常有意义的靶点。在体内，整合作用是一个多步骤的反应过程，主要包括：病毒cDNA与IN结合；IN发挥内切酶作用对病毒cDNA进行3’-加工；IN通过链转移反应将病毒cDNA整合到宿主细胞DNA。在体外，使用重组IN蛋白、寡聚核苷酸DNA底物以及二价金属离子可以实现IN在体内所发挥的整合功能，据此建立高效的IN抑制剂的筛选方法，是当前IN抑制剂体外筛选的主要手段。本研究表达纯化了重组IN蛋白，建立了高通量的HIV-1整合酶抑制剂筛选方法。与原有方法相比，本研究新建立的筛选方法灵敏可靠、步骤简便、成本低廉。药物筛选不仅包括生物实验方法，计算机辅助虚拟筛选方法在药物筛选中也占据了越来越重要的地位。本论文不仅在生物学实验基础上进行了整合酶抑制剂筛选方法的探索，还从计算机模拟和机器学习的角度对整合酶抑制剂虚拟筛选进行了研究。利用CoMFA分析以及支持向量机（SVM）建模等方法考察HIV-1整合酶抑制剂活性，建立了基于定量构效关系（QSAR）和SVM的预测模型，通过预测结果来判断模型的外部预测能力，结果显示SVM表现出了较强的建模和预测能力。论文工作主要包括以下三个方面：（1）表达纯化整合酶蛋白并进行链转移反应活性鉴定首先将HIV-1整合酶原核表达载体pET-28a（+）/IN（F185K/C280S）转化入大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）进行原核表达，该表达载体含有IN基因并引入了F185K/C280S突变以提高蛋白溶解性。用镍琼脂糖凝胶进行亲和层析纯化，获得了纯度和活性均较高的整合酶重组蛋白。运用高通量的酶联免疫吸附方法（ELISA），对重组蛋白进行链转移活性鉴定，表明重组蛋白具有较好的催化活性，该工作为建立整合酶链转移反应抑制剂筛选方法奠定了基础。（2）建立便捷高效的整合酶链转移反应抑制剂筛选方法研究的目标是建立高效便捷的HIV-1整合酶链转移反应抑制剂筛选方法，设计了生物素标记的供体DNA和荧光基团FITC标记的靶DNA，用链霉亲和素磁珠捕获反应体系中的DNA产物；最后用荧光分析仪检测DNA产物的荧光信号，并计算待测样品的抑制率。用已知整合酶抑制剂S-1360和MK-0518对筛选方法进行了验证，测定结果与已有实验数据相符合，表明本筛选方法能够有效并可靠地应用于HIV-1整合酶链转移反应抑制剂的筛选。与原有的整合酶链转移反应抑制剂筛选方法相比，本筛选方法还具有显着的改进：（i）原有的HIV-1整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法是用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体检测地高辛基团，并利用碱性磷酸酶的特异性显色反应来读取信号，而本方法是利用荧光基团标记靶DNA，直接检测荧光基团的荧光信号即可对整合酶的链转移反应活性或待测样品的抑制活性进行评价，故本方法步骤更为简单，省力省时；（ii）原有的方法需要使用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，而本方法无需使用抗地高辛抗体，成本更为低廉。该方法还能应用于去整合反应和抑制剂作用机理的研究，具有重要的学术和应用价值。（3）应用CoMFA和SVM构建嘧啶酮类HIV-1整合酶抑制剂筛选模型SVM应用于抑制剂筛选，通过对抑制剂进行定量构效关系（QSAR）建模，将化合物的活性与化合物的各种结构参数建立起相关联系，确定回归方程以预测新化合物的活性。应用CoMFA软件计算68个嘧啶酮类（pyrimidones）化合物的拓扑、分子极化、亲水性等结构参数，用所选的结构参数作为SVM的输入，建立起非线性的支持向量回归模型。模型获得训练集的活性预测值与实验值相关系数为0.938，获得测试集的活性预测值与实验值相关系数为0.804，表明模型所获得的活性预测值与实验结果相吻合，说明模型能够有效地进行HIV-1IN抑制剂筛选。本研究利用SVM算法与CoMFA方法相结合，为建立抑制剂筛选模型提供了一些有益的探索和有价值的信息，不仅可以进行药物虚拟筛选，并且可以为抗HIV-1药物设计提供有效的生物学信息。
张轶俊[6]（2013）在《稳定高表达对核苷（酸）类似物耐药HBV毒株肝癌细胞系的建立》文中研究说明核苷（酸）类似物治疗能快速有效地抑制HBV复制,延缓肝脏病变的进展,从而降低肝硬化和肝癌的发生率。但长期抗病毒治疗容易出现对核苷（酸）类似物耐药,导致治疗失败。对耐药机制的体外研究以及筛选新的针对耐药HBV毒株的抗病毒药物需要合适的体外研究模型。为建立稳定高表达耐核苷（酸）类似物HBV变异株肝癌细胞系,我们开展了以下工作：在研究的第一部分中,我们构建了8种HBV表达质粒,包括野生型质粒以及常见的7种耐不同核苷（酸）类似物的变异型质粒,以用于人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞系的转染研究和筛选稳定细胞系。选用野生型质粒进行细胞转染、潮霉素筛选、阳性克隆筛选、长期传代以及有限稀释纯化细胞克隆等步骤,筛选出一株表达野生型HBV稳定细胞株,建立及完善了筛选稳定细胞系的体系,以应用于后续耐药HBV稳定细胞系的筛选。在研究的第二部分中,我们应用第一部分工作中建立的筛选体系,经过大规模的筛选获得了一株高表达耐拉米夫定HBV稳定细胞株,并命名为HepG2-HS204V。采用Southern blot技术证实该细胞株胞内HBV复制水平显着高于HepG2.2.15细胞株,上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平显着高于HepG2.2.15,达10倍以上。胞外分泌的病毒颗粒水平与HepG2.2.15相似。该细胞株显示出预期的耐药表型特征,包括对拉米夫定耐药以及对阿德福韦敏感。采用Southern blot方法证实该细胞株内HBV基因序列以整合的形式存在；Northern blot的方法证实2.4/2.1kb的亚基因组RNA的转录水平明显高于HepG2.2.15,提示可能该细胞株产生高水平HBsAg的原因。最后我们用CsCl梯度离心分离细胞上清各组份,采用免疫电镜以及免疫印迹的方法证实该细胞株可以分泌完整的病毒颗粒以及不同形式的亚病毒颗粒。经过长期传代证明了其稳定的生物学特性。在研究的第三部分中,我们同样应用建立的筛选体系,筛选出一株高表达耐阿德福韦N236T变异HBV稳定细胞株,命名为HepG2-HS236T。同时筛选出一株表达耐阿德福韦A181V变异HBV稳定细胞株。采用Southern blot技术证实该细胞株胞内HBV复制水平显着高于HepG2.2.15细胞株,上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平显着高于HepG2.2.15,达5倍以上。胞外分泌的病毒颗粒水平与HepG2.2.15相似。表型实验显示了预期的表型耐药特征,即对拉米夫定敏感以及对阿德福韦的敏感性明显降低。HepG2-HS236T细胞株中同样发现了以整合形式存在的HBV序列,采用常规电镜也发现了存在于细胞上清液中的病毒颗粒。长期传代证实了其稳定的生物学特性。而表达耐阿德福韦A181V变异HBV稳定细胞株其病毒蛋白水平为HepG2.2.15 2-3倍左右,但胞内HBV复制水平以及胞外HBV DNA分泌水平较低。在研究的第四部分中,我们同样应用建立的筛选体系,筛选出一株耐恩替卡韦L180M+M204V+T184S变异型和一株L180M+M204V+M250L变异型HBV细胞株。但其胞内HBV复制以及胞外HBV DNA的分泌均较低,有待于进一步优化。
朱洪伟[7]（2011）在《鸭肠炎病毒UL15及UL41基因的鉴定》文中指出鸭肠炎病毒（DEV）,又称鸭疱疹病毒I型,是鸭、鹅及天鹅等雁形目水鸟的一种重要病原体,可引起急性、接触性传染的鸭病毒性肠炎（DVE）,该病在家养及野生水禽中可造成高死亡率及产蛋下降。DEV基因组DNA序列的测定工作直到最近2年才陆续完成,而其编码基因的确定大多仅停留在与其他疱疹病毒同源基因的序列分析基础上,对蛋白编码基因的探索有助于我们更好地了解该病毒的生物学特征。为此,本研究开展了DEV UL15和UL41基因及其编码蛋白的鉴定和分析工作。DEV UL15由2个外显子和1个3.5 kb的内含子组成,其编码序列可转录2个转录本:全长的UL15及N-末端截断的UL15.5。2.9 kb的UL15转录本编码一739个氨基酸的蛋白质,其分子量大小约为82 kDa,而UL15.5转录本长约1.3 kb,包含888 bp的ORF,该ORF编码一大小约为32 kDa的多肽。序列分析表明UL15编码序列在疱疹病毒科内高度保守,并且含有2个在疱疹病毒及噬菌体末端酶催化亚基序列中保守的Walker A （261VPRRHGKT267）和Walker B （354LLFVDE359）基序。基于23个疱疹病毒UL15的氨基酸序列构建的系统发育树表明DEV与α疱疹病毒亚科,Mardivirus病毒属内病毒亲缘关系较近。此外,DEV UL15的转录和表达对放线菌酮（CHX）和膦乙酸（PAA）均敏感,说明UL15在DEV复制过程中晚期表达。Western blot结果显示,抗UL15C232的抗血清可在DEV感染的细胞内检测到UL15和UL15.5的表达,而在纯化的病毒粒子中检测不到蛋白的存在。间接免疫荧光结果显示,在感染早期（6 hpi） UL15定位在CEF细胞的细胞质中,到12 hpi和24 hpi时则转运进入细胞核,而在无其他病毒蛋白参与下,UL15则滞留在细胞质内。UL41的同源蛋白编码病毒宿主关闭蛋白（VHS）,可非特异性的降解宿主及病毒mRNA。PSI-BLAST搜索显示,DEV UL41氨基酸序列具有核酸酶家族蛋白特征,且模拟的3D空间结构也与T4 RNase H和Taq DNA聚合酶的活性区域很好的叠合。此外,基于UL41氨基酸序列构建的系统发育树分析发现DEV与Mardivirus内病毒亲缘关系较近。为进一步分析编码蛋白特性,将UL41 ORF克隆至表达载体pMAL-c4x中,原核表达了可溶性全长融合蛋白MBP-UL41,并制备了抗UL41的抗血清。随后的体外VHS活性检测发现,融合蛋白具有RNase活性。CEF细胞内瞬时表达的UL41可致共转染的报告基因Luc表达量降低,证实了细胞内表达的UL41蛋白的RNase活性。此外,时序性分析发现UL41基因的表达对CHX敏感,而对PAA不敏感,说明UL41是早期表达基因。Western blot结果显示,DEV感染的细胞内可检测到UL41蛋白的存在,DEV病毒粒子中也含有UL41蛋白。在DEV感染的CEF细胞内,UL41定位在细胞质的核周区域,感染早期呈颗粒性聚集分布。在pcDNA-UL41转染的细胞中,瞬时表达的UL41主要位于细胞质的核周区域,细胞核中也有少量分布。最后,UL41蛋白上的保守性氨基酸残基的单点突变可导致蛋白的VHS活性的降低或丧失。综合突变分析及同源蛋白预测的结果推测,D253和D299可能是蛋白上的一个配体结合位点。综上所述,本研究鉴定了DEV的UL15和UL41基因和/或其编码的蛋白,为明确DEV病毒在疱疹病毒科的分类地位以及阐明这2个蛋白在DEV感染中的作用提供了实验数据。
何红秋[8]（2010）在《HIV-1整合酶活性检测方法建立和应用研究》文中进行了进一步梳理人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）是人类历史上最严重、最致命的疾病之一。艾滋病目前仍然不能治愈。HIV编码的整合酶（IN）介导病毒DNA与宿主细胞基因组整合,是病毒复制所必需的关键酶之一。抑制IN的功能能够有效阻断病毒在宿主细胞内的复制。同时,由于正常人体细胞中没有IN的功能类似物,特异性作用于IN的抑制剂对人体的副作用可能很小。因此,IN被认为是抗HIV药物研发的理想靶点。IN在体内主要通过催化3′加工和链转移两步反应实现整合过程。以上两步反应能够在体外使用重组IN蛋白、寡核苷酸DNA底物以及二价金属辅助离子实现。此外,IN还能在体外催化链转移的逆反应——去整合,将链转移形成的DNA产物重新还原生成病毒DNA和靶DNA。建立高效的IN活性检测方法,并据此开展抑制剂的筛选,是当前IN抑制剂体外筛选的主要手段,也是以IN为靶点的抗病毒药物研发的热点之一。本研究表达纯化了重组IN蛋白,建立了IN活性检测的一系列高通量方法,并应用这些方法进行了IN的性质、抑制剂筛选等方面的研究。论文内容主要包括以下几个方面:（1）整合酶蛋白表达纯化及3′加工活性高通量检测方法的建立使用PCR获取了HXB2CG病毒株IN基因,通过序列分析,设计突变引物,使用重叠PCR方法将HXB2CG IN基因突变为HIV NL4-3 IN基因,并引入了F185K/C280S突变以提高蛋白溶解性。将目的基因连接到pET表达载体中,在大肠杆菌BL21中实现了高效且可溶性表达。通过亲和层析方法,从细胞破碎上清液中纯化到纯度高且具有3′加工和链转移功能活性的重组IN蛋白。根据分子信标的原理,设计了荧光基团和淬灭基团标记的模拟病毒DNA序列的3′加工DNA底物,提出了一种检测3′加工反应活性的新型荧光分析法。实验表明,该方法不但灵敏度、特异性高,操作简单,方便快捷,为全液相反应环境,而且能够实时定量监测IN 3′加工反应。该方法能够用于IN 3′加工反应性质研究和以3′加工为靶标的IN抑制剂高通量筛选。本研究建立的3′加工反应荧光检测方法有潜力应用到其他蛋白质与DNA相互作用的研究中,具有重要的学术和应用价值。（2）整合酶链转移活性高通量检测方法的建立和应用抑制链转移反应被认为是体内抑制IN功能活性的关键,当前IN抑制剂的体外筛选主要以链转移反应为靶标。本研究设计合成了分别用生物素和地高辛修饰的供体DNA和靶DNA,引入了链霉亲和素磁珠捕获反应DNA产物,提出了检测IN链转移反应活性或者检测3′加工与链转移反应整体活性的高通量酶联免疫吸附测定法（ELISA）。与之前的各种方法相比,我们提出的高通量ELISA具有明显的改进:（i）无需使用放射性底物,实现了高通量;（ii）反应时所有的试剂均自由悬浮在液体环境中,磁珠–DNA产物、磁珠–抗体接触更容易更充分,显着提高灵敏度,还能灵活应用到研究反应中各试剂的相互作用,有助于研究抑制剂的作用机理;（iii）无需包被、封闭微孔板,省时省力,检测前转移磁珠至新的微孔板能够几乎完全消除微孔板对试剂的非特异性吸附,有效降低了背景值,提高了特异性;（iv） ELISA和荧光免疫吸附测定（FLISA）两种检测策略并用,增加了方法的应用范围。成功应用高通量ELISA研究了金属离子对链转移反应的影响,得出了一些有意义的结果。使用已知IN抑制剂证明了高通量ELISA应用到IN抑制剂筛选中的有效性,且从天然产物提取物和合成化合物中成功筛选了数个具有初步活性的IN抑制剂。（3）整合酶去整合活性高通量检测方法的建立IN在体外能通过去整合反应实现对整合过程的逆转,且整合酶核心区（IN-CCD）具有独立催化去整合功能。建立去整合活性高通量检测方法对研究IN功能及筛选IN抑制剂都具有重要意义。本研究表达纯化了具有功能活性的野生型IN及IN-CCD蛋白,设计合成了生物素和地高辛双标记的去整合DNA底物,基于链霉亲和素磁珠捕获生物素标记DNA,建立了一种检测IN和IN-CCD体外去整合活性的高通量ELISA。研究了金属离子对去整合高通量ELISA的影响,结果表明与3′加工和链转移反应相似,IN去整合反应也更偏好于使用Mn2+而不是Mg2+为金属辅助离子。进一步使用NaCl滴定实验分析表明,IN去整合对Mn2+的选择偏好性与Mn2+比Mg2+更能稳定IN–DNA复合物有关。使用了已知IN抑制剂baicalein验证去整合高通量ELISA筛选IN抑制剂的有效性,证明了baicalein是明确的以IN-CCD为靶标的IN抑制剂。本研究建立的去整合高通量ELISA具有高通量、高灵敏度、高特异性、低背景、省时省力等优点,能够应用到去整合反应、抑制剂作用机理等研究中,且具有应用到以IN为靶标,特别是以IN-CCD为靶标的抑制剂高通量筛选的潜力。（4）整合酶核心区野生型和F185K可溶性突变型蛋白活性和溶解性研究野生型（WT） IN和IN-CCD溶解性较差,在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体,给后期纯化及蛋白质功能研究带来不便,而F185K突变后IN和IN-CCD能实现可溶性表达且活性不受影响。通过构建、表达、纯化得到WT和F185K突变型IN-CCD,比较了其溶解性和活性差别。分析并比较了WT和F185K/C280S突变型IN蛋白溶解性和活性差别。结果表明,F185K和F185K/C280S突变后IN和IN-CCD的溶解性显着提高,能够实现可溶性表达;同时,突变后IN-CCD的去整合活性有一定程度的降低,IN的3′加工和链转移活性有一定程度降低。进一步通过同源模建,构建了WT和F185K突变型IN-CCD的蛋白结构,并在水溶液中进行了1800 ps的分子动力学（MD）模拟,得出了一些有意义的结果:（i） F185K突变后,体系的功能loop区柔性有一定程度的降低,整体运动性略有减小,催化核心DDE基序残基之间距离无显着变化,因此,突变后蛋白催化活性降低,但活性受影响程度不大;（ii） F185K突变对IN-CCD内部静电相互作用网络的改变驱动了蛋白构象的变化,特别是loop区构象变化明显,引起蛋白表面的部分疏水残基被包埋,亲水残基暴露,造成IN-CCD相对的极性溶剂可接近面积增大。同时,F185K突变后蛋白与水之间形成的氢键数量有明显的增加,这些变化使IN-CCD的溶解性显着提高。MD模拟与实验结果相吻合。该工作为理解蛋白质溶解性和蛋白质工程中蛋白质可溶性改造提供了一些有价值的信息和理论依据。
程振涛[9]（2009）在《山羊痘病毒某些生物学特性及其主要结构蛋白P32基因的研究》文中研究表明山羊痘是由羊痘病毒属（Capripoxvirus）山羊痘病毒（Goat poxvirus,GPV）引起的一种高度接触性传染病,临床上以体温升高,全身皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹为主要特征。本病被世界动物卫生组织（OIE）列为A类重大动物传染病,我国也将其列为一类动物疫病。2002年10月以来,贵州省羊群中首次暴发疑似山羊痘病例,并迅速波及到8个养羊较为集中的地区,对我省养羊业的健康发展构成了巨大的威胁。为了防制本病,本研究对我省两株山羊痘病毒分离株进行了某些生物学特性及其主要结构蛋白P32基因进行了详细研究。将贵州省山羊痘病毒分离株GPV-LD和GPV-QL接种Vero-E6、BHK-21细胞,3～7d感染细胞显现圆缩、聚集成簇等细胞病变效应;以GPV荧光抗体对感染细胞飞片染色,在细胞浆中检测到特异性的黄绿色荧光;取感染细胞超薄切片进行电子显微镜观察,细胞浆中发现大量成熟和未成熟的痘病毒颗粒;将感染细胞培养物提取总DNA样本,采用针对P32结构蛋白基因和ITR非编码区基因的两对引物进行PCR鉴定,分别扩增出969bp和289bp的DNA片段,对目的DNA片段的测序结果证实感染细胞培养物中存在GPV特异性的病原核酸;采用2000TCID50的病毒感染细胞培养物通过皮下接种3月龄健康山羊,在14～45d成功复制出与山羊痘自然病例相类似的临床症状和剖检病变,并从感染组织材料中回收到接种的病毒。对GPV结构蛋白P32基因和非编码区ITR基因的两对引物进行比较,以期开展临床山羊痘病例的定性PCR检测。研究结果表明两对引物具有羊痘病毒属特异性,不与副痘病毒属羊传染性脓疱病毒、禽痘病毒属鸡痘病毒、健康山羊皮肤样本发生交叉反应。贵州分离毒P32基因和ITR基因与国内外参考毒株的核苷酸同源性分别达99.5%～100%和100%;PCR最小检出量分别为19.06ng和24.40ng。为此,ITR基因引物更适合于临床山羊痘病例的诊断,而P32基因则有利于病毒囊膜表面蛋白的深入研究。根据GPV参考毒株的全基因序列,针对gp064基因分别设计与合成了TaqMan-MGB探针和引物,应用实时荧光PCR方法开展对山羊痘病例的定量检测。一般PCR方法只能检测患羊出现痘疹病变的皮肤和黏膜材料,而FQ-PCR方法则能够从患羊鼻腔拭子、血液样本、皮肤、肺、胃、淋巴结等组织材料中检出GPV病原核酸。按照本试验构建的标准曲线,TaqMan-MGB-FQ-PCR方法的检测极限为0.1TCID50的病毒量。检测结果表明在人工复制山羊痘病例中,不同组织的含毒量呈现皮肤＞瘤胃＞肺＞淋巴结的趋势;接种山羊从第9～15d形成病毒血症,持续时间较短;鼻拭子中从第7～22d均能检测到病毒的存在,表明患羊痘疹痂皮和鼻分泌物是山羊痘蔓延扩散的主要传染源。应用FQ-PCR方法在皮肤痘疹病变出现之前3～5d即可检测病毒的增殖动态,为山羊痘的早期诊断提供了实用的技术。对山羊痘现场自然病例和人工复制病例进行病理形态学观察,患病羊群的大体病变以皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹为特征;病变部位上皮细胞增生、变性,同时出现巨噬细胞、淋巴细胞和嗜中性白细胞等炎性细胞浸润;受害细胞胞浆内观察到线粒体肿胀、内质网扩张、高尔基复合体扩张甚至破裂。在感染细胞的胞浆中观察到大量成熟和未成熟的痘病毒颗粒,包括形态较大,被膜完整或不完整,呈C形或花瓣状的初期病毒颗粒;在中央或偏中央部位开始形成致密类核体的中期病毒颗粒;和形态较小,有囊膜包裹,中央可见两面凹陷呈哑铃形核酸芯髓的成熟期痘病毒颗粒。将GPV-QL、GPV-LD、GPV-Y和GPV-B毒株的P32基因克隆至pMD18-T载体,重组质粒测序和序列分析显示,GPV贵州分离株之间核苷酸同源性高达99.9%,与国内其它GPV分离株的核苷酸同源性达到99.7%～100%,与国外GPV分离株核苷酸同源性达到99.5%～99.6%。系统发生树分析显示羊痘病毒属中SPV与LSDV之间亲缘关系较近,聚为一类,而它们与GPV亲缘关系较远,后者聚为一类,不同毒株之间表现出明显的种间差异和地域关系。P32蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构分析结果表明,GPV P32蛋白基因在肽段227-251区域存在一个潜在的优势抗原表位。以pMD18-T-P32/LD质粒为模板,扩增P32基因不同长度的片段并克隆至表达载体,构建原核重组表达载体和真核重组表达载体,转化至相应的宿主菌中进行诱导表达。结果表明,P32基因N端1/3片段和中间1/3片段未能通过原核表达载体pET-28a、毕赤酵母真核表达载体pPICZaA在各自宿主菌BL21（DE3）、X-33中获得表达;而P32全基因在两种表达系统中均获得了良好的表达,SDS-PAGE和Western-Blotting分析显示表达蛋白分子量分别为35.5KD和64KD。表达蛋白通过Ni柱亲和层析和Sephadex G-100层析获得纯化,该纯化蛋白在琼脂扩散试验中与山羊痘阳性血清出现特异性的沉淀线,而与阴性血清不发生反应;采用纯化蛋白接种家兔制备免疫血清,该免疫血清使山羊痘病毒感染力减少50%的中和指数达到1:123.07。采用纯化的P32蛋白建立了检测山羊痘血清抗体的间接ELISA方法。应用H.E染色法、凋亡试剂盒检测法、流式细胞仪检测法和DNA Ladder检测法证实GPV能够诱导BHK-21细胞发生凋亡,结果显示,GPV能引起BHK-21细胞凋亡。
宋德光[10]（2008）在《犊牛口腔黏膜上皮细胞cDNA文库的构建及其水泡性口炎病毒受体的筛选》文中研究表明水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus, VSV）是引起多种动物水泡性口炎的一种重要人兽共患病病原,属于弹状病毒科的成员。VSV对马、牛、猪特别易感,羊、山羊、多种野生动物和人均有易感性。水泡性口炎与口蹄疫、猪水泡病、猪水泡疹的临床症状十分相似,以口腔黏膜、舌、唇、乳头和蹄冠部上皮出现水泡为主要特征。VSV对不同动物致病性的共同特征为具有嗜上皮性,根据这一特性开展该病毒的致病机制研究,对于水泡性口炎疾病的防治意义重大。本研究以犊牛口腔黏膜上皮为材料,分离培养犊牛原代口腔黏膜上皮细胞,经形态学观察、细胞贴壁率和生长曲线计算、流式细胞仪检测等系统鉴定,确定已成功建立了一种原代犊牛口腔黏膜上皮细胞培养方法,并获得高纯度的原代上皮细胞,为研究具有嗜上皮性病毒的侵入机制和细胞cDNA文库构建提供了良好的实验体系。将VSV接种于犊牛口腔黏膜上皮细胞,应用超薄切片技术进行病毒的形态发生和细胞超微结构变化特征的观察,通过接毒细胞出现病变和电镜观察到弹状病毒样粒子,证实VSV可感染原代培养的犊牛口腔黏膜上皮细胞,并能繁殖扩增病毒。通过超微结构观察,初步明确VSV对该细胞的侵袭过程,且病毒通过细胞膜和胞浆内的空泡膜上出芽增殖后获得囊膜而成熟。将原代细胞大量培养增殖后,提取细胞的总RNA后分离其mRNA,利用噬菌体表面展示技术,构建了对VSV具有高反应性的CPMBCs高质量cDNA表达文库。未扩增文库的滴度为1.3×107 pfu/mL,文库重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.4×1010 pfu/mL。为高通量地从库中筛选出与VSV相互作用的噬菌体重组子,即寻找该病毒相互作用受体蛋白奠定了坚实的基础。用纯化的VSV与构建的T7噬菌体展示文库进行文库筛选,获得一个VSV可能的受体蛋白基因功能区片段。该基因片段长度为801bp,含有一大小为375bp的开放阅读框,编码124个氨基酸残基,将其命名为CPMBCsCP1。测序结果经登陆NCBI BLAST核酸同源性检索为与人类的剪接因子3b的同源性较高。DNAStar软件和ScanProsite分析结果表明是CPMBCsCP1蛋白亲水性较好,具有免疫原性和良好的抗原性,其生物学活性有可能在细胞信号传导通路中接受多种信号的调控。该项研究不仅为VSV由其受体介导的分子致病机制研究奠定坚实的基础,而且将为我国针对VSV引发疾病的防治研究提供参考依据。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 溶藻弧菌病研究概况 |
| 1.1.1 弧菌病 |
| 1.1.2 弧菌的致病机理及毒力因子 |
| 1.1.3 溶藻弧菌的致病性 |
| 1.1.4 溶藻弧菌的生理学特征 |
| 1.2 弧菌的粘附定植作用 |
| 1.2.1 弧菌的粘附作用 |
| 1.2.2 影响弧菌粘附的因素 |
| 1.2.3 弧菌的定植过程 |
| 1.2.4 附属定植因子AcfA |
| 1.3 验证DNA与蛋白质之间相互作用的常用方法 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 溶藻弧菌?acfA缺失株的构建及生物学特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、引物和实验用鱼 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶藻弧菌acfA的基因克隆 |
| 2.2.2 溶藻弧菌缺失突变株?acfA的构建 |
| 2.2.3 缺失株?acfA生物学特性的研究 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 acfA的基因克隆 |
| 2.3.2 缺失株?acfA的构建 |
| 2.3.3 缺失株?acfA生物学特性的研究 |
| 2.4 讨论 |
| 3 溶藻弧菌野生株WT和缺失株?acfA在石斑鱼肠道菌群分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细菌 |
| 3.1.2 实验用鱼 |
| 3.1.3 实验培养基与用具 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1石斑鱼肠道定植实验 |
| 3.2.2 石斑鱼肠道的16S rDNA高通量测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Alpha多样性分析 |
| 3.3.2 稀释曲线与等级聚类曲线 |
| 3.3.3 基于OTU的 venn图 |
| 3.3.4 珍珠龙胆石斑鱼肠粘膜菌群多样性 |
| 3.3.5 物种丰度聚类热图 |
| 3.3.6 PCoA分析和PCA分析 |
| 3.3.7 肠道定植实验 |
| 3.4 讨论 |
| 4 溶藻弧菌野生株WT与缺失株?acfA的转录组测序分析 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细菌的培养及采样 |
| 4.2.2 溶藻弧菌野生株HY9901的acfA基因表达 |
| 4.2.3 野生株WT与缺失株?acfA的转录组测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 采样点的确定 |
| 4.3.2 转录组数据质量评估 |
| 4.3.3 WT和acfa差异基因分析 |
| 4.3.4 WT和 acfa的 GO与 KEGG富集分析 |
| 4.3.5 RT-PCR检验转录组数据 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 溶藻弧菌acfA基因转录组分析 |
| 5 溶藻弧菌?sodB缺失株的构建及生物学特性研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株、质粒、引物和实验用鱼 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 溶藻弧菌野生株WT、缺失株?sodB的 sodB基因时序表达 |
| 5.2.2 溶藻弧菌sodB的基因克隆 |
| 5.2.3 溶藻弧菌缺失突变株?sodB的构建 |
| 5.2.4 缺失株?sodB生物学特性的研究 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 sodB基因的时序表达 |
| 5.3.2 sodB的基因克隆 |
| 5.3.3 缺失株?sodB的构建 |
| 5.3.4 缺失株?sodB生物学特性的研究 |
| 5.4 讨论 |
| 6 溶藻弧菌AcfA调控SOD、Flg和 Dct基因的功能验证 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 荧光定量PCR |
| 6.2.2 β-半乳糖苷酶报告基因实验 |
| 6.2.3 细菌单杂交 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 检验sodB、flgF、flgG、flgI和 dctQ基因表达水平 |
| 6.3.2 启动子的扩增 |
| 6.3.3 重组质粒pME6522-启动子的构建及转化 |
| 6.3.4 β-半乳糖苷酶报告基因验证Acf A与5 个基因启动子的互作 |
| 6.3.5 细菌单杂交诱饵载体pB1H2-AcfA构建 |
| 6.3.6 重组质粒pH3U3-启动子构建及鉴定 |
| 6.3.7 Omega-AcfA蛋白表达 |
| 6.3.8 细菌单杂交验证AcfA与5 个基因启动子的互作 |
| 6.4 讨论 |
| 7 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.文献综述 |
| 1.1 LD的结构与组成 |
| 1.2 免疫细胞中的LD成分 |
| 1.3 病原体诱导LD的形成 |
| 1.3.1 寄生虫 |
| 1.3.2 细菌 |
| 1.3.3 病毒 |
| 1.4 病原体介导的LD结构变化 |
| 1.5 LD与吞噬体的相互作用 |
| 1.6 LD-吞噬体相互作用的意义 |
| 1.7 总结与展望 |
| 2.引言 |
| 2.1 技术路线图 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.1.4 菌株、细胞和质粒 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒提取 |
| 3.2.2 类鼻疽菌感染A549 细胞模型建立 |
| 3.2.3 透射电镜观察A549 细胞脂质体 |
| 3.2.4 Western Blot检测 |
| 3.2.5 RT-PCR |
| 3.2.6 激光共聚焦显微镜检测脂质代谢变化 |
| 3.2.7 类鼻疽菌感染A549 细胞后表达芯片谱分析 |
| 3.2.8 细胞转染实验 |
| 3.2.9 激光共聚焦检测细胞自噬点 |
| 3.2.10 A549 细胞脂质成分甘油三酯检测 |
| 3.2.11 A549 细胞脂质成分胆固醇检测 |
| 3.2.12 A549 细胞β-氧化速率检测 |
| 3.2.13 细菌胞内增殖实验 |
| 3.2.14 数据统计分析 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 类鼻疽菌感染A549 细胞后抑制宿主细胞脂质代谢 |
| 4.2 类鼻疽菌通过抑制自噬导致脂质蓄积 |
| 4.3 类鼻疽菌通过上调NR1D2 抑制脂质代谢 |
| 4.4 类鼻疽菌通过上调NR1D2 抑制自噬介导脂质代谢 |
| 4.5 激活宿主脂质代谢有利于类鼻疽菌的清除 |
| 5.实验结论与展望 |
| 5.1 实验结论 |
| 5.2 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间科研成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 流感病毒 |
| 1.1.1 流感病毒及其基因组结构 |
| 1.1.2 流感病毒的生命周期 |
| 1.1.3 流感病毒的聚合酶 |
| 1.1.4 流感病毒的启动子 |
| 1.1.5 核糖核蛋白复合物(RNP)的功能 |
| 1.1.6 宿主细胞对于流感病毒感染的免疫应答 |
| 1.1.7 对抗流感病毒感染的主要策略 |
| 1.1.8 流感病毒的反向遗传学技术及其应用 |
| 1.2 片段匹配性在流感病毒进化过程中的作用 |
| 1.2.1 抗原漂移和抗原转变 |
| 1.2.2 流感病毒的基因重配 |
| 1.2.3 片段匹配性在基因重配中的作用 |
| 第二章 甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素调节病毒RNA合成与蛋白表达研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞和质粒 |
| 2.2.2 主要的实验试剂 |
| 2.2.3 质粒构建 |
| 2.2.4 甲型和乙型流感病毒启动子序列的生物信息学分析 |
| 2.2.5 甲型和乙型流感病毒小型复制子系统的建立 |
| 2.2.6 Primer extension和Western blot分析 |
| 2.2.7 病毒拯救 |
| 2.2.8 病毒生长曲线的绘制 |
| 2.2.9 病毒滴度的测定 |
| 2.2.10 病毒RNA序列测定 |
| 2.2.11 甲型和乙型流感病毒聚合酶蛋白复合物的纯化 |
| 2.2.12 ApG-primed transcription |
| 2.2.13 二核苷酸复制起始试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 生物信息学分析确认甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素的存在 |
| 2.3.2 甲型和乙型流感病毒聚合酶对不同型别RNA模板的偏好性 |
| 2.3.3 甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素在识别二者聚合酶中的作用 |
| 2.3.4 甲型和乙型流感病毒启动子3'端第5个核苷酸的特性在调节体内聚合酶活性中的作用 |
| 2.3.5 甲型和乙型流感病毒启动子3'端第5个核苷酸的特性在调节体外聚合酶活性中的作用 |
| 2.3.6 甲型和乙型流感病毒型特异性启动子元素突变对病毒复制的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 全文总结 |
| 3.1 全文总结 |
| 3.2 研究中的不足和有待进一步解决的问题 |
| 3.3 前景与展望 |
| 参考文献 |
| 文章情况 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 双生病毒的研究意义和研究发展 |
| 1.1.1 植物双生病毒概述 |
| 1.1.2 双生病毒的分类与基因组结构 |
| 1.1.3 双生病毒的生活史 |
| 1.2 双生病毒卫星的研究进展 |
| 1.2.1 卫星DNA β编码的βC1蛋白功能研究进展 |
| 1.3 促分裂原活化蛋白激酶家族研究进展 |
| 1.3.1 植物免疫反应的基本介绍 |
| 1.3.2 促分裂原活化蛋白激酶研究进展 |
| 1.3.3 植物MAPKKK研究进展 |
| 1.3.4 植物MAPKK研究进展 |
| 1.3.5 植物MAPK研究进展 |
| 1.3.6 植物MAPK途径参与病原细菌与真菌的免疫反应 |
| 1.3.7 植物MAPK参与病毒的免疫反应 |
| 1.3.8 病原物对植物MAPK通路的抑制 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 常规实验方法 |
| 2.1.1 拟南芥培养和生长管理 |
| 2.1.2 烟草培养和生长管理 |
| 2.1.3 植物DNA提取 |
| 2.1.4 Genomic DNA电泳及转膜 |
| 2.1.5 Southern blot检测 |
| 2.1.6 植物RNA提取 |
| 2.1.7 反转录和RT-PCR |
| 2.1.8 蛋白在烟草中的瞬时表达 |
| 2.1.9 蛋白提取和Western blot杂交检测 |
| 2.1.10 重组目的蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 2.1.11 Pull down实验 |
| 2.1.12 酵母双杂交实验 |
| 2.1.13 酵母蛋白提取 |
| 2.1.14 农杆菌介导的拟南芥转化 |
| 2.2 常规实验试剂 |
| 2.2.1 酶和试剂 |
| 3 TYLCCNB编码的βC1蛋白与MAPK途径中MKK2与MPK4的互作机理研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和质粒载体 |
| 3.1.3 MKK2组成型磷酸化突变和MPK4激活基序无义突变构建 |
| 3.1.4 酵母双杂交实验 |
| 3.1.5 双分子荧光互补实验 |
| 3.1.6 亚细胞定位 |
| 3.1.7 免疫沉淀筛选βC1互作蛋白 |
| 3.1.8 互补荧光素酶检测蛋白质互作 |
| 3.1.9 免疫共沉淀验证βC1蛋白与MKK2和MPK4蛋白的互作 |
| 3.1.10 体外磷酸化实验 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 鉴定本氏烟MAPK激酶NbSIPKK蛋白为βC1的潜在互作蛋白。 |
| 3.2.2 酵母双杂交验证βC1与拟南芥MKK2的互作 |
| 3.2.3 互补荧光素酶实验验证βC1与MKK2的互作 |
| 3.2.4 双分子荧光互补实验验证βC1与MKK2的互作 |
| 3.2.5 免疫共沉淀验证βC1与MKK2的互作 |
| 3.2.6 双分子荧光互补实验确定βC1与MKK2的激酶功能域互作 |
| 3.2.7 体外磷酸化实验表明βC1抑制MKK2的激酶功能 |
| 3.2.8 体外磷酸化实验验证βC1抑制MPK4的激酶活性 |
| 3.2.9 酵母双杂交和互补荧光素酶实验确定βC1与MPK4的互作 |
| 3.2.10 双分子荧光互补实验确定βC1与MPK4的互作位置 |
| 3.2.11 βC1抑制MPK4二聚体的形成 |
| 3.3 讨论 |
| 4 TYLCCNV/TYLCCNB与植物MAPK途径的相关性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株和质粒 |
| 4.1.3 Flg22处理拟南芥幼苗 |
| 4.1.4 拟南芥胼胝质染色 |
| 4.1.5 粗提病毒感染的本氏烟内病毒粒子 |
| 4.1.6 flg22处理后野生型与35S-βC1过表达转基因拟南芥的转录组分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 中国番茄黄曲叶病毒的侵染能够激活烟草的MAPK途径 |
| 4.2.2 病毒粗提液激活拟南芥MAPK途径 |
| 4.2.3 βC1蛋白抑制flg22肽段对拟南芥MAPK的激活 |
| 4.2.4 βC1蛋白影响flg22肽段诱导拟南芥MAPK下游报告基因的转录 |
| 4.2.5 βC1蛋白影响flg22诱导的胼胝质沉积 |
| 4.2.6 βC1蛋白通过MKK2来抑制flg22对拟南芥MAPK的激活 |
| 4.2.7 βC1蛋白通过MKK2调节flg22诱导的MAPK下游报告基因的转录 |
| 4.2.8 βC1蛋白与MAPK途径中其他成员的互作验证 |
| 4.3 讨论 |
| 5 植物MKK2/MPK4途径对TYLCCNV/TYLCCNB致病性的影响研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株和质粒 |
| 5.1.3 拟南芥侵染 |
| 5.1.4 用CRISPR技术敲除本氏烟NbSIPKK和NbMPK4的位点选择和验证 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 mkk2突变体拟南芥具有更高的TYLCCNV+TYLCCNB侵染效率 |
| 5.2.2 本氏烟NbSIPKK敲除突变体具有更高的TYLCCNV病毒敏感性 |
| 5.2.3 本氏烟NbMPK4敲除突变体具有更高的TYLCCNV病毒敏感性 |
| 5.3 讨论 |
| 6 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录A 论文中常见专业名词中英文对照及缩写 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 |
| 附录C 各种反应体系及反应条件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩写及符号表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 艾滋病及 HIV-1 病毒相关研究进展 |
| 1.1.1 艾滋病发展及病毒概述 |
| 1.1.2 HIV-1 的结构 |
| 1.1.3 HIV-1 的生活周期 |
| 1.1.4 抗艾滋病药物作用机制 |
| 1.2 HIV-1 整合酶及其抑制剂研究进展 |
| 1.2.1 HIV-1 整合酶的结构 |
| 1.2.2 HIV-1 整合酶的功能 |
| 1.2.3 以 HIV-1 整合酶为靶点的抑制剂研究进展 |
| 1.3 整合酶抑制剂体外筛选方法研究进展 |
| 1.3.1 放射自显影方法 |
| 1.3.2 酶联免疫吸附方法 |
| 1.3.3 基于荧光的检测方法 |
| 1.3.4 基于微孔板的磁珠方法 |
| 1.4 计算机辅助模拟用于抑制剂虚拟筛选研究进展 |
| 1.4.1 分子对接和分子模拟 |
| 1.4.2 定量构效关系和药效团模型 |
| 1.4.3 用机器学习和支持向量机方法建模 |
| 第2章 整合酶蛋白表达纯化及链转移活性鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组整合酶蛋白的表达纯化 |
| 2.3.2 重组整合酶蛋白浓度 |
| 2.3.3 重组整合酶蛋白反应活性鉴定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 整合酶链转移反应抑制剂荧光筛选方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 整合酶链转移反应抑制剂荧光筛选方法的原理 |
| 3.3.2 整合酶链转移反应抑制剂荧光筛选的结果 |
| 3.3.3 应用荧光方法筛选整合酶抑制剂的有效性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于支持向量机的整合酶抑制剂活性预测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 支持向量机算法 |
| 4.2.2 样本数据来源和结构参数计算 |
| 4.2.3 筛选描述符 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 建立基于支持向量机的预测模型 |
| 4.3.2 活性预测结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文和申请专利 |
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 耐核苷(酸)类似物变异HBV表达载体的构建以及稳定细胞系筛选体系的建立优化 |
| 一. 前言 |
| 二. 材料与方法 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 高表达耐拉米夫定HBV稳定细胞株的建立 |
| 一. 前言 |
| 二. 材料与方法 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 高表达耐阿德福韦HBV稳定细胞株的建立 |
| 一. 前言 |
| 二. 材料与方法 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 表达耐恩替卡韦HBV稳定细胞株的建立 |
| 一. 前言 |
| 二. 材料与方法 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结从及展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.1.1 病因学及流行病学 |
| 1.1.2 临床表现 |
| 1.1.3 病理病变 |
| 1.1.4 DVE 的诊断 |
| 1.1.5 鸭病毒性肠炎的防制 |
| 1.2 鸭肠炎病毒生物学特性 |
| 1.2.1 DEV 的分类学地位 |
| 1.2.2 形态特征 |
| 1.2.3 理化特性 |
| 1.2.4 培养特性 |
| 1.2.5 抗原性 |
| 1.2.6 DEV 的形态发生与细胞的超微结构变化 |
| 1.3 DEV 分子生物学研究进展 |
| 1.3.1 DEV 基因组序列的测定 |
| 1.3.2 DEV 基因组结构 |
| 1.4 α-疱疹病毒的复制 |
| 1.4.1 病毒吸附并进入宿主细胞 |
| 1.4.2 脱去外膜的衣壳进入细胞核 |
| 1.4.3 重塑宿主细胞核 |
| 1.4.4 病毒基因表达 |
| 1.4.5 病毒DNA 复制 |
| 1.4.6 病毒衣壳包装 |
| 1.4.7 病毒子释放 |
| 1.5 UL15 的基因结构及编码蛋白功能 |
| 1.6 病毒宿主关闭蛋白(UL41)的功能 |
| 1.6.1 疱疹病毒诱导宿主关闭的一般特征 |
| 1.6.2 VHS 的作用机理 |
| 1.6.3 VHS 的生物学功能 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 第二章 鸭肠炎病毒UL15 基因及其编码蛋白的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 试剂盒、限制性酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 DEV 在CEF 上的增殖及滴度测定 |
| 2.1.7 DEV 病毒的纯化 |
| 2.1.8 CEF 总RNA 的提取 |
| 2.1.9 RT-PCR 法扩增UL15 基因编码序列 |
| 2.1.10 UL15 基因剪切位点的确定 |
| 2.1.11 地高辛标记的Northern blot 探针的制备 |
| 2.1.12 探针标记效率的测定 |
| 2.1.13 RNA 的变性电泳及转膜 |
| 2.1.14 RNA 的固定及Northern 杂交 |
| 2.1.15 DEV 感染CEF 细胞mRNA 的纯化 |
| 2.1.16 5′-cDNA 末端快速扩增(5′-RACE) |
| 2.1.17 3′-cDNA 末端快速扩增(3′-RACE) |
| 2.1.18 DEV UL15 基因的序列分析 |
| 2.1.19 pET-UL15C~(232) 原核载体的构建 |
| 2.1.20 6×His-UL15C~(232) 融合蛋白在 E.coli 中的表达及纯化 |
| 2.1.21 兔抗 6×His-UL15C~(232) 抗血清的制备 |
| 2.1.22 Western blot |
| 2.1.23 UL15 基因表达时相分析 |
| 2.1.24 UL15 真核表达质粒的构建及中量提取 |
| 2.1.25 UL15 在CEF 细胞上的瞬时表达 |
| 2.1.26 UL15 基因产物在CEF 细胞中的定位 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 DEV 病毒的增殖与纯化结果 |
| 2.2.2 UL15 RT-PCR 扩增结果 |
| 2.2.3 UL15 Northen 探针的标记结果 |
| 2.2.4 UL15 Northern blot 结果 |
| 2.2.5 UL15 基因剪切位点的确定 |
| 2.2.6 UL15 基因末端序列的扩增结果 |
| 2.2.7 UL15 基因的序列分析结果 |
| 2.2.8 6×His-UL15C~(232) 融合蛋白抗血清的制备 |
| 2.2.9 Western blot 检测感染细胞内UL15 蛋白的表达 |
| 2.2.10 UL15 基因的表达时相结果 |
| 2.2.11 病毒粒子与兔抗UL15C~(232) 抗血清的反应性 |
| 2.2.12 UL15 基因在CEF 中的瞬时表达 |
| 2.2.13 UL15 表达产物在CEF 中的亚细胞定位 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 DEV UL15 基因结构 |
| 2.3.2 UL15.5 基因的序列分析 |
| 2.3.3 DEV UL15 可能的功能 |
| 2.3.4 DEV 的分类地位-基于UL15 氨基酸序列的分析 |
| 2.3.5 UL15C~(232) 的原核表达 |
| 2.3.6 UL15 的表达时序性 |
| 2.3.7 UL15 在病毒粒子中的存在性 |
| 2.3.8 UL15 在感染细胞中的亚细胞定位 |
| 第三章 鸭肠炎病毒UL41 基因及其编码蛋白的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒与细胞 |
| 3.1.2 质粒与菌种 |
| 3.1.3 试剂盒、限制性酶类及主要生化试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.1.6 DEV UL41 的序列分析 |
| 3.1.7 PCR法扩增UL41及US3基因序列 |
| 3.1.8 UL41 蛋白的原核表达 |
| 3.1.9 可溶性MBP-VHS 融合蛋白的纯化 |
| 3.1.10 VHS 底物RNA 的制备 |
| 3.1.11 RNA 的提取及电泳 |
| 3.1.12 体外VHS 活性检测 |
| 3.1.13 兔抗GST-UL41 抗血清的制备 |
| 3.1.14 Western blot |
| 3.1.15 UL41 基因表达时相分析 |
| 3.1.16 UL41 真核表达质粒的构建及中量提取 |
| 3.1.17 UL41 在CEF 细胞上的瞬时表达 |
| 3.1.18 UL41 基因产物在CEF 细胞中的定位 |
| 3.1.19 UL41 的定点突变 |
| 3.1.20 瞬时表达UL41 的VHS 活性检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 UL41 序列分析结果 |
| 3.2.2 UL41 及US3的PCR结果 |
| 3.2.3 UL41 的原核表达 |
| 3.2.4 UL41 的纯化 |
| 3.2.5 US3 体外转录物的制备 |
| 3.2.6 UL41 的体外VHS 活性检测 |
| 3.2.7 兔抗DEV UL41 血清的反应性 |
| 3.2.8 UL41 在DEV 感染的CEF 中的表达 |
| 3.2.9 UL41 基因的表达时相结果 |
| 3.2.10 Western blot 检测DEV 病毒粒子中的UL41 |
| 3.2.11 UL41 在感染细胞中的亚细胞定位 |
| 3.2.12 UL41 的瞬时表达及其VHS 活性的测定 |
| 3.2.13 UL41 突变体表达载体的构建及瞬时表达 |
| 3.2.14 定点突变的UL41 VHS 活性检测 |
| 3.2.15 保守性氨基酸位点的功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 DEV UL41 的序列分析 |
| 3.3.2 DEV 的分类地位-基于UL41 的分析 |
| 3.3.3 UL41 的可溶性表达及纯化 |
| 3.3.4 UL41 表达的时序性 |
| 3.3.5 UL41 是病毒粒子的组成部分 |
| 3.3.6 UL41 在感染细胞中的分布 |
| 3.3.7 UL41 的VHS 活性 |
| 3.3.8 VHS 活性的关键位点 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 主要英文缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 HIV 和艾滋病概述 |
| 1.1.1 艾滋病的流行现状 |
| 1.1.2 HIV-1 的结构 |
| 1.1.3 HIV-1 的生活周期与致病过程 |
| 1.2 艾滋病防治的研究进展 |
| 1.2.1 艾滋病的化学药物治疗 |
| 1.2.2 艾滋病疫苗研制进展 |
| 1.2.3 中草药在艾滋病防治中的应用 |
| 1.2.4 基因治疗及其他防治艾滋病的方法 |
| 1.3 以整合酶为靶点的抗艾滋病药物研究进展 |
| 1.3.1 整合酶的结构和功能 |
| 1.3.2 整合酶抑制剂的研究进展 |
| 1.4 以整合酶为靶标的抑制剂筛选方法研究进展 |
| 1.4.1 放射自显影方法 |
| 1.4.2 基于微孔板的酶联免疫吸附测定法 |
| 1.4.3 基于荧光共振能量转移方法 |
| 1.4.4 其他检测方法 |
| 第2章 整合酶蛋白表达纯化及3′加工活性高通量检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组整合酶蛋白表达质粒pNL-IN 的构建 |
| 2.3.2 重组整合酶蛋白的表达纯化及功能鉴定 |
| 2.3.3 整合酶3′加工反应活性高通量检测方法的建立 |
| 2.3.4 应用整合酶3′加工反应活性高通量检测方法测定整合酶抑制剂 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 整合酶链转移活性高通量检测方法的建立及应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 整合酶链转移反应活性高通量ELISA 检测的原理 |
| 3.3.2 整合酶链转移反应活性高通量ELISA 检测的结果 |
| 3.3.3 应用高通量ELISA 研究金属离子对整合酶链转移反应的影响 |
| 3.3.4 应用高通量ELISA 筛选整合酶抑制剂的有效性 |
| 3.3.5 应用高通量ELISA 从真菌代谢产物中筛选整合酶抑制剂 |
| 3.3.6 应用高通量ELISA 测定合成化合物对整合酶活性抑制效果 |
| 3.3.7 高通量ELISA 的统计分析结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 整合酶去整合活性高通量检测方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 PCR 引物合成 |
| 4.2.2 寡核苷酸链底物合成修饰 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 野生型整合酶和整合酶核心区蛋白的表达纯化及活性鉴定 |
| 4.3.2 去整合高通量ELISA 的灵敏度和特异性 |
| 4.3.3 应用去整合高通量ELISA 研究金属辅助离子的选择偏好性 |
| 4.3.4 应用去整合高通量ELISA 测定抑制剂对整合酶活性的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 整合酶核心区野生型和F185K 可溶性突变型活性和溶解性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 分子生物学实验 |
| 5.2.2 整合酶核心区模型搭建 |
| 5.2.3 分子动力学模拟 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 野生型和F185K 突变型整合酶核心区溶解性和活性比较 |
| 5.3.2 分子动力学模拟结果分析 |
| 5.3.3 溶剂可接近面积与氢键分析 |
| 5.3.4 整合酶核心区蛋白的结构分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 主要结论 |
| 论文创新点 |
| 展望及建议 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文和申请专利 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述 |
| 第一章 羊痘研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 羊痘病的发病概况 |
| 3 病毒感染机制 |
| 4 发病机理 |
| 5 临床症状 |
| 6 病理变化 |
| 7 羊痘的诊断 |
| 8 羊痘的免疫及疫苗 |
| 9 防制措施 |
| 10 病毒的基因组研究进展 |
| 11 羊痘病毒研究的展望 |
| 第二章 基因克隆与表达 |
| 1 基因的研究历史 |
| 2 基因工程 |
| 3 基因表达系统 |
| 3.1 原核表达系统 |
| 3.2 真核表达系统 |
| 研究内容 |
| 第一部分 山羊痘病毒某些生物学特性及PCR鉴定方法的研究 |
| 第三章 山羊痘病毒贵州分离株的某些生物学特性研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 流行病学调查结果 |
| 2.2 正常细胞形态观察 |
| 2.3 GPV引起的细胞病变观察 |
| 2.4 感染细胞内GPV的荧光抗体检测结果 |
| 2.5 细胞培养物中GPV颗粒的电镜观察 |
| 2.6 GPV引起的显微病理形态观察 |
| 2.7 GPV病毒颗粒的超微观察 |
| 3 讨论 |
| 第四章 山羊痘病毒PCR鉴定方法的建立与应用 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 基于P32基因PCR方法的建立 |
| 2.2 基于ITR基因PCR方法的建立 |
| 2.3 P32基因和ITR基因的序列分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 山羊痘病毒TAQMAN-MGB实时定量荧光PCR鉴定方法的建立与应用 |
| 摘要 |
| Abtsract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 标准质粒的构建 |
| 2.3 FQ-PCR反应体系的优化 |
| 2.4 FQ-PCR的重复性检验 |
| 2.5 标准曲线的构建 |
| 2.6 FQ-PCR的特异性 |
| 2.7 FQ-PCR的应用 |
| 3 讨论 |
| 第六章 山羊痘人工感染试验 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GPV细胞培养物的TCID_(50)值的确定 |
| 2.2 动物模型的流行病学结果 |
| 2.3 实验羊的临床剖检变化 |
| 2.4 感染羊组织病料中GPV的普通PCR检测 |
| 2.5 病羊组织中GPV的FQ-PCR检测结果 |
| 2.6 病变材料中GPV的细胞分离鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 P32基因的研究 |
| 第七章 GPV P32基因的克隆测序及序列分析 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 目的DNA的克隆 |
| 2.3 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.4 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.5 测序序列核苷酸和氨基酸同源性分析 |
| 2.6 测序序列的系统进化树分析 |
| 3 讨论 |
| 第八章 GPV P32基因的生物信息学分析 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GPV P32基因的核苷酸同源性分析结果 |
| 2.2 P32蛋白的跨膜结构预测 |
| 2.3 P32蛋白的亲水性分析 |
| 2.4 P32蛋白抗原指数、骨架柔韧性、表面可及性预测 |
| 2.5 P32蛋白二级结构的预测 |
| 2.6 P32蛋白B细胞抗原表位的综合评价 |
| 3 讨论 |
| 第九章 GPV P32基因的原核表达 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 P32基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 重组表达质粒的PCR鉴定 |
| 2.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.4 目的蛋白的表达结果 |
| 2.5 表达产物的Western-Blotting分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第十章 GPV P32基因的真核表达 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 阳性重组质粒的鉴定 |
| 2.3 重组酵母菌的Mut型鉴定结果 |
| 2.4 重组酵母菌基因组PCR鉴定结果 |
| 2.5 表达蛋白的SDS-PAGE分析结果 |
| 2.6 表达蛋白的Western-Blotting分析结果 |
| 3 讨论 |
| 第十一章 P32表达蛋白的抗原性分析及间接ELISA方法的建立 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛋白纯化的结果 |
| 2.2 P32蛋白的抗原性检测 |
| 2.3 间接ELISA方法的建立 |
| 2.4 GPV P32间接ELISA判定标准的确定 |
| 2.5 ELISA方法的特异性检测 |
| 2.6 重复性试验 |
| 2.7 ELISA方法的临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 细胞凋亡研究 |
| 第十二章 山羊痘病毒诱导BHK-21细胞凋亡的检测 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 H.E染色 |
| 2.2 活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的鉴别 |
| 2.3 TUNEL法检测 |
| 2.4 Annexin V-FITC检测 |
| 2.5 DNA Ladder检测 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 发表论文与参见学术会议情况 |
| 附录二 主要英文缩写及含义 |
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 水泡性口炎病毒研究进展 |
| 1 VSV的形态结构及化学组成 |
| 2 VSV基因组成、结构蛋白及其功能 |
| 3 VSV的分子致病机制 |
| 4 水泡性口炎病毒的检测技术 |
| 5 VSV在抗病毒、抗肿瘤方面的应用 |
| 6 结语 |
| 第二章 病毒细胞膜受体的筛选与鉴定研究进展 |
| 1 病毒受体的生物学特性及其功能 |
| 2 病毒受体的筛选与鉴定方法 |
| 3 结语 |
| 第三章 噬菌体展示技术的研究进展 |
| 1 噬菌体展示技术的产生 |
| 2 噬菌体展示技术的原理 |
| 3 噬菌体展示技术的特点 |
| 4 噬菌体系统的种类 |
| 5 噬菌体展示文库的种类 |
| 6 噬菌体展示文库的筛选 |
| 7 噬菌体展示文库的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新生犊牛口腔黏膜上皮细胞的原代培养 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 水泡性口炎病毒感染犊牛口腔黏膜上皮细胞的超微结构变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 CPMBCs cDNA噬菌体展示文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 水泡性口炎病毒CPMBCs膜受体的初步筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
