杨梦璐[1]（2021）在《壳聚糖基防龋基因疫苗载体的制备及性能研究》文中研究表明目的:利用壳聚糖作为载体的主要成分,制备壳聚糖/海藻酸钠p H敏感型复合载体包覆防龋基因疫苗,通过体外实验和动物实验观察载体的理化性能及生物学性能。方法:1、壳聚糖/海藻酸钠（CS/SA）复合载体的制备:通过向壳聚糖溶液中掺入一定比例的海藻酸钠和鱼精DNA,使其整体保持正电荷状态,然后加入三聚磷酸钠使其交联,之后在其外部再包覆一层海藻酸钠,利用钙离子使海藻酸钠交联形成钙壳层。2、负载p VAX1-Spap/A质粒的壳聚糖/海藻酸钠复合载体的制备:在前述实验已经初步掌握了载体制备的合适条件（搅拌速度、滴加速度、试剂比例、温度等）的基础之上,向壳聚糖溶液中加入提取的基因疫苗——p VAX1-Spap/A质粒,并加入一定以比例的鱼精DNA以减少基因疫苗释放后体内环境中的核酸酶对其的降解。然后加入三聚磷酸钠使其交联,并使其外部包覆一层海藻酸钠,利用钙离子使海藻酸钠交联形成钙壳层。控制内层壳聚糖和外部海藻酸钠的比例,在体外模拟环境下检测复合载体的理化性能。3、动物实验:将21只清洁级雌性SD大鼠随机分为3组,分别为空白对照组、CS/SA疫苗载体组、空载体组。第28天开始免疫,实验组以100μg/m L剂量免疫,加强免疫3周,首次免疫前1天及每次免疫后7天采取血液、唾液,直至第7周,第7周样本采集完成后处死大鼠。通过间接ELISA法检测1-7周血清中Ig G及唾液中Ig A的变化水平。结果:1、在制备空载载体的基础上制备了的负载p VAX1-Spap/A质粒的CS/SA基因疫苗复合载体,复合载体的具有较好的机械性能,其冻干粉呈现为多孔团聚结构,且具有较好的包封率,各种CS/SA的比例下的包封率均约90%以上。负载基因疫苗的载体在体外模拟胃液（p H=2.1）环境中的释放实验显示,疫苗24小时内的释放率为0.3%-3.2%,在体外模拟肠液（p H=7.4）环境中的释放实验显示,疫苗24小时内的释放率为31.2%-68.7%。2、负载重组质粒p VAX1-Spap/A的CS/SA复合载体组具有免疫原性,能诱导机体产生特异性抗体,与对照组（空白对照组及空载体组,下同）抗体水平差异具有统计学意义。结论:1、负载重组质粒p VAX1-Spap/A的CS/SA复合载体在体外展现了对p H敏感的缓释效能,对基因疫苗在低p H环境下展现了一定的保护性能。2、负载重组质粒p VAX1-Spap/A的CS/SA复合载体与对照组之间的抗体水平具有统计学差异,能携带基因疫苗引起免疫应答。
黄岚[2]（2021）在《基于小鼠Survivin抗原的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导特异性抗肿瘤免疫反应的研究》文中认为目的:诱导Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽的淋巴细胞,探究MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞在抗肿瘤免疫反应中的功能特点。方法:一、用Net MHCIIpan 4.0和SYFPEITHI两个预测T细胞表位的在线预测系统对小鼠Survivin抗原15个氨基酸的MHC-Ⅱ类表位进行筛选。将筛选出的MHC-Ⅱ类表位肽进行合成,制成肽疫苗,免疫C57BL/6野生型小鼠,分离其脾脏淋巴细胞。诱导Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽的淋巴细胞,利用流式和钙黄绿素检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞对小鼠黑色素瘤B16F10细胞的作用。利用Western Blot检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞与B16F10细胞共培养后颗粒酶B和穿孔素的表达情况。利用ELISA检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的淋巴细胞中IFN-γ和IL-10的分泌情况。二、设计了针对小鼠Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位基因的表位盒。利用基因工程的方法分别构建含有Survivin抗原的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位的小鼠Survivin抗原表位基因疫苗。三、用B16F10黑色素瘤细胞对小鼠进行荷瘤,建立荷瘤小鼠模型。在不同的时间点,将带有Survivin抗原的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位的基因疫苗用脂质体包裹,通过尾静脉注射到小鼠体内。观察肿瘤生长变化,测量肿瘤体积大小和重量,通过HE染色和IHC的方法检测肿瘤局部淋巴细胞的浸润情况,QPCR法检测肿瘤局部浸润CD8+T细胞的耗竭程度。结果:在体外细胞学实验中,Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞对小鼠黑色素瘤B16F10细胞系具有一定的杀伤作用,与对照组相比,颗粒酶B和穿孔素的表达也有所增加。当Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞共同作用时,杀伤效果更佳。MHC-Ⅱ类表位肽诱导组中IFN-γ表达量高而IL-10表达量低,说明Survivin抗原MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞主要是Th1类细胞。体内动物实验中,Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位基因疫苗能够有效抑制肿瘤的生长。与早期治疗和晚期治疗组相比,肿瘤疫苗预防组的肿瘤生长大大减缓,治疗效果更显着。无论进行早期还是晚期治疗,肿瘤生长均能得到有效控制。HE染色和IHC的结果显示,实验组中肿瘤局部坏死细胞更多,淋巴细胞的浸润也更多。在MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位基因疫苗共同作用时,肿瘤局部浸润的CD8+T细胞表面抑制性受体PD-1,Tim-3,2B4的表达有所下降,说明MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类抗原表位联合作用时可能降低了肿瘤局部浸润T细胞的耗竭程度。结论:小鼠Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位肽诱导的T淋巴细胞在体外对B16F10细胞具有一定的杀伤功能。基于小鼠Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ表位的基因疫苗可以激活抗原特异性T细胞的应答,从而发挥抗肿瘤作用,有效控制小鼠肿瘤的生长。
尹良伟[3]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中认为自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
韦芊含[4]（2020）在《shRNA干扰Vegfr2研究洛克沙胂体内促血管作用及对VEGFR2-mTOR的影响》文中提出洛克沙胂（Roxarsone,Rox）具有促生长、抗菌、抗球虫等功效,作为饲料添加剂在畜禽生产中被广泛使用。但近年来研究表明Rox在体内外可促进血管生成,存在着诱导血管新生相关疾病发生的风险。VEGF可与血管内皮细胞表面的VEGFR2结合进而将信号传导至下游,对血管新生发挥调控作用。mTOR是PI3K/AKT信号通路的下游分子,在肿瘤生成和血管生成中具有调控作用。本课题组前期研究中发现Rox在体内外能够促进血管生成,使VEGF/VEGFR2以及PI3K/AKT表达上调。本文借助课题组前期构建的靶向Vegfr2基因shRNA重组慢病毒,转染大鼠血管内皮细胞并用于小鼠基质胶塞模型,以及利用小鼠黑色素移植瘤模型的体内试验,通过Rox或雷帕霉素处理,考察对基质胶塞、移植瘤及其血管生长的影响;Western Blot检测VEGF/VEGFR2、mTOR相关蛋白的表达,研究Rox体内促血管生成中VEGF/VEGFR2-mTOR 调节机制。在小鼠基质胶塞模型的体内试验中,血管内皮细胞与基质胶注射于小鼠皮下,建立基质胶塞模型。不同处理如下:PBS组、1.0 μM Rox处理组、shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）。测定胶塞的重量、体积及血红蛋白含量,并对胶塞进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明,Rox组基质胶塞体积、重量及血红蛋白含量均显着增加,分别是PBS组的2.10、1.69、1.49倍;胶塞组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达水平亦显着升高（P<0.05）。与Rox组相比,Rox+RNAi组胶塞的体积、重量、血红蛋白、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显着调降低（P<0.05）。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显着抑制Rox对基质胶塞的生长及其血管生成的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显着抑制作用。在小鼠B16F10黑色素移植瘤模型中,不同处理分组如下:PBS组、25 mg/kg Rox组、shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）、阴性shRNA感染对照组（NC组）。重组慢病毒与B16F10细胞注射于小鼠腋下,于注射第二天连续7天灌胃给予Rox或PBS,每天1次。测量小鼠体重、肿瘤体积及重量;肿瘤组织进行HE染色及CD34免疫组化分析,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox处理组小鼠的移植瘤体积和重量均显着增加,瘤重约为PBS组的1.53倍;Rox+RNAi组瘤重极显着减小,约是Rox组的0.65倍。Rox组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达均显着上调（P<0.05）。与Rox组比较,Rox+RNAi组肿瘤组织中VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白表达均显着降低（P<0.05）。靶向Vegfr2基因shRNA干扰可显着抑制Rox对B16F10移植瘤及其血管生长的促进作用,对Rox引起的mTOR信号上调也有显着抑制。在大鼠血管内皮细胞的体外试验中,不同处理分为PBS组、1.0μM Rox处理组、靶向Vegfr2基因shRNA干扰与Rox共处理组（Rox+RNAi组）、shRNA干扰组（RNAi组）、Rox与雷帕霉素共处理组（Rox+RAPA组）、雷帕霉素处理组（RAPA组）和shRNA阴性对照组（NC组）。MTT法检测血管内皮细胞的活性,Western Blot检测VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR的表达。结果表明Rox能够促进血管内皮细胞生长,显着上调VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白的表达（P<0.01）。与Rox组比较,Rox+RNAi组细胞活力、VEGF、VEGFR2、mTOR和p-mTOR蛋白水平均显着降低（P<0.05）;Rox+RAPA组VEGFR2及mTOR表达无显着差异,但VEGF和p-mTOR的表达极显着降低（P<0.001）。靶向Vegfr2基因的RNA干扰可显着抑制Rox对内皮细胞生长,及VEGF/VEGFR2-mTOR信号的促进作用;RAPA可抑制Rox对内皮细胞的促进作用,并下调VEGF、p-mTOR蛋白的表达。综上所述,洛克沙胂在体内可显着促进基质胶塞和小鼠黑色素移植瘤的生长及其血管生成,靶向Vegfr2基因RNAi可有效抑制洛克沙胂对基质胶塞和黑色素移植瘤的生长及血管生成。VEGF/VEGFR2-mTOR信号在Rox体内促血管生成中发挥重要调节作用。
周仪[5]（2020）在《MUC1-survivin治疗性癌症疫苗的药代动力学与组织分布研究》文中研究说明癌症由于其逐年迅速攀升的高致病率及死亡率,严重威胁着人们的生存健康及生活质量。肿瘤免疫治疗作为随现代生物技术进步,应运而生的第四种肿瘤治疗方式,由于其良好的治疗效果,得到广泛关注。肿瘤基因疫苗具有制备简单,成本低、安全性高等特点,成为研究最为广泛的肿瘤免疫治疗方式。但肿瘤基因疫苗作为含有抗原、能够诱导机体免疫反应、产生特异性免疫、从而杀伤肿瘤的生物制剂,其长期稳定性及安全性是非临床研究的主要内容。对于肿瘤疫苗的非临床安全性研究,不仅要评价急性毒性试验、重复给药毒性试验、过敏试验等毒理学角度涉及的安全性内容,还必须通过组织分布,定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律,从药代动力学角度提供理论支撑。本课题组,前期已构建以双顺反子为载体、两种肿瘤相关抗原survivin和MUC1为免疫原、CpG基序和IL-2为免疫佐剂的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS,并且已完成BALB/c小鼠肌肉单次注射给药毒性试验、豚鼠全身主动过敏试验、家兔肌肉注射刺激性试验,为疫苗的临床应用提供了毒理学相关参考数据。基于以上前期研究基础,本论文将继续完成非临床安全性检测的组织分布及药代动力学研究,从定量分析的角度,为疫苗临床应用提供支撑。首先对质粒标准品CpDV-IL2-sPD1/MS进行序列分析,针对序列特点特异性设计引物,而后以质粒标准品及小鼠基因组DNA分别为模板,进行Q-PCR反应,分析CT值结果并考虑后续实验进行可行性,综合分析,确定选择引物IL-2（Y）继续进行后续实验。在确定引物后,进行方法学的建立,包括对引物浓度、引物退火温度、反应体系DNA载量等相关内容优化。在方法学建立过程中,主要采用单一变量法,始终以质粒标准品为模板,以灭菌水为阴性对照,进行梯度试验,确定了Q-PCR的反应体系,其中最适引物浓度为200 nM、引物最适退火温度为60℃、反应体系最大DNA载量为0.2 ug。而后对方法学从线性及线性范围、准确度、精密度、灵敏度等方面进行验证。确立质粒标准品在102-108拷贝/反应范围内建立的标准曲线,具有良好线性,线性系数（R2）大于0.99,PCR反应扩增效率在0.9-1.1之间,且检测方法对质粒标准品灵敏准确,相对回收率在50%-200%之间,RSD小于20%,灵敏度为62.5拷贝/ug genome。综上,完成整体方法学的建立与验证。提取给药后不同时间点的小鼠基因组DNA,运用建立并验证的方法学,进行Q-PCR反应,对组织样品中四个取样时间点的768例实验样品进行绝对定量分析。从组织分布结果可见,疫苗在给药后,首先在注射部位及血液中被检测到,而后在所选取的十六个组织部位均有分布,最后在脑组织中仍有少许残留。由此,可判断疫苗注射后,在体内的代谢呈快速吸收与分布,缓慢消除的特点。综上,本论文完成了课题组研制的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS的非临床安全性检测中组织分布及药代动力学研究,首次采用Q-PCR法,对组织样品中疫苗含量进行绝对定量分析,进一步证实了疫苗的安全性,也提供了下一步探讨研究的主要方向,为疫苗进入临床试验阶段,提供了科学、可靠的理论依据。
姜俊男[6]（2020）在《胃癌腹膜转移中eIF4E调控的STEAP1促进胃癌进展》文中指出研究目的:胃癌作为一种恶性肿瘤,其患者经常发生转移,腹膜转移最为常见,但是其转移的确切机制仍不清楚,胃癌腹膜转移被认为是胃癌治疗的难题。此外,目前尚无治疗胃癌腹膜转移的标准方式,所以明确胃癌患者发生腹膜转移的机理非常必要,本文旨在探究胃癌发生腹膜转移过程中的重要分子STEAP1在胃癌中表达的调控机制及对胃癌进展的影响。研究方法:收集20名胃癌腹膜转移患者的癌及癌旁组织,并分离两种组织样本中的多聚核糖体,并进行qRT-PCR实验鉴定胃癌腹膜转移患者两种样本多聚核糖体中基因（上皮至间质转化过程（EMT）相关）的差异表达谱。蛋白酶体抑制剂MG-132处理HMrSv5细胞和MKN45细胞以抑制蛋白酶体降解。荧光素酶实验用于检测STEAP1的翻译调控机制。MNK抑制剂CGP57380处理MKN45细胞以抑制eIF4E磷酸化。细胞迁移通过Transwell迁移实验检测,细胞侵袭使用Transwell侵袭实验检测。建立异种种植瘤检测肿瘤生长能力变化。研究结果:通过比较胃癌腹膜转移患者的肿瘤组织和正常组织多聚核糖体的差异性变化,我们发现共49种差异表达的EMT相关基因,其中肿瘤组织多聚核糖体中30种基因上调,19种基因下调,其中STEAP1上调倍数最大。在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织中STEAP1蛋白质表达水平升高,在男性和女性患者中均是如此。但STEAP1 mRNA表达水平在男性和女性胃癌腹膜转移患者肿瘤组织和癌旁正常组织间无显着差异,该现象与蛋白酶体降解无关。荧光素酶实验显示STEAP1的mRNA在5’7mG cap依赖性翻译起始水平上受到调控。Western blot和qRT-PCR实验进一步证明STEAP1表达在翻译水平受p-eIF4E调控。此外,STEAP1高表达促进胃癌细胞迁移能力和侵袭能力,并促进异种种植瘤体内生长。结论:1.自胃癌腹膜转移患者癌及癌旁组织分离的多聚核糖体中,上皮至间质转化相关基因中共发现49种差异基因,其中30种基因上调,19种基因下调,其中STEAP1升高倍数最大。2.胃癌腹膜转移患者癌组织中STEAP1表达升高。3.STEAP1的表达在翻译起始阶段受到调控。4.STEAP1表达上调依赖于eIF4E及其磷酸化程度的调控。5.STEAP1高表达促进胃癌细胞迁移和侵袭能力及体内肿瘤生长能力。
黄浩强[7]（2020）在《超声联合微泡介导基因转染的规律研究与免疫应用》文中研究表明与传统重组蛋白疫苗相比,被称作“第三代”疫苗的基因疫苗,在病毒抗原蛋白的基因序列公布后的数周内可完成快速研发和生产,同时其高度模拟病毒感染的细胞内抗原表达方式可以诱导体液免疫及细胞免疫来实现病毒的预防和治疗。基因疫苗中,DNA疫苗更是具有存储稳定的优点。然而,现有DNA疫苗的临床转化仍面临基因转染效率低和免疫原性低的技术挑战。为此,本论文提出一种利用超声波联合正电性微泡介导声致穿孔效应来实现DNA疫苗在体转染和免疫的新技术。考虑到超声和微泡是诱导细胞声致穿孔损伤发生的能量控制关键。本论文首先在体外细胞实验中利用绿色荧光蛋白报告基因转染效率对声致穿孔声压参数（0.13,0.28,0.43和0.58MPa）和微泡电荷属性（正电性和中性）进行了优化研究。随后进一步在小鼠后腿胫骨前肌进行了荧光素酶报告基因的在体转染,并对不同声压参数下不同时间点荧光素酶表达量进行了小动物成像和定量测量。最后我们依据乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的基因序列合成了乙肝DNA疫苗,检验了声致穿孔介导乙肝DNA疫苗在体诱导抗体生成和免疫细胞激活的可行性。本论文研究结果发现,声致穿孔基因转染后细胞绿色荧光蛋白报告基因转染效率随超声声压参数增加而增加,且阳离子微泡的基因转染效果要优于中性微泡。进一步发现,阳离子聚合物PEI压缩后的基因质粒,其细胞转染效率显着优于未压缩质粒。小鼠在体荧光素酶基因的表达效率,同样随超声压力的增加而增加。对在体基因表达的时间分布进行研究发现小鼠在转染一天后出现明显的荧光素酶表达,其表达量在第四天达到高峰,之后保持在一定水平缓慢降低,在30天观察期有检测到荧光素酶蛋白的表达。为声致穿孔诱导基因疫苗在体长时间有效性的表达提供证据。通过声致穿孔技术在体递送乙肝DNA疫苗质粒后,成功诱导了部分小鼠产生免疫应答,在血清中检测出HBsAg抗体产生,说明了声致穿孔介导DNA疫苗免疫的可行性。
吴元玉[8]（2019）在《STEAP1调控胃癌腹膜转移过程中的肿瘤发生和化疗耐药性》文中认为研究目的:作为全球第三大最致死性肿瘤,胃癌的发病率和病死率仍然较高,危害较大。随着科技的进步和治疗手段的多样化,胃癌的5年生存率明显提高。但由于胃癌易发生转移,在治疗上仍存在巨大的挑战。胃癌的转移途径主要有直接浸润,血行转移,淋巴转移以及腹膜种植转移。目前对于胃癌细胞腹膜转移的分子机制尚不清晰,因此研究胃癌腹膜转移的机制显得尤为重要。研究发现:在胃癌腹膜转移过程中,转录后的调控机制发挥至关重要的作用,因此本部分实验主要筛选胃癌腹膜转移过程中在翻译水平存在表达差异的基因,以此寻找针对腹膜转移治疗的潜在分子靶点。STEAP1在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织和转染miR-3978拮抗剂的HMrSV5细胞中表达水平均显着上调,且上调幅度最大。STEAP1在前列腺癌、膀胱癌、尤因肉瘤等肿瘤中均发现表达水平显着上调,且可以调控肿瘤细胞的体外增殖、侵袭和迁移能力,以及调控体内肿瘤生长能力。但是STEAP1是否参与胃癌细胞的细胞增殖能力、侵袭能力和迁移能力的调控,目前机制尚不明确。因此本实验主要研究STEAP1表达水平变化对胃癌腹膜转移过程中的肿瘤发生和肿瘤细胞对化疗药物敏感性的调控作用。研究方法:收集20名胃癌腹膜转移患者的癌症组织样本和癌旁正常组织样本进行多聚核糖体分离,通过qRT-PCR技术分析在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织和癌旁正常组织的多聚核糖体中与上皮至间质转化过程相关基因的表达水平差异。然后使用转染miR-3978拮抗剂的人腹膜上皮细胞系HMRSv5细胞模拟腹膜转移,并提取转染miR-3978拮抗剂的HMRSv5细胞和未转染miR-3978拮抗剂的HMRSv5细胞中的多聚核糖体,使用qRT-PCR技术分析多聚核糖体中与上皮至间质转化过程相关基因的表达水平变化。随后再将siRNA-STEAP1转染至胃癌细胞系MKN45细胞以敲低胃癌细胞中STEAP1的表达水平。在STEAP1表达水平敲低后,使用MTT实验检测胃癌细胞增殖能力,Transwell细胞迁移实验检测胃癌细胞迁移能力,Transwell细胞侵袭实验检测胃癌细胞侵袭能力。使用稳定转染shRNA-STEAP1的胃癌MKN45细胞建立大鼠异种种植瘤,从而检测STEAP1调控体内肿瘤细胞生长能力。MTT实验检测STEAP1表达水平降低后胃癌MKN45细胞对于多西紫杉醇的敏感性。研究结果:通过比较胃癌腹膜转移患者的肿瘤组织和正常组织核糖体的差异性变化,我们发现共49种基因表达水平存在显着差异,其中30种基因在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织中的表达水平显着高于正常组织,19种基因在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织中的表达水平显着低于正常组织。30种表达水平显着上调的基因中前十位基因分别是:STEAP1、SPP1、VPS13A、MMP2、BMP1、ZEB1、TBP、ESR1、ZEB2、MMP9。其中STEAP1是在肿瘤组织中表达水平上调最显着的基因。19种表达水平显着下调的基因中下调最显着的前十位基因分别是:CDH1、KRT14、CALD1、FGFBP1、EGFR、CAV2、IL1RN、SPARC、GNG11、DSP。与未转染miR-3978拮抗剂的HMRSv5细胞相比,发现前者细胞中存在59种与上皮至间质转化相关的基因表达水平具有显着变化,其中42种基因表达水平显着上调,17种基因表达水平显着下调。42种表达水平显着上调的基因中上调最显着的前十位基因分别是:STEAP1、VCAN、SPP1、VPS13A、KRT19、FN1、TMEM132A、TGFB3、ZEB2、MMP9。而 STEAP1 是在转染 miR-3978 拮抗剂的 HMRSv5 细胞中表达水平上调最显着的基因。17种表达水平显着下调的基因中下调最显着的前十位基因分别是:KRT14、CDH1、FGFBP1、EGFR、CAV2、CAMK2N1、ERBB3、CALD1、SNAI2、SNAI1。此外,我们还发现有41种基因在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织与转染miR-3978拮抗剂的HMrSV5细胞中存在差异表达。胃癌细胞系MKN45细胞转染siRNA-STEAP1后,qRT-PCR实验验证STEAP1表达水平显着下调。STEAP1表达水平降低可显着抑制MKN45细胞体外增殖能力、细胞迁移能力和细胞侵袭能力。使用稳定转染两种shRNA-STEAP1的MKN45细胞建立的大鼠异种种植瘤模型,在STEAP1表达水平显着下调后,能够有效的抑制体内肿瘤细胞生长。在不同浓度多西紫杉醇处理后的HMrSV5细胞中,STEAP1表达水平上调可增强HMrSV5细胞活力,即HMrSV5细胞对多西紫杉醇敏感性降低。在不同浓度多西紫杉醇处理的MKN45细胞中,STEAP1表达水平下调后MKN45细胞活力降低,即MKN45细胞对于多西紫杉醇敏感性增加。结论:1.在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织和正常组织的多聚核糖体中,49种上皮至间质转化过程相关基因存在表达差异,包括30种表达水平显着上调的基因和19种表达水平显着下调的基因,其中STEAP1表达水平上调幅度最大。2.在转染miR-3978拮抗剂模拟腹膜转移的HMrSV5细胞多聚核糖体中,59种上皮至间质转化过程相关基因存在表达差异,包括42种表达水平显着上调的基因和17种表达水平显着下调的基因,同样发现STEAP1表达水平上调幅度最大。3.胃癌腹膜转移患者肿瘤组织与转染miR-3978拮抗剂的HMrSV5细胞存在41种共同差异表达基因,两种模型具有很高的相似性。4.在胃癌细胞系MKN45中,STEAP1表达水平降低可以抑制MKN45细胞的体外增殖能力、迁移能力和侵袭能力。5.STEAP1表达水平下调后,胃癌细胞系MKN45细胞建立的异种种植瘤体内生长被抑制。6.STEAP1表达水平上调可以降低人间皮细胞系HMrSV5对于多西紫杉醇的化疗敏感性,STEAP1表达水平下调可以显着增加MKN45细胞对多西紫杉醇治疗的化学敏感性。7.STEAP1可能是胃癌腹膜转移患者治疗的潜在生物靶点。
傅连臣,刘灵芝,侯佩强[9]（2019）在《DNA疫苗研究进展》文中研究说明DNA疫苗是当前基因研究、疫苗应用领域的一项重要课题,DNA免疫技术在疾病控制中发展迅速。本文探讨了DNA疫苗的免疫机制、技术特点及影响因素,并对几种DNA疫苗在医学上的研究进展以及应用前景作一综述。
林忠,谢群莉,李胜英,金慧,徐芬芬,谢丽云,蒋正立[10]（2019）在《HER-2/neu表位肿瘤疫苗研究进展》文中进行了进一步梳理原癌基因HER-2/neu（human epidermal growth factor receptor type 2）在乳腺癌（20%～40%）、结直肠癌（54%～100%）、卵巢癌（25%）等多种肿瘤中有扩增或过表达,故HER-2/neu蛋白是肿瘤候选靶标抗原之一,且已被证明具有开发抗乳腺癌疫苗的潜力。目前针对不同类型的HER-2疫苗,包括全细胞疫苗、全序列蛋白疫苗、肽疫苗、树突状细胞（DC）相关疫苗以及基因疫苗等展开了一系列研究,并取得一定进展。该文通过检索百度学术,PubMed,Springer以及ScienceDirect数据库,对近年来HER-2/neu肿瘤疫苗的制备及其抗肿瘤活性机制的研究进展进行综述。HER-2/neu肿瘤疫苗经抗原递呈细胞（APCs）展示,能够有效地激活CD4+T和CD8+T,并诱导特异性抗肿瘤免疫应答反应,其结构及组成佐剂的改变、融合表达以及DC诱导等疫苗设计工艺改变,能够显着地提高疫苗的免疫活性和抗肿瘤活性。HER-2疫苗在临床试验研究中发现能够有效地降低抗体药物治疗所致的耐药性,反复用药以及其它化疗药物的严重毒副作用等缺陷,并有效稳定地发挥抗肿瘤活性,为肿瘤的治疗提供一个崭新的视角。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 壳聚糖在纳米药物递送载体领域的应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 病例一 |
| 病例二 |
| 病例三 |
| 病例四 |
| 病例五 |
| 附件 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Survivin抗原表位生物学分析及体外细胞学验证 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 小鼠Survivin基因信息和氨基酸全序列 |
| 2.1.2 实验细胞系 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 实验材料合成 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠Survivin抗原表位的生物信息学分析 |
| 2.2.1.1 Net MHCIIpan4.0在线预测系统分析小鼠Survivin抗原表位 |
| 2.2.1.2 SYFPEITHI在线预测系统分析小鼠Survivin抗原表位 |
| 2.2.2 诱导Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位的T淋巴细胞 |
| 2.2.2.1 疫苗制备及免疫小鼠 |
| 2.2.2.2 制备小鼠脾脏淋巴细胞 |
| 2.2.3 钙黄绿素检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性 |
| 2.2.4 CFES-PI染色法检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞对B16F10 细胞的杀伤作用 |
| 2.2.5 Western Blot检测GZMB和perforin的表达 |
| 2.2.6 ELISA检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞作用B16F10 细胞IFN-γ和IL-10 分泌情况 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠Survivin抗原MHC-Ⅱ类表位的Net MHCIIpan4.0 预测结果. |
| 2.3.2 Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞形态学观察 |
| 2.3.3 Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞对B16F10细胞杀伤作用 |
| 2.3.4 CFSE-PI染色法检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用 |
| 2.3.5 Western Blot检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞与B16F10作用后GZMB和perforin的蛋白表达情况 |
| 2.3.6 ELISA检测Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位肽诱导的T淋巴细胞作用B16F10细胞后IFN-γ和IL-10分泌情况 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Survivin抗原表位基因疫苗的设计与构建 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 基因序列选择 |
| 3.1.2 序列分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 表位盒设计 |
| 3.2.2 真核密码子优化 |
| 3.2.3 表位盒的合成及基因疫苗的构建 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 筛选的Survivin抗原表位 |
| 3.3.2 表位盒设计与构建 |
| 3.3.3 蛋白酶体裂解预测 |
| 3.3.4 核苷酸密码子优化 |
| 3.3.5 表位盒的合成及基因疫苗的构建 |
| 3.3.5.1 质粒构建策略 |
| 3.3.5.2 测序结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 针对Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位的基因疫苗对荷黑色素瘤小鼠抗肿瘤作用 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 质粒、动物和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Western Blot检测Survivin基因的表达 |
| 4.2.2 质粒提取 |
| 4.2.3 C57BL/6小鼠黑色素瘤模型的建立 |
| 4.2.4 动物分组与免疫 |
| 4.2.5 HE染色与IHC |
| 4.2.6 小鼠肿瘤局部淋巴细胞的提取 |
| 4.2.7 RT-QPCR检测肿瘤及脾脏中耗竭相关基因的表达 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠B16F10黑色素瘤组织中表达Survivin抗原 |
| 4.3.2 Survivin抗原MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类表位对肿瘤生长的预防及治疗作用 |
| 4.3.3 肿瘤治疗作用与pcDNA3.1(+)空载体无关 |
| 4.3.4 HE染色和IHC免疫组化 |
| 4.3.5 PD-1、TIM-3、2B4耗竭相关基因表达情况 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 靶向VEGF/VEGFR2治疗的研究进展 |
| 1 VEGF与VEGFR |
| 1.1 VEGF家族 |
| 1.2 VEGF的受体VEGFR |
| 1.3 VEGFVEGFR与临床相关疾病 |
| 2 以VEGF/VEGFR2为靶点的肿瘤治疗 |
| 2.1 以VEGF/VEGFR2为靶点的抗肿瘤天然化合物 |
| 2.2 以VEGF/VEGFR2为靶点的抗肿瘤合成药物 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二部分 正文 |
| 第一章 靶向Vegfr2基因RNA干扰研究洛克沙胂体内促血管生成作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 shRNA对血管内皮细胞VEGFR2的干扰作用 |
| 2.2 靶向Vegfr2基因的shRNA在Rox促小鼠基质胶塞生长中的作用 |
| 2.3 靶向Vegfr2基因的shRNA在Rox促小鼠黑色素移植瘤生长中的作用 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 砷化合物与血管生成 |
| 3.3 关于体内血管生成试验的模型 |
| 3.4 关于靶向Vegfr2基因的RNA干扰 |
| 第二章 洛克沙胂体内促血管生成作用中VEGF/VEGFR2-mTOR的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对基质胶塞中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 2.2 对B16F10移植瘤中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 洛克沙胂体外促血管内皮细胞生长中VEGF/VEGFR2-mTOR的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对内皮细胞活力的影响 |
| 2.2 对内皮细胞中VEGF、VEGFR2、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 名词缩写注释表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤治疗 |
| 1.1.1 肿瘤治疗方式 |
| 1.1.2 肿瘤免疫治疗 |
| 1.1.3 肿瘤基因疫苗 |
| 1.2 疫苗非临床研究 |
| 1.2.1 疫苗非临床研究内容 |
| 1.2.2 疫苗非临床安全性研究 |
| 1.2.3 药代动力学与组织分布 |
| 1.3 论文的立题依据及实验设计 |
| 1.3.1 前期基础 |
| 1.3.2 本论文的立论依据 |
| 1.3.3 实验方案及框架 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂、仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物回溶 |
| 2.2.2 质粒标准品准备 |
| 2.2.3 待测样品准备 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR检测(qRT-PCR) |
| 2.2.5 qRT-PCR反应条件优化 |
| 2.2.6 标准曲线建立 |
| 2.2.7 方法验证 |
| 2.2.8 统计学处理方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 qRT-PCR法检测肿瘤基因疫苗组织分布方法学的建立 |
| 3.1.1 引物设计及选择 |
| 3.1.2 引物退火温度和浓度的优化选择 |
| 3.1.3 反应体系最大DNA载量 |
| 3.1.4 引物特异性 |
| 3.1.5 小结 |
| 3.2 标准曲线和定量范围 |
| 3.3 qRT-PCR法检测肿瘤基因疫苗组织分布的方法学的验证 |
| 3.3.1 准确度与精密度 |
| 3.3.2 灵敏度 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 BALB/c小鼠肌肉注射给予粘蛋白1-生存素治疗性癌症疫苗组织分布检测 |
| 3.4.1 动物个体各组织分布数据 |
| 3.4.2 试验样品再分析 |
| 3.4.3 组织分布浓度随时间变化情况 |
| 3.4.4 小结 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 胃癌 |
| 2.1.1 胃癌的流行病学特点 |
| 2.1.2 胃癌的病因及危险因素 |
| 2.1.3 胃癌的分类 |
| 2.1.4 胃癌的临床表现和症状 |
| 2.1.5 胃癌的筛查及诊断 |
| 2.1.6 现有胃癌治疗方法 |
| 2.1.7 胃癌的预后和预防 |
| 2.2 胃癌腹膜转移相关研究进展 |
| 2.2.1 胃癌转移概述 |
| 2.2.2 胃癌腹膜转移 |
| 2.2.3 胃癌腹膜转移治疗现状 |
| 2.3 STEAP1 |
| 2.3.1 STEAP家族及STEAP1 |
| 2.3.2 STEAP1 与胃癌发生发展关系 |
| 2.3.3 STEAP1 可作为胃癌潜在治疗靶点 |
| 2.3.4 STEAP1 调控化疗耐药性 |
| 2.4 eIF4E |
| 2.4.1 eIF4E概述 |
| 2.4.2 eIF4E的生物学功能 |
| 2.4.3 eIF4E的活化调控机制 |
| 2.4.4 elF4E在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.5 靶向elF4E的肿瘤治疗策略 |
| 2.4.6 小结 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 实验仪器与实验试剂 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 组织样本收集 |
| 3.3 细胞培养、传代、冻存 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞传代 |
| 3.3.3 细胞冻存 |
| 3.4 多聚核糖体提取 |
| 3.5 多聚核糖体RNA提取 |
| 3.6 多聚核糖体中基因检测-实时荧光定量PCR实验 |
| 3.7 胃癌组织中RNA提取实验 |
| 3.8 胃癌组织中STEAP1 检测-实时荧光定量PCR实验 |
| 3.9 细胞转染与转导 |
| 3.10 蛋白质提取 |
| 3.11 WESTERN BLOT |
| 3.12 荧光素酶报告子构建及荧光素酶检测 |
| 3.13 细胞侵袭实验 |
| 3.14 细胞迁移实验 |
| 3.15 裸鼠异种种植瘤实验 |
| 3.16 数据分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 STEAP1 在胃癌腹膜转移患者肿瘤组织多聚核糖体中表达水平显着上调 |
| 4.2 胃癌腹膜转移患者中STEAP1 表达水平受转录后调控机制调控 |
| 4.3 STEAP1 的表达水平在翻译起始阶段受到调控 |
| 4.4 STEAP1 表达上调依赖于EIF4E及其磷酸化能力 |
| 4.5 STEAP1 表达在翻译水平受P-EIF4E调控 |
| 4.6 STEAP1 促进胃癌细胞的迁移能力 |
| 4.7 STEAP1 促进胃癌细胞的侵袭能力 |
| 4.8 STEAP1 促进胃癌体内肿瘤生长 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 STEAP1在胃癌腹膜转移患者中STEAP1表达水平上调 |
| 5.2 STEAP1 表达在翻译水平受P-EIF4E调控 |
| 5.3 STEAP1 促进胃癌进展 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 背景介绍 |
| 1.1.1 基因疫苗 |
| 1.1.2 常用的基因转染方法 |
| 1.1.3 声致穿孔基因转染 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 声致穿孔基因转染的有效性和长效性研究 |
| 1.2.2 声致穿孔免疫增效的生物医学机制 |
| 1.2.3 声致穿孔基因转染技术已有应用领域 |
| 1.3 研究目的与内容 |
| 第2章 研究方法与材料 |
| 2.1 声致穿孔基因转染实验平台搭建 |
| 2.1.1 声致穿孔基因转染实验平台介绍 |
| 2.1.2 可倒置的浸入式活细胞培养皿制作 |
| 2.2 超声声场测量与声压评估 |
| 2.2.1 超声声场测量装置 |
| 2.2.2 超声传播方向上的压力分布测量 |
| 2.2.3 不同峰值平面上的声压分布测量 |
| 2.2.4 输出负峰声压和输出幅值之间的对应关系 |
| 2.3 细菌培养与质粒提取 |
| 2.3.1 细菌培养实验材料 |
| 2.3.2 大肠杆菌的纯化、扩增与保种 |
| 2.3.3 质粒提取与浓缩 |
| 2.4 细胞培养与样品准备 |
| 2.4.1 细胞培养实验材料 |
| 2.4.2 细胞培养方法 |
| 2.4.3 样品准备方法 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 超声联合微泡介导的体外基因转染规律研究 |
| 3.1 超声联合微泡基因转染的体外实验研究方法 |
| 3.1.1 超声联合微泡基因转染实验材料 |
| 3.1.2 超声联合微泡基因转染方法与步骤 |
| 3.1.3 基因转染效率评估方法 |
| 3.2 声致穿孔对于基因转染的增强作用 |
| 3.3 不同声压参数对于基因转染效率的影响 |
| 3.4 不同质粒浓度对于基因转染效率的影响 |
| 3.5 微泡电性与超声方向对于转染效率的影响 |
| 3.6 超声微泡联合PEI基因转染规律的研究 |
| 3.6.1 超声微泡联合PEI诱导基因转染实验方法 |
| 3.6.2 超声微泡联合PEI诱导基因转染实验结果 |
| 3.6.3 不同浓度PEI/DNA复合物基因转染实验结果 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 超声联合微泡介导的基因转染的在体规律探究 |
| 4.1 在体超声成像追踪微泡实验 |
| 4.1.1 在体超声成像实验材料 |
| 4.1.2 在体超声成像实验方法与步骤 |
| 4.1.3 在体超声成像实验结果 |
| 4.2 超声联合微泡介导绿色荧光蛋白基因在体转染实验 |
| 4.2.1 在体绿色荧光蛋白基因转染实验材料 |
| 4.2.2 在体绿色荧光蛋白基因转染实验方法与步骤 |
| 4.2.3 在体绿色荧光蛋白基因转染实验结果 |
| 4.3 超声联合微泡介导荧光素酶基因转染小鼠在体规律研究 |
| 4.3.1 在体荧光素酶基因转染小鼠实验材料 |
| 4.3.2 在体荧光素酶基因转染小鼠实验方法 |
| 4.3.3 在体荧光素酶基因转染小鼠实验结果 |
| 4.4 超声微泡介导基因转染小鼠肌肉损伤与修复结果 |
| 4.4.1 石蜡切片masson染色结果 |
| 4.4.2 石蜡切片caspase-3 标记结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 超声联合微泡介导乙肝DNA疫苗免疫研究 |
| 5.1 乙肝DNA质粒的构建及有效性检测 |
| 5.1.1 乙肝DNA疫苗转染方法与蛋白提取步骤 |
| 5.1.2 酶联免疫吸附法检测S蛋白抗原表达结果 |
| 5.2 超声微泡介导乙肝DNA疫苗的体外实验 |
| 5.2.1 乙肝DNA疫苗体外细胞实验分组 |
| 5.2.2 乙肝DNA疫苗体外细胞抗原表达结果 |
| 5.3 超声微泡介导乙肝DNA疫苗的在体实验 |
| 5.3.1 乙肝DNA疫苗在体动物实验分组 |
| 5.3.2 乙肝DNA疫苗在体动物实验抗原表达结果 |
| 5.4 乙肝DNA疫苗冰冻切片免疫组化结果 |
| 5.4.1 HBsAg冰冻切片免疫组化方法与步骤 |
| 5.4.2 HBsAg冰冻切片免疫组化结果 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 本文的主要创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 答辩委员会决议书 |
| 深圳大学指导教师对研究生学位论文的学术评语 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胃癌腹膜转移中上皮至间质转化过程相关基因差异表达筛选 |
| 1.2 STEAP1调控胃癌腹膜转移过程中的肿瘤发生和化疗耐药性 |
| 第2章 实验方法 |
| 2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 组织样本收集 |
| 2.3 细胞培养、传代、冻存 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3 细胞冻存 |
| 2.4 细胞转染 |
| 2.4.1 miR-3978转染步骤 |
| 2.4.2 pcDNA-STEAP1、荧光素酶过表达载体、si-STEAP1和sh-TEAP1转染步骤 |
| 2.5 多聚核糖体提取 |
| 2.6 RNA提取实验 |
| 2.7 多聚核糖体RNA提取 |
| 2.8 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.8.1 多聚核糖体中基因的表达水平 |
| 2.8.2 MKN45细胞中转染sh-STEAP1或者si-STEAP1后细胞中STEAP1 mRNA的表达水平 |
| 2.9 MTT法检测细胞活力 |
| 2.10 细胞侵袭实验 |
| 2.11 细胞迁移实验 |
| 2.12 异种种植瘤实验 |
| 2.13 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 胃癌腹膜转移患者肿瘤组织多聚核糖体中上皮至间质转化过程相关基因差异表达谱 |
| 3.2 模拟腹膜转移的HMRSV5细胞(转染MIR-3978拮抗剂)模型多聚核糖体中上皮至间质转化过程相关基因差异表达谱 |
| 3.3 QRT-PCR实验验证STEAP1表达水平被SIRNA-STEAP1敲低 |
| 3.4 STEAP1表达水平下调可以降低胃癌细胞的增殖能力 |
| 3.5 STEAP1表达水平下调可以降低胃癌细胞的迁移能力 |
| 3.6 STEAP1表达水平下调可以降低胃癌细胞的侵袭能力 |
| 3.7 SHRNA-1-STEAP1和SHRNA-2-STEAP1转染MKN45细胞后敲低STEAP1表达水平 |
| 3.8 STEAP1表达水平降低抑制胃癌体内肿瘤生长能力 |
| 3.9 STEAP1表达水平上调降低人间皮细胞系HMRSV5对于多西紫杉醇的化疗敏感性 |
| 3.10 STEAP1表达水平下调增加胃癌细胞系MKN45细胞对于多西紫杉醇的化疗敏感性 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在校期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 1 DNA疫苗的免疫机制 |
| 2 DNA疫苗的特点 |
| 2.1 免疫效果好 |
| 2.2 危险性低 |
| 2.3 免疫应答持久,可提供联合免疫 |
| 2.4 方法简便,价格低廉 |
| 2.5 易于贮藏和运输 |
| 3 影响DNA免疫效果的主要因素 |
| 3.1 目的基因的选择 |
| 3.2 载体及启动子的选择 |
| 3.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 3.4 接种途径 |
| 4 DNA疫苗在医学上的研究 |
| 4.1 艾滋病DNA疫苗 |
| 4.2 流感、禽流感DNA疫苗 |
| 4.3 乙型肝炎DNA疫苗 |
| 4.4 丙型肝炎DNA疫苗 |
| 4.5 疟疾DNA疫苗 |
| 4.6 登革病毒DNA疫苗 |
| 4.7 寨卡病毒DNA疫苗 |
| 4.8 肿瘤DNA疫苗 |
| 1 HER-2与肿瘤发展间的关系 |
| 2 HER-2抗原抗肿瘤的作用机制 |
| 3 不同类型的HER-2肿瘤疫苗研究进程 |
| 3.1 HER-2全序列基因疫苗 |
| 3.2 短肽HER-2基因表位疫苗 |
| 3.3 重组HER-2疫苗 |
| 3.4 脂质体佐剂疫苗 |
| 3.5 DC介导的HER-2抗肿瘤疫苗 |
| 3.6 HER-2突变体肿瘤疫苗 |
| 4 结论 |
