朱晓婷[1]（2021）在《解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究》文中指出选题依据:阿尔茨海默病（AD）致残、致死率高,发病机制复杂,大脑内Aβ异常沉积是AD发生发展的重要病理变化及核心环节,前期研究已证实了解毒益智方具有抑制AD线虫头部Aβ斑块沉积及相关基因表达的作用,随之开展的随机对照临床研究证实解毒益智方应用6个月后MMSE、MoCA、ADL评分变化明显优于口服尼莫地平片的对照组。黄连为解毒益智方中的君药,为该方的主要成分,在本方中发挥“解毒”的重要功效。经查阅国内外文献发现黄连中发挥“解毒”作用的主要物质为黄连多糖（CCP）,因此设计体外细胞实验探究解毒益智方中的君药黄连的主要有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用,为“毒损”的病机及“解毒”的治法提供理论依据,为后续研究提供研究基础。因前期开展的研究均是以单基因单细胞的生物为研究对象,不能很好地模拟AD的疾病特点,因此选用APP/PS1双转基因小鼠作为研究对象,该小鼠很好的模拟了中枢神经系统Aβ异常沉积的状态,通过对小鼠的行为学研究及分子生物学研究,进一步评价解毒益智方的治疗作用。目的:通过体外细胞实验探讨基于“补肾益髓、活血化痰解毒”法形成的解毒益智方其中君药的有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用。通过行为学、分子生物学等研究手段,对APP/PS1小鼠的认知功能、Aβ沉积、BACE1表达的相关蛋白、基因等方面进行检测和分析,探讨解毒益智方对APP/PS1小鼠的作用机制,为中药治疗AD的推广应用提供可靠的研究证据。方法:1.本研究分别从体外实验、动物实验探究解毒益智方的作用机制。体外实验部分采用MTT还原法、Hoechst33258荧光染色等方法对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型进行线粒体活性、细胞活力、细胞凋亡的测定,探究CCP对PC12细胞的保护作用。动物实验部分选用APP/PS1双转基因小鼠为研究对象,随机分为5组,分别是模型组（APP/PS1组）、盐酸多奈哌齐组（Donepezil组）、解毒益智方低剂量组（JDYZFL组）、解毒益智方中剂量组（JDYZFM组）、解毒益智方高剂量组（JDYZFH组）,每组16只小鼠,另选用16只C57小鼠作为正常对照组（Control组）,于每日早晨8:30进行灌胃治疗,各组每日灌胃药物及剂量分别是,正常组和模型组0.5%CMC溶液0.20g·kg-1·d-1;阳性对照组:盐酸多奈哌齐溶液0.30g·kg-1·d-1;解毒益智方高、中、低剂量组药物浓度依次为0.60g·kg-1·d-1,0.3g·kg-1·d-1,0.15g·kg-1·d-1。持续6个月治疗结束。2.以Aβ25-35损伤的PC12细胞为研究对象,通过测定细胞活力、LDH释放率、细胞凋亡率、和线粒体膜电位的水平等评价CCP的神经保护作用。3.通过水迷宫实验,记录解毒益智方对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响。4.通过ELISE及免疫荧光法检测APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积的影响。5.采用PCR方法检测脑组织SIRT1、NF-κB、BACE1基因量变化,并进一步采用Western blot方法检测大脑皮层内SIRT1、BACE1、NF-κB蛋白的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1转运蛋白通路SIRT1、BACE1、NF-κB的影响。结果:1.通过体外研究观察CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的影响PC12细胞活力测定结果显示:PC12细胞经过浓度为5-50μM的Aβ25–35处理24h后,细胞活力随着Aβ25–35浓度的增加从24%下降至61%。当Aβ25–35在浓度范围为5至50μM时引起PC12细胞中LDH释放增加至对照组的约130-160%。在用不同浓度的CCP（5至200μg/ml）处理PC12细胞24h后,未观察到显着的细胞损失。通过Hoechst33258染色及FCM测定细胞凋亡结果显示:细胞核在荧光显微镜下具有显着的浓缩核和凋亡的细胞形成。与在未处理的PC12细胞中观察到的完整,圆形和相对大的细胞核相比,暴露于50μMAβ25–35 24h的细胞显示出典型的细胞凋亡特征,包括染色质浓缩,核碎裂和凋亡小体的出现。用CCP不同浓度（5,25,50,100,200μg/ml）处理后可有效逆转细胞凋亡,其中100μg/ml效果最明显,FCM分析显示单独暴露于50μMAβ25–35 24h导致58.88±6.12%的凋亡率,这与正常对照组中的7.21±0.82%的值显着不同（P<0.01）。加入100μg/ml的CCP后,细胞凋亡下降至12.51±1.32%。通过JC-1红色荧光与JC-1绿色荧光的比率的变化来检测Aβ诱导的线粒体功能障碍结果显示:当PC12细胞暴露于50μM的Aβ25–35中24h后,与正常对照组相比,显着减弱了JC-1的红色荧光比例,提高了JC-1绿色荧光比例（P<0.01）。用CCP（100μg/ml）预处理Aβ25–35处理的PC12细胞显着抵消了Aβ25–35损伤引起的膜电位损失,JC-1从Aβ25–35处理的PC12细胞中的22.1%变为绿色荧光至84.3%,与正常对照组相近（P>0.05）。通过蛋白质印迹法检测细胞色素C结果显示:经50μMAβ25–35处理PC12细胞24h后细胞色素C在细胞质中的蛋白质表达增加,而预先用CCP（100μg/ml）处理的PC12细胞显着减弱线粒体释放的胞质细胞色素C。2.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响。水迷宫实验结果显示:随着实验天数的后移,各组小鼠潜伏期、路径长度、游泳距离均有所缩短,表明随着训练次数的增加各组小鼠对象限平台的定位记忆能力随之有所提升。与Control组相比,APP/PS1组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离均明显延长,差异显着（P<0.01）。首次到达平台的时间明显延长,目标停留次数明显减少,差异显着（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离有所缩短,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。首次到达平台的时间缩短,目标停留次数增多,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组相比,JDYZFL组作用与其相当,JDYZFM组略优于Donepezil组,差异有统计学意义（P<0.05）。干预治疗6个月的12月龄小鼠的定位航行实验及空间搜索实验结果优于干预治疗3个月的9月龄小鼠,差异有统计学意义（P<0.05）。3.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响。各组小鼠结果如下:与Control组比较,APP/PS1组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积极数量明显增多,具有极显着统计学意义（P<0.01）。与APP/PS1组相比,JDYZFL组、JDYZFM组及Donepezil组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量不同程度降低,具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组比较,JDYZFM组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。通过免疫荧光法测得小鼠大脑皮层内Aβ表达发现,Control组只产生微量Aβ,而APP/PS1组Aβ表达量明显增高,经过用药干预后,12月龄干预组小鼠可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量较9月龄小鼠明显减少,免疫荧光标记从宏观上可以发现干预组Aβ沉积明显减少,APP/PS1组Aβ沉积明显增多。4.调控BACE1表达的相关因子结果（1）PCR检测结果各组小鼠进行的PCR检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量明显增高,SIRT1/GAPDH明显降低,差异有显着统计学意义(（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组及JDYZFM组小鼠海马体内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,SIRT1/GAPDH表达含量不同程度增高,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。JDYZFH组在NF-κB/GAPDH表达上无统计学差异。与Donepezil组相比,JDYZFL组及JDYZFM组BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。PCR结果证实药物干预组可通过提高SIRT1mRNA的含量降低NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达,从而抑制Aβ的产生而起到神经保护的作用。各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1mRNA的表达均有所提高,NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）Westorn blot检测结果各组小鼠的Western blot检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层SIRT1的蛋白表达明显降低,NF-κB、BACE1蛋白表达显着升高（P<0.01）。与APP/PS1相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组BACE1、NF-κB表达降低,SIRT1蛋白表达增高差异有统计学意义（P<0.05）。与Donepezil比较,JDYZFL组、JDYZFM组NF-κB蛋白表达有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）。JDYZFL组SIRT1、BACE1蛋白表达无显着差异,JDYZFM组SIRT1表达有所提高,BACE1蛋白表达量略有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。经过为期3个月及6个月的干预后,各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1的蛋白表达均有所提高,NF-κB、BACE1蛋白的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1 CCP能够保护Aβ25-35损伤的PC12细胞,其机制可能与提高细胞活力、抑制细胞凋亡、减少LDH释放、阻断膜电位的丧失,并阻止线粒体细胞色素C释放,修复线粒体功能障碍有关。2 JDYZF各剂量组可不同程度提高APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验及空间搜索实验的成绩,说明JDYZF可改善小鼠空间学习及记忆能力。3 JDYZF可不同程度降低APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层内Aβ的异常沉积。4 JDYZF抑制BACE1的异常表达,其作用机制可能是通过调控大脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1信号通路的相关因子表达实现的。
宋晓萍[2]（2021）在《七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究》文中进行了进一步梳理本实验室前期从七鳃鳗组织中分离纯化一种选择性识别并杀伤肿瘤细胞的免疫蛋白LIP（Lamprey Immune Protein）,其具有凝集素结构域（Jacalin＿like）和气单胞菌溶素结构域（Aerolysin correlation）,LIP蛋白通过识别乳腺癌细胞（MCF-7）膜表面Neu5Gc唾液酸修饰的糖型结构靶向肿瘤细胞,在细胞膜表面沉积进而杀伤肿瘤细胞。由于正常细胞表面没有Neu5Gc修饰的糖型结构,因此LIP蛋白对正常组织细胞（MCF-10A）没有较强或者很少的识别、结合和杀伤效果。肺癌是我国以及国际范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,晚期肺癌主要依靠药物治疗,在治疗过程中对正常细胞也产生杀伤作用等一系列药物副作用。由于药物副作用的存在使得肺癌治疗药物的选择成为临床医生的关注点之一,所以探究LIP对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的识别和杀伤作用并揭示其作用机制至关重要。首先,使用LIP蛋白筛查23株不同组织来源的肿瘤细胞系,LIP对各组织来源的肿瘤细胞系有不同的识别能力和杀伤作用,说明LIP对肿瘤细胞杀伤具有特异性选择和一定的广谱性,而对正常组织细胞无结合和杀伤作用。通过高内涵成像分析系统和乳酸脱氢酶（LDH）方法检测LIP对人小细胞肺癌NCI-H446、人肺鳞癌细胞NCI-H520、人肺腺癌A549和正常肺上皮细胞L132的杀伤情况,细胞死亡率结果表明随着LIP浓度的增加,NCI-H446、NCI-H520、A549细胞的活力降低。A549细胞死亡率最低,为26.7%;NCI-H520细胞的死亡率最高,为61.3%。和临床常用的化疗药物顺铂,紫杉醇,5-Fu尿嘧啶比较,低剂量的LIP蛋白也可以达到高剂量化疗药物的杀伤效率,使细胞微团塌陷,破碎,不再聚集成团。同时发现LIP蛋白除单独应用对肿瘤细胞有作用外,与顺铂联合用药处理肿瘤细胞更能增加其对肺癌细胞的杀伤效果,随着浓度的增加,杀伤效率增加。细胞迁移实验结果显示,LIP显着抑制三种肺癌细胞的迁移,相反,它并没有抑制L132细胞的迁移。通过荧光探针、免疫荧光结合共聚焦显微镜对线粒体,内质网及细胞骨架进行观察,结果显示LIP促使肺癌细胞线粒体变短并皱缩成球形,线粒体数量明显减少,荧光消失;LIP引起内质网肿胀和损伤,导致空泡化,严重破坏细胞稳态,使细胞内容物外泄导致凋亡;LIP造成肺癌细胞骨架系统瓦解,微管解聚。采用Annexin V-FITC方法检测LIP对肺癌细胞凋亡的影响,结果显示LIP促使三种肺癌细胞磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻。流式细胞术实验结果显示,2μM和4μM LIP处理L132细胞24 h后,细胞处于相对稳定状态。相同剂量LIP处理NCI-H446、NCI-H520、A549细胞24 h后,细胞凋亡率明显增高。同时,LIP破坏线粒体,降低线粒体膜电位。从共聚焦显微镜图像可以看出,LIP处理的三种肺癌细胞的活性氧（ROS）水平高于未处理的对照组,说明LIP介导肿瘤细胞的破坏与活性氧有关。为了探究LIP诱导肺癌细胞凋亡的机制,LIP处理NCI-H446、NCI-H520和A549细胞后,通过免疫印迹检测PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达均显着上调且呈时间和剂量依赖性,明确内质网诱导的凋亡依赖于IRE-1、ATF-6和PERK通路,导致下游CHOP表达上调。在内质网应激抑制剂4-PBA作用48h后,PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达水平显着降低。总之,七鳃鳗免疫蛋白LIP通过内质网应激信号通路介导肺癌细胞凋亡。本文建立肺癌小鼠荷瘤模型并在细胞瘤处直接注射LIP蛋白,能显着延缓肿瘤生长速度,肿瘤组织明显缩小,但是对小鼠正常组织细胞没有明显的副作用。通过免疫组化实验检测发现,LIP可以选择性识别人肺癌组织样本,而对癌旁组织无识别效果。
胡继盛[3]（2021）在《WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究》文中提出背景血管的损伤后重构在临床上是常见的血管病理生理学过程,然而该过程往往导致预后不良,比如动脉管腔狭窄,动脉移植后增生,介入手术后血管内膜增生等。血管损伤重构过程不能及时处理,这将间接性的导致心血管疾病以及心血管相关的他并发症的发生。常见的并发症有动脉粥样硬化,心肌梗塞,脑梗塞等。大量的低密度脂蛋白（low-density lipoproteins,LDL）逐渐积累到受损的血管内皮下空间中,被血管壁中的巨噬细胞和平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）摄取,摄取了脂质的巨噬细胞和平滑肌细胞形成泡沫细胞并逐渐演变成动脉粥样硬化。由脂质介导的炎症诱导了平滑肌细胞的大量增殖并且迁移到血管内膜。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）是血管壁的主要细胞组成部分,在血管受到外力、炎症等刺激后,位于血管中层的平滑肌细胞快速的发生表型转换、增殖,然后向血管内膜迁移,导致内膜增生,这就是新生内膜的形成过程,但是该过程的分子机制仍不清楚。前人的研究表明,VSMCs的增殖和迁移在血管内膜形成过程中有着至关重要的作用。肌动蛋白细胞骨架作为细胞的支撑基础,参与了众多的细胞生物学过程,比如细胞运动,表型转换,细胞的增殖和迁移等。细胞骨架的重构决定着细胞的运动,增殖等一系列的生物学过程。由于聚合的肌动蛋白相对稳定,因此需要特定的肌动蛋白调节蛋白来辅助,并促进肌动蛋白丝的分解。肌动蛋白丝解聚的生理意义不仅在于能够去除旧的肌动蛋白丝,而且解聚后形成肌动蛋白单体还可以补充用于新一轮肌动蛋白组装的肌动蛋白单体库。因此,肌动蛋白组装和解聚的平衡对于细胞骨架尤为重要。肌动蛋白解聚因子（Actin depolymerizing factor,ADF/Cofilin）通过切断肌动蛋白丝并从肌丝上解离肌动蛋白单体来促进肌动蛋白解聚。尽管ADF/Cofilin通常积聚在肌动蛋白细胞骨架动态的亚细胞区域,但是仅ADF/Cofilin单独作用,特别是高浓度时,对驱动肌动蛋白丝的快速解聚并不是十分有效。因此,当需要肌动蛋白单体快速周转时,其他的解聚因子需要与ADF/Cofilin配合来达到肌动蛋白快速解聚的效果。肌动蛋白相互作用蛋白1（Actin interacting protein 1,AIP1）,也称为WD重复结构域1（WD repeat domain 1,WDR1）,即使ADF/Cofilin被肌动蛋白丝饱和,也能强烈增强肌动蛋白丝的分解。作为ADF/Cofilin的主要辅助因子,WDR1介导的肌动蛋白动力学不仅对细胞极性的形成有着重要的调节作用,而且在细胞的增殖和迁移过程有着不可或缺的作用。前人的研究表明,VSMCs的迁移和增殖在血管形成过程中扮演着至关重要的作用,但是WDR1作为细胞骨架解聚因子的辅助因子,其在VSMCs中介导血管重构的作用机制仍不清楚。信号转导和转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3）是Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路的重要因子之一,涉及到炎症以及其他各种细胞生物学过程,例如细胞分裂和细胞增殖等。前人的研究表明在血管损伤后的第七天内,磷酸化形式STAT3的水平显着升高,这表明STAT3对于血管新生内膜的形成至关重要。血管损伤后,STAT3的活化与WDR1的表达呈正相关,但是在VSMCs中,STAT3是否参与WDR1的表达调控还未可知。STAT3的激活和核转运是其发挥转录作用的前提,有研究表明STAT3的核转运是Ran和Importinβ依赖性的。细胞骨架响应于细胞微环境的改变和机械性刺激对众多的细胞生物学过程均有影响。WDR1是细胞骨架重构的重要因子之一,有报道称,在乳腺癌细胞中,Wdr1的缺失影响Importinβ的表达。综合以上几点,STAT3可能会通过促进WDR1的转录进而促进血管内膜的形成,反过来WDR1介导的肌动蛋白动力学也会影响STAT3的核贩运,WDR1-STAT3形成反馈环共同调节血管损伤后重构。目的本研究从分子、细胞、动物水平探究WDR1在血管损伤后重构中的作用机制,并阐释STAT3与WDR1之间的相互作用对血管损伤后重构过程的影响,进一步完善血管损伤后重构的分子调控网络,为临床治疗外周血管疾病提供线索。方法第二章:本研究通过颈总动脉结扎的方式构建小鼠血管损伤模型,在损伤不同天数通过颈椎脱臼法处死小鼠并按照不同实验目的取材。通过免疫组化、RT-PCR、Western blot等生物学方法检测血管损伤不同天数的血管中Wdr1的表达。同时,通过Western blot和明胶酶谱实验分别检测了增殖标志物PCNA的表达和基质金属蛋白酶9的活性。第三章:通过Cre-Loxp系统构建Wdr1条件敲除小鼠,设计引物,通过PCR鉴定小鼠基因型。腹腔注射他莫昔芬（10 mg/kg/天）诱导敲除Wdr1,利用Western blot和RT-PCR分别从蛋白质和RNA水平检测Wdr1的表达。然后通过手术损伤颈总动脉,通过HE染色检测血管内膜增厚情况。在敲降Wdr1后,利用TUNEL检测细胞的凋亡情况,同时通过免疫荧光检测p-H3和SMA的表达。通过明胶酶谱实验检测Wdr1敲除后MMP9的活性。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,体外加入4-OH他莫昔芬诱导原代细胞中Wdr1的敲除。检测细胞敲除效率以及凋亡后,再通过CCK8和划痕实验证实WDR1对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。第四章:过表达WDR1,通过Transwell和CCK8实验进一步证实WDR1对平滑肌细胞迁移和增殖的影响。在损伤不同天数的血管中,通过Western blot检测STAT3的激活,证实STAT3与血管损伤修复间的联系。体外通过AngⅡ和IL-6处理平滑肌细胞模拟血管损伤过程,利用划痕实验和CCK8检测AngⅡ和IL-6处理后的增殖和迁移能力。通过Western bloting和RT-PCR检测不同细胞因子处理后的Wdr1的表达。在平滑肌细胞中敲降STAT3,用AG490处理平滑肌细胞,检测WDR1的表达情况,在敲降STAT3的基础上过表达WDR1,检测细胞的增殖和迁移能力。在敲降Wdr1的基础上过表达Cofilin,免疫荧光实验、CCK8、Western blot和划痕实验证实WDR1介导的肌动蛋白动力学与平滑肌细胞增殖与迁移之间的关系。最后,通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀证实STAT3直接靶向Wdr1的启动子。第五章:敲降和过表达Wdr1后检测STAT3的表达与活化情况,探究WDR1能否对STAT3的表达和活化有影响。通过核质分离证实WDR1对STAT3的核转移的影响,Western blot、核质分离实验探究与STAT3核转移相关因子Ntf2、importinβ、Importinα、Ran的表达和核质分布情况。通过Transwell和CCK8实验验证Ntf2、Importinβ过表达对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。结果第二章:HE结果证实颈总动脉结扎可以有效诱导血管内膜增厚,并且免疫组化实验、Western blot和RT-PCR结果显示在损伤不同天数,Wdr1的表达呈现时间依赖性升高,在损伤第14天达到峰值、并且增殖标志物PCNA的表达也是呈时间依赖性升高。明胶酶谱实验结果提示在动脉损伤后MMP9的活性显着性提高。第三章:基因型鉴定结果显示Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠成功构建。Western blot和RT-PCR结果显示,他莫西芬注射后能够成功诱导小鼠动脉细胞中Wdr1的敲除。进一步的研究结果表明,Wdr1的敲除有效抑制血管损伤后血管新生内膜的形成。免疫荧光和明胶酶谱实验表明,在Wdr1敲除后,动脉中的细胞增殖和迁移能力被显着抑制了。TUNEL实验结果表明Wdr1的敲除不影响细胞的凋亡。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,Western blot和RT-PCR结果显示4-OH他莫西芬诱导后Wdr1成功敲除。划痕和CCK8实验结果显示Wdr1的敲除抑制了原代平滑肌细胞的增殖和迁移。第四章:Transwell实验和CCK8实验表明,过表达Wdr1增强了HAVSMCs细胞的增殖和迁移能力。在诱导增殖的HAVSMCs和损伤的血管中,Western blot结果显示STAT3的磷酸化水平显着升高。HAVSMCs中敲降STAT3可显着性抑制其增殖和迁移,并且通过JAK2的特异性抑制剂处理HAVSMCs也能得到相同结果。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀结果提示STAT3通过靶向Wdr1来促进其转录的。Western blot和免疫荧光实验结果提示,肌动蛋白动力学是WDR1介导的平滑肌细胞增殖和迁移所必需的。第五章:Western blot结果提示WDR1的缺失并不影响STAT3的表达和激活。核质分离的结果显示,WDR1缺失抑制了活化的STAT3的核转移。进一步的Western blot和核质分离结果显示WDR1的缺失抑制了Importinβ的表达和Ran的核质分布,从而抑制活化的STAT3的核转移。结论血管损伤修复是一个复杂的生物学过程,受到多种因素的影响。各种转录因子,炎症因子等共同构成一个调控网络,参与血管新生内膜的形成。本研究本研究揭示了WDR1调控血管内膜形成的分子机制,主要是STAT3调控Wdr1的表达以及WDR1缺失对STAT3核转运影响的分子机制。STAT3在血流动力学改变和炎症因子刺激的作用下大量激活并转运入核参与血管内膜形成的分子调节过程。高表达Wdr1能够显着促进VSMCs的增殖和迁移,以此来促进血管新生内膜的形成。当抑制STAT3的激活时,Wdr1的表达显着下调,同时平滑肌细胞的增殖和迁移能力显着下降、血管内膜形成也被显着抑制了。随后的荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验结果表明STAT3与Wdr1基因的启动子相结合并促进Wdr1的转录。反过来,WDR1的缺失抑制了核转运因子2（nuclear transport factor 2,NTF2）和Importinβ的表达,进而影响阻碍STAT3的核转运;同时,在敲降Wdr1的平滑肌细胞中,Ran的核质比显着下降,进一步说明WDR1对于STAT3的核转运至关重要。本研究以细胞骨架解聚因子WDR1为切入点,重点阐明了WDR1影响血管新生内膜形成的分子机制,为研究血管内膜增生发生发展的机制提供了新的见解,为临床上治疗术后血管内膜增生提供了线索。
陈震[4]（2021）在《Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的宫颈癌（Cervical Carcinoma,CC）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的常见的妇科恶性肿瘤。我国是CC患病人数最多的国家之一,CC的预防和治疗任务繁重。HPV疫苗和宫颈涂片筛查虽然能够有效的预防CC发生,但晚期CC预后通常很差。环状RNA（circRNAs）在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用,这也包括在CC中。此外,由于具有高稳定性,特异性表达等特点,circRNAs在肿瘤的治疗与诊断中前景可期。然而,当前很大一部分circRNAs的表达和功能尚不清楚。本研究旨在探讨hsa＿circ＿0006332（Hsa＿circ00063322）和hsa＿circ＿0000069（Hsa＿circ0000069）在CC发展中的作用及其表达升高的相关分子机制。研究方法1.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069环状性质验证及其在宫颈癌细胞和组织中的表达通过RnaseR消化实验和基因组DNA扩增实验验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的环状结构。放线菌素D实验和核质分布实验检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的高稳定性和细胞分布。采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）法分别检测CC和正常组织与细胞中Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达,以确定宫颈组织癌变后Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达变化。2.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069表达升高的机制研究通过数据库分析,发现Hsa＿circ00063322表达可能受转录因子FOXA1调控,而Hsa＿circ0000069表达受RNA m6A甲基化修饰调控。通过染色质免疫共沉淀实验验证FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子结合;qPCR法检测FOXA1对Hsa＿circ00063322表达的调节;荧光素酶实验确认了FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子区的结合位点。m6A RNA免疫共沉淀（Me-RIP）检测CC和正常细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平,以及METTL3敲低后Hsa＿circ0000069的m6A修饰变化。qPCR法验证METTL3对Hsa＿circ0000069表达的调节。放线菌素D实验检测METTL3敲低对Hsa＿circ0000069稳定性的影响,以及两个m6A修饰位点处m6A修饰分别对Hsa＿circ0000069稳定性的影响。制备Hsa＿circ0000069 m6A修饰位点单突变体和双突变体,然后通过Me-RIP和qPCR实验检测Hsa＿circ0000069两处m6A修饰之间的关系。3.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的细胞功能制备并通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069稳定敲低的细胞。制备Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069瞬间过表达细胞。采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）和5-乙基-2′-脱氧尿苷（Ed U）检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的增殖能力。将Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞进行顺铂和氟尿嘧啶处理,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用划痕和Transwell实验检测Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的迁移能力。4.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别靶向调节miR-548q和miR-4426,miR-548q靶向抑制L2的表达通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别对miR-548q和miR-4426的调节关系,以及miR-548q对HPV16小衣壳蛋白L2的调节关系。荧光素酶实验验证Hsa＿circ00063322与miR-548q,Hsa＿circ0000069与miR-4426,以及miR-548q与L2的结合位点。qPCR检测肿瘤和正常组织中miR-548q,miR-4426和L2的表达。5.Hsa＿circ00063322/miR-548q/L2和Hsa＿circ0000069/miR-4426信号通路的验证采用qPCR检测Hsa＿circ00063322过表达以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时过表达或者Hsa＿circ00063322敲低以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时敲低后L2表达变化,采用免疫荧光（IF）、Ed U、流式和Transwell实验检测miRNA过表达以及circRNA和miRNA同时过表达或者miRNA敲低以及circRNA和miRNA同时敲低后细胞的功能表型变化。研究结果1.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ00063322的表达显着上调,利用Hsa＿circ00063322表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（ROC分析AUC=0.8597）。Hsa＿circ00063322具有高稳定性,主要分布在胞浆中。FOXA1是Hsa＿circ00063322的转录因子,与MYBL2（Hsa＿circ00063322亲本基因）启动子区在两个位点结合。2.制备Hsa＿circ00063322稳定敲低细胞系。Hsa＿circ00063322敲低可显着抑制CC细胞的增殖能力,并增加其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性;而Hsa＿circ00063322瞬时过表达可促进其增殖能力,并削弱其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性。3.Hsa＿circ00063322可与miR-548q靶向结合,并且调节miR-548q的表达。与癌旁正常组织相比,宫颈癌组织中miR-548q的表达显着降低,且miR-548q和Hsa＿circ00063322的组织表达水平负相关。4.miR-548q与L2转录本在两个位点结合,介导了Hsa＿circ00063322对L2表达的调节。Hsa＿circ00063322过表达阻遏了miR-548q的抑癌活性,而Hsa＿circ00063322敲低抑制了miR-548q抑制剂的促癌活性。5.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ0000069的表达显着上调,利用Hsa＿circ0000069表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（AUC=0.7901）。Hsa＿circ0000069具有高稳定性,主要分布在胞浆中。6.相比正常宫颈细胞,CC细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平显着升高。m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069稳定性。Hsa＿circ0000069转录本中存在两处m6A修饰位点,二者的作用相互协同。7.制备Hsa＿circ0000069稳定敲低细胞系。Hsa＿circ0000069敲低显着抑制了CC细胞的增殖和迁移能力,而Hsa＿circ0000069瞬时过表达促进了CC细胞的增殖和迁移能力。8.Hsa＿circ0000069可与miR-4426靶向结合,并且调节miR-4426的表达。Hsa＿circ0000069过表达阻遏了miR-4426的抑癌活性,而Hsa＿circ0000069敲低抑制了miR-4426抑制剂的促癌活性。研究结论1.CC中,转录因子FOXA1促进了Hsa＿circ00063322的表达,Hsa＿circ00063322通过吸附miR-548q,防止了L2被降解,并促进了CC细胞的增殖能力,削弱了CC细胞对化疗药物的敏感性。2.CC中,m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069的稳定性,Hsa＿circ0000069通过吸附miR-4426,促进了CC细胞的增殖和迁移能力。
陈顺泰[5]（2021）在《桔梗皂苷D基于JNK/PUMA通路诱导非小细胞肺癌凋亡的机制研究》文中进行了进一步梳理肺癌是临床最常见的肿瘤,在我国患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的前列。其中,非小细胞肺癌占全部肺癌病人的80%。目前非小细胞肺癌的主要治疗方式包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等。在过去的三十年中,细胞凋亡一直是被研究的热点,并被认为是细胞发育和程序性死亡的主要机制。细胞凋亡的失调是肿瘤发生的主要原因之一,诱导或促进肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤治疗的主要方向。因此,诱导肿瘤细胞凋亡,使机体内细胞的增殖与程序性死亡恢复平衡是治疗肿瘤的关键。JNKs可以通过对基因表达的影响,以及调节内源性和外源性凋亡途径调节诱导细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是调节细胞凋亡的关键因子,PUMA是Bcl-2家族成员中BH3的亚组中最有效的杀手之一,激活PUMA能够恢复癌细胞的凋亡从而抑制肿瘤的生长,它可能是一个极好的肿瘤细胞治疗靶标。“全国名中医”朴炳奎教授依据多年的临床经验并且结合现代医学药物筛选结果研制了具有确切肺癌疗效的肺瘤平膏。将肺瘤平膏拆分为益气类药物,解毒类药物,活血类药物,化痰类药物,通过前期的拆方析因研究,解毒组主要发挥抑瘤作用,益气组主要可能通过调整机体免疫功能间接发挥抑瘤作用,益气类药物与解毒类药物合用可起到协同提高抑制肿瘤的作用。而理气化痰类的桔梗发挥的作用如何,有待于进一步研究。桔梗是全方化痰药物中的重要组成部分,具有宣肺平喘,化痰排脓的之功效。根据《中国药典》桔梗皂苷D是中草药桔梗的主要生物活性成分,研究发现,桔梗皂苷D具有抗炎镇痛、降脂降糖、抗肿瘤等多种活性作用。而有研究报道桔梗皂苷D可以抑制人胃癌细胞增殖,因此,我们推测桔梗皂苷D可能是肺瘤平膏化痰组的有效组分之一。研究目的通过观察肺瘤平膏（化痰组）含药血清对人非小细胞肺癌细胞以及其主要组分桔梗皂苷D对人非小细胞肺癌细胞荷瘤动物模型中肿瘤组织及非小细胞肺癌细胞株中JNK/PUMA蛋白表达的影响,从诱导凋亡的角度揭示肺瘤平膏（化痰组）及桔梗皂苷D防治肺癌的分子机制,旨在阐释肺瘤平膏防治肺癌的科学内涵,同时为进一步应用中医药治疗肺癌提供科学依据。研究方法（1）肺瘤平膏（化痰组）含药血清作用于H1299细胞后,CCK8检测H1299细胞增殖,Western blot检测相关分子JNK表达的影响;（2）桔梗皂苷D作用于H1299、H2030、A549细胞后,ATK发光法检测细胞活性,计算桔梗皂苷D对以上细胞的IC50值;（3）桔梗皂苷D干预H1299、H2030细胞后,流式细胞术检测细胞凋亡,western blot检测细胞凋亡相关分子表达;（4）桔梗皂苷D干预H1299、H2030细胞后,Western blot检测细胞JNK/PUMA信号通路相关蛋白分子表达,qPCR检测PUMA mRNA变化;（5）通过合成si-RNA、转染技术降低H1299细胞JNK1以及JNK2的表达,桔梗皂苷D干预后,qPCR验证干扰效率,Western blot检测JNK/PUMA信号通路相关蛋白表达;（6）桔梗皂苷D干预H1299细胞后,构建质粒通过双萤光素酶报告基因检测细胞转录因子AP-1的变化;（7）采用H1299细胞株,接种到NSG裸鼠的右侧腋下,建立H1299人非小细胞肺癌荷瘤动物模型,用生理盐水、低剂量桔梗皂苷D、高剂量桔梗皂苷D干预14天后,取材,测量瘤重,计算抑瘤率;（8）采用H1299细胞株,接种到NSG裸鼠的右侧腋下,建立H1299人非小细胞肺癌荷瘤动物模型,用生理盐水、低剂量桔梗皂苷D、高剂量桔梗皂苷D干预14天后,取材,用免疫组织化学法,检测肿瘤组织Ki-67与caspase-3的表达变化。研究结果（1）肺瘤平膏（化痰组）含药血清较空白血清在一定程度能够影响细胞的CCK8 OD值结果,肺瘤平膏（化痰组）在一定程度能够抑制H1299细胞的增殖;肺瘤平膏（化痰组）含药血清组干预H1299细胞48小时后,肺瘤平膏（化痰）组P-JNK表达量为1.17±0.11,对照组为0.07±0.02,肺瘤平膏（化痰）组较对照组明显上升,结果具有统计学意义（P<0.05）;肺瘤平膏（化痰）组PUMA表达量为1.46 ± 0.05,对照组为0.19±0.04,肺瘤平膏（化痰）组较对照组明显上升,结果具有统计学意义（P<0.05）;肺瘤平膏（化痰）组Cleaved caspase-3表达量为0.95±0.07,对照组为0.95±0.10,两组之间没有明显差异。（2）桔梗皂苷D对H1299细胞的IC50值为7.9 μmol/L;桔梗皂苷D对H2030细胞的IC50值为9.7 μmol/L;桔梗皂苷D对A549的IC50值为 10.3 μmol/L。（3）流式细胞技术结果显示,桔梗皂苷D组细胞凋亡的比例大于对照组,且差异具有明显的统计学意义（P<0.01）;Western Blot检测H1299细胞凋亡相关蛋白结果表明,5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L组细胞PARP表达量分别为0 μmol/L组的2.38±0.60、22.29±6.40、43.14±15.3倍,其中 10μmol/L、15μmol/L组较0μmol/L组差异具有明显的统计学意义（P<0.05）;5μmol/L、10μmol/L、15 μmol/L组细胞Cleaved caspase-3表达量分别为 0μmol/L 组的 1.87±0.40、19.86±7.22、74.61±6.88 倍,其中 10 μmol/L、15μmol/L组较0μmol/L比组差异具有明显的统计学意义（P<0.0001）;Western Blot检测H2030细胞凋亡相关蛋白结果表明,5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L组细胞PARP表达量分别为0μmol/L组的2.82±0.59、15.1±6.14、52.52± 15.95倍,其中10μmol/L、15 μmol/L组较0μmol/L组差异具有明显的统计学意义（P<0.01）;5μmol/L、10μmol/L、15 μmol/L组细胞Cleaved caspase-3表达量分别为0μmol/L组的2.24±0.75、29.08±13.62、115.6±13.8倍,其中10 μmol/L、15 μmol/L组较0 μmol/L组差异具有明显的统计学意义（P<0.0001）。（4）Western Blot检测H1299细胞,结果表明,桔梗皂苷D干预48小时之后,5 μmol/L、10 μmol/L、15μmol/L组H1299细胞P-JNK的蛋白表达水平分别是0 μmol/L组的2.80±0.45、17.96±0.27、29.5±1.82倍,其中10 μmol/L、15μmol/L 组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.0001）;5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L组H1299细胞PUMA的蛋白表达水平分别是0 μmol/L组的1.24±0.1、7.97±3.07、12.08±3.86倍,其中15μmol/L组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。10μmol/L、15μmol/L组P-c-Jun、c-Jun的表达也较0 μmol/L有所上升。JNK的表达在不同浓度桔梗皂苷D干预后都变化不明显;Western Blot检测H2030细胞,结果表明,桔梗皂苷D干预48小时之后,5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L组H2030细胞P-JNK的蛋白表达水平分别是0μmol/L组的3.32±0.73、31.99±11.63、20.5±4.10倍,其中10μmol/L、15 μmol/L 组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）;5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L组H2030细胞PUMA的蛋白表达水平分别是0μmol/L组的1.32±0.25、9.26±2.99、10.97±4.04倍,其中10μmol/L、15 μmol/L组较0μmol/L组明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。10 μmol/L、15 μmol/L组P-c-Jun、c-Jun的表达也较0μmol/L有所上升。JNK的表达在不同浓度桔梗皂苷D干预后变化不明显;qPCR检测H1299细胞,干预48小时后,与对照组相比,桔梗皂苷D组H1299细胞PUMA mRNA表达量明显上升,且差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）Western Blot检测结果显示,空白JNK1沉默组JNK、JNK1表达较空白阴性对照组明显下降,结果具有统计学意义（P<0.05）;空白JNK2沉默组JNK、JNK2表达较空白阴性对照组明显下降,结果具有统计学意义（P<0.05）;桔梗皂苷D JNK1沉默组JNK、JNK1、P-JNK、P-c-Jun、c-Jun、Cleavedcaspase-3、PUMA表达较桔梗皂苷D阴性对照组明显下降,结果具有统计学意义（P<0.05）;桔梗皂苷D JNK2沉默组JNK、JNK2、P-JNK、P-c-Jun、c-Jun、Cleavedcaspase-3表达较桔梗皂苷D阴性对照组有所下降,其中只有JNK、JNK2具有统计学意义（P<0.05）。（6）双萤光素酶报告基因实验结果显示,干预24小时以及48小时,两组结果比较均有差异,干预48小时比24小时两组差异更大。以上结果均具有统计学意义（P<0.01）。（7）不同浓度桔梗皂苷D干预14天后,低剂量与高剂量桔梗皂苷D组平均瘤重明显小于对照组,结果具有统计学意义。桔梗皂苷D低剂量组抑瘤率为36.87%,桔梗皂苷D高剂量组抑瘤率为52.49%。（8）干预14天后,桔梗皂苷D低剂量组与桔梗皂苷D高剂量组肿瘤组织中Ki-67的表达均明显低于对照组,分别为对照组Ki-67表达量的72±1%以及53±3%,结果具有统计学意义;干预14天后,桔梗皂苷D低剂量组与桔梗皂苷D高剂量组肿瘤组织中Cleaved caspase-3的表达均明显高于对照组,分别为对照组Cleavedcaspase-3表达量的2.66±0.17倍以及3.60±0.16倍,结果具有统计学意义。研究结论（1）在肺瘤平膏中,化痰类药物能激活肺癌细胞JNK/PUMA通路。（2）桔梗皂苷D通过调控JNK/PUMA通路诱导肺癌凋亡。（3）化痰法发挥抗肿瘤作用可通过调控细胞凋亡实现。
韩卓[6]（2021）在《维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究》文中进行了进一步梳理维生素C（Vitamin C,VitC）是人和动物必需的营养物质。科学界对于VitC功能几乎所有的认识都基于它作为电子供体,即作为天然还原剂的化学性质,主要表现在VitC能够清除细胞代谢过程中产生的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,保护重要的生物大分子免于氧化损伤,维持细胞的正常功能。对VitC研究的一次重大突破,在于发现VitC是亚铁离子(ferrous ion,Fe2+)和2-氧戊二酸盐（2-oxoglutarate）依赖型双加氧酶(Fe2+-and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,Fe2+/2OGDDs)家族关键的“辅因子”,维持Fe2+/2OGDDs在细胞内的活性。进一步研究揭示,VitC能作为辅因子调节Fe2+/2OGDDs家族中与表观修饰有关的酶的催化活性,其中包括DNA羟化酶TET（ten-eleven translocation（TET）family of DNA hydroxylases）和具有Jumonji-C结构域的组蛋白去甲基化酶（Jumonji-C domain-containing histone demethylases）。这一发现直接加速了VitC在干细胞和再生医学领域中的研究,越来越多的证据表明VitC能够通过调控表观修饰酶的活性来提升细胞重编程的效率和质量,也能参与调节干细胞的自我更新和定向分化。有研究曾提出,VitC作为辅因子的生物学功能,本质上依然以VitC固有的还原性为基础,但VitC对表观修饰酶功能调控的特殊性却暗示VitC很可能还存在其他的作用机制,说明我们目前对VitC功能的认识很可能还存在很大空白,大大限制了VitC的应用价值。2014年,本课题组研究发现,VitC通过激活Janus kinase（JAK）2/signal transducer and activator of transcription（STAT）2信号途径,在小鼠胚胎干细胞中诱导Nanog基因的表达。我们曾初步证实,钠离子依赖型VitC转运蛋白2（sodium-dependent vitamin C transporter 2,SVCT2）能够介导VitC对JAK2和STAT2的信号激活,并参与对下游基因的调控,提示VitC与细胞信号转导有关联。在此基础上,本研究以小鼠F9畸胎瘤干细胞系为主要研究对象,首次证明VitC具有“生物信号分子”的作用,完善了对VitC生物学功能的认知。研究可分为两大阶段,第一阶段揭示VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能;第二阶段研究VitC激活的JAK2信号传递途径具有的调控作用及其对VitC生物学功能的补充。主要的研究内容和结果列举如下:1.发现和探究VitC转运蛋白SVCT2的受体功能。首先,通过蛋白质免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）和免疫印迹,我们证明SVCT2特异性结合JAK2而不结合JAK1、JAK3和TYK2。然后,通过基序预测和突变体策略,研究SVCT2蛋白序列中介导JAK2结合和激活的关键结构基序。结果显示,位于SVCT2羧基末端的618-621位氨基酸序列以及连接第8～9号跨膜螺旋的胞质侧肽段中的418-422位氨基酸序列是负责结合JAK2的关键基序,介导VitC对JAK2的激活。通过磷酸化位点预测和突变体策略,研究JAK2对SVCT2潜在的磷酸化作用及其对招募STAT2的影响。结果显示,VitC激活的JAK2催化SVCT2羧基端Tyr626发生磷酸化,介导SVCT2对STAT2的招募,进一步诱导JAK2和STAT2的磷酸化。之后,通过双荧光素酶报告（Dual Luciferase Reporter）实验,我们还证明SVCT2响应VitC处理增强STAT2的转录因子活性,且依赖JAK2的激活。综上,本研究证实SVCT2是VitC的“受体样转运蛋白”,具有JAK2偶联受体的典型特征。此外,本研究还证明VitC对JAK2的激活与VitC在细胞内的积累无关。2.研究SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间的关联。通过co-IP和免疫印迹,研究SVCT2介导的VitC运输对JAK2激活的影响。结果显示,抑制SVCT2对VitC的运输作用会抑制SVCT2对JAK2的磷酸化激活。通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography）实验,研究SVCT2对JAK2的激活是否反过来影响SVCT2对VitC的运输。结果显示,抑制JAK2的激活也会削弱SVCT2对VitC的运输能力。这部分研究证明,SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间紧密偶联、不可分割,是一个完整的生物学事件。3.研究VitC激活JAK2与清除ROS之间的关系。首先,通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）和免疫印迹,研究VitC抑制ROS的作用对激活JAK2的影响。结果显示,VitC对JAK2的激活并不依赖对ROS的抑制。接下来,我们研究VitC激活的JAK2是否反过来影响VitC对ROS水平的调控。结果显示,VitC抑制细胞内ROS的水平且部分依赖JAK2的活性。随后的研究进一步证明,VitC激活的JAK2催化其固有底物脯氨酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase,PDHK1）发生磷酸化,活化的PDHK1又催化脯氨酸脱氢酶E1α亚基（E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase,PDHA1）Ser232发生磷酸化,抑制PDHA1的活性,降低细胞氧化代谢效率,进而抑制ROS的产生。4.研究JAK2的激活对VitC表观调控功能的影响。通过免疫荧光、点杂交和免疫印迹,研究VitC激活的JAK2对5hm C水平的调控。结果显示,抑制JAK2的激活会抑制VitC对5hm C水平的促进。通过磷酸化位点预测和突变体策略,我们首次证明TET3是JAK2的激酶底物。VitC和SVCT2激活的JAK2直接催化TET3 Tyr1375发生磷酸化。后续研究证实Tyr1375的磷酸化增强了TET3的酶活性并影响其对靶基因的选择,表明VitC不仅仅以辅因子身份调控TET酶的功能。另外,VitC激活的JAK2催化其固有底物组蛋白H3第41位酪氨酸残基发生磷酸化,而后者有利于开放染色质状态的建立。通过微球菌核酸酶消化实验,我们证明VitC确实能够提高基因组DNA的可接近性,且依赖于JAK2的激活。5.研究JAK2的激活对VitC在细胞多能性和分化调控中的影响。通过碱性磷酸酶染色、表达谱m RNA测序和实时定量PCR,研究VitC激活的JAK2对F9细胞的多能性,以及对多能性和分化相关基因表达的影响。结果显示,在F9细胞中,VitC对细胞多能性没有明显影响,但倾向于促进分化发育相关基因（特别是与神经成熟相关基因）的表达,且依赖于JAK2的激活;只有在JAK2活性被抑制的条件下,VitC更倾向于促进细胞的多能性,并诱导一系列多能性相关基因（但不包括Nanog）的表达。进一步的研究发现,VitC激活的JAK2实际上通过两条作用相反的途径分别调控两类下游基因的表达,即通过依赖STAT2的途径调控少数特定多能性相关基因（比如Nanog）的表达;通过不依赖STAT2的途径调控与分化相关基因的表达。综上,本研究发现VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能,并证明激活JAK2是VitC发挥调控作用的重要途径。这是对VitC生物学作用突破性的发现,为其生理和药理功能的研究带来新的思考,对VitC在疾病治疗和再生医学等众多领域的应用具有一定的指导意义。
陶攀峰[7]（2021）在《RIPK1切割位点变异导致新型自身炎症性疾病的分子机制研究》文中研究指明自身炎症性疾病是指在没有高滴度自身抗体或抗原特异性T细胞参与的情况下,机体发生非诱发炎症的一类遗传疾病,例如家族性地中海热,主要临床表现包括周期性发热、皮疹、CRP升高、淋巴结肿大、肝脾肿大、关节炎、炎症性肠病、血管炎、结节性多动脉炎、基底节钙化或肺间质病等多种形式的系统性炎症。发现新致病基因并深入研究致病机制对患者的精准治疗和研究基因的生理功能都有重要意义。RIPK1在死亡受体或模式识别受体介导的细胞凋亡、程序性坏死和炎症信号通路的激活与转换中发挥着关键作用。肿瘤坏死因子TNF与受体TNFR1结合后,招募接头蛋白TRADD和RIPK1等形成复合体I,介导NF-κB通路的级联激活,起始促炎基因和促细胞存活基因的转录。在此过程中,RIPK1起着重要的支架作用,激酶活性受到泛素化和磷酸化修饰的限制。去泛素化或去磷酸化可以激活RIPK1,促进与FADD和caspase-8等蛋白组成复合物IIa,启动RIPK1依赖的细胞凋亡。若caspase-8酶活被抑制,激活的RIPK1会招募RIPK3和MLKL形成复合体IIb导致程序性坏死、细胞内容物泄露和炎症的发生。在小鼠模型中,Fadd敲除导致过度的细胞坏死和小鼠胚胎期死亡,通过敲除Ripk1可以挽救。Casp8敲除同样导致小鼠胚胎期死亡,通过敲除Ripk3或者Mlkl可以挽救。这提示FADD-caspase-8的激活可以抑制RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的程序性坏死来保证小鼠胚胎发育,但具体的分子机制及在人类疾病中的生理意义尚不清楚。RIPK1第324位天冬氨酸是潜在的被caspase-8切割的位点,我们从未诊断的自身炎症性疾病病例中发现两个患病家系,分别携带新发的RIPK1杂合变异p.Asp324Val和p.Asp324His,患者主要表现出周期性发热和淋巴结肿大等症状。患者血清中炎症细胞因子和趋化因子水平升高,外周血单个核细胞（PBMCs）中炎症信号通路相关基因的转录水平升高。在机制的研究中,RIPK1切割位点变异促进了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中TNF诱导的RIPK1激活及其介导的细胞凋亡、程序性坏死和促炎细胞因子IL-6的产生。同样的,切割位点变异也促进了患者PBMCs中TNF诱导的细胞凋亡、程序性坏死和IL-6转录水平的升高,且都依赖于RIPK1的激酶活性。与PBMCs相反,患者的成纤维细胞（Fibroblasts）中RIPK1、TNFR1等蛋白的表达水平和胞内活性氧水平降低,表现出对TNF诱导的细胞坏死和对erastin和RSL3诱导的铁死亡的抵抗。基于RIPK1切割位点变异能引起细胞因子IL-6的显着变化,我们建议患者用IL-6受体抑制剂进行治疗,取得了很好的疗效。综上所述,我们发现caspase-8在RIPK1 D324位点的切割负调控了RIPK1的激活及其介导的细胞程序性死亡,而切割位点的变异导致患者PBMCs中RIPK1的过度激活及其介导的细胞凋亡、程序性坏死和炎症信号通路激活水平的升高,最终导致了患者表现出反复发热和淋巴结肿大等症状。而患者fibroblasts发展出了多种补偿机制,使其可以抵抗不同的死亡刺激,这也可能使患者没有皮肤受累或病变。
于海滨[8]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中指出随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
赵英淇[9]（2020）在《Fas和TNF-α通路在皮质酮和CRH诱导小鼠输卵管上皮细胞凋亡过程中的作用研究》文中研究表明本实验室前期研究证明,在胚胎着床前对母鼠施加束缚应激,促进应激相关激素CRH和皮质酮（CORT）大量分泌,诱导输卵管上皮细胞凋亡,并且发现Fas和TNF-α系统参与该过程。体外实验进一步证明,CRH和CORT通过Fas信号通路引起输卵管上皮细胞凋亡,但是TNF-α系统是否参与其中尚不清楚。本实验中,我们利用体外培养小鼠输卵管上皮细胞模型,添加CRH和CORT进一步探究其影响输卵管上皮细胞凋亡的具体信号通路。结果发现,体外培养输卵管上皮细胞添加CRH(浓度为2×10-6M)和CORT(浓度为1×10-5M)后,与对照组相比健康细胞比例显着下降、细胞凋亡比例显着升高（健康细胞:89.6%vs 64.8%vs 64.8%,早期凋亡:9.4%vs 29.5%vs 29.9%）（p<0.05）、Bcl-2/Bax的比值显着下降（p<0.05）,说明添加CRH和CORT促进输卵管上皮细胞凋亡。与对照组相比,体外培养输卵管上皮细胞过程中添加CRH导致TNF-α和Fas L的表达显着升高;而添加CORT培养后,Fas L的表达显着升高,但TNF-α的表达显着下降。转染si RNA敲低输卵管上皮细胞中TNF-α和Fas L的表达水平,再添加激素培养输卵管上皮细胞发现,敲低Fas L后体外添加CRH和CORT培养的输卵管上皮细胞Bcl-2/Bax的比值显着升高（p<0.05）;而在敲低TNF-α后,虽然体外添加CRH培养的输卵管上皮细胞中Bcl-2/Bax的比值显着升高（p<0.05）,但添加CORT组的Bcl-2/Bax的比值显着降低。并且在敲低Fas L和TNF-α后,添加CRH体外培养输卵管上皮细胞,其与对照组相比健康细胞的比例显着升高,凋亡细胞的比例显着下降（健康细胞:63.2%vs 70.7%vs70.1%,早期凋亡:31.7%vs 26.4%vs 27.4%）,同样在敲低Fas L后添加CORT体外培养输卵管上皮细胞,与对照组相比健康细胞的比例显着升高,凋亡细胞的比例显着下降（健康细胞:62.6%vs 71.1%,早期凋亡:33.3%vs 27.7%）,但是在敲低TNF-α后添加CORT体外培养输卵管上皮细胞,健康细胞和早期凋亡细胞的比例与对照组相比差异不显着（健康细胞:62.6%vs 63.0%,早期凋亡:33.3%vs 31.0%）。从Fas L基因突变和TNF-α基因敲除小鼠获取输卵管上皮细胞后,体外培养过程添加CRH和CORT发现,与野生型小鼠细胞相比,在添加CRH后两种基因突变细胞的凋亡情况都有所缓解（健康细胞:66.9%vs 81.8%vs 81.1%,早期凋亡:24.2%vs 16.4%vs16.8%）;而在添加CORT时只有Fas L基因突变的小鼠细胞凋亡有所缓解,TNF-α基因敲除小鼠细胞凋亡并不缓解（健康细胞:64.3%vs 80.6%vs 64.1%,早期凋亡:30.1%vs 16.8%vs 30.7%）。综上所述,本实验证明,CRH诱导输卵管上皮细胞的凋亡过程涉及Fas和TNF-α两个系统,而CORT诱导输卵管上皮细胞的凋亡过程通过Fas通路但不涉及TNF-α系统。
马雨水[10]（2020）在《肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究》文中提出作为目前最常见的致死性肿瘤疾病之一,肝癌的五年生存率仅7%。肝癌发生隐袭,其早期诊断十分困难,大约90%的肝癌患者被诊断时已是中晚期而丧失外科手术切除机会,导致肝癌的预后非常差。常规化疗药物治疗不仅毒副作用大,而且不能明显缓解疾病进展或延长患者生命。因此需要对于肝癌的发病机制和其中的关键调控因子进行深入的研究,提高肝癌的早期诊断、开发新型肝癌治疗药物,提高肝癌治疗疗效,延缓肿瘤复发与转移,改善患者预后。据报道,lnc RNA OIP5-AS1在几种癌症中表达增加。然而,lnc RNA OIP5-AS1在肝癌中的作用仍有待研究。在本文第一部分中,我们通过实时定量PCR实验,证实lnc RNA OIP5-AS1在肝癌组织标本中上调,其过表达与肝癌患者的低生存率有关。细胞和裸鼠的体内外功能实验也表明,lnc RNA OIP5-AS1可以促进肝癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外,荧光素酶分析证实lnc RNA OIP5-AS1与hsa-mi R-26a-3p,EPHA2之间的结合位点。回复实验进一步证实lnc RNA OIP5-AS1对肝癌细胞生物学行为的影响。基于以上实验探讨,我们的研究结果提示lnc RNA OIP5-AS1可能通过调节hsa-mi R-26a-3p/EPHA2信号轴来促进肝癌细胞的增殖和侵袭。实验证据表明,肝细胞癌的发生和发展过程中,肝癌干细胞（LCSCs）可能起重要的作用。其中,微小RNA（mi RNA）在LCSCs诱发的肝癌中起着重要的作用,但mi RNA-302家族在LCSCs中的作用和相关分子机制却鲜为人知。本文第二部分中,我们应用Mi RNAs微阵列技术,检测参与LCSCs维持和分化的mi RNAs;进而我们探讨mi R-302a/d及其靶基因E2F7在肝癌中的生物学作用及其分子机制。同时,我们采用定量PCR和Kaplan-Meier生存分析法检测mi R-302a/d和E2F7在HCC患者中的表达及相关性。我们的结果显示:mi RNA-302家族成员在HCC细胞球形形成过程中下调,mi R-302a/d表达低的肝癌患者的生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相对较短。此外,荧光素酶分析证实mi R-302a/d直接靶向抑制E2F7。过表达mi R-302a/d抑制E2F7 m RNA和蛋白表达。而且mi R-302a/d的低表达和E2F7的高表达与肝癌患者OS和PFS较短显着相关。进一步的细胞功能分析也表明mi R-302a/d可能通过直接抑制靶基因E2F7及其下游AKT/β-catenin/CCND1信号通路,负调控肝癌干细胞的自我更新能力和细胞周期转换。因此,我们的结果提示:E2F7是mi R-302a/d的直接靶点,mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路抑制LCSCs的干细胞和肝癌细胞的增殖。在论文第三部分中,我们通过条件性c Myc转基因小鼠与Alb-Cre工具小鼠杂交,在肝脏内形成自发肝癌,用于肝癌模型的建立与后续的机制研究,以及洛那法尼联合Degrasyn对Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠治疗作用及其机制的初步探讨。我们的结果发现洛那法尼联合Degrasyn治疗组的小鼠肝表面癌结节明显减少、体重恢复,中位生存期延长,提示洛那法尼联合Degrasyn没有明显的毒副作用,并且对Alb-c Myc自发成瘤小鼠有一定的治疗效果。机制上,我们通过全转录组测序发现,与对照组相比,Alb-c Myc组样本中发现2655个dif-m RNAs、96个dif-mi RNAs以及158个dif-lnc RNAs。对与m RNA相关的差异表达基因的富集分析证实参与染色体稳定性和蛋白质降解过程的基因可能在肝癌的发病机制中起重要作用。进一步的实验验证,与对照组相比,lnc RNA OIP5-AS1和E2F7在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着上调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着降低;相关mi R-26a-3p,mi R-302a/d和EPHA2在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着下调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着升高。这些结果暗示:洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用,其机制涉及对lnc RNA OIP5-AS1,mi R-26a-3p,EPHA2,mi R-302a/d和E2F7表达的调控效应。总之,本论文揭示肝癌中lnc RNA OIP5-AS1通过hsa-mi R-26a-3p/EPHA2轴和mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路调控肝癌细胞恶性生物学行为的分子机制;洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用。以上两部分机制研究加深我们对第三部分洛那法尼联合Degrasyn对肝癌治疗效果作用的理解,为肝癌的诊断和治疗提供理论和实践基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 AD的病因病机及治疗进展 |
| 1 中医学对痴呆的系统认识及研究进展 |
| 1.1 中医学对痴呆病名由来及发展的认识 |
| 1.2 中医学对痴呆病因病机的古代认识 |
| 1.3 中医学对痴呆辨证论治及相关研究的认识 |
| 1.4 中医学对痴呆治疗的古今认识 |
| 综述二 西医学对AD的发病机制及治疗进展研究 |
| 1 现代医学对AD的认识及研究进展 |
| 1.1 AD的概述及流行病学 |
| 1.2 现代医学对AD发病因素的认识及研究 |
| 1.3 现代医学对AD发病相关机制的认识 |
| 2 现代医学对AD治疗的认识 |
| 2.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEIs) |
| 2.2 兴奋性氨基酸受体拮抗剂 |
| 2.3 甘露特纳胶囊 |
| 2.4 其他非药物治疗 |
| 3 问题与展望 |
| 综述三 Aβ在脑内异常沉积的机制 |
| 1.Aβ的产生、分布与清除、传递与运输的研究进展 |
| 1.1 Aβ的产生 |
| 2 Aβ的清除 |
| 2.1 细胞的清除作用 |
| 2.2 Aβ被降解酶的清除作用 |
| 2.3 中枢Aβ的清除途径 |
| 2.4 血液成分介导的Aβ清除 |
| 综述四 解毒益智方在阿尔茨海默病中的应用 |
| 1 解毒益智方的创立 |
| 1.1 脑髓理论 |
| 1.2 髓虚毒损 |
| 1.3 补肾益髓,活血化痰解毒法 |
| 2 解毒益智方通过调节SIRT1/AMPK通路抑制BACE1表达改善Aβ的沉积 |
| 3 解毒益智方对阿尔茨海默病的临床应用 |
| 实验研究 |
| 第一章 CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤保护性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠行为学的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平变化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内BACE1表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的发病机制及临床表现 |
| 1.1.1 肺癌的发生 |
| 1.1.2 罹患肺癌的危险因素 |
| 1.1.3 肺癌的临床表现 |
| 1.2 肺癌的诊断 |
| 1.2.1 肺癌的辅助影像学检查 |
| 1.2.2 获取肺癌组织学或细胞学检查技术 |
| 1.2.3 肺癌的实验室血清学检查 |
| 1.2.4 肺癌的病理学评估 |
| 1.3 肺癌的治疗 |
| 1.4 肺癌的靶向治疗 |
| 1.4.1 非小细胞肺癌靶向药物 |
| 1.4.1.1 以表皮生长因子受体为靶点的药物 |
| 1.4.1.2 间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制药 |
| 1.4.1.3 ROS1 重排抑制药 |
| 1.4.1.4 血管内皮生长因子为靶点的药物 |
| 1.4.1.5 其他 |
| 1.4.2 非小细胞肺癌免疫治疗药物 |
| 1.4.3 SCLC靶向药物的现状 |
| 1.5 七鳃鳗LIP的发现及细胞毒作用 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 七鳃鳗LIP蛋白对23 种肿瘤细胞杀伤活性比较分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组LIP蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.2 重组LIP蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 重组LIP蛋白活性鉴定 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 重组LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.2.6 流式细胞仪对LIP蛋白杀伤肿瘤细胞定量分析 |
| 2.2.7 Western blot检测LIP蛋白在细胞膜表面的沉积 |
| 2.2.8 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组LIP蛋白的纯化 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测LIP蛋白对肿瘤和正常细胞的识别 |
| 2.3.3 Western Blot检测LIP蛋白在细胞表面的沉积 |
| 2.3.4 LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 LIP蛋白对三种肺癌细胞的生物学活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP蛋白对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.2 荧光显微镜检测LIP对三种肺癌细胞微团杀伤活性 |
| 3.2.3 LDH检测LIP对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.4 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP联合顺铂对三种肺癌细胞的杀伤作用 |
| 3.2.5 细胞划痕实验检测LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.6 免疫荧光检测LIP蛋白对细胞骨架的影响 |
| 3.2.7 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞杀伤活性探究 |
| 3.3.2 LIP蛋白与多种化疗药物对三种肺癌细胞杀伤活性比较探究 |
| 3.3.3 LIP蛋白与顺铂联合作用三种肺癌细胞探究 |
| 3.3.4 LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力探究 |
| 3.3.5 LIP蛋白对三种肺癌细胞骨架的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对线粒体的影响 |
| 4.2.2 Annexin V-FITC检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.4 流式细胞术检测LIP蛋白作用后肺癌细胞线粒体膜电位变化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体损伤探究 |
| 4.3.2 LIP蛋白诱导三种肺癌细胞凋亡检测 |
| 4.3.3 LIP蛋白通过影响线粒体膜电位变化抑制线粒体功能 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 LIP蛋白通过引起内质网应激激活细胞凋亡通路 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的影响 |
| 5.2.2 共聚焦监测LIP蛋白对三种肺癌细胞内ROS的影响 |
| 5.2.3 细胞蛋白提取及蛋白浓度定量 |
| 5.2.4 WesternBlot检测内质网应激及加入抑制剂后凋亡通路相关蛋白的表达 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的损伤 |
| 5.3.2 LIP蛋白作用三种肺癌细胞后ROS含量变化情况 |
| 5.3.3 三种肺癌细胞中内质网应激诱导的凋亡通路相关蛋白表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 LIP蛋白在荷瘤小鼠及人源肿瘤组织水平对瘤体的识别和抑瘤作用 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 注射LIP蛋白对小鼠肺癌细胞瘤的影响 |
| 6.2.2 透射电镜观察鼠肺癌肿瘤组织 |
| 6.2.3 人肺癌肿瘤组织的保存处理 |
| 6.2.4 肿瘤组织包埋及冰冻切片的制备 |
| 6.2.5 人肺癌肿瘤组织的HE染色 |
| 6.2.6 人肺癌肿瘤组织的免疫组织化学染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 小鼠肺癌细胞瘤注射LIP蛋白后的变化 |
| 6.3.2 LIP蛋白促小鼠A549-Luc-C8 细胞瘤的细胞凋亡 |
| 6.3.3 LIP蛋白对荷瘤小鼠正常组织形态的影响 |
| 6.3.4 人肺癌组织的HE染色 |
| 6.3.5 LIP蛋白特异性识别人肺癌组织 |
| 6.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 读博期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肌动蛋白概述 |
| 1.2 WDR1的结构和actin切割 |
| 1.3 WDR1的生物学功能 |
| 1.3.1 WDR1与癌症 |
| 1.3.2 WDR1与内皮发育 |
| 1.3.3 WDR1与肌节组装 |
| 1.3.4 WDR1与血液疾病 |
| 1.4 本课题研究内容 |
| 1.4.1 血管损伤模型构建 |
| 1.4.2 探究血管损伤与WDR1的相关性 |
| 1.4.3 体外证实WDR1对平滑肌细胞的影响 |
| 1.4.4 STAT3与WDR1相互调控的分子机制 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 WDR1在血管损伤模型中的表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成功构建颈动脉损伤的小鼠模型 |
| 2.3.2 颈动脉结扎后Wdr1表达水平呈时间依赖性增高 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Wdr1的缺失抑制血管新生内膜的形成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 成功构建Wdr1条件性敲除小鼠 |
| 3.3.2 Wdr1条件性敲除抑制了血管内膜的增厚 |
| 3.3.3 敲除Wdr1抑制平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 3.3.4 原代血管平滑肌细胞敲降Wdr1抑制细胞的增殖和迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 STAT3直接调控Wdr1的转录来促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.3.2 活化的STAT3参与动脉损伤修复过程 |
| 4.3.3 STAT3 的激活是WDR1介导的平滑肌细胞的增殖和迁移所必需 |
| 4.3.4 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移需要ADF/Cofilin介导的肌动蛋白动力学的参与 |
| 4.3.5 STAT3直接结合Wdr1的启动子调节其转录活性 |
| 4.3.6 体内抑制JAK2/STAT3途径可降低Wdr1的表达和新内膜形成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 Wdr1的缺失抑制STAT3的核转移 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HAVSMCs中Wdr1的缺失不影响STAT3 的表达和活化 |
| 5.3.2 WDR1介导pSTAT3的核转移 |
| 5.3.3 WDR1通过调控Importinβ的表达和Ran的核质分布来影响p STAT3 的核 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究内容的创新与应用 |
| 6.3 本研究中的不足以及下一步的工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Hsa_circ00063322 吸附miR-548q促进宫颈癌细胞增殖、减弱药物敏感性并调节HPV L2 表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 2.1.2 实验步骤与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 宫颈癌中Hsa_circ00063322 的表达特征及转录调节 |
| 2.2.2 Hsa_circ00063322 影响CC细胞增殖和药物敏感性,以及在体肿瘤生长 |
| 2.2.3 Hsa_circ00063322 作为miRNAs海绵吸附miR-548q |
| 2.2.4 Hsa_circ00063322 通过miR-548q调节L2 表达,以及细胞增殖和药物敏感性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 3.1.2 实验步骤与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 宫颈癌中Hsa_circ0000069 的表达特征 |
| 3.2.2 m6A修饰提高了Hsa_circ0000069 转录本的稳定性 |
| 3.2.3 Hsa_circ0000069 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.2.4 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 妇科肿瘤分子标志物及其个体化精准医疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间学术成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 化痰法在肺癌治疗中的研究及应用 |
| 1 中医理论中“痰”的概念 |
| 2 痰与肺癌的关系 |
| 3 化痰法的理论内涵 |
| 4 化痰法在肺癌治疗中的应用 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 JNK/PUMA在调控肺癌细胞凋亡方面的研究进展 |
| 1 细胞凋亡的机制 |
| 2 JNK信号通路 |
| 3 PUMA与凋亡 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一: 肺瘤平膏(化痰组)含药血清对非小细胞肺癌细胞H1299的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 桔梗皂苷D对非小细胞肺癌细胞H1299、H2030、A549杀伤能力的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 桔梗皂苷D对非小细胞肺癌凋亡的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四:桔梗皂苷D对非小细胞肺癌JNK/PUMA通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五:桔梗皂苷D通过作用于JNK1调控H1299细胞JNK/PUMA通路 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六:桔梗皂苷D通过转录因子AP-1调控H1299细胞凋亡 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七:桔梗皂苷D对非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八:桔梗皂苷D对非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤增殖与凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 维生素C性质及其生物学功能的研究进展 |
| 1.1.1 维生素C的发现、生物合成及利用 |
| 1.1.2 维生素C的运输及机体稳态调节 |
| 1.1.3 维生素C的抗氧化性 |
| 1.1.4 维生素C是二价铁离子和α-氧戊二酸盐依赖性双加氧酶家族蛋白的关键辅因子 |
| 1.1.5 维生素C促进细胞重编程 |
| 1.1.6 维生素C是一个低甲基化诱导因子 |
| 1.1.7 维生素C的潜在抗癌机制 |
| 1.1.8 维生素C与其他疾病的关系及潜在治疗作用 |
| 1.1.9 维生素C在调控细胞信号通路方面的初探索 |
| 1.1.10 维生素C已知的生物学功能具有两面性 |
| 1.2 钠离子依赖型维生素C转运蛋白SVCTs的研究进展 |
| 1.2.1 SVCTs的结构、定位和运输作用 |
| 1.2.2 SVCT1和SVCT2 表达和功能的调控 |
| 1.2.3 SVCT2 在调控细胞分化和细胞功能成熟中的作用 |
| 1.3 非受体型酪氨酸激酶JAK2 的研究进展 |
| 1.3.1 JAK激酶家族蛋白的结构和功能简介 |
| 1.3.2 JAK2 激酶活性的调控 |
| 1.3.3 非经典细胞核内JAK2 信号转导途径研究进展 |
| 第二章 维生素C转运蛋白SVCT2 受体功能的探究 |
| 2.1 材料、试剂与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 2.1.6 细胞培养 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 免疫印迹 |
| 2.1.10 蛋白质免疫(共)沉淀(Immunoprecipitation (IP)/co-Immunoprecipitation (co-IP)) |
| 2.1.11 总RNA提取、反转录和实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR) |
| 2.1.12 双荧光素酶报告实验(Dual Luciferase Reporter Assay,DLR) |
| 2.1.13 细胞内VitC含量测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SVCT2 响应VitC处理特异性激活JAK2和STAT2 |
| 2.2.2 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导与JAK2 的互作 |
| 2.2.3 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导对JAK2 的磷酸化激活 |
| 2.2.4 VitC对 JAK2 的激活与VitC的胞内积累无关且呈现振荡性 |
| 2.2.5 VitC诱导SVCT2 Tyr~(626)发生磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.6 SVCT2 Tyr626的磷酸化介导对 STAT2 的招募 |
| 2.2.7 SVCT2 响应VitC处理增强STAT2 的转录因子活性 |
| 2.2.8 SVCT2对JAK2 的激活依赖对VitC的运输 |
| 2.2.9 SVCT2对VitC的充分运输依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.10 DHA和 GLUT1/3 不能激活JAK2/STAT2 信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 VitC激活的JAK2 信号途径调节细胞内ROS的水平 |
| 3.1 材料、试剂与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 3.1.6 细胞培养 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 免疫印迹 |
| 3.1.9 细胞内ROS含量测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VitC对 JAK2 的激活与对 ROS的抑制无关 |
| 3.2.2 VitC抑制ROS的水平且部分依赖JAK2 的激活 |
| 3.2.3 激活JAK2 有助于SVCT2对ROS的抑制 |
| 3.2.4 VitC诱导PDHK1和PDHA1 的磷酸化且依赖JAK2 的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞表观调控 |
| 4.1 材料、试剂与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与耗材 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 4.1.6 细胞培养 |
| 4.1.7 真核表达载体构建 |
| 4.1.8 细胞转染 |
| 4.1.9 免疫印迹 |
| 4.1.10 IP/co-IP |
| 4.1.11 5mC和5hmC免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)实验 |
| 4.1.12 点杂交(dot blot,DB)实验 |
| 4.1.13 微球菌核酸酶消化实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 VitC诱导F9 细胞基因组5hm C的积累且部分依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.2 VitC激活的JAK2 催化 TET3 Tyr~(1375)发生磷酸化 |
| 4.2.3 Tyr~(1375)的磷酸化提高TET3 的酶活性 |
| 4.2.4 VitC诱导组蛋白H3 Tyr~(41)的磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.5 VitC提高F9 细胞DNA的可接近性且依赖JAK2 的激活 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞多能性和分化调控 |
| 5.1 材料、试剂与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与耗材 |
| 5.1.4 主要试剂配方 |
| 5.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 5.1.6 细胞培养 |
| 5.1.7 细胞转染 |
| 5.1.8 免疫印迹 |
| 5.1.9 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色实验 |
| 5.1.10 总RNA提取、反转录和RT-q PCR |
| 5.1.11 表达谱m RNA测序及数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 VitC和 JAK2 抑制剂处理下F9 细胞表达谱m RNA测序分析 |
| 5.2.2 VitC在 JAK2 活性抑制的条件下促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.3 激活JAK2 不利于VitC促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.4 VitC诱导多能性相关基因Nanog、Esrrb、Prdm14和Prdm16 的表达且依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.5 VitC诱导神经成熟相关基因的表达且严格依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.6 VitC激活的JAK2 分别通过依赖 STAT2 和不依赖 STAT2 的途径诱导多能性相关基因和分化相关基因的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 研究有待改进之处 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 自身炎症性疾病 |
| 1.1.1 自身炎症性疾病概述 |
| 1.1.2 炎性小体激活和白介素依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.3 NF-κB信号通路激活依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.4 I型干扰素信号通路激活依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.5 补体途径依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.6 其他自身炎症性疾病 |
| 1.2 程序性细胞死亡 |
| 1.2.1 细胞凋亡 |
| 1.2.2 程序性坏死 |
| 1.2.3 细胞焦亡 |
| 1.2.4 其他形式的程序性细胞死亡 |
| 1.2.5 程序性细胞死亡与自身炎症性疾病 |
| 1.3 RIPK1及其参与的信号通路 |
| 1.3.1 RIP激酶家族概述 |
| 1.3.2 TNFR1 诱导的炎症和细胞死亡信号通路 |
| 1.3.3 TLR3和TLR4 信号通路 |
| 1.3.4 RLRs信号通路 |
| 1.3.5 RIPK1的促细胞存活功能 |
| 1.3.6 RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 1.3.7 靶向RIPK1的人类疾病研究 |
| 1.4 课题研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床样本和资料 |
| 2.1.2 细胞系、质粒和菌株 |
| 2.1.3 实验试剂、耗材及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集和处理 |
| 2.2.2 质粒构建与制备 |
| 2.2.3 细胞的培养、冻存和复苏 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 基因敲除细胞系构建 |
| 2.2.6 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.7 多重液相蛋白定量 |
| 2.2.8 酶联免疫吸附试验 |
| 2.2.9 细胞总RNA提取和反转录 |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.12 细胞存活和死亡检测 |
| 2.2.13 流式细胞术 |
| 2.2.14 细胞内活性氧测定 |
| 2.2.15 RIPK1体外切割实验 |
| 2.2.16 转录组测序及数据分析 |
| 2.2.17 基因变异位点分析与预测 |
| 2.2.18 数据采集和统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 自身炎症性疾病患者携带新发的RIPK1切割位点变异 |
| 3.1.1 患者临床特征和遗传分析 |
| 3.1.2 RIPK1第324 位天冬氨酸的保守性和变异致病性分析 |
| 3.1.3 RIPK1第324 位天冬氨酸变异不影响其蛋白稳定性和蛋白互作 |
| 3.1.4 RIPK1第324 位天冬氨酸变异导致其不能被caspase-8 蛋白酶切割 |
| 3.2 携带RIPK1切割位点变异的患者细胞中炎症信号过度激活 |
| 3.2.1 患者体内炎性细胞因子水平升高 |
| 3.2.2 患者PBMCs中细胞因子水平升高 |
| 3.2.3 患者PBMCs中 MAPK和 IL-6/JAK/STAT3 信号通路激活水平升高 |
| 3.2.4 患者PBMCs中炎症信号通路激活水平升高 |
| 3.3 RIPK1切割位点变异促进小鼠MEFs中程序性坏死和细胞凋亡 |
| 3.3.1 RIPK1切割位点变异促进TNF诱导的细胞死亡 |
| 3.3.2 RIPK1切割位点变异促进复合体II的形成 |
| 3.3.3 RIPK1切割位点变异促进细胞死亡依赖其激酶活性 |
| 3.3.4 RIPK1切割位点变异促进TNF诱导的细胞凋亡 |
| 3.3.5 RIPK1切割位点变异促进其他死亡受体诱导的细胞死亡 |
| 3.4 RIPK1切割位点变异促进患者PBMCs中程序性坏死和细胞凋亡 |
| 3.4.1 患者PBMCs中细胞死亡相关基因的转录水平升高 |
| 3.4.2 RIPK1切割位点变异促进PBMCs中TNF诱导的细胞死亡 |
| 3.4.3 患者体内细胞坏死激活水平升高 |
| 3.4.4 患者PBMCs中细胞坏死依赖的IL6转录水平升高 |
| 3.5 携带RIPK1切割位点变异的患者fibroblasts抵抗细胞死亡诱导 |
| 3.5.1 患者fibroblasts抵抗TNF诱导的细胞坏死 |
| 3.5.2 患者fibroblasts抵抗细胞坏死的补偿机制 |
| 3.5.3 患者fibroblasts抵抗氧化应激诱导的铁死亡 |
| 3.6 RIPK1切割位点变异促进RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.1 TNF诱导患者PBMCs中RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.2 TNF诱导小鼠MEFs中RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.3 携带RIPK1切割位点变异的患者响应IL-6 受体抑制剂治疗 |
| 3.7 RIPK1切割位点变异不促进NF-κB信号通路激活 |
| 3.7.1 切割位点变异减弱了HEK293T细胞中RIPK1促进的NF-κB激活 |
| 3.7.2 RIPK1切割位点变异不影响MEFs中TRAIL诱导的NF-κB激活 |
| 3.7.3 RIPK1切割位点变异不影响fibroblasts中TNF诱导的NF-κB激活 |
| 4 结论 |
| 5 讨论和展望 |
| 5.1 RIPK1变异导致免疫缺陷或者自身炎症性疾病 |
| 5.2 RIPK1变异导致细胞程序性死亡的调节异常 |
| 5.3 RIPK1变异导致炎症信号通路的调节异常 |
| 5.4 针对RIPK1变异患者的临床治疗 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 实验抗体和试剂列表 |
| 7.2 实验耗材和设备列表 |
| 7.3 主要溶液及配制方法 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
| 答辩决议书 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 应激 |
| 1.1.1 应激对雌性生殖系统的影响 |
| 1.1.2 应激相关激素 |
| 1.2 细胞凋亡 |
| 1.2.1 细胞凋亡的形态学 |
| 1.2.2 细胞凋亡的机制 |
| 1.2.3 细胞凋亡的途径 |
| 1.3 Fas/FasL系统 |
| 1.3.1 Fas/FasL分布 |
| 1.3.2 Fas/FasL系统诱导凋亡的机制 |
| 1.4 TNF-α/TNFR系统 |
| 1.4.1 TNF-α和 TNF受体超家族 |
| 1.4.2 TNF-α的蛋白结构 |
| 1.4.3 TNF-α的受体 |
| 1.4.4 TNF-α细胞信号 |
| 1.5 实验的目的及意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂及其配制 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 实验动物的饲养 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠输卵管上皮细胞的培养 |
| 2.2.2 输卵管上皮细胞中TNF-α的检测 |
| 2.2.3 输卵管上皮细胞中FasL的检测 |
| 2.2.4 输卵管上皮细胞siRNA转染 |
| 2.2.5 TNF-αsiRNA序列筛选 |
| 2.2.6 FasL siRNA序列筛选 |
| 2.2.7 PCR反应 |
| 2.2.8 流式细胞仪检测OECs凋亡 |
| 2.2.9 流式细胞仪检测siRNA转然后OECs凋亡 |
| 2.2.10 流式细胞仪检测C57及转基因小鼠OECs凋亡 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 添加应激相关激素对体外培养OECs凋亡的影响 |
| 3.1.1 体外培养过程中添加CRH对 OECs凋亡相关基因表达的影响 |
| 3.1.2 体外培养过程中添加CORT对 OECs凋亡相关基因表达的影响 |
| 3.1.3 体外添加应激相关激素CRH和 Cort对 OECs凋亡比例的影响 |
| 3.2 体外培养OECs添加应激相关激素对TNF-α/FasL表达的影响 |
| 3.2.1 体外培养OECs添加CRH对 FasL表达的影响 |
| 3.2.2 体外培养OECs添加皮质酮对FasL表达的影响 |
| 3.2.3 体外培养OECs添加CRH对 TNF-α表达的影响 |
| 3.2.4 体外培养OECs添加皮质酮对TNF-α表达的影响 |
| 3.3 siRNA转染后添加应激相关激素对体外培养OECs凋亡情况的影响 |
| 3.3.1 siRNA序列的筛选 |
| 3.3.2 输卵管上皮细胞siRNA干涉FasL后添加CRH体外培养的凋亡情况 |
| 3.3.3 输卵管上皮细胞siRNA干涉FasL后添加皮质酮体外培养凋亡情况 |
| 3.3.4 输卵管上皮细胞siRNA干涉TNF-α后添加CRH体外培养凋亡情况 |
| 3.3.5 输卵管上皮细胞siRNA干涉TNF-α后添加皮质酮体外培养凋亡情况 |
| 3.3.6 输卵管上皮细胞siRNA干涉FasL和 TNF-α后添加CRH对凋亡比例的影响 |
| 3.3.7 输卵管上皮细胞siRNA干涉FasL和 TNF-α后添加Cort对凋亡比例的影响 |
| 3.4 使用基因敲除小鼠添加应激相关激素体外培养OECs的凋亡情况 |
| 3.4.1 体外添加应激相关激素CRH对基因敲除小鼠OECs凋亡比例的影响 |
| 3.4.2 体外添加应激相关激素Cort对基因敲除小鼠OECs凋亡比例的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本实验使用的体外培养OECs模型的科学性 |
| 4.2 OECs细胞凋亡的诱因 |
| 4.3 CRH和Cort诱导OECs凋亡的死亡受体信号通路 |
| 4.4 OECs凋亡过程中死亡受体信号通路作用的验证 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的现状 |
| 1.2 非编码RNA概述 |
| 1.2.1 lncRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.2.2 MicroRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.3 小分子靶向药物在肝癌中的研究进展 |
| 1.4 洛那法尼与Degrasyn在肿瘤研究中的应用 |
| 第二章 lncRNA OIP5-AS1 在肝癌中的作用与机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 lncRNA OIP5-AS1与肝癌 |
| 2.1.2 研究目标 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 肝癌中明显表达失调的lncRNAs鉴定 |
| 2.2.2 lncRNA OIP5-AS1敲低细胞系 |
| 2.2.3 lncRNA OIP5-AS1作用体外实验检测 |
| 2.2.4 探讨lncRNA OIP5-AS1对hsa-miR-26a-3p的调控 |
| 2.2.5 lncRNA OIP5-AS1参与hsa-miR-26a-3p对EPHA2调控机制 |
| 2.2.6 明确lncRNA OIP5-AS1、hsa-miR-26a-3p和EPHA2相互关系 |
| 2.2.7 lncRNA OIP5-AS1和hsa-miR-26a-3p体内成瘤实验 |
| 2.2.8 验证肝癌中三者的表达相关性及其临床意义 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 试剂与耗材 |
| 2.3.2 主要实验设备 |
| 2.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 2.3.4 实验方法 |
| 2.3.5 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肝癌中失调lncRNA的鉴定 |
| 2.4.2 肝癌中lncRNA明显失调的验证 |
| 2.4.3 肝癌组织和细胞系lncRNA OIP5-AS1 的表达 |
| 2.4.4 干扰lncRNA OIP5-AS1抑制细胞增殖和体外侵袭能力 |
| 2.4.5 lncRNA OIP5-AS1 是调节hsa-miR-26a-3p的分子海绵 |
| 2.4.6 hsa-miR-26a-3p在肝癌患者中的表达及其预后价值评估 |
| 2.4.7 lncRNA OIP5-AS1 负调控hsa-miR-26a-3p促进细胞增殖和侵袭 |
| 2.4.8 lncRNA OIP5-AS1 充当hsa-miR-26a-3p ce RNA调控EPHA2 |
| 2.4.9 敲低lncRNA OIP5-AS1 抑制体内肿瘤发生 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 miR-302a/d在肝癌干细胞中的作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 miR-302家族与肝癌 |
| 3.1.2 研究目标 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.2.1 HCC细胞系的肿瘤球体外形成和鉴定 |
| 3.2.2 miR-302a/d,RNAi和E2F7过表达细胞系构建与鉴定 |
| 3.2.3 miR-302a/d作用体外实验检测作用体外实验检测 |
| 3.2.4 miR-302a/d和E2F7相互关系裸鼠体内成瘤实验 |
| 3.2.5 验证肝癌中miR-302a/d和E2F7表达相关性及其临床意义 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 试剂与耗材 |
| 3.3.2 主要实验设备 |
| 3.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 3.3.4 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HCC细胞系的肿瘤球的体外形成和鉴定 |
| 3.4.2 miRNA芯片分析表明,miR-302 家族参与LCSC干性维持 |
| 3.4.3 LCSC的分化和CSC标志物表达 |
| 3.4.4 miR-302a/d抑制HCC细胞的增殖和球体形成并促进细胞凋亡 |
| 3.4.5 miR-302a/d直接靶向HCC细胞E2F7 |
| 3.4.6 E2F7在LCSC形成和分化中的表达 |
| 3.4.7 miR-302a/d通过抑制细胞周期进入来抑制LCSC干性 |
| 3.4.8 E2F7激活AKT1细胞周期蛋白D1信号和下游细胞周期 |
| 3.4.9 miR-302a/d协同E2F7 调控β-catenin/CCND1 信号转导 |
| 3.4.10 miR-302a/d和E2F7 在肝癌中的表达及相关性 |
| 3.4.11 miR-302a/d和E2F7在LCSC中的表达及相关性 |
| 3.4.12 miR-302a/d和E2F7在肝癌中的临床意义 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 洛那法尼联合Degrasyn治疗作用初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 肝癌治疗 |
| 4.1.2 研究目标 |
| 4.2 研究内容 |
| 4.2.1 繁殖和鉴定自发成瘤肝癌小鼠 |
| 4.2.2 洛那法尼联合Degrasyn对HCC自发成瘤小鼠疗效的观察 |
| 4.2.3 洛那法尼联合Degrasyn作用于HCC自发成瘤小鼠机制探 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 试剂与耗材 |
| 4.3.2 主要实验设备 |
| 4.3.3 实验动物 |
| 4.3.4 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Alb-c Myc小鼠基因型鉴定 |
| 4.4.2 Alb-c Myc小鼠表型及洛那法尼联合Degrasyn治疗效果探讨 |
| 4.4.3 洛那法尼联合Degrasyn对小鼠器官组织的影响 |
| 4.4.4 Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠分子检测 |
| 4.4.5 洛那法尼联合Degrasyn治疗对相关分子的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌非编码 RNA 调控机制及相关药物研发进展 |
| 主要参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
| 附件 |
