慢性苯中毒相关基因cDNA的表达与克隆

一、慢性苯中毒相关基因cDNA的表达与克隆（论文文献综述）

周昊^[1]（2021）在《职业性苯暴露矩阵建立及生物效应因子的研究》文中进行了进一步梳理目的:苯作为一种有机溶剂和生产原料,已广泛应用在各行业中。职业性苯暴露的危害主要是长时间低剂量暴露引发的慢性中毒和短时间高剂量暴露引发的急性中毒。常通过呼吸道吸入及接触皮肤吸收进入生物体内引起损害。多年来,我国一直以监测空气中苯浓度作为评价苯暴露量。苯职业暴露矩阵可对缺乏职业监测数据的苯暴露水平进行评估,可分析不同职业及工种间的苯暴露水平的差异,也可分析苯暴露随时间的变化趋势;基于生物个体的苯职业暴露史,利用苯职业暴露矩阵可对生物个体的瞬时暴露水平及累积暴露量进行估值,进而评估个体暴露量。本研究旨在构建我国不同行业的苯职业暴露矩阵并开发相应的计算机查验系统。为卫生政策的制定、暴露风险水平的评估及职业危害的监控等提供数据支撑。职业性苯暴露可引起造血系统为主的多种疾病,通过生物信息学手段,利用公开数据库中不同职业性苯暴露水平的工人的外周血中的lnc RNAs和m RNAs表达谱进行鉴定和分析,从分子水平上筛选可能在苯暴露致白血病的发病过程中发挥重要作用的关键基因,认识苯及苯的代谢物引起的表观遗传学变化,以期寻找职业性苯暴露的早期监测和预警的潜在靶点。肿瘤细胞通过抑制细胞分泌增殖因子使肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）失调。肿瘤微环境中免疫细胞类型的差别和肿瘤细胞与免疫细胞互作的不同使微环境中癌症的免疫反应存在差异,这种变化对肿瘤患者预后影响较大。本研究应用RNA-seq数据集的遗传和临床特征,利用ESTIMATE和CIBERSORT描述弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）中肿瘤细胞与免疫细胞的互相作用,评估免疫细胞群与预后结果之间的关系,建立最佳的DLBCL患者的个性化风险预测预后模型,为阐明职业性苯暴露致白血病的发病分子机制提供理论基础。研究方法:本研究通过构建苯职业暴露矩阵,筛选可能在苯暴露致病过程中关键基因,建立弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的个性化风险预后预测模型三个阶段研究,阐述职业性苯暴露风险、致病机制和个性化预后预测。第一部分研究通过收集1949年至2018年间涵盖66个职业和91个工种的共计5807条苯职业暴露环境监测数据,采用五折交叉验证方法分别对不同类型数据（短时间暴露浓度和时间加权平均浓度）进行线性混合效应模型的构建与验证工作,其中暴露的时间趋势为固定效应变量,而暴露的工种和厂区则作为随机效应变量。通过不断优化模型参数,确定最优模型结构,并利用相关系数和Bland-Altman图对模型的稳定性和可靠性进行评估,最后,利用全部数据集拟合最终模型并构建特定时间-职业和工种的苯职业暴露矩阵。第二部分研究收集基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中的苯职业暴露数据集（GSE5073718）,该数据集包括4例慢性苯中毒患者、3名苯作业工人（苯暴露组）和3名未接触苯的健康对照者。获取数据集中lnc RNA和m RNA表达谱,采用R软件limma软件包筛选组间差异表达基因,并通过基因集富集（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）识别出显着富集在生物过程（process progression,BP）和KEGG通路的基因集,利用Oncomine数据库分析差异表达基因在白血病患者中的表达水平分析。通过检索相互作用基因的搜索工具STRING 10.5在线进行蛋白质相互作用网络的构建。第三部分研究收集TCGA网站中229名DLBCL患者全转录组测序的数据。使用ESTIMATE和CIBERSORT算法估计22种浸润免疫细胞的数量。使用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）惩罚性回归分析和列线图模型来构建和评估预后免疫评分PIS模型,以进行整体生存预测。通过GSEA生成了免疫基因预后评分IGPS,并在独立的GSE10846数据集中应用Cox回归进行验证分析。结果:1.通过不断优化模型结构,本研究确定出两种模型的最优参数,并基于全部数据集进行最终参数的输出,在苯的短时间暴露浓度模型和时间加权平均浓度模型中,工种和厂区变量的方差之和分别占总方差的94.76%和67.92%。苯的短时间暴露水平在1982年之前呈线性下降趋势,之后又出现缓慢的上升趋势,且多数职业和工种的苯暴露浓度均超过了国家所规定的职业接触限值（10 mg/m3）。对于苯时间加权平均浓度而言,其总体变化趋势为2007年之前呈现显着的下降趋势,而后各年间浓度水平趋于平稳,直到2016年各职业的暴露水平又再次出现了较大的波动,但对暴露行业整体而言,大部分职业和工种的苯时间加权平均浓度值仍处于国家规定的职业接触限值以下（6 mg/m3）。2.苯中毒组有222个基因上调,苯暴露组有21个基因上调。苯中毒组和苯暴露组中以下基因表现出同向变化趋势:KCNJ15、CXCR1、PI3、LINC02597、CYP4F3、ALPL、KRT237。在苯暴露组表达上调的基因在白血病患者中也表现出上调趋势,其中KCNJ15、CXCR1、CYP4F3、KRT23最为明显。差异表达基因显着富集于免疫反应、防御反应、和炎症应答生物学过程。蛋白互作的关键蛋白对比分析发现,CXCR1、CCR2、STAT3和PIK3CD为苯暴露致病风险的关键基因。3.Kaplan–Meier曲线分析和对数秩检验发现DLBCL中TME中活化自然杀伤（nature killer,NK）细胞比例较高的病例表现出明显较短的总存活率（P<0.001）,而静息NK细胞更能代表患者的TME理想结果（P=0.001）。活化的和静止的NK细胞是DLBCL预后的独立危险因素,调整后HR为1.72（95%CI[1.20-2.48];P=0.001）和0.53（95%CI[0.37-0.76];P=0.005）。预后不良与DLBCL样本中活化的NK细胞的TME浸润增加和静息NK细胞的TME数目减少有关。应用LASSO法对五种免疫细胞建立了DLBCL患者的个性化风险预后预测模型。五种类型的免疫细胞（活化和静止的NK细胞、Tregs、以及M0和M2巨噬细胞）来建立微环境免疫评分PIS模型,将DLBCL患者分为两个风险组,高PIS组的患者预后明显较差,HR=2.16（95%CI,[1.33-3.50];P=0.002）。并应用8个基因的HR进行加权建立了以IGPS为独立影响因素（HR:2.14,95%CI[1.40-3.28]）的预后模型,该模型在验证数据集中具有很高的特异性和敏感性。免疫评分及其相关结果的差异归因于参与细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路的八个特定免疫基因。结论:本研究构建出的职业暴露矩阵可作为职业流行病学研究中苯暴露评价的暴露浓度数据库,用于职业性苯暴露的风险评估和卫生监管。不同苯暴露水平下基因表达水平存在明显差异,其中KCNJ15、CXCR1、PI3、LINC02597、CYP4F3、ALPL、KRT237在苯暴露组和苯中毒组均显着上调。而KCNJ15、CXCR1CYP4F3、KRT237基因上调与白血病的发病风险相关。职业性苯中毒致白血病的发病机制可能与改变机体免疫反应和炎症应答有关。肿瘤细胞与免疫细胞的互作影响DLBCL患者的临床结局和分子特征,与基于NK细胞、Tregs和巨噬细胞的PIS模型相比,基于免疫相关基因特征的预后模型预测效果最佳。

姜敏^[2]（2021）在《焦化行业职业暴露风险评价及METTL14/miR-92a-3p/RGS3通路在焦炉逸散物致细胞恶性转化中的作用研究》文中进行了进一步梳理目的:焦化作业在备煤、炼焦和回收等多个生产环节均易产生焦炉逸散物、粉尘、一氧化碳等多种职业危险因素的污染,且排放特征极其复杂,环境风险水平高,因此对污染物暴露的环境浓度进行准确评估尤为必要。然而,我国仍然是以环境监测或生物检测等方式来评估职业污染物的暴露水平,浪费人力物力的同时,还由于工作场所和个体的差异而限制了研究结果的外推。此外,焦化工人生产活动中暴露的大量环境污染物可对其健康产生极大的危害。因此,定期监测焦化行业职业污染物的暴露浓度和职业人群的健康状况,并进行定性定量分析,是对焦化作业人群健康危害控制的基础。虽然目前关于焦化污染物在人体各器官系统疾病的发生和发展中的作用已有诸多报道,但其确切的致病机制仍需进一步阐明。近年来,作为一种常见的表观遗传修饰模式,RNA甲基化的作用和功能正不断被发掘,其中RNA m6A修饰作为真核生物中丰度最高的RNA甲基化修饰方式成为新的研究热点。此外,微小RNA（micro RNA,miRNA）作为一类长度在19-25个核苷酸之间的非编码单链小分子RNA,其成熟体在转录后水平与靶基因的信使RNA的3’非翻译端特异性结合,通过调控翻译过程来参与细胞的增殖、分化、凋亡等生物过程,其在肿瘤的发生发展过程扮演着重要的角色。但是m6A修饰及相关miRNA是否参与焦炉逸散物诱导的支气管上皮细胞恶性转化及其作用机制尚不明确。基于以上科学问题,本研究按照污染物类别和数据类型分别构建特定年份-职业及工种的职业暴露矩阵,并通过该职业暴露矩阵对各污染物的暴露水平进行评估,以探究不同污染物暴露水平对焦化工人呼吸系统损伤的影响。此外,通过建立焦炉逸散物致人支气管上皮细胞损伤的细胞模型,探究m6A相关酶系及相关miRNA及其靶向调控基因在焦炉逸散物诱导的支气管上皮细胞恶性转化中的作用、功能及通路,为进一步评估焦炉逸散物的健康损害效应,建立健全焦化作业人群的健康防护方案提供重要依据。研究方法:本研究通过构建焦化行业主要职业污染物的特定年份-职业及工种的职业暴露矩阵以评估各污染物的暴露水平,从而探究不同污染物的暴露对焦化作业工人肺损伤的影响,并利用不同体外实验探索m6A相关酶系及相关miRNA及其靶向调控基因在焦炉逸散物诱导的支气管上皮细胞恶性转化中的生物学改变,进而明确焦炉逸散物在诱导支气管上皮细胞恶性转化中的作用及机制。第一部分研究通过专家咨询及文献查阅等方式,确定焦化行业存在的主要职业危险因素并收集相应污染物的职业暴露数据,将收集的数据按照4:1的比例随机分为训练集和验证集。利用线性混合效应模型对训练集中不同污染物分别构建特定年份-职业及工种的职业暴露矩阵。将已构建的职业暴露矩阵中污染物的预测浓度与验证集中的实测浓度以及焦化工人尿液中多环芳烃的内暴露水平进行相关性分析并利用相关性散点图和Bland-Altman图,对职业暴露矩阵的稳定性及可靠性进行评价。第二部分研究以某焦化厂不同生产车间1810名工人为目标人群,调查其基本人口学信息,生活习惯和既往病史以及职业史,并基于前期的职业暴露矩阵计算各污染物的个体累积暴露剂量,同时进行肺功能各指标的检测,以焦炉工人是否发生肺通气障碍为因变量,年龄、体重指数、吸烟史、饮酒史、累积工龄以及污染物累积暴露量为自变量构建logistic回归模型以识别职业风险因素并对其风险水平进行评估。第三部分研究首先采用二甲基亚砜配制的焦炉逸散物有机提取物溶液按20mg/ml的浓度对人正常支气管上皮细胞进行慢性染毒以构建支气管上皮细胞恶性转化模型,采用软琼脂克隆形成实验验证细胞是否完成恶性转化。然后利用CCK-8实验检测细胞的增殖情况;固定细胞以后,利用PI染料检测细胞周期过程的改变;采用7-AAD和Annexin V-APC双染料法对细胞进行染色,以检测细胞凋亡的发生情况。通过上述功能学实验判断焦炉逸散物对恶性转化细胞生物学行为的影响。然后利用qRT-PCR和Western Blot实验检测恶性转化细胞中METTL3,METTL14以及miR-92a-3p的表达水平的改变,同时利用Starbase以及Linked Omics等数据库预测miR-92a-3p的下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因试验,qRT-PCR和Western Blot实验技术验证miR-92a-3p对下游基因的靶向调控作用。此外,通过向人正常支气管上皮细胞系中转染METTL14过表达质粒,并采用qRT-PCR和Western Blot实验方法探究METTL14对miR-92a-3p及其下游靶基因的调控作用。本研究采用SAS 9.4软件进行模型拟合及职业暴露矩阵构建,并利用Stata 14.0软件进行污染物累积暴露水平的计算。同时运用Med Calc 18.2.1绘制Bland-Altman图;SPSS 22.0被用于数据的整理、Spearman秩和检验以及logistic回归模型的构建。Student’s t检验被用于两组连续型正态分布的定量资料之间的比较;三组及以上连续性正态分布的定量资料的比较则采用方差分析,并采用Dunnett法对实验组与对照组间进行两两比较;此外,χ2检验被用于分类变量间的比较。所有检验均为双侧检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.通过专家评价,将焦炉逸散物、粉尘、一氧化碳、高温和噪声作为焦化行业的主要职业污染物纳入研究,并最终收集6021条时间加权平均浓度数据和2356条短时间暴露水平数据,其中涵盖27个职业和35个工种,所涉及年份从1977年至2018年。通过拟合线性混合效应模型,依据暴露类型对五种污染物分别构建相应职业暴露矩阵。Spearman秩相关检验、散点图及Bland-Altman图表明,除噪声短时间暴露浓度矩阵数据与验证集数据之间相关性不存在统计学意义外,其余各组数据间一致性均较好。对内暴露结果进行相关性分析发现除9-羟基菲外,1-羟基吡和1-羟基萘的浓度与焦炉逸散物职业暴露矩阵预测值间均具有一定的相关性,且相关系数均具有统计学意义。2.通过Logistic回归模型,本研究发现随着年龄的增长,焦炉工人肺通气功能障碍的发生风险也随之升高,比值比为1.092（1.057-1.129）。与不吸烟人群相比,吸烟人群更容易发生肺通气功能障碍,其比值比为1.359（1.079-1.710）。然而,累积工龄是焦化作业工人肺功能障碍发生的一个保护性因素（比值比为0.716（0.586-0.874））。此外,随着COE和噪声累积暴露的增加,焦化工人发生肺通气障碍的风险也在显着提高。COE和噪声的累积暴露水平每增加1个单位,肺通气障碍的危险性分别提高至1.295和1.002倍。而与高温累积暴露水平在200℃以下的个体相比,累积暴露水平在200-500℃、500-800℃和800℃及以上的个体的肺通气功能障碍发生风险依次为3.717倍、3.839倍和5.015倍。通过对阻塞性呼吸功能障碍进行logistic回归分析,本研究发现累积工龄、吸烟状况、焦炉逸散物、噪声和高温的不同累积暴露水平均会影响焦化工人的肺功能状况。与不吸烟人群相比,吸烟工人更容易发生阻塞性肺通气障碍,比值比和95%可信区间为1.342（1.045-1.722）。随着焦炉逸散物和噪声的累积暴露量的增加,其比值比分别为1.513（1.259-1.818）和1.003（1.000-1.006）。与高温累积暴露水平在200℃以下的个体相比,累积暴露水平在200-500℃、500-800℃和800℃及以上者,比值比分别为4.950（2.935-8.348）、5.728（2.539-12.923）和8.081（2.459-26.552）。然而,随着累积工龄的增加,阻塞性肺通气障碍的发病风险反而降低（比值比为0.677,P<0.001）。当以限制性肺通气功能障碍为因变量进行模型拟合时,累积工龄、焦炉逸散物和噪声累积暴露量的危险作用则不具有统计学意义。然而,吸烟和累积暴露于200-500℃的高温下仍会增加工人发生限制性肺通气功能障碍的风险,其比值比分别为1.401（1.070-1.835）和1.771（1.160-2.703）。此外,随着年龄的增长,发生限制性肺通气功能障碍的风险也随之提高,比值比为1.050（P<0.001）。3.利用焦炉逸散物的有机提取物对人正常支气管上皮细胞进行染毒以建立细胞恶性转化模型。功能学实验结果表明,与阴性对照组相比,恶性转化组细胞的分裂和增殖能力受到显着促进,而细胞凋亡过程则未见显着变化。通过qRT-PCR和Western Blot技术检测RNA甲基化转移酶METTL3和METTL14以及miR-92a-3p表达量的改变,结果发现在恶性转化组细胞中,METTL14和miR-92a-3p的表达显着上调,但未观察到METTL3表达水平的改变。接下来本研究应用Target Scan和Starbase等数据库对miR-92a-3p下游靶基因进行预测,发现RGS3可能是miR-92a-3p的潜在靶向调控基因,通过Linked Omics在线网站分析发现miR-92a-3p与RGS3的表达量间存在显着负相关关系,然后应用双荧光素酶报告基因实验,qRT-PCR和Western Blot实验证实了miR-92a-3p可以直接结合到RGS3的3’-UTR区并抑制RGS3的表达。且与阴性对照组相比,恶性转化组细胞中RGS3表达水平显着降低。此外,向细胞中转入METTL14过表达质粒以后,发现miR-92a-3p及其靶基因的表达水平受到不同程度的影响,其中miR-92a-3p的表达显着上调而RGS3的表达则受到相应抑制。结论:1.本研究构建焦化行业五种主要职业污染物（焦炉逸散物,粉尘,一氧化碳,高温和噪声）的职业暴露矩阵。2.基于前述职业暴露矩阵,通过评估各污染物暴露水平对焦化工人肺功能损伤的影响,发现焦炉逸散物、噪声和高温的累积暴露可显着提高焦化工人肺功能障碍的风险。3.焦炉逸散物可促进细胞的分裂与增殖以维持细胞的恶性表型并通过METTL14/miR-92a-3p/RGS3通路发挥作用。

于婷^[3]（2020）在《二烯丙基一硫拮抗苯诱导白细胞减少的效果及其机制研究》文中研究说明研究目的苯是一种透明油状液体,是具有芳香气味的无色或浅黄色的液体。苯作为一种重要的生产原料和有机溶剂在多种工艺中被使用,是职业场所中常见的一种毒物和污染物。1982年国际癌症研究机构（IARC）将苯规定为公认的环境致癌物质。在我国,慢性职业中毒中苯中毒连续多年居于首位。血液系统是慢性苯中毒损害的一个主要靶点。在中毒早期主要引起外周血白细胞减少为,再生障碍性贫血,粒细胞白血病是苯中毒严重时导致的结果。针对慢性苯中毒的治疗目前尚无特定的特效药,主要采用对症、纠正贫血、升高白细胞、支持疗法和抗肿瘤化疗药物进行治疗,但是长期使用可引一系列副作用,如发热、乏力、骨痛、甚至刺激恶性细胞生长等。因此,现在极为重要的是在生活中寻找一种干预药物通过饮食来预防慢性苯中毒。大蒜素在常温下快速的被代谢分解为具有多种生物学功效的有机硫化物（OSCs）,如二烯丙基三硫（DATS）、二烯丙基二硫（DADS）、二烯丙基一硫（DAS）等。DAS的拮抗效果在慢性苯中毒诱导的白细胞减少方面是否也发挥作用尚未见报道。因此,在本次实验中我们选择的干预药物是DAS,经过经口染苯建立外周血白细胞减少症模型,分两部分试验来进行,试图证实DAS是否对苯诱导的小鼠外周血白细胞减少症有拮抗作用?拮抗机制是什么?第一部分,选择ICR小鼠90只,随机分成空白对照组、DAS对照组、苯模型组、DAS低、中、高剂量干预组,每组15只。苯模型组和DAS各干预组动物均经口给予苯（1.3g/kg.bw）,使用玉米油溶解苯,随后以等体积的玉米油给与另外两组实验动物。2 h前,分别给予苯+DAS低、中、高剂量干预组和DAS对照组40、80、160、160mg/kg的DAS,其余两组给以等体积的玉米油,1次/d,持续4周。分别于第14、29天经眼内眦取血于抗凝管中以检测血常规;于第30天,处死动物,迅速取脾脏和胸腺称重并计算脏器系数;取适当部位的脾脏、胸腺经固定后制备石蜡切片做病理学检查,剩余部分于-80℃冷冻保存。结果发现:1.血常规改变与空白对照组比较,苯模型组小鼠染毒第14d外周血白细胞计数下降68.99%,差别有统计学意义（P<0.01）,其中淋巴细胞、单核细胞分别降低了 71.72%,53.19%,差异均有统计学意义（P<0.01）;与染毒第14天比较,苯模型组小鼠染毒第29天淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞进一步分别下降为83.00%,81.03%,89.37%,差异有统计学意义（P<0.01或0.05）;红细胞、血红蛋白分别降低20.84%,19.25%,差异有统计学意义（P<0.01或0.05）。与苯模型组相比较,DAS高剂量干预组干预第14天白细胞计数明显增加270.30%,差异有统计学意义（P<0.01）,其中,单核细胞、淋巴细胞分别增加136.36%、260.00%,差异有统计学意义（P<0.01或0.05）;与干预第14天比较,第29天干预效果明显。DAS低、中、高剂量各干预组白细胞分别增长95.76%,167.80%,453.39%,差异均有统计学意义（P<0.01）;淋巴细胞分别增加114.67%,157.33%,553.33%,差异均有统计学意义（P<0.01）;DAS中剂量组单核细胞增加154.55%（P<0.01）,中性粒细胞增加281.82%（P<0.01）;DAS高剂量组单核细胞增加472.73%（P<0.05）,中性粒细胞增加713.64%（P<0.01）;经DAS干预后,小鼠红细胞、血小板、血红蛋白均明显增高,具有统计学差异（P<0.01或 0.05）。2.病理改变肉眼观察可见空白对照组脾脏颜色暗红,表面光滑,被膜完整,质脆而软,形状呈长椭圆状。苯模型组脾脏颜色变淡,表面粗糙,形状大小较空白对照组变小。DAS40m/kg、80m/kg、160m/kg各剂量干预组无论脾脏颜色还是大小均有恢复趋势。空白对照组具有被膜完整的胸腺,质软,乳白色,短小肥厚。苯中毒模型组胸腺颜色变浅,小而扁平。与苯模型组比较,DAS 40m/kg、80m/kg、160m/kg剂量干预组胸腺病理组织颜色和大小均有不同程度的改善,趋于空白对照组。肉眼观察脾脏病理在DAS对照组中未见明显可见病变。镜下观察正常脾脏被膜呈粉红色,红髓呈深红色,白髓致密呈紫蓝色,为脾结节。红髓和白髓界限清晰。相较于空白对照组,苯中毒模型组脾脏病理色淡,红髓数目多且呈淡粉色,松散分布的白髓及其白髓间分布数量较少的淋巴细胞,红白髓界限不明显。与苯模型组相比较,DAS40m/kg、80m/kg、160m/kg各剂量干预组白髓、红髓的颜色、界限、数目均有不同程度的好转。与空白组对照比较,DAS对照组脾脏病理接近空白对照组,肉眼观察无明显可见病变。与空白对照组比较,苯模型组脾脏白髓面积比降低明显（P<0.01）;与苯模型组比较,DAS40m/kg、80m/kg、160m/kg各剂量组脾脏白髓面积比显着升高（P<0.01或0.05）。正常胸腺轮廓表面被膜呈粉红色,皮质胸腺细胞致密呈深紫蓝色,髓质颜色较浅,皮质和髓质界限清晰。相较于空白对照组,苯模型组中胸腺的皮质变薄,皮质间含有少量的胸腺细胞,皮质与髓质界线不清晰。与苯模型组相比较,DAS低、中、高剂量组皮质厚度、胸腺细胞的数目均有不同程度的恢复。相较于空白对照组,苯模型组皮质面积降低（P<0.01）;与苯模型组相比较,DAS40m/kg、80m/kg、160rm/kg剂量组胸腺皮质面积好转（P<0.01或0.05）。DAS对照组胸腺皮质面积比呈降低趋势（P<0.01）。3.脏器系数改变脾脏重量、脾脏系数、胸腺重量、胸腺系数均值在各组小鼠中存在统计学差异;和空白对照组比较,苯中毒模型组脾脏重量、脾脏系数、胸腺重量、胸腺系数均降低（P<0.01）。与苯模型组比较,DAS80mg/kg.bw、160mg/kg.bw干预组脾脏重重、脾脏系数明显升高（P<0.01或0.05）,DAS160mg/kg.bw干预组胸腺重量、胸腺系数显着升高（P<0.01）。第二部分,选用大鼠建立白细胞减少模型,对DAS升高白细胞的作用和机制做进一步探讨。按照第一阶段动物分组及处理方法进行第二阶段的实验,4周连续灌胃,于4周末麻醉大鼠（戊巴比妥50mg/kg.bw）,腹主动脉法取血进行血常规检测,摘取脾脏和胸腺进行脏器系数计算、,摘取两侧股骨冲取骨髓细胞进行骨髓白细胞计数、骨髓嗜多染红细胞微核、γH2AX表达量、氧化抗氧化指标的检测和氧化抗氧化相关蛋白表达的检测。结果显示:1.血常规改变相较于空白对照组,苯中毒模型组外周血白细胞计数降低了59.76%（P<0.01）,其中单核细胞降低了 69.90%（P<0.01）、中性粒细胞降低了73.97%（P<0.01）,淋巴细胞比例呈现增加趋势32.28%（P<0.01）,血红蛋白、红细胞、血小板分别降低了 57.74%、5.02%、2.52%、（P>0.05）;与苯模型组比较,DAS中、高剂量干预组白细胞计数增加了 164.86%、132.97%（P<0.01）,其中DAS低、中、高剂量干预组单核细胞、中性粒细胞比例增加（P<0.01）,淋巴细胞比例降低（P<0.01）。2.骨髓中白细胞计数骨髓白细胞计数均值在各组间具有统计学差异。相较与空白对照组,经苯染毒的大鼠骨髓白细胞计数降低了 33.11%（P<0.01）,其中单核细胞、中性粒细胞比例分别降低了 39.61%、28.64%,淋巴细胞比例增加了 15.79%;与苯模型组比较,DAS低、中、高剂量干预组白细胞计数显着增加了 137.92%、273.56%、378.66%（P<0.01）,其中中性粒细胞比例在DAS低、中、高剂量干预组中均增加（P<0.01）。3.骨髓嗜多染红细胞微核率检测大鼠骨髓嗜多染红细胞微核数（MPCE）、微核率（‰）在各组间存在统计学差异（P<0.05）。苯模型组中大鼠MPCE数、微核率（‰）升高（P<0.05）相较于空白对照组;而与苯模型组比较,DAS各剂量干预组MPCE数、微核率（‰）降低（P<0.05）。DAS对照组（160mg/kg）MPCE数、微核率（‰）与空白对照组比较无统计学差异。4.BMCs及PBLs中γH2AX表达量的影响各组间BMCs中γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度存在统计学差异（P<0.05）。和空白对照组相比,苯模型组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度升高（P<0.05）;与苯模型组比较,DAS80、160mg/kg剂量干预组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度降低（P<0.05）。各组间大鼠PBLs中γH2AX表达的平均荧光强度和相对荧光强度的均值具有统计学差异（P<0.05）。与空白对照组比较,苯模型组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度升高的均值（P<0.05）;与苯模型组相比,DAS低、中、高剂量干预组γH2AX的平均荧光强度和相对荧光强度的均值呈降低趋势（P<0.05）。5.血清中MDA浓度、T-SOD活性、GSH含量、GSH/GSSG比值、T-AOC水平的改变MDA浓度均值在各组血清之间有统计学差异。与空白对照组,MDA浓度在苯模型组中呈增加趋势（P<0.01）;与苯模型组对比,DAS高剂量干预组MDA浓度减少（P<0.01）。各组T-SOD活性均值存在统计学差异。与苯模型组比较,DAS80mg/kg、160 mg/kg剂量干预组T-SOD活性升高（P<0.01或0.05）;而苯模型组T-SOD活性相较于空白对照组降低（P<0.01）。与苯模型组相比,DAS高（160mg/kg）剂量干预组GSH、GSH/GSSG升高（P<0.01或0.05）;而相较于空白对照组,苯模型组GSH、GSH/GSSG降低（P<0.01）。与苯模型组比较,T-AOC在DAS40、80、160mg/kg剂量干预组升高（P<0.01或0.05）。而在苯模型组中的T-AOC能力相较于空白对照组降低（P<0.05）。6.脾脏匀浆中MDA浓度、T-SOD活性、GSH含量、GSH/GSSG 比值、T-AOC水平的变化脾脏中MDA浓度均值在各组间存在统计学差异。与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组MDA浓度降低（P<0.01）;与空白对照组对比,苯模型组MDA浓度增长（P<0.05）。T-SOD活性均值在各组间存在统计学差异。与空白对照组对比,苯模型组T-SOD活性减少;与苯模型组比较,DAS160mg/kg干预组T-SOD活性升高（P<0.05）。与空白对照组比较,苯模型组GSH、GSH/GSSG 比值降低（P<0.01或0.05）;与苯模型组比较,DAS40、80、160mg/kg各剂量干预组GSH、GSH/GSSG比值升高（P<0.01 或 0.05）。与空白对照组比较,苯模型组T-AOC降低（P<0.05）;与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组T-AOC升高（P<0.05）。7.BMCs 中 MDA 浓度、T-SOD 活性、GSH 含量、GSH/GSSG 比值、T-AOC水平的改变骨髓细胞中MDA浓度均值在各组之间存在统计学差异。与空白对照组对比,苯模型组MDA浓度增长（P<0.05）;与苯模型组相比,MDA浓度在DAS40、80、160 mg/kg干预组呈降低趋势（P<0.01）。与空白对照组对比,苯模型组T-SOD活性下降;而与苯模型组相比,DAS40mg/kg剂量干预组T-SOD活性升高（P<0.05）。与空白对照组对比,模型组GSH、GSH/GSSG 比值降低;与苯模型组比较,DAS160mg/kg 剂量干预组 GSH、GSH/GSSG 比值升高（P<0.05）。与空白对照对比,苯模型组T-AOC降低;与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kgge各剂量干预组T-AOC升高。8.PBMCs 中 MDA 浓度、T-SOD 活性、GSH 含量、GSH/GSSG 比值、T-AOC水平的改变苯模型组MDA浓度相较于空白对照组MDA浓度增加（P<0.01）;而与苯模型组相比,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组MDA浓度降低（P<0.01）。与空白对照组相比,苯模型组T-SOD活性降低;与苯模型组比较,T-SOD在DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组活性呈升高趋势。苯模型组GSH、GSH/GSSG比值降低相较于空白对照组;与苯模型组比较,DAS中、高剂量干预组GSH、GSH/GSSG比值升高（P<0.01或0.05）。与空白对照比较,苯模型组T-AOC降低（P<0.05）;与苯模型组比较,DAS40、80、160 mg/kg剂量干预组T-AOC升高。9.氧化应激相关蛋白在骨髓细胞中的表达情况与空白对照组相比,苯模型组中Keap1和Nrf2的蛋白表达分别降低50.21%和51.09%。其下游抗氧化蛋白γ-GCSC,HO-1,SOD-1等表达量分别降低38.12%,50.09%,65.12%。与苯模型组相比较,相关蛋白的表达量在DAS各剂量干预组均有改善。结论1.连续四周灌胃苯导致苯模型组外周血白细胞减少,可判定外周血白细胞减少动物模型构建成功。2.DAS各剂量组可升高外周血白细胞和骨髓白细胞数量,证明其具有拮抗血液毒性和骨髓抑制的作用。3.DAS拮抗苯的骨髓抑制,减少DNA损伤,可能与激活Keap1/Nrf2通路,上调下游蛋白相关蛋白NQO1、γ-GCSc、SOD-1表达,减少脂质过氧化,改善了氧化应激有关。

贺今^[4]（2019）在《芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策》文中进行了进一步梳理研究目的苯（C6H6）作为芳香烃毒物,既是油漆、喷漆、制鞋、制药和粘胶等行业中常用的有机溶剂,也是汽车尾气排放、室内装修和香烟烟雾中常见的环境污染物,因此职业暴露人群及普通人群均有机会接触苯,导致慢性苯中毒。慢性苯中毒所引起的血液系统损伤主要表现为白细胞减少和血小板减少,严重者可引起再生障碍性贫血/骨髓造血衰竭（Bone marrow failure,BMF）以及急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）。BMF主要表现为骨髓造血抑制引起的三系细胞减少,其毒性机制主要为苯及其代谢物如氢醌、苯酚在骨髓蓄积引起的造血干/祖细胞毒性,但其具体分子机制尚未完全阐明。流行病学研究表明苯中毒患者引起的AML通常发生于BMF之后,因此苯诱导的AML（Benzene-induced AML,BZ-AML）作为继发性白血病,具有与原发性白血病不同的机制特点,对其发病机制的研究有助于BZ-AML预防及治疗。炎症小体是一类分布于胞浆中的蛋白复合体。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3）是目前研究最广泛及最具有特征性的炎症小体之一,在接受到内源性危险信号如ROS刺激后可活化并诱导免疫和炎性反应,因此在免疫防御及氧化应激方面具有重要意义。目前研究已经表明苯可引起ROS的过度生成,而ROS是NLRP3炎症小体的内源性激活物。那么,NLRP3炎症小体是否在苯诱导的氧化应激损伤中发挥作用?NLRP3炎症小体的活化与机体T淋巴细胞免疫功能损伤有无关联?通过调控与苯诱导的骨髓毒性相关的哪些分子通路发挥作用?在苯诱导的BMF和AML不同造血损伤中NLRP3的表达有无异同?现在尚不清楚。苯作为芳香烃毒物,主要与胞浆内的芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）结合,AhR是一种存在于胞浆中的配体激活的转录因子,苯作为外源性配体与胞浆中AhR结合后使其受到活化而进入细胞核中,进而启动目标基因的表达。目前研究证实AhR基因敲除小鼠在苯染毒暴露后不再引起骨髓造血毒性,表明AhR是苯诱导骨髓造血毒性的重要胞浆转录因子。目前认为苯诱导的造血毒性的主要机制有两点:1、苯与骨髓细胞浆内的AhR结合后直接作用于造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）引起细胞周期、基因调控、凋亡及氧化应激的异常,从而引起HSC的增殖期和静止期平衡异常;2、苯的代谢物如苯醌、氢醌与骨髓细胞的AhR结合后引起的细胞毒性反应。因此,AhR在苯的造血毒性机制中具有重要作用,但其具体分子调控机制尚不清楚。目前建立的苯诱导的造血损伤动物模型,在不同的种系、苯暴露剂量和途径及时间均进行了实验性研究,然而尚欠缺可完全复制的苯诱导的BMF、AML动物模型。我们在总结既往动物模型建立研究基础上,优化了苯暴露途径、剂量、时间,分别应用不同苯暴露的方案建立了拟人化的BMF和AML小鼠模型。在建模基础上,进一步明确苯与AhR结合后能否激活NLRP3炎症小体,及NLRP3异常表达在苯诱导骨髓细胞氧化损伤中的作用。此外,分别利用淫羊藿多糖（Epimedium polysaccharides,EPS）对苯诱导的 BMF 及鸦胆子苦醇（Brusatol）对苯诱导的AML进行药物治疗干预,进一步验证NLRP3的异常表达在苯诱导的BMF和AML不同造血毒性中的作用。为明确AhR介导的NLRP3炎症小体异常活化在苯诱导的造血毒性中的作用及EPS、Brusatol的临床应用提供了体内实验依据。本论文从以下两个方面进行了研究:一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策:在成功采用皮下注射苯的方法建立苯诱导的BMF小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓细胞中AhR及NLRP3炎症小体基因及蛋白表达均明显增高,表明AhR及NLRP3炎症小体的异常活化与骨髓造血衰竭密切相关;应用EPS能通过抗凋亡、抑制氧化应激、增强T淋巴细胞免疫功能及调节造血因子紊乱机制发挥改善骨髓造血衰竭的作用。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策:在成功采用吸入苯的方法建立BZ-AML小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓单个核细胞的NRF2及NLRP3炎症小体的异常活化与苯的致白血病作用密切相关,Brusatol通过抑制骨髓单个核细胞NRF2、NLRP3的基因及蛋白表达及诱导凋亡发挥抗白血病作用。研究方法一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策1.50只CD1雄性小鼠分为建模组和对照组。建模组40只,分为4个亚组（10只/组）:BMF组、EH组、EL组、CsA组,背部皮下注射苯油混合物,对照组（Control组）10只背部皮下注射等量玉米油,每周注射3次（周一、三、五）,直至累计完成25次注射剂量。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.利用剪尾取血法采集外周血,兽用血细胞计数仪检测白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）计数以及网织红细胞（RC）百分比、血红蛋白（Hgb）浓度的变化;利用HE染色观察外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学改变,通过与对照组比较,验证苯诱导的BMF小鼠的成模率。3.设计AhR、CYP1A1特异性引物,骨髓细胞经裂红及离心后获得骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs）,利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测AhR及CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和BMMNCs中的差异表达。4.利用流式细胞仪检测BMMNCs中ROS的生成及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分比,qPCR和Western blot方法检测NLRP3的表达,研究NLRP3炎症小体异常表达在苯诱导的氧化应激损伤及免疫毒性中的意义。5.利用流式细胞仪检测BMMNCs的细胞周期、细胞凋亡率,Western blot方法检测D1型细胞周期蛋白（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶K4（Cyclin-dependent kinases K4,CDK4）蛋白的表达水平,研究细胞周期及细胞凋亡率的异常在苯诱导的BMF发病机制中的意义。6.建模成功后,给予 EH 组（EPS100mg/kg）、EL 组（EPS20mg/kg）、CsA 组（CsA1Omg/kg）小鼠采用灌胃给药治疗4周,BMF组及对照组给予等量生理盐水灌胃。每天灌胃1次,连续4周。通过观察各组小鼠体重变化,兽用血细胞分析仪检测小鼠血常规变化,显微镜观察外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理学变化,观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用。7.为明确EPS对苯诱导的BMF的治疗作用机制,本研究进一步利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞凋亡率的变化,通过qPCR方法观察BMMNCs 凋亡相关基因 Caspase-9、BCL-2、BAX 的表达,进一步 Western blot方法检测BAX蛋白的表达,观察EPS对凋亡的影响及机制。8.为明确EPS是否通过调控细胞周期发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞周期的变化,通过qPCR及Western blot方法检测BMMNC中CDK4基因和蛋白的表达,观察EPS对于细胞周期的影响。9.为明确EPS是否通过调控免疫及造血因子发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪及ELISA方法,检测各组小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群变化,以及外周血造血调控因子IL-2、IL-11和EPO浓度的变化,观察EPS对于T细胞亚群及细胞因子的影响。10.为明确EPS是否通过调节BMMNCs的氧化应激损伤发挥作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs中ROS水平变化,进一步qPCR检测BMMNCs中NLRP3炎症小体基因表达变化,观察EPS对于氧化应激损伤的影响。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策1.将30只雄性CBA/Ca小鼠随机分为3组（10只/组）:对照组、BZ-AML组、Brusatol组。对照组（Control组）小鼠吸入空气,BZ-AML组、Brusatol组小鼠通过静式染毒柜吸入苯:苯浓度300ppm,每天6小时（6h/d）,每周5天（5d/w）,连续8周。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.通过血常规、外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学检查以及流式细胞仪检测CD34+、CD45+、CD13+、CD19+髓性白血病免疫分型,通过与对照组比较,验证BZ-AML小鼠的成模。3.流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs中的ROS生成及外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞的百分比。4.利用SPE-GC-MS检测BZ-AML小鼠血液、肝脏、肾脏、骨髓不同脏器苯及其代谢产物苯酚、氢醌等的浓度,分析了苯及其代谢物在不同脏器的分布在BZ-AML发病机制中的意义。5.利用流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs的细胞凋亡率及细胞周期的改变,分析凋亡和周期异常在其发病机制中的意义。6.利用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）及 Western blot 检测 BZ-AML小鼠骨髓组织及BMMNCs的NLRP3的表达,Western blot检测BZ-AML小鼠BMMNCs中AhR及CYP1A1的表达,观察AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML发病机制中的意义。7.确认建模成功后,Brusatol用无菌注射用水稀释后,Brusatol组给予腹腔注射Brusatol 4mg/kg,对照组及BZ-AML组均给予腹腔注射等体积的无菌注射用水,每天注射1次,5天/疗程,连续两个疗程。治疗结束后,Western blot检测 BZ-AML 小鼠 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、CDK4、CyclinDl、NLRP3等的表达变化,进一步验证AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中的调控机制。研究结果一、AhR介导的NLRP3信号通路在苯致BMF中作用机制及EPS逆转策略1.建立苯诱导的BMF小鼠模型首先我们利用CD1小鼠皮下注射苯（2mL/kg）的方法建立BMF小鼠模型。血常规结果显示,BMF模型组与对照组比较WBC、RBC、PLT计数、RC百分比及Hgb浓度明显下降;血涂片及骨髓细胞学涂片显示有核细胞均明显减少;股骨组织病理学检查显示骨髓增生度极度低下,造血面积明显减少。结果表明小鼠模型与人类苯诱导的BMF具有相似的造血损伤特征。2.AhR、CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和骨髓中的差异性表达为了明确AhR和CYP1A1在苯诱导的造血毒性中作用,本研究首先检测了苯蓄积的主要靶器官肝脏和骨髓中AhR和CYP1A1的表达。qPCR方法检测基因表达和Western blot方法检测蛋白表达结果显示,与对照组相比,BMF组小鼠AhR和CYP1A1在骨髓和肝脏表达均明显升高,而在骨髓细胞的表达增高较肝脏更为显着。3.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的ROS增高及NLRP3炎症小体活化为了研究NLRP3在苯诱导的骨髓毒性中的作用,本研究在成功建立BMF模型基础上,首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS生成,明确苯暴露是否诱导小鼠骨髓氧化应激损伤。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的ROS产生明显增高。为观察苯诱导的ROS生成增加是否引起NLRP3的活化,本研究应用qPCR和Western blot检测了 BMMNCs的NLRP3的表达,mRNA及蛋白结果均表明BMF模型组BMMNCs的NLRP3表达明显增高。因此,苯诱导的骨髓细胞ROS增高引起的NLRP3炎症小体的活化与骨髓毒性密切相关。4.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的S期阻滞及CDK4、CyclinD1蛋白表达降低为了观察苯暴露对BMF模型小鼠BMMNCs细胞周期的影响,本研究首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的细胞周期的改变。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠S期细胞百分比明显增加。进一步用Western blot检测周期调控相关的CDK4、Cyclin D1蛋白的表达,发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的CDK4、Cyclin D1的蛋白表达明显降低。5.苯诱导BMF小鼠模型外周血造血因子IL-11、IL-2、EPO的失调为了观察苯诱导的BMF是否伴随造血因子的紊乱,本研究应用ELISA检测了血浆IL-11、IL-2、EPO的表达,发现与对照组相比,BMF模型组IL-2及EPO明显增高但IL-11降低,结果表明造血因子的紊乱在苯诱导的BMF发病机制中起一定作用。6.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的体重减轻为了观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用,我们在利用雄性CD1小鼠皮下注射苯的方法成功建立BMF小鼠模型后,给予不同剂量组的EPS灌胃治疗4周。发现与未治疗的BMF小鼠发生的进行性消瘦比较,EH组和EL组小鼠体重增加。这说明EPS具有缓解BMF引起的小鼠体重减轻的作用。7.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的造血损伤EPS治疗4周后,与未治疗的BMF小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血常规示WBC和PLT计数、Hgb浓度、RC百分比均增加,外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理检测均显示骨髓有核细胞增加,这些结果表明,EPS能改善苯诱导的BMF。8.EPS通过下调BAX表达抑制苯诱导的BMMNCs过度凋亡因为观察到苯诱导BMF组小鼠的BMMNCs凋亡率增高,本研究进一步观察了 EPS治疗后小鼠BMMNCs凋亡率的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs凋亡率下降,进一步检测凋亡相关基因BAX、BCL-2、Caspase-9,发现EPS治疗组BMMNCs中BAX基因水平降低,Caspase-9、BCL-2则没有明显统计学差异。进一步蛋白结果验证也表明,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs的BAX蛋白表达降低。这些结果表明,EPS是通过下调BAX基因及蛋白表达发挥抗凋亡作用。9.EPS通过上调CDK4减轻苯诱导的BMMNCs的S期阻滞为了观察EPS改善苯诱导的BMF是否与周期调控有关,本研究进一步检测了 EPS治疗后小鼠BMMNCs细胞周期的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的S期阻滞减轻,进一步检测CDK4的表达,我们发现EPS治疗组和药物阳性对照CsA组小鼠的BMMNCs的CDK4表达上调。这些结果表明,EPS治疗通过上调CDK4的蛋白表达减轻了苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的S期阻滞。10.EPS通过抑制NLRP3炎症小体的活化减轻苯诱导的氧化应激损伤体外研究已经证实EPS具有抗氧化应激作用,本研究进一步用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS的水平变化,观察EPS改善苯诱导的BMF与氧化应激损伤的关系。结果发现EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的ROS的增高受到抑制。qPCR结果显示EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的NLRP3的mRNA表达均明显降低。这些结果表明EPS可能通过抑制NLRP3炎症小体的活化发挥减轻苯诱导的骨髓细胞氧化应激损伤。11.EPS改善了外周血CD4+/CD8+T细胞比例及纠正造血因子的失衡为了观察EPS对苯诱导的BMF是否具有免疫调节作用,本研究进一步流式细胞仪检测了 EPS治疗后T淋巴细胞百分比及ELISA检测造血因子水平的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的CD3+、CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+比例明显增加;与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血浆IL-11增高而IL-2和EPO降低。结果表明经EPS治疗后,苯诱导的BMF引起的T淋巴细胞免疫抑制及造血因子失衡得到缓解,EPS具有增强T淋巴细胞免疫功能和纠正造血因子失衡的作用。二、AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中作用机制及Brustol逆转策略1.采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型雄性CBA/Ca小鼠,采用静式吸入苯暴露染毒方法建立BZ-AML小鼠模型,与对照组比较,BZ-AML组小鼠血常规显示WBC、RBC和PLT降低,中性粒细胞百分比增高,外周血及骨髓细胞学涂片显示明显增多的原始细胞;肝脏病理检查显示原始细胞对肝窦的浸润伴脂肪细胞的增多;骨髓病理检查显示有原始细胞浸润骨膜,通过SPE-GC-MS分析苯及其代谢物,结果表明BZ-AML组与对照组相比,其血液、骨髓、肾脏、脾脏和肝脏中的含量明显高于对照组,BZ-AML组BMMNCs出现与人类相似的髓性白血病免疫分型表现:CD34+、CD13+、CD19-。2.苯诱导BZ-AML小鼠的免疫功能抑制建模完成后,应用流式细胞仪检测BZ-AML组和对照组小鼠外周血的T淋巴细胞亚群结果表明,BZ-AML组的CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+的T淋巴细胞明显低于对照组。表明BZ-AML的发病机制与苯诱导的免疫功能明显抑制密切相关。3.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2活化BZ-AML组与对照组比较,qPCR及Western blot结果表明BMMNCs的AhR、CYP1A1、NLRP3、NRF2基因和蛋白表达明显增高;免疫组化也表明骨髓组织的NRF2、NLRP3蛋白表达增强,研究结果证明在苯与AhR结合后可进一步诱导BMMNCs及股骨组织NRF2、NLRP3的活化,这可能是BZ-AML的发病机制之一。4.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs凋亡受阻、G0/G1期阻滞BZ-AML组和对照组比较,流式细胞仪结果表明BMMNCs的细胞凋亡受阻、G0/G1期细胞百分比增高,研究结果证明苯诱导了 BMMNCs的凋亡阻遏及G0/G1期阻滞。5.Brusatol治疗能抑制BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2的活化经Brusatol治疗10天后,1HC及Western blot结果表明与BZ-AML组小鼠比较,Brusatol组小鼠NLRP3、KEAP1及NRF2蛋白的表达明显降低,结果表明Brusatol通过抑制NLRP3及KEAP1-NRF2的活化发挥抗白血病作用。6.Brusatol治疗能诱导BZ-AML小鼠BMMNCs的凋亡经Brusatol治疗10天后,流式细胞仪检测对照组、BZ-AML组、Brusatol组小鼠 BMMNCs 晚期凋亡率分别为 4.27±0.42%,1.20±0.50%,2.14±0.28%。结果表明,Brusatol能诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的凋亡,从而发挥抗白血病作用。研究结论一、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在苯诱导的BMF中发挥重要作用1.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的ROS过度生成,ROS可引起NLRP3炎症小体的活化;2.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的凋亡率增加和S期阻滞;3.AhR和CYP1A1在肝脏和骨髓高表达,但骨髓表达增高更明显,其组织的差异表达是苯诱导的BMF造血毒性的重要机制;4.外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞降低及造血因子IL-11、IL-2和EPO的失衡与苯诱导的BMF免疫毒性密切相关。二、EPS通过抗凋亡、抗炎、减轻周期阻滞、增强T细胞免疫功能发挥改善骨髓造血衰竭的作用1.EPS能通过的下调BMMNCs的BAX基因和蛋白的表达发挥抗凋亡作用;2.EPS能通过抑制BMMNCs的NLRP3炎症小体活化、降低ROS生成发挥抗氧化应激作用;3.EPS能通过上调BMMNCs的CDK4蛋白表达减轻S期阻滞的作用;4.EPS通过增加外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比及改善IL-11、IL-2和EPO造血因子的失衡,发挥增强免疫的作用。三、利用CBA/Ca小鼠采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型1.外周血及骨髓细胞学涂片、肝脏及骨髓病理检查均显示原始细胞增多,结合骨髓细胞的白血病免疫分析:CD34+、CD13+、CD19-,验证了拟人化的BZ-AML动物模型成功构建;2.BZ-AML 小鼠外周血的 CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞免疫功能明显受抑制;3.BZ-AML小鼠存在BMMNCs的凋亡抑制及G0/G1期的阻滞。四、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在BZ-AML中发挥调控作用1.BZ-AML 小鼠的 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、NLRP3 均表达增强,表明苯和AhR结合后引起了 NRF2、NLRP3活性增强;2.Brusatol通过诱导BMMNCs凋亡增加发挥抗白血病作用;Brusatol明显降低了NLRP3、KEAP1-NRF2相关基因和蛋白的表达,表明Brusatol抗白血病机制与抑制NLRP3炎症小体、KEAP1-NRF2的活化密切相关。创新性和意义1.明确了在苯诱导的BMF小鼠模型中,苯暴露引起BMMNCs的ROS过度生成并伴随NLRP3炎症小体的活化;2.体内实验证明了 EPS、Brusatol对苯诱导的BMF、AML具有治疗作用;3.体内实验证明EPS、Brusatol可能通过抑制NLRP3活性发挥改善骨髓造血毒性的作用;4.发现了 AhR和CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠的肝脏和骨髓的差异性表达,其在骨髓的增高更为显着,为苯的造血毒性机制提供了新观点;5.研究结果为EPS、Brusatol治疗苯诱导的BMF、AML不同造血毒性的临床应用奠定了实验基础。局限性1.未进行体外细胞培养深入探究苯诱导的ROS生成与NLRP3炎症小体的活化的剂量-效应关系,故ROS水平与NLRP3炎症小体活化的浓度-效应关系尚未确定;2.由于时间的关系,未深入研究苯与胞浆的AhR结合后是如何调控胞内NLRP3活化的具体分子通路。

宁琼^[5]（2019）在《Tim-3在苯染毒诱导急性髓系白血病免疫逃逸中的作用及机制研究》文中研究指明第一部分 苯染毒诱导急性髓系白血病动物模型的建立及特点[研究目的]苯是广泛存在于人们生产和生活环境中的化学物质,可由装修释放、职业暴露、烟草燃烧、汽车尾气等产生,是目前公认的可诱导白血病尤其是急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）发生的重要环境因素。长期慢性苯暴露主要损害造血系统,可引起白细胞总数、中性粒细胞计数以及血小板计数减低,全血细胞减少,再生障碍性贫血甚至白血病。基于流行病学证据,苯暴露引起的白血病类型主要为急性髓系白血病。白血病治疗费用较高,苯所致白血病的发生对社会造成的危害和影响程度较大。但是苯所致白血病的机制尚不完全清楚,且缺乏相应的动物模型。因此,系统的论证苯与白血病发生之间的关系,有着重要的社会意义和科学价值。采用皮下注射苯的染毒方法简单、易于操作,也比较接近于苯接触人群的实际暴露情况,因此本实验拟建立皮下注射苯染毒诱导AML动物模型,为进一步研究苯所致白血病的发病机制提供动物模型,并在此基础上寻找苯所致白血病的关键基因和通路。[研究方法]1.动物模型建立染毒组采用皮下注射苯玉米油（苯和玉米油的比例为1:9）混合溶剂（纯苯浓度为250mg/kg·d）,每周连续注射6天,休息1天,直至建立苯染毒诱导的AML动物模型。对照组给予皮下注射同等剂量的玉米油。2.血常规检测染毒组与对照组在不同时期节点麻醉动物后取外周血,枸橼酸钠稀释10倍后,五分类血细胞分析仪检测两组小鼠血细胞计数,持续观察白细胞、红细胞、血小板数量变化规律。3.外周血涂片染毒组与对照组在不同时期节点麻醉动物后取外周血,进行血涂片,行瑞氏-吉姆萨染色,观察细胞形态。4.骨髓涂片染毒组与对照组麻醉后处死动物,取股骨骨髓,进行骨髓涂片,冲出后自然风干,再行瑞氏-吉姆萨染色,进行骨髓细胞学检查。5.组织病理学检查染毒组与对照组麻醉后处死动物,分别取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和骨髓组织,使用4%多聚甲醛固定,常规制作石蜡切片,HE染色、镜检。[实验结果]1.小鼠生存状态染毒初期,部分小鼠开始出现易激惹、精神略显亢奋,增重缓慢;随着染毒时间延长,小鼠体重下降,部分小鼠出现步态不稳、竖毛、弓背、皮毛粗糙、脱毛等症状。染毒过程中有小鼠出现恶液质表现,后死亡。对照组小鼠生长正常,未见此表现。2.外周血细胞计数在苯染毒后不同阶段,染毒组外周血白细胞计数呈现染毒初始阶段减少,白血病爆发阶段骤然升高的趋势。与对照组相比,染毒6月组外周血白细胞计数明显升高。染毒组红细胞、血小板计数总体呈现逐渐下降趋势。与对照组相比,染毒6月组外周血红细胞和血小板计数明显减少。3.血涂片染毒6月组血涂片显示啮齿类动物血片特点,有环形中性粒细胞、单核细胞、嗜多色红细胞、血小板,并可查见白血病细胞。对照6月组血涂片未见白血病细胞。4.骨髓涂片染毒6月组骨髓涂片提示骨髓中可见灶状成团分布的白血病细胞,细胞胞体较大,核浆比例失调,且原始细胞比例>30%。细胞化学染色示MPO阴性至弱阳性,PAS阴性,符合急性髓系白血病特点。表明皮下注射苯染毒6月时AML动物模型成功建立。对照6月组骨髓涂片未见明显异常。5.组织病理学检查染毒6月组小鼠肺脏正常组织结构破坏,肺泡固有的结构被弥漫增殖的肿瘤细胞所取代,瘤细胞形态基本一致,细胞胞体较大,核圆形而不规则,核染色质较疏松,核分裂象较多见。染毒6月组小鼠脾脏正常组织结构破坏,固有的结构被弥漫增殖的肿瘤细胞所取代,白血病细胞在脾小体和红髓内呈弥漫性浸润。染毒6月组小鼠骨髓组织增生异常活跃,可发现瘤细胞聚集。染毒6月组小鼠肝脏组织汇管区可见大小不一、形态各异的肿瘤细胞,可见核分裂象。对照6月组小鼠肺脏、脾脏、骨髓和肝脏病理学检查未见明显异常。染毒6月组和对照6月组小鼠心脏、肾脏病理组织均未见明显异常改变。[研究结论]实验结果表明,可通过皮下注射苯的染毒方式诱导AML,染毒6月时成功建立苯诱导AML小鼠动物模型。苯染毒影响小鼠的体重增长,对神经系统影响表现为先兴奋后抑制。苯染毒后外周血白细胞数量先下降后升高,血小板和红细胞计数逐渐减少,骨髓造血功能受到抑制。染毒过程中先出现苯中毒表现,后发生急性白血病。染毒6月组骨髓涂片可见较多原始细胞。染毒6月组骨髓病理检查可见骨髓组织增生异常活跃,脾脏、肝脏病理组织中亦可观察到明显的髓外肿瘤细胞浸润。此外,苯诱导白血病模型组中肺组织也是较早观察到肿瘤细胞浸润的器官。第二部分 Tim-3在苯诱导AML中的表达及免疫抑制作用[研究目的]苯是引起急性髓系白血病（AML）的重要环境致病因素,但其具体发生机制仍未明确。目前关于白血病发病机制的研究众多,其最终发生与白血病细胞增殖失控、凋亡受阻、分化障碍造成的克隆性增殖,以及由于免疫缺陷造成的肿瘤免疫逃逸两方面均密切相关。我们第一部分实验建立了苯染毒诱导AML的小鼠动物模型,较好的模拟了苯白血病过程中体内造血微环境变化,为深入研究苯所致白血病的发病机制提供了较为理想的动物模型。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞、成纤维细胞及内皮细胞能通过产生多种趋化因子将肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的前体细胞—单核细胞招募到肿瘤部位,并将其由发挥免疫监视的M1型巨噬细胞“驯化”为发挥免疫抑制作用的M2型巨噬细胞,称为巨噬细胞极化。而TAMs通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）等多种生长因子促进肿瘤生长,与肿瘤的发生及不良预后相关。负性共刺激分子（又称负性免疫检查点分子）对免疫应答的抑制作用作为一种重要的肿瘤免疫逃逸机制受到了 广泛关注。Tim-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）,全名T淋巴细胞免疫球蛋白粘蛋白3,作为一种免疫调节分子,在免疫学领域得到了广泛的研究。然而,Tim-3在血液学恶性肿瘤中的作用或表达的研究至今还很有限,尤其是在苯所致白血病中的研究尚未见报道。鉴于白血病高度恶性的生物特性以及与实体肿瘤的差异性,研究Tim-3在苯染毒诱导的AML中的表达及意义是有必要的。我们将通过负性免疫检查点分子Tim-3的表达变化与功能介导为切入点,进一步研究Tim-3在苯诱导AML发病过程中微环境的免疫抑制作用,为阐释苯所致白血病的发病机理、监测并干预苯的血液学毒性提供实验室基础,并为苯所致白血病的治疗提供免疫靶点。[研究方法]1.免疫细胞因子检测造模成功的染毒模型组（苯所致白血病模型组）和对照组实验动物分别进行眼眶取血,分离血清,依照Elisa试剂盒说明书进行操作,用酶标仪在450nm波长测染毒模型组和对照组实验动物血清IL-12、TGF-β1的含量。2.流式细胞术检测分别检测染毒模型组与对照组实验动物骨髓、脾脏及外周血的CD8+T细胞和CD14+单核细胞上Tim-3表达水平。3.免疫荧光染色检查（1）分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫荧光法检测骨髓组织的F4/80（M1+M2）巨噬细胞上Tim-3的表达及CD206（M2型）巨噬细胞在（M1+M2）巨噬细胞中的表达。（2）分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫荧光法检测脾脏组织的CD163（M2型）巨噬细胞在CD68（M1+M2）巨噬细胞中的表达。[研究结果]1.免疫细胞因子检测IL-12、TGF-β1（1）细胞因子IL-12染毒模型组血清IL-12较苯染毒前明显降低,分别为（128.65±62.06）pg/mL和（240.46±130.98）pg/mL,有统计学差异（p<0.05）。染毒模型组血清IL-12与对照组相比明显降低,分别为（128.65±62.06）pg/mL和（216.71±70.16）pg/mL,有统计学差异（p<0.05）。（2）细胞因子TGF-β1染毒模型组血清TGF-β1较苯染毒前明显升高,分别为（103.59±36.13）pg/mL和（54.03±21.07）pg/mL,有统计学差异（p<0.05）。染毒模型组血清TGF-β1与对照组相比明显升高,分别为（103.59±36.13）pg/mL和（76.84±15.73）pg/mL,有统计学差异（p<0.05）。2.流式细胞术检测骨髓、脾脏及外周血中CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平（1）骨髓细胞上Tim-3的表达:与对照组相比,染毒模型组骨髓CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平均明显升高（p<0.05）。（2）脾脏细胞上Tim-3的表达:与对照组相比,染毒模型组脾脏CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平均明显升高（p<0.05）。（3）外周血Tim-3的表达:与对照组相比,染毒模型组外周血CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平均明显升高（p<0.05）。3.免疫荧光检测骨髓巨噬细胞Tim-3的表达及骨髓、脾脏巨噬细胞极化状态（1）染毒模型组骨髓（F4/80）巨噬细胞上Tim-3的表达明显高于对照组。染毒模型组骨髓巨噬细胞CD206（M2型）极化程度较对照组显着增高。（2）染毒模型组脾脏巨噬细胞CD163（M2型）极化程度较对照组显着增高。[研究结论]1.免疫负调分子Tim-3在苯染毒模型组小鼠骨髓、脾脏、外周血CD14+单核细胞上的表达明显增高,且在该组小鼠骨髓巨噬细胞上的表达水平也明显高于对照组,表明苯染毒后可促进巨噬细胞Tim-3的表达。2.苯染毒模型组随着Tim-3表达的上调,血清M1型巨噬细胞功能标志物IL-12水平下降,M2型巨噬细胞功能标志物TGF-β1水平增高。苯染毒模型组骨髓和脾脏巨噬细胞中M2型巨噬细胞表达明显高于对照组,提示苯染毒可诱导巨噬细胞向M2型极化。3.Tim-3在苯染毒模型组小鼠骨髓、脾脏、外周血CD8+T细胞的表达水平亦明显增高,表明苯染毒后可促进免疫T细胞表面负调控分子的表达,抑制T细胞功能,进一步证实了免疫抑制在苯所致白血病发病中的作用。苯染毒诱导AML使Tim-3在多种免疫细胞上表达上调,通过巨噬细胞极化、减少促炎细胞因子分泌、促进抗炎细胞因子释放,使巨噬细胞的表型和功能发生改变,以及促进T细胞功能耗竭等综合机制,诱导肿瘤微环境中负性免疫应答,抑制了免疫反应,从而发生免疫逃逸。因此Tim-3可能是介导肿瘤免疫逃逸的机制之一,其可能作为苯白血病发病及预后标志物,未来可能指导苯白血病的治疗。第三部分 Tim-3上调及PI3K/AKT/m TOR信号通路在苯诱导AML中的作用机制研究[研究目的]本研究第二部分提示苯的血液毒性可能通过巨噬细胞极化、减少促炎细胞因子分泌、促进抗炎细胞因子释放,使巨噬细胞表型和功能发生改变等上调Tim-3的表达,诱导机体免疫系统逐渐产生免疫抑制,发生肿瘤免疫逃逸,增加了白血病罹患性。那么Tim-3上调在苯诱导白血病的过程中发挥了什么作用?它可能与哪些因素有关?研究发现,Tim-3在人急性髓系白血病（AML）细胞中高度表达,通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路触发生长因子样效应,并通过激活HIF-1信号通路促进缺氧诱导的新生血管形成和提高肿瘤细胞糖酵解能力,从而维持肿瘤细胞的生存与增殖。同时多项研究亦证实PI3K/AKT/mTOR信号通路激活后参与巨噬细胞的增殖发育和活化进程,并促进巨噬细胞由M1型向M2型转换。因此本研究首次以苯染毒诱导AML过程中引起单核/巨噬细胞上Tim-3的改变为切入点,进一步探讨苯白血病发病中Tim-3与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的调控关系,同时也对TGF-β/Smad通路蛋白进行了检测。从Tim-3介导的肿瘤相关巨噬细胞极化、逃脱免疫监视进而促进苯白血病发病的作用机制角度出发,进一步为Tim-3及PI3K/AKT/mTOR信号通路作为苯所致白血病免疫治疗的潜在靶点提供理论依据。[研究方法]1.分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫组化检测骨髓组织PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达;2.分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫荧光法检测骨髓巨噬细胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白的表达;3.分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫组化检测骨髓组织TGF-β1、Smad3蛋白的表达。[研究结果]1.PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表达（1）免疫组化法检测小鼠股骨骨髓组织PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达。检测结果显示,与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白表达水平均明显增高（p<0.05）。（2）免疫荧光检测小鼠股骨骨髓巨噬细胞p-PI3K、p-AKTP、p-mTOR蛋白的表达。检测结果显示,与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓巨噬细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达水平均明显升高。2.TGF-β/Smad通路蛋白的表达免疫组化法检测结果显示,与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓组织中TGF-β1表达水平明显增高（p<0.05）。与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓组织Smad3表达水平明显升高（p<0.05）。[研究结论]本实验在前期工作基础上进一步研究Tim-3调控在苯诱导AML过程中对肿瘤巨噬细胞免疫逃逸功能的影响,进而探索验证了 Tim-3上调,骨髓组织巨噬细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达增高,因此该信号通路蛋白可能参与了苯染毒过程中巨噬细胞的活化进程,促进巨噬细胞由M1型向M2型极化从而诱导AML。同时研究显示染毒模型组小鼠骨髓组织TGF-β/Smad通路蛋白表达亦明显升高,因此该信号蛋白亦可能共同参与了苯白血病的发病过程。该结果为苯所致白血病的免疫治疗探寻有效靶点,揭示苯染毒诱导AML中Tim-3表达上游/下游相关的关键信号分子及其功能调控网络奠定了基础。

李刘丽,阎佳宁,潘亮,高琳,张国培,肖明扬,薛萍,张倩也,逯晓波^[6]（2017）在《19q13相邻基因多态性与慢性苯中毒发病风险关联的病例对照研究》文中认为目的探讨共同位于19q13基因ERCC1,ERCC2,XRCC1,PPP1R13L,CD3EAP的单核苷酸多态性（SNP）与慢性苯中毒（CBP）发病风险的关联,找寻慢性苯中毒易感人群的生物标志,并为CBP的早期防治提供科学理论依据。方法 CBP确诊患者100例,按照1∶2匹配同样接触苯的健康对照200例,采集血样2 ml,提取DNA,采用SNa Pshot检测XRCC1 rs25489,PPP1R13L rs1005165及rs1970764;Taq Man Real time PCR探针法检测ERCC1rs11615,ERCC2 rs13181、rs1799793、rs238406,XRCC1 rs25487、rs1799782及CD3EAP rs967591多态基因型。结果ERCC1 rs11615,XRCC1 rs1799782,XRCC1 rs25487多态性与慢性苯中毒发病风险相关,ERCC1 rs11615 TT和XRCC1rs25487 TT基因型均可使CBP发生风险增高（ORa=3.236,95%CI 1.3537.740,χ2=6.875,P=0.009;ORa=2.093,95%CI 0.9664.533,χ2=5.642,P=0.018）,XRCC1 rs1799782 AA和AG基因型均可使CBP发生风险降低（ORa=0.074,95%CI 0.0340.160,χ2=45.128,P=0.000;ORa=0.357,95%CI 0.1950.653,χ2=12.168,P=0.000）。尚未发现其他基因多态与CBP发病风险的关联。结论在相同苯作业环境下,携带ERCC1 rs11615 TT、XRCC1 rs25487 TT基因型的个体发生慢性苯中毒的风险增高,上述基因多态可能成为预测慢性苯中毒的生物学标志。

肖芸^[7]（2012）在《1，4-苯醌诱导的人骨髓间充质干细胞蛋白质表达谱改变》文中研究指明苯暴露可以导致白血病等血液系统疾病。苯是间接致癌物,须先在体内进行生物活化后由其代谢产物等产生毒效应。苯进入人体后,在肝内细胞色素氧化酶作用下生成苯酚、儿茶酚胺、氢醌（hydroquinone, HQ）等。苯的这些代谢物被输送到骨髓,在过氧化物酶的作用下氧化生成1,4-苯醌（1,4-benzoquinone,1,4-BQ）。1,4-BQ是苯主要代谢产物之一,被认为是苯诱导产生骨髓毒性的主要化合物,与苯的血液毒性密切相关。苯的毒性作用受骨髓内错综复杂的微环境影响,人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBM-MSCs）对骨髓内微环境的维持是必不可少的。我们以前曾经用以双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）为基础的蛋白质组学技术分析了HQ引起的人肝细胞蛋白质表达谱的改变。本研究采用同样方法进一步探讨不同浓度的1,4-BQ （10、25、50uM）染毒24小时引起的hBM-MSCs蛋白质表达谱改变。我们发现了差异在1.5倍以上的蛋白点75个,选取其中的42个进行高压液相色谱-串联质谱分析,32个蛋白质得到鉴定,16个表达上调,16个表达下调。在鉴定的蛋白质中,56.25%的蛋白质位于细胞浆,18.75%的蛋白质位于细胞核,15.63%为分泌蛋白：位于线粒体、内质网或溶酶体,9.38%的蛋白质位于细胞膜上。这些蛋白质参与细胞生理过程的多个方面,可大致归为以下几类：代谢相关蛋白（25.00%）,热休克蛋白（15.63%）,细胞骨架蛋白（12.50%）、转录调节蛋白（12.5%）、细胞膜转运蛋白（6.25%）、信号传导相关蛋白（6.25%）和其它功能蛋白（21.88%）。采用Western blot对其中几个差异蛋白HSP27、Vimentin、Copine1、Copine3进行验证。结果显示：10、25μM1,4-BQ处理后HSP27、Vimentin、Copine3蛋白表达量没有显着性变化,但是50μM1,4-BQ处理后HSP27、Copine3蛋白表达量明显减少而Vimentin表达量明显升高,这3个蛋白质的Western blot验证结果与2-DE结果一致。Copine1蛋白在10μM1,4-BQ处理组没有变化,在50nM1,4-BQ处理组的表达量明显增加,这与2-DE结果一致；但25μM1,4-BQ处理组Copine1蛋白表达量也增加,这与2-DE结果有出入。为了探讨HSP27、Copinel、Copine3蛋白高表达及Vimentin蛋白低表达是否与其1mRNA转录相关,我们采用荧光实时定量PCR技术测定了这4个蛋白的mRNA表达量。1,4-BQ染毒24小时剂量达到50μM可引起HSP27mRNA低表达和Vimentin mRNA高表达,10、25μM1,4-BQ对HSP27和Vimentin mRNA表达没有影响。HSP27和Vimentin mRNA水平表达情况与蛋白质水平一致。1,4-BQ染毒24小时,在mRNA水平,剂量达到10μM和25μM即可引起copine1和copine3mRNA表达水平下降；在蛋白质水平,剂量达到25μM和50μ,M方引起copine1和copine3蛋白表达下降。1,4-BQ引起的copine mRNA水平改变要比蛋白质水平敏感。总之,1,4-BQ可引起hBM-MSCs蛋白质表达谱的改变,这些差异表达蛋白或许可以作为苯及其代谢物1,4-BQ等引起的血液系统疾病候选生物标志物,本研究成果将有助于进一步阐明苯及其代谢物1,4-BQ的血液毒性机制。

曾可静,李萡,牛宇哲,刘思初,陈少华,杨力建,左璨粲,孙润陆,梁赵佳,陈嘉榆,余卫,李扬秋^[8]（2011）在《职业苯接触工人外周血T-bet和GATA-3表达变化的特点》文中研究指明目的:了解职业苯接触及慢性苯中毒工人外周血中T细胞特异性转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达情况。方法:利用SYBR Green I实时荧光定量PCR分别检测20例正常人、25例职业苯接触工人和27例慢性苯中毒工人外周血单个核细胞T-bet和GATA-3 mRNA表达情况。结果:在职业接触苯工人组及慢性苯中毒工人组,多数样本表现为GATA-3表达上升和T-bet表达下降,而少数病人则表现为相反的模式。GATA-3在正常人的表达水平为0.39±0.22,与正常组对照比较职业接触苯工人组中有19例GATA-3表达水平呈上升趋势（0.57±0.54）,慢性苯中毒工人组中则有20例GATA-3表达水平呈上升趋势（0.52±0.50）。此外,在职业接触苯工人组中发现6例GATA-3表达水平显着下降（0.15±0.12,P<0.05）,同样在慢性苯中毒工人组中也有7例GATA-3表达水平显着下降（0.07±0.06,P<0.05）。T-bet在正常人的表达水平为2.15±1.45,与正常组对照比较职业接触苯工人组中有19例T-bet表达水平呈下降趋势（1.91±1.49）,慢性苯中毒工人组中T-bet表达水平均呈下降趋势（1.52±0.56）。此外,在职业接触苯工人组中也可发现6例T-bet表达水平显着上升（3.19±2.10,P<0.05）。结论:职业苯接触及慢性苯中毒影响工人外周血中T细胞特异性转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达水平。

肖芸,姚耿东,张幸^[9]（2008）在《苯及其代谢物血液毒性机制研究进展》文中进行了进一步梳理苯为确认的人类致癌物,可引起非淋巴细胞性白血病等一系列血液系统的损害,但其血液毒性机制至今仍不十分明确。本文就苯的代谢活化、苯及其代谢物的细胞毒性、遗传毒性及该领域的相关方法学研究进展作一综述。

李萡,李扬秋,陈少华,杨力建,余卫,刘薇薇,陈嘉榆^[10]（2008）在《慢性苯中毒病人相关TCR Vα12和Vα19 T细胞克隆性研究》文中进行了进一步梳理目的:了解慢性苯中毒病人外周血中TCR Vα克隆性增殖T细胞特点。方法:利用RT-PCR方法扩增3例慢性苯中毒病人外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因的互补决定区3（CDR3）,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。克隆性增殖T细胞PCR产物进行CDR3区序列分析。结果:3例慢性苯中毒病人外周血中Vα12和Vα19亚家族T细胞呈克隆性增殖,序列分析显示3例慢性苯中毒病人Vα12（1例）和Vα19（2例）CDR3区氨基酸序列分别是FCALSDRNTGGF,YICAVSHSGGGA和VYICAVNYGGS已被GenBank收录（EU285264、EU379941和EU429520）。结论:在慢性苯中毒病人中发现3个新的TCR Vα亚家族重排序列,外周血T细胞出现的TCR Vα12和Vα19克隆性增殖T细胞可能是机体接触苯后所发生的特异性免疫反应。

二、慢性苯中毒相关基因cDNA的表达与克隆（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、慢性苯中毒相关基因cDNA的表达与克隆（论文提纲范文）

（1）职业性苯暴露矩阵建立及生物效应因子的研究（论文提纲范文）

（2）焦化行业职业暴露风险评价及METTL14/miR-92a-3p/RGS3通路在焦炉逸散物致细胞恶性转化中的作用研究（论文提纲范文）

（3）二烯丙基一硫拮抗苯诱导白细胞减少的效果及其机制研究（论文提纲范文）

（4）芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策（论文提纲范文）

（5）Tim-3在苯染毒诱导急性髓系白血病免疫逃逸中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（6）19q13相邻基因多态性与慢性苯中毒发病风险关联的病例对照研究（论文提纲范文）

（7）1，4-苯醌诱导的人骨髓间充质干细胞蛋白质表达谱改变（论文提纲范文）

（8）职业苯接触工人外周血T-bet和GATA-3表达变化的特点（论文提纲范文）

（9）苯及其代谢物血液毒性机制研究进展（论文提纲范文）

（10）慢性苯中毒病人相关TCR Vα12和Vα19 T细胞克隆性研究（论文提纲范文）

四、慢性苯中毒相关基因cDNA的表达与克隆（论文参考文献）

• [1]职业性苯暴露矩阵建立及生物效应因子的研究[D]. 周昊. 中国医科大学, 2021(02)
• [2]焦化行业职业暴露风险评价及METTL14/miR-92a-3p/RGS3通路在焦炉逸散物致细胞恶性转化中的作用研究[D]. 姜敏. 中国医科大学, 2021(02)
• [3]二烯丙基一硫拮抗苯诱导白细胞减少的效果及其机制研究[D]. 于婷. 山东大学, 2020(02)
• [4]芳香烃受体介导NLRP3炎症小体信号通路在苯致造血损伤中的作用机制研究及逆转对策[D]. 贺今. 山东大学, 2019(02)
• [5]Tim-3在苯染毒诱导急性髓系白血病免疫逃逸中的作用及机制研究[D]. 宁琼. 山东大学, 2019(02)
• [6]19q13相邻基因多态性与慢性苯中毒发病风险关联的病例对照研究[J]. 李刘丽,阎佳宁,潘亮,高琳,张国培,肖明扬,薛萍,张倩也,逯晓波. 中国工业医学杂志, 2017(04)
• [7]1，4-苯醌诱导的人骨髓间充质干细胞蛋白质表达谱改变[D]. 肖芸. 浙江大学, 2012(09)
• [8]职业苯接触工人外周血T-bet和GATA-3表达变化的特点[J]. 曾可静,李萡,牛宇哲,刘思初,陈少华,杨力建,左璨粲,孙润陆,梁赵佳,陈嘉榆,余卫,李扬秋. 中国病理生理杂志, 2011(09)
• [9]苯及其代谢物血液毒性机制研究进展[J]. 肖芸,姚耿东,张幸. 中国工业医学杂志, 2008(04)
• [10]慢性苯中毒病人相关TCR Vα12和Vα19 T细胞克隆性研究[J]. 李萡,李扬秋,陈少华,杨力建,余卫,刘薇薇,陈嘉榆. 暨南大学学报(医学版), 2008(04)