陈柯[1]（2021）在《热休克蛋白70在电针治疗IBS-D中的表达及作用机制》文中认为目的:通过观察电针对腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠组织HSP70mRNA和蛋白表达影响,以及对结肠组织炎性细胞因子IFN-y和IL-10表达水平的影响,探讨HSP70在电针治疗IBS-D大鼠中的作用机制。方法:将30只SD大鼠随机分为空白组、模型组和电针组,每组10只。除空白组外,模型组和电针组均采用慢性束缚应激联合番泻叶灌胃法建立IBS-D模型,观察和测量各组大鼠造模前后的一般情况、内脏敏感性和腹泻指数,评估模型。模型建立完成后,电针组给予足三里穴电针治疗,每日1次,每次20min,共7d,空白组和模型组仅做相同固定处理,不予电针治疗。电针治疗期间,观测大鼠体质量、内脏敏感性和腹泻指数,以评估电针对IBS-D大鼠主要症状的改善作用。治疗结束后麻醉大鼠,取大鼠部分结肠组织后处死,用ELISA法检测各组大鼠结肠组织中IFN-γ、IL-10的水平,q-PCR检测各组大鼠结肠组织HSP70mRNA表达水平,Western blot检测各组大鼠结肠组织HSP70蛋白的表达水平。结果:（1）大鼠一般情况:空白组大鼠状态良好,皮毛干净,活泼好动但极少打斗,模型组与电针组在造模完成后,大鼠明显精神较为倦怠,少动畏惧,但又极易激怒好斗,肛周及尾部污秽。（2）体质量变化:造模前,各组大鼠体质量无明显差异。造模后,模型组和电针组体质量明显低于空白组（P<0.01）。结束电针治疗后,电针组大鼠体质量增长量明显增多（P<0.01）。（3）内脏敏感性:造模前,各组大鼠AWR评分中的3分阈值无明显差异。模型建立后,模型组和电针组AWR 3分阈值均较空白组降低（P<0.01）,但两组之间无显着差异。电针治疗结束后,电针组AWR 3分阈值较模型组显着升高（P<0.01）,与空白组相比,无显着差异。（4）腹泻指数:造模后,模型组和电针组均较空白组显着增加（P<0.01）。治疗后,电针组较模型组明显下降（P<0.01）,与空白组无明显差异。（5）结肠组织IFN-γ、IL-10水平:与空白组比较,模型组IFN-γ水平明显上升（P<0.01）,而IL-10水平明显下降（P<0.01）。与模型组相比,电针组IFN-γ水平明显低于模型组（P<0.01）,而IL-10水平高于模型组（P<0.01）。（6）HSP70mRNA表达:与空白组比较,模型组结肠组织中HSP70mPNA的表达升高（P<0.05）。电针组HSP70表达明显低于模型组（P<0.05）。（7）HSP70蛋白表达:与空白组比较,模型组与电针组结肠组织中HSP70蛋白表达均有升高（P<0.05）,但电针组HSP70表达明显低于模型组（P<0.05）。结论:（1）电针能改善IBS-D大鼠的内脏高敏感和腹泻症状。（2）电针可改善IBS-D大鼠结肠组织炎症反应。（3）电针可能通过HSP70表达,调节IBS-D大鼠结肠组织IFN-γ和IL-10水平。
原建琦[2]（2021）在《辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫诱导羊保护性免疫效果及其机制的初步研究》文中研究说明捻转血矛线虫是一种重要的牛羊寄生虫,广泛存在于全球各大牧区,多寄生于幼龄小反刍动物的皱胃,引起牛羊幼畜的极度消瘦,感染高峰期可给牧区养殖业造成巨大的经济损失。目前,该病的防治主要通过驱虫药,但随着越来越多的抗生素被用于该病的防治,捻转血矛线虫耐药虫株也随之出现,为该病的防治的提出了新的挑战。相关研究指出,大剂量紫外辐照可有效地降低捻转血矛线虫幼虫的发育率和成虫产卵率,接种经高剂量紫外辐照处理过的感染性幼虫可诱导宿主产生高水平的保护性免疫效果,而接种正常幼虫的羊宿主中则没有观察到该效果。本实验室研究显示,适当强度的紫外辐照可使捻转血矛线虫的应激分子如钙网织蛋白（CRT）和热休克蛋白70（HSP70）在虫体细胞表面高表达,这可能在诱导宿主高保护性免疫应答中起到了关键性作用。因此,本实验比较研究了不同辐照剂量对捻转血矛线虫L3期幼虫的致弱效应;初步对辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫诱导宿主高保护免疫效果进行评估;初步对辐照致弱捻转血矛线虫幼虫外分泌蛋白（ESP）及重组虫体蛋白（Hc CRT、Hc HSP70）诱导羊免疫细胞免疫应答反应进行探究。旨在进一步阐明辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫引起宿主高保护性免疫应答的细胞与分子机制。首先,我们分析了不同辐照剂量对捻转血矛线虫L3期幼虫的致弱效应。不同组幼虫分别辐照（0～10 min）,体外分别培养（0～16d）进行光镜观察。发现辐照时间为0 min和3 min的幼虫存活率存在显着差异,且存活率均高于60%;使用经3 min辐照和正常幼虫分别免疫接种绵羊宿主,在免疫后（18～22d）进行虫卵计数,22d剖检进行成虫计数。结果发现辐照组与正常组相比粪检虫卵数量显着减少,幼虫发育率下降99%以上,表明3 min紫外辐照对捻转血矛线虫L3期幼虫具有显着的致弱效应。其次,我们验证辐照捻转血矛线虫L3期幼虫是否能够诱导宿主产生高保护性免疫。我们对初次免疫后25d的动物进行攻击感染,在攻击感染后23d,计算减卵率;攻击感染后26d,同期剖检各组绵羊,计算皱胃减虫率。同时分离初次免疫后（2d,7d,13d,18d）和攻击感染后（2d,5d,13d）的各组绵羊血清进行抗体水平检测。发现在攻击感染后,辐照组减卵率达75%,减虫率达97%;初次免疫后,免疫早期各组特异性抗体Ig G和分型抗体Ig G1、Ig G2、Ig A、Ig M均上调,辐照组抗体总含量显着高于正常组。攻击感染后辐照组血清内寄生虫特异性抗体Ig G和各分型抗体含量均呈现继续上调的趋势;表明辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫能够引起宿主更高的体液免疫反应。此外,我们采用Transwell法初步研究了辐照和正常捻转血矛线虫L3期幼虫ESP的免疫功能,收取初次免疫以及攻击感染后的羊宿主外周血单个核细胞（PBMC）分别与正常幼虫共培养24h,采用ELISA法检测PBMC细胞因子的表达量。结果发现:辐照组和正常组虫体与阴性PBMC共孵育,都能使宿主PBMC细胞上调表达TH2型IL-4、IL-13;TH1型IFN-γ、TNF-α和IL-17等细胞因子,但辐照组细胞因子TH2型细胞因子IL-4、IL-13表达水平高于正常组,正常组细胞因子TNF-α、IL-17表达水平高于辐照组;经辐照和正常虫体免疫后的绵羊,取PBMC与正常组幼虫共孵育,各组TH1/TH2型细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α和调节性因子IL-17均上调。辐照组可诱导宿主产生趋向于TH2型免疫的TH1/TH2混合免疫应答,而正常组诱导宿主产生趋向于TH1型免疫的TH1/TH2混合免疫应答。与此同时,我们初步研究了应激蛋白（Hc CRT、Hc HSP70）诱导羊免疫细胞免疫应答反应的机制,分别取初次免疫和攻击感染后不同时间段各组PBMC和剖检的各组肠系膜淋巴结细胞进行刺激。发现线虫重组蛋白Hc CRT能使绵羊阴性PBMC细胞上调表达TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10等细胞因子,使阴性淋巴细胞下调表达TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10等细胞因子,使初次免疫和攻击感染后各组PBMC/淋巴结细胞下调表达IL-4、IL-13、TNF-α、IL-10、IL-17等细胞因子;线虫重组蛋白Hc HSP70能使绵羊PBMC/淋巴细胞上调表达TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10等,表现出类似于辐照虫体刺激的混合型免疫应答反应。总之,本研究发现适当剂量紫外辐照可在保证幼虫存活率的同时,抑制捻转血矛线虫L3期幼虫发育率;还发现辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫可诱导宿主产生高保护性体液免疫和细胞免疫效果,辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫外分泌蛋白（ESP）及候选应激蛋白Hc HSP70可诱导羊免疫细胞产生趋向于TH2型细胞免疫应答的TH1/TH2混合型免疫反应。本研究对证实辐照苗免疫效果以及阐明其中分子与细胞机制提供实验依据。
彭卓隽[3]（2020）在《艾灸干预胃荷瘤大鼠提取HSP70-PCs并回输大鼠体内对肿瘤细胞的抑制作用》文中研究表明目的:探索艾灸的抗肿瘤效应与诱导胃癌组织HSP70-PCs的相关性;观察将艾灸干预后胃癌组织HSP70-PCs提取物回输至荷瘤大鼠体内对肿瘤增殖及免疫功能的影响;观察艾灸后胃癌组织HSP70-PCs提取物对树突状细胞、T细胞、Walker-256肿瘤细胞的影响。探讨艾灸抗癌作用及可能机制,对艾灸-HSP70疫苗的研发提供初步的实验依据。方法:（1）16只SD大鼠以Walker-256细胞来源的腹水造皮下瘤模型,成模后随机分为模型组和艾灸组,艾灸组干预14天后,无菌环境下剖开荷瘤部位将各组大鼠剥取肿瘤,称重,用抗体柱亲和纯化方法从艾灸组、模型组来源的胃肿瘤大鼠肿瘤中提取HSP70-PCs。（2）从成年大鼠骨髓及脾脏获取树突状细胞与T细胞,各分组为盐水组、模型组与艾灸组,每组6孔加入培养板,相应干预72h后测量OD值;孔板加入Walker-256细胞,按照效靶比1:20,1:40接种T细胞,并加入不同组别提取的HSP70-PCs,2.5 ug/ml,每组6孔,72h后测OD值;孔板加入Walker-256细胞,按效靶比1:20接种T细胞和DC,并加入不同组提取的HSP70-PCs,每组6孔,72h后测OD值。（3）将体重160～180g大鼠18只,分别于右后肢腹股沟处注射Walker256细胞5×106个/ml,0.2ml/部位。7日后,成模大鼠随机分为盐水组、模型组、艾灸组,模型组和艾灸组分别于两侧后肢腹股沟皮下注射模型和艾灸来源的HSP70-PCs蛋白溶液共10ug（20ug/ml,0.5ml/只）,盐水组每周注射一次等量的生理盐水作对照,每7日注射1次,共注射3次。于第28日禁食不禁水12小时后眶内采血,采血后处死动物,无菌条件下切开荷瘤部位皮肤,称取瘤体重量。流式细胞仪检测外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞比例,HE法观察walker-256细胞瘤组织形态,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:（1）模型组HSP70-PCs含量为14.2ug/克组织,总量102.24ug;艾灸组为72ug/克组织,总量972ug。0.01),艾灸组细胞数明显多于模型组（P<0.01）;培养2日后两组细胞数仍明显多于对照组（P<0.01）,但艾灸组与模型组之间无明显差异（P>0.05）;培养3日后,各组细胞数无差异（P>0.05）。T细胞培养3日后,与对照组比较,艾灸组T细胞光密度稍增加（P<0.05）,但与模型组无差异（P>0.05）。T细胞与Walker-256癌细胞混养效靶比1:20时,模型组、艾灸组光密度相比对照组明显降低（P<0.05）;效靶比1:40时,艾灸组光密度明显降低,与对照组仍有差异（P<0.05）,但与模型组无差异（P>0.05）。T细胞、DC与Walker-256癌细胞混养时,与对照组比较,艾灸组样本的光密度下降,差异显着（P<0.01）,但与模型组无差异（P>0.01）。组大鼠去脏器体质量相比模型组明显增加（P<0.01）、胸腺质量与脾脏指数增加（P<0.05）;与对照组比较,模型组血中CD4+T细胞数量及CD4+/CD8+比值上升（P<0.01）,艾灸组CD8+T细胞数显着上升（P<0.01）,CD4+/CD8+比值稍下降（P<0.05）;艾灸组CD4+T细胞数较模型组明显减少,CD8+T细胞数增加,CD4+/CD8+比值下降（均P<0.01）;结论:1.HSP70-PCs提取物回输对荷瘤大鼠肿瘤增长具有抑制作用,而艾灸组提取物干预后抑制作用更明显。2.艾灸干预后肿瘤组织的HSP70-PCs提取物能加速免疫细胞的增殖,并促进淋巴细胞反应对Walker-256癌细胞的杀伤作用。3.艾灸干预后肿瘤组织的HSP70-PCs提取物回输后,能调节荷瘤大鼠的免疫功能。
曲莹莹[4]（2020）在《酵母硒改善LPS诱导的肉鸡肠道免疫功能障碍的研究》文中研究表明硒是一种必要的微量元素,在人和动物的生长发育过程中扮演着重要角色。人体主要从鱼,蛋,肉和奶中摄入硒。在大部分地区中,肉类中的硒是主要的摄入来源。在中国的低硒地区,由于土壤中的硒含量较低,动植物无法从中摄取足够的硒,导致一系列疾病譬如:白肌病、繁殖功能下降、脑软化症、神经退行性疾病等等。通过向动物饲料中添加硒可以提高动物饮食硒的摄入量,人类通过食用富硒动物的可食用组织提高体内硒含量。因此,生产富硒动物可以提高人类从膳食中摄入的硒元素。硒分为有机硒与无机硒。一般来说,有机硒的优点在于易于动物吸收代谢、生物利用率高、毒副作用低。本文研究的是酵母硒对肉鸡肠道的影响。本试验通过实时荧光定量PCR、Western Blot等方法揭示硒对肉鸡肠道的作用。本试验分为6组,分别为CON组、0.35Se组、0.5Se组、CON+LPS组、0.35Se+LPS组以及0.5Se+LPS组,在此基础上,观察鸡肠道组织形态学的变化,并且对肠道细胞因子、抗菌肽、免疫球蛋白、热休克蛋白、硒蛋白和相关炎症因子的m RNA和Western Blot进行检测。试验结果表明:（1）补充酵母硒后的肉鸡肠道上皮结构清晰,肠道绒毛长度增高,隐窝深度增加。LPS刺激后的肉鸡肠道组织形态学发生明显变化,肠道上皮炎症的特征明显。肠道黏膜层结构疏松,局部有大量炎性细胞聚集,淋巴细胞增多。肠道炎症的病理变化以CON+LPS组最明显,绒毛稀疏,肠腺结构模糊,绒毛膜有断裂,中央乳糜管变窄。以上光学显微镜结果说明LPS刺激可损伤肉鸡肠道免疫功能,并且导致肠道炎症的发生。（2）相比于对照组,0.35Se组和0.5Se组中的IL-1R、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17和IFN-γ的m RNA表达水平差异不显着;抗菌肽AVBD1、AVBD6、AVBD7、AVBD9、AVBD10、AVBD12的m RNA表达量显着升高;免疫球蛋白Ig A、Ig Y、p Ig R基因表达差异不明显,而CON+LPS组中的IL-1R、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17和IFN-γ的m RNA水平显着增加;抗菌肽AVBD1、AVBD6、AVBD7、AVBD9、AVBD10、AVBD12的m RNA表达量显着下降;免疫球蛋白Ig A、Ig Y、p Ig R的m RNA表达量显着下降。与CON+LPS组相比较,0.35Se+LPS组与0.5Se+LPS组中IL-1R、IL-2、IL-4、IL-6的m RNA表达水平显着降低,IFN-γ的m RNA表达水平显着升高,而0.35Se+LPS组的IL-17的m RNA表达水平显着升高、0.5Se+LPS组的IL-17的m RNA表达量显着降低;抗菌肽AVBD1、AVBD6、AVBD7、AVBD9、AVBD10、AVBD12的m RNA表达量显着升高,其中0.35Se+LPS组的抗菌肽表达量显着高于0.5Se+LPS组;免疫球蛋白Ig A、Ig Y、p Ig R的m RNA表达量显着升高。表明LPS诱导了肉鸡肠道免疫系统的损伤,酵母能够提高肠道免疫系统功能。（3）对肉鸡肠道中13种硒蛋白相关基因（Dio3、GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、Sel H、Sel N、Sel O、Sel P1、Sel P2、Sel T、Sel W、Sepx1、Txnrd1）进行检测发现,补充酵母硒的组肉鸡体内硒蛋白相关基因表达显着提高,而LPS刺激下调了肠道组织中硒蛋白的表达水平。与CON+LPS组相比,0.35Se+LPS组与0.5Se+LPS组中硒蛋白的表达量均显着增加。（4）相比较于对照组,CON+LPS组中的HSP27、HSP70和HSP90的m RNA表达量显着降低,而HSP40、HSP60的m RNA表达水平显着升高;0.35Se组与0.5Se组中HSP27、HSP40、HSP70的m RNA表达水平显着升高,HSP60的m RNA表达水平差异不显着,HSP90的m RNA表达水平显着降低。与CON+LPS组相比,0.35Se+LPS组与0.5Se+LPS组中HSP27、HSP70、HSP90的m RNA表达量显着升高,HSP40的m RNA表达水平差异不显着,0.35Se+LPS组的HSP60的m RNA表达量显着升高,而0.5Se+LPS组的HSP60的m RNA表达量显着降低。同样与对照组相比,HSP60、HSP70、HSP90的蛋白表达水平显着增加,因此酵母硒能够提高肠道的免疫功能。（5）另外对相关的炎症因子进行检测,与对照组相比,0.35Se组与0.35Se组中COX-2、NF-κB、PGE、TNF-α的m RNA表达水平差异不显着,i NOS的m RNA表达水平显着降低;CON+LPS组中COX-2、NF-κB、PGE、TNF-α、i NOS的表达量均显着提高。与CON+LPS组比较,0.35Se+LPS组和0.5Se+LPS组的COX-2、NF-κB、PGE、TNF-α、i NOS的表达量显着降低。表明LPS刺激导致肉鸡肠道促进了炎症反应的发生,而酵母硒减轻了LPS所引起的肠道炎症反应。综上所述,LPS刺激肉鸡肠道发生免疫系统的损伤、激活一系列炎症因子以及免疫系统相关因子导致免疫系统功能障碍。本试验目的是阐明酵母硒通过介导免疫系统来调节细胞因子、抗菌肽、免疫球蛋白、硒蛋白、热休克蛋白及相关炎症因子等的表达,增强了肠道上皮免疫系统功能,并确定酵母硒对LPS诱导的肠道免疫系统功能障碍产生了影响。
王丽[5]（2020）在《BVDV非结构蛋白Npro介导泛素化降解ELF4的分子机制研究》文中指出牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus）是一种单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的呼吸道症状,腹泻,黏膜糜烂,流产或产出先天缺陷的犊牛等症状,还能引起白细胞减少和免疫抑制。Npro蛋白是ORF中编码的第一种蛋白质,在瘟病毒属中高度保守,具有蛋白酶活性,但目前尚不能完全解释其蛋白水解作用及参与调控免疫抑制的机理。据报道BVDV Npro蛋白通过蛋白酶体途径降解IRF3,并且E1泛素激活酶起到了作用;转录因子ELF4可形成二聚体入核激活I型IFN启动子,诱导I型IFN产生,并参与机体的抗病毒先天免疫反应。我们前期研究证明:BVDV非结构蛋白Npro通过蛋白酶体途径降解BoELF4,负调控I型干扰素的表达;但是Npro蛋白降解ELF4蛋白过程中的作用机制尚不完全清楚。由此,本研究探讨了BVDV Npro蛋白通过泛素化途径降解ELF4的分子机制,以及筛选了与Npro蛋白互作的蛋白,为深入了解Npro蛋白的功能、BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。首先,本研究构建了pcDNA3.1-Npro真核表达质粒,PCR扩增目的基因,胶回收后,对目的基因及表达载体进行双酶切鉴定,之后进行连接与转化,并将鉴定正确的重组质粒pcDNA3.1-Npro转染至293T细胞中,通过Western blot验证。结果显示,在23KDa处出现明显的目的条带,与预期大小一致,证明BVDV Npro蛋白真核表达载体构建成功。其次,利用生物信息学软件预测了Npro蛋白与ELF4蛋白的互作及潜在泛素化位点;并利用Co-IP方法验证了两个蛋白的互作关系。结果显示,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4发生共沉淀;BVDV Npro蛋白通过泛素化降解ELF4,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4。以上结果表明,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4存在相互作用,并且BVDV Npro蛋白通过K48位多聚泛素化降解ELF4。最后,将pcDNA3.1-Npro真核表达质粒转染至MDBK细胞中,利用Co-IP方法验证,并将其送去做质谱,对鉴定结果进行GO分析。之后,我们从质谱结果中筛选出25种候选蛋白,重点对Hsp70蛋白进行验证。结果,成功构建了pcDNA3.0-Hsp70真核表达质粒;Co-IP结果显示,BVDV Npro蛋白与Hsp70蛋白发生共沉淀;Hsp70蛋白可以降解BoELF4,当加入Npro质粒时,降解ELF4更加明显。以上结果表明,Hsp70蛋白与Npro蛋白存在相互作用,并且二者可能协同降解ELF4。综上所述,本研究证明了BVDV Npro蛋白与ELF4有相互作用,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4;BVDV Npro蛋白与Hsp70有相互作用,并且二者均能协同降解ELF4;Hsp70在协同降解ELF4中的作用机制有待于进一步研究。本研究为深入了解BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。
杨长幸[6]（2020）在《基于转录组和MicroRNA数据探讨尖头大吻鱥的高温胁迫效应》文中进行了进一步梳理尖头大吻鱥（Rhynchocypris oxycephalus）属于冷水性小型鱼类,广泛分布在我国的山涧溪流中,由于长期适应于在冷水中生活,因而对水温升高十分敏感。随着全球气候变暖加剧,冷水性鱼类的生存环境不断减少,通过对冷水鱼高温胁迫效应和适应机制的研究,可以为尖头大吻鱥的保护提供理论依据。本文通过前期设置多温度梯度的预实验,同时对11℃以及高温处理12h的16℃、26℃的尖头大吻鱥脾脏组织进行高通量测序,分析尖头大吻鱥不同温度下转录组和miRNA的变化,以探讨在高温情况下尖头大吻鱥在高温状况下的基因表达情况和miRNA的表达情况,初步探讨miRNA对靶基因表达调控的影响。主要研究结果如下:1.通过对尖头大吻鱥转录组测序,经过生物信息学分析后,共得到转录本序列214308325条,其中包含Unigenes数量为130635206条。通过差异基因筛选发现,共有差异表达基因1316个,其中上调基因334个,下调基因982个。通过GO分析发现,富集最多的是生化途径,其次分别是是分子功能和细胞组分中注释的基因数。通过KEGG分析,对照组11℃和21℃对比以及21℃和26℃对比,发现金黄色葡萄球菌感染通路（Staphylococcus aureus infection）、近端小管重碳酸盐回收（Proximal tubule bicarbonate reclamation）、军团菌病（Legionellosis）等信号通路差异表达基因富集显着性最高,这些信号通路中主要的基因为补体以及热休克蛋白,推测认为温度升高导致体内器官损伤,补体含量上升,同时热休克蛋白对受热损伤的细胞具有修复作用,增加了鱼体的免疫力。另外还有一些相关的信号通路均和免疫和代谢相关。2.miRNA通过高通量测序,筛选一定长度范围内的sRNA进行后续分析,共得到Mappend mature（比对上的miRNA成熟体）总数为146个,Mapped hairpin（比对上的miRNA前体）总数为178个。对于新miRNA预测,共得到Mappend mature（比对上的miRNA成熟体）总数为177个,Mapped star（预测到的miRNA*链）92个。其中,21℃和11℃对照组对比,存在18个上调的miRNA,23个下调的miRNA;26℃和11℃对照组对比,存在11个上调的miRNA,30个下调的miRNA;21℃和26℃对比,存在15和上调的miRNA,1个下调的miRNA。对照组11℃和21℃对比以及对照组11℃和26℃对比,预测到差异miRNA的靶基因相关信号通路中细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）信号通路涉及的基因最多;21℃和26℃对比,预测到差异miRNA的靶基因相关信号通路中甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）信号通路涉及的基因数最多。这些代谢通路虽然和转录组结果未完全重叠,但同样是富集在免疫以及代谢相关的代谢通路,推测认为由于高温导致尖头大吻鱥机体损伤诱导了这些代谢通路的相关miRNA富集。3.通过荧光定量验证,验证了主要涉及内质网蛋白加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）通路（HSP70、HSP90β1、HSP90β2）以及金黄色葡萄球菌感染（Staphylococcus aureus infection）通路（C3、MHCIIB）的基因,挑选有注释结果且表达量发生显着变化的NF-κB2、RH、MT1基因,并且随机选择了根据计算结果不同表达趋势的10个的miRNA,结果显示表达趋势和转录组测序分析结果一致,进一步肯定了转录组和miRNA分析的可靠性。4.为进一步验证基因及其调控相关的miRNA之间的调控关系,我们设计另一组实验,验证miRNA和基因之间相互的调控作用。设置了16℃、21℃、26℃三个温度梯度,在不同时间段验证HSP70和miR-101a之间的相互作用。温度升高导致miR-101a的表达量下降,但随着温度的升高,肝脏内的HSP70快速增加,在24h时表达量达到最高,此时,miR-101a的表达量也出现回升,随后HSP70表达量逐渐下降,miR-101a的表达量也随着减少,该结果和已报道的研究结果一致,验证了高温胁迫下miRNA和靶基因之间的相互作用。总结:本论文通过转录组及相关miRNA测序,分析了不同温度下尖头大吻鱥的差异表达基因和差异表达miRNA,其中有1650个基因和323个miRNA参与了这一调控适应过程,并通过选择一定数量的基因和miRNA通过荧光定量验证了测序以及数据分析结果的准确性,后续进一步实验验证miRNA和靶基因的调控关系。转录组的差异表达基因和miRNA的靶基因均富集在代谢以及免疫相关的KEGG通路。通过本论文我们建立了高温胁迫下尖头大吻鱥的转录组表达谱和miRNA数据库,为后续多组学研究全面揭示高温胁迫下冷水鱼类代谢通路变化等高温适应机制奠定基础。
柳艳红[7]（2020）在《间歇式冷刺激对肉鸡免疫功能的影响》文中进行了进一步梳理在高寒地区,寒冷是制约畜禽产业发展的重要因素之一,对动物的生产性能、抗氧化系统、免疫系统以及神经内分泌系统等方面产生影响。为了缓解冷应激对肉鸡的不利影响,我们采用温和冷刺激的方法对肉鸡进行训练,以免疫性能作为筛选指标,旨在找到提高肉鸡免疫机能和抗冷应激能力的最佳冷刺激方法。本研究以400只罗斯308肉雏鸡为研究对象,随机分为1个对照组和4个冷刺激组。对照组采用传统饲养温度饲养,冷刺激组则采用比对照组低3℃的冷刺激训练方式饲养,其中冷刺激组的冷刺激时长分别设置为3小时、4小时、5小时和6小时（分别记为CS3、CS4、CS5和CS6）,冷刺激间隔时间为1天。检测冷刺激过程中肉鸡生产性能、免疫器官指数、血清中免疫球蛋白和细胞因子含量与免疫相关基因（Toll样受体、β防御素、细胞因子和免疫球蛋白）m RNA表达量水平,以及急性冷应激6小时和12小时前、后肉鸡法氏囊、脾脏和胸腺中热休克蛋白m RNA表达量水平,实验结果如下:1.生产性能:间歇式冷刺激对肉鸡的平均日采食量无显着影响（P>0.05）,各组之间差异不显着（P>0.05）。间歇式冷刺激对肉鸡的平均日增重和料肉比有显着影响（P<0.05）。CS3组肉鸡的平均日增重显着高于对照组、CS4和CS6组（P<0.05）,与CS5组间无显着差异（P>0.05）;CS5组的平均日增重显着高于对照组（P<0.05）,与CS4和CS6组间差异不显着（P>0.05）。冷刺激组中CS3组的料肉比显着低于对照组和其它冷刺激组（P<0.05）,CS4、CS5和CS6组肉鸡的料肉比与对照组均无显着差异（P>0.05）。2.免疫器官指数:第22、29、36和43日龄,冷刺激组中肉鸡的法氏囊器官指数和脾脏器官指数与对照组相比均无显着差异（P>0.05）,且冷刺激组间也无显着差异（P>0.05）。第49日龄,CS5组肉鸡的法氏囊器官指数与CS6组、对照组差异不显着（P>0.05）,但显着高于CS3和CS4组（P<0.05）;CS5组的脾脏器官指数显着高于CS3组（P<0.05）,CS3组与CS4组、CS6组和对照组之间差异不显着（P>0.05）,CS5组与CS4组、CS6组和对照组之间差异不显着（P>0.05）。3.血清中免疫指标:间歇式冷刺激21天后（即36日龄）,肉鸡血清中Ig A和Ig G含量均显着高于对照组（P<0.05）;CS5组血清中Ig G含量显着高于CS3组（P<0.05）,CS4、CS5和CS6组之间差异不显着（P>0.05）,CS3、CS5和CS6组之间差异不显着（P>0.05）;肉鸡血清中Ig A含量在各冷刺激组之间差异不显着（P>0.05）。冷刺激组血清中IL-2含量均显着高于对照组（P?0.05）,冷刺激组间IL-2含量无显着差异（P>0.05）;冷刺激组中IFN-γ含量与对照组无显着差异（P>0.05）;CS4组血清中IFN-γ含量显着高于CS6组（P<0.05）,其余各组之间差异不显着（P>0.05）。冷刺激结束14天后（即49日龄）,CS5组血清中Ig A含量显着高于对照组和其它冷刺激组（P<0.05）;除CS5组外,Ig A含量在其余各组之间差异不显着（P>0.05）。CS4组肉鸡血清中Ig G含量显着高于对照组（P<0.05）,CS3组、CS6组和CS4组与CS5组之间差异不显着（P>0.05）。CS5组肉鸡血清中Ig G含量显着高于CS6组（P<0.05）;CS5组、CS3组和对照组之间差异不显着（P>0.05）;CS6组、CS3组和对照组之间差异不显着（P>0.05）。4.免疫相关基因m RNA表达量:1)Toll样受体m RNA表达量:间歇式冷刺激21天后,冷刺激组肉鸡法氏囊中TLRs基因表达量均显着降低（P<0.05）,CS4和CS5组中TLR1、TLR5、TLR15和TLR21均显着低于CS3组（P<0.05）,其中CS5组中TLR3、TLR4和TLR7均低于CS4组（P<0.05）;同时CS6组中TLR1、TLR4和TLR15均高于CS5组（P<0.05）。间歇式冷刺激使得肉鸡脾脏中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21表达量显着高于对照组（P<0.05）,其中CS5组中TLR4、TLR5和TLR21表达量均显着高于其余3个冷刺激组（P<0.05）。冷刺激结束14天后,CS5和CS6组的肉鸡法氏囊中TLRs表达量均显着低于对照组（P<0.05）,除TLR21外,CS5组中其余指标均显着低于CS3组（P<0.05）;另外,CS5中TLR1、TLR2、TLR3、TLR5和TLR21表达量也显着低于CS4组（P<0.05）,与此同时,CS5中TLR2、TLR5、TLR7和TLR15显着低于CS6组（P<0.05）。冷刺激组中CS4、CS5和CS6组肉鸡脾脏中TLR3、TLR4、TLR7和TLR15的表达量均显着低于对照组（P<0.05）,其中,CS5组中TLR7和TLR15同时显着低于其余3个冷刺激组（P<0.05）。间歇式冷刺激使得CS5和CS6组肉鸡胸腺中TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15的表达量显着低于对照组和CS4组（P<0.05）,同时,CS6组中TLR2、TLR3、TLR4和TLR15均高于CS5组（P<0.05）。2)β防御素m RNA表达量:间歇式冷刺激21天后,CS4和CS6组肉鸡法氏囊中除Av BD8表达量显着降低（P<0.05）外,其余Av BDs指标差异不显着（P>0.05）,CS5组中Av BD2和Av BD8均显着低于对照组且低于CS6组（P<0.05）;CS3组肉鸡脾脏中Av BDs基因水平均升高（P<0.05）,CS4和CS6组脾脏中均无指标降低,而CS5组中Av BD2表达量显着低于对照组（P<0.05）;冷刺激组肉鸡胸腺中Av BDs基因水平普遍低于对照组（P<0.05）,CS3和CS4组Av BD4、Av BD5和Av BD7降低（P<0.05）,而CS5和CS6组中Av BD5、Av BD7、Av BD8和Av BD10均显着低于对照组（P<0.05）,其中CS5和CS6组中Av BD8显着低于其余冷刺激组（P<0.05）。冷刺激结束14天后,肉鸡法氏囊中防御素基因表达量普遍下调（P<0.05）,且CS5组法氏囊中Av BD2、Av BD4和Av BD7始终显着低于其它冷刺激组（P<0.05）;CS5组肉鸡脾脏中Av BD4和Av BD7以及CS6中Av BD5基因水平显着低于对照组（P<0.05）,并且CS5组中Av BD4和Av BD7表达量同时显着低于CS6组（P<0.05）;冷刺激组肉鸡胸腺中Av BD7表达量均显着降低（P<0.05）,另外,CS5和CS6组中Av BD2和Av BD10显着低于CS3和CS4组（P<0.05）。3)细胞因子m RNA表达量:间歇式冷刺激21天后,肉鸡的脾脏和胸腺中IL-2的基因表达量显着高于对照组（P<0.05）,而且IL-6和IFN-γ的基因表达量水平在CS5组的脾脏和胸腺中也得到显着提高（P<0.05）;此外,CS5组脾脏中IL-2和IL-8显着高于CS3和CS4组（P<0.05）,胸腺中IL-2、IL-8和IL-17同时显着高于其余3个冷刺激组（P<0.05）,而且CS5和CS6组胸腺中IL-17基因水平也显着升高（P<0.05）。冷刺激结束14天后,冷刺激组肉鸡的脾脏中IL-2的表达量水平仍显着高于对照组（P<0.05）,而且CS5和CS6组中IL-2显着高于CS3和CS4组（P<0.05）;除CS3组外,CS4、CS5和CS6组肉鸡胸腺中IL-2、IL-17和IFN-γ的基因表达量均显着升高（P<0.05）,而且CS5和CS6组中IL-6均显着高于对照组、CS3和CS4组（P<0.05）。4)免疫球蛋白m RNA表达量:间歇式冷刺激21天后,CS4和CS5组法氏囊中Ig A和Ig G表达量显着高于CS3和CS6组（P<0.05）,CS5和CS6组胸腺中Ig A均显着高于CS3和CS4组（P<0.05）,CS5与CS6组中Ig A表达量水平无差异（P>0.05）但CS5中Ig G显着高于CS6组（P<0.05）;脾脏中Ig G表达量均显着高于对照组（P<0.05）,CS6组中Ig G表达量与CS5组中无差异（P>0.05）但显着高于CS3和CS4组（P<0.05）。冷刺激结束14天后,CS5和CS6组肉鸡法氏囊中Ig G显着高于CS3和CS4组（P<0.05）;CS5组肉鸡脾脏和胸腺中Ig A表达量显着高于对照组和其它冷刺激组（P<0.05）。5.急性冷应激后热休克蛋白m RNA表达量:冷应激6小时后,冷刺激组和对照组肉鸡法氏囊中HSP40和HSP70表达量显着升高（P<0.05）;CS4、CS5和CS6组肉鸡脾脏中HSP27、HSP40和HSP60表达量显着升高（P<0.05）,而对照组肉鸡脾脏中HSP27显着升高（P<0.05）而HSP40和HSP60差异不显着（P>0.05）;CS3和CS4组肉鸡胸腺中HSP40、HSP60和HSP70以及CS5和CS6组中HSP60、HSP70和HSP90表达量均显着升高（P<0.05）,对照组胸腺中HSP60显着升高（P<0.05）而HSP70和HSP90显着下降（P<0.05）。冷应激12小时后,冷刺激组和对照组法氏囊中HSP40、HSP70和HSP90表达量均升高（P<0.05）;冷刺激组肉鸡脾脏中HSP40、HSP60、HSP70和HSP90表达量升高（P<0.05）,对照组脾脏中HSP40和HSP60升高（P<0.05）而HSP27和HSP70下降（P<0.05）;CS4、CS5和CS6组肉鸡胸腺中HSP60、HSP70和HSP90表达量升高（P<0.05）,对照组胸腺中HSP70升高（P<0.05）而HSP60和HSP90显着下降（P<0.05）。与冷应激6小时相比,冷应激12小时后,冷刺激组和对照组肉鸡法氏囊中HSP40、HSP70和HSP90表达量均升高（P<0.05）;CS3、CS5和CS6组脾脏中HSP40、HSP60、HSP70和HSP90表达量均升高（P<0.05）,CS4组和对照组脾脏中HSP40和HSP90表达量显着升高（P<0.05）;CS5和CS6组中HSP40和HSP70与CS3和CS4组胸腺中HSP27表达量均显着升高（P<0.05）,而对照组中HSP27和HSP40表达量差异不显着（P>0.05）,冷刺激组与对照组中HSP60均显着下降（P<0.05）。综上所述,本研究得出以下结论:（1）间歇式冷刺激影响肉鸡生产性能。间歇式冷刺激3小时组和间歇式冷刺激5小时组的平均日增重提高,间歇式冷刺激3小时组的料肉比降低。（2）间歇式冷刺激对肉鸡免疫器官指数无显着影响。间歇式冷刺激5小时组有增强肉鸡法氏囊和脾脏器官指数的趋势。（3）间歇式冷刺激5小时组对肉鸡免疫机能有一定的增强作用。（4）间歇式冷刺激能够在一定程度上缓解冷应激对肉鸡所造成的损伤,且间歇式冷刺激5小时组抗冷能力更好。
张蕾[8]（2020）在《宿主蛋白HSP47对鲤春病毒血症病毒侵染的影响》文中提出由鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of Carp virus,SVCV）引起的鲤春病毒血症（Spring Viremia of Carp,SVC）是一种急性且致命的鱼类传染病。该病的主要特点是发病急且死亡率高,目前并无有效的治疗方法,严重威胁水产养殖业的经济发展。热应激蛋白家族（Heat Shock Proteins,HSPs）是生命体处于应激状态时,机体为维护体内正常生理功能而产生的一类伴侣蛋白。宿主体内的热应激蛋白不仅在胚胎发育、信号传导、抗氧化、抗应激、抗细胞凋亡等方面有明显的调节功能,在协同免疫方面也发挥着重要作用。因此本研究首先通过蛋白组学筛选出SVCV感染鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）后表达差异显着的蛋白。以此为基础克隆EPC源的HSP47基因序列并进行生物学分析,同时设计siRNA构建HSP47基因沉默EPC细胞,以SVCV为外源病毒进行感染。探讨SVCV在正常EPC,HSP47过表达EPC与HSP47基因沉默EPC中的复制能力。为科研工作者探讨SVCV的致病机理与宿主自身蛋白的抗病毒免疫反应提供一定依据。1.与SVCV相互作用的宿主蛋白的筛选与分析蛋白组学结果显示SVCV感染组与空白组共有35个显着差异性的蛋白,其中包含19个显着上调和16个显着下调的蛋白。其中ATPase和PSMC2等表达显着上调,而HSP70和HSP47等表达下调。差异细胞蛋白主要集中在生物过程、细胞组成以及分子功能等方面。本章节首次从EPC细胞中克隆出HSP47基因序列:全长1209bp,共编码304个氨基酸,通过序列同源性比对发现EPC细胞源的HSP47与鲤鱼和鲫鱼亲缘关系最近。与智人、小鼠和斑马鱼的蛋白同源性分别是63.88%、64.35%和87.8%。2.过表达宿主HSP47基因对SVCV复制的影响本章以SVCV易感细胞EPC为实验对象,通过使用DAPI染色观察SVCV感染后的细胞病变情况。显微镜下可以清晰的看到SVCV感染后EPC表面死细胞显着增多,在感染48h时开始出现大量空斑,在感染60h时细胞基本脱落丧失细胞活性。荧光定量结果显示SVCV-G的基因表达量随感染时间的增加而显着增加,在48h时表达量呈直线式增长。与之相反的是随着SVCV感染时间的增加,HSP47基因的表达量呈下降趋势,在24h时显着下调,蛋白表达结果与基因一致。实验结果表明转染p CDNA3.1-His-GFP-HSP47质粒能使细胞HSP47蛋白表达量显着提高。当细胞转染过表达质粒之后,与SVCV感染组相比,过表达HSP47组的SVCV的病毒滴度和基因表达量显着下调。实验结果表明过表达宿主HSP47基因可以在一定程度上抑制病毒复制。3.RNA干扰HSP47后对SVCV复制的影响本章实验对正常及HSP47基因沉默的细胞分别进行病毒感染。通过流式细胞术检测病毒感染后的细胞凋亡率和坏死率,实验数据表明,HSP47干扰后的细胞凋亡率和坏死率显着提高。与对照组相比,RNA干扰EPC组的SVCV的病毒滴度和SVCV-G表达量显着上调。而阴性对照组与SVCV组结果差异不显着。与正常EPC组相比,SVCV感染可显着上调HSP47基因沉默组内的IFN-α,IL-1β和IL-10细胞因子的表达。同时上调细胞TLR3和IRF3的表达。实验结果表明干扰宿主HSP47基因不仅会影响到病毒的复制,同时对细胞的凋亡坏死以及细胞内相关因子的表达也产生一定的影响。
李婉娟[9]（2020）在《Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒蛋白NS66的多抗制备及宿主热休克蛋白在病毒感染过程中的表达研究》文中研究说明由草鱼呼肠孤病毒所引发的草鱼出血病,极大地危害中国淡水养殖业的健康持续发展。针对草鱼呼肠孤病毒分子结构及基因功能的研究是明确病毒侵染宿主机制的基础,而对草鱼呼肠孤病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用研究则是攻克草鱼出血病的重点和难点。热休克蛋白70（HSPs）具有辅助增强蛋白质折叠,协助蛋白质复合物组装,帮助蛋白质跨膜并纠正蛋白质折叠不当和聚集等功能。在哺乳类中,正常状态下Hsc70高表达受到刺激后表达量进一步增加,与细胞的发育、分化紧密相关,为组成型蛋白;而Hsp70在正常生理状态条件下不表达或存在量较少,但是机体受外界刺激胁迫条件时其表达量迅速增加,具有细胞保护功能,为诱导型蛋白。与Hsc70不同,哺乳动物的Hsp70已被确认为促进等许多病毒的关键性宿主因子。但是还没有研究证实鱼Hsp70是否能促进任何水生呼肠孤病毒的感染。基于此,本研究包含了以下三个方面:1.Ⅲ型GCRV非结构蛋白基因NS66的原核表达,多克隆抗体的制备使用PCR法扩增GCRV104株s6基因片段,并克隆到表达载体p GEX-4T-3,转化至BL21大肠杆菌后用IPTGda诱导表达大量融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定分析产物大小后,使用尿素纯化不可溶蛋白获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白p GEX-4T-3-NS66免疫注射小鼠,获得Anti pGEX-4T-3-NS66多克隆抗体,使用Western blot方法测定制备的抗体效价,用Western blot和IFA（间接免疫荧光试验）方法鉴定抗体特异性是否良好。SDS-PAGE分析发现表达的重组蛋白约66 k D,大小与预期估计相符,蛋白主要存在于包涵体中;Western blot显示制备的多克隆抗体效价大于1 50 000,Western blot和IFA结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV104病毒。由GCRV104病毒编码的非结构蛋白NS66可能参与了病毒复制和组装过程,形成了病毒包涵体,这为建立GCRV104免疫学诊断方法以及研究GCRV编码的NS66蛋白的功能奠定了前期工作基础。2.草鱼热休克蛋白HSPs对Ⅲ型GCRV的应激表达首先制备了可以将Hsp70与同源蛋白Hsc70区分的特异性抗体,利用实时荧光定量和western blot等方法证实正常条件下草鱼HSC70高表达,病毒感染过程中上调不明显;草鱼HSP70正常条件下不表达,在病毒感染后持续被诱导增加。HSP家族同源蛋白HSP30表达模式与HSP70一致,HSP90表达模式与HSC70一致。对HSP70蛋白进行抑制或者过表达处理,检测到的病毒表达量也会同步降低或增加。表明Hsc70和Hsp70的表达模式与它们在哺乳动物中的同源物相似。说明草鱼HSP70蛋白对病毒复制具有一定的促进作用。3.草鱼热休克蛋白HSPs的可能性调控机制为进一步明确草鱼HSP70蛋白如何参与免疫反应系统调控,我们将HSP70、HSC70与酵母表达载体连接,且试验构建的p GADT7-HSC70或p GADT7-HSP70质粒在酵母中不存在自激活作用,用p GADT7-HSC70或p GADT7-HSP70质粒作诱饵分别与GCRV104基因片段定向筛选并未发现阳性菌落,说明HSP70和HSC70可能与GCRV104表达的蛋白不存在直接相互作用。因缺乏热休克蛋白与草鱼呼肠孤病毒相互作用的直接证据,为验证热休克蛋白的转录翻译调控是否不通过病毒介导而与非正常折叠蛋白通路被激活相关的假设,我们检测了UPR上的关键性指标因子。结果表明,病毒感染过程中,XBP1S、ATF4、ATF6、GRP94均没有被显着诱导差异,仅GRP78在病毒感染144h被诱导增加10倍转录量。综上,病毒GCRV-104感染下Hsp70表达上调并非是通过非正常折叠蛋白通路的激活。
孙伯禄[10]（2020）在《基于电化学传感技术的几种抑郁症标志物及中药组分分析研究》文中研究说明电化学传感技术受到了药学及医学工作者的广泛关注,其在癌症标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等方面的研究成为近年来的研究热点。然而,该技术在抑郁症标志物及中药分析领域却鲜有研究报道。本论文聚焦于电化学传感技术在抑郁症标志物及中药组分分析领域的研究,以裸玻碳电极为基础电极,以功能改性石墨烯基碳材料后获得聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯（PDDA-G）、金纳米粒子/Fe3O4磁功能化还原氧化石墨烯（AuNPs/MrGO）、聚苯胺功能化石墨烯量子点（PAGD）、多孔石墨烯（PG）、类沸石咪唑酯金属有机骨架材料功能化氮掺杂石墨烯（ZIF-8@N-Gr）为电极基础修饰材料,借助功能改性材料所具有的高生物相容性、高导电性以及大比表面积等性能,进一步通过条件优化以构建的传感器实现目标分析物的快速、灵敏、专属性检测。本论文首先基于抗原抗体特异性识别作用构建了用于三种抑郁症标志物——皮质醇（Cor）、热休克蛋白70（HSP70）、载脂蛋白A4（Apo-A4）灵敏检测的电化学免疫传感器;其次构建了中药党参中党参炔苷（Lob）、黄芪红芪中毛蕊异黄酮（CYS）灵敏测定的电化学传感器,并进一步采用电化学传感器技术评价了四种中药活性单体:儿茶素（Catechin）、山奈酚（Kaempferol）、芹菜素（Apigenin）、柚皮素（Naringenin）以及当归水提取物和它所含单体成分的抗氧化活性。该研究的开展,一方面为临床抑郁症的早期预警、筛查和客观诊断提供了有效的评价手段和参考依据,另一方面为复杂体系中中药活性组分的直接、快速检测及活性评价提供了高选择、高灵敏、便捷高效的方法。具体研究包括两大部分（研究思路见图1）:图1基于电化学传感技术的几种抑郁症标志物及中药组分分析研究思路图第一部分:基于电化学免疫传感技术的三种抑郁症标志物分析研究抑郁症具有发病率、复发率和自杀率高的特点,目前诊断主要依靠量表评分,迫切需要更精准的诊断方法。皮质醇（Cor）是应激刺激诱发抑郁症密切相关的生物标志物;热休克蛋白70（HSP70）作为应激刺激时由血管内皮细胞释放至血液的一种生物标志物,它与长期应激所致的抑郁症关系密切;载脂蛋白A-Ⅳ（Apo-A4）是应激刺激诱发抑郁症的动物模型血和尿样品中发现的与抑郁症匹配率较高的一种生物标志物,它们均痕量存在于血、尿、唾液等生物样本中,依靠目前传统的ELISA、免疫印迹等方法,难以满足它们灵敏、快速的检测。为了实现这三种抑郁症标志物更为灵敏、便捷、准确的测定,本研究构建了四种传感器:1)基于AuNPs/MrGO的皮质醇电化学免疫传感器;2)基于PAGD的高稳定人休克蛋白70电化学免疫传感器;3)基于PG的高灵敏人休克蛋白70电化学免疫传感器;4)基于类沸石咪唑酯金属有机骨架材料功能化氮掺杂石墨烯（ZIF-8@N-Gr）的全血样品中人物载脂蛋白A-Ⅳ（Apo-A4）高选择性分析的电化学免疫传感器。高性能材料的应用既有效增加了电极表面靶标分子的固载量,又为电极转导信号的双重放大提供了条件,为三种标志物高灵敏、高选择性的便捷分析提供了保障。具体研究内容如下:1.基于金纳米粒子/Fe3O4磁功能化还原氧化石墨烯的皮质醇电化学免疫传感器研究利用制备的AuNPs/MrGO复合材料修饰玻碳电极（GCE）构建了用于Cor检测的竞争型电化学免疫传感器。玻碳电极经AuNPs/MrGO复合材料修饰后,一方面因氧化石墨烯的磁功能化,表现出更大的比表面积,另一方面因金纳米粒子的修饰呈现出更加良好的生物相容性,使得Cor在电极表面的负载量显着增加,加之AuNPs/MrGO的高导电性,因此构建的免疫传感器的电化学响应得到了极大的增强,从而实现了人血浆样品中Cor的灵敏检测。在优化的条件下,该传感器对Cor检测的线性范围为0.1-1000 ng/mL,检出限（S/N=3）为0.05 ng/mL。该传感器也表现出良好的精密度、较好的稳定性,为抑郁症标志物—Cor的灵敏快速分析提供了一种新颖便捷的分析手段。2.构建基于聚苯胺功能化石墨烯量子点的电化学免疫传感器用于热休克蛋白70的检测由于制备的PAGD具有丰富的极性基团,能够为生物大分子的共价键合提供活性位点,可牢固地将HSP70固载到电极表面,且能最大限度地释放HSP70的结合位点,提高传感器的稳定性。基于此,本研究利用超声裂解和诱导聚合制备的性能优越的PAGD用于人热休克蛋白70（HSP70）灵敏分析的竞争型电化学免疫传感器的构建。PAGD较大的比表面积、优良的导电性及生物相容性使得构建的呈现出较佳的分析性能。在优化的实验条件下,该免疫传感器在0.0976-100ng/mL的范围内对HSP70呈现良好的线性关系,检出限（S/N=3）为0.05 ng/mL。将其用于人血浆样品中痕量HSP70分析时表现出较好的选择性、良好的精密度和稳定性。3.一种新型多孔石墨烯基电化学免疫传感器用于抑郁症标志物——热休克蛋白70的早期筛查为了进一步提高HSP70免疫传感器的分析性能、简化传感器的制备步骤,本研究以导电性能优越且具有较大比表面积的PG为电极修饰材料,借助PG良好的生物相容性和空穴结构所具有的强吸附作用将HSP70固定在电极表面,构建了 HSP70分析的电化学免疫传感器。高导电性的PG显着增加了电极表面电子的传输效率,提高了传感器的灵敏度,实现了人血浆样品中痕量HSP70的检测。在优化的条件下,该传感器对HSP70在0.0448-100 ng/mL的范围内呈现良好的线性关系,检出限（S/N=3）为0.02 ng/mL。与同等实验条件下的酶联免疫吸附实验（ELISA）及基于PAGD的HSP70免疫传感器相比,该方法表现出更优越的性能,为临床抑郁症标志物—HSP70的检测开拓了一种便捷高效的检测技术。4.用于抑郁症标志物—人载脂蛋白A4（Apo-A4）高灵敏分析的新技术研究利用高性能材料开发直接、快速、超灵敏检测全尿或全血样品中疾病标志物的电化学传感器成为当前传感器研究邻域的一大新挑战。石墨烯经氮掺杂获得的氮掺杂石墨烯（N-Gr）具有更优的导电性和催化活性,而类沸石咪唑酯金属有机骨架材料（ZIF-8）则具有较大的比表面积。基于此,本研究将N-Gr和ZIF-8进行复合得到比表面积大,导电性和结构优化的ZIF-8@N-Gr复合材料,并作为电极修饰材料构建了抑郁症标志物—Apo-A4检测的电化学免疫传感器。ZIF-8@N-Gr的应用,既增加了 Apo-A4的负载位点,又提高了传感器的灵敏度,而Apo-A4单克隆抗体的选用则保证了免疫传感器的高选择性。将构建的传感器用于100%全血样品中Apo-A4的检测时,在1.47× 10-10 g/mL-3.00× 10-7 g/mL的范围内呈现出良好的线性关系,最低检测限为8.33×10-11 g/mL。该研究为临床100%全血样品中痕量Apo-A4的高选择、高灵敏检测提供了一种极具应用潜力的分析技术。总体来说,构建的这四种电化学免疫传感器能够实现三种抑郁症标志物的快速、灵敏分析。然而抑郁症作为一种多因素导致的、难以早期预警和诊断的慢性疾病,往往需要多生物指标结合临床症状和检查来实现其确诊。因此,期望构建多指标同时检测的电化学免疫传感器用于抑郁症的早期预警、筛查和客观诊断。第二部分:基于电化学传感器的几种中药组分分析、评价研究目前,用于中药活性组分分析的方法多依赖于色谱和质谱技术,然而它们分析速度慢、通量低、多需要复杂的样品前处理等特点,限制了其在在线、实时检测方面的应用。电化学传感技术因其分析速度快、灵敏度高、选择性强、适于复杂样品中痕量活性组分的直接、实时检测等,在中药活性组分分析、评价领域具有较好的应用前景。基于此,本研究分别利用制备的Fe3O4磁功能化还原氧化石墨烯（MrGO）、多孔石墨烯（PG）及聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯（PDDA-G）构建了中药党参、黄芪、红芪中指标性成分分析,及四种结构相似黄酮类化合物、当归水提物抗氧化活性评价的电化学传感器。1.基于Fe3O4磁功能化还原氧化石墨烯的电化学传感器对党参炔苷的直接电化学分析由于党参炔苷在弱酸性条件下,其炔基易受电化学催化发生迈耶-舒斯特重排反应,进而发生电子转移产生电信号。基于此,本研究将制备的MrGO修饰在玻碳电极（GCE）表面,构建了党参炔苷检测的电化学传感器,与GCE相比,MrGO的应用明显增强了党参炔苷在电极表面的电化学响应。在优化的条件下,党参炔苷的氧化峰电流与其浓度在1.0×10-7-1.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限（S/N=3）为4.3×10-8 mol/L。构建的电化学传感器用于党参炔苷检测时表现出良好的重现性、长期稳定性和高选择性。将该方法用于党参药材提取物中党参炔苷测定时,其回收率保持在95.38%-104.66%的范围内。2.用于毛蕊异黄酮痕量分析的电化学传感器研究毛蕊异黄酮（CYS）3’位羟基受自身结构影响具有较高的活性,在电化学作用下易发生氧化还原反应。而直接修饰有多孔石墨烯的玻碳电极（PG@GCE）则对CYS具有较好的电化学催化作用,使得CYS在PG@GCE表面具有较高的电化学响应。因此,本研究优选制备的结构优化的PG,构建了复杂体系中CYS痕量分析的电化学传感器。在优化的实验条件下,采用灵敏度较高的差分脉冲伏安法（DPV）对CYS分析显示,在浓度1.76×10-7 mol/L～4.4×10-5 mol/L范围内具有良好的线性关系,最低检出限为5.78×10-8 mol/L（S/N=3）。将该传感器用于中药黄芪、红芪的提取物及血浆样品中CYS分析时呈现良好的分析性能,为中药黄芪和红芪中指标性成分的快速分析及生物样品中CYS的痕量分析提供了一种新颖的分析手段。3.基于功能化石墨烯的电化学传感器评价黄酮类化合物抑制蛋白质的损伤如何快速的实现中药组分的活性评价是近年来众多研究者所关注的热点,而利用生物分子受到作用体系中某些变化因素的刺激后,生物分子的活性或结构发生变化,进而导致电化学检测信号发生变化,由此可间接地实现一些小分子化合物的活性评价。基于此,本研究将牛血清白蛋白（BSA）固定在功能化石墨烯（PDDA-G）修饰的玻碳电极上,构建了用于蛋白质氧化损伤和黄酮类化合物抗氧化活性评价的电化学传感器。由于牛血清白蛋白（BSA）受羟自由基（·OH）损伤后就会发生变性,致使其在钴的多吡啶（Co（bpy）33+）探针溶液中检测时,电化学信号就会减小,而黄酮类化合物则能有效抑制·OH对蛋白质的损伤。因此,构建的传感器可用于·OH对BSA的诱导损伤,及四种黄酮类化合物抑制·OH对BSA损伤的抗氧化活性评价的研究,结果四种结构相似的黄酮类化合物的活性大小依次为:儿茶素>山奈酚>芹菜素>柚皮素,该结果与文献报道的结果一致。该研究为结构相似化合物的抗氧化活性评价提供了一种快捷、灵敏的手段。4.基于DNA/NA-PDDA-G电化学传感器评价阿魏酸及当归水提物抗氧化活性为了拓宽活性评价电化学传感器的应用范围,在原有基础上,对其进行了进一步的改进,并将其用于中药水提取物及单一组分抗氧化活性的比较。本研究将DNA固定在Nafion-聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯修饰的玻碳电极上,构建了用于DNA氧化损伤监测,及当归水提物和其单一组分阿魏酸抗氧化活性评价的电化学传感器。由于DNA受羟自由基（·OH）损伤后就会造成DNA链的损伤、断裂等,致使其在六氨合钌（Ru（NH3）63+）探针溶液中检测时,电化学信号就会增强,而当归水提物和阿魏酸则能有效抑制·OH对DNA的损伤。实验结果表明,当归水提物的抗氧化活性强于阿魏酸单体,这是由于当归水提物中的其他成分对阿魏酸的抗氧化活性起到了协同作用。本方法具有简单、成本低、灵敏度高、重现性好等优点,不仅可以用于DNA损伤的监测,而且可以用于抗氧化剂活性大小的评价,也为中药复杂提取物中的其他组分是否影响单一组分的抗氧化活性的评价提供了一种便捷、高效的方法。可见,针对活性组分的特点,选用适宜的电极修饰材料构建电化学传感器可以实现中药组分的定量分析和活性评价。是否可以通过优化传感器的制备和分析策略,以及应用近年来不断涌现出的性能更加优异的材料用于更为复杂的体系中中药组分直接、快速定量分析和活性评价的电化学传感器的开发成为本研究后期所重点关注的焦点。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 IBS-D模型建立 |
| 2.2 动物模型评价 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 干预后症状评估 |
| 2.5 实验样本采集 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 动物模型评价结果 |
| 1.1 大鼠一般情况比较 |
| 1.2 体质量比较 |
| 1.3 内脏敏感性比较 |
| 1.4 腹泻指数比较 |
| 2 干预后症状评估结果 |
| 2.1 干预期体质量增长量比较 |
| 2.2 干预后内脏敏感性比较 |
| 2.3 干预后腹泻指数比较 |
| 3 指标检测结果 |
| 3.1 结肠组织IFN-γ和IL-10表达比较 |
| 3.2 结肠组织HSP70 mRNA表达比较 |
| 3.3 结肠组织HSP70蛋白表达比较 |
| 讨论 |
| 1 IBS-D临床现状 |
| 2 现代医学对IBS-D的认识 |
| 3 中医对IBS-D的认识 |
| 3.1 中医病因病机 |
| 3.2 针灸治疗IBS的作用机制 |
| 3.3 足三里穴选择依据 |
| 4 动物模型讨论 |
| 4.1 IBS-D动物模型选择 |
| 4.2 内脏敏感性评价标准 |
| 5 实验结果讨论 |
| 5.1 动物模型评价结果分析 |
| 5.2 干预后症状评估结果分析 |
| 5.3 指标检测结果分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 腹泻型肠易激综合征的中医药研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 捻转血矛线虫概述 |
| 1.1.1 捻转血矛线虫病 |
| 1.1.2 捻转血矛线虫及其生活史 |
| 1.1.3 捻转血矛线虫诱导宿主免疫应答 |
| 1.1.4 捻转血矛线虫防治手段发展 |
| 1.2 紫外辐照致弱苗的发展及应用 |
| 1.3 外排泄分泌蛋白(ESP) |
| 1.4 钙网织蛋白和热休克蛋白 |
| 1.4.1 钙网织蛋白简介 |
| 1.4.2 钙网织蛋白生物学功能 |
| 1.4.3 热休克蛋白简介 |
| 1.4.4 热休克蛋白生物学功能 |
| 1.5 Transwell简介 |
| 第2 章 辐照致弱捻转血矛线虫幼虫免疫效果的验证与研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 捻转血矛线虫L3 期幼虫获得 |
| 2.2.2 不同剂量紫外辐照对L3 期幼虫体外培养存活率影响的测定 |
| 2.2.3 辐照致弱对捻转血矛线虫绵羊体内产卵数影响的测定 |
| 2.2.4 辐照致弱对捻转血矛线虫绵羊体内定殖率影响的测定 |
| 2.2.5 辐照致弱捻转血矛线虫L3 期幼虫诱发宿主减卵效果测定 |
| 2.2.6 辐照致弱捻转血矛线虫L3 期幼虫诱发宿主减虫效果测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同剂量紫外辐照对L3 期幼虫体外培养存活率的影响测定结果 |
| 2.3.2 辐照致弱对捻转血矛线虫绵羊体内产卵数影响测定结果 |
| 2.3.3 辐照致弱对捻转血矛线虫绵羊体内定殖率影响测定结果 |
| 2.3.4 辐照致弱捻转血矛线虫L3 期幼虫诱发宿主减卵效果测定结果 |
| 2.3.5 辐照致弱捻转血矛线虫L3 期幼虫诱发宿主减虫效果测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3 章 辐照致弱捻转血矛线虫幼虫诱导绵羊免疫反应血清学研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 可溶性幼虫抗原制备 |
| 3.2.2 实验动物安排 |
| 3.2.3 ELISA法测定绵羊血清中寄生虫特异性抗体Ig G含量 |
| 3.2.4 ELISA法测定绵羊血清中IgG_1、IgG_2、IgA、IgM含量 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 测定绵羊血清中寄生虫特异性抗体Ig G含量结果 |
| 3.3.2 测定绵羊血清中IgG_1、IgG_2、IgA、IgM含量结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4 章 捻转血矛线虫幼虫ESP与应激分子诱导绵羊免疫细胞功能研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验菌株 |
| 4.1.3 主要试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HcCRT、HcHSP70 重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.2.2 绵羊肠系膜淋巴细胞分离 |
| 4.2.3 绵羊PBMC分离 |
| 4.2.4 辐照致弱/正常L3 期幼虫ESP诱导绵羊PBMC细胞因子表达 |
| 4.2.5 ELISA法测定HcCRT和 HcHSP70 诱导绵羊淋巴细胞细胞因子表达 |
| 4.2.6 ELISA法测定HcCRT和 HcHSP70 诱导绵羊PBMC细胞因子表达 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 辐照致弱/正常L3 期幼虫ESP诱导绵羊PBMC细胞因子表达结果 |
| 4.3.2 HcCRT和 HcHSP70 蛋白的纯化和鉴定 |
| 4.3.3 绵羊肠系膜淋巴细胞形态观察 |
| 4.3.4 HcCRT和 HcHSP70 诱导绵羊淋巴细胞细胞因子表达结果 |
| 4.3.5 HcCRT和 HcHSP70 诱导绵羊PBMC细胞因子表达结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5 章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 :HSP70的提纯 |
| 1 实验材料 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 :艾灸后胃癌组织HSP70-PCs提取物对免疫细胞的影响及对肿瘤细胞的抑制效应 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 T细胞与肿瘤免疫 |
| 4.2 DC与肿瘤免疫 |
| 4.3 HSP70 体外对DC、T淋巴细胞的增殖作用 |
| 5 研究小结 |
| 第三部分 :艾灸后的胃癌组织HSP70-PCs提取物回输后对荷瘤大鼠的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 热休克蛋白70在治疗肿瘤中的应用 |
| 4.2 HSP70对胸腺、脾腺的影响 |
| 4.3 HSP70 对外周血中CD4+、CD8+T 细胞的影响 |
| 4.4 艾灸的热刺激效应能诱导HSP70高表达 |
| 5 小结 |
| 第四部分 讨论 |
| 1 中西医对于胃癌的认知 |
| 2 艾灸治疗癌症的依据和思路 |
| 3 从艾灸诱导HSP70产生思考艾灸抗肿瘤的机制 |
| 4 存在的问题与展望 |
| 第五部分 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 艾灸对患癌机体免疫细胞调节作用探讨 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 硒与免疫功能的研究进展 |
| 1.1.1 硒的一般生物学功能 |
| 1.1.2 硒与免疫系统之间的关系 |
| 1.2 肠道免疫功能的研究进展 |
| 1.2.1 肠道的主要功能 |
| 1.2.2 细胞因子在肠道免疫中的作用 |
| 1.2.3 抗菌肽在肠道免疫中的作用 |
| 1.2.4 免疫球蛋白在肠道免疫中的作用 |
| 1.2.5 热休克蛋白在肠道免疫中的作用 |
| 1.2.6 炎性因子在肠道免疫中的作用 |
| 1.2.7 硒蛋白在肠道免疫中的作用 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验动物分组 |
| 2.2.2 肠道组织中总RNA的提取与c DNA的合成 |
| 2.2.3 引物合成与荧光定量PCR(q RT-PCR)检测 |
| 2.2.4 Western blot对目的基因蛋白的检测 |
| 2.2.5 肠道组织病理学观察 |
| 2.3 实验数据统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 肠道组织光型显微镜观察 |
| 3.2 肠道组织中抗菌肽基因表达水平的检测结果 |
| 3.3 肠道组织中细胞因子基因表达水平的检测结果 |
| 3.4 肠道组织中免疫球蛋白基因及蛋白表达水平的检测结果 |
| 3.5 肠道组织中热休克蛋白基因及蛋白表达水平的检测结果 |
| 3.6 肠道组织中炎症因子相关基因表达水平的检测结果 |
| 3.7 肠道组织中硒蛋白相关基因表达水平的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同酵母硒水平对肉鸡肠道组织中抗菌肽的影响 |
| 4.2 不同酵母硒水平对肉鸡肠道组织中细胞因子的影响 |
| 4.3 不同酵母硒水平对肉鸡肠道组织中免疫球蛋白的影响 |
| 4.4 不同酵母硒水平对肉鸡肠道组织中热休克蛋白的影响 |
| 4.5 不同酵母硒水平对肉鸡肠道组织中相关炎性因子的影响 |
| 4.6 不同酵母硒水平对肉鸡肠道组织中硒蛋白的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 |
| 1.2.1 流行病学 |
| 1.2.2 发病机理 |
| 1.2.3 诊断 |
| 1.2.4 病原学 |
| 1.2.5 BVDV结构与功能 |
| 1.2.6 BVDV引起的免疫反应 |
| 1.3 天然免疫中的泛素化修饰 |
| 1.3.1 泛素化修饰的简介 |
| 1.3.2 泛素化修饰参与调控抗病毒天然免疫 |
| 1.4 转录因子ELF4 |
| 1.4.1 ETS家族的简介 |
| 1.4.2 ELF4的功能 |
| 1.5 热休克蛋白Hsp70 |
| 1.5.1 热休克蛋白Hsp70的简介 |
| 1.5.2 Hsp70系统在病毒生命周期中的功能 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 2 牛病毒性腹泻病毒N~(pro)真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体、细胞和病毒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与病毒增殖 |
| 2.2.2 病毒及细胞的RNA提取及反转录 |
| 2.2.3 BVDV N~(pro)基因的克隆及分析 |
| 2.2.4 BVDV N~(pro)蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 293T细胞的转染 |
| 2.2.6 重组蛋白pcDNA3.1-N~(pro) Western blot的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BVDV NADL株接种MDBK细胞结果 |
| 2.3.2 N~(pro)基因PCR的扩增 |
| 2.3.3 重组质粒p MD-18T-N~(pro)的鉴定 |
| 2.3.4 BVDV N~(pro)蛋白生物信息学分析 |
| 2.3.5 真核表达产物pcDNA3.1-N~(pro)的鉴定 |
| 2.3.6 重组蛋白pcDNA3.1-N~(pro)的Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 BVDV非结构蛋白N~(pro)通过K48位多聚泛素化降解ELF4 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞及质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 蛋白互作的预测 |
| 3.2.2 ELF4泛素化位点的预测 |
| 3.2.3 转化 |
| 3.2.4 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.2.6 免疫共沉淀试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 蛋白互作预测结果 |
| 3.3.2 ELF4泛素化位点的预测及分布 |
| 3.3.3 重组质粒p3×flag-cmv-7.1-ELF4的鉴定 |
| 3.3.4 ELF4蛋白Western blot的鉴定 |
| 3.3.5 通过Co-IP试验分析N~(pro)和ELF4的相互作用 |
| 3.3.6 N~(pro)降解ELF4的K48位多聚泛素化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 筛选BVDV N~(pro)互作蛋白及对ELF4的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 质粒、细胞、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 检测N~(pro)在MDBK细胞中的表达 |
| 4.2.2 BCA试剂盒检测蛋白浓度 |
| 4.2.3 快速银染试验 |
| 4.2.4 免疫共沉淀试验 |
| 4.2.5 牛Hsp70基因引物的设计与合成 |
| 4.2.6 牛Hsp70基因的扩增 |
| 4.2.7 牛Hsp70基因真核表达载体的构建 |
| 4.2.8 磷酸钙沉淀转染 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 N~(pro)质粒在MDBK细胞中的表达情况 |
| 4.3.2 Co-IP中N~(pro)蛋白总量的测定 |
| 4.3.3 Co-IP试验结果 |
| 4.3.4 LC-MS/MS质谱技术鉴定SDS-PAGE胶中的所有蛋白 |
| 4.3.5 候选蛋白分析结果 |
| 4.3.6 牛源Hsp70基因的扩增 |
| 4.3.7 真核表达产物pcDNA3.0-Hsp70双酶切鉴定 |
| 4.3.8 牛源Hsp70质粒的表达 |
| 4.3.9 BVDV N~(pro)蛋白与Hsp70的相互作用 |
| 4.3.10 转染Hsp70质粒对BoELF4蛋白水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 尖头大吻鱥研究概况 |
| 1.1.1 尖头大吻鱥形态学及分类学研究概况 |
| 1.1.2 尖头大吻鱥生理和生物学研究 |
| 1.2 转录组研究概况 |
| 1.2.1 高通量测序技术发展概况 |
| 1.2.2 转录组学研究对象及方法 |
| 1.2.3 转录组学鱼类中的研究进展 |
| 1.3 MicroRNA研究概况 |
| 1.3.1 MicroRNA的研究进展 |
| 1.3.2 MicroRNA的形成与特征 |
| 1.3.3 MicroRNA的功能 |
| 1.3.4 miRNA的鉴别与表达分析 |
| 1.4 高温胁迫效应研究概况 |
| 1.4.1 高温胁迫效应及相关研究 |
| 1.4.2 水生生物高温胁迫研究进展 |
| 1.4.3 鱼类高温胁迫研究概况 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 第二章 尖头大吻鱥温度胁迫转录组分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 转录组文库的构建与测序 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 转录组数据分析结果 |
| 2.3 转录组数据的验证 |
| 2.4 数据处理结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 高温胁迫下尖头大吻鱥脾脏免疫响应的转录组分析 |
| 2.5.2 高温胁迫下尖头大吻鱥脾脏代谢响应的转录组分析 |
| 2.5.3 高温胁迫下尖头大吻鱥脾脏基因表达调控的转录组分析 |
| 2.5.4 金色葡萄球菌感染通路分析 |
| 第三章 miRNA文库构建、测序分析与验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 miRNA文库构建与测序分析 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 miRNA测序分析结果 |
| 3.3 miRNA数据表达验证 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 数据处理结果 |
| 3.4 HSP70和der-miR-101a基因表达分析 |
| 3.4.1 前言 |
| 3.4.2 材料与方法 |
| 3.4.3 HSP70基因表达 |
| 3.4.4 der-miR-101a基因表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 miRNA的测序与验证讨论 |
| 3.5.2 高温胁迫下HSP70和der-miR-101a基因表达 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学位论文目录 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 冷应激 |
| 1.1.1 应激的概述 |
| 1.1.2 冷应激对动物的影响 |
| 1.2 冷适应 |
| 1.3 温度对动物免疫功能能的影响 |
| 1.3.1 温度对动物免疫器官的影响 |
| 1.3.2 温度对动物Toll样受体的影响 |
| 1.3.3 温度对动物β防御素的影响 |
| 1.3.4 温度对动物细胞因子的影响 |
| 1.3.5 温度对动物免疫球蛋白的影响 |
| 1.4 温度对动物热休克蛋白的影响 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验动物及日常管理 |
| 2.2 试验设计 |
| 2.3 样品采集与处理 |
| 2.4 生产性能的检测 |
| 2.5 血清中免疫指标的检测 |
| 2.6 基因表达量的检测 |
| 2.6.1 总RNA的提取 |
| 2.6.2 反转录 |
| 2.6.3 引物设计 |
| 2.6.4 实时荧光定量PCR |
| 2.7 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 间歇式冷刺激对肉鸡生产性能的影响 |
| 3.2 间歇式冷刺激对肉鸡免疫器官指数的影响 |
| 3.3 间歇式冷刺激对肉鸡血清中免疫指标的影响 |
| 3.4 间歇式冷刺激对肉鸡免疫功能的影响 |
| 3.4.1 间歇式冷刺激对 Toll 样受体 mRNA 相对表达量的影响 |
| 3.4.2 间歇式冷刺激对β防御素mRNA相对表达量的影响 |
| 3.4.3 间歇式冷刺激对细胞因子 mRNA 相对表达量的影响 |
| 3.4.4 间歇式冷刺激对免疫球蛋白 mRNA 相对表达量的影响 |
| 3.5 急性冷应激对间歇式冷刺激肉鸡热休克蛋白mRNA相对表达量的影响 |
| 3.5.1 急性冷应激对间歇式冷刺激肉鸡法氏囊组织热休克蛋白mRNA相对表达量的影响 |
| 3.5.2 急性冷应激对间歇式冷刺激肉鸡脾脏组织热休克蛋白mRNA相对表达量的影响 |
| 3.5.3 急性冷应激对间歇式冷刺激肉鸡胸腺组织热休克蛋白mRNA相对表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 间歇式冷刺激对肉鸡生产性能的影响 |
| 4.2 间歇式冷刺激对肉鸡免疫器官的影响 |
| 4.3 间歇式冷刺激对肉鸡免疫功能的影响 |
| 4.3.1 间歇式冷刺激对Toll样受体的影响 |
| 4.3.2 间歇式冷刺激对β防御素的影响 |
| 4.3.3 间歇式冷刺激对细胞因子的影响 |
| 4.3.4 间歇式冷刺激对免疫球蛋白的影响 |
| 4.4 急性冷应激对间歇式冷刺激肉鸡的热休克蛋白的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 SVCV的研究进展 |
| 1.1 鲤春病毒血症病毒的概述 |
| 1.2 SVCV致病机制研究现状 |
| 1.3 SVC 的防治与干扰方法 |
| 第二章 热应激蛋白的研究进展 |
| 2.1 热应激蛋白家族简介 |
| 2.2 热应激蛋白47的研究进展 |
| 2.3 HSPs与病毒相互作用的研究 |
| 第三章 本研究的目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 与SVCV相互作用的宿主蛋白的筛选与分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验设备 |
| 1.1.5 细胞的传代 |
| 1.1.6 病毒感染及病毒滴度测定方法 |
| 1.1.7 蛋白组学检测方法 |
| 1.1.8 荧光定量PCR |
| 1.1.9 HSP47基因克隆与载体构建 |
| 1.1.10 载体构建 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 .讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 过表达宿主 HSP47 基因对 SVCV 复制的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 RNA干扰HSP47 后对SVCV复制的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.4 MTT法测细胞活性 |
| 3.1.5 HSP47 基因siRNA的设计与合成 |
| 3.1.6 siRNA细胞转染 |
| 3.1.7 荧光定量PCR检测 |
| 3.1.8 Western blot检测 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 HSP47-siRNA转染EPC细胞效果 |
| 3.2.2 HSP47-siRNA干扰效率 |
| 3.2.3 转染试剂对EPC细胞活性的影响 |
| 3.2.4 HSP47 沉默对SVCV复制的影响 |
| 3.2.5 HSP47 沉默对EPC细胞凋亡的影响 |
| 3.2.6 HSP47 沉默对 SVCV 感染 EPC 细胞细胞因子表达量的影响 |
| 3.2.7 HSP47 沉默对 SVCV 感染 EPC 细胞 TLR3,TLR7,IRF3 和 IRF7 表达量的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.草鱼呼肠孤病毒分子研究进展 |
| 1.1 草鱼呼肠孤病毒的生物学信息 |
| 1.2 草鱼呼肠孤病毒致病机理研究现状 |
| 2.热休克蛋白的研究 |
| 2.1 热休克蛋白70的结构 |
| 2.2 热休克蛋白70的生物学功能 |
| 2.3 热休克蛋白70参与免疫应答 |
| 2.4 鱼类HSP70研究进展 |
| 3.热休克蛋白70抗病毒研究 |
| 4.本文研究的目的及意义 |
| 第一章 Ⅲ型GCRV非结构蛋白基因NS66 的原核表达,多克隆抗体的制备 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 试验病毒及细胞 |
| 1.3 试验试剂及药品 |
| 1.4 所用软件 |
| 1.5 目的基因的克隆 |
| 1.5.1 病毒总RNA的提取及反向转录合成第一链cDNA |
| 1.5.2 引物设计及目的基因的扩增 |
| 1.6 重组表达质粒的构建、表达及纯化 |
| 1.6.1 NS66原核表达质粒及真核质粒的构建 |
| 1.6.2 诱导表达、纯化 |
| 1.7 多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 1.7.1 多克隆抗体的制备 |
| 1.7.2 Western Blot检测分析 |
| 1.7.3 效价分析 |
| 1.7.4 NS66亚细胞定位 |
| 1.7.5 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 1.8 蛋白表达动力学 |
| 2.结果 |
| 2.1 NS66目的基因的扩增鉴定 |
| 2.2 重组质粒的构建 |
| 2.3 重组蛋白rNS66的诱导表达、纯化 |
| 2.4 多克隆抗体鉴定Western blot分析 |
| 2.5 多克隆抗体效价分析 |
| 2.6 NS66亚细胞定位 |
| 2.7 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.8 蛋白表达动力学 |
| 3.讨论 |
| 第二章 病毒感染条件下热休克蛋白基因的表达研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 试验病毒及细胞 |
| 1.3 试验试剂及药品 |
| 1.4 所用软件和工具 |
| 1.5 目的基因的克隆 |
| 1.5.1 总RNA的提取及cDNA第1 条链的合成 |
| 1.5.2 引物设计及目的基因的扩增 |
| 1.6 草鱼热休克蛋白的生物学信息分析 |
| 1.7 病毒质粒拷贝数与病毒感染 |
| 1.7.1 病毒质粒拷贝数标准曲线构建 |
| 1.7.2 病毒感染 |
| 1.8 抗体特异性鉴定 |
| 1.9 病毒感染条件下热休克蛋白基因的表达变化 |
| 1.9.1 转录水平变化 |
| 1.9.2 翻译水平变化 |
| 1.10 HSP70抑制剂 |
| 1.10.1 抑制剂毒性测试 |
| 1.10.2 转录水平抑制作用 |
| 1.10.3 蛋白水平抑制作用 |
| 1.11 过表达HSP70 |
| 1.11.1 转录水平作用 |
| 1.11.2 蛋白水平作用 |
| 2.结果 |
| 2.1 目的基因的克隆 |
| 2.2 草鱼热休克蛋白的生物学信息分析 |
| 2.3 病毒质粒拷贝数标准曲线 |
| 2.4 抗体特异性分析 |
| 2.5 热休克蛋白在GCRV感染下的表达 |
| 2.5.1 转录水平 |
| 2.5.2 翻译水平 |
| 2.6 HSP70抑制剂 |
| 2.6.1 抑制剂毒性 |
| 2.6.2 转录水平抑制作用 |
| 2.6.3 翻译水平抑制作用 |
| 2.7 过表达HSP70 |
| 2.7.1 转录水平作用 |
| 2.7.2 蛋白水平作用 |
| 3.讨论 |
| 第三章 草鱼热休克蛋白调控病毒复制的可能性机制探讨 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 试验病毒及细胞 |
| 1.3 试验试剂及药品 |
| 1.4 所用软件 |
| 1.5 目的基因克隆 |
| 1.5.1 总RNA的提取及cDNA第一条链的合成 |
| 1.5.2 引物设计及目的基因扩增 |
| 1.6 诱饵表达质粒的构建 |
| 1.7 酵母双杂交筛选与草鱼HSP70、HSC70 可能相互作用的病毒蛋白 |
| 1.7.1诱饵重组质粒和病毒所有基因质粒转染酵母菌AH109 |
| 1.7.2 pGADT7-HSP70、pGADT7-HSC70 自激活检测 |
| 1.7.3 营养缺陷培养基筛选阳性菌落 |
| 1.8 非正常折叠蛋白通路(UPR) |
| 1.8.1 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.8.2 病毒感染前后非正常折叠蛋白通路标志性基因变化检测 |
| 2.结果 |
| 2.1 目的基因克隆 |
| 2.2 诱饵质粒pGADT7-HSP70和pGADT7-HSC70 自激活检测 |
| 2.3 营养缺陷培养基筛选阳性菌落 |
| 2.4 非正常折叠蛋白通路标志性基因在GCRV感染下的表达 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 发表论文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 基于电化学传感技术的抑郁症标志物分析研究进展 |
| 1.1 电化学传感技术简介及其应用 |
| 1.1.1 电化学传感技术简介 |
| 1.1.2 电化学传感器的分类及其应用 |
| 1.1.2.1 离子型电化学传感器 |
| 1.1.2.1.1 电活性物质测定的电化学传感器 |
| 1.1.2.1.2 非电活性物质测定的分子印迹传感器 |
| 1.1.2.2 电化学生物传感器 |
| 1.1.2.2.1 DNA电化学生物传感器 |
| 1.1.2.2.2 细胞电化学生物传感器 |
| 1.1.2.2.3 适配体电化学生物传感器 |
| 1.1.2.2.4 酶电化学生物传感器 |
| 1.1.2.2.5 电化学免疫传感器 |
| 1.1.2.2.6 场效应晶体管生物传感器 |
| 1.2 基于碳材料的电化学传感技术研究 |
| 1.2.1 碳材料的分类 |
| 1.2.2 基于石墨烯的电化学传感器 |
| 1.2.2.1 石墨烯电化学传感器的特点 |
| 1.2.2.2 石墨烯电化学传感器的应用 |
| 1.2.2.3 石墨烯电化学生物传感器的应用 |
| 1.2.2.3.1 基于石墨烯的DNA传感器 |
| 1.2.2.3.2 基于石墨烯的细胞传感器 |
| 1.2.2.3.3 基于石墨烯的电化学免疫传感器 |
| 1.2.3 基于多孔石墨烯的电化学传感器 |
| 1.2.3.1 多孔石墨烯电化学传感器的特点 |
| 1.2.3.2 多孔石墨烯电化学传感器的应用 |
| 1.2.3.3 多孔石墨烯电化学生物传感器的应用 |
| 1.2.4 基于石墨烯量子点的电化学传感器 |
| 1.2.4.1 石墨烯量子点电化学传感器的特点 |
| 1.2.4.2 石墨烯量子点电化学传感器的应用 |
| 1.2.4.3 石墨烯量子点电化学生物传感器的应用 |
| 1.2.5 基于碳纳米管的电化学传感器 |
| 1.2.5.1 碳纳米管电化学传感器的特点 |
| 1.2.5.2 碳纳米管电化学传感器的应用 |
| 1.2.5.3 碳纳米管电化学生物传感器的应用 |
| 1.2.5.3.1 基于碳纳米管的酶传感器 |
| 1.2.5.3.2 基于碳纳米管的免疫传感器 |
| 1.3 抑郁症标志物分析的电化学传感技术研究现状 |
| 1.3.1 抑郁症及其危害 |
| 1.3.2 抑郁症的诊断现状 |
| 1.3.3 抑郁症标志物 |
| 1.3.4 抑郁症标志物电化学传感器的研究现状 |
| 1.3.4.1 用于抑郁症标志物分析电化学传感器 |
| 1.3.4.1.1 多巴胺(DA)检测电化学传感器 |
| 1.3.4.1.2 五羟色胺(5-HT)检测电化学传感器 |
| 1.3.4.1.3 L-色氨酸(L-Trp)检测电化学传感器 |
| 1.3.4.1.4 去甲肾上腺素(NA)检测电化学传感器 |
| 1.3.4.1.5 丙二醛(MDA)检测电化学传感器 |
| 1.3.4.2 用于抑郁症标志物分析的电化学分子印迹传感器 |
| 1.3.4.2.1 L-色氨酸(L-Trp)检测电化学分子印迹传感器 |
| 1.3.4.2.2 γ-氨基丁酸(γ-GABA)检测电化学分子印迹传感器 |
| 1.3.4.3 用于抑郁症标志物分析的电化学免疫传感器 |
| 1.3.4.3.1 皮质醇检测电化学免疫传感器 |
| 1.3.4.3.2 热休克蛋白70(HSP70)检测电化学免疫传感器 |
| 1.3.4.3.3 人载脂蛋白A4(Apo-A4)检测电化学免疫传感器 |
| 1.3.5 抑郁症标志物电化学传感器的总结及展望 |
| 参考文献 |
| 第二节 基于电化学传感技术的中药组分分析评价研究进展 |
| 2.1 基于电化学传感技术的中药组分分析研究现状 |
| 2.1.1 中药质量控制的现状 |
| 2.1.2 中药活性组分 |
| 2.1.3 电化学传感技术在中药活性组分分析中的应用 |
| 2.1.3.1 中药活性组分分析的电化学传感器研究 |
| 2.1.3.2 中药活性组分快检的电化学分子印迹传感器研究 |
| 2.2 基于电化学传感技术的中药活性组分抗氧化活性评价研究现状 |
| 2.2.1 中药活性组分中的抗氧化剂 |
| 2.2.2 抗氧化活性物质的抗氧化机理 |
| 2.2.2.1 清除自由基 |
| 2.2.2.2 螯合金属离子 |
| 2.2.2.3 清除氧 |
| 2.2.2.4 作用于自由基有关的酶 |
| 2.2.3 抗氧化活性评价的方法 |
| 2.2.4 电化学传感器技术评价抗氧化活性的策略 |
| 2.2.4.1 电化学定量检测 |
| 2.2.4.2 电化学参数评价 |
| 2.2.4.3 用于抗氧化活性评价的膜损伤电化学传感器研究 |
| 2.3 电化学传感技术在中药活性组分分析评价领域的机遇 |
| 参考文献 |
| 第三节 本论文所涉及的研究内容 |
| 第二章 基于金纳米粒子/Fe_3O_4磁功能化石墨烯的皮质醇电化学免疫传感器研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 磁功能化石墨烯(MrGO)复合材料的制备 |
| 2.2.4 Cor/AuNPs/MrGO@Nafion/GCE修饰电极的制备 |
| 2.2.5 电化学测量及免疫反应过程 |
| 2.2.5.1 基础电极的电化学表征 |
| 2.2.5.2 电化学免疫传感器的循环伏安表征 |
| 2.2.5.3 免疫反应及皮质醇的测量过程 |
| 2.2.6 实际血浆样品的采集 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 磁功能化石墨烯(MrGO)的表征 |
| 2.3.1.1 原子力显微镜对GO、r GO和 rGO-PEI的表征 |
| 2.3.1.2 X射线衍射对Fe_3O_4 纳米粒子和磁功能化石墨烯(MrGO)进行表征 |
| 2.3.1.3 傅里叶变换红外光谱对GO、GO-PEI和 MrGO的表征 |
| 2.3.1.4 Fe_3O_4 纳米粒子及MrGO的磁滞回线 |
| 2.3.1.5 Fe_3O_4和MrGO的 TEM表征 |
| 2.3.2 MrGO的 SEM表征比较 |
| 2.3.3 基础电极的电化学表征 |
| 2.3.4 电化学免疫传感器的的循环伏安法表征 |
| 2.3.5 免疫传感器的分析性能 |
| 2.3.6 免疫传感器的特异性,再生性和稳定性考查 |
| 2.3.7 免疫传感器应用于实际样品中皮质醇(Cor)的检测 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 构建基于聚苯胺功能化石墨烯量子点的电化学免疫传感器用于热休克蛋白70的检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器与试剂 |
| 3.2.2 聚苯胺功能化石墨烯量子点复合材料(PAGD)的制备 |
| 3.2.3 修饰电极的制备 |
| 3.2.4 电化学测量及免疫反应过程 |
| 3.2.4.1 基础电极的电化学表征 |
| 3.2.4.2 电化学免疫传感器的循环伏安表征 |
| 3.2.4.3 免疫反应及人热休克蛋白70(HSP70)的测量过程 |
| 3.2.5 实际血浆样品的采集 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 材料的表征 |
| 3.3.2 PAGD/GCE修饰电极的电化学表征 |
| 3.3.3 电化学免疫传感器的的循环伏安法表征 |
| 3.3.4 免疫传感器的分析性能 |
| 3.3.5 免疫传感器的特异性,重现性和稳定性考查 |
| 3.3.6 免疫传感器用于实际样品中热休克蛋白70(HSP70)的检测 |
| 3.4.结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 一种新型多孔石墨烯基电化学免疫传感器用于抑郁症标志物——热休克蛋白70的早期筛查 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器与试剂 |
| 4.2.2 多孔石墨烯的制备 |
| 4.2.3 修饰电极的制备 |
| 4.2.4 电化学测量及免疫反应过程 |
| 4.2.4.1 基础电极的电化学表征 |
| 4.2.4.2 电化学免疫传感器的循环伏安表征 |
| 4.2.4.3 免疫反应及人热休克蛋白70(HSP70)的测量过程 |
| 4.2.5 实际血浆样品的采集 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 材料的表征 |
| 4.3.2 基础电极的电化学表征 |
| 4.3.3 电化学免疫传感器的的循环伏安法表征 |
| 4.3.4 免疫传感器的分析性能 |
| 4.3.5 免疫传感器的特异性,重现性和稳定性考查 |
| 4.3.6 免疫传感器应用于实际样品中人热休克蛋白70(HSP70)的检测 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 用于抑郁症标志物—人载脂蛋白A4(Apo-A4)高灵敏分析的新技术研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 仪器与试剂 |
| 5.2.2 类沸石咪唑酯金属有机骨架-氮掺杂石墨烯复合材料(ZIF-8@N-Gr) |
| 5.2.3 修饰电极的制备 |
| 5.2.4 电化学测量及免疫反应过程 |
| 5.2.4.1 基础电极的电化学表征 |
| 5.2.4.2 电化学免疫传感器的循环伏安表征 |
| 5.2.4.3 免疫反应及人载脂蛋白A4(Apo-A4)的测量过程 |
| 5.2.5 实际血浆样品的采集 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 材料的表征 |
| 5.3.2 基础电极的电化学表征 |
| 5.3.3 电化学免疫传感器的的循环伏安法表征 |
| 5.3.4 免疫传感器的分析性能 |
| 5.3.5 免疫传感器的特异性,重现性和稳定性考查 |
| 5.3.6 免疫传感器应用于实际样品中人载脂蛋白A4(Apo-A4)的检测 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 基于Fe_3O_4磁功能化还原氧化石墨烯的电化学传感器对党参炔苷的直接电化学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.2.3 MrGO/Nafion@GCE电化学传感器的构建 |
| 6.2.4 电化学测量 |
| 6.2.4.1 MrGO/Nafion@GCE电极的电化学表征 |
| 6.2.4.2 党参炔苷在MrGO/Nafion@GCE电极上的电化学响应 |
| 6.2.5 党参提取物样品的准备 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 MrGO/Nafion@GCE修饰电极的电化学表征 |
| 6.3.2 党参炔苷的电化学行为 |
| 6.3.3 实验条件的优化 |
| 6.3.3.1 修饰量的影响 |
| 6.3.3.2 pH值的影响 |
| 6.3.3.3 扫描速率的影响 |
| 6.3.3.4 富集条件的影响 |
| 6.3.4 线性范围和检出限 |
| 6.3.5 重现性与稳定性 |
| 6.3.6 干扰实验 |
| 6.3.7 实际样品中党参炔苷的检测 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 用于毛蕊异黄酮痕量分析的电化学传感器研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验部分 |
| 7.2.1 仪器与试剂 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.2.2.1 多孔石墨烯的制备 |
| 7.2.2.2 修饰电极的制备 |
| 7.2.2.3 修饰电极的电化学表征 |
| 7.2.2.4 样品的制备 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 材料的表征 |
| 7.3.2 电化学传感器有效比表面积的计算 |
| 7.3.3 PG@GCE修饰电极的电化学表征 |
| 7.3.4 毛蕊异黄酮在传感器上的电化学行为考察 |
| 7.3.5 实验条件的优化 |
| 7.3.5.1 修饰量的影响 |
| 7.3.5.2 pH值的影响 |
| 7.3.5.3 扫描速率 |
| 7.3.5.4 富集时间的影响 |
| 7.3.6 线性范围和检出限 |
| 7.3.7 传感器的重现性、选择性和稳定性研究 |
| 7.3.8 实际样品的分析 |
| 7.3.8.1 黄芪、红芪中毛蕊异黄酮(CYS)的测定 |
| 7.3.8.2 生物样本中毛蕊异黄酮(CYS)的测定 |
| 7.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第八章 基于功能化石墨烯电化学传感器评价黄酮类化合物抑制蛋白质的损伤 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 实验部分 |
| 8.2.1 化学药品及试剂 |
| 8.2.2 仪器 |
| 8.2.3 BSA/PDDA-G/GCE电极的制备 |
| 8.2.4 电化学测量 |
| 8.2.4.1 循环伏安法对PDDA-G的修饰量的考查 |
| 8.2.4.2 修饰电极的电化学表征 |
| 8.2.4.3 方波伏安法对蛋白质损伤的测定和黄酮类化合物抗氧化活性的评价 |
| 8.2.5 BSA的氧化损伤过程 |
| 8.3 结果与讨论 |
| 8.3.1 自由基的产生及其检测 |
| 8.3.2 修饰量的影响 |
| 8.3.3 BSA/PDDA-G/GCE修饰电极的形貌表征 |
| 8.3.4 BSA/PDDA-G/GCE修饰电极的电化学表征 |
| 8.3.5 BSA损伤的电化学检测 |
| 8.3.6 实验条件的优化 |
| 8.3.6.1 BSA/PDDA-G/GCE修饰电极在Fenton体系损伤时间的优选 |
| 8.3.6.2 Fenton体系的pH值对BSA损伤程度的影响 |
| 8.3.6.3 Fe~(2+)/H_2O_2 配比对BSA损伤程度的影响 |
| 8.3.7 Fenton损伤蛋白质的红外验证 |
| 8.3.8 四种黄酮类化合物对BSA氧化损伤抑制的研究 |
| 8.3.9 修饰电极的重复性和稳定性研究 |
| 8.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第九章 基于DNA/Nafion-聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯电化学传感器评价阿魏酸及当归水提物抗氧化活性 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 实验部分 |
| 9.2.1 仪器与试剂 |
| 9.2.2 聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯(PDDA-G)的制备 |
| 9.2.3 当归样品的制备 |
| 9.2.4 DNA/NA-PDDA-G/GCE修饰电极的构建 |
| 9.2.5 电化学测量方法 |
| 9.2.6 DNA氧化损伤的过程 |
| 9.3 结果与讨论 |
| 9.3.1 自由基的产生及其阿魏酸抗氧化作用的检测 |
| 9.3.2 修饰电极的形貌表征 |
| 9.3.3 修饰电极的电化学表征 |
| 9.3.4 DNA损伤的电化学检测 |
| 9.3.5 实验条件的优化 |
| 9.3.5.1 Fenton体系损伤时间的影响 |
| 9.3.5.2 Fenton体系的pH值对DNA损伤程度的影响 |
| 9.3.5.3 Fe~(2+)/H_2O_2 配比对DNA损伤程度的影响 |
| 9.3.6 抗氧化剂对DNA氧化损伤抑制的研究 |
| 9.3.7 修饰电极的重复性和稳定性研究 |
| 9.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第十章 总结与展望 |
| 10.1 主要结论 |
| 10.2 论文存在的不足与研究展望 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
