硫反义寡核苷酸对实验性肝纤维化大鼠TIMP-1基因和蛋白表达的抑制作用

一、硫代反义寡核苷酸对实验性肝纤维化大鼠TIMP-1基因及蛋白表达的抑制作用（论文文献综述）

张兴旺^[1]（2021）在《CCL4诱导小鼠肝纤维化模型基因芯片整合分析及核心基因的筛选验证研究》文中认为背景与目的:肝硬化（Liver cirrhosis）是肝脏在慢性炎症刺激的作用下肝小叶重建、假小叶和纤维结节形成所导致的病理改变,可能进一步发展为肝癌。肝硬化是一个世界性的卫生问题,它可由多种病因引起,在肝硬化的形成过程中,肝纤维化（Liver fibrosis）是其必经阶段。目前的研究普遍认为肝纤维化是可逆的,随着测序技术的进步和基因数据库中测序数据的不断增加,人们通过对数据的分析发现在肝纤维化病变过程中涉及到部分基因及通路的改变,并且在针对性的增强或抑制某些基因的表达后,肝纤维化得到了不同程度的逆转,这些实验证明通过调控基因表达来治疗肝纤维化是可行的。目前已有许多相关研究揭示了一些重要的基因及通路,如TGF-β（Transforming growth factor-β）通路等,但目前尚无特异性治疗肝纤维化的药物,因此在疾病进展过程中针对基因表达改变的研究仍存在一定的空白和进一步探索的空间。本研究使用生物信息学方法探索并分析小鼠肝纤维化进程中的关键性致病基因,并通过PCR实验验证生物信息学分析结果,为肝纤维化的早期诊断和个体化治疗提供依据。方法:1.在NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中筛选并下载CCL4诱导的小鼠肝纤维化基因芯片数据GSE27640和GSE55747,使用R语言对芯片数据进行进一步的探索,找出其中的差异表达基因,使用David数据库分析差异表达基因参与的细胞功能及通路,使用Cytoscape软件构建调控网络筛选出位于结点的10个核心致病基因,并在NCBI的Gene数据库中查询核心致病基因的功能及研究进展;2.使用CCL4诱导构建小鼠肝纤维化模型,取实验组小鼠肝硬化组织及对照组小鼠健康肝脏健康组织通过PCR实验观察基因表达情况验证我们生物信息学方法分析的结果。结果:1.将两组GEO数据整合分析后得到117个共同差异表达基因（其中108个基因表达上调,9个基因表达下调）。2.对共同差异表达基因进行功能富集分析后发现差异表达基因功能和信号通路在以下几个方面明显富集:1)在生物学进程（biological process,BP）中,共同上调基因明显富集在凋亡过程、转化、蛋白质折叠等过程。2)在分子功能（molecular function,MF）里,共同上调基因在蛋白质结合、poly（A）RNA结合、蛋白质同源二聚化活性等功能中明显富集。3)在细胞组分（cellular component,CC）里,共同上调基因主要见于细胞质、胞外体、细胞外间隙等。对差异表达基因进行信号通路富集分析结果显示共同上调基因主要富集在以下通路:内质网中的蛋白质加工、精氨酸和脯氨酸代谢等通路。3.对差异表达基因绘制蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction,PPI）网络图,使用Cytoscape软件最终筛选出10个核心致病基因:Lgals3,Actb,Anxa5,Lyz2,Sec61a1,Anxa2,Isg15,Timp1,P4hb,Rpl37。4.PCR验证结果显示筛选出的10个核心基因中有9个在转录水平表达与我们在GEO数据库中下载的基因芯片数据生物信息学分析的结果基本相符。结论:1.整合两组基因芯片数据使用生物信息学方法分析我们得到了117共同差异表达基因,其中上调的108个基因参与细胞凋亡、蛋白质结合等过程;2.从筛选出的共同差异表达基因中我们筛选出了10个核心致病基因,根据在NCBI的Gene数据库中查询到的研究结果如下:1)已明确有文献报道与肝纤维化有关的基因如Lgals3、Actb、Timp-1,2)文献报道与其他器官组织纤维化相关的基因如Lyz2、Anxa2,3)目前研究结果未发现与肝纤维化相关的基因如Anxa5、Isg15、P4hb、Rpl37、Sec61a1;3.通过构建小鼠肝纤维化模型并进行PCR实验,验证了我们生物信息学分析的结果,证明我们筛选出的核心致病基因,可作为肝纤维化诊断、治疗的靶标。

周怡驰^[2]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中研究表明中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。

李霞^[3]（2012）在《雄芍汤抗肝纤维化的物质基础研究》文中进行了进一步梳理第一部分雄芍汤有效部位的提取分离及含量测定目的建立雄芍汤的提取方法,以及其总提取物中粗多糖、总苷、总生物碱三个有效部位的分离和含量测定方法。方法以水煎煮法作为雄芍汤的提取方法。采用醇沉法,并结合Sevage法除蛋白,以分离粗多糖；采用水饱和正丁醇萃取法分离总苷；采用强酸型阳离子交换树脂法分离总生物碱。采用可见分光光度法测定雄芍汤粗多糖提取物中总多糖的含量,以及总苷提取物中人参总皂苷的含量,采用高效液相色谱法测定总苷提取物中芍药苷的含量,采用酸碱滴定法测定雄芍汤总生物碱提取物中总碱的含量。结果粗多糖提取物中总多糖含量为55.74%,平均回收率为98.23%,RSD为0.54%；总苷提取物中人参总皂苷的含量为63.54%,平均回收率为96.34%,RSD为0.61%；总苷提取物中芍药苷的含量为10.01%,平均回收率为99.67%,RSD为1.38%；总生物碱提取物中总碱的含量为79.42%,平均回收率为101.12%,RSD为3.37%。结论雄芍汤的提取分离方法简便易行,其粗多糖提取物、总生物碱提取物与总苷提取物的含量测定方法灵敏度高,重现性好,可用于雄芍汤有效部位的质量控制。第二部分雄芍汤及其有效部位抗模型大鼠肝纤维化的作用及机理研究目的采用二甲基亚硝胺（DMN）诱导大鼠肝纤维化模型,进行雄芍汤及其三个有效部位（粗多糖、总生物碱和总苷）抗DMN诱导模型大鼠肝纤维化的药效学观察及其作用机理研究,以初步阐明雄芍汤中发挥抗纤维化作用的物质基础,为雄芍汤的开发应用打下坚实的理论基础。方法将86只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组（以下简称为正常组）12只及造模组74只。除正常组外,其余大鼠均采用DMN腹腔注射法制备大鼠肝纤维化模型,按10mg/kg剂量注射1%DMN,隔日1次,每周3次,共4周,正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水。在造模期间,造模组大鼠死亡4只,用于判定模型制备情况处死4只。造模成功后,除正常组外,将造模组剩余的66只大鼠再随机分为6组,每组11只：模型对照组、扶正化瘀对照组、雄芍汤组、粗多糖组、总生物碱组、总苷组（以下分别简称为模型组、扶正组、雄芍组、多糖组、总碱组、总苷组）。分别以0.105g/ml的扶正化瘀溶液、1.610g/ml的雄芍汤药液、35.420mg/ml的雄芍汤粗多糖提取物溶液、0.196mg-ml的雄芍汤总生物碱提取物溶液以及25.725mg/ml的雄芍汤总苷提取物溶液,按0.5ml/100g体重给各治疗组大鼠灌胃,正常组与模型组灌服等量生理盐水,每日1次,疗程4周。实验过程中观察大鼠一般情况,药物干预4周后处死取材。肉眼观察大鼠新鲜肝脏；计算肝重指数和脾重指数；全自动生化分析仪检测血清肝功能指标ALT、AST、TIBL和ALB；放射免疫分析法检测血清肝纤维化标志物HA、LN、PCⅢ和CIV；黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活力,DTNB还原法检测血清GSH-PX活力,TBA法检测血清MDA含量；ELISA法检测血清MMP-13与TIMP-1含量；样本碱水解法检测肝组织中羟脯氨酸含量；HE染色与Masson染色观察肝组织病理学改变；免疫组化法检测肝组织CTGF、 PDGF-B、Col一I、α-SMA的表达；FQ-PCR检测肝组织TGF-β1mRNA表达； Western blotting检测肝组织Smad3、Smad7蛋白表达。结果1.扶正化瘀胶囊、雄芍汤、雄芍汤粗多糖及雄芍汤总苷均能改善肝纤维化大鼠的一般情况,而雄芍汤总生物碱不具有此作用；2.肝重指数与脾重指数：模型组肝重指数显着低于正常组,脾重指数显着高于正常组（P<0.01）；与模型组比较,除总碱组与模型组无显着性差异外,其余各治疗组肝重指数均显着升高,脾重指数均显着降低（P<0.01）；扶正组与雄芍组的肝重指数、脾重指数均无显着性差异,与这两组相比,各有效部位组肝重指数均显着降低,脾重指数均显着升高（P<0.05或P<0.01）。3.肝功能指标：模型组血清ALT、AST及TBIL均显着高于正常组,ALB显着低于正常组（P<0.01）；与模型组比较,除总碱组与模型组无显着性差异外,其余各治疗组ALT、AST、TBIL均显着降低,ALB均显着升高（P<0.05或P<0.01）；与雄芍组比较,各有效部位组ALT、AST与TIBL均显着升高（P<0.01）。4.肝纤维化标志物：模型组血清HA、LN、PC Ⅲ及CIV均显着高于正常组（P<0.01）；与模型组比较,除总碱组与模型组无显着性差异外,其余各治疗组HA、LN、PC Ⅲ及CIV均显着降低（P<0.05或P<0.01）；与雄芍组比较,除多糖组和总苷组的cIV与雄芍组无显着性差异外,多糖组、总碱组和总苷组的其余指标均显着升高（P<0.05或P<0.01）。5.血清SOD、GSH-PX及MDA：模型组血清SOD及GSH-PX均显着低于正常组,MDA高于正常组（P<0.01）；与模型组比较,扶正组、雄芍组和总碱组SOD及GSH-PX均显着升高（P<0.01）,MDA均显着降低（P<0.05或P<0.01）,多糖组、总苷组与模型组各组之间差异无显着性；与雄芍组比较,多糖组、总苷组与总碱组的SOD、GSH-PX均显着降低（P<0.05或P<0.01）, MDA均显着升高（P<0.01）。6.血清MMP-13及TIMP-1:模型组血清MMP-13显着低于正常组,TIMP-1显着高于正常组（P<0.01）；与模型组比较,除多糖组TIMP-1与模型组、总碱组与模型组无显着性差异外,其余各治疗组MMP-13均显着升高（P<0.05或P<0.01）, TIMP-1均显着降低（P<0.01）；与雄芍组比较,多糖组与总碱组MMP-13均显着降低,TIMP-1均显着升高（P<0.05或P<0.01）。7.肝组织Hyp、肝纤维化程度：模型组Hyp、肝纤维化半定量计分均显着高于正常组（P<0.01）；与模型组比较,除总碱组与模型组无显着性差异外,其余各治疗组Hyp、肝纤维化半定量计分均显着降低（P<0.01）；扶正组与雄芍组无显着性差异,各有效部位组Hyp、肝纤维化半定量计分均显着高于扶正组及雄芍组（P<0.05或P<0.01）。8.免疫组化：模型组肝组织CTGF、PDGF-B、Col-I及α-SMA表达均显着高于正常组（P<0.01）；与模型组比较,除总碱组与模型组无显着性差异外,其余各治疗组CTGF、PDGF-B、Col-I及α-SMA表达均显着降低（P<0.05或P<0.01）；扶正组与雄芍组无显着性差异,除多糖组的α-SMA表达与扶正组、雄芍组各组之间差异无显着性外,各有效部位组的其余指标均显着高于扶正组及雄芍组（P<0.05或P<0.01）。9.TGF-β1mRNA、Smad3及Smad7蛋白表达：模型组肝组织TGF-β1mRNA、 Smad3蛋白表达均显着高于正常组,Smad7蛋白表达显着低于正常组（P<0.01）；与模型组比较,除总苷组Smad7、总碱组与模型组无显着性差异外,其余各治疗组TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表达均显着降低,Smad7蛋白表达均显着升高（P<0.05或P<0.01）；与雄芍组比较,多糖组的TGF-β1mRNA表达显着降低（P<0.05）,总碱组与总苷组的Smad3蛋白表达显着升高（P<0.01）。结论雄芍汤总生物碱不具有抗DMN诱导的大鼠肝纤维化的作用,而雄芍汤粗多糖与雄芍汤总苷均具有确切的改善或逆转DMN诱导的大鼠肝纤维化的疗效。雄芍汤的物质基础为：（1）总生物碱介导雄芍汤抗脂质过氧化损伤的作用；（2）总苷介导雄芍汤促进MMP-13生成,抑制TIMP-1生成,从而促进Ⅰ型胶原降解的作用,粗多糖的作用次之；（3）粗多糖介导雄芍汤下调TGF-β1、α-SMA及Smad3表达,上调Smad7表达,调节TGF-β-Smad通路的作用,总苷的作用次之；（4）粗多糖与总苷共同介导雄芍汤抑制促纤维化细胞因子CTGF与PDGF-B表达的作用。第三部分雄芍汤及其有效部位含药血清对人肝星状细胞LX-2增殖的影响目的观察雄芍汤及其有效部位含药血清对人肝星状细胞增殖的影响,探讨雄芍汤抑制HSC增殖的物质基础。方法MTT比色法检测雄芍汤及其有效部位含药血清对LX-2增殖的影响。结果与20%、10%同浓度正常组相比,除总碱组与正常组无显着性差异外,其余各治疗组均对LX-2细胞的增殖有抑制作用（P<0.01）；与20%同浓度雄芍组相比,总碱组、总苷组对LX-2细胞增殖的抑制率显着降低（P<0.05或P<0.01）；与10%同浓度雄芍组相比,各有效部位组对LX-2细胞增殖的抑制率均显着降低（P<0.05或P<0.01）。结论雄芍汤总生物碱不具有抑制HSC增殖的作用,而雄芍汤粗多糖与雄芍汤总苷均具有抑制HSC增殖的功效。雄芍汤粗多糖介导雄芍汤抑制HSC增殖的作用,总苷的作用次之。

金蕊^[4]（2010）在《特发性眼眶炎性假瘤发病分子机理研究》文中指出特发性眼眶炎性假瘤（Idiopathic Orbital Inflammatory Pseudotumor, IOIP）为常见眼眶疾病,占眼眶病变的7.1%-12.3%。IOIP是指无全身与局部原因的特发性眼眶组织内慢性炎症细胞浸润,形成眶内占位性病变,纤维化是IOIP重要的病理变化。一般IOIP病人需要做手术切除病变组织,进行免疫组织化学检测才能确诊,而且容易复发。由于该病的病因和发病机制不明,诊断与治疗相当困难与棘手,是眼科领域研究的难点之一,所以对IOIP发病机理的研究显得特别迫切。本研究对进行炎性假瘤手术患者病理组织11例和非患者的正常组织4例,提取总RNA后,进行芯片检测,芯片结果用Real time RT-PCR进一步法验证。按照表达差异变化大于21.5倍或小于2-1.5和P<0.005的标准,筛选出表达差异基因744个,其中在IOIP组包括552个下调基因和192个表达上调基因。用主成分分析法和聚类法分析,IOIP组和正常对照组显着的分为两组。结果显示,IOIP组与正常对照组相比较,T细胞的标志分子(CD3和CD45)和B细胞的标志分子(CD20和CD79)及大量与T和B淋巴细胞扩增和激活相关的基因(SYK, CD20, LAT, SPIB, LCK, HCST和CD72)显着表达上调,证实眼眶炎性假瘤是以T或B细胞增殖为主的多克隆性病变。同时,发现PI3K和NF-κB通路的激活及炎性相关因子的高表达。EB病毒的感染会引起淋巴细胞的浸润,但EBV的感染是否和IOIP的发病相关还未被证明。在聚类分析中,受EBV感染激活的EBI2基因在IOIP组中显着表达上调（最大表达差异倍数11.7,P=0.00029）,被认为是在EBV感染细胞里最过表达的基因（>200倍）。EBV-DNA检测显示,IOIP病理组织中有90%（9/10）阳性,而在正常对照组（0/4）中未检测到阳性结果。纤维化是IOIP重要的病理改变,造成纤维化的主要原因就是细胞外基质在组织中过多堆积。ECM的代谢主要由基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）及其抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMPs）所调节,MMPs促进ECM的降解,而TIMPs通过抑制MMPs,阻止ECM的降解,从而形成或促进纤维化,其中起主要作用的是TIMP-1。本研究发现部分样品（5/11）中TIMP-1在芯片检测中表达上调,提示其可能参与了IOIP的纤维化过程。本研究成功构建TIMP1-shRNA载体,通过RNAi方法,有效的抑制TIMP-1基因的表达,在纤维化相关蛋白（透明质酸和纤维连接蛋白）中检测到抑制效果。综上所述,本研究证明EBV感染与IOIP的发病相关,EBI2基因是IOIP的分子标志,IOIP可能是由EBV感染引起的自身免疫疾病,这些发现表明应重新审视IOIP现有的临床诊断和治疗方案。由于EBV是鼻咽癌的主要致病因素,有研究发现伴眼征的鼻咽癌发生率为13.1～29.0%,而IOIP作为一种由EBV引起的眼部常见病,有可能是EBV早期激活的标志,对其进行进一步深入研究将对EBV致癌机理的研究提供重要的线索。

刘加群^[5]（2009）在《两种不同肝纤维化相关细胞因子shRNA表达载体的构建》文中研究说明目的:结缔组织生长因子（CTGF）是新近发现的一种促肝纤维化的重要细胞因子,是转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）信号传导途径的下游效应介质。CTGF可直接介导原代肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）活化、增殖及迁移,还能促进活化HSC的合成及分泌细胞外基质（extracellular matrix,ECM）。金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）也是TGF-β信号传导途径的下游效应介质,在肝纤维化发生时,它主要由激活的HSC表达。TIMP-1不仅抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）活性阻止胶原降解,也通过抑制HSC凋亡、促进胶原分泌而在肝纤维化病情进展中发挥关键作用。所以,减少CTGF和TIMP-1的表达,可以减轻肝纤维化程度。本研究旨在构建以大鼠CTGF或TIMP-1基因为靶点的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）表达载体,为进一步探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。方法:根据前期筛选出的对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt ,按照RNA干扰（RNA interference,RNAi）序列设计原则,各设计1对含有短发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,分别克隆到经双酶切后的质粒载体psiRNA-h7SKGFPzeo,构建成含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1,并对重组质粒进行双酶切琼脂糖电泳和测序鉴定。结果:酶切证实以大鼠CTGF或TIMP-1基因为靶点的表达shRNA的目的基因片段分别被成功的克隆到质粒载体psiRNA-h7SKGFPzeo中,测序结果证明重组质粒载体的插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论:成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的shRNA表达质粒重组体,为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径打下了实验基础。

贺欣^[6]（2009）在《肝复康对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1及Collagen Ⅲ表达的影响》文中提出目的:在正常肝脏的纤维组织中存在着细胞外基质（ECM）生成与降解的动态平衡,肝纤维化是ECM生成与降解过程失衡的结果[1,2]。既往对ECM的生成与沉积研究较多,近年开始对ECM降解的研究也日益深入,但是在肝纤维化临床治疗领域,并没有取得明显的进步。中药肝复康是本校病理生理教研室多年来通过反复实验总结出的抗纤维化经验方,本试验拟从ECM降解的角度探讨肝复康的作用机制。方法:将SD大鼠随机分为正常对照组（C）、模型组（M）、模型对照组（MC）、高剂量治疗组（HT）、中剂量治疗组（MT）、低剂量治疗组（LT）和预防组（P）。除正常对照组外,余鼠用皮下注射四氯化碳的方法复制大鼠肝纤维化模型。处死各组大鼠后测其血清丙氨酸转氨酶（ alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（ aspartate- aminotransferase,AST）、白蛋白（albumin,A）、球蛋白（globulin, G）的含量;HE染色法观察肝组织病理学变化;免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达;逆转录聚合酶链（reverse transcription polymerase- chain reaction, RT-PCR）法观察基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、Ш型胶原（CollagenШ）mRNA表达量的变化。同期正常饮食饲养大鼠作对照。结果:1.血清学指标:与模型组比较,肝复康治疗后可明显减少ALT及AST的释放,升高血清白蛋白,降低血清球蛋白,升高白球比,以中剂量治疗组最为显着。2.肝组织病理学变化:与模型组比较,肝复康治疗组肝细胞变性及坏死程度减轻,汇管区及小叶间仅有少量纤维组织增生,纤维间隔细小,尤以中剂量治疗组差异显着。3.肝组织免疫组化染色:模型组α-SMA主要表达于汇管区及纤维间隔,且呈长椭圆形或梭形,免疫组织化学染色面积显着高于正常对照组。中剂量治疗组α-SMA表达较模型组明显下降,与正常对照组无明显差异。4.肝组织TIMP-1和CollagenШmRNA的表达:模型组大鼠肝组织TIMP-1 mRNA表达较正常对照组明显上调。模型对照组、高剂量治疗组、中剂量治疗组和低剂量治疗组大鼠肝组织TIMP-1 mRNA表达较模型组均显着下调,其中以中剂量治疗组最为明显,预防组大鼠肝组织TIMP-1 mRNA表达较模型组没有显着性差异。模型组大鼠肝组织CollagenШmRNA表达较正常对照组明显上调。中剂量治疗组大鼠肝组织CollagenШmRNA表达较模型组明显下调,有显着性差异,且与正常对照组比较无显着性差异。结论:1.肝复康能显着降低CCl4诱导的大鼠肝纤维化的程度,降低TIMP-1及CollagenШmRNA表达水平,对肝纤维化有良好的治疗作用。2.肝复康对CCl4诱导的肝纤维化有疗效,作用机制可能与其下调TIMP-1表达水平,从而减轻了其对MMPs的抑制有关。

王世春,沈雁^[7]（2008）在《反义核酸技术在受胶原基因表达调控的肝纤维化研究中的应用》文中提出肝纤维化是慢性肝损伤的修复反应,以胶原为主的细胞外基质（ECM）在肝内大量沉积的病理过程。其形成机制较为复杂,各种细胞因子彼此相互作用,形成细胞因子网络,共同调控肝纤维化的发生、发展。抗肝纤维化治疗策略主要包括调控HSC活化增殖或促其凋亡、抑制胶原合成或促其降解、细胞因子治疗和间充质干细胞治疗等。反义核酸技术是一种发展迅速并极富应用前景的基因控制技术。它是利用DNA或RNA分子通过Watson Crick碱基配对原则与目的基因的mRNA互补结合,通过各种机制使其降解或抑制其编码蛋白的翻译,从而抑制目的基因的表达,主要包括反义寡核苷酸技术、RNA干扰技术和三股螺旋结构寡核苷酸技术。本文综述了应用反义核酸技术调控相关基因的表达来防治肝纤维化的研究现状。

刘斌^[8]（2008）在《反义转化生长因子受体与反义基质金属蛋白酶抑制因子联合作用对肝纤维化的影响》文中研究指明背景:在我国肝纤维化发生率高,是肝硬化发展的必经环节。目前研究认为肝纤维化属于可逆性病变,因此阻止和延缓肝纤维化的发生、发展则是治疗肝硬化的关键。研究发现在致肝纤维化的细胞因子中最重要是转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）,其致纤信号传导通路已阐明:首先活化了的TGF-β与II型TGF-β受体（TβRⅠI）结合并使之磷酸化而具有激酶活性;与TGF-β结合的TβRⅠI再结合I型TGF-β受体（TβRⅠ）形成I、II型受体复合物,并使TβRⅠ磷酸化具有激酶活性;最后,激活的TβRⅠ激活酶磷酸化其特殊的受体Smads （R-Smads） ,从而调节肝星形细胞（HSC）的转化和ECM的合成、降解。即TGF-β发挥作用必须借助其在细胞膜上的跨膜受体TβRⅠ和TβRⅠI。故从理论上,可推测选择性抑制TβRⅠ的表达,应可影响TGF-β信号传导,从而抑制TGF-β的促纤维化作用。在正常肝脏中,基质金属蛋白酶（matrixmetalloprotei-nases,MMPs）与基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metallopropteinases,TIMPs）处于动态平衡的状态,维持了胶原的产生与降解之间的平衡。当有损伤因子作用于肝脏,使HSC活化,打破了MMPs与TIMPs的平衡,就会导致胶原纤维降解的减少,致使大量的胶原在肝组织中沉积。肝内主要存在的TIMPs有TIMP-1和TIMP-2,其中以TIMP-1表达更为显着;主要存在的MMPs在人类为MMP-1,在啮齿类动物为MMP-13;TIMP-1可与MMP-1/MMP-13特异性结合,抑制其活性。故推测,抑制TIMP-1的表达,可减轻TIMP-1对MMP-1/MMP-13的抑制作用,增加ECM的降解,减少ECM的沉积,延缓肝纤维化的发生、发展。本实验旨在前期研究的基础上,应用分子生物学检测技术RT-PCR和western–bloting（蛋白印迹）测定各实验模型组大鼠肝组织TβRⅠ,TβRⅡ和TIMP-1,MMP-13 mRNA含量及蛋白的表达,并对所得数据进行科学分析,从生物分子的角度阐述并验证本课题,反义转化生长因子受体与反义基质蛋白酶抑制因子联合作能够有效的干预肝纤维化的发生,发展。最终的目标是运用基因治疗技术寻找一种防止和延缓各种慢性肝病向肝纤硬化发展的有效方法,为今后人类肝纤维化基因治疗奠定基础。材料与方法:取-80℃低温保存的实验大鼠肝脏:正常对照组12例,模型对照组12例、空质粒组13例、反义TIMP-1真核表达质粒组13例,反义TβRⅠ治疗组13例,反义TβRⅡ治疗组13例,反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组13例:反义TβRⅡ治疗组+反义TIMP-1治疗组13例。1.运用RT-PCR半定量检测肝组织内TβRⅠmRNA、TβRⅡmRNA、TIMP-1mRNA、MMP-13 mRNA测定。2.western blot蛋白印记技术检测大鼠肝组织中TβRⅠ、TβRⅡ、TIMP-1、MMP-13蛋白表达。3.进行系统科学数据分析,论证。结果:与模型对照组和空质粒组相比,反义TβRⅠ治疗组,反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组、反义TIMP-1治疗组、反义TβRⅡ治疗组、反义TβRⅡ+反义TIMP-1各治疗组中的TβRⅠ、TβRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表达均有下降,各组比对均有统计学意义（P<0.05）。在正常对照组与各实验治疗组之间TβRⅠ、TβRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表达均有显着性差异（P<0.05）;反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组较反义TβRⅠ治疗组、反义TIMP-1治疗组比对有统计学意义（P<0.05）;反义TβRⅡ+反义TIMP-1各治疗组较反义TβRⅡ治疗组,反义TIMP-1治疗组比对有统计学意义（P<0.05）模型对照组和空质粒对照组之间TβRⅠ、TβRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表达则无显着差异（P>0.05）。结论:1、反义TβRⅠ、TβRⅡ真核细胞表达质粒通过阻断TGF-β1的作用通道,减少细胞外间质（ECM）的合成,减轻肝纤维化的发展;通过实验也验证了TGF-β信号通路的存在。2、反义TβRⅠ、TβRⅡ真核细胞通过阻断TGF-β1的作用通道,对MMP-13产生抑制作用,对TIMP-1的促进作用,间接使细胞外间质（ECM）降解增加,抑制肝纤维化的进程。3、反义TIMP-1真核细胞通过拮抗TIMP-1对MMP-13的抑制作用,使细胞外间质（ECM）降解增加。4、两种重组质粒协同作用,可产生叠加效应,达到有效抑制延缓肝纤维化发生的目的。最终的目的是寻求一种防止和延缓各种慢性肝病向肝硬化发展的有效方法。

付德才^[9]（2008）在《甲珠防治肝纤维化基础及临床研究》文中研究表明肝纤维化是各种病因所致慢性肝病的共同病理过程,也是肝硬化发生的前奏和必经中间环节。其可逆性为临床防治肝硬化提供了良好契机,防治和逆转肝纤维化是延缓或阻止肝硬化发生的重要手段,为肝病患者延长寿命、提高生命质量提供了可能,是治疗各种慢性肝炎的远期目标。肝纤维化的防治和逆转已成为该领域国内外同行的研究热点。目前的研究认为,肝纤维化的病理改变是细胞外基质（ECM）的增生和降解失衡所致,近年来研究显示许多中医方药对肝纤维化有很好的治疗效果,并已展示良好的应用前景。从祖国医学辩证,认为肝纤维化是由于气滞、血瘀、络阻所致,肝纤维化初期主要为气滞,进而血瘀,最后络阻,气机不畅,肝纤维化、肝硬化形成。甲珠为穿山甲的鳞片,主归肝经,具有软坚、通络、散结的功效,是历代医家治疗症、瘕、集、聚的常用药,近来,被广泛用治肝硬化取得了较好的临床效果。本实验利用CCl4建立急性肝损伤和慢性肝纤维化的实验鼠动物模型,造模两周后采用中药甲珠不同剂量灌胃,干预肝纤维化的形成,观察实验效果,探讨其抗肝纤维化的机制,结果发现甲珠通过提高机体对自由基的清除能力,保护肝细胞,改善肝功能,减少肝纤维化发生发展的始动因素,对治疗组各肝纤维化指标有明显改善;通过临床病例治疗观察,进一步证实甲珠对肝纤维化的有一定的防治作用。为临床甲珠抗肝纤维化提供了理论基础。

田力^[10]（2007）在《超声造影剂携基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA阻逆大鼠肝纤维化的实验研究》文中研究表明基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重要酶类，几乎能降解ECM的所有成分，已发现26种，按作用底物不同分为胶原酶、明胶酶、基质溶素、膜型基质金属蛋白酶等。而基质金属蛋白酶抑制因子（Tissue inhibitor of Matrixmetalloproteinase，TIMP）是近年发现的MMPs的天然抑制剂，迄今发现有4种，TIMP-1、2、4为可溶性分泌蛋白，TIMP-3是一种结合ECM的非可溶性蛋白。TIMP主要功能是通过对MMPs的抑制作用，调节ECM代谢，抑制新生血管生成，阻碍MMPs介导的内皮细胞移动，抑制基质中促血管生成因子的释放，防止ECM降解，在ECM改建和肝纤维化的病理过程中发挥重要作用。肝纤维化是肝脏对慢性持续性损伤的一种“愈合反应”，是纤维增生和降解不平衡的结果。其中心环节是使胶原纤维沉积增多、降解减少，而决定纤维合成—降解平衡的关键又在于MMPs与TIMP之间的调节失衡。肝脏在各种损伤性因素的始动作用下激活肝星形细胞（hepatic stellate cells，HSC），使HSC由静息细胞转变为移行细胞，然后转分化为肌成纤维样细胞，转化后其重要功能之一是使TIMP合成及分泌增加。TIMP-1从2个方面抑制MMPs活性：1)在酶原活化阶段，TIMP与MMPs可形成稳定复合体，阻碍MMP的酶原自我激活：2)在活化的酶原阶段，TIMP可直接与活化的MMPs形成1：1复合体，抑制其活性。肝组织中主要来源于HSC的TIMP-1，能结合除MMP-14、19以外的所有MMPs而减低其表达活性，特别是与能特异性分解Ⅰ、Ⅲ型胶原的间质胶原酶MMP-1的结合，使大量间质胶原及纤维连接蛋白（FN）取代Disse氏腔内Ⅴ、Ⅳ、Ⅵ、ⅩⅣ胶原成分，在基质重构形成Disse氏腔纤维化中起重要作用。抗肝纤维化研究，一方面积极抑制胶原过度产生，另一方面应设法促进肝窦周过度沉积ECM胶原纤维的降解，抑制TIMP-1的表达可释放MMPs对ECM胶原纤维的降解，改善肝纤维化结构，为阻止甚或逆转肝纤维化提供条件。比较现代基因抑制研究中反义寡聚核苷酸（antisenseoligonucleotides，ODNs）技术、核酶（ribozymes）技术、DNA酶（DNAzymes）技术、RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，以RNAi技术设计构建目的基因的小干扰RNA（smoll interference RNA，siRNA）抑制效果明显优于对应的单链反义RNA和反义DNA，抑制效果高出上百倍，并且siRNA在很低浓度即显示较高活性而没有毒性；剂量反应曲线显示siRNA的IC50值比同一靶序列的反义寡核苷酸低100倍；RNAi高度特异性，siRNA中间位置单个碱基改变就可使RNAi失效，而针对同源基因共有序列的siRNA则导致同源基因共同失活：具有高度稳定性，siRNA在胎牛血清中的半衰期大约为24h，而反义寡核苷酸仅仅几分钟内就被降解。本课题利用RNAi技术设计TIMP-1的siRNA真核表达载体，以降解TIMP-1的mRNA，使TIMP-1在翻译过程中断，阻止其蛋白表达，解除对MMPs抑制。然而如何将所构建的TIMP-1 siRNA表达载体高效、安全转达肝组织并能在相应细胞中持续表达其抑制效果仍是所有基因治疗得以实现的关键问题。细胞膜是治疗基因进入细胞需要克服的屏障，其通透性改变是基因转染的前提。超声造影剂微泡技术研究并应用于临床，起初仅适用于超声诊断。新近研究发现，超声微泡表面所带负电荷能结合药物及基因大分子形成微泡—基因复合体。超声照射可使组织和体液内存在的微泡-基因复合体发生空化效应，使微泡破裂并释放所携基因药物。微泡破裂所形成的休克波使局部毛细血管通透性增加，并使细胞膜产生声孔（当声强为0.8W／cm-1.0W／cm时，用电子显微镜观察到内皮细胞膜出现缝隙），利于药物进入细胞间隙及细胞，实现目的基因在靶组织及细胞中的转染和表达。本课题应用RNAi技术构建抑制TIMP-1的真核表达载体TIMP-1 pRNAT-U6.2siRNA（TIMP-1 siRNA），并应用超声造影剂微泡技术携带TIMP-1 siRNA转染肝纤维化大鼠，观察其对大鼠血清学、肝组织结构形态学的影响，为肝纤维化基因治疗提供高效、特异基因及安全、有效基因转载途径。本实验分为以下四个部分。第一部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表达载体的构建及鉴定方法1．根据siRNA设计原则，在TIMP-1 mRNA序列中选择2个特异性靶序列（447-465nt、552-540nt）及1条无关对照序列。2．体外合成对应发卡样DNA片段，将其克隆入pGEM-T连接载体，BamH I和Xho I分别双酶切pGEM-T及表达载体pRNAT-U6.2，胶回收粘末端将特异序列定向亚克隆构建TIMP-1 pRNAT-U6.2／siRNA真核表达质粒并测序3．Lentivirus病毒包装构建TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA慢病毒表达载体。4．用脂质体包裹TIMP-1 siRNA质粒、单纯慢病毒表达载体分别转染T6细胞，荧光显微镜观察TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA质粒及病毒载体在T6中表达，RT-PCR及FQ-PCR检测T6细胞TIMP-1 mRNA在TIMP-1 siRNA干扰下的表达水平。5．统计学处理：所有数据均经SPSS10.0软件进行统计分析。计量资料用采用（?）±S表示；两组均数的比较用t检验（t-test）；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）。结果1．所构建的TIMP-1 pRNAT-U6.2／siRNA表达质粒，经酶切鉴定与测序，结果显示特定位点靶序列与设计序列完全一致。2．Lentiverus病毒包装的TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA病毒表达载体滴度1.2～2.8x06-7IU／ml。3．慢病毒载体转染T6细胞较脂质体包裹质粒效率高，si-447序列较si-552序列沉默效应高，P＜0.05。4．转染T6细胞后，细胞TIMP-1 mRNA表达显着降低，si-447质粒沉默效率（78±8.72）％，si-552沉默效率（54.3±5.51）％；病毒表达载体si-447的沉默效率（81.3±7.61）％，si-552（66.3±8.37）％；si-C与T6细胞内TIMP-1 mRNA无显着差异，P＞0.05。第二部分建立肝纤维化大鼠模型方法1．SPF级雄性Wistar大鼠，体质量（150±10）g，1％二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）按10 mg／kg，腹腔内注射，第1周连续3次，第2、3、4、5、6周各连续2次；对照组同时间、同剂量生理盐水腹腔注射。2．第1次注药后第1、2、4、6、8各周随机取5只大鼠，取血及肝组织，Elisa方法测血清TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；HE染色观察肝组织结构，按1995年肝纤维化分类标准鉴定；Masson染色观察肝组织胶原纤维含量，免疫组化检测肝组织内TIMP-1蛋白表达，原位杂交鉴定在肝组织内TIMP-1 mRNA表达。3．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积x 100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显着性，P＜0.05有统计学意义。结果1．一般状况：模型组大鼠于注射DMN 16天后开始出现尿黄，进食和饮水减少；第32天始大鼠陆续出现目黄，好斗，皮毛皱而不洁，渐嗜睡；第45天始4只大鼠出现腹水，第8周时，均见臌胀腹水，2只死亡。2．造模大鼠血清TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ动态变化：注药一周，TIMP-1即开始升高，后持续增强，4周后维持高值；MMP-1含量2周处高峰，随后缓慢降低，8周时含量最低，然而仍高出正常对照组；HA含量注药后一周升幅达2倍，后持续增高，至6周时处高峰；LN注药后小幅增长至6周达高峰；CP-Ⅰ含量注药后1周始较对照组升高，6周处高峰；CP-Ⅲ含量用药后小幅升高，6周处于高峰。3．原位杂交及免疫组化评价肝组织内TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达及Masson染色观察肝胶原纤维含量：TIMP-1 mRNA及蛋白在肝纤维化造模早期1周时表达均增高，较对照组有显着性差异，P＜0.001；随用药次数及时间表达持续增高，6周、8周TIMP-1 mRNA呈高表达，但其两者差异不明显；肝胶原纤维百分含量4周前表达量较对照组虽有显着性差异，P＜0.05，但增幅不大；4周后，肝胶原纤维显着持续增高，8周时达：17.3±1.95。4．大鼠肝组织病理学变化：模型组大鼠用药后1周即可见肝细胞变性及小点状坏死灶，汇管区炎症，窦周及小叶内少量纤维沉积；2w时，部分小叶内点片状坏死灶，部分大鼠肝组织汇管区周围纤维沉积，纤维间隔形成；4 w时，大部分大鼠肝组织见肝细胞变性及融合坏死灶，纤维间隔伴小叶结构紊乱，符合肝纤维化3级，至6 w后停用DMN时，大鼠肝纤维化达到2～3级，大部分在3级，偶有4级片子；至8 w，所有大鼠肝纤维化达到3～4级，大部分4级。第三部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA真核表达载体转染肝纤维化大鼠对大鼠血清学、肝形态学的影响方法1．分组：造模成功大鼠分为TIMP-1 siRNA病毒载体组（T-si组：24只肝纤维化大鼠，20μl病毒载体＋200μl生理盐水），模型对照组（对照组：24只肝纤维化大鼠，220μl生理盐水），正常组(24只未经特殊处理Wister大鼠220μl生理盐水，以上药物均经大鼠阴茎静脉快速注射。注药后分别在2d、1w及2w处死，取血及肝组织（一部分4％多聚甲醛处理石蜡包埋，另部分-80℃冷冻切片y荧光纤维镜下观察及免疫组化等）。2．标本处理：双抗体夹心ABC-ELISA法测TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量（浓度：ng／ml）；HE染色观察肝组织结构及损伤分级；Masson染色测定肝组织胶原纤维含量；原位杂交、免疫组化法观察肝内TIMP-1 mRNA及蛋白分布；荧光显微镜下观察肝组织内TIMP-1 siRNA慢病毒表达载体肝组织内转染效率。3．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积×100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显着性，P＜0.05有统计学意义。结果1．488 nm激发光荧光显微镜观察，507 nm的荧光照像，软件分析视野中绿色荧光强度值。2 d后，T-si组肝、肾、心肌组织切片中均有散在TIMP-1 siRNA慢病毒表达载体的绿色荧光表达，2．肝组织内免疫组化、原位杂交及Masson染色显示：2 d处死的大鼠肝组织胶原纤维、TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达均较造模组百分含量无显着性差异，P＞0.05；1 w后，肝组织TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达、胶原纤维含量均较造模组减低，P＜0.05；2 w后，肝组织TIMP-1 mRNA及TIMP-1蛋白表达均较造模组减低，P＜0.05，肝组织内胶原纤维含量较第1 w组有显着性差异（P＜0.05），较造模组差异显着，P＜0.001。3．ELISA方法检测血清：2 d，TIMP-1、MMP-1及LN较对照组有显着性差异（P＜0.05），HA、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量较造模组差异不明显，P＞0.05；2 w，TIMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量均较对照组有显着降低，P＜0.001，MMP-1含量较对照组显着增高，P＜0.001；2 w后各参数改变较1w后有显着差异（P＜0.05），但幅度减缓。第四部分基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA在超声造影剂及超声辐照干预下对纤维化大鼠的影响方法1．超声造影剂及基因载体混合：SonoVue是单分子层磷脂外壳的六氟化硫粉末，额定生理盐水注入后形成亲水端朝外、疏水链在内的六面体结构微泡，平均直径2.5μm，浓度（1～5）×108／ml。TIMP-1 siRNA及造影剂以1：10混匀，置4℃冰箱30 min，使2者混合充分。2．分组：TIMP-1 siRNA病毒组（Ⅴ组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl生理盐水：TIMP-1 siRNA病毒混合超声微泡组（V＋B组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl造影剂；TIMP-1 siRNA病毒混合超声微泡＋肝区超声辐照组（V＋B＋U组）：TIMP-1 siRNA 20μl＋200μl造影剂，同时机械指数（MI） 1.0超声辐照肝区5 min；造模对照组（C组）：220μl生理盐水，以上药物均经大鼠阴茎静脉快速注射。分别于2 d、1 w及2w后各组随机处理8只：取血、无菌取肝肾及心肌组织，两份保存，一份入4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，另一份迅速冻存。3．标本处理：ELISA方法测TIMP-1、MMP-1、HA、LN、CP-Ⅰ、CP-Ⅲ含量；各组织快冷冻切片，荧光显微镜观察组织内TIMP-1 siRNA的荧光表达；HE、Masson染色观察肝组织结构及胶原含量；提取肝组织总RNA，逆转录做荧光定量RT-PCR检测肝组织内TIMP-1 mRNA表达量。4．统计学处理：图像分析方法均采用病理分析仪高清晰图像处理系统，每张切片取四周及中央5个区域，每个区域均取阳性反应最多的视野，测定阳性反应面积百分比（阳性面积／肝组织面积x 100％），取平均值。采用SPSS 10.0统计软件，数值以均数±标准差（（?）±s）表示，采用t检验，方差分析比较不同组间数值差异显着性，P＜0.05有统计学意义。结果1．转染2 d后，V＋B＋U组肝组织内TIMP-1 siRNA绿色荧光表达量显着高于其它各组（P＜0.001），V组、V＋B组各组织见散在绿色TIMP-1 siRNA表达，组间差异不明显（P＞0.05）；V＋B＋U组可见荧光表达呈树枝状强化。2．肝组织内胶原纤维含量：用药后2d，V＋B＋U组TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白及肝内胶原纤维含量均有降低，较对照组差异显着，P＜0.05；V组及V＋B组较对照组差异不明显，P＞0.05；1w及2w后，V＋B＋U组TIMP-1mRNA及蛋白、胶原纤维含量减低，均较对照组及V组、V＋B组差异显着（P均＜0.001），V组、V＋B组组间差异不明显（P＞0.05）。3．ELISA方法检测测大鼠血清显示：2d时，V组、V＋B组各测值除TIMP-1 MRNA较对照组减低外（P＜0.05），其余各测值均较对照组无显着差异，P＞0.05；V＋B＋U组MMP-1较对照组显着增高，余测值均较对照组减低，差异显着（P均＜0.05）；1w及2w后，V＋B＋U组各测值均较对照组及V组、V＋B组差异显着（P均＜0.001），V组、V＋B组各测值组间无显着差异（P均＞0.05）。4．FQ-PCR检测肝组织内TIMP-1 mRNA表达量：1w后，V＋B＋U组对TIMP-1mRNA抑制效率为73.1％，V＋B组及V组抑制效率分别为47.1％，40.3％；2 w后，V＋B＋U组抑制效率为85.5％，V组抑制效率为68.4％，V＋B组抑制效率为66.4％。结论1．成功筛选构建了TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA真核表达质粒及Lentivirus病毒包装的TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA慢病毒表达载体。2．首次将TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA质粒及TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA／LentisiRNA慢病毒载体转染肝星形细胞（T6），鉴定其对TIMP-1表达的沉默效应，TIMP-1基因447-470bp做为siRNA插入序列的表达载体沉默效应最显着。3．应用肝毒性药物DMN成功建立大鼠肝纤维化模型，系统观察造模各时期肝组织结构形态学变化及血清学相关指标的改变，为研究肝纤维化病理及治疗肝纤维化提供实验依据。4．首次将TIMP-1 siRNA静脉注射于活体肝纤维化大鼠体内，在体抑制TIMP-1表达显着，血清MMP-1含量增高，TIMP-1及HA、CP-1等相关肝纤维指标降低，纤维化肝组织内胶原纤维含量减少、肝组织结构有一定改善。5．首次应用超声造影剂混合TIMP-1 pRNAT-U6.2／Lenti siRNA共同输注肝纤维化大鼠体内，应用高机械指数超声辐照肝组织，使TIMP-1 pRNAT-U6.2／LentisiRNA表达载体在肝脏高浓度表达，起到将目的基因定位释放于肝组织作用，为安全、靶向基因治疗肝纤维化提供有效转载途径。本项目的特色与创新之处：（1）肝星形细胞（HSC）激活是肝细胞外基质过度沉积形成肝纤维化的基础，而基质金属蛋白酶及其抑制因子的调节失衡是核心，以往研究多在抑制肝星形细胞的激活，而肝星形细胞的激活呈多因素，难以充分抑制。本课题针对核心中基质金属蛋白酶抑制因子-1，应用基因抑制先进的RNA干扰技术及新的pRNAT-U6.2／Lenti表达载体系统，首次将其应用在肝纤维化研究中，为肝纤维化基因治疗提供有效靶基因及工具。（2）首次将TIMP-1小干扰RNA表达载体应用超声造影剂携带，在高机械指数超声辐照条件下探索将目的基因定向释放于靶器官肝组织的的方法，提高基因转染效率、减低基因对非目的器官干扰，为肝纤维化基因治疗提供高效、安全转运途径。

二、硫代反义寡核苷酸对实验性肝纤维化大鼠TIMP-1基因及蛋白表达的抑制作用（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、硫代反义寡核苷酸对实验性肝纤维化大鼠TIMP-1基因及蛋白表达的抑制作用（论文提纲范文）

（1）CCL4诱导小鼠肝纤维化模型基因芯片整合分析及核心基因的筛选验证研究（论文提纲范文）

（2）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）

（3）雄芍汤抗肝纤维化的物质基础研究（论文提纲范文）

（4）特发性眼眶炎性假瘤发病分子机理研究（论文提纲范文）

（5）两种不同肝纤维化相关细胞因子shRNA表达载体的构建（论文提纲范文）

（6）肝复康对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1及Collagen Ⅲ表达的影响（论文提纲范文）

（8）反义转化生长因子受体与反义基质金属蛋白酶抑制因子联合作用对肝纤维化的影响（论文提纲范文）

（9）甲珠防治肝纤维化基础及临床研究（论文提纲范文）

（10）超声造影剂携基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA阻逆大鼠肝纤维化的实验研究（论文提纲范文）

四、硫代反义寡核苷酸对实验性肝纤维化大鼠TIMP-1基因及蛋白表达的抑制作用（论文参考文献）

• [1]CCL4诱导小鼠肝纤维化模型基因芯片整合分析及核心基因的筛选验证研究[D]. 张兴旺. 吉林大学, 2021(01)
• [2]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
• [3]雄芍汤抗肝纤维化的物质基础研究[D]. 李霞. 湖北中医药大学, 2012(01)
• [4]特发性眼眶炎性假瘤发病分子机理研究[D]. 金蕊. 北京工业大学, 2010(12)
• [5]两种不同肝纤维化相关细胞因子shRNA表达载体的构建[D]. 刘加群. 泸州医学院, 2009(06)
• [6]肝复康对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1及Collagen Ⅲ表达的影响[D]. 贺欣. 大连医科大学, 2009(02)
• [7]反义核酸技术在受胶原基因表达调控的肝纤维化研究中的应用[J]. 王世春,沈雁. 药学与临床研究, 2008(04)
• [8]反义转化生长因子受体与反义基质金属蛋白酶抑制因子联合作用对肝纤维化的影响[D]. 刘斌. 石河子大学, 2008(01)
• [9]甲珠防治肝纤维化基础及临床研究[D]. 付德才. 吉林大学, 2008(11)
• [10]超声造影剂携基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA阻逆大鼠肝纤维化的实验研究[D]. 田力. 郑州大学, 2007(06)