崔嘉琦[1]（2021）在《2014-2018年中国H6亚型禽流感病毒的部分生物学特性研究》文中研究指明H6亚型是禽流感病毒最丰富的亚型之一,除了可以感染野鸟和家禽外,也可发生跨越种间障碍感染人。近年来,我们除了在活禽交易市场分离到该亚型病毒,也在部分养殖场中分离到了H6亚型禽流感病毒。已有研究表明H6亚型禽流感病毒在进化过程种有部分病毒获得了潜在感染哺乳动物的能力,为了解当前我国H6亚型禽流感病毒的流行情况,并评价其抗原性的变化和对哺乳动物的感染风险,我们测定了2014-2018年期间分离的409株H6亚型禽流感病毒的表面基因序列,根据分离到的时间、地点、宿主及表面基因的进化关系,选择40株（其中28株病毒分离自养殖场,11株分离自活禽交易市场,1株野鸟源）H6亚型禽流感病毒进行部分生物学特性研究。病毒的遗传演化分析结果表明,HA基因差异较大,进化速率最快,为3.569×10-3substitutions/site/year。部分病毒的HA基因发生了第141位（全文皆按H3 numbering）氨基酸的插入,或157-158位氨基酸缺失的现象。分离病毒的NA基因亚型包括N1、N2、N6和N8,N1、N2和N6的进化速率较为接近,N8的进化速率最慢;其中N6亚型为优势的NA亚型。通过对病毒的全基因组序列分析发现,本研究中的40株病毒可以分为36个不同的基因型,这些病毒的内部基因与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H11和H12等多种野鸟来源或者鸭源的禽流感病毒的内部基因具有广泛的重排现象,表明当前我国流行的H6亚型禽流感病毒具有明显的遗传多样性。根据HA基因的氨基酸差异,我们从40株病毒中选择27株进行抗原性分析,病毒尿囊液灭活后,加佐剂免疫6周龄SPF鸡,免疫三周后分离获得抗血清;将这27株病毒与对应的血清进行交叉血凝抑制试验。根据交叉血凝抑制试验的结果,使用抗原作图法进行抗原性分析,发现27株H6亚型禽流感病毒至少可以分为五个抗原群,不同抗原群之间的病毒抗原差异明显。在病毒序列分析和抗原性分析基础上,选择19株病毒进行小鼠的感染性试验,结果表明,所有试验毒株不需要提前适应即可有效地在小鼠的肺脏内复制,有两株病毒不能在小鼠的鼻甲中复制;小鼠感染病毒后体重呈一过性下降,不表现出明显的临床症状,表明H6亚型禽流感病毒对小鼠呈低致病性。值得注意的是,GS/GD/S40190/2017（H6N2）在小鼠（1/3）的脑中出现了滴度为1.25 log10 EID50/ml的复制,对其滴定的鸡胚尿囊液进行测序表明,PB2发生了E677G突变;DK/Hu N/S41299/2017（H6N2）在小鼠（1/3）的肾中出现了1.75log10 EID50/ml的复制,且其PB2发生了R368Q突变。根据小鼠试验的结果及HA的氨基酸特征,我们选择17株病毒进行了受体结合特性试验。结果表明,除CK/AH/S1224/2017（H6N6）和CK/JX/SE2578/2017（H6N6）仅能结合α-2,3链禽源受体外,其余15株病毒均能够同时结合α-2,3链禽源受体和α-2,6链人源受体,尽管大部分毒株结合α-2,3链禽源受体的能力大于结合α-2,6链人源受体的能力,但是一株野鸟源的毒株WB/XJ/S1541/2015（H6N6）和一株HA 157-158位氨基酸缺失的毒株DK/GX/S30803/2017（H6N6）结合α-2,6链人源受体的能力更强,表明当前我国流行的H6亚型禽流感病毒具有感染人类的潜在风险。在2014-2018年H6亚型AIVs中,发现两株病毒CK/He N/S40124/2017（H6N8）和CK/SC/S4230/2016（H6N8）的HA在第141位发生了缬氨酸的插入,由于在之前的监测过程中并未发现该位点出现过氨基酸的插入,并且将其与在NCBI下载到的所有全长（1667条）H6 AIVs的HA序列进行比对,也没有发现参考序列在该位点有缬氨酸存在的现象。为了探究其是否对病毒的生物学特性产生影响,我们利用反向遗传操作技术将其中一株病毒CK/He N/S40124/2017（H6N8）的HA第141位缬氨酸进行删除并拯救了重组病毒r He N124-HAΔ141,进一步试验发现其对小鼠的感染性和病毒的受体结合特性无明显影响,但可降低单抗1D6对病毒CK/He N/S40124/2017（H6N8）的中和活性。综上所述,当前我国流行的H6亚型AIVs具有明显的遗传多样性,不同抗原群之间的毒株抗原性差异较大;近年来在养殖场中分离到的毒株数量逐渐增多,病毒来源呈现多样化和复杂化;同时部分病毒还具有感染哺乳动物甚至人的潜在风险,因此应继续加强对H6亚型禽流感病毒的监测和研究,为我国禽流感的综合防控策略调整和人类健康保护提供理论基础和数据支持。
张醒海[2]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中研究指明流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
尹馨[3]（2021）在《H7N9亚型禽流感病毒的进化监测及关键生物表型的分子机制研究》文中认为2013年,我国首次出现低致病性H7N9亚型流感病毒感染并致人死亡事件。2017年,该低致病性H7N9亚型流感病毒进一步突变为高致病性H7N9病毒,并呈现对鸡的高致病力。鉴于此,2017年9月开始,我国在家禽中全面实行疫苗免疫政策,疫苗免疫不但有效阻断了H7N9病毒在家禽中的流行,为养禽业每年挽回数百亿元的经济损失,更在阻断人感染H7N9病毒方面取得“立竿见影”的效果,将一场“潜在的人流感大流行”扼杀在萌芽状态。然而,在后续的监测中,我们发现H7N9病毒在我国尚未被完全根除,其进化和生物学特性仍需进一步跟踪并开展研究。本研究在2018年2月至2019年12月的监测和诊断过程中分离到19株H7N9病毒,对它们进行了系统的分析评估。遗传演化以及关键氨基酸分析发现,19株H7N9病毒在HA、NA、M基因的核苷酸同源性分别为97%～100%、97.6%～100%和97.1%～100%,与2017年高致病性H7N9病毒属于同一分支内。19株中的18株病毒在PB2、PB1、PA、NP和NS基因的核苷酸同源性分别为97.6%～100%,98%～100%,98%～100%,98%～100%和97.7%～100%,而DK/FJ SE0377/18病毒株与它们的核苷酸差异较大,与其他18株病毒的PB2、PB1、PA、NP和NS在进化树上分布于不同的分支内,核苷酸同源性分别为85.7%～86.2%,88.8%～89.4%,90.5%～91.4%,93.7%～94.6%和69.1%～69.7%。按照95%的核苷酸差异标准进行划分,可将19株H7N9病毒划分为2个基因型,其中18株病毒属于本实验室先前报道过的G2基因型,而DK/FJ SE0377/18病毒株单独形成一个新的基因型G10。动物感染试验表明,H7N9病毒对鸡呈现高致病性,对鸭致病力温和,对小鼠呈现出不同致病力,所有病毒均能在小鼠的肺以及鼻甲有效复制,部分病毒能在肾脏,脾脏以及脑中复制,其中4株病毒能引起小鼠不同程度的死亡。除CK/NX/SD007/2018、CK/LN/SD004/2019和CK/He B/S1118/2019不会引起小鼠体重下降外,其余病毒均能引起小鼠体重不同程度的下降,且CK/IM/SD010/2019的MLD50(Median mice lethal dose,MLD50小鼠半数致死量)为4.8 log10EID50。受体结合试验表明,目前监测到的H7N9病毒以高亲和力与禽型受体结合,但逐渐丧失了与人型受体结合的能力。抗原性试验表明,19株H7N9病毒明显的形成了两个抗原组:抗原I组包含疫苗株H7-Re2,CK/GX/SD098/17,和2018年分离到的11株病毒;抗原II组包含一株2018年的分离株CK/LN/SD014/18和7株2019年分离到的病毒株;且第二组病毒与Re-2疫苗株出现明显的抗原差异。为研究H7N9禽流感病毒的抗原性变异机制,我们分析了两个抗原组内病毒在HA1蛋白上的差异性氨基酸,发现8个氨基酸在抗原组I的病毒中是保守的,但在抗原组II的病毒中发生了突变。由此拯救出一系列点突变毒株,发现T135V,T160A突变能够增强CK/IM/SD010/2019与Re-2抗血清的反应性。也发现T135V和T160A的突变也会改变病毒与单抗的反应性。发现HA上135位和160位的突变会引入了两个糖基化位点,并由此导致了抗原漂移。以上研究结果对于我们了解疫苗免疫后我国H7N9亚型禽流感病毒的生物学特性变化具有非常重要的意义,为我国防控H7N9提供了重要的理论基础。
李刚[4]（2021）在《H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制》文中研究说明2013～2016间,H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对禽呈现低致病性,但在2016年底之后,逐渐被H7N9亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）所取代。相比于低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV）,H7N9亚型HPAIV不仅致病力强,而且与LPAIV的遗传距离不断加大。尽管目前H7灭活疫苗已由Rel更新至Re3,但仍难实现对部分流行株的覆盖,因此需要研制广谱高效的H7N9亚型AIV疫苗。净化是控制该疫病的有效手段,已列入我国政府制定的国家动物防疫中长期计划,但现有疫苗难以运用血清学诊断方法区别自然感染和疫苗免疫动物,因此迫切需要研制可用于区别自然感染和疫苗免疫动物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA）的标记疫苗用于 H7N9亚型AIV的净化。1.H7N9亚型HPAIV HA和NA基因供体毒株的筛选对实验室前期分离的 3 株 H7N9 亚型 HPAIVs A/Chicken/Guangdong/GD4/2017（GD4）、A/Chicken/Guangdong/HZLH2/2017（HZLH2）和 A/Chicken/Hebei/XT-3/2017（XT-3）进行空斑纯化及遗传进化分析,结果显示,3株病毒株的HA基因均属于长江三角洲系A/Duck/Zhejiang/12/2011（H7N3）所属分支,且与H7-Re2疫苗株的HA基因供体毒株A/Chicken/Guangxi/SD098遗传距离相近。3株毒HA蛋白裂解位点处均有连续碱性氨基酸的插入,包含两种高致病性毒株裂解位点模式,分别是PEIPKGKRTAR↓ GLF和PEIPKRKRTAR ↓ GLF,其中GD4和HZLH2属于第一种裂解位点模式,XT-3属于第二种裂解位点模式。3株毒HA蛋白受体结合位点均为186V和226Q,鹅红细胞凝集试验证明这些毒株均具有α2,3和α2,6双受体偏嗜性。热稳定性试验结果显示,在37℃和42℃条件下,GD4和HZLH2的HA效价保持不变,XT-3的HA效价（log2）由9降低为8;在56℃条件下作用90 min后,GD4、HZLH2、XT-3的HA效价（log2）分别由原来的10、10、9降低为7、8、2,由此判定GD4、HZLH2、XT-3分别属于中等热稳定型、热稳定型和热不稳定型病毒。在pH稳定性试验中,3株毒的HA效价在pH为3.0、5.0和9.0环境中均未出现明显降低,显示了良好的pH稳定性。生物学特性测定结果显示,GD4具有更高的HA效价和EID50滴度,分别达10 log2和8.17 log10/0.1 mL。静脉接种致病指数（Intravenous pathogenicity index,IVPI）试验显示,GD4 的致病指数为2.55,符合HPAIV特征。基于GD4制备油乳灭活疫苗并免疫SPF鸡,制备抗血清用于交叉血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验,结果显示,H7-Re2血清针对HPAIV HZLH2和XT-3毒株的交叉反应能力不足,GD4免疫血清针对H7-Re2标准抗原、GD4毒株、LPAIV JD/17和HPAIV HZLH2、XT-3具有更好的交叉反应性,因此选择GD4株作为供体毒株为后续疫苗候选株的构建提供HA和NA基因。2.H7N9 亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX 的构建及生物学特性分析本研究选用 H7N9 亚型 HPAIV A/Chicken/Guangdong/GD4/2017（GD4）为 HA 和NA基因供体毒株,并对HA基因裂解位点处连续碱性氨基酸进行缺失致弱,并根据前期针对H7亚型特异性抗原表位的筛选结果将其HA2区域的12肽（HA2-12）（463ADS EMDKLYERVKRQLRENA482）替换为 H3 亚型相应肽段（463ADSEMNKLFEKTKKQL RENA482）作为DIVA疫苗的标记,并与繁殖能力强的H9N2亚型鸡胚高度适应性AI V A/Chicken/Taixing/10/2010（TX）的内部骨架（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）进行组合,通过反向遗传技术拯救出一株H7N9亚型重组病毒株,命名为rGD4HALo-mH3-NA-TX。间接免疫荧光试验结果显示,该毒株对H7亚型HA2-12肽单抗3G10呈阴性反应,而野生型毒株GD4呈阳性反应,表明12肽段替换成功,可以作为DIVA的标记;连续传代 5 次后,rGD4HAIo-mH3-NA-TX 的 HA 效价为 10 log2,EID50 值为 8.50 log10/0.1 mL,与亲本株rGD4相当;在鸡胚感染试验中,GD4株可以在接种后约36 h致死鸡胚,而rGD4HALo-mH3-NA-TX在不同的稀释度下均不致死鸡胚,IVPI试验结果显示,所有接种r GD4HALo-mH3-NA-TX的鸡都存活且没有明显的临床症状,致病指数为0.01,表明该重组病毒致弱成功。3.H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫效力评价及DIVA特性鉴定交叉HI试验显示,与H7-Re2血清相比,H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫血清针对H7-Re2标准抗原、GD4毒株、LPAIV JD/17和HPAIV HZLH2和XT-3具有更好的交叉反应性;将H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX制备油乳剂灭活疫苗并免疫3周龄SPF鸡,评估体重变化、HI抗体水平及消长规律,结果显示,rGD4HALo-mH3-NA-TX一次免疫20 d内体重变化与PBS免疫组相当,表明该灭活疫苗安全性高;在一次免疫后2周,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组HI效价（log2）为7.15±1.63,高于 GD4（6.10±1.57）和 JD-cHA/17（5.40±1.64）免疫组,在一免后三周,rGD4HALo-mH3-NA-TX 免疫组 HI 水平（8.60±1.60）与 GD4 免疫组（8.70±1.22）相当,高于JD-cHA/17免疫组（8.00±1.72）。从抗体持续时间上分析发现,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组在第五周HI水平达到峰值（9.80±0.45 1og2）,随后缓慢下降,但在免疫后11周仍可达7.40±0.55 log2。交叉攻毒保护试验结果显示,当分别用JD/17和GD4以106EID50剂量滴鼻点眼攻毒时,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组体重增长水平均大于GD4、JD-cHA/17和 PBS 免疫组;rGD4HALo-mH3-NA-TX 免疫组能够提供针对 HPAIV（GD4）和 LPAIV（JD/17）更强的交叉排毒保护水平,分别为90%和80%,而JD-cHA/17免疫组分别为60%和80%,GD4免疫组分别为80%和70%。用建立的竞争抑制ELISA方法评价rGD4HALo-mH3-NA-TX的 DIVA 特性,结果显示,针对 GD4（56.79±3.76%）、JD/17（55.33±3.06%）、和 H7-Re2（48.56±3.98%）血清的抑制率显着高于阴性值（16.14%）,但针对rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫血清的抑制率为11.71±0.37%,低于阴性对照,表明所构建的重组毒株的免疫血清能够与野毒株感染血清加以区分,具有明显的DIVA特性。综上,H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX繁殖性能强、生产安全性高、具有DIVA特性,可针对H7N9亚型LPAIV和HPAIV提供高效的交叉免疫保护力,可作为一株理想的H7N9亚型AIV标记疫苗候选株。
裴宇茹[5]（2021）在《2018-2020年华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学和PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响》文中研究说明H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）自1992年在我国广东省鸡群中发现以来,已蔓延至全国大多数地区,呈地方流行性,难以彻底根除。经过多年的遗传进化,H9N2亚型AIV的致病性和传播性不断增加,给家禽养殖业造成严重的经济损失。此外,H9N2亚型AIV可以突破种间屏障直接感染哺乳动物包括人;并提供内部基因给其他亚型AIV产生如H5NX、H7N9、H10N8等人兽共患的新型AIV。因此,H9N2亚型AIV对公共卫生具有潜在威胁。近年来,虽然我国H9N2亚型AIV优势基因型仍然是G57或S基因型,但已有研究表明H9N2亚型AIV各基因片段发生了适应性变异,导致其跨宿主传播能力以及对哺乳动物的致病性增强。尤其是PB2基因上的一些适应性变异能增强病毒在哺乳动物中的复制和致病性。因此,有必要对H9N2亚型AIV进行定期流行病学监测、遗传进化及PB2基因关键分子标记的分析。本研究对2018年10月至2020年1月期间我国华东地区活禽交易市场和养鸡场的禽类进行每月流行病学监测,对H9N2亚型AIV全基因组进行遗传进化分析,并对PB2基因适应性分子标记对病毒在细胞内复制和聚合酶活性的影响进行分析。1华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查2018年10月至2020年1月,在华东地区活禽市场共采集1291份泄殖腔和喉头样品。通过SPF鸡胚培养和血凝血抑试验鉴定出408份AIV和NDV 阳性样品,病毒阳性样品占总样品数比例为31.58%（408/1291）。其中H9N2亚型AIV阳性样品178份（13.78%,178/1291）。同时,在养鸡场临床样品中分离鉴定105株H9N2亚型AIV,共获得H9N2病毒283株。在活禽市场408份阳性样品中,H9N2亚型AIV占比位居第一（43.63%,178/408）,其次是 H5 亚型（31.86%,130/408）、H3 亚型（15.68%,64/408）、NDV（7.35%,30/408）等。2018.10-2020.1 期间 H9N2 分离率（13.08%-14.5%）明显高于 2011.7-2016.9 期间分离率（0.21%-0.78%）,与 2016.10-2018.9（8.49%-15.12%）分离率没有明显差异。H9N2亚型AIV的主要宿主依旧是鸡（97.19%,173/178）;病毒样品的来源主要是华东地区江苏、山东和安徽等地;H9N2亚型AIV在炎热的夏季平均分离率达11.98%,无明显季节性差异。2华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株基因组遗传变异特征从H9N2分离株中选择277株进行HA和NA基因测序,获得277条HA基因、226条NA基因序列,根据HA和NA基因遗传进化结果选择55个代表性分离株进行全基因组测序,并运用MEGA 7.0最大似然法（Maximum Likelihood,ML）绘制全基因遗传发生树。分析结果显示,所有分离株的HA基因和NA基因均由病毒A/Duck/HongKong/Y280/97演化而来,分别分布在calde 15和calde 2;内部基因PB2基因和M基因由病毒A/Quail/HongKong/G 1/97演化而来,分别分布在clade 8和calde 3;PB1基因、PA基因、NP基因和NS基因由A/Chicken/Shanghai/F98/98演化而来,分别分布在clade 5、clade 7、clade 6和calde 7,因此分离到的H9N2亚型AIV毒株均属于S或G57基因型。其中HA基因已出现一个新的分支Group 3,该分支仅包含2018年末和2019年的毒株。所有毒株的HA蛋白均发生了影响病毒受体结合特性的第226位谷氨酰胺（Gln,Q）突变为亮氨酸（Leu,L）。大多数分离株（61.5%,139/226）NA基因与WJ57/12相似具有5个潜在糖基化位点,其余分离株有4个（25.67%,58/226）或6个（12.83%,29/226）潜在糖基化位点。聚合酶蛋白复合体发生多个与哺乳动物宿主适应性相关氨基酸位点,如 PB2 V147I（54/55）、A184T（50/55）、I292V（40/55）、A588V（53/55）,PB1 M317V（36/55）,PAK356R（50/55）、S409N（54/55）等,说明近两年H9N2病毒对哺乳动物宿主适应性不断增强的趋势。3 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究根据NCBI数据库下载和实验室测序获得的PB2基因,比较H和S基因型毒株PB2基因序列,筛选出8个适应性变异位点（H→S）:V147I、A184T、R353K、R389K、S590G、T598V、L648V和V661A。基于H9N2/S代表株AH320反向遗传平台,分别对PB2不同结构域进行组合突变,检测其聚合酶活性。结果显示,AH320PB2 I147V、T184A两个位点组合突变和单点突变模式下的聚合酶活性和病毒复制滴度均降低,其中AH320-I147V+T184A组合突变导致的聚合酶活性降低最为显着。同时,与母本毒AH320 相比,在病毒感染 24h,AH320-I147V、AH320-T184A 和 AH320-I147V+T184A突变毒显着降低PB2基因的mRNA、vRNA、cRNA表达量以及PB2蛋白、NP蛋白的表达水平。结果表明,PB2蛋白适应性变异147、184是影响S基因型H9N2毒株在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸。在2018-2020年期间,S（或G57）基因型的H9N2病毒仍然是华东地区活禽市场中AIV的主要亚型。HA蛋白和聚合酶复合体蛋白PB2,PB1和PA均显示出更多的哺乳动物适应性分子标记。此外,研究表明PB2蛋白147、184是影响S基因型H9N2病毒在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸位点。
李军[6]（2021）在《H5+H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的构建及免疫效果评估》文中研究说明1997年香港出现了 H5N1亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）,并引起了人的感染,此后该病毒蔓延到了亚洲、非洲和欧洲等多个国家和地区。截至到 2021年4月已感染了862人,并导致455人死亡（https://www.who.int/influenza/humananimalinterface/H5N1cumulativetable arc hives/en/）。除了H5N1 亚型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic influenza virus,HPAIV）外,H7亚型HPAIV也给养殖业和人类的健康带来很大影响。2013年3月,中国上海和安徽省的3名居民感染了 H7N9亚型AIV。据报道,截至2021年4月,H7N9流感病毒已感染1568人,导致616人死亡,病死率较高。（http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/H7N9/situationupdate.html）。H5N1和H7N9 HPAIV严重威胁养禽业和人类健康,因此需要一种高度安全和有效的疫苗来预防潜在的H5N1或H7N9亚型AIV的大流行。传统的流感疫苗大多以灭活苗为主,主要依赖鸡胚生产,这种灭活苗存在很多缺陷,比如当流感疫情暴发时,鸡胚供应不足,或者引起局部或全身过敏反应,以及免疫反应持续时间短等。因此急需一种安全有效的疫苗来替代传统的灭活疫苗。病毒样颗粒（Virus-like Particles,VLP）不含病毒的遗传物质,由有一种或多种病毒结构蛋白自行组装形成,其结构与天然病毒结构相似。VLP包含了较高密度的病毒表面蛋白,能够像天然病毒一样有效的进入到细胞,具有很好的免疫原性和安全性。此外,VLP的生产不依赖鸡胚,保证了禽流感大流行时疫苗的充足供应并且具有生产周期短和生产成本低等优点。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,制备了 H5 VLP疫苗和H5+H7 VLP二联疫苗。攻毒保护试验结果证明两种VLP疫苗免疫SPF鸡均可提供针对H5和H7亚型HPAIV 100%的临床保护,且与市售的商品化疫苗的免疫效果相当,这为H5N1和H7N9禽流感二联疫苗的制备提供了可参考的方法。1.H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备与免疫效果评估本研究基于H5N1亚型HPAIV clade 2.3.2.1d TT3株的HA基因构建了重组杆状病毒rBac-TT3-HA,与实验室前期构建的表达H7N9亚型HPAIV NA、M1基因的重组杆状病毒rBac-GD15-NA和rBac-GD15-M1分别以MOI=1共感染Sf9细胞,制备了 H5 VLP。同时以单独表达HA蛋白的重组杆状病毒rBac-TT3-HA制备的灭活疫苗和商品化灭活苗作对照。对4周龄SPF鸡进行单次免疫15 μg的剂量,结果发现所有疫苗组均可诱导宿主产生高效的血凝抑制（HI）抗体、病毒中和（VN）抗体和IgG抗体。用TT3病毒进行攻毒保护试验,发现在14天观察期内各疫苗组的SPF鸡均未出现临床症状和死亡,而PBS对照组的鸡在2天内全部死亡,说明H5 VLP疫苗可以提供针对H5N1亚型HPAIV 100%的临床保护。在攻毒后的第1、3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行病毒测定,结果显示各疫苗组均没有检测到排毒,而PBS对照组所有鸡均有排毒。同时组织脏器病毒载量测定结果显示,所有疫苗组均可完全抑制病毒在鸡体内的复制。肺脏组织病理切片结果发现,所有疫苗组均有效地减轻了免疫鸡感染病毒后的肺损伤,且以H5 VLP效果最显着。总之,这些结果表明,H5VLP疫苗提供了针对H5N1亚型HPAIV的完全临床保护,并可以完全抑制排毒和病毒在体内的复制,显着减轻肺脏的损伤。因此,本研究研制的H5 VLP为开发新型的H5N1疫苗提供了替代策略。2.H5+H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的构建及免疫效果评估本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统,分别制备了 H5和H7两种VLP,将两种VLP以相同浓度混匀后和佐剂以1:2的比例进行乳化制备H5+H7 VLP二价疫苗,同时以商品化灭活苗作为对照。SPF鸡单次免疫15 μg H5+H7 VLP疫苗和商品化疫苗均可诱导机体产生有效的HI抗体、VN抗体以及IgG抗体。用H5N1和H7N9亚型HPAIV进行攻毒,在14天观察期内疫苗组均没有观察到临床症状和死亡,而H5N1未免疫对照组在2天内全部死亡,H7N9未免疫组在5天内全部死亡,说明H5+H7 VLP疫苗可以提供针对H5N1和H7N9亚型HPAIV 100%的临床保护。在攻毒后的第2、4、6天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测,结果显示各疫苗组均没有检测到排毒。此外,组织病毒载量结果显示所有疫苗组均可完全抑制病毒在鸡体内的复制。值得注意的是,与商品化疫苗相比,H5+H7 VLP疫苗能更有效地减轻免疫鸡在感染病毒后的肺损伤程度。总之,这些结果表明,H5+H7 VLP疫苗提供了针对H5N1和H7N9亚型HPAIV100%的临床保护,并可以完全抑制免疫鸡的排毒以及病毒在体内的复制。此外,在减轻病毒感染导致的肺损伤方面,H5+H7VLP优于商品化疫苗。因此,本研究用两种VLP共同乳化的策略制备的二价VLP疫苗为其他多价疫苗的制备提供了的参考。
陈凯彪[7]（2021）在《H1和H3亚型猪流感病毒的双重荧光定量RT-PCR方法与遗传进化和生物学特性研究》文中研究表明猪因其呼吸道上皮同时具有人（α-2,6）和禽（α-2,3）流感病毒受体,被认为是人和禽流感病毒间发生基因重配的重要场所。有研究表明,我国近10年来猪群中广泛流行的猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）为欧亚类禽H1N1（Eurasian avian-like H1N1,EAH1N1）、2009 大流行 H1N1（Pandemic 2009 H1N1,Pdm09H1N1）以及类人 H3N2（Human-like H3N2,HLH3N2）。并且,这三种不同进化谱系的SIV持续不断地在猪群中发生着基因片段的重组,产生了众多基因型。值得注意的是,刘金华等学者报道的基因4型（Genotype4,G4）EAH1N1不仅在猪群中获得了优势流行,还具有较强的跨宿主传播潜能,对养猪业和公共卫生安全均构成了严重威胁。本研究基于目前我国猪群中主要存在H1和H3亚型SIV的现状,建立了同时检测并区分两种亚型SIV的一步法双重荧光定量RT-PCR（Real-time reverse-transcriptive PCR,RT-qPCR）方法,并将其应用于 SIV 的流行病学调查与分离鉴定,且进一步对临床分离株的遗传进化与生物学特性进行了分析。研究结果将为SIV的快速检测提供技术支撑,并为深入了解SIV的流行动态及致病特性提供理论参考。1.H1和H3亚型猪流感病毒一步法双重RT-qPCR方法的建立与应用本章通过比对近10年在我国流行的SIV HA基因序列,设计了一对能够同时匹配EA H1N1和Pdm09 H1N1的引物探针组以及一对匹配HL H3N2的引物探针组,并在此基础上建立了一种基于TaqMan-MGB探针的一步法RT-qPCR方法。该方法具有良好的灵敏性,最低能够检测到5copie/μL的质粒标准品以及2.1 EID50/mL的病毒RNA。此外,通过同时使用RT-qPCR和鸡胚接种对人工感染SIV的小鼠肺脏进行检测,RT-qPCR方法与传统的病毒分离法具有97.9%（47/48）的符合率。并且,该双重RT-qPCR在进行批间和批内重复性试验时,变异系数（Coefficientofvariation,CV）均小于3%,提示其具有良好的重复性。进一步地,应用该RT-qPCR方法对2019-2020年秋冬季屠宰场来源的猪鼻拭样品进行检测,结果显示H1亚型SIV的阳性数总体要高于H3亚型,此结果与其他研究人员所报道的情况一致,表明该RT-qPCR方法在H1和H3亚型SIV的快速检测方面具有较好的应用前景。2.猪流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析结合第一章中建立的RT-qPCR检测方法,从屠宰场所采集的598份鼻拭中成功分离出具有血凝活性的9株EAH1N1和4株HLH3N2病毒,并另从170份由猪场送检样品中分离获得1株EA H1N1病毒。接下来,基于这14株病毒的HA基因的测序结果,选取出其中的3株EAH1N1和2株HLH3N2亚型SIV进行全基因组测序与遗传进化分析。结果显示,这5株SIV均具有Pdm09 H1N1的PB2、PB1、PA、NP 和 M 基因以及三源重组（Triple reassortant,TR）SIV 的 NS基因,即它们的内部基因组成来源均与当前中国猪群中优势流行的G4 EAH1N1相 同。此 外,值 得注 意 的 是,EA H1N1 分 离 株A/swine/Huadong/11/2020（H 1N1）[HD 11]与 人 流 感 病 毒 株A/Shandong/00204/2021（H1N1）高度同源,两者的核苷酸一致性高达99.35%～99.89%,提示这两株H1N1可能具有共同祖先或两者间存在跨宿主传播。3.5株猪流感病毒的生物学特性研究进一步对第二章中已全基因测序的5株SIV进行了抗原差异性分析与受体结合能力、体外复制能力和对小鼠致病能力的测定。结果显示,3株G4 EAH1N1分离株之间及其与基因1型（Genotype 1,G1）、基因5型（Genotype 5,G5）之间和2株HL H3N2分离株之间及其与人源H3N2病毒间均不存在明显的抗原性变化,但部分EA H1N1毒株与Pdm09 H1N1存在一定的抗原性差异;5株SIV均呈现α-2,3和α-2,6双受体结合特性,其中HD11（H1N1）分离株明显偏嗜α-2,6受体;5株SIV在MDCK细胞上均复制良好,其中HD11（H1N1）在各取样时间点均具有相对最高的病毒滴度;106.0EID50攻毒剂量下的小鼠实验中,HD11（H1N1）与A/swine/Shandong/SG03（H1N1）这2个分离株表现出明显的致病性,分别导致100%和80%的小鼠死亡率,并在5株受试SIV中具有相对最高的组织病毒载量以及细胞炎性因子水平。进而提示,G4 EAH1N1跨宿主传播的潜能对公共卫生产生的威胁不容忽视,亟需加强监测。
凌蒙蒙[8]（2021）在《H9N2与H3N2亚型禽流感二价嵌合病毒样颗粒的构建及免疫效果评价》文中研究指明本研究以鼠白血病病毒的gag蛋白替换禽流感病毒的M1蛋白,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备了一种将H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白,以及H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白共同嵌合到gag蛋白上,以此构建二价嵌合禽流感病毒样颗粒,旨在获得同时诱导H9N2和H3N2亚型禽流感病毒特异性免疫的疫苗。具体构建过程为:首先构建p Fast Bac1-H9、p Fast Bac1-H3和p Fast Bac1-Mgag N2三种重组穿梭质粒,然后将其分别转化至E.coli DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得三种重组杆粒,即r Bacmid-H9、r Bacmid-H3和r Bacmid-Mgag N2。然后,将三种重组杆粒分别感染Sf9贴壁细胞,96h后收取P1代杆状病毒,盲传3代后获得P4代杆状病毒,即r BV-H9、r BV-H3和r BV-Bgag N2。测定P4代杆状病毒滴度后,将三种杆状病毒以MOI=3的感染剂量共感染Sf9悬浮细胞。96 h后将收取的细胞上清经20%-30%-60%蔗糖密度梯度离心纯化。血凝结果显示,该病毒样颗粒的血凝效价为28;western blot鉴定结果表明,其能够正确表达目的蛋白;在透射电镜下,所获得的病毒样颗粒粒子直径约为180 nm,表面嵌有纤突。由此表明,四种蛋白成功组装成了二价嵌合病毒样颗粒（bivalent chimeric virus-like particles,bc VLPs）。为了验证所制备的bc VLPs的免疫效果,对免疫鸡只进行了HI抗体效价测定和脾淋巴细胞增殖能力检测。HI抗体效价测定结果表明,免疫后三周内各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的HI抗体效价呈上升趋势,即使免疫后第35天,各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的HI抗体效价仍高于2log2,并且高剂量bc VLPs免疫组与疫苗免疫组对比显示,高剂量bc VLPs免疫组各时间点的HI与疫苗免疫组无显着差异（p>0.05）。由此表明bc VLPs具有较强的免疫原性,免疫后能诱导机体产生良好的体液免疫。脾淋巴细胞增殖能力检测结果表明,各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的SI随着时间延长而增长,到免疫后第3周达到高峰,并且高剂量bc VLPs免疫组与疫苗免疫组对比显示,高剂量bc VLPs免疫组各时间点的SI与疫苗免疫组无显着差异（p>0.05）。由此表明bc VLPs能诱导机体产生良好的细胞免疫。为了评价本研究制备的二价嵌合病毒样颗粒bc VLPs的保护效力,于免疫三周后用H9N2和H3N2亚型AIV进行滴鼻攻毒。体外排毒和体内载毒检测结果表明,高剂量和中剂量bc VLPs免疫组攻毒后,病毒的体外排毒时间和体内载毒时间短于疫苗免疫攻毒组,而低剂量bc VLPs免疫攻毒组的体外排毒时间和体内载毒时间短于疫苗免疫攻毒组或与疫苗免疫攻毒组的时间相当。此外,IHC方法检测抗原试验结果表明,免疫攻毒后第7天,低剂量免疫攻毒组和疫苗免疫攻毒组鸡只的肺脏和气管已检测不到病毒,而攻毒对照组鸡只的肺脏和气管中仍能检测到病毒。由此表明,bc VLPs免疫攻毒组体外排毒时间更短、体内病毒载量更低,因此bc VLPs疫苗能够更好地阻止病毒复制,有效地保护鸡只免受病毒的攻击。总之,本研究制备的bc VLPs能够诱导鸡只产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,可以有效保护鸡只免受同源病毒的攻击,为新型二价AIV疫苗的研制提供了新的疫苗制备策略。
宋祖晨[9]（2021）在《2013-2018年中国H3N2亚型猪流感病毒疫苗株的筛选及免疫原性研究》文中认为猪流感病毒（SIV）为正黏病毒科的A型流感病毒属成员,能够引起猪的急性、热性呼吸道疾病,传染性强。猪流感病毒虽然致死率低,但在流感病毒的遗传进化和生态分布中占据着重要地位。一方面,猪作为人流感病毒和禽流感病毒的共同易感宿主,不同来源的流感病毒可以在猪体内发生重排;另一方面,猪流感病毒还可以与人或禽细胞的表面受体结合,造成对人或禽的感染,在流感病毒的适应性进化中起着重要作用。因此,研制疫苗对猪流感进行防控不仅是养殖业的需要,还有着深远的公共卫生学意义。本实验室于2013～2018年在中国地区猪群中分离到9株H3N2猪流感病毒,对其表面基因进行遗传演化分析发现,9株分离病毒HA、NA之间的同源性较高,在进化关系上均属于近代人源谱系猪流感病毒。对9株病毒进行抗原性差异分析,所有病毒都可以发生交叉HI反应,但不同H3亚型病毒之间的抗原性具有一定的差异,其中A/swine/Guangxi/1659/2017（H3N2）具有较为广谱的抗原性。根据遗传进化分析和抗原性分析结果,本研究采用反向遗传技术,选取A/swine/Guangxi/1659/2017（H3N2）的表面基因作为H3N2亚型猪流感疫苗株表面基因的供体,以PR8病毒的内部基因为骨架,成功拯救出H3亚型重组流感病毒GX1659/PR8。对GX1659/PR8的表面基因测序,结果显示其基因序列和亲本病毒GX1659完全一致。用100 EID50剂量的GX1659和GX1659/PR8感染鸡胚,在不同时间测定鸡胚尿囊液的血凝效价和EID50,并绘制其生长曲线。结果显示,GX1659和GX1659/PR8分别在接种后60 h和48 h血凝效价达到峰值,GX1659/PR8效价滴度明显高于亲本病毒GX1659。可见与亲本病毒相比,重组病毒GX1659/PR8在鸡胚上的复制能力有较大的提升。基于GX1659/PR8毒株的以上特性,本研究进一步将GX1659/PR8作为种子毒株制备灭活疫苗,在小鼠和猪上评价其免疫原性和保护效力。结果显示,GX1659/PR8疫苗株能诱导小鼠和猪体内产生针对同源病毒的高滴度的HI抗体、NT抗体以及特异性IgG抗体。对小鼠二免后攻毒,通过鸡胚滴定法滴定小鼠脏器中病毒含量,结果表明该疫苗能显着的抑制同源病毒在动物机体内的复制;但是对于异源病毒,疫苗的保护效果并不理想,不能很好的抵御异源病毒的感染。本研究还进行了猪的主动免疫及免疫持续期实验,血凝抑制结果显示,该疫苗能对猪提供大于180天的持久保护。
潘舒心[10]（2021）在《禽流感（H5+H7）重组杆状病毒载体三价灭活疫苗对家禽免疫效果研究》文中进行了进一步梳理高致病性禽流感是由H5或H7亚型禽流感病毒（AIV）引起的一种重要人兽共患传染病,它不仅对家禽养殖业危害巨大,还严重威胁人类生命健康。疫苗免疫是有效控制高致病性禽流感的重要措施。昆虫细胞杆状病毒表达系统是一种适合大规模培养表达外源蛋白的有效方法,已成为疫苗开发的重要平台。国家禽流感参考实验室与洛阳某生物制品企业合作进行了禽流感（H5+H7）重组杆状病毒载体三价灭活疫苗（r BH5-11株+r BH5-12株+r BH7-2株）的研发。本研究对该杆状病毒载体疫苗实验室制品进行了安全性、有效性和对商品家禽的免疫效果评估,以期为禽流感重组杆状病毒载体疫苗的研制及应用提供科学依据。疫苗的安全性和有效性评估结果表明,以0.3m L/只单剂量和2m L/只大剂量疫苗接种的3周龄SPF鸡,在免疫后28d内无不良反应;3批疫苗常规剂量（0.3m L/只）分别接种SPF鸡后3周时,免疫鸡血清中针对H5亚型Re-11株和Re-12株、H7亚型H7-Re2株AIV的HI平均抗体效价在7.9log2～8.5log2之间,对照鸡血清中针对3种抗原的HI抗体均为阴性;将效力检验用H5N6、H5N1和H7N9亚型AIV按100CLD50的剂量,以滴鼻的方式攻毒后14d观察期内,所有免疫组鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得100%的免疫保护,对照鸡则全部发病死亡;HI抗体与攻毒保护关系研究结果显示,当H5和H7亚型HI抗体滴度达到3log2,可为攻毒免疫鸡提供抗死亡保护,达到4log2时,可提供完全免疫保护。该疫苗与市售商品疫苗的免疫抗体比较结果显示,常规剂量疫苗（0.3ml/只）免疫后产生的HI抗体滴度与市售疫苗无显着差异。以上结果表明3批次疫苗对鸡安全、有效,与市售疫苗免疫效果一致。疫苗对流行株的攻毒结果显示,将疫苗以常规剂量（0.3m L/只）接种SPF鸡后3周时,免疫鸡血清中针对3种抗原的HI平均抗体效价均在7.9log2以上,使用2株H5N6亚型AIV、2株H5N1亚型AIV及1株H7N9亚型AIV和1株H7N2亚型AIV流行株,以105CLD50/只滴鼻方式攻毒后,各免疫组均获得100%的免疫保护,对照鸡全部排毒死亡。结果表明,疫苗接种能够有效预防H5和H7亚型禽流感流行株的感染。疫苗持续期及其对商品家禽的免疫研究结果显示,21日龄SPF鸡一次免疫（0.3 m L/只）后2周至22周,其血清中H5和H7亚型HI抗体滴度始终高于4log2;80日龄商品蛋鸡在接种2次疫苗（0.5m L/只剂量）3周至22周,血清中针对3种抗原的HI平均抗体效价均在6log2以上;在免疫后3周和22周;分别用效力检验毒株H5N6、H5N1和H7N9亚型AIV按100CLD50的剂量,以滴鼻的方式攻毒后14d观察期内,免疫鸡不发病,不排毒,不死亡,对照鸡全部排毒死亡。2周龄商品鸭接种2次疫苗（0.5m L/只剂量）,在首次免疫后3周至20周,血清中针对3种抗原的HI平均抗体效价均在5.6log2以上,在免疫后3周和20周分别用H5和H7亚型禽流感效力检验毒株以100DLD50的剂量滴鼻攻击后,免疫鸭获得完全保护。本研究结果表明,禽流感（H5+H7）重组杆状病毒载体三价灭活疫苗（r BH5-11株+r BH5-12株+r BH7-2株）安全、有效,SPF鸡、商品鸡和商品鸭接种后均获得良好的免疫保护效果,本研究为禽流感疫苗的研制提供了新思路和科学依据。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 禽流感病毒概述 |
| 1.2.1 禽流感病毒的毒力因子 |
| 1.2.2 禽流感病毒的传播 |
| 1.3 历史上流感大流行与禽流感病毒的关系 |
| 1.4 H6亚型禽流感病毒的流行与监测 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂、载体、菌株和细胞 |
| 2.2 2014-2018年部分H6亚型AIVs的表面基因测序及HA基因的遗传演化分析 |
| 2.2.1 RT-PCR扩增 |
| 2.2.2 序列的测定 |
| 2.2.3 HA基因的遗传演化分析 |
| 2.3 H6亚型AIVs的纯化 |
| 2.4 H6亚型AIVs的遗传演化分析 |
| 2.4.1 RT-PCR扩增 |
| 2.4.2 序列的测定 |
| 2.4.3 H6亚型AIVs的遗传演化分析 |
| 2.5 H6亚型AIVs的贝叶斯进化分析 |
| 2.6 H6亚型AIVs的抗原性分析 |
| 2.6.1 病毒特异性血清的制备 |
| 2.6.2 交叉血凝抑制试验 |
| 2.7 H6亚型AIVs对小鼠的感染性评价 |
| 2.7.1 H6亚型AIVs的 EID50测定 |
| 2.7.2 H6亚型AIVs对小鼠的感染性试验 |
| 2.8 H6亚型AIVs的受体结合特性分析 |
| 2.8.1 蔗糖密度梯度离心浓缩纯化H6亚型AIVs |
| 2.8.2 固相结合ELISA试验检测H6亚型AIVs的受体结合特性 |
| 2.9 探究HA第141位缬氨酸的插入对病毒生物学特性的影响 |
| 2.9.1 重组病毒r He N124与r He N124-HAΔ141的拯救 |
| 2.9.2 针对He N124-HA和 He N124-HAΔ141单克隆抗体的制备 |
| 2.9.3 HA第141位缬氨酸的插入对抗原性的影响 |
| 2.9.4 HA第141位缬氨酸的插入对小鼠感染性的影响 |
| 2.9.5 HA第141位缬氨酸的插入对受体结合特性的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 2014-2018年H6亚型AIVs部分HA 基因的遗传演化分析结果及NA 基因各亚型的数量统计 |
| 3.2 H6亚型AIVs的分子特征 |
| 3.3 H6亚型AIVs的遗传演化分析结果 |
| 3.3.1 HA基因的遗传演化分析 |
| 3.3.2 NA基因的遗传演化分析 |
| 3.3.3 PB2基因的遗传演化分析 |
| 3.3.4 PB1基因的遗传演化分析 |
| 3.3.5 PA基因的遗传演化分析 |
| 3.3.6 NP基因的遗传演化分析 |
| 3.3.7 M基因的遗传演化分析 |
| 3.3.8 NS基因的遗传演化分析 |
| 3.3.9 H6亚型AIVs的基因型划分结果 |
| 3.4 H6亚型AIVs的贝叶斯分析结果 |
| 3.5 H6亚型AIVs的抗原性分析结果 |
| 3.6 H6亚型AIVs对小鼠的感染性试验结果 |
| 3.7 H6亚型AIVs的受体结合特性分析结果 |
| 3.8 HA第141位缬氨酸的插入对病毒生物学特性的影响 |
| 3.8.1 HA第141位缬氨酸的插入对病毒抗原性的影响 |
| 3.8.2 HA第141位缬氨酸的插入小鼠感染性的影响 |
| 3.8.3 HA第141位缬氨酸的插入对病毒受体结合特性的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 H6亚型AIVs基因来源的复杂多样性 |
| 4.2 H6亚型AIVs的抗原性 |
| 4.3 H6亚型AIVs与公共卫生安全 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒的基本特征 |
| 1.2 禽流感HA蛋白的糖基化修饰 |
| 1.3 H7N9 亚型禽流感概述 |
| 1.3.1 H7N9 亚型禽流感的起源与进化 |
| 1.3.2 H7N9 亚型禽流感的对家禽和哺乳动物致病性以及传播性 |
| 1.4 影响H7N9 关键生物表型的因素 |
| 1.4.1 宿主适应性 |
| 1.4.2 致病性 |
| 1.4.3 受体结合特性 |
| 1.4.4 传播性 |
| 1.4.5 耐药性 |
| 1.4.6 抗原性 |
| 1.5 H7N9 亚型禽流感的防控 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 H7N9 亚型禽流感病毒的遗传演化 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 实验主要试剂及仪器 |
| 2.1.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.1.3 病毒株 |
| 2.1.4 病毒RNA的提取以及RT-PCR |
| 2.1.5 序列测定 |
| 2.1.6 序列和进化树分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 关键氨基酸分析 |
| 2.2.2 HA基因的遗传演化 |
| 2.2.3 NA基因的遗传演化 |
| 2.2.4 内部基因的遗传演化 |
| 2.2.5 基因型划分 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 H7N9 亚型禽流感病毒对家禽和小鼠的致病性 |
| 3.1 试验材料和方法 |
| 3.1.1 试验毒株 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 病毒的纯化以及鸡胚半数感染量(EID_(50))测定 |
| 3.1.4 家禽感染试验 |
| 3.1.5 小鼠感染试验 |
| 3.1.6 小鼠半数致死量(MLD_(50))的测定 |
| 3.1.7 试验操作条件 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 H7N9 亚型禽流感病毒对鸭的感染性 |
| 3.2.2 H7N9 亚型禽流感病毒对鸡的感染性 |
| 3.2.3 H7N9 亚型禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 H7N9 亚型禽流感病毒的受体结合特性分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 病毒株 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.1.3 病毒纯化浓缩 |
| 4.1.4 固相结合ELISA试验 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 H7N9 亚型禽流感病毒的抗原性 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 病毒株 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 血清制备 |
| 5.1.4 交叉血凝抑制实验 |
| 5.1.5 抗原性差异分析 |
| 5.1.6 免疫攻毒保护实验 |
| 5.1.7 试验操作条件 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 H7N9 亚型禽流感病毒抗原性变异的分子机制 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 病毒及质粒 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 引物 |
| 6.1.4 重组pBD质粒构建 |
| 6.1.5 病毒拯救 |
| 6.1.6 HA-HI试验 |
| 6.1.7 Western Blot试验 |
| 6.1.8 HA蛋白的3D结构分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 IM19与SD098在HA1 上氨基酸差异分析 |
| 6.2.2 点突变病毒的抗原性分析 |
| 6.2.3 糖基化影响病毒的抗原性 |
| 6.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: H7N9亚型禽流感病毒的流行现状及其疫苗的研究进展 |
| 1 禽流感概述 |
| 2 H7N9亚型禽流感研究进展 |
| 3 H7N9亚型禽流感疫苗研制策略 |
| 4 针对禽流感病毒的DIVA策略 |
| 5 目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 H7N9亚型HPAIV HA和NA基因供体毒株的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H7N9亚型重组病毒株rGD4_(HALo-mH3-NA)-TX的构建及生物学特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H7N9亚型重组病毒株rGD4_(HALo-mH3-NA)-TX免疫效力评价及DIVA特性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒流行病学 |
| 1.1 H9N2亚型禽流感在我国的暴发和流行 |
| 1.2 H9N2亚型AIV的进化和重组 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒蛋白研究进展 |
| 2.1 血凝素蛋白(Hemagglutinin Proteins,HA) |
| 2.2 神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase Proteins,NA) |
| 2.3 聚合酶复合体蛋白(Polymerase Complex Proteins) |
| 2.4 核蛋白(Nucleoprotein,NP) |
| 2.5 基质蛋白(Matrix Proteins,M) |
| 2.6 非结构蛋白(Nonstructural Proteins,NS) |
| 3 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究进展 |
| 3.1 PB2蛋白的功能结构域 |
| 3.2 PB2蛋白关键氨基酸位点对病毒复制影响 |
| 4 结语 |
| 第一章 华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒与阳性血清 |
| 1.2 病毒运输液 |
| 1.3 SPF鸡胚和SPF鸡红细胞 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 其它材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 病毒分离 |
| 2.3 病毒亚型鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒亚型鉴定结果 |
| 3.2 近十年来活禽交易市场H9N2亚型AIV分离率 |
| 3.3 H9N2亚型AIV的分布特点 |
| 3.4 养鸡场H9N2亚型AIV的鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株基因组遗传变异特征 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 SPF鸡胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验器材 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 数据库和分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒RNA的提取与反转录 |
| 2.2 RT PCR扩增及电泳检测 |
| 2.3 PCR胶块产物回收纯化 |
| 2.4 DNA测序与序列处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 HA基因 |
| 3.2 NA基因 |
| 3.3 M基因 |
| 3.4 NP基因 |
| 3.5 NS基因 |
| 3.6 PB2基因 |
| 3.7 PB1基因 |
| 3.8 PA基因 |
| 4 讨论 |
| 第三章 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与质粒 |
| 1.2 细胞系与鸡胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验器材 |
| 1.5 数据库和分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 PB2蛋白适应性变异位点分析 |
| 2.2 构建单点和多点突变质粒 |
| 2.3 测定聚合酶活性 |
| 2.4 拯救病毒和生长动力学测定 |
| 2.5 相对荧光定量法检测PB2基因的mRNA、vRNA和cRNA表达 |
| 2.6 Wersten-blot检测蛋白表达水平 |
| 3 结果 |
| 3.1 组合位点突变对聚合酶活性的影响 |
| 3.2 组合突变毒株生长动力学 |
| 3.3 单点突变毒株聚合酶活性 |
| 3.4 单点突变毒株的生长动力学 |
| 3.5 单点突变毒株mRNA,cRNA,vRNA的表达水平 |
| 3.6 单点突变毒株的蛋白表达水平 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录: H9N2亚型禽流感病毒背景信息 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 综述 |
| 引言 |
| 1. 禽流感病毒及其致病性 |
| 1.1 禽流感病毒 |
| 1.2 禽流感病毒的致病性 |
| 2. 禽流感病毒疫苗研究进展 |
| 3. 病毒样颗粒疫苗研究进展 |
| 3.1 病毒样颗粒疫苗的研发技术 |
| 3.2 流感病毒VLP的细胞表达系统 |
| 3.3 禽流感病毒抗原在VLP疫苗研制中的应用 |
| 3.4 VLP疫苗的局限性和面临的挑战 |
| 3.5 VLP的未来趋势 |
| 第2章 H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备及免疫效果评估 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞、质粒和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 鸡胚及动物实验 |
| 1.5 试剂配制 |
| 1.6 主要分子生物学软件 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的纯化 |
| 2.5 重组杆状病毒的扩大培养 |
| 2.6 VLP的组装、浓缩、超离与鉴定 |
| 2.7 疫苗的制备 |
| 2.8 病毒的扩增及生物学特性 |
| 2.9 疫苗免疫实验 |
| 2.10 攻毒保护实验 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 rBac-TT3-HA的HA滴度测定 |
| 3.4 透射电镜观察 |
| 3.5 H5 VLP的HA滴度测定 |
| 3.6 H5 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.7 攻毒保护实验 |
| 4. 讨论 |
| 第3章 H5+H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备及免疫效果评估 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞和毒株 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 鸡胚与实验动物 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要分子生物学软件 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 重组杆状病毒的扩大培养 |
| 2.2 VLP的组装、浓缩、超离与鉴定 |
| 2.3 VLP疫苗的制备 |
| 2.4 疫苗免疫实验 |
| 2.5 TT3和GD15病毒的准备 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 透射电镜观察 |
| 3.2 H5 VLP和H7 VLP的HA滴度测定 |
| 3.3 H5+H7 VLP疫苗诱导的抗体应答检测 |
| 3.4 攻毒保护实验 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 猪流感病毒流行病学及其检测方法研究进展 |
| 1 猪流感病毒流行病学 |
| 2 猪流感病毒检测方法的研究进展 |
| 第一章 H1和H3亚型猪流感病毒一步法双重RT-qPCR方法的建立与应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 5株猪流感病毒的生物学特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 H9N2 和H3N2 亚型禽流感流行情况概述 |
| 1.1 H9N2 亚型禽流感流行情况 |
| 1.2 H3N2 亚型禽流感流行情况 |
| 第二章 流感疫苗研究进展 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 减毒活疫苗 |
| 2.3 亚单位疫苗 |
| 2.4 重组活载体疫苗 |
| 2.5 DNA疫苗 |
| 2.6 通用疫苗 |
| 2.7 病毒样颗粒疫苗 |
| 2.8 本研究的目的意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 H9N2 与H3N2 亚型禽流感二价嵌合病毒样颗粒的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 H9N2 与H3N2 亚型禽流感二价嵌合病毒样颗粒的免疫效果评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流感病毒概述 |
| 1.2 H3N2 亚型猪流感的流行病学 |
| 1.3 猪流感的诊断 |
| 1.3.1 病毒的分离与繁殖 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断技术 |
| 1.4 猪流感疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.4.2 减毒活疫苗 |
| 1.4.3 DNA疫苗 |
| 1.4.4 亚单位疫苗 |
| 1.4.5 通用疫苗 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 H3 亚型猪流感病毒的部分生物学特性分析及疫苗株的筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒纯化 |
| 2.2.2 病毒RNA提取、反转录 |
| 2.2.3 PCR扩增及目的片段的回收 |
| 2.2.4 基因组序列测定与分析 |
| 2.2.5 抗原性差异分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HA基因的分析 |
| 2.3.2 NA基因的分析 |
| 2.3.3 抗原性差异分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组H3N2亚型猪流感疫苗株的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与质粒 |
| 3.1.2 菌种、细胞和鸡胚 |
| 3.1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒的构建 |
| 3.2.3 重组病毒的拯救 |
| 3.2.4 重组病毒 GX1659/PR8 和亲本病毒 GX1659 生长曲线的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪流感病毒GX1659 表面基因HA和 NA扩增结果 |
| 3.3.2 重组病毒表面基因重组质粒的构建 |
| 3.3.3 重组H3N2 流感病毒GX1659/PR8 的拯救 |
| 3.3.4 重组H3N2 亚型猪流感病毒GX1659/PR8 的鉴定 |
| 3.3.5 GX1659/PR8和GX1659 在鸡胚上的生长曲线 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 疫苗的免疫效力评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 攻毒毒株和疫苗株 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 以小鼠为模型对疫苗的免疫效力评估试验 |
| 4.2.2 以猪为模型对疫苗的免疫效力评估试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 以小鼠为模型对疫苗的免疫效力评估结果 |
| 4.3.2 以猪为模型对疫苗的免疫效力评估结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 H5 亚型禽流感的流行与危害 |
| 1.3 H7 亚型禽流感的流行与危害 |
| 1.4 高致病性禽流感对人的危害 |
| 1.5 我国H5 亚型和H7 亚型高致病性禽流感的免疫防控 |
| 1.5.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.5.2 重组病毒活载体疫苗 |
| 1.5.3 DNA疫苗 |
| 1.5.4 杆状病毒载体疫苗 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 禽流感(H5+H7)重组杆状病毒载体三价灭活疫苗的安全性和有效性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒株、抗原及血清 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 试验动物、鸡胚及试验场所 |
| 2.1.4 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 安全性试验 |
| 2.2.1.1 单剂量接种的安全试验 |
| 2.2.1.2 超剂量接种的安全试验 |
| 2.2.2 免疫效力试验 |
| 2.2.2.1 免疫 |
| 2.2.2.2 HI抗体检测 |
| 2.2.2.3 攻毒试验 |
| 2.2.3 对H5 亚型和H7 亚型AIV异源代表株的攻毒保护效力试验 |
| 2.2.3.1 免疫 |
| 2.2.3.2 HI抗体检测 |
| 2.2.3.3 攻毒试验 |
| 2.2.4 HI抗体与攻毒保护关系试验 |
| 2.2.4.1 免疫 |
| 2.2.4.2 抗体测定与重新分组 |
| 2.2.4.3 攻毒试验 |
| 2.2.4.3.1 H5N6 亚型AIV攻毒试验 |
| 2.2.4.3.2 H5N1 亚型AIV攻毒试验 |
| 2.2.4.3.3 H7N9 亚型AIV攻毒试验 |
| 2.2.5 杆状病毒载体疫苗与市售商品疫苗的免疫效力比较 |
| 2.2.5.1 免疫及HI抗体检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 安全性试验结果 |
| 2.3.1.1 单剂量接种的安全试验结果 |
| 2.3.1.2 超剂量接种的安全试验结果 |
| 2.3.2 免疫效力试验结果 |
| 2.3.2.1 抗体检测结果 |
| 2.3.2.2 攻毒试验结果 |
| 2.3.3 杆状病毒载体疫苗对 H5 亚型和 H7 亚型异源代表株的攻毒保护效力试验结果 |
| 2.3.3.1 抗体测定结果 |
| 2.3.3.2 攻毒试验结果 |
| 2.3.4 HI抗体与攻毒保护关系试验结果 |
| 2.3.4.1 H5 亚型Re-11 株HI抗体效价与攻毒保护平行关系试验结果 |
| 2.3.4.1.1 HI抗体测定结果 |
| 2.3.4.1.2 重新分组及H5N6 亚型AIV攻毒试验结果 |
| 2.3.4.2 H5 亚型Re-12 株HI抗体效价与攻毒保护平行关系试验结果 |
| 2.3.4.2.1 HI抗体测定结果 |
| 2.3.4.2.2 重新分组及H5N1 亚型AIV攻毒试验结果 |
| 2.3.4.3 H7 亚型H7-Re2株HI抗体效价与攻毒保护平行关系试验结果 |
| 2.3.4.3.1 HI抗体测定结果 |
| 2.3.4.3.2 重新分组及H7N9 亚型AIV攻毒试验结果 |
| 2.3.5 杆状病毒载体疫苗与市售商品疫苗的免疫效力比较结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 禽流感(H5+H7)重组杆状病毒载体三价灭活疫苗对家禽的免疫持续期研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒株、抗原及血清 |
| 3.1.2 疫苗 |
| 3.1.3 试验动物、鸡胚 |
| 3.1.4 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 SPF鸡免疫抗体持续期试验 |
| 3.2.2 商品蛋鸡免疫抗体持续期试验 |
| 3.2.2.1 免疫 |
| 3.2.2.2 HI抗体检测 |
| 3.2.2.3 攻毒试验 |
| 3.2.3 商品鸭的疫苗安全性试验 |
| 3.2.3.1 单剂量接种的安全试验 |
| 3.2.3.2 超剂量接种的安全试验 |
| 3.2.4 商品鸭免疫抗体持续期试验 |
| 3.2.4.1 免疫 |
| 3.2.4.2 HI抗体检测 |
| 3.2.4.3 攻毒试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SPF鸡免疫抗体持续期试验结果 |
| 3.3.2 商品蛋鸡免疫抗体持续期试验结果 |
| 3.3.2.1 抗体测定结果 |
| 3.3.2.2 攻毒试验结果 |
| 3.3.3 商品鸭的疫苗安全性试验结果 |
| 3.3.3.1 单剂量接种的安全试验结果 |
| 3.3.3.2 超剂量接种的安全试验结果 |
| 3.3.4 商品鸭免疫抗体持续期试验结果 |
| 3.3.4.1 抗体测定结果 |
| 3.3.4.2 攻毒试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
