周华倩[1]（2021）在《牛支原体抗体检测胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用》文中研究指明牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）属于柔膜体纲、支原体目、支原体属的一种没有细胞壁的微小生物,能够引起牛的呼吸系统疾病、乳腺炎、中耳炎、结膜炎、脑膜炎和关节炎。牛支原体病在国内各地区呈现不同程度的暴发和流行,对养殖业造成严重经济损失。早诊断、早预防是防治关键技术环节,但目前尚无牛支原体商品化疫苗,且抗生素治疗效果有限。实验室常用的普通PCR、荧光定量PCR、ELISA抗体检测等已用于牛支原体实验室诊断,但便携式现场快速诊断方法才能真正满足现场诊断的需求。本研究目的是基于牛支原体P48和P80蛋白,建立用于现场快速检测牛支原体抗体的免疫胶体金层析试纸条。首先将pET32a（+）-p48和p ET32a（+）-p80重组表达质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中,挑取阳性单克隆菌落诱导表达和纯化,分别用SDS-PAGE、Western-blotting和BCA试剂盒检测纯化蛋白的纯度、反应原性和浓度。结果表明P80和P48与高免牛支原体血清具有较好的反应原性,所表达的蛋白的纯度和浓度为90%以上,均达到试纸条后续研制的要求。用检测牛支原体抗体的比利时Bio K 302、加拿大Bio vet和国生生物商品化试剂盒对实验室试验牛血清和来自甘肃、宁夏、内蒙等地的临床血清进行检测,建立了牛支原体血清库,各类血清的制备为试纸条各部分条件的优化奠定了基础。用柠檬酸三钠还原法制备35 nm胶体金颗粒,根据其检测方法确定所制备的金颗粒符合标记要求。对标记在胶体金上的重组蛋白P48、P80和鸡Ig Y抗体的最佳标记p H值和最佳标记蛋白量进行筛选,确定在1ml金溶液中加入0.1 mo L/L K2CO3的量分别为10μL、16μL和12μL时溶液可达到最佳标记p H值,加入P48、P80和鸡Ig Y的量分别是14μg、10μg和6μg时达到最佳标记量。确定金标蛋白和金标抗体最适使用浓度分别为D523=20.0和D523=5.0。梯度浓度的蛋白A+G（检测线）和羊抗鸡Ig Y抗体（质控线）,对标准阴阳性血清检测,确定其最适使用浓度均为1 mg/m L。试纸条对牛支原体标准阳性血清最低检测限为10-6,对里奇氏支原体等四种阳性样品检测结果均为阴性,表明该试纸条具有较好的敏感性和特异性。按2μL/cm将金标溶液喷在玻璃纤维上,1μL/cm速度喷涂蛋白A+G和羊抗鸡Ig Y抗体于酸纤维膜上,组装成可检测牛支原体抗体的试纸条。试纸条对牛支原体抗体最早检出时间的确定为在第14天可检出。对实验室制备的46份阳性血清和77份阴性血清,以及临床样品库中81份阳性血清和61份阴性血清进行检测评估,与商品化试剂盒检测结果比较,结果显示阳性符合率分别为100%和90.12%,阴性符合率分别为89.61%和98.36%。综上所述,本实验所研制的具有检测时间短、操作简单、易于保存、生产成本低、便于携带等特点的免疫胶体金层析试纸条可现场快速检测牛支原体抗体。
陈瑶[2]（2020）在《奇楠沉香内生菌多样性对结香进程的响应》文中进行了进一步梳理奇楠沉香是土沉香（Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg）中的一种嫁接树种,被认为是沉香中最上等和最珍贵的品种,是我国濒危树种,具有重要药用价值、经济价值和生态效益。本研究以广州省茂名市奇楠沉香心材作为研究对象,采用高通量测序技术,研究了奇楠沉香不同结香时期心材内生真菌、内生细菌的群落结构和多样性,结合心材理化性质,采用方差分析等方法对它们之间的关系进行分析,为人工促进奇楠沉香结香研究提供理论依据。主要研究结果如下:（1）奇楠沉香不同结香时期心材理化性质。奇楠沉香心材理化性质均存在不同程度的差异。随着创伤期延长,心材含水率逐渐降低,分别为35.48%、32.19%、25.56%。pH值、灰分也逐渐降低,分别是8.61、6.15、5.37和0.418%、0.320%、0.271%。心材的热水抽提物、苯-醇抽提物含量逐渐增加,分别为 2.890%、3.104%、3.450%和 2.974%、5.741%、7.825%。矿质元素K、Ca、Mg含量均显着降低,降幅分别为53.59%、26.20%、73.14%,S显着增加,增幅为27.55%。（2）奇楠沉香不同结香时期心材内生真菌群落结构及多样性。①经过高通量测序,共获得138,248条序列。②得到204个OTUs。门水平上,奇楠沉香心材内生真菌优势菌为:子囊菌门、担子菌门。在属水平上,奇楠沉香结香初期心材内生真菌优势菌群依次是:镰刀菌属（Fusarium）、枝孢属（Cladosporium）和帚枝霉属（Sarocladium）。结香中期心材内生真菌优势菌群依次为:镰刀菌属、Ophiosphaerella 属、Bulleribasidium 属、Cystobasidium 属、Tuber属、枝孢属。结香后期心材内生真菌优势菌群依次为:镰刀菌属、枝孢属、Cystobasidium属、Tuber属。在种水平上,结香初期心材优势菌为:Sarocladium zeae（8.84%）、Dicyma pulvinata 和 Zasmidium cerophillum。结香中期心材优势菌为:茄皮腐镰孢Fusarium solani（17.18%）、粘红酵母 Rhodotorula glutinis（3.71%）和Rhynchogastrema complexa、Parastagonospora nodorum。结香后期心材优势菌为:茄皮腐镰孢（17.34%）、Rhynchogastrema complexa、Parastagonospora nodorum。③奇楠沉香结香中期心材内生真菌丰富度大于结香初期及结香后期;结香初期Pielou’s evenness指数较低,中后期均匀度较高。多样性指数综合分析表明结香中期内生真菌多样性较高。（3）奇楠沉香不同结香时期心材内生细菌群落结构及多样性。①经过高通量测序,共获得191,092条序列。②得到43个OTUs。变形菌门为奇楠沉香结香中期和后期心材内生细菌的优势门类,占比分别达92%和96%。属水平上,奇楠沉香结香初期心材内生细菌优势菌群依次是:青枯菌属（Ralstonia）、单孢菌属（Pelomonas）、放线孢菌属（Actinomycetospora）、短杆菌属（Brachybacterium、Curtobacterium）和支原体属（Mycoplasma）。结香中期心材内生细菌优势菌群依次为:青枯菌属、单孢菌属、假单孢菌属（Pseudomonas）、鞘脂菌属（Sphingobium）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、异样根瘤菌属（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）和伯克氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）。结香后期心材内生细菌优势菌群依次为:青枯菌属、假单孢菌属、鞘脂单胞菌属、异样根瘤菌属和伯克氏菌属、单孢菌属、鞘脂菌属和Hansschlegelia属。在种水平上,结香初期心材优势菌为旁短杆菌Brachycterium paraconglomeratum（3.33%）和肺支原体Mycoplasma pulmonis。结香中期心材优势菌为:热带根瘤菌Rhizobium tropici、肺支原体Mycoplasma pulmonis（3.66%）、绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa（9.52%）、甲氧菌Methylobacterium radiotolerans、牛肝菌 Labrys portucalensis和鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.CC-MHH0546。结香后期心材优势菌为:热带根瘤菌（11.59%）、肺支原体（3.26%）、多芳香单孢菌Sphingomonas polyaromaticivorans（9.43%）和甲氧菌,其余物种丰度均低于2%。③奇楠沉香结香中后期内生细菌群落结构多样性大于结香初期,多样性指数分析表明结香中期心材内生细菌种类较丰富,优势属突出,且分布均匀。
安泓霏[3]（2020）在《宁夏地区牛子宫内膜炎流行病学调查及组方泡腾栓的研制》文中认为宁夏具有适合发展奶产业和肉牛产业的自然条件,但中小型规模牛场和散养户的饲养量基数比较大,饲养水平不高导致产科疾病多发,尤其是牛子宫内膜炎最为常见。为了更好的治疗子宫内膜炎,本研究对宁夏6个市、县（区）开展牛子宫内膜炎流行病学调查,对导致子宫内膜炎的主要病原菌进行分离鉴定和药敏试验,针对性地研制出一种治疗牛子宫内膜炎的中药组方泡腾栓,并对该药物进行安全性评价和临床治疗实验,收到了良好疗效。具体研究内容如下:1.随机调查宁夏33个规模化养殖场和50个散养户,共抽检2 160头牛,结果显示:2016年1月12月宁夏平均发病率约为27.0%,各市、县（区）之间的发病率差异不显着（P>0.05）,发病率与季节气候、饲养管理水平和牛年龄有相关性:发病率春秋季节较低,冬夏季节较高;规模养殖场全年发病率为18.5%,显着低于散养户发病率35.5%（P<0.05）;随着牛年龄增长,子宫内膜炎发病率呈现高-低-高的趋势,其中4岁时发病率最低为17.17%,8岁时发病率最高为42.0%;不同品种的牛发病率差异不显着（P>0.05）。2.从宁夏6个市、县（区）抽检的180头份牛子宫内膜炎病料样品中共分离鉴定出20种细菌。其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球菌和无乳链球菌检出率较高,检出率分别为53.3%、50.0%、28.9%和18.3%,其他细菌检出率较小;银川市和利通区以单一感染为主,单一感染率分别为60%和53.3%,其它地区均以混合感染为主;在单一感染的病例中,银川市、利通区、青铜峡市的优势病原菌为金黄色葡萄球菌,西吉县、彭阳县的优势病原菌为大肠杆菌;在混合感染的病例中,各地检出的病原菌的种类复杂,不具有规律性;通过药敏实验,测得各市、县（区）分离的主要致病菌对大部分抗菌药物都产生了耐药性,磺胺类药物耐药率最高,β-内酰胺类药物、氨基糖苷类药物和大环内酯类药物次之,喹诺酮类药物耐药率最低。3.选定泡腾栓作为研制药物剂型,对引起宁夏地区牛子宫内膜炎的主要致病菌进行中药体外抑菌试验,采用正交法筛选中药组方和泡腾栓辅料,确定中药组方为:连翘、黄连、黄柏、蒲公英、升麻、红花、柴胡、当归,泡腾栓辅料配比为:酒石酸∶碳酸钠碳酸氢钠混合物（1∶9）∶甘露醇乳糖混合物（1∶10）∶十二烷基硫酸钠∶中药干浸膏粉=0.25∶0.2∶0.15∶0.1∶0.3,确定的制粒工艺为滚压干法制粒,共制备三个批次的中药组方泡腾栓。经过质量检验,该处方及配比组成的颗粒外观合格,硬度大于6kg/cm2,脆碎度在0.5%以下,崩解时限在5min以内,重量差异在±5%以内,最小发泡量大于6mL,泡沫持续时间在5558min之间,变形温度在38.538.9°C,融变时限低于30min,需氧菌数量每克小于100cfu,霉菌和酵母菌每克小于10cfu,均符合药典规定,满足使用需求。通过小鼠急性毒性实验,测得该中药组方泡腾栓的LD50≈5 788.32mg,属于实际无毒物质,家兔阴道大剂量给药后应激反应较小,对家兔眼睛有轻度刺激性,符合黏膜用药要求。经过临床治疗实验,中药组方泡腾栓治疗急性和慢性子宫内膜炎的有效率均为90%,与抗生素恩诺沙星相比,不但治疗有效率高,还能更快促进牛恢复发情周期,大幅提高受孕率,尤其是对慢性子宫内膜炎的疗效显着,临床上有较好的应用前景。
刘星丽[4]（2020）在《家禽支原体和滑液囊支原体的分离鉴定和基因组序列分析》文中认为支原体种类繁多,能够感染禽类的支原体至少有28种。大多数支原体属于条件性致病菌,仅有少数支原体可导致禽类发病。支原体单独或混合感染不仅可导致家禽产生慢性呼吸道病、关节炎和气囊炎等,而且还可导致禽类生长发育不良、生产性能降低等,产生十分严重的经济损失。本研究从发生呼吸困难的孔雀和发生瘫痪的商品肉鸡分别分离出两种不同的支原体,进行了病原学鉴定、诊断方法建立和全基因组测序研究。现汇报如下:1.支原体的分离鉴定、生物学特性和16S rRNA基因系统发育分析（1）孔雀源支原体按照常规方法对发病孔雀进行支原体的分离和纯化、形态学鉴定和生理生化实验,进行了16S rRNA基因测序,结果分离出一株家禽支原体（Mycoplasma gallinaceum,MGC）,与家禽中常见的鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）和滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）同属于支原体科、支原体属,但为不同的种,命名为Peacock20181011。该菌生长速度较快,经过23次纯培养后,液体培养1220 h即可观察到培养基颜色由红变橙黄,而MG和MS等其它支原体一般在4872 h才发生颜色的改变。结合16S rRNA基因测序分析显示,该菌与MGC经典模式菌株NCTC10183（LR214950）的相似性为99.8%,而与家禽经典菌株MG、MS的相似性仅为73.9%和88%。综合比较显示,该菌株是一株MGC新菌株。致病性研究表明,该菌株不会引起SPF鸡病变,不会致死鸡胚,但可引起鸡胚发育迟缓以及爪部蜷缩等病变,具有一定的鸡胚致病性。最小抑菌浓度实验（minimum inhibitory concentration experiment,MIC）结果显示该菌对单硫酸卡那霉素和氟苯尼考等6种药物敏感,为临床该病的治疗用药提供了依据。（2）肉鸡源支原体利用常规的支原体分离鉴定方法从发生瘫痪的肉鸡关节液中分离出一株支原体,该菌株与MS模式菌株WVU1853高度同源,16S rRNA基因相似性为98.5%,而与MGC、MG、鸡支原体和火鸡支原体的相似性分别为92.8%、77.4%、89.5%和90.1%。结合理化特征和16S rRNA基因序列同源性,确定新分离菌株属于MS,命名为WF2018。鸡胚接种试验表明,MS可以致死SPF鸡胚,引起鸡胚发育迟缓,致病性明显强于MGC。MIC结果则与MGC相同。2.建立了检测MGC的PCR方法和针对MS的LAMP方法（1）PCR诊断利用Primer 5软件,针对MGC 16S rRNA基因序列具有种属特异性的高保守区段,设计1对PCR引物,进行了PCR反应温度优化、特异性和灵敏度评估。结果表明,其反应最佳退火温度为52℃,最小检测剂量为1.07 pg/μL,且与MG、MS和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）等无交叉反应,具有较好的特异性和灵敏度,适合于临床MGC的快速诊断。（2）LAMP通过Primer Explorer V5软件,针对MS VLHA基因具有种属特异性的高保守区段设计LAMP引物,并进行反应条件优化。结果表明,LAMP反应的最佳温度为63℃,扩增时间为60 min,最低检测的剂量为807 fg/μL,且与MG、MGC和A.laidlawii等反应阴性,为MS的特异性诊断提供了方法。3.分离株的基因组序列测定和功能分析利用二代和三代测序技术,分别对Peacock20181011和WF2018进行了全基因组测序,并进行基因组成分和功能分析。（1）Peacock20181011菌株该菌株基因组全长为1 183 913 bp;预测有898个基因;含有非编码RNA（non coding RNA,ncRNA）46个,其中5S rRNA 3个拷贝,16S rRNA和23S rRNA各4个拷贝;（G+C）mol%含量为28.7%。该菌与MGC菌株模式菌株NCTC10183和南非流行株B2096 8B在基因组方面存在一定的差异。对Peacock20181011基因组进行了COG和GO数据库注释,发现其功能基因较多;同时,进行了KEGG数据库比对,预测了其代谢通路,发现该菌株具有较为完整的糖酵解/糖异生代谢途径。数据库比对显示,含有20个毒力基因和2个四环素耐药基因。（2）WF2018菌株该菌株基因组全长为809 346 bp;预测有743个基因;含有48个ncRNA,其中含有3个拷贝5S rRNA,16S rRNA和23S rRNA各有2个拷贝;（G+C）mol%含量为28.36%。该菌与MS模式菌株NCTC10124和我国地方流行株HN01等基因组信息相似。同MGC基因组分析方法相同,对该菌株进行了COG、GO和KEGG等数据库比对分析,发现该菌株与经典菌株GX11-T的蛋白功能分类和部分代谢通路存在一定的差异。数据库比对显示,共有67个毒力基因,其中54个为VLHA,还预测到该菌株有8个抗生素抗性基因,319和631号基因与氟喹诺酮抗生素抗性相关,707号基因与利福霉素的耐药性相关。
辛闻婷,杨媛媛,王馨宇,吴东,李灵恩[5]（2019）在《实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立》文中研究表明目的建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果该方法在模板浓度为5×100～5×106copies/μL之间呈良好的线性关系（R2=0. 9972）且扩增效率为98. 11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3. 33%（2/60）、1. 67%（1/60）,细胞样品支原体检测阳性率均为5%（3/60）。结论本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。
李晓娴[6]（2018）在《SPF级实验小鼠嗜肺巴斯德杆菌的分离鉴定》文中研究指明嗜肺巴斯德杆菌是SPF级实验小鼠必须排除的特定病原体之一,它的存在会加重其他病原的感染,除了损害小鼠自身的健康和生产,还会对科研实验造成不可预知的影响。由于实验动物的特殊性,无法通过药物治疗嗜肺杆菌,因此主要靠饲养管理来预防,加上定期有效的抽样检测作为保障的关键手段。本试验目的是通过对比国家标准推荐的生化培养检测方法和PCR检测技术,来寻找一个更高效、可靠的鉴定方式,为SPF级实验小鼠建立更好的健康监测程序。试验一、国标法检测SPF级小鼠嗜肺巴斯德杆菌本试验选取5个品系不同性别的2月龄到12月龄SPF级的实验小鼠,分为实验种群和哨兵鼠。严格按照屏障设施的SOP进行饲养管理,饲养1个月以上用于该试验。按照国家标准推荐的方法,共检测267只小鼠,经过剖检取样,分离培养,结果显示符合菌落形态,染色为革兰氏阴性小杆菌的分离株共1 16个。进一步再经生化鉴定,符合DHL培养基不生长,硝酸盐还原阳性、尿素酶阳性、过氧化氢阳性、硫化氢阳性、明胶阴性等的菌株判定为嗜肺杆菌阳性,不符合判为阴性。本试验结果显示严格意义上全部符合阳性判断标准的分离株为0。在试验过程中阴性判定的情况有:无菌落生长;生长菌落为革兰氏阳性球菌;生化项目不符合等（如硫化氢阴性、硝酸盐阴性、尿素酶阴性等明显不符的项目）。通过增加生化项目,前后共使用了 33个生化指标,但没有特异性的生化指标可以有效地鉴定嗜肺巴斯德杆菌。目前只依靠国标推荐的检测方法会造成很大的漏检和误判。试验二、嗜肺巴斯德杆菌的PCR鉴定与鉴别本试验取相同饲养条件的小鼠542只,经剖检分离培养,挑取符合菌落形态及染色特征的,转接血平板进行纯化培养,抽提纯化细菌DNA,进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳,在1030bp左右有目的片段的菌株共91个,PCR检测嗜肺巴斯德杆菌阳性率为1 7.5%。为了进一步验证细菌的特异性,再用细菌通用引物进行PCR扩增后测序,进行序列比对后发现,嗜肺巴斯德杆菌阳性菌株共57个,1个肠球菌,1个肠杆菌,6个粪肠球菌,1个表皮葡萄球菌,1个巴氏葡萄球菌,3个芽孢杆菌,1个鹑鸡肠球菌,1个奇异变形杆菌,14个放线杆菌,2个博代氏杆菌,另有3个菌株测序未成功。嗜肺巴斯德杆菌阳性检出率为10.96%,PCR扩增的准确率为62.64%。由此可见,嗜肺杆菌在实验动物设施中存在一定比例的感染,通过传统分离纯化培养,结合PCR扩增技术和测序比对,能极大地增加检出率和准确度。从结果数据中可以看出,通过不间断的对设施小鼠的检测,可以很好的了解病原菌在动物品系中的分布情况和时间段上的感染特征。
祝岩波,徐增年,魏世锦,郑龙,尤红煜,孟钰榕,刘福英,梁晓亮,王俊霞[7]（2017）在《实验动物四种病原体多重PCR方法的建立与应用》文中研究表明目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Genebank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌（356 bp）、支气管鲍特杆菌（237 bp）、支原体（266 bp）和肺炎克雷伯杆菌（142bp）的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。
祝岩波,徐增年,魏世锦,郑龙,尤红煜,孟钰榕,刘福英,梁晓亮,王俊霞[8]（2017）在《多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与应用》文中指出目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Genebank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌（356 bp）、支气管鲍特杆菌（237 bp）、支原体（266 bp）和肺炎克雷伯杆菌（142 bp）的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。
祝岩波,徐增年,魏世锦,郑龙,尤红煜,孟钰榕,刘福英,梁晓亮,王俊霞[9]（2017）在《实验动物四种病原体多重PCR方法的建立与应用》文中研究指明目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Gen Bank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌（356 bp）、支气管鲍特杆菌（237 bp）、支原体（266 bp）和肺炎克雷伯杆菌（142 bp）的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。
祝岩波[10]（2017）在《实验动物病原体多重PCR检测方法的建立与初步应用》文中进行了进一步梳理目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物作为人类的替身承担药物安全和治疗效果,其质量直接影响众多领域科学实验的准确性。随着我国科研水平的不断提高,研究人员对实验动物的微生物质量控制要求越来越严格。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、多杀巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、支气管鲍特杆菌（Bordetella bronchiseptica）、肺支原体（Mycoplasma pneumoniae）、泰泽氏菌（clostridium piliformis）、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）等七种病原体是我国实验动物微生物质量控制需要排除的病原体,也是实验动物常见的易感病原体。目前对实验动物携带的病原体主要依靠分离纯化培养、菌落形态、镜下观察及生化试验等方法进行鉴定,检测周期长,费用高,并且需要有经验的检测人员进行判定,漏检、误判时有发生。PCR（Polymerase Chain Reaction）技术以其简便、快速、准确等优点已广泛用于医疗和卫生行业,但实验动物的微生物质量控制还未将PCR检测方法纳入,更没有多重PCR方法,这已成为多种病原体或大样本简单、快速、准确鉴定的掣肘。多重PCR（multiplex PCR）可以在同一反应体系中扩增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高效等优点。用于实验动物病原微生物检测,可以同时检测多种病原体,适合大样本的检测与鉴定,具有高灵敏性、高特异性和低成本等优点。多重PCR在其他行业应用较多,然而,目前应用在实验动物病原微生物检测的研究很少。本研究目的是针对七种实验动物病原菌金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌、肺炎克雷伯杆菌,建立多重PCR检测方法,并与传统的微生物检测方法或血清学方法比较,验证多重PCR检测方法的可操作性和准确性。方法:1、标准菌株的培养和DNA提取:将金黄色葡萄球菌标准株接种到SP琼脂培养基,绿脓杆菌标准株接种到NAC琼脂培养基,肺炎克雷伯杆菌接种到dhl琼脂培养基,37℃培养18-24h;多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌接种到血琼脂培养基,37℃培养24-48h;肺支原体接种到液体培养基中,一周后进行观察收集。按照细菌提取试剂盒方法提取各种病原体的dna,泰泽氏菌dna由中国食品药品检定研究院惠赠。2、引物的设计:通过查阅文献和primer5.0软件设计金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌的特异性引物,使用blast分析引物特异性;进行pcr扩增,测序鉴定。3、特异性实验和敏感性实验:pcr扩增非目的菌进行特异性实验;将模板dna按照10倍的比例进行梯度稀释,检测pcr敏感性。4、四组多重pcr检测方法的建立和初步应用4.1将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,同时加入16srrna的引物作为内质控,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性。应用该多重反应体系检测人工感染的粪便样本和76例新鲜大、小鼠粪便样本,同时采用传统检测方法进行检测。4.2将多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体三种病原微生物在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。4.3将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌和肺支原体五种病原微生物在同一个反应体系中扩增,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系,应用该多重反应体系检测人工感染病原菌的粪便、气管分泌物、棉拭子和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。4.4将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和泰泽氏菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测112例实验动物粪便样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。结果:1、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌在琼脂培养基上生长,肺支原体液体培养颜色由红色变为黄色。2、获得10对特异性引物,并通过blast比对验证引物的特异性,扩增产物大小分别为金黄色葡萄球菌（153bp）、绿脓杆菌（600bp）、肺炎克雷伯杆菌（368bp）、通用引物（520bp）、多杀巴氏杆菌（356bp）、支气管鲍特杆菌（237bp）、肺支原体（266bp）、泰泽氏菌（639bp）、绿脓杆菌（197bp）,扩增产物测序结果均与genebank中相应序列一致。3、pcr特异性和敏感性实验:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌特异性实验结果,除标准菌株扩增出阳性条带外,其它菌种均扩增阴性。敏感性实验:金黄色葡萄球菌dna检测最低限为1pg;绿脓杆菌dna检测最低限为10pg;肺炎克雷伯杆菌dna检测最低限为10pg;多杀巴氏杆菌dna检测最低限为1pg;支气管鲍特杆菌dna检测最低限为10pg;肺支原体dna检测最低限为1pg;泰泽氏菌dna检测最低限为100pg,对应的拷贝数600copies/μl。4、四组多重pcr检测方法:4.1建立金黄色葡萄球菌（153bp）、绿脓杆菌（600bp）、肺炎克雷伯杆菌（368bp）和16srrna（520bp）的多重pcr检测方法。应用多重pcr方法检测人工感染病原菌样本,检测结果均阳性;76份大、小鼠粪便样本多重pcr检测结果显示1份小鼠粪便样本绿脓杆菌阳性,其余样本检测阴性;传统培养检测方法检测结果与多重pcr检测结果一致。4.2建立多杀巴氏杆菌（356bp）、支气管鲍特杆菌（237bp）、肺支原体（266bp）的多重pcr检测方法;应用多重pcr方法检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔棉拭子样本多重pcr检测结果19例兔棉拭子样本多杀巴氏杆菌阳性,9例大鼠棉拭子肺支原体阳性;多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌传统培养检测方法检测结果全部阴性,肺支原体血清学方法检测9例阳性。4.3建立金黄色葡萄球菌（153bp）、绿脓杆菌（600bp）、多杀巴氏杆菌（356bp）、支气管鲍特杆菌（237bp）和肺支原体（266bp）的多重pcr检测方法;应用多重pcr方法检测人工感染的粪便、气管分泌物和棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔粪便和棉拭子样本多重PCR检测结果1例小鼠粪便绿脓杆菌阳性;传统培养检测方法检测结果与多重PCR结果一致,肺支原体血清学方法检测肺支原体全部阴性。4.4建立金黄色葡萄球菌（153bp）、绿脓杆菌（197bp）和泰泽氏菌（639bp）的多重PCR检测方法。应用多重PCR方法检测112例大小鼠、兔粪便样本检测结果全部阴性,传统培养鉴定方法检测金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌结果阴性,血清学方法检测泰泽氏菌全部阴性。结论:针对七种病原体金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌和肺炎克雷伯杆菌,根据病原菌特点和检测取材方法,分别建立了四组多重PCR检测方法。四种组合均有良好的敏感性和特异性,人工感染的样本均检测结果阳性。多重PCR检测方法的初步应用显示,多重PCR具有良好的可操作性和准确性,检测结果与传统培养或血清学检测方法一致,有些样本传统培养方法或血清学检测方法未检测出的,但多重PCR体系检测出阳性结果。本方法的建立为今后多重PCR应用于实验动物微生物的检测奠定了基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛支原体病原的研究现状 |
| 1.1.1 牛支原体的生物学性状 |
| 1.1.2 牛支原体的流行病学 |
| 1.1.3 牛支原体的致病机理 |
| 1.1.4 牛支原体的免疫学研究 |
| 1.1.5 牛支原体疫苗研究现状 |
| 1.1.6 牛支原体的诊断方法研究进展 |
| 1.2 胶体金免疫层析技术研究简介 |
| 1.2.1 胶体金免疫层析技术研究进展 |
| 1.2.2 胶体金溶液的制备 |
| 1.2.3 胶体金的质量鉴定 |
| 1.2.4 胶体金免疫层析技术原理 |
| 1.2.5 胶体金免疫层析技术的分类 |
| 1.2.6 胶体金免疫层析技术的特点 |
| 1.2.7 胶体金免疫层析技术的应用领域 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 牛支原体重组P48 和P80 蛋白的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 主要溶液配制 |
| 2.1.3 P48 和P80 重组质粒的转化 |
| 2.1.4 P48 和P80 重组蛋白的表达 |
| 2.1.5 P48和P80 重组蛋白的纯化和SDS-PAGE分析 |
| 2.1.6 Western blot对重组蛋白的反应原性鉴定 |
| 2.1.7 重组蛋白的浓缩和浓度测定 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组蛋白P48 和P80 的表达分析 |
| 2.2.2 重组蛋白P48 和P80 的纯化与分析 |
| 2.2.3 重组蛋白Western Blot的分析 |
| 2.2.4 重组蛋白的浓缩和浓度测定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 牛支原体血清库及阴阳性血清的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂和仪器 |
| 3.1.2 人工感染血清样品库的制备 |
| 3.1.3 人工免疫血清样品库的制备 |
| 3.1.4 临床阳性血清样品库的制备 |
| 3.1.5 临床阴性血清样品库的制备 |
| 3.1.6 标准阴性血清的制备与检测 |
| 3.1.7 标准阳性血清的制备与检测 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 牛支原体抗体检测血清库的制备 |
| 3.2.2 标准阴阳性血清的制备和检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 牛支原体病抗体检测试纸条最适条件的确定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 主要溶液配方 |
| 4.1.3 胶体金颗粒的制备及稳定性观察 |
| 4.1.4 胶体金标记P48和P80蛋白最佳结合pH值选择 |
| 4.1.5 胶体金标记P48 和P80 蛋白最佳标记量的选择 |
| 4.1.6 金标P48 和P80 抗原的制备 |
| 4.1.7 鸡IgY抗体与胶体金最佳结合pH值选择 |
| 4.1.8 鸡IgY抗体最佳标记量选择 |
| 4.1.9 金标鸡IgY抗体的制备 |
| 4.1.10 金标抗原使用浓度的确定 |
| 4.1.11 金标抗体使用浓度的确定 |
| 4.1.12 检测线浓度的确定 |
| 4.1.13 质控线羊抗鸡IgY浓度的确定 |
| 4.1.14 牛支原体抗体检测试纸条的制备 |
| 4.1.15 试纸条反应模式的初步确定 |
| 4.1.16 样品稀释液和检测样品最适量的选择 |
| 4.1.17 试纸条特异性、敏感性试验 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 胶体金颗粒的测定和稳定性观察 |
| 4.2.2 胶体金标记蛋白最适pH值的确定 |
| 4.2.3 胶体金标记蛋白最适浓度的确定 |
| 4.2.4 标记鸡IgY抗体的最适量和最佳pH值 |
| 4.2.5 金标抗原的稳定性 |
| 4.2.6 金标抗体的稳定性 |
| 4.2.7 金标溶液浓度 |
| 4.2.8 检测线的蛋白浓度 |
| 4.2.9 质控线的羊抗鸡IgY浓度 |
| 4.2.10 样品稀释液和检测样品最适量的确定 |
| 4.2.11 试纸条特异性实验 |
| 4.2.12 试纸条敏感性实验 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 牛支原体抗体检测的胶体金免疫层析试纸条的实验室检测及临床应用 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要试验材料 |
| 5.1.2 试纸条对牛支原体感染抗体最早检出时间的确定 |
| 5.1.3 试纸条对牛支原体免疫抗体最早检出时间的确定 |
| 5.1.4 试纸条对实验室血清的检测 |
| 5.1.5 试纸条对临床血清的检测 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 牛支原体抗体检测试纸条对感染血清中抗体最早检出时间的确定 |
| 5.2.2 试纸条对人工免疫血清中抗体最早检出时间的确定 |
| 5.2.3 试纸条对实验室制备血清的检测 |
| 5.2.4 试纸条对临床血清的检测 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 土沉香和奇楠沉香 |
| 1.1.1 土沉香简介 |
| 1.1.2 奇楠沉香简介 |
| 1.1.3 奇楠沉香研究进展 |
| 1.2 沉香结香机理研究进展 |
| 1.2.1 真菌侵染促结香 |
| 1.2.2 细胞伤害促结香 |
| 1.2.3 激发子促结香 |
| 1.3 奇楠沉香主要化学成分研究进展 |
| 1.4 人工促结香技术研究进展 |
| 1.4.1 物理造伤法 |
| 1.4.2 非生物试剂法 |
| 1.4.3 生物法 |
| 1.5 植物内生菌研究进展 |
| 1.5.1 植物内生菌简介 |
| 1.5.2 植物内生菌的分类鉴定研究 |
| 1.5.3 植物内生菌的研究现状 |
| 1.5.4 植物内生菌的作用 |
| 1.6 植物内生菌与沉香结香研究进展 |
| 1.6.1 沉香形成的三种假说 |
| 1.6.2 内生真菌与沉香结香关系 |
| 1.7 高通量测序技术研究进展 |
| 1.8 研究目的、意义与内容 |
| 1.8.1 课题来源 |
| 1.8.2 研究目的与意义 |
| 1.8.3 研究区域概况 |
| 1.8.4 主要研究内容 |
| 1.8.5 技术路线 |
| 2 奇楠沉香不同结香时期心材理化性质 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验地概况及材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 奇楠沉香不同结香时期心材含水率 |
| 2.2.2 奇楠沉香不同结香时期pH值 |
| 2.2.3 奇楠沉香不同结香时期矿质元素 |
| 2.2.4 奇楠沉香不同结香时期各化学组成变化 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 3 奇楠沉香内生真菌群落结构及多样性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试样品 |
| 3.1.2 DNA的提取 |
| 3.1.3 DNA的检测 |
| 3.1.4 真菌的特异性扩增 |
| 3.1.5 Hi seq文库构建及测序 |
| 3.1.6 数据处理及分析 |
| 3.1.7 OTU聚类分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 奇楠沉香不同结香时期心材内生真菌数据筛选 |
| 3.2.2 心材内生真菌物种组成及分类学分析 |
| 3.2.3 心材内生真菌物种丰富度OTU聚类分析 |
| 3.2.4 心材内生真菌群落结构多样性分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 3.3.1 不同结香时期心材内生真菌物种组成 |
| 3.3.2 不同结香时期心材内生真菌群落多样性 |
| 4 奇楠沉香内生细菌群落结构及多样性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试样品 |
| 4.1.2 DNA的提取 |
| 4.1.3 DNA的检测 |
| 4.1.4 内生细菌的特异性扩增 |
| 4.1.5 Hi seq文库构建及测序 |
| 4.1.6 数据处理及分析 |
| 4.1.7 OTU聚类分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 奇楠沉香不同结香时期心材内生细菌数据筛选 |
| 4.2.2 心材内生细菌物种组成及分类学分析 |
| 4.2.3 心材内生细菌物种丰富度OTU聚类分析 |
| 4.2.4 心材内生细菌群落结构多样性分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 4.3.1 不同结香时期心材内生细菌群落结构 |
| 4.3.2 不同结香时期心材内生细菌群落多样性 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 论文创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B 攻读学位期间主要学术成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词表 |
| 第一章 牛子宫内膜炎研究进展 |
| 1 牛子宫内膜炎概述 |
| 1.1 牛子宫内膜炎的分类 |
| 1.1.1 产褥期子宫内膜炎 |
| 1.1.2 临床型子宫内膜炎 |
| 1.1.3 隐性子宫内膜炎 |
| 1.2 牛子宫内膜炎的病因 |
| 1.2.1 病原微生物感染 |
| 1.2.2 日粮营养失衡 |
| 1.2.3 环境因素 |
| 1.2.4 继发性因素 |
| 1.2.5 内分泌因素 |
| 1.2.6 遗传因素 |
| 1.3 牛子宫内膜炎的诊断 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.1.1 直肠检查 |
| 1.3.1.2 阴道检查 |
| 1.3.1.3 超声波检查 |
| 1.3.2 实验室诊断 |
| 1.3.2.1 子宫分泌物检查 |
| 1.3.2.2 精液试验 |
| 1.3.2.3 尿液组胺检查 |
| 1.3.2.4 乳中孕酮含量检测 |
| 1.3.2.5 子宫组织与细胞检查 |
| 1.4 牛子宫内膜炎的治疗 |
| 1.4.1 子宫内疗法 |
| 1.4.1.1 子宫冲洗治疗 |
| 1.4.1.2 子宫灌注治疗 |
| 1.4.1.3 子宫填塞药物治疗 |
| 1.4.2 全身抗菌治疗 |
| 1.4.3 激素治疗 |
| 1.4.4 激光治疗 |
| 1.4.5 其它疗法 |
| 1.5 牛子宫内膜炎的预防 |
| 1.5.1 提高饲养管理水平,严格遵守操作规程 |
| 1.5.2 加强牛产后护理和保健 |
| 2 泡腾栓剂的研究进展 |
| 2.1 栓剂简介 |
| 2.2 中药泡腾栓的研究概况 |
| 3 宁夏养牛业现状 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 宁夏地区牛子宫内膜炎流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 调查对象 |
| 1.1.2 采样地点 |
| 1.1.3 药品与试剂 |
| 1.1.4 耗材与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抽样方法 |
| 1.2.2 养殖基本情况调查 |
| 1.2.2.1 选址与布局(20分) |
| 1.2.2.2 设施与设备(30分) |
| 1.2.2.3 管理制度与人员配备(30分) |
| 1.2.2.4 环保要求与生产性能(20分) |
| 1.2.3 牛子宫内膜炎发病情况调查 |
| 1.2.3.1 临床症状检查 |
| 1.2.3.2 直肠检查 |
| 1.2.3.3 实验室诊断 |
| 1.2.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状结果 |
| 2.2 子宫分泌物检查结果 |
| 2.3 养殖基本情况调查结果 |
| 2.4 牛子宫内膜炎发病情况 |
| 2.5 牛子宫内膜炎发病率和季节变化的相关性 |
| 2.6 牛子宫内膜炎发病率和地域的相关性 |
| 2.7 牛子宫内膜炎发病率和饲养模式的相关性 |
| 2.8 牛子宫内膜炎发病率和年龄的相关性 |
| 2.9 牛子宫内膜炎发病率和品种的相关性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 养殖基本概况 |
| 3.2 宁夏牛子宫内膜炎的发病情况 |
| 3.3 牛子宫内膜炎发病率和季节变化的相关性 |
| 3.4 牛子宫内膜炎发病率和地域的相关性 |
| 3.5 牛子宫内膜炎发病率和饲养模式的相关性 |
| 3.6 牛子宫内膜炎发病率和年龄的相关性 |
| 3.7 牛子宫内膜炎发病率和品种的相关性 |
| 第三章 宁夏牛子宫内膜炎主要病原菌分离鉴定及药敏实验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 试剂与药品 |
| 1.1.3 耗材与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 子宫内膜炎患牛子宫分泌物的采集 |
| 1.2.2 细菌的分离培养 |
| 1.2.3 高智能全自动细菌鉴定及药敏分析仪鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 宁夏各县、市(区)分离菌株生化鉴定结果 |
| 2.2 宁夏各市、县(区)牛子宫内膜炎检出细菌的分布 |
| 2.3 宁夏各市、县(区)牛子宫内膜炎感染类型 |
| 2.4 宁夏各市、县(区)细菌的耐药率检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定 |
| 3.2 病原菌的耐药性分析 |
| 第四章 治疗牛子宫内膜炎中药组方泡腾栓的研制 |
| 实验一 中草药组方的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 中草药 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 中草药筛选 |
| 1.2.2 中草药有效成分提取 |
| 1.2.3 供试菌液的制备 |
| 1.2.4 中草药抑菌正交实验 |
| 1.2.5 中草药组方的确立与体外抑菌效果观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 中草药组方筛选正交设计试验结果 |
| 2.2 中草药组方抑菌试验结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 中药组方泡腾栓的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 泡腾栓辅料的选择 |
| 1.2.2 中药和辅料的预处理 |
| 1.2.3 泡腾栓辅料配比优选实验 |
| 1.2.4 中药组方泡腾栓制备工艺流程 |
| 1.2.5 中药组方泡腾栓质量检查 |
| 2 结果 |
| 2.1 中药组方泡腾栓辅料配比优选结果 |
| 2.2 正交实验结果方差分析 |
| 2.3 中药组方泡腾栓质量检查结果 |
| 2.3.1 外观检查 |
| 2.3.2 硬度、脆碎度和崩解时限检查 |
| 2.3.3 重量差异检查 |
| 2.3.4 pH值、发泡量、泡沫持续时间测定 |
| 2.3.5 变形温度、融变时限和微生物限度测定 |
| 2.3.6 中药组方泡腾栓抑菌实验结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 中药组方泡腾栓安全性评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验器材与药品 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小鼠腹腔给药急性毒性预实验 |
| 1.2.2 小鼠腹腔给药急性毒性正式实验 |
| 1.2.3 家兔阴道给药急性毒性实验 |
| 1.2.4 家兔Draize眼部刺激试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠腹腔急性毒性实验结果 |
| 2.2 家兔阴道给药急性毒性实验结果 |
| 2.3 家兔Draize眼部刺激试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 急性毒性试验结果分析 |
| 3.2 家兔眼部刺激试验结果分析 |
| 实验四 中药组方泡腾栓对牛子宫内膜炎的治疗效果观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验药品 |
| 1.1.2 实验器材 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验分组与设计 |
| 1.2.2 治疗效果判定标准 |
| 2 结果 |
| 2.1 两种药物对急性、慢性子宫内膜炎的治疗效果 |
| 2.2 两种药物对患病牛发情时间和受孕率的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 中英文对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 支原体 |
| 1.2 家禽支原体 |
| 1.3 滑液囊支原体 |
| 1.4 病原微生物的快速诊断 |
| 1.5 基因组研究进展 |
| 1.6 本研究的立题依据、研究内容及技术路线 |
| 第二章 支原体的分离鉴定、生物学特性研究 |
| 第1节 孔雀源支原体的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病料来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 孔雀源支原体的分离纯化 |
| 1.2.2 形态学鉴定 |
| 1.2.3 细菌L型鉴别 |
| 1.2.4 生理生化特性研究 |
| 1.2.5 致病性研究 |
| 1.2.6 药物敏感性 |
| 1.2.7 分子生物学鉴定 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 分离纯化 |
| 1.3.2 形态学观察 |
| 1.3.3 细菌L型鉴别 |
| 1.3.4 生理生化特性 |
| 1.3.5 致病性 |
| 1.3.6 药物敏感性 |
| 1.3.7 分子生物学鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 第2节 肉鸡源支原体的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要和仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 分离纯化 |
| 2.3.2 形态学观察 |
| 2.3.3 细菌L型鉴别 |
| 2.3.4 生理生化特性 |
| 2.3.5 致病性 |
| 2.3.6 药物敏感性 |
| 2.3.7 分子生物学鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 MGC PCR和 MS LAMP诊断方法的建立 |
| 第1节 MGC PCR诊断方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 支原体基因组的提取与含量测定 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 扩增体系 |
| 1.2.4 扩增程序 |
| 1.2.5 退火温度的优化 |
| 1.2.6 特异性测定 |
| 1.2.7 灵敏度的测定 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 退火温度 |
| 1.3.2 特异性 |
| 1.3.3 灵敏度 |
| 1.4 讨论 |
| 第2节 MS LAMP诊断方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 支原体基因组的提取与含量测定 |
| 2.2.2 引物设计与合成 |
| 2.2.3 反应体系 |
| 2.2.4 反应温度的优化 |
| 2.2.5 反应时间的优化 |
| 2.2.6 特异性测定 |
| 2.2.7 灵敏度的测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 反应温度 |
| 2.3.2 反应时间 |
| 2.3.3 特异性 |
| 2.3.4 灵敏度 |
| 2.4 讨论 |
| 第四章 Peacock20181011和WF2018 的全基因组测序分析 |
| 第1节 Peacock20181011 的全基因组测序分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 基因组提取与检测 |
| 1.2.2 全基因组测序与组装 |
| 1.2.3 基因组组分分析 |
| 1.2.4 基因组功能分析 |
| 1.2.5 基因组圈图 |
| 1.2.6 共线性分析 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 基因组提取与检测 |
| 1.3.2 基因组组分分析 |
| 1.3.3 基因组功能分析 |
| 1.3.4 基因组圈图 |
| 1.3.5 共线性分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第2节 WF2018 全基因组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 主要仪器试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组提取与检测 |
| 2.2.2 基因组测序与组装 |
| 2.2.3 基因组组分分析 |
| 2.2.4 基因组功能分析 |
| 2.2.5 共线性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 基因组提取与检测 |
| 2.3.2 基因组组分分析 |
| 2.3.3 基因组功能分析 |
| 2.3.4 基因组圈图 |
| 2.3.5 共线性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和样品 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 质粒标准品的构建 |
| 1.5 荧光定量PCR反应体系及条件的优化 |
| 1.6 标准曲线的绘制 |
| 1.7 荧光定量PCR敏感性检测 |
| 1.8 荧光定量PCR特异性检测 |
| 1.9 荧光定量PCR重复性检测 |
| 1.1 0 临床样品检测 |
| 1.1 0. 1 样品处理 |
| 1.1 0. 2 临床样品检测: |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒标准品的鉴定 |
| 2.2 荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.3 荧光定量PCR的标准曲线 |
| 2.4 荧光定量PCR的灵敏性 |
| 2.5 荧光定量PCR的特异性 |
| 2.6 荧光定量PCR的重复性 |
| 2.7 临床样品的检测 |
| 3 讨论 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 嗜肺巴斯德杆菌概述 |
| 2 嗜肺巴斯德杆菌的病原学 |
| 3 嗜肺巴斯德杆菌的临床表现 |
| 4 嗜肺巴斯德杆菌的流行现状 |
| 5 嗜肺巴斯德杆菌的诊断技术 |
| 5.1 按检测样本分类 |
| 5.2 按检测方法分类 |
| 6 嗜肺巴斯德杆菌的综合防控措施 |
| 6.1 环境控制 |
| 6.2 饲养管理 |
| 6.3 饲养设备 |
| 6.4 兽医防控 |
| 6.5 药物治疗 |
| 6.6 其他注意事项 |
| 7 本研究的目的意义 |
| 第二章 国标法检测SPF级小鼠嗜肺巴斯德杆菌 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 剖检观察 |
| 2.2 培养及镜检 |
| 2.3 生化试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 嗜肺巴斯德杆菌的PCR鉴定与鉴别 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PCR扩增 |
| 2.2 序列测定 |
| 2.3 其他数据 |
| 3 讨论 |
| 3.1 嗜肺巴斯德杆菌的PCR鉴定与传统培养法比较 |
| 3.2 嗜肺巴斯德杆菌在动物种群中的分布情况和感染规律 |
| 3.3 PCR诊断技术在实验动物中的应用前景 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 动物样本 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细菌DNA的提取 |
| 1.3.2 气管分泌物和鼻棉拭子DNA的提取 |
| 1.3.3 PCR反应体系和反应条件 |
| 1.3.4 特异性检测 |
| 1.3.5 敏感性检测 |
| 1.3.6 应用 |
| 1.3.7 血清学方法 |
| 1.3.8 传统培养方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性 |
| 2.2 敏感性 |
| 2.3 应用 |
| 3 讨论 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 实验动物泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒和大鼠冠状病毒的检测方法的评价 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
