张仔豪[1]（2020）在《吸附剂辅助下人参皂苷Rg5的高效制备研究》文中进行了进一步梳理人参皂苷Rg5是原人参二醇组皂苷（PPD）经结构修饰而得到的次级稀有人参皂苷,是具有良好的抗肿瘤、改善肺部炎症、抑制血小板聚集、改善记忆等药理活性的潜在天然药物。本文建立了称量法绘制人参皂苷标准曲线的方法,并选用无机强酸盐酸作催化剂,通过对原人参二醇组皂苷的选择性结构修饰,高效制备了人参皂苷Rg5。通过称量法配制了不同浓度人参皂苷对照品溶液,经液相色谱分析,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制了人参皂苷标准曲线。实验表明,称量法绘制标准曲线时,R2均在0.9999或以上,说明拟合度高。称量法制备标准曲线,对移液器和操作人员的移液技术没有过高的要求,操作简单,准确性好,而且对照品溶液在不变质条件下即使浓度发生变化也可长期使用,是一种实用性很强的标准曲线制备方法。以PPD皂苷为原料,盐酸为催化剂,制备了人参皂苷Rg5,并通过单因素实验进行了制备工艺优化。实验表明,当PPD皂苷浓度为20 mg/mL、反应溶剂为95%乙醇、盐酸浓度为0.01 mol/L、反应温度为70℃、反应时间为3 h时,人参皂苷Rg5的收率可以达到52.32%。以PPD皂苷为原料、高粘度壳聚糖为吸附剂、盐酸为催化剂,高效制备了人参皂苷Rg5,并通过单因素实验和响应曲面法进行了制备工艺优化。实验结果表明,溶剂为甲醇、盐酸浓度为0.17 mol/L、高粘度壳聚糖用量为20 mg、反应温度为65℃、反应时间为100 min时,人参皂苷Rg5的收率最高可以达到59.49%。对壳聚糖的作用机制研究表明,高粘度壳聚糖在盐酸存在下通过氢键作用吸附PPD皂苷,并使其在壳聚糖表面进行结构修饰,从而抑制人参皂苷Rg5的大量分解,提高人参皂苷Rg5的收率。本论文通过优化盐酸催化制备人参皂苷Rg5的工艺条件,大幅提高了人参皂苷Rg5的收率和制备效率,有效降低了制备成本,可以对人参皂苷Rg5的制备提供技术支持和理论支持,对于人参皂苷Rg5在医药方面的开发应用提供原料支持。
肖爽[2]（2020）在《干旱对棉花微根系与地上部形态生理的影响及细根差异蛋白质组学分析》文中进行了进一步梳理干旱是严重限制作物生长发育与产量品质的最主要的非生物胁迫之一。棉花作为世界性重要的经济作物,对于非生物胁迫表现出较高的耐受性,但是干旱仍然会对棉花生产造成巨大威胁。根系是与土壤直接接触的器官,最先感受到土壤的水分亏缺。微根系（细根、根毛）是根系中较为敏感与活跃的部分,是植物获取水分的重要器官。但是,目前关于大田作物微根系在干旱胁迫下的形态响应却鲜有报道。本研究在人工气候室内开展两类盆栽试验（自制原位根系观察装置培养法和传统盆栽培养法）,以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种“国欣棉9号”为试验材料,通过控制土壤相对含水量（RSWC）的方法设计正常灌溉（CK,70±5%RSWC）和干旱胁迫（DS,40±5%RSWC）处理。通过调查棉花微根系的形态与生理特征,结合差异蛋白质组学分析手段,以期探明干旱胁迫对棉花地上部发育的影响和微根系形态变化特征及可能的调控机理,分析微根系干旱响应蛋白的分类及功能。研究主要结果如下:1.自制的“植物培养与根系原位观测”一体化装置可满足棉花正常生长发育和根系原位无损观测的需求,能够清晰观察到细根和根毛的形态变化特征。2.干旱胁迫抑制棉株地上部的生长与发育。与CK 比较,DS处理下株高与茎粗在15 DAD（Days After Drought Treatment）出现了显着的降低,叶面积在30 DAD后表现出降低,主茎功能叶的相对叶绿素含量（SPAD值）表现下降,叶片相对含水量降低,下部叶片变黄、萎蔫后发生脱落。3.干旱胁迫抑制棉株主茎功能叶片的光合性能,提高了植株的水分利用效率。DS处理植株的光合气体交换参数（净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度）在30 DAD时均较CK呈现出降低趋势,达到极显着差异水平（P<0.01）;叶片瞬时水分利用效率和叶片内禀水分利用效率均在30 DAD和45 DAD时表现为显着的增长（P<0.01）,至60 DAD时下降至与CK同水平。4.棉花感受到土壤干旱后,根系变长,直径降低。通过分析自制根系原位观测装置获取的高分辨率根系图片,发现DS处理在处理第9周时细根的根长密度较CK显着增长17.08%（P<0.01）,其平均直径于同期出现16.03%的降低（P<0.01）,但其根表面积密度的变化并未呈现出规律性。应用传统盆栽培养法获得的总根长、总根表面积和平均总根直径等根系形态特征与之相似。说明原位根系图像法对所见局部细根与传统方法所获总根根系形态对于干旱胁迫的响应趋势具有一致性。5.干旱胁迫加速棉花细根与根毛的死亡进程,促进根毛的伸长。CK处理下细根寿命与其直径表现正相关关系（R2=0.6933）,直径越大,细根寿命越长,DS处理下这种关系未发生改变（R2=0.7342）,但是细根的寿命均发生缩短。干旱胁迫同样加速了根毛的死亡,与细根相比,根毛寿命较短,但却是最先对干旱胁迫做出响应的部位。不同生育阶段的根毛寿命不同,营养生长阶段的中值寿命较生殖生长阶段更长,CK处理下分别为21 d和14 d,DS处理下则分别缩短至19 d和13 d。干旱处理第2周时,DS处理下根毛长度显着高于CK（P<0.01）,并且随着处理时间的延长,两处理下根毛长度的差距逐渐增大,高峰时较CK增加88.01%。6.干旱胁迫不同程度增强了棉花细根的抗氧化酶活性,加重了膜脂过氧化程度,并引发积累渗透调节物质。15 DAD时棉花细根的酶类抗氧化剂活性和非酶类抗氧化剂含量均较CK出现了显着的增长。同时DS处理的MDA含量显着高于CK（P<0.01）,H2O2含量于30 DAD后较CK显着升高（P<0.05）。30 DAD时细根内脯氨酸与可溶性糖含量均较CK发生显着增加。7.基于串联质量标记技术,对0 DAD、30 DAD和45 DAD时的CK和DS处理下棉花细根样品进行差异蛋白质组学分析。共鉴定到11,628个蛋白质,其中10,344个蛋白质包含定量信息。基于细根形态与生理生化结果,选择30 DAD和45 DAD作为重点关注时期,以差异倍数变化数值大于1.3倍作为显着上调,小于0.77倍作为显着下调的变化标准,分别于“DS30 vs CK30”和“DS45 vs CK45”比较组中得到223和1273个差异表达蛋白（DEPs）。8.GO注释将DEPs分为生物过程（主要为代谢过程、细胞过程和单一生物过程）,细胞组分（主要为细胞、细胞器和细胞膜）和分子功能（主要为结合和催化活性）三类。KEGG通路富集分析发现,“DS30 vs CK30”比较组的上调DEPs主要富集到“角质、木栓质和蜡的生物合成”、“糖鞘脂的生物合成”、“半乳糖代谢”和“戊糖、葡萄糖醛酸转换”通路,下调DEPs主要富集到“单萜生物合成”、“碳固定”和“氧化磷酸化”通路;“DS45 vs CK45”比较组的上调DEPs主要富集到“半乳糖代谢”、“精氨酸和脯氨酸代谢”、“吞噬体”、“淀粉和蔗糖代谢”和“氨基糖和核苷酸糖代谢”等通路,下调DEPs主要富集到“次生代谢产物的生物合成”、“脂肪酸代谢”、“脂肪酸合成”、“萜类骨架的生物合成”和“类胡萝卜素的生物合成”等通路。将DEPs富集到的通路和与逆境响应相关的重要差异表达蛋白进一步分为5个大类:碳水化合物和能量代谢、胁迫和防御反应、脂代谢、植物激素代谢、氨基酸代谢、次生代谢,并针对个别蛋白进行了较为全面的描述和研究,以探知干旱胁迫响应过程中具有较高研究价值的DEPs。上述研究结果将为进一步明确棉花的抗旱机制提供依据,为作物干旱应激调控及抗旱品种培育提供新的思路,同时也可为根系性状的优化改进提供理论指导。
颜文颖[3]（2020）在《一种三重化学修饰的血红蛋白氧载体及其携放氧活性的研究》文中研究指明临床输血是多种疾病治疗的重要手段。然而,天然血液具有来源匮乏、应用前需要进行血型匹配以防止交叉感染等弊端,使得诸多学者开始进行红细胞代用品的研究。本文旨在借助化学修饰方法调控成人血红蛋白（Human adult hemoglobin,HbA）的氧亲和力以获得一种低氧亲和力、高四聚体稳定性和高自氧化速率的三重修饰血红蛋白氧载体。本课题以HbA作为研究对象,利用分子内交联、还原烷基化以及琥珀酰亚胺化学反应对其进行化学修饰,并研究修饰前后HbA及其衍生物相关的结构和功能特征。研究内容主要分为两个部分:首先,利用双（3,5-二溴水杨酸基）延胡索酸酯（Bis（3,5-dibromosalicylate）fumurate,DBBF）对血红蛋白分子进行分子内交联,提高游离血红蛋白的四聚体稳定性,使之具备类似于红细胞内的四聚体结构形式从而降低氧亲和力;在此基础上再利用乙醛酸钠对其进行末端羧甲基化反应,凭借静电排斥作用维持其低氧亲和力的T态,得到三种小分子修饰产物（αα-Hb、Glx-Hb以及Glx-αα-Hb）并探究了修饰前后血红蛋白分子的结构和功能性质等变化情况。随后,利用带有八臂琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）对HbA及其衍生物进行共价修饰得到四种PEG化血红蛋白分子（PEG-Hb、PEG-αα-Hb、PEG-Glx-Hb 以及 PEG-Glx-αα-Hb）,以进一步提高其四聚体的稳定性,并增加其流体力学体积,以降低因血管外溢而引发的肾毒性同时也可以降低免疫原性。根据研究结果发现,双重修饰产物（Glx-αα-Hb）的P50值为34.6 mmHg,约为原蛋白的3倍,氧转运效率（Oxygen transfer efficient,OTE）则由原蛋白的9.1%增加到 33.1%;三重修饰产物（PEG-Glx-αα-Hb）的 P50和 OTE较 Glx-αα-Hb有轻微的降低,其中P50为27.8 mmHg且OTE为30.5%。同时伴随着自氧化速率的增加和高铁血红蛋白（metHb）含量的增大,值得指出的是化学修饰程度越高对应的自氧化速率和metHb含量越大。其中,Glx-αα-Hb的自氧化速率和metHb含量分别为 0.036 h-1 和 12%（4 小时）,而 PEG-Glx-αα-Hb 则为 0.044 h-1 和 15%。圆二色光谱远紫外区域（260～190 nm）的结果表明化学修饰并未对HbA二级结构没有产生影响,但近紫外区域（480～260nm）的结果表明双重修饰和三重修饰均影响了对血红蛋白的四级结构和血红素的微环境。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,发生分子内交联反应后的修饰产物在32 kDa附近具有明显条带,这是由于分子内交联反应使得HbA的两个Lys-99（α）残基之间形成了富马酰亚胺桥的共价连接;经八臂PEG修饰后HbA的相对分子质量主要集中在90 kDa及以上区域,可见PEG化共价修饰能明显增加血红蛋白的相对分子质量。分子排阻层析法分析结果表明,经PEG修饰后血红蛋白的出峰位置较其所对应的原蛋白向左移动其流体力学体积明显增大,此结果也在一定程度上说明其与稳定性增强有关;拉曼光谱学图谱结果表明,双修饰产物在1340～1390 cm-1范围内拉曼强度明显增加,这与其四级结构的改变存在着联系。借助胰蛋白酶肽图谱和高效液相色谱确定双重化学修饰反应发生的位点是Val-1（α）和Lys-99（α）。根据紫外分光光度法动力学可知包括原蛋白在内的八种化学修饰产物中巯基数量并未发生改变,但不同的修饰方法对巯基反应活性的影响存在一定差异,主要是由于化学修饰对HbA的αlβ2界面造成了扰动。基于分子内交联、还原烷基化以及琥珀酰亚胺化学反应修饰得到的三重修饰血红蛋白氧载体具有较低的氧亲和力能够有效地向缺氧组织释放氧气同时伴随着自氧化速率的增加和metHb的产生;由于富马酰亚胺桥的形成以及八臂PEG的修饰增强了亚基间的相互作用使得HbA的四聚体稳定性提高。
张静[4]（2020）在《鱼头脂质指纹图谱及鱼头汤改善HepG2高脂细胞模型脂质沉积作用》文中认为Omega-3长链多不饱和脂肪酸（Omega-3 PUFA）对抗炎、改善心脑血管疾病、改善肥胖、抑制癌症等改善慢性疾病方面具有显着功效。自然界天然的EPA、DHA主要包括甘油三酯（TG）、磷脂（PL）和少量的游离脂肪酸（FFA）三种形式,人工合成的乙酯型（EE）是高纯度鱼油中EPA、DHA主要存在形式。相比人工合成的EE型,天然的EPA和DHA具有更高的生物利用率,需要不断探索可以使人类更加便捷、高效的获取EPA和DHA。本研究选对三种代表性海水、淡水鱼类,首先以大西洋鲑为例,对其头、背、腹、尾四个部位的总脂得率及脂肪酸组成进行对比,确定后续研究的对象;紧接着,选用三种代表性海水及淡水鱼:大眼金枪鱼、大西洋鲑和鳙鱼的头部,对其总脂得率、不同类型脂质组成、脂肪酸组成进行分析对比,并利用UHPLC-QE-MS/MS对三种鱼头甘油三酯分子指纹图谱进行分析,利用多元统计分析从脂质组成角度对三种鱼进行区分;分别选用HPLC-UV系统和UHPLC-ESI-MS/MS对大眼金枪鱼头汤中微纳胶粒的维生素E组成、脂质分子指纹图谱进行分析,从大眼金枪鱼头汤抗氧化活性物质基础的角度对微纳胶粒中EPA和DHA保护机制进行初步探究;研究不同加姜含量对大眼金枪鱼头汤脂肪酸组成及脂质氧化特性的影响;建立高脂HepG2细胞模型,研究大眼金枪鱼头汤（加姜）的抑制癌细胞生长作用,及其对高脂细胞模型的TG及总胆固醇（TC）沉积的影响。研究结果显示:（1）通过以大西洋鲑的不同部位为研究对象,发现其头部总脂质含量最高（头18.2%,尾16.05%,腹17.59%,背16.89%）,且含有最多种类脂肪酸（头28种,尾13种,腹12种,背16种）。通过对三种典型海水及淡水鱼的鱼头脂质组成进行分析,大西洋鲑头部的脂质含量最高（大西洋鲑15.67%,大眼金枪鱼12.87%,鳙鱼5.61%）,三者之间具有显着性差异（P<0.05）;大眼金枪鱼头部总脂中的PUFA含量最高,鳙鱼最低（70%,45%,24%）;而鳙鱼头部总脂中单不饱和脂肪酸（MUFA）含量最高,（62%,46%,17%）;对于饱和脂肪酸（SFA）,大眼金枪鱼和鳙鱼头部总脂中的含量相近,大西洋鲑最低（13%,14%,9%）。三种鱼头中,TG是最主要的脂质组分（61-86%）,其次为PL（9-32%）。同时,三种鱼头不同类型脂质中,大眼金枪鱼头的（EPA+DHA）含量在三种鱼头中最高（P<0.05）。（2）三种鱼头共检测到208种TG分子,其中大眼金枪鱼头中发现146种,大西洋鲑和鳙鱼头中分别为90种。三种鱼头共同含有28种TG分子。三种鱼头含有EPA或DHA的TG分子及其占总量的比例分别为72种（56.12%）、7种（22.88%）以及7种（5.46%）,彼此之间具有显着性差异（P<0.05）。利用多元统计分析发现,从TG分子组成的角度,三种鱼头彼此之间可以被完全区分。进一步对其差异代谢物进行分析,结果表明,大眼金枪鱼VS.大西洋鲑共有41种,大眼金枪鱼VS.鳙鱼共有64种,大西洋鲑VS.鳙鱼共有22种。大眼金枪鱼与大西洋鲑和鳙鱼鱼头的TG分子组成的主要区别,在于其含有EPA或DHA的TG分子种类不同,连接有EPA或DHA的TG分子种类数占它们各自差异TG分子种类数近50%。而将大西洋鲑与鳙鱼鱼头进行对比,仅有9%的差异TG分子含有EPA或DHA;（3）金枪鱼头汤中的维生素E总量为0.551 mg/100 g,检测到三种同分异构体,分别为δ-生育酚0.133 mg/100 g,γ-生育酚0.257 mg/100 g,α-生育酚0.161mg/100 g。经微滤处理后并未检出维生素E。大眼金枪鱼头汤微滤液共检出17类、631种脂质分子,其m/z分布在396至1659之间。其中,磷脂酰胆碱（PC）分子（107种）和TG分子（251种）是两种主要的极性脂和中性脂。微滤金枪鱼头汤中的长链脂肪酸主要存在于磷脂及甘油酯两类脂质分子中,同时,这两种脂质也是金枪鱼头汤微纳胶粒内芯与外膜的主要组成成分。由于磷脂分子特殊的两亲性结构,含有EPA、DHA的疏水基团被包裹在内部,连接在甘油酯上的EPA、DHA也位于微纳胶粒内部。较大粒径的微纳胶粒在金枪鱼头汤加工过程中,其内部的EPA、DHA相较小粒径保护程度高,被氧化降解程度低。因此,对于金枪鱼头汤微滤液中脂质分子指纹图谱的分析,也从脂质物质基础的角度对其氧化稳定性差异进行解释。（4）不同加姜量金枪鱼头汤的总脂得率无显着性差异（P≥0.05）,总脂肪酸含量（TFA）随着加姜量升高呈现出增长趋势,当加姜量为30%时,TFA含量最高（P<0.05）。五组鱼头汤中最主要的都为短链饱和脂肪酸C4:0,占总脂肪酸的比例为25-72%。EPA含量随着加姜量升高无显着性差异（P≥0.05）,DHA含量呈现出显着的上升趋势（P<0.05）,且在30%加姜量时达到最大（3.55 mg/100 g汤）。推测生姜的加入从抑制脂氧合酶活性和分担脂质氧化压力两方面延缓脂质氧化,并显着提高汤中高不饱和程度脂肪酸的含量;通过对各个脂质氧化指标进行对比分析,发现鱼头汤脂质的共轭二烯值、过氧化值（POV）呈现出相似的变化趋势,即随着加姜量增大先下降、再上升,在不加姜时达到最大值,在加姜量20%时达到最小值（P<0.05）,分别为0.36μmol/mg总脂和0.03 g/100 g汤。对金枪鱼头汤TBARS进行分析,其丙二醛（MAD）值随着加姜量升高不断下降,在不加姜时达到最大值,在加姜量30%时达到最小值0.04 mg/kg汤（P<0.05）。推测加姜对金枪鱼头汤的初级氧化和次级氧化反应均起到了延缓改善作用。（5）通过对比不同诱导物浓度对于HepG2细胞的相对存活率、油红O染色、TG及TC沉积的不同,最终确立用900μM诱导物（油酸:棕榈酸,2:1）作为模型诱导参数,作用时间为24 h。加姜与否对大眼金枪鱼头汤对高脂HepG2模型细胞相对存活率有显着的影响（P<0.05）。低稀释倍数下,不加姜的金枪鱼头汤对模型细胞具有轻微促进生长的作用,而加姜金枪鱼头汤则产生抑制模型细胞生长的现象。高稀释倍数下,不加姜鱼头汤的促细胞生长作用,与加姜鱼头汤的抑制细胞生长作用都出现了减弱的现象。随着鱼头汤添加量逐渐减少,不同实验组的细胞相对存活率接近对照组。在此基础上,进一步研究结果显示,大眼金枪鱼头汤微滤液对于模型细胞无毒性作用。因此,最终选择将受试物稀释20倍,添加4%。大眼金枪鱼头汤对高脂HepG2细胞的TG沉积有显着改善作用（P<0.05）,加姜组略高于不加姜组,原汤的降胞内TG作用略强于微滤液（P≥0.05）。相比对照组,大眼金枪鱼头汤及微滤液、加30%姜鱼头汤及微滤液对于高脂模型细胞内TG含量分别降低了37%、32%、45%、30%。但大眼金枪鱼头汤对细胞内的TC含量无明显下降作用。通过监测24 h内金枪鱼头汤对高脂HepG2细胞模型内TG含量的影响,发现从6 h开始,金枪鱼头汤两组的TG含量出现下降情况,直到24 h达到最低值（P<0.05）。
文美玲[5]（2020）在《基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略的建立与应用》文中研究指明蛋白质组学是对器官、组织或细胞内所有蛋白质进行大规模研究,其终极目标为全面理解并重构目标蛋白质组的构成、功能及生物过程。其中,差异蛋白质组学通过比较特定蛋白质组在不同状态下的差异来探究生理和病理机制,对于理解疾病发展、治疗方法开发和临床生物标志物的发现具有重要意义。蛋白质的功能不仅与具体蛋白质的表达水平和含量密切相关,还与蛋白质间的相互作用和具体结构形式直接相关。目前,差异蛋白质组学研究多采用shotgun（鸟枪法）分析策略,该策略在定性定量方面表现出极高的性能,但在完整蛋白质到肽段的处理过程中不可避免会造成大量蛋白质结构和相互作用的破坏且难以追溯,而这些信息对于全面理解蛋白质组的功能具有重要意义。基于此现状,本文建立了基于一维凝胶电泳-液相色谱-质谱（1DE-LC-MS）系统化分析的差异蛋白质组学研究策略,利用1DE对蛋白结构信息的保留和分离的高效性,及LC-MS/MS在大规模鉴定和定量上的高性能,实现对蛋白组学样品的大规模差异分析,同时获取与蛋白质相互作用及蛋白质降解等结构相关的信息。该策略主要由五步构成:1)非变性PAGE或SDS-PAGE分离样品;2)针对每个样品泳道平行切胶;3)对所有胶粒进行胶内酶解,接以定量LC-MS/MS分析;4)数据分析,得到蛋白质鉴定及定量结果,进行蛋白质含量差异分析;5)重构蛋白质在1DE凝胶泳道上的含量分布谱图（1DE-MS blots）,并进行与相互作用和亚基组成相关联的差异分析。本文分别在非变性1DE和SDS-PAGE情况下,将1DE-LC-MS系统化分析方法应用于人血浆/血清差异和不同时期脑缺血复灌损伤的研究中,在蛋白质含量差异分析的同时挖掘蛋白质结构信息。本文具体的研究内容及结果如下:1.1DE-LC-MS系统化分析方法中关键步骤的建立和优化。首先,通过自制的装置实现了批量梯度PAGE胶制备和平行电泳;其次,根据实际的凝胶尺寸设计平行切胶工具,将凝胶沿电泳方向切成大小均一的小胶粒,并将胶内酶解流程进行了标准化;然后,通过实验明确了凝胶电泳后CBB染色对于1DE-LC-MS系统化分析的有利作用;最后,建立“native 1DE-MS blots”（非变性1DE情况）或“SDS-PAGE-MS blots”（SDS-PAGE情况）进行蛋白质结构信息挖掘。2.结合非变性1DE、平行切胶和定量LC-MS/MS,本文建立了非变性1DE-LC-MS系统化分析方法,并应用于人血浆和血清的差异分析中。在不去除高丰度蛋白质的情况下,成功鉴定了315个蛋白质,其中33个在血浆/血清中的含量存在显着差异（变化倍数?2或?0.5,p?0.05）。除含量差异外,通过比较蛋白质的native 1DE MS-blots,我们还发现许多蛋白质在血浆/血清中结构也不同,这与凝血、补体激活中的多种酶促反应直接相关。3.结合SDS-PAGE、平行切胶和定量LC-MS/MS,本文建立了SDS-PAGE-LC-MS系统化分析方法,并应用于不同时期脑缺血复灌损伤（I/R）大鼠脑皮质蛋白质组的差异研究。此研究设置了I/R模型组（缺血2小时+复灌1天、7天和14天）以及对应假手术对照组,共6个研究组（n=4）,大鼠脑皮质蛋白质经SDS-PAGE分离后,进行全泳道切胶接以定量LC-MS/MS分析。最终鉴定到5621个蛋白质,三个时间点的模型组与对应的假手术组相比较分别有568、755和492个蛋白质发生显着的含量变化（变化倍数?1.5或?0.67,p?0.05）。生物信息学分析提示在缺血复灌损伤的不同时期最突出的改变集中在细胞骨架、突触可塑性、能量代谢、炎症反应和溶酶体五大方面。此外,通过分析蛋白质的SDSPAGE-MS blots,我们发现许多蛋白质存在降解现象,对于理解缺血复灌损伤机理和治疗方法的开发具有重要意义。这是常规差异蛋白质组学方法无法获取的,表明本策略在大规模组学分析上的独特优势。综上所述,本研究建立了基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略并开展了实际应用。常规的shotgun差异蛋白质策略只能获得蛋白质含量差异信息,相比之下我们建立的1DE-LC-MS系统化分析方法不仅可以分析蛋白质的含量差异还能根据1DE-MS blots追溯相关结构信息,如亚基组成、切割或降解、或相互作用等,为全面理解蛋白质的功能及生理病理机制提供更丰富的信息。
王旭[6]（2020）在《新型荧光试剂的开发及其在食品中氨基化合物分析中的应用》文中指出氨基酸作为一种重要的生命物质,广泛存在于生物体内,同时氨基酸还是各种食品中不可缺少的营养物质,影响着这些产品的味道、香气和颜色,并且具有很复杂的生物学功能,然而,一些食品添加剂、防腐剂以及食品包装材料的使用导致了在食品中出现了多种具有致癌性质的氨基污染物,因此开发高灵敏度且高选择性的分析方法监测这些物质对于研究食品与人体健康之间的关系是至关重要的。高效液相色谱技术因其分辨率高,灵敏度高,通用性强和样品处理简单的优点一直是食品与卫生安全领域分析中最常用的检测技术之一,而受限于多数氨基化合物没有发光性质,开发高灵敏度的标记试剂一直是研究的重中之重,另外,食品中氨基化合物的复杂性和多样性也对不同氨基化合物的选择性检测提出了更高的要求。本研究的重点在于设计与合成新型的荧光试剂用于标记氨基化合物并开发选择性强,灵敏度高的分析方法用于食品中不同氨基化合物的检测,具体内容如下:第一章:简述了食品中常见的氨基化合物,氨基化合物常用的分析技术,用于标记氨基的衍生化试剂的研究现状,选题意义及本论文主要工作。第二章:设计与合成了新型的荧光标记试剂4-（咔唑-9-基）-苄基氯甲酸酯（CBBC-Cl）并进行了结构确认和光谱性质表征,建立了以CBBC-Cl为标记试剂的柱前衍生-高效液相色谱分析-质谱鉴定的分析方法用于四种茶叶中20中氨基酸的定量分析,并深入探讨了不同茶叶生产工艺中氨基酸含量的变化趋势。第三章:以乙酸和氢溴酸混合溶液作为脱硝试剂,以CBBC-Cl作为衍生试剂,结合分散液-液微萃取和高效液相色谱-荧光检测实现了多种食品中的亚硝胺的快速分析。第四章:以廉价的商业试剂2-甲酰基苯基硼酸（FPBA）为开关型荧光试剂,结合高效液相色谱-荧光检测实现了多种食品中氨基脲的准确、快速分析,深入考察了样品中多种氨基酸对实际样品分析的影响,结果表明该方法选择性强,灵敏度高。
刘亚平[7]（2019）在《藏鸡种蛋氧化应激响应蛋白质的筛选及其PIT54对血管生成机制的研究》文中认为近些年来,大量研究探究了鸡蛋不同部位的蛋白质组及其生物活性。但是,不同生长环境对于鸡蛋蛋白质组及生物活性的影响尚不清楚。为挖掘藏鸡蛋特有的功能蛋白质,本研究以两种海拔鸡种蛋为研究对象,分别选取青藏高原的土着品种藏鸡种蛋和在世界范围内广泛饲养的人工选育品种白来航鸡种蛋,对蛋清和蛋黄蛋白质组及其生物功能进行了详细的分析,进而通过构建人工注释的鸡蛋蛋清和蛋黄蛋白质数据集,筛选出抗氧化相关候选蛋白质PIT54,并围绕着两种海拔高度鸡种蛋PIT54的DNA序列的单核苷酸多态性位点、蛋白质提取优化、质谱分析、抗氧化活性和对血管生成的影响及其机制初步探究等方面开展了一系列研究工作。主要研究结果如下:（1）利用非标记蛋白质组学对藏鸡种蛋清蛋白质（TEW）和白来航种蛋蛋清蛋白质（CEW）进行了比较研究,以鉴定差异蛋清蛋白质及其生物活性。一共鉴定出176种蛋白质。其中,14种表达量差异显着（倍数>1.5且P<0.05）的蛋白质,主要参与了脂质转运、免疫防御、生长发育和抗氧化过程;通过体外实验和Caco-2细胞的抗氧化实验证实了CEW和TEW之间抗氧化应激活性的差异;前列腺素-H2D-异构酶前体和谷胱甘肽过氧化物酶被认为是与差异抗氧化活性相关的候选蛋白质。（2）通过非标记定量技术比较了藏鸡种蛋蛋黄蛋白质（TEY）和白来航鸡种蛋蛋黄蛋白质（CEY）的蛋白质表达图谱,一共鉴定出135种蛋白质,其中19种蛋白质的表达量在两组样本间存在显着差异（倍数>1.5且P<0.05）;差异表达的蛋白质主要与氧化应激、免疫、能量代谢以及组织发育等过程相关;为了进一步验证抗氧化能力的差异,通过体外实验和对H2O2诱导氧化应激的Caco-2细胞的保护作用实验比较了CEY和TEY的抗氧化应激活性差异。TEY和CEY均具有抗氧化活性,但前者表现出的抗氧化应激能力更强（P<0.05）,该结果可能与TEY中的抗氧化活性相关蛋白（谷胱甘肽过氧化物酶3和PIT54）的表达量差异有关。（3）由于蛋白质表达的动态性,本研究中鉴定的蛋白质种类与文献报道种类有所差异。为更加广泛地筛选抗氧化蛋白质进行后续实验,通过构建人工注释的鸡蛋蛋清和蛋黄蛋白质的非冗余数据集,筛选出了鸡蛋中抗氧化蛋白质合集,以具有抗氧化应激作用和研究较少为基本原则,初步选择了PIT54作为候选的抗氧化活性相关蛋白。PIT54还具有促进血管生成以及免疫调节等生物活性。进一步通过生物信息学对PIT54的结构和功能进行分析发现,分子中含有4个重复的SRCR结构域和6个保守的半胱氨酸残基,具有清道夫受体活性,定位于细胞膜,主要与脂质运输、细胞激活以及含氧化合物响应过程相关,说明其的确与低氧氧化应激过程相关。（4）根据PIT54可以与血红蛋白结合的特性,将鸡血红蛋白通过CNBr偶联到活化的Sepharose 4B上,制备吸附血红蛋白的亲和柱,用来纯化PIT54。研究了不同缓冲液体系（Tris-HCl,p H 8.1和硼酸盐缓冲液,p H 8.1）对于PIT54分离的影响,建立了从蛋黄中分离纯化PIT54的方法,蛋黄经正己烷脱油后获得粗蛋白,依次经过DEAE阴离子交换层析和吸附血红蛋白的亲和层析柱亲和层析两步分离法,便可以快速高效地获得PIT54蛋白质,并保持了蛋白质活性,该方法操作简单。相比于C-PIT54,T-PIT54具有更强的与Hb结合的能力（P<0.05）和抑制LDL脂质氧化反应的能力（P<0.05）。质谱分析发现PIT54分子中一共检测到3个N-糖基化位点（85N、157N和485N）。其中,157N仅在C-PIT54中检测到,另外两个位于SRCR结构域的糖酸化位点在T-PIT54分子中的糖基化程度显着高于C-PIT54（P<0.05）。C-PIT54和T-PIT54分子中都只检测到了一个磷酸化位点411Ser,位于SRCR结构域N端,T-PIT54的磷酸化程度显着低于C-PIT54（P<0.05）。（5）为了研究两种海拔高度鸡种蛋来源的PIT54对常氧和低氧孵化的鸡胚血管生成的影响,需要模拟高原低氧环境。首先,本研究在原有孵化箱的基础上,通过外加氮气模拟低氧环境;利用单片机优化了氧气、二氧化碳、温度、湿度及其翻蛋控制系统,同时完善了孵化箱的密闭性;实现了准确、稳定的模拟不同含氧量下的鸡胚孵化过程。该设备操作简单,成本低,实用性强。利用该孵化箱模拟低氧环境进行后续实验。之后,以不同孵化时期的常氧和低氧孵化的白来航鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）为研究对象,以血管覆盖度和血管直径的分布情况为指标,筛选出D4、D8和D12为给药的时间点;然后,比较分析了T-PIT54和C-PIT54处理对低氧和常氧环境下的藏鸡和白来航鸡胚CAM血管发育情况的影响。最终发现了PIT54可以作为促血管生成因子,具有促进血管生成的作用,T-PIT54具有更强的促进血管生成的能力（P<0.05）,且作用范围广泛;C-PIT54对血管生成的促进作用具有种间差异性;T-PIT54和C-PIT54对于第8天的鸡胚的影响最大。因此,选择了两种给药处理的NC8、HC8和HT8组进行后续机制探究;（6）筛选出特异性肽段CTVNKNLEETETS制备PIT54抗体,经检验抗体效果良好。利用该抗体通过WB和免疫组织化学分析PIT54在鸡胚组织中的特异性表达,结果发现PIT54蛋白质在鸡胚的血液和肺泡中大量表达,在心脏、脑和血管中少量表达,在系带和肝脏中未检测到PIT54的特异性表达。通过免疫分子印迹分别考察了T-PIT54和C-PIT54处理后,CAM中的VEGFR2上下游相关蛋白的表达水平及磷酸化情况。发现低氧环境中,C-PIT54和T-PIT54可以通过显着增加上游的HIF-1α的表达量,刺激血管新生;增强VEGFR2/Src信号分子机制提高内皮细胞的通透性,有助于出芽和迁移;通过影响PI3K/Akt信号分子机制和提升ERK的磷酸化程度促进细胞增殖;增加p38单个蛋白质的磷酸化水平抑制细胞凋亡。这些都证明了C-PIT54和T-PIT54可以促进血管生成,提高低氧环境的适应性。但是,这两种外源添加的PIT54对低氧孵化鸡胚血管生成的促进作用具有种间差异性。两者在常氧白来航鸡胚中表现出与低氧环境相反的作用,可以避免血管内皮细胞的过度增殖。（7）通过对藏鸡源和白来航鸡源的PIT54 protein基因的DNA序列进行扩增测序发现,PIT54 protein基因全长5186 bp,包括8个外显子和7个内含子。同源比对结果显示,测序获得的T-PIT54与C-PIT54的内含子序列差异较大,但是,CDS序列保守性较高（99%identify）,表明了藏鸡源和白来航鸡源的PIT54 protein具有遗传稳定性。与C-PIT54相比,T-PIT54的DNA序列中存在着5个突变和5个插入片段;根据预测获得T-PIT54与C-PIT54蛋白质的氨基酸序列,生物信息学分析发现,T-PIT54的α-螺旋,结构更加紧密。两种蛋白质分子中都存在12个结合位点,但是部分位点具有种间特异性。这些序列与结构的差异可能是造成T-PIT54与C-PIT54抗氧化活性和促进血管生成活性差异的主要原因。
陈博[8]（2019）在《痕量芥子气染毒血样中蛋白加合物的液相色谱—质谱分析方法研究》文中研究指明芥子气（HD）是一种活性很强的糜烂性化学战剂,可以通过眼睛、皮肤以及呼吸道等途径进入人体,引起皮肤、粘膜组织的损伤。二战期间,日本侵略者对中国军民大量使用化学战剂,在战败后,日军在中国遗弃了大量的化学武器,其中大部分为芥子气,这些遗留化学武器至今仍严重威胁着我国人民的健康与安全,因此,建立系统、可靠、准确的分析检测方法十分必要。本论文针对化武履约以及临床救治等领域对痕量芥子气染毒分析方法研究的迫切需求,采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）联用技术进行相关研究,建立了一次采血同时检测两种生物标志物的定性、定量分析方法。具体结论及创新点如下:1、建立了痕量芥子气染毒血浆中羟乙基硫乙基-半胱氨酸-脯氨酸（HETE-CP）加合物的UPLC-MS/MS（MRM）分析方法。首先采用丙酮沉淀染毒血浆中的白蛋白,在pH值为8.8、3.00 mg/mL链霉蛋白酶作用下,50oC静置反应2.0 h,酶解液经溶剂沉淀后离心浓缩,加入4.00 mg/mL氯甲酸苄酯（Cbz-Cl）作为衍生化试剂,4oC振荡反应30 min,最后采用UPLC-MS/MS（MRM）进行检测。芥子气染毒血浆在4oC、室温以及37oC储存一周,或反复冻融十次,稳定性良好;定量分析方法的线性范围为1.00200 ng/mL（HD染毒血浆浓度）,线性方程为y=0.07579x-0.00146,相关系数R2>0.998,检出限为0.500 ng/mL（HD染毒血浆浓度,S/N≥5）;天内（n=3）准确度为93.4%104%,精密度RSD≤6.1%;天间（n=9,2周）准确度为97.1%111%,精密度RSD≤9.0%。通过Cbz-Cl衍生,极大地降低了目标峰附近的背景干扰,增加了方法的灵敏度。通过方法学考察,说明该方法具有良好的线性,且天内、天间的准确度、精密度良好;该方法未使用任何纯化方法,极大地简化了操作步骤。研究表明,该方法灵敏度高、操作简单、易于推广,检出限可达0.500 ng/mL,相较于之前使用相似低分辨质谱仪器进行检测的方法降低了15倍,同时略低于使用高分辨质谱进行检测的方法检出限,为人体中毒的定性、定量分析及相应的临床救治提供参考。2、建立了芥子气染毒血红蛋白（HD-Hb）羟乙基硫乙基-缬氨酸（HETE-Val）加合物的UPLC-MS/MS（MRM）分析方法。采用Edman降解法将HD-Hb加合物转化成为HETE-Val加合物,建立的HETE-Val加合物的UPLC-MS/MS（MRM）检测方法对芥子气染毒血红蛋白溶液的检出限为100 ng/mL。使用UPLC-MS/MS进行检测,无须进行溶剂置换以及干燥等操作,且省略了后续的衍生操作,极大地简化了样品制备过程。本研究提供了一种新的HETE-Val加合物的检测手段,丰富了芥子气染毒样品的分析方法。3、使用酸水解、胃蛋白酶酶解、链霉蛋白酶酶解三种方法对芥子气染毒血红蛋白溶液进行处理,筛选出芥子气染毒血红蛋白八种生物标志物,分别为HETE-VL、HETE-DE、HETE-PK、HETE-MFL、HETE-EVG（或HETE-DGL或HETE-VAD）、HETE-DAL、HETE-HAH（或HETE-AHH）、HETE-His多肽或氨基酸加合物,其中HETE-VL、HETE-DE、HETE-His具有较好的质谱响应,六种生物标志物未见相关报道,为芥子气染毒样品的检测提供了多种新的生物标志物。4、建立了痕量芥子气染毒血红蛋白羟乙基硫乙基-组氨酸（HETE-His）加合物的UPLC-MS/MS（MRM）分析方法。从人全血中提取珠蛋白后,在pH为8.8、3.00mg/mL链酶蛋白酶作用下,55oC振荡酶解10.0 h。采用PPL柱进行纯化,洗脱液经浓缩后加入25.0 mg/mL Cbz-Cl,4oC振荡衍生30 min,最后采用UPLC-MS/MS（MRM）进行检测。HD染毒全血经样品制备后的待测液在4oC、室温以及37oC储存一周,或反复冻融十次,稳定性良好。定量方法的线性范围为10.01000 ng/mL（HD染毒全血浓度）,线性方程为y=0.51x-1.36,相关性系数R2>0.995,检出限为10.0 ng/mL（S/N≥5,HD染毒全血浓度）。天内（n=3）准确度为90.2107%,精密度RSD≤10.3%;天间（n=9,2周）准确度为89.8115%,精密度RSD≤11.5%。经方法学考察,结果表明建立的方法线性范围宽、重复性好、操作简单、实验时间短、灵敏度高、实验条件温和。该研究比文献报道的灵敏度提高了150倍以上,可用于痕量芥子气暴露染毒的溯源性检测与分析。
徐巨才[9]（2019）在《停流型二维液相色谱系统的构建及其在食源性蛋白水解物分离及活性在线检测中的应用》文中研究说明食源性生物活性肽具有安全性高、易吸收、来源广等多种优点,越来越受到科研学者的关注。然而,受传统分离纯化技术效率限制,目前已报道的生物活性肽段序列很少,因此,发展一种可同时实现食源性蛋白水解物快速分离、活性肽段检测和结构鉴定的技术手段是目前亟需解决的问题。本文分别探讨了肽分子在停流型二维液相色谱（2D-LC）中第一维凝胶色谱（SEC）和反相色谱（RPLC）的额外峰展宽情况,并对现有二维色谱峰检测方法进行了一系列改善,在此基础上,构建了快速停流型SEC×RPLC-MS系统用于改善食源性蛋白水解物中肽段的分离和鉴定,与此同时,本文进一步构建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系统,用于食源性蛋白水解物中活性肽段的快速检测和鉴定。本文主要研究内容和结果如下:（1）构建了一种常规全自动停流型SEC×RPLC二维液相色谱,并系统研究了停流操作对停流型2D-LC中第一维SEC分离的影响,结果表明:大分子蛋白质或多肽在第一维SEC停流分析过程中的额外峰展宽极小,而小分子肽的额外峰展宽相对较大,但可通过调整其停流时间和分析温度对其进行控制,此外,停流位置和停流次数对样品在第一维SEC中的额外峰展宽影响极小。将该停流型SEC×RPLC应用于花生蛋白水解物的分离,获得了明显优于单维液相色谱的分离效果,其全二维分离峰容量高达504。（2）在停流型SEC×RPLC的基础上,将两个维度的色谱柱互换并对阀切换结构进行改良,进一步构建了一种可用于蛋白水解物分子量分析的常规停流型RPLC×SEC二维液相色谱,并系统性研究了第一维RPLC的额外峰展宽情况,结果表明:分子量较大或保留时间较长的物质在第一维RPLC中额外峰展宽均较小,仅有保留时间较短的小分子物质存在较为严重的额外峰展宽。将该停流型RPLC×SEC用于食源性蛋白水解物的分离分析,发现第一维RPLC分离可大大降低第二维SEC的分离难度,改善其分离效果。与停流型SEC×RPLC相比,停流型RPLC×SEC的全二维分离速度较慢且峰容量较低（仅为200左右）,但该系统可用于测定第一维RPLC全流出组分的分子量分布情况,同时,还可用于更准确地测定第一维RPLC特定流出组分的分子量。（3）基于原两步检测法,对二维液相色谱峰检测方法进行了改良。在新方法中,引入了保留时间判定和双向峰重叠判定,其中保留时间判定可根据第一维流出组分的不同采取不同的色谱峰偏移阈值,以适用于采用可变第二维液相色谱梯度的二维液相色谱峰检测,而双向峰重叠可支持设定峰宽对比高度,以减小峰拖尾对二维液相色谱峰检测的影响。新方法在常规分离、第一维欠采样和第二维采用可变梯度时所获得的复杂二维液相色谱数据中均获得了较好的检测效果,正确检测率均高于60%。与原Peters方法相比,新方法所得二维色谱峰检测的正确率至少提高了6%。（4）对常规停流型SEC×RPLC的第二维液相色谱（2D-LC）进行升级,构建了一种基于常规离子源的快速停流型SEC×RPLC-MS系统,并对其分离条件进行了优化,应用于食源性蛋白水解物的肽组学分析。结果表明:超高效UPLC SEC与HSS T3柱可作为食源性蛋白水解物二维分离的较优色谱柱对,结合进一步的进样量、组分转移体积及死体积优化,该二维色谱分离效果大大改善,峰容量高达1165,体现了其对复杂样品的强大分离能力。在玉米蛋白水解物的分离和鉴定试验中,快速停流型SEC×RPLC-MS的PSMs（母离子二级谱匹配数量）较传统1D-LC-MS提高了至少25%,MS2采集数量提高了至少两倍。将该系统进一步应用于大豆肽及酪蛋白水解物的肽段分离和鉴定,实际峰检测数量均超过200,PSMs鉴定量均超过9 k,而MS2采集量更是超过了50 k,充分展现了快速停流型SEC×RPLC-MS对食源性蛋白水解物的强大分离和鉴定能力。此外,通过将该鉴定结果与Biopep活性肽段数据库进行对比,快速地发现了酪蛋白水解物中的6条已知活性肽段,同时发现了大量包含活性片段的潜在生物活性肽段。（5）在常规停流型RPLC×SEC的基础上,对其停流型阀切换结构进行进一步的改良,并对其2D-LC进行升级,构建了停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系统。通过探讨反应环管路长短、DPPH·浓度、温度及甲酸添加量对第二维SEC-DPPH自由基清除活性分析的影响,确定了第二维SEC-DPPH自由基清除活性分析的适宜条件为:反应环10 m、DPPH·浓度200μM、温度40℃、甲酸添加量0.06%。通过谷胱甘肽标准品的停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析,对该系统的有效性进行了充分验证,在此基础上,进一步将其应用于复杂混合标准品的分析,成功从复杂混标中鉴定到了具有强DPPH自由基清除活性的二肽GC和CW,并对上述两种二肽进行了验证,展示了该系统较强的创新性、有效性和实用性。
刘洋[10]（2019）在《弹性蛋白肽的抗皮肤光老化功效及其作用机制研究》文中研究说明弹性蛋白作为皮肤组成中重要的结构蛋白,在皮肤老化过程中由于弹性蛋白酶等基质金属蛋白酶含量的升高而被降解,导致皮肤失去弹性,因此,开发一种弹性蛋白酶抑制肽是抵御或延缓皮肤老化的有效方法,在抗皮肤老化功能性食品中具有非常广阔的应用前景。本文以牛动脉为主要原料,通过分析Alcalase?2.4L对牛弹性蛋白的酶解规律,优选弹性蛋白酶抑制活性较高的水解产物进行光损伤动物实验和成纤维细胞实验以验证其功效,并进一步从水解产物中分离、鉴定了4条具有高弹性蛋白酶抑制活性的肽段。在此基础上,探究了弹性蛋白酶抑制肽对光损伤成纤维细胞的保护作用机理,并对这些肽的消化吸收特性进行了研究。本文主要实验结果如下:（1）深入研究了Alcalase?2.4L对牛弹性蛋白的酶解规律,发现由于弹性蛋白结构稳定难以被深度酶解,其水解度和游离氨基酸含量都很低（最大值分别仅为2.16%和33.23μg/mL）。此外,由于弹性蛋白特殊的氨基酸组成,其水解产物含有较高水平的Gly、Ala、Val、Pro、Leu,这些氨基酸在弹性蛋白水解产物中对于抑制弹性蛋白酶具有重要作用。通过利用二维液相色谱进一步分析弹性蛋白水解产物的指纹图谱发现大分子量/极性较小的肽随酶解时间的增加被深度水解成分子量较小和/或较强极性的肽,且酶解10 h后样品指纹图谱趋于一致,结合质谱分析、鉴定了405个多肽,发现大多数肽段来自弹性蛋白中含有丰富的疏水重复单元的疏水结构域,而弹性蛋白的C末端区域中很少有蛋白片段被释放。（2）摄入弹性蛋白水解产物（Elastin hydrolysates,EH）的小鼠其皮肤含水量及羟脯氨酸含量明显增加,表皮增生和皮脂腺增生症状明显改善,表明EH可以有效保护皮肤免受紫外损伤。成纤维细胞实验结果进一步表明,EH可有助于提升光损伤的成纤维细胞细胞存活率,同时,EH能显着（p<0.05）提升光损伤的成纤维细胞中的I型胶原蛋白和弹性蛋白含量,且能够有效抑制光损伤成纤维细胞中弹性蛋白酶和胶原蛋白酶含量的升高,说明EH能通过降低弹性蛋白酶和胶原蛋白酶含量来减少UV诱导的胶原蛋白和弹性蛋白的流失。（3）以弹性蛋白酶抑制活性为指标,采取超滤、大孔树脂、C18层析、HPLC等分离技术手段从EH中分离得到具有高抑制活性的组分,并利用UPLC-Q-TOF-MS/MS对其主要肽段进行鉴定,得到了其序列分别为PY,GLPY,GLGPGV和GPGGVGAL四种多肽。通过对以上肽段分子化学合成,进一步发现四条肽段中GLPY的弹性蛋白酶抑制活性最强,在10 mM浓度下抑制率为58.77%,其次为GPGGVGAL和GLGPGVG,PY的弹性蛋白酶抑制活性最弱。除GLGPGVG对弹性蛋白酶的抑制类型属于竞争性抑制外,其他三个多肽均为混合抑制类型。GLPY对弹性蛋白酶具有最强的亲和力（6.4 kcal/mol）,其与弹性蛋白酶之间可形成5个键长较短的氢键,这可能是其具有最佳弹性蛋白酶抑制活性的主要原因。此外,在GLGPGVG、GPGGVGAL及PY和弹性蛋白酶的之间可分别观察到5个、3个及1个氢键,说明这四种多肽可以通过与弹性蛋白酶发生分子相互作用以抑制其活性。（4）GLPY等多肽可通过提升光损伤细胞内SOD的活性,抑制紫外诱导的ROS的增加,减少细胞的氧化应激反应,从而在两个方面起到减少光损伤所致成纤维细胞凋亡的作用:一方面通过抑制胞内Ca2+离子水平的增加,从而减少Ca2+离子调节的线粒体途径、内质网途径和/或死亡受体蛋白等途径引起的成纤维细胞凋亡;另一方面,下调弹性蛋白酶和胶原蛋白酶,并上调胶原蛋白mRNA表达以促进胶原蛋白合成,最终减少细胞基质的降解,从而抑制成纤维细胞的失巢凋亡;（5）PY,GLPY,GLGPGVG和GPGGVGAL四个多肽均能不同程度地被胃肠道消化酶系降解,其弹性蛋白酶抑制活性在经胃肠道消化后均呈现显着降低的趋势,其中PY和GPGGVGAL在消化后已不具备弹性蛋白酶抑制活性。GLPY,GLGPGVG消化后活性的降低与其消化产物GL,PY,LGPGVG和G的活性较低有关。在Caco-2模拟小肠吸收模型中,尽管6.50%的GLPY和56.51%的GLGPGVG被小肠细胞刷状边界膜的酶及胞内酶进一步水解,但仍有较大部分肽段被细胞所直接吸收。GLPY和GPGGVGAL的表观渗透率分别为1.02×10-66 cm/s和0.47×10-6 cm/s,其中,GLPY较GLGPGVG更易被吸收,且其主要通过转胞吞途径被吸收,需消耗能量,其转运途径部分依赖于转运蛋白PepT1。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 人参 |
| 1.1.1 人参的历史 |
| 1.1.2 人参分布及生长环境 |
| 1.1.3 人参的分类 |
| 1.2 人参的化学成分及功效 |
| 1.2.1 人参皂苷 |
| 1.2.2 人参多糖 |
| 1.2.3 挥发油 |
| 1.2.4 含氮化合物 |
| 1.2.5 人参其他成分 |
| 1.3 次级稀有人参皂苷Rg3和Rg5 的制备方法及功效 |
| 1.3.1 稀有人参皂苷Rg3 |
| 1.3.2 稀有人参皂苷Rg5 |
| 1.4 研究意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 第2章 重量法建立人参皂苷标准曲线 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 供试品溶液的制备 |
| 2.2.3 色谱条件 |
| 2.2.4 标准曲线的建立方法 |
| 2.2.5 称量法绘制标准曲线方法学考察 |
| 2.2.6 标准曲线准确性验证实验 |
| 2.2.7 人参皂苷混合对照品标准曲线制备 |
| 2.3 结果与结论 |
| 2.3.1 不同方法建立标准曲线 |
| 2.3.2 方法学考察实验结果 |
| 2.3.3 标准曲线准确性考察 |
| 2.3.4 混合对照品绘制标准曲线方程实验 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于盐酸催化的人参皂苷Rg5 的高效制备方法 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器及设备 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与结论 |
| 3.3.1 PPD皂苷的制备 |
| 3.3.2 单因素试验优化人参皂苷Rg5 的制备方法 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 吸附剂辅助下盐酸催化的人参皂苷Rg5 的高效制备方法 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器与试剂 |
| 4.2.2 HPLC色谱条件 |
| 4.2.3 吸附剂辅助人参皂苷Rg5 的高效制备方法 |
| 4.2.4 高粘度壳聚糖在人参皂苷Rg5 的制备中的作用 |
| 4.3 结果与结论 |
| 4.3.1 人参皂苷Rg5 的线性关系考察 |
| 4.3.2 稳定性实验 |
| 4.3.3 精密度实验 |
| 4.3.4 吸附剂的筛选 |
| 4.3.5 高粘度壳聚糖辅助下单因素实验优化 |
| 4.3.6 响应面优化实验 |
| 4.3.7 验证实验 |
| 4.3.8 高粘度壳聚糖在制备人参皂苷Rg5 中的作用探讨 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 后记和致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 干旱胁迫对植物的影响及植物的耐旱机制 |
| 1.2.1 干旱胁迫对植物生长的影响 |
| 1.2.2 植物抗旱研究概述 |
| 1.2.3 植物根系与干旱胁迫 |
| 1.3 植物微根系研究进展 |
| 1.3.1 植物细根研究进展 |
| 1.3.2 植物根毛研究进展 |
| 1.3.3 微根系对土壤干旱的形态响应 |
| 1.3.4 微根系观测方法研究进展 |
| 1.4 植物蛋白质组学研究进展 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学研究技术概述 |
| 1.4.3 棉花响应干旱胁迫蛋白质组学研究进展 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 棉花微根系响应干旱胁迫的原位形态特征研究 |
| 2.1 试验材料与仪器 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 试验设计 |
| 2.3 测定项目及方法 |
| 2.3.1 地上部形态、相对叶绿素含量及植株鲜重的测定 |
| 2.3.2 根系图像的原位获取 |
| 2.3.3 根毛长度测量 |
| 2.3.4 细根、根毛寿命观察 |
| 2.3.5 数据处理与分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 干旱胁迫对棉花地上部生长发育的影响 |
| 2.4.2 干旱胁迫对棉花根系发育的影响 |
| 2.4.3 干旱胁迫对棉花细根、极细根比例的影响 |
| 2.4.4 干旱胁迫对棉花活根、死根比例的影响 |
| 2.4.5 干旱胁迫对棉花细根寿命的影响 |
| 2.4.6 干旱胁迫对棉花根毛长度的影响 |
| 2.4.7 干旱胁迫对棉花根毛寿命的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 干旱胁迫对棉花植株地上部发育的影响 |
| 2.5.2 干旱胁迫对棉花细根发育的影响 |
| 2.5.3 干旱胁迫对棉花细根寿命的影响 |
| 2.5.4 干旱胁迫对棉花根毛寿命的影响 |
| 3 干旱胁迫对棉花地上部形态与细根生理生化特性的影响 |
| 3.1 试验材料与仪器 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 植物材料的培养及处理 |
| 3.3 测定项目及方法 |
| 3.3.1 地上部形态 |
| 3.3.2 光合气体交换参数测定与计算 |
| 3.3.3 地上部生理指标测定 |
| 3.3.4 根系形态指标 |
| 3.3.5 渗透调节物质、活性氧代谢及抗氧化系统相关指标的测定 |
| 3.3.6 内源激素含量的测定 |
| 3.3.7 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 干旱胁迫对棉花地上部形态的影响 |
| 3.4.2 干旱胁迫对棉花根系形态的影响 |
| 3.4.3 干旱胁迫对棉花光合气体交换参数的影响 |
| 3.4.4 干旱胁迫对棉花叶片水分利用效率的影响 |
| 3.4.5 干旱胁迫对棉花苗期叶片SPAD值和相对含水量的影响 |
| 3.4.6 干旱胁迫对棉花细根酶类抗氧化剂的影响 |
| 3.4.7 干旱胁迫对棉花细根非酶类抗氧化剂的影响 |
| 3.4.8 干旱胁迫对棉花细根脂质过氧化水平的影响 |
| 3.4.9 干旱胁迫对棉花细根渗透调节物质的影响 |
| 3.4.10 干旱胁迫对棉花细根内源激素含量的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 棉花通过改变器官形态、生理特征与光合性能响应土壤干旱 |
| 3.5.2 干旱胁迫激活了棉花细根一系列抗氧化反应 |
| 3.5.3 干旱胁迫对棉花细根渗透调节物质的影响 |
| 3.5.4 干旱胁迫下棉花细根内源激素的响应 |
| 4 棉花细根响应干旱胁迫的蛋白质组学研究 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.2 植物材料的培养与处理 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 蛋白提取 |
| 4.3.2 胰酶酶解 |
| 4.3.3 TMT标记 |
| 4.3.4 高效液相色谱(HPLC)分级 |
| 4.3.5 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)分析 |
| 4.3.6 数据库搜索 |
| 4.3.7 基于平行反应监测的靶向蛋白验证 |
| 4.3.8 生物信息学分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 SDS-PAGE检测 |
| 4.4.2 质谱质控检测结果 |
| 4.4.3 TMT蛋白鉴定总览 |
| 4.4.4 样品重复性检验 |
| 4.4.5 差异蛋白质鉴定数量分析 |
| 4.4.6 正常灌水与干旱胁迫下棉花细根发育相关差异蛋白功能分类 |
| 4.4.7 不同胁迫时间下棉花细根响应干旱胁迫差异蛋白功能分类 |
| 4.4.8 正常灌水与干旱胁迫下棉花细根发育相关差异蛋白GO富集分析 |
| 4.4.9 不同胁迫时间下棉花细根响应干旱胁迫差异蛋白GO富集分析 |
| 4.4.10 正常灌水与干旱胁迫下棉花细根发育相关差异蛋白KEGG富集分析 |
| 4.4.11 不同胁迫时间下棉花细根响应干旱胁迫差异蛋白KEGG富集分析 |
| 4.4.12 正常灌水与干旱胁迫下棉花细根发育相关差异蛋白结构域富集 |
| 4.4.13 正常灌水与干旱胁迫下棉花细根发育相关差异蛋白结构域富集 |
| 4.4.14 差异蛋白的蛋白表达水平验证 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 干旱胁迫下参与碳水化合物和能量代谢的部分差异表达蛋白 |
| 4.5.2 干旱胁迫下参与胁迫抵抗和防御反应的部分差异表达蛋白 |
| 4.5.3 干旱胁迫下参与植物激素代谢的部分差异表达蛋白 |
| 4.5.4 干旱胁迫下参与脂肪酸代谢的部分差异表达蛋白 |
| 4.5.5 干旱胁迫下参与氨基酸代谢的部分差异表达蛋白 |
| 4.5.6 干旱胁迫下参与次生代谢的部分差异表达蛋白 |
| 5 结论 |
| 6 附录 |
| 参考文献 |
| 在读期间的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 蛋白质及多肽药物 |
| 1.1.1 蛋白质及多肽类药物的种类 |
| 1.1.2 蛋白质及多肽类药物存在的问题及解决方案 |
| 1.2 血液代用品 |
| 1.2.1 血液代用品的必要性 |
| 1.2.2 血液代用品的种类 |
| 1.3 血红蛋白 |
| 1.3.1 血红蛋白的结构 |
| 1.3.2 血红蛋白的生理功能 |
| 1.3.3 游离血红蛋白的缺陷 |
| 1.3.4 化学修饰血红蛋白的方法 |
| 1.3.5 化学修饰血红蛋白的研究意义 |
| 1.4 聚乙二醇修饰 |
| 1.4.1 聚乙二醇的理化性质 |
| 1.4.2 聚乙二醇修饰的优势 |
| 1.4.3 聚乙二醇修饰的基团 |
| 1.5 修饰后血红蛋白的分离纯化方法 |
| 1.5.1 离子交换层析 |
| 1.5.2 凝胶过滤层析 |
| 1.5.3 反相高效液相层析 |
| 1.6 修饰血红蛋白的常用表征方法 |
| 1.6.1 拉曼光谱 |
| 1.6.2 高效液相色谱 |
| 1.6.3 圆二色光谱 |
| 1.6.4 血氧分析仪 |
| 1.7 论文立体思路 |
| 第2章 三重修饰血红蛋白氧载体的制备与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 血红蛋白的纯化 |
| 2.3.2 血红蛋白修饰产物的制备和纯化 |
| 2.3.3 HbA溶液的聚乙二醇化修饰产物的制备与纯化 |
| 2.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳分析 |
| 2.3.5 HbA溶液浓度的测定 |
| 2.3.6 凝胶过滤高效液相色谱分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 血红蛋白的纯化 |
| 2.4.2 αα-Hb与Glx-Hb的纯化 |
| 2.4.3 双修饰产物的纯化和电泳结果 |
| 2.4.4 八臂聚乙二醇修饰产物的纯化和电泳结果 |
| 2.4.5 分子排阻高效液相色谱鉴定 |
| 2.5 本章总结 |
| 第3章 三重化学修饰血红蛋白氧载体的结构和功能性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 圆二色光谱表征 |
| 3.3.2 拉曼光谱表征 |
| 3.3.3 氧饱和曲线测定 |
| 3.3.4 别构效应分析 |
| 3.3.5 自氧化速率及高铁血红蛋白(metHb)含量测定 |
| 3.3.6 巯基数目滴定 |
| 3.3.7 胰蛋白酶肽图谱 |
| 3.3.8 反相高效液相色谱 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 圆二色光谱 |
| 3.4.2 拉曼光谱表征结果 |
| 3.4.3 氧饱和曲线 |
| 3.4.4 别构效应分析 |
| 3.4.5 自氧化速率和metHb含量 |
| 3.4.6 巯基数量的滴定 |
| 3.4.7 修饰位点的测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 结果与讨论 |
| 4.1 本文的实验结果 |
| 4.2 本文的创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 Omega-3长链多不饱和脂肪酸 |
| 1.2 EPA、DHA天然脂质分子链结构的鉴定 |
| 1.2.1 气相色谱法 |
| 1.2.2 高效液相色谱法 |
| 1.2.3 质谱法 |
| 1.2.4 脂质组学数据库 |
| 1.3 汤的研究进展 |
| 1.3.1 汤的风味 |
| 1.3.2 汤的营养品质 |
| 1.3.3 汤的生理活性作用 |
| 1.4 海洋源天然活性物质的降血脂作用 |
| 1.4.1 海洋生物多糖的降血脂作用 |
| 1.4.2 海洋生物肽的降血脂作用 |
| 1.4.3 海洋n-3PUFA的降血脂作用 |
| 1.5 本课题的理论依据、研究意义及主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目的及意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 大西洋鲑不同部位脂肪酸组成及三种鱼头脂质组成 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验试剂与标准品 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 数据处理 |
| 2.2 .结果与讨论 |
| 2.2.1 大西洋鲑不同部位总脂得率 |
| 2.2.2 大西洋鲑不同部位总脂肪酸比较 |
| 2.2.3 三种鱼头不同脂质组分分析 |
| 2.2.4 三种鱼头总脂及不同脂质组分脂肪酸组成分析 |
| 2.3 结论 |
| 第三章 三种鱼头甘油三酯指纹图谱分析比较 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验原料 |
| 3.1.2 实验试剂与标准品 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 数据处理 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 甘油三酯分子定性定量 |
| 3.2.2 不同来源甘油三酯分子轮廓比较分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 大眼金枪鱼头汤维生素E及脂质指纹图谱 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验原料 |
| 4.1.2 实验试剂与标准品 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.1.5 数据处理 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 维生素E组成 |
| 4.2.2 大眼金枪鱼头汤微滤液脂质组成分析 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 加姜对大西洋金枪鱼头汤脂肪酸组成及脂质氧化特性的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验原料 |
| 5.1.2 实验试剂与标准品 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.1.5 数据分析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 不同加姜量大眼金枪鱼头汤脂肪酸组成对比 |
| 5.2.2 不同加姜量大眼金枪鱼头汤共轭二烯值比较 |
| 5.2.3 不同加姜量大眼金枪鱼头汤POV比较 |
| 5.2.4 不同加姜量大眼金枪鱼头汤TBARS比较 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 大眼金枪鱼头汤对HepG2细胞脂肪沉积的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验原料 |
| 6.1.2 实验试剂与标准品 |
| 6.1.3 实验仪器 |
| 6.1.4 实验方法 |
| 6.1.5 数据处理 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 高脂模型诱导 |
| 6.2.2 大眼金枪鱼头汤对模型细胞生长的影响 |
| 6.2.3 含不同粒径微纳胶粒金枪鱼头汤对高脂Hep G2 细胞内TG及 TC含量的影响 |
| 6.2.4 大眼金枪鱼头汤降胞内TG过程检测 |
| 6.3 本章小结 |
| 全文结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的主要科研成果 |
| 参会与获奖情况 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学概述 |
| 1.2 蛋白质组学的主要研究策略 |
| 1.2.1 Top-down蛋白质组学策略 |
| 1.2.2 Bottom-up蛋白质组学策略 |
| 1.2.3 Hybrid(基于凝胶)蛋白质组学策略 |
| 1.3 定量与差异蛋白质组学 |
| 1.3.1 同位素标记的定量蛋白质组学 |
| 1.3.2 非标记定量蛋白质组学 |
| 1.4 研究背景、内容和意义 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 第二章 1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学方法的流程建立和条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.3 相关溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 平行梯度凝胶制备 |
| 2.3.2 平行凝胶电泳 |
| 2.3.3 平行切胶 |
| 2.3.4 标准化胶内酶解 |
| 2.3.5 CBB染色的必要性探究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 平行制胶、平行电泳、平行切胶和标准化酶解流程的建立 |
| 2.4.2 CBB染色对简单样品1DE-LC-MS分析的影响 |
| 2.4.3 CBB染色对复杂样品1DE-LC-MS/MS系统化分析的影响 |
| 2.4.4 蛋白质native1DE-MS-blots或 SDS-PAGE-MS blots的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 非变性1DE-LC-MS系统化差异蛋白质组学分析方法的建立及在人血浆/血清研究中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 相关溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人血浆和血清样品准备 |
| 3.3.2 人血浆和血清蛋白的非变性一维凝胶电泳 |
| 3.3.3 平行全泳道网格凝胶切取、胶粒编号及表观分子量评估 |
| 3.3.4 胶内酶解及Nano LC-MS/MS数据采集 |
| 3.3.5 质谱数据分析 |
| 3.3.6 Western blot实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 结合非变性PAGE分离,全泳道切胶和定量LC-MS/MS分析结果 |
| 3.4.2 总蛋白native1DE-MS blots反应整体蛋白分布 |
| 3.4.3 蛋白质native1DE-MS blots反应蛋白质结构信息 |
| 3.4.4 血浆和血清蛋白native1DE-MS blots的比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 SDS-PAGE-LC-MS系统化差异蛋白质组学分析方法建立及在脑缺血复灌损伤研究中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验仪器与试剂 |
| 4.2.3 相关溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 局灶性大鼠脑缺血复灌损伤模型构建 |
| 4.3.2 动物分组及实验设计 |
| 4.3.3 动物模型成功性验证 |
| 4.3.4 大鼠脑皮质蛋白质组学分析 |
| 4.3.5 Western blot蛋白验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 大鼠脑缺血复灌损伤模型验证结果 |
| 4.4.2 大鼠脑皮质蛋白质组数据整体评估 |
| 4.4.3 大鼠脑皮质蛋白质组的差异变化蛋白及Western blot验证 |
| 4.4.4 蛋白质SDS-PAGE-MS blots反应蛋白质结构信息 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食品中的氨基化合物 |
| 1.2 食品中氨基化合物的分析技术 |
| 1.3 衍生化方法在氨基化合物分析中的研究现状 |
| 1.3.1 衍生化技术简介 |
| 1.3.2 氨基衍生化试剂简介 |
| 1.4 选题意义与主要研究内容 |
| 第2章 新型荧光标记试剂CBBC-Cl用于茶叶中氨基酸的高效液相色谱分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 CBBC-Cl的合成 |
| 2.2.4 标准溶液的制备 |
| 2.2.5 样品处理 |
| 2.2.6 衍生化反应 |
| 2.2.7 色谱质谱参数 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 4-(咔唑-9-基)-苄醇(CBBC-OH)的紫外吸收 |
| 2.3.2 4-(咔唑-9-基)-苄醇(CBBC-OH)的荧光性质 |
| 2.3.3 CBBC-Cl及其衍生物的稳定性 |
| 2.3.4 衍生化条件的优化 |
| 2.3.5 HPLC分离和MS鉴定 |
| 2.3.6 方法验证 |
| 2.3.7 牛血清白蛋白水解物的可靠性测试 |
| 2.3.8 样品分析 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 新型荧光标记试剂CBBC-Cl用于食品中亚硝胺的高效液相色谱分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 标准溶液的制备 |
| 3.2.4 样品处理 |
| 3.2.5 NAs的脱硝反应 |
| 3.2.6 衍生化反应 |
| 3.2.7 DLLME程序 |
| 3.2.8 色谱质谱参数 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 衍生化条件的优化 |
| 3.3.2 DLLME的优化 |
| 3.3.3 HPLC分离和MS鉴定 |
| 3.3.4 方法验证 |
| 3.3.5 方法比较 |
| 3.3.6 样品分析 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 2-甲酰基苯基硼酸用于食品中氨基脲的高效液相色谱分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 标准溶液的制备 |
| 4.2.4 样品处理 |
| 4.2.5 衍生化反应 |
| 4.2.6 色谱质谱参数 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 衍生化条件的优化 |
| 4.3.2 HPLC分离和MS鉴定 |
| 4.3.3 衍生化的选择性 |
| 4.3.4 FPBA-SEM的稳定性 |
| 4.3.5 方法验证 |
| 4.3.6 样品分析 |
| 4.3.7 方法比较 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鸡蛋蛋白质的主要功能 |
| 1.1 抗氧化活性(氧化应激响应活性) |
| 1.2 抗菌活性 |
| 1.3 血管紧张素转移酶抑制活性 |
| 1.4 抗病毒活性 |
| 1.5 其他生物活性 |
| 2 蛋白质组学研究 |
| 2.1 蛋白质组学的常用技术 |
| 2.2 蛋白质组学技术的应用 |
| 2.3 鸡蛋蛋白质翻译后的研究 |
| 3 藏鸡蛋的研究进展 |
| 3.1 藏鸡蛋蛋壳的研究进展 |
| 3.2 低氧孵化对鸡胚组织器官的影响 |
| 3.3 低氧适应性相关蛋白质的研究 |
| 4 PIT54及血管生成的研究进展 |
| 4.1 PIT54的相关研究 |
| 4.2 血管生成及常用的模型 |
| 4.3 促血管生成因子对于血管生成的影响 |
| 5 本课题选题的学术思想 |
| 5.1 研究目的与意义 |
| 5.2 学术思想 |
| 5.3 主要研究内容 |
| 第二章 两种海拔高度鸡种蛋蛋清蛋白质组的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 EW基本营养成分分析 |
| 2.2 蛋清蛋白质的GO分类分析 |
| 2.3 差异蛋白质的生物信息学分析 |
| 2.4 生物信息学分析两组的抗氧化活性差异 |
| 2.5 CEW和 TEW的抗氧化活性测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 差异蛋白质的功能分析 |
| 3.2 抗氧化相关蛋白质的筛选 |
| 4 小结 |
| 第三章 两种海拔高度鸡种蛋蛋黄蛋白质组的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 2.1 TEY和 CEY的基本营养成分分析及其蛋白质的鉴定 |
| 2.2 TEY和 CEY中差异表达的蛋白质 |
| 2.3 差异蛋白质的生物信息学分析 |
| 2.4 生物信息学分析差异蛋白质与抗氧化活性相关 |
| 2.5 藏鸡和白来航鸡抗氧化活性相关的蛋白和基因 |
| 2.6 体外抗氧化测定 |
| 2.7 细胞毒性/细胞保护作用 |
| 3 讨论 |
| 3.1 差异蛋白质的功能分析 |
| 3.2 CEYH和 TEYH对于Caco-2 细胞的保护作用 |
| 3.3 鉴定与抗氧化活性有关的蛋黄蛋白质 |
| 4 小结 |
| 第四章 两种海拔高度鸡种蛋抗氧化蛋白质筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 蛋白质注释 |
| 1.3 鸡蛋抗氧化活性蛋白质的筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 比较本研究中鉴定的蛋白质与已报道蛋白质 |
| 2.2 构建蛋清和蛋黄中蛋白质数据集 |
| 2.3 确定抗氧化活性候选蛋白质 |
| 2.4 PIT54的功能分析与同源比对 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸡蛋中抗氧化活性蛋白质的筛选 |
| 3.2 PIT54的生物活性预测分析 |
| 3.3 PIT54的保守性分析 |
| 4 小结 |
| 第五章 两种海拔高度鸡种蛋蛋黄PIT-54的纯化与质谱分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 血红蛋白的提取及亲和层析柱的制备 |
| 2.2 PIT54蛋白质纯化 |
| 2.3 质谱鉴定 |
| 2.4 PIT54与血红蛋白的结合能力 |
| 2.5 PIT54抗氧化能力的测定 |
| 2.6 两种来源的PIT54糖基化位点鉴定 |
| 2.7 两种蛋白质的磷酸化位点差异鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 两种海拔高度PIT54对CAM血管生成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 低氧孵化过程的模拟与控制 |
| 2.2 调试与孵化测试 |
| 2.3 鸡胚尿囊绒毛膜的给药时间点筛选 |
| 2.4 两种PIT54 对于鸡胚CAM的血管发育的影响 |
| 3.讨论 |
| 3.1 高原低氧孵化箱的模拟与控制 |
| 3.2 不同孵化时间对于CAM血管生成的影响 |
| 3.3 不同药物对于鸡胚CAM血管发育的影响 |
| 4 小结 |
| 第七章 两种海拔PIT54对CAM血管生成机制的探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PIT54抗体的制备与效果评价 |
| 2.2 PIT54的表达部分探测 |
| 2.3 C-PIT54和T-PIT54对HIF-1α表达量的影响 |
| 2.4 不同药物处理对VEGFR2/Src信号分子机制的影响 |
| 2.5 C-PIT54和T-PIT54对PI3K/Akt信号分子机制的影响 |
| 2.6 C-PIT54和T-PIT54对ERK和p38 及各自磷酸化水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PIT54表达部位分析 |
| 3.2 C-PIT54和T-PIT54 对血管生成相关蛋白的影响 |
| 3.3 PIT54 影响鸡胚CAM血管生成的机制 |
| 4 小结 |
| 第八章 两种海拔高度鸡PIT54基因测序比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 载体的构建与酶切鉴定 |
| 2.2 PIT54 protein基因DNA结构分析 |
| 2.3 不同来源的PIT54 protein基因DNA序列比较分析 |
| 2.4 预测的T-PIT54与C-PIT54 氨基酸序列的比较分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第九章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新性 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.2.1 芥子气及其相关性质 |
| 1.2.2 芥子气在人体内的代谢途径 |
| 1.3 芥子气暴露染毒生物标志物的分析方法 |
| 1.3.1 芥子气原体的分析 |
| 1.3.2 芥子气水解产物的分析 |
| 1.3.3 芥子气氧化产物的分析 |
| 1.3.4 芥子气-谷胱甘肽加合物及其β-裂解产物的分析 |
| 1.3.5 芥子气-大分子加合物的分析 |
| 1.4 研究内容与方案 |
| 1.4.1 痕量芥子气染毒血浆中HETE-CP加合物分析方法研究 |
| 1.4.2 芥子气染毒血红蛋白HETE-Val加合物的分析方法研究 |
| 1.4.3 芥子气染毒血红蛋白生物标志物的筛选 |
| 1.4.4 痕量芥子气染毒HD-Hb加合物经酶解后产生的生物标志物的分析方法研究 |
| 第二章 痕量芥子气染毒血浆HETE-CP加合物的UPLC-MS/MS分析方法研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与器材 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 注意事项 |
| 2.2.2 溶液配制 |
| 2.2.3 内标溶液的制备 |
| 2.2.4 标准曲线溶液与质量控制样品的配制 |
| 2.2.5 样品制备 |
| 2.2.6 仪器条件 |
| 2.2.7 方法学考察 |
| 2.2.8 分子模拟计算方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 丙酮沉淀血浆白蛋白 |
| 2.3.2 链霉蛋白酶酶解 |
| 2.3.3 固相萃取柱分离纯化HETE-CP加合物 |
| 2.3.4 Cbz-Cl衍生 |
| 2.3.5 使用2-CEES染毒血浆作为内标 |
| 2.3.6 UPLC-MS/MS方法优化 |
| 2.3.7 UPLC-MS/MS碎裂途径研究 |
| 2.3.8 方法学考察结果 |
| 2.3.9 白蛋白作用位点分子模拟研究 |
| 2.4 本章总结 |
| 第三章 芥子气染毒血红蛋白HETE-Val加合物的UPLC-MS/MS分析方法研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器与器材 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 注意事项 |
| 3.2.2 溶液配制 |
| 3.2.3 不同浓度芥子气染毒血红蛋白溶液的制备 |
| 3.2.4 样品制备 |
| 3.2.5 仪器条件 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 质谱条件优化 |
| 3.3.2 检测结果 |
| 3.4 本章总结 |
| 第四章 芥子气染毒血红蛋白新生物标志物的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器与器材 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 注意事项 |
| 4.2.2 溶液配制 |
| 4.2.3 芥子气染毒血红蛋白溶液的制备 |
| 4.2.4 仪器条件 |
| 4.2.5 样品制备 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 酸水解后的生物标志物的筛选 |
| 4.3.2 胃蛋白酶酶解后的生物标志物的筛选 |
| 4.3.3 链霉蛋白酶酶解后的生物标志物的筛选 |
| 4.3.4 不同处理方法筛选得到的生物标志物的比较 |
| 4.4 本章总结 |
| 第五章 痕量芥子气染毒全血中组氨酸加合物的UPLC-MS/MS分析方法研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 仪器与器材 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 注意事项 |
| 5.2.2 溶液配制 |
| 5.2.3 内标的制备 |
| 5.2.4 标准曲线样品与质量控制样品的配制 |
| 5.2.5 样品制备 |
| 5.2.6 仪器条件 |
| 5.2.7 方法学考察 |
| 5.2.8 分子模拟计算方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 珠蛋白的提取 |
| 5.3.2 链酶蛋白酶酶解 |
| 5.3.3 固相萃取(SPE)纯化 |
| 5.3.4 Cbz-Cl衍生 |
| 5.3.5 使用2-CEES染毒血红蛋白溶液作为内标 |
| 5.3.6 UPLC-MS/MS方法优化 |
| 5.3.7 组氨酸加合物加合位点研究 |
| 5.3.8 UPLC-MS/MS碎裂途径研究 |
| 5.3.9 方法学考察结果 |
| 5.3.10 血红蛋白作用位点分子模拟研究 |
| 5.4 本章总结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 下一步工作的设想与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 食源性蛋白水解物的色谱分离技术 |
| 1.2.1 凝胶色谱(SEC) |
| 1.2.2 离子交换色谱(IEC) |
| 1.2.3 反相液相色谱(RPLC) |
| 1.2.4 亲水作用色谱(HILIC) |
| 1.2.5 其他单维色谱分离技术 |
| 1.2.6 多维色谱分离技术 |
| 1.3 二维液相色谱分离技术 |
| 1.3.1 二维液相色谱发展历史 |
| 1.3.2 二维液相色谱系统分类 |
| 1.3.3 停流型二维液相色谱 |
| 1.4 二维液相色谱分离效果评价 |
| 1.4.1 正交度 |
| 1.4.2 峰容量评价 |
| 1.4.3 实际峰检测数量 |
| 1.5 二维液相色谱的应用 |
| 1.5.1 二维液相色谱在常规分析中的应用 |
| 1.5.2 二维液相色谱-质谱联用技术的应用 |
| 1.5.3 二维液相色谱-质谱/在线活性检测联用分析 |
| 1.6 本课题研究的立题依据和主要研究内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 第一维SEC中的额外峰展宽研究及常规停流型SEC×RPLC系统的构建及应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料与试剂 |
| 2.2.2 样品制备方法 |
| 2.2.3 一维停流型SEC系统 |
| 2.2.4 停流型SEC×RPLC二维液相色谱系统 |
| 2.3 理论部分 |
| 2.3.1 停流型二维液相色谱中第一维色谱肽分子的扩散分析 |
| 2.3.2 停流操作所导致的额外色谱峰展宽 |
| 2.3.3 停流分析过程中样品通过色谱柱所需的总时间与停流次数的关系 |
| 2.3.4 停流分析下第一维SEC分离柱效的评价 |
| 2.3.5 峰容量 |
| 2.3.6 数据处理 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 停流时间对不同样品分子额外峰展宽的影响 |
| 2.4.2 色谱峰停流位置对额外展宽的影响 |
| 2.4.3 停流次数对色谱峰额外展宽的影响 |
| 2.4.4 色谱柱分析温度对色谱峰额外展宽的影响 |
| 2.4.5 对目标物质的停流型分析 |
| 2.4.6 停流型SEC×RPLC二维液相色谱的应用 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 第一维RPLC中的额外峰展宽研究及常规停流型RPLC×SEC在肽分子量测定中的应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料与试剂 |
| 3.2.2 标准溶液及样品制备方法 |
| 3.2.3 仪器及色谱分析方法 |
| 3.2.4 停流型RPLC中肽分子的额外峰展宽 |
| 3.2.5 停流型RPLC的分离效果评价 |
| 3.2.6 二维色谱峰容量 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 停流型RPLC中肽分子量大小对额外峰展宽的影响 |
| 3.3.2 停流型RPLC中样品保留时间对额外峰展宽的影响 |
| 3.3.3 流速对停流型RPLC额外峰展宽的影响 |
| 3.3.4 柱温对停流型RPLC的影响 |
| 3.3.5 第二维SEC分离的分子量标准曲线 |
| 3.3.6 停流型中心切割分析 |
| 3.3.7 停流型全二维色谱分析 |
| 3.3.8 停流型RPLC×SEC和停流型SEC×RPLC二维液相色谱的对比 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 二维液相色谱峰的两步检测法改进研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 理论部分 |
| 4.2.1 检测方法概述 |
| 4.2.2 单维色谱峰检测 |
| 4.2.3 二维色谱峰的重构 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 实验材料与试剂 |
| 4.3.2 仪器方法 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 常规二维色谱分析所得数据的二维色谱峰检测 |
| 4.4.2 第一维欠采样时所得数据的二维色谱峰检测 |
| 4.4.3 采用第二维可变梯度时所得数据的二维色谱峰检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 快速停流型SEC×RPLC二维液相色谱-质谱联用系统的构建及其在食源性多肽分离及鉴定中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验试剂与材料 |
| 5.2.2 样品制备方法 |
| 5.2.3 仪器方法 |
| 5.2.4 二维液相色谱峰容量 |
| 5.2.5 数据分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同的第一维凝胶柱对二维色谱分离效果的影响 |
| 5.3.2 不同的第二维RPLC色谱柱对二维色谱分离效果的影响 |
| 5.3.3 进样量与组分转移体积对二维液相色谱分离效果的交互影响 |
| 5.3.4 二维液相色谱系统体积最小化 |
| 5.3.5 快速停流型二维液相色谱-质谱联用系统(2D-LC-MS/MS)在食品肽段鉴定中的应用 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析系统的构建及其应用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验试剂与材料 |
| 6.2.2 样品制备方法 |
| 6.2.3 离线DPPH自由基清除率的测定 |
| 6.2.4 仪器与方法 |
| 6.2.5 数据处理 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 在线一维SEC-DPPH自由基清除活性分析方法 |
| 6.3.2 在线一维RPLC-DPPH自由基清除活性分析方法 |
| 6.3.3 停流型RPLC×SEC-MS/DPPH自由基清除活性分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 论文创新点 |
| 3 展望 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 皮肤老化 |
| 1.1.1 皮肤结构 |
| 1.1.2 光老化皮肤 |
| 1.1.3 皮肤光老化原因 |
| 1.2 胞外基质蛋白和基质金属蛋白酶 |
| 1.2.1 胶原蛋白 |
| 1.2.2 弹性蛋白 |
| 1.2.3 基质金属蛋白酶 |
| 1.3 抗皮肤老化活性物质研究 |
| 1.3.1 抗氧化 |
| 1.3.2 抗皱 |
| 1.3.3 其他 |
| 1.4 活性多肽的生物利用度 |
| 1.4.1 胃肠道消化 |
| 1.4.2 小肠吸收 |
| 1.5 本文的立题依据与研究内容 |
| 1.5.1 本文的立题依据与研究目的 |
| 1.5.2 本文的研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 弹性蛋白肽酶解规律初探 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料和化学品 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 牛弹性蛋白的纯化 |
| 2.3.2 不同酶解时间牛弹性蛋白的酶解效率 |
| 2.3.3 不同酶解时间牛弹性蛋白的弹性蛋白酶抑制活性 |
| 2.3.4 不同酶解时间牛弹性蛋白的总氨基酸组成 |
| 2.3.5 不同酶解时间牛弹性蛋白的游离氨基酸组成 |
| 2.3.6 不同酶解时间牛弹性蛋白的肽指纹图谱 |
| 2.3.7 不同酶解时间牛弹性蛋白的特征峰定量分析 |
| 2.3.8 不同酶解时间牛弹性蛋白的分子特征峰主成分分析 |
| 2.3.9 牛弹性蛋白水解产物肽谱 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 弹性蛋白肽对光老化小鼠及光损伤成纤维细胞的保护作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 EH对光老化小鼠皮肤成分的影响 |
| 3.3.2 EH对光老化小鼠皮肤组织的影响 |
| 3.3.3 EH对光老化小鼠血清抗氧化指标的影响 |
| 3.3.4 EH对光损伤成纤维细胞存活率的影响 |
| 3.3.5 EH对光损伤成纤维细胞I型胶原蛋白和弹性蛋白的影响 |
| 3.3.6 EH对光损伤成纤维细胞胶原蛋白酶和弹性蛋白酶的影响 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 弹性蛋白酶抑制肽的分离纯化鉴定及其合成验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 大孔树脂分离弹性蛋白水解产物 |
| 4.3.2 XDB-C18 层析分离弹性蛋白水解产物 |
| 4.3.3 RP-HPLC分离弹性蛋白水解产物 |
| 4.3.4 UPLC-Q-TOF-MS/MS质谱分析弹性蛋白酶抑制肽序列 |
| 4.3.5 弹性蛋白酶抑制肽抑制类型分析 |
| 4.3.6 计算机模拟弹性蛋白酶抑制肽与弹性蛋白酶的分子对接 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 弹性蛋白酶抑制肽对光损伤成纤维细胞保护作用机制研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.2.5 统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVAL对光损伤HFF细胞的保护作用 |
| 5.3.2 PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVAL对细胞内ROS含量及SOD活性的影响 |
| 5.3.3 PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVAL对细胞内Ca2+含量及线粒体膜电位的作用 |
| 5.3.4 PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVAL四种肽对细胞内弹性蛋白含量和I型胶原蛋白含量的影响 |
| 5.3.5 PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVAL四种肽对细胞内弹性蛋白酶含量和胶原蛋白酶(MMP-1)含量的影响 |
| 5.3.6 PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVAL四种肽对细胞内弹性蛋白和I型胶原蛋白mRNA表达的影响 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 弹性蛋白酶抑制肽的模拟消化吸收特性研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 主要试剂 |
| 6.2.4 实验方法 |
| 6.2.5 统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 胃肠道体外模拟消化对PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVGAL弹性蛋白酶抑制活性的影响 |
| 6.4.2 PY,GLPY,GLGPGVG,GPGGVGAL胃肠道消化产物的鉴定 |
| 6.4.3 GLPY,GLGPGVG胃肠道消化产物的弹性蛋白酶抑制活性 |
| 6.4.4 GLPY,GLGPGVG的 Caco-2 细胞毒性实验 |
| 6.4.5 GLPY,GLGPGVG在 Caco-2 吸收过程中的变化 |
| 6.4.6 GLPY和 GLGPGVG的表观渗透系数研究 |
| 6.4.7 GLPY的渗透类型研究 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 论文创新点 |
| 3 展望 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
