崔荣兴[1]（2021）在《阴虚津亏模型小鼠唾液腺水通道蛋白AQP1、AQP5的表达及意义》文中指出阴虚证是常见的中医临床基本证候,其核心机理是津液亏虚,导致阴主濡润的生理功能减退,从而引起诸多症状的发生。本课题组前期通过制定阴虚证普适性辨证标准量表并形成专家共识:口干是阴虚证诊断的重要辨证要点之一。由于多种因素引起人体内阴液亏虚、阴不制阳,以致阳气相对亢盛,导致津液无以上承于口,口失濡润。津液是人体内的一切正常水液的总称。现代医学研究证实,水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）参与调节机体组织细胞内外水分子的转运速率,影响机体的水液代谢过程。因此,唾液腺组织AQPs及其相关分子机制的异常表达与阴虚口干之间是否具有相关性,成为有待解决的问题。一、理论探讨本章主要对近年来阴虚证动物模型造模方法的研究进展进行总结,分析不同造模方法的优势与不足。同时,对“阴主濡润”的理论源流与内涵以及AQPs相关研究进行深入探讨。最后,基于“阴主濡润”理论探讨了 AQPs及其相关分子机制在唾液分泌中的作用,为阐释阴虚证辨证要点“口干”症状的生物学基础提供依据。本章内容为论文设计与研究提供了方向与理论基础。二、实验研究目的:1.建立阴虚津亏动物模型,探讨模型评价方法。2.探讨阴虚津亏模型小鼠腮腺、颌下腺组织AQP1、AQP5表达变化的意义。3.探讨阴虚津亏模型小鼠“口干”症状的分子机制。方法:将18只SPF级C57BLKS/J雄性小鼠适应性饲养3天后,按照随机分组原则分为正常组9只、模型组9只。采用“热盛伤阴”法建立阴虚津亏动物模型,模型组每只小鼠每日予以0.1 mL/10 g剂量的伤阴药灌胃,正常组每只小鼠每日予以等体积的超纯水灌胃,造模时间共计8周。观察小鼠日常行为变化,造模结束后利用旷场实验观察小鼠中央格穿格次数、中央格停留时间百分比、旷场区运动总距离和速度。观察并记录小鼠肛温与“五心”温度、饮水量、唾液流率、摄食量、体质量、皮肤含水量、粪便含水量、尿胆红素等基础指标。采用苏木素-伊红（HE）染色法观察小鼠腮腺、颌下腺病理变化。运用免疫组织化学、Western Blotting分子生物实验技术观察小鼠腮腺、颌下腺组织AQP1和AQP5的表达变化。利用Western Blotting观察颌下腺组织p-PKA/PKA、p-CREB/CREB的表达变化。结果:（一）阴虚津亏动物模型建立与评价灌服伤阴药期间,模型组小鼠活泼喜跳动,与正常组小鼠比较,更易激惹。造模结束后的旷场实验结果显示:与正常组小鼠比较,模型组小鼠中央格穿格次数与停留时间百分比差异不显着,旷区运动总距离明显增加（P<0.01）,运动速度显着提高（P<0.001）。与正常组小鼠比较,模型组小鼠心前区温度、左上肢爪心温度、左下肢爪心温度以及右下肢爪心温度均显着升高（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01）,肛温、右上肢爪心温度变化差异性不显着;模型组小鼠饮水量明显增多（P<0.0001）,唾液流率显着降低（P<0.05）,摄食量显着降低（P<0.0001）,体质量、皮肤含水量、粪便含水量均无显着性差异。正常组小鼠尿胆红素阳性例数1例,阳性率11.1%;模型组小鼠尿胆红素阳性例数6例,阳性率66.7%。（二）AQP1、AQP5在阴虚津亏模型小鼠唾液腺中的表达1.HE染色观察小鼠腮腺、颌下腺病理变化与正常组小鼠比较,模型组小鼠腮腺组织中腺泡细胞形态结构并未发生明显改变,腺泡细胞有所减少,分泌管形态略微扩张;颌下腺组织出现浆液性腺泡细胞萎缩、分泌管与微血管扩张等病理性变化。2.免疫组化结果（1）腮腺组织中,AQP1分布在腺泡细胞基底膜以及分泌管上皮细胞膜,AQP5分布在分泌管、腺泡细胞顶质膜和基底膜。与正常组小鼠比较,模型组小鼠腮腺组织中AQP1和AQP5的表达呈降低趋势,组间差异均无统计学意义。（2）颌下腺组织中,AQP1分布在腺泡细胞基底膜以及分泌管上皮细胞膜,AQP5分布于腺泡细胞的顶质膜和基底膜,分泌管上皮细胞顶质膜上亦有分布。与正常组小鼠相比,模型组小鼠颌下腺组织中AQP1和AQP5的显着降低（P<0.001,P<0.01）。3.Western Blotting 结果与正常组小鼠相比,模型组小鼠腮腺组织中AQP1和AQP5的表达水平均显着降低（P<0.05,P<0.05）;模型组小鼠颌下腺组织中AQP1和AQP5的表达水平均显着降低（P<0.05,P<0.05）。（三）阴虚津亏模型小鼠“口干”症状的分子机制研究Western Blotting结果显示:与正常组小鼠比较,模型组小鼠颌下腺组织p-PKA/PKA、p-CREB/CREB 的表达水平明显降低（P<0.05,P<0.001）。结论:1.“热盛伤阴”法能够成功建立阴虚津亏动物模型。基于阴虚证临床表现“五心烦热、口干、大便干燥、皮肤干燥、尿赤、形体消瘦”等制定模型评价方法,有利于完善阴虚证动物模型评价体系。2.阴虚津亏动物模型“口干”症状的发生与腮腺、颌下腺组织形态的病理性变化有关。腮腺、颌下腺组织水通道蛋白AQP1、AQP5表达水平的降低可能是导致阴虚口干发生的重要因素。3.阴虚津亏动物模型“口干”症状的发生与颌下腺组织形态的病理性变化关系尤为密切,并且颌下腺组织AQP5的表达水平降低可能是导致阴虚口干的重要因素,这一变化过程可能是由cAMP-PKA-CREB信号通路所调控。
王宝剑[2]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中研究指明黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
王俊秀[3]（2021）在《飞蝗DEAD-box家族基因及分子功能研究》文中认为DEAD-box蛋白是一类依赖于ATP的RNA解旋酶,广泛存在于细菌、真菌和动植物中,参与细胞内几乎所有与RNA有关的代谢过程,在生物体的生长发育过程中扮演着不可或缺的角色。多数有关DEAD-box蛋白的研究集中在酵母、哺乳动物和人中,而昆虫中的研究相对较少。本文以农业害虫飞蝗（Locusta migratoria）为研究对象,分析DEAD-box基因在飞蝗不同发育阶段和表皮、脂肪体及卵巢等组织器官中的表达模式,并通过RNAi方法探究了DEAD-box基因在飞蝗生长和生殖发育过程中的功能。本研究为全面解析飞蝗DEAD-box基因功能奠定了基础,也为害虫防治提供了新的靶标基因。本文主要研究结果如下:一、飞蝗DEAD-box家族基因的分子特性及系统发育分析根据人和果蝇DEAD-box基因（DDXs）序列,搜索飞蝗转录组数据库,获得了32个飞蝗DEAD-box家族基因,并参照与人DDXs的同源性,对飞蝗DDXs进行命名（LmDDXs）。研究发现,不同LmDDXs基因之间的序列长度集中在840-2502 bp之间,其中26个基因具备全长CDS序列,均包含DDXs基因特有的9个保守motifs。大部分LmDDXs蛋白均含有DEXDc和HELICc功能域,且部分LmDDXs蛋白的N-或C-末端含有特异的结构域,如DUF4217、Zn＿C2HC、KH和DBP10 CT domain,这些结构可能决定了LmDDXs基因的功能特异性。利用飞蝗基因组数据库分析其基因结构,结果显示,LmDDXs基因的外显子数目差异较大,其中LmDDX23和LmDDX41只有一个外显子,而LmDDX27有15个外显子。系统发育分析发现:几乎所有LmDDXs基因在果蝇、家蚕、赤拟谷盗、白蚁和德国小蠊中都有直接同源基因,表明昆虫中DDXs基因具有高度保守性。另外,大多数飞蝗LmDDXs在人中也都有同源基因。这说明DDXs基因在动物进化过程中是保守的。二、飞蝗DEAD-box家族基因的mRNA表达特性及功能分析利用RT-qPCR对32个飞蝗LmDDXs基因在不同发育阶段的表达进行了分析,结果显示:LmDDXs基因在卵（中期）、若虫和成虫中均有表达;大部分LmDDXs基因在飞蝗卵期的表达量较低,在2、3龄若虫期的表达较高;LmDDX4、LmDDX49和LmDDX52等基因在整个发育过程中的表达比较稳定。LmDDXs基因在飞蝗表皮、脂肪体、前肠、中肠、后肠、胃盲囊、马氏管、精巢和卵巢中的表达图谱显示:大部分基因在精卵巢中的表达水平较其它组织高。采用RNAi技术分析了32个LmDDXs基因在飞蝗生长发育中的功能,对3龄若虫飞蝗注射ds LmDDXs,结果表明:LmDDXs的沉默效率在52%-98%之间;其中下调LmDDX18、LmDDX39、LmDDX41、LmDDX47、Lme IF4A和LmDDX3、LmDDX6 7个基因导致飞蝗存活时间缩短,最终于蜕皮前后相继死亡;解剖死亡飞蝗的内部结构发现,前5个基因的下调引起飞蝗中肠和胃盲囊发育萎缩,而后2个基因则无此现象。上述结果表明:部分LmDDXs基因在飞蝗肠道发育中发挥重要作用。三、LmDDX47对飞蝗肠道发育的影响为了解LmDDXs基因对飞蝗肠道发育的具体影响,本文选择了LmDDX47,分别在5龄若虫和成虫中对其进行RNAi分析。结果表明:在这些发育阶段中下调LmDDX47,均会导致飞蝗中肠及胃盲囊萎缩,表明LmDDX47在肠道发育和维持上是必需的,没有发育阶段特异性。进一步通过切片染色观察中肠和胃盲囊组织学变化,结果显示:下调LmDDX47,导致肠上皮细胞和肠道干细胞的数目明显减少;经TUNEL染色发现肠上皮细胞出现明显的凋亡现象,Histone 3 RNA原位杂交显示肠道干细胞的增殖能力减弱;深入观察其超微结构变化发现,线粒体形态肿大且分布于整个细胞中;为了更好地理解LmDDX47在肠道发育中的作用机制,本文分析了LmDDX47在中肠的表达丰度及其亚细胞定位情况,结果表明:LmDDX47在整个飞蝗中肠发育过程中稳定表达,且定位于细胞核仁,预测其参与核糖体的合成。经RT-qPCR检测发现下调LmDDX47确实引起18S r RNA的合成减少。为了深入解析LmDDX47在飞蝗中肠的作用机制,对干扰LmDDX47后的飞蝗中肠蛋白进行了蛋白修饰检测,结果显示:部分中肠蛋白的乙酰化、巴豆酰化程度增加。这些研究结果表明:LmDDX47在飞蝗肠道发育中对肠干细胞的增殖、线粒体正常形态的维持和部分肠道蛋白的修饰具有调控作用。四、DEAD-box基因对飞蝗生殖发育的影响LmDDXs表达数据显示:绝大部分LmDDXs在飞蝗精、卵巢表达较高,但下调这些基因后,没有发现明显的精巢发育异常。因此,本文仅聚焦LmDDXs基因对卵巢发育的影响。首先选择了12个在飞蝗卵巢中表达量较高的LmDDXs基因进行研究,结果表明:下调LmDDX3,LmDDX6,LmDDX18,LmDDX39,LmDDX41,LmDDX47和Lme IF4A的表达,均导致飞蝗卵巢发育和卵母细胞成熟阻滞,表明这些基因对飞蝗卵巢发育至关重要。进一步以LmDDX3和LmDDX6为例,具体分析了其在成虫飞蝗卵巢发育中的作用。下调LmDDX3或LmDDX6,均引起调控卵巢发育的JH信号通路靶基因的表达异常,脂肪体组织中卵黄原蛋白（LmVg）的表达降低;最终导致飞蝗卵巢发育和卵母细胞成熟受阻。然而,下调LmDDX3和LmDDX6后,部分靶基因的表达出现明显差异。下调LmDDX3后,卵黄原蛋白受体（LmVg R）的表达显着升高,而下调LmDDX6后,LmVg R的表达则没有明显变化;此外,下调LmDDX6导致JH受体LmMet及其靶基因LmGrp78-2均发生下调,而干扰LmDDX3并不影响这些基因的表达。这表明这些LmDDXs在卵巢发育过程中的作用机制可能不同。综上所述,本文通过生物信息学方法获得了32个LmDDXs基因,并对其进行了基因和蛋白结构分析;采用RT-qPCR的方法分析了这些基因在飞蝗不同发育阶段和不同组织器官中的表达情况;利用RNAi方法筛选获得了参与飞蝗肠道和卵巢发育的几个关键基因。详细研究了LmDDX47对飞蝗中肠发育以及LmDDX3和LmDDX6对成虫飞蝗卵巢发育的作用机制。研究结果揭示了部分LmDDXs基因在飞蝗生长发育中的生物学功能,为研究其它生物类群DDXs基因功能奠定了基础,并为开展基于RNAi的害虫防治提供了新的分子靶标。
张荣沛[4]（2021）在《蒸馏水对人晶状体上皮细胞活性的影响及分子机制》文中指出第一部分蒸馏水对人晶状体上皮细胞的活性影响及清除作用目的:探讨蒸馏水（DW）引起年龄相关性白内障患者离体前囊膜晶状体上皮细胞（LECs）死亡的有效及最佳作用时间。探讨DW联合冲洗清除LECs的有效及最佳作用时间。观察并分析DW处理后LECs的组织病理学变化。方法:收集白内障手术取出的156片晶状体前囊膜,分别等分为312小片。157小片用于细胞活性研究,随机分为4组:阴性对照组、阳性对照组、平衡盐溶液（BSS）组和DW组（BSS或DW分别浸泡囊膜1、2或3分钟）,分析各组细胞活性指标差异。125小片囊膜随机分为2组:BSS联合冲洗组和DW联合冲洗组（BSS或DW分别浸泡囊膜1、2或3分钟后,70cm瓶高处BSS冲洗囊膜1分钟）,分析各组LECs脱落百分比差异。各取15小片囊膜分别行苏木素-伊红（HE）染色及透射电子显微镜（TEM）检查,分析DW处理后的组织病理学变化。结果:（1）DW对LECs活性的影响:DW 2、3分钟组较阴性对照组LECs密度降低,LECs死亡数和死亡率增加有统计学差异。作用时间相同时,DW与BSS相比LECs死亡数和死亡率增加有统计学差异。DW 3分钟组引起LECs死亡数和死亡率增加的作用最显着。（2）DW对LECs的清除作用:DW联合或不联合冲洗各处理组较阴性对照组LECs脱落百分比增加有统计学差异。作用时间相同时,DW联合冲洗较单用DW处理LECs脱落百分比增加有统计学差异。DW 3分钟联合冲洗组引起LECs脱落百分比增加的作用最显着。（3）DW对LECs显微结构的影响:HE染色结果示DW 1、2、3分钟组细胞破坏,DW 2、3分钟组LECs部分脱落。（4）DW对LECs超微结构的影响:TEM结果示DW 1、2、3分钟组细胞溶解破坏,细胞器肿胀,细胞间连接破坏;DW 1、2分钟组细胞与囊膜连接疏松,DW 3分钟组细胞与囊膜部分分离。结论:（1）DW处理人眼离体前囊膜LECs 2或3分钟均可明显降低细胞活性,导致LECs死亡;DW 3分钟引起LECs死亡的作用最显着。（2）DW 1、2或3分钟联合BSS冲洗均可有效清除人眼离体前囊膜LECs;DW 3分钟联合冲洗清除LECs的作用最显着。（3）DW处理后LECs的组织病理学变化提示LECs坏死。第二部分蒸馏水对人晶状体上皮细胞作用的分子机制目的:研究蒸馏水（DW）能否诱导LECs凋亡,及引起凋亡的有效及最佳作用时间。研究DW引起LECs凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9水平变化的有效及最佳作用时间。方法:选取人晶状体上皮细胞（LECs）SRA01/04细胞系,分为4组:阴性对照组、阳性对照组、平衡盐溶液（BSS）组和DW组（BSS或DW分别处理SRA01/04细胞30秒,1、2或3分钟后继续培养24小时）。通过流式细胞术检测细胞是否凋亡,分析各组细胞凋亡率差异;通过蛋白质印迹法检测细胞Bax、Bcl-2,Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9蛋白水平变化,比较各组凋亡蛋白水平差异。结果:（1）流式细胞术:DW 2和3分钟组较阴性对照组SRA01/04细胞总凋亡率和晚期凋亡率增加有统计学差异;DW 3分钟组较阴性对照组细胞早期凋亡率增加有统计学差异。作用时间为2或3分钟时,DW较BSS细胞总凋亡率及晚期凋亡率增加有统计学差异。DW 3分钟组引起细胞凋亡率增加的作用最显着。（2）蛋白质印迹法:DW 2和3分钟组较阴性对照组Bax、Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9蛋白水平增加,Bcl-2蛋白水平降低有统计学差异。作用时间为1、2或3分钟时,DW较BSS Bax、Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9蛋白水平增加,Bcl-2蛋白水平降低有统计学差异。DW 3分钟组引起细胞凋亡蛋白水平变化的作用最显着。结论:（1）DW处理2或3分钟可引起LECs凋亡,且主要引起细胞晚期凋亡。DW 3分钟引起LECs凋亡的作用最显着。（2）DW处理2或3分钟可引起Bax、Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 9蛋白水平增加,Bcl-2蛋白水平降低,导致LECs凋亡。DW 3分钟组凋亡相关蛋白水平变化最显着。
杨荣[5]（2020）在《石斛酚、丁香酸的跨膜转运蛋白筛选、验证及其相互作用研究》文中认为研究目的及背景:石斛酚、丁香酸是从名贵中药材石斛中提取出的活性成分,具有良好的抗糖尿病性白内障作用。目前,石斛酚,丁香酸的药理机制已经逐步被阐明,但是其在人晶状体上皮细胞（Human lens epithelial cells,HLECs）内的跨膜吸收转运的确切机制尚不清楚。本课题旨在筛选、验证摄取石斛酚、丁香酸进入HLECs的跨膜转运蛋白,考察药物分子与跨膜转运蛋白的相互作用力。方法:1.PDB数据库、TCDB和Uniprot蛋白数据库合并Pubmed文献数据库检索在HLECs表达且能够吸收转运药物分子进入细胞内的候选跨膜转运蛋白,同源模建候选转运蛋白的三维结构,利用分子对接实验进一步模拟筛选石斛酚、丁香酸的候选跨膜转运蛋白。2.通过小干扰RNA（siRNA）沉默候选跨膜转运蛋白,转染孵育72小时后进行实时荧光定量PCR实验（qPCR）和蛋白印迹实验（western blot）实验验证沉默效果,构建候选跨膜转运蛋白瞬时沉默的HLECs细胞。3.使用高效液相色谱检测沉默候选跨膜转运蛋白的HLECs对石斛酚、丁香酸的吸收量,与正常组HLECs细胞对石斛酚、丁香酸的吸收量比较,筛选转运吸收石斛酚、丁香酸进入HLECs胞内的跨膜转运蛋白。4.使用原子力扫描探针显微镜在液相力曲线测量模式下进一步考察药物分子与各自跨膜转运蛋白相互作用的粘滞力。结果:1.蛋白数据库综合文献检索得到表达于人晶状体上皮细胞的吸收跨膜转运蛋白19个,经过纳入与排除后,得到4个可能的转运蛋白单羧酸转运蛋白12（Monocarboxylate transporter 12,MCT12）、Na（+）/二羧酸共转运体1（Na（+）/dicarboxylate cotransporter 1,NaDC1）、钠依赖性磷酸转运蛋白1（Sodium-dependent phosphate transport protein 1,NPT1）和人有机阴离子转运蛋白1（Organic anion transporter 1,OAT1）。石斛酚与MCT12的最低结合能为-5.98 kcal/mol,与OAT1的结合能为-4.35 kcal/mol,石斛酚与NaDC1和NPT1的结合能分别为-2.34和-1.19 kcal/mol。丁香酸分别与MCT12和OAT1的结合能为-5.56和-4.46 kcal/mol,丁香酸与NaDC1和NPT1的结合能大小分别为-1.71和-1.22 kcal/mol。表明石斛酚、丁香酸与MCT12和OAT1均有较强的结合能力,可能被其转运吸收。因此石斛酚、丁香酸的候选跨膜转运蛋白为MCT12和OAT1。2.qPCR结果显示沉默后MCT12的基因相对表达量为0.42±0.02,OAT1的基因相对表达为0.60±0.04,与正常组细胞相比,其表达基因表达量显着下降,MCT12的沉默效率约为58%,OAT1的基因沉默效率约为40%,western blot结果显示MCT12和OAT1的蛋白表达水平相比正常组显着降低。3.高效液相检测MCT12沉默组HLECs对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.342±0.033μmol/g和0.444±0.031μmol/g;OAT1沉默组对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.609±0.023μmol/g和0.092±0.009μmol/g。正常HLECs对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.570±0.008μmol/g和0.496±0.070μmol/g。与正常细胞对石斛酚的吸收量相比,MCT12沉默组HLECs对石斛酚的吸收量明显减少,而对丁香酸的吸收量无明显改变。与正常细胞对丁香酸的吸收量比较,OAT1沉默组对丁香酸的吸收量明显减少,而对石斛酚的吸收量无明显改变。4.正常HLECs细胞的粘滞力大小为0.050±0.008n N,石斛酚作用之后细胞粘滞力增加,大小为0.329±0.022n N,与正常细胞粘滞力相比显着增加,当MCT12被沉默再给予石斛酚之后,粘滞力为0.123±0.015n N,与正常细胞+石斛酚组相比显着减少;当丁香酸作用之后细胞粘滞力大小为0.219±0.035n N,与正常组比较显着增加,当OAT1被沉默再给予丁香酸之后,细胞的粘滞力为0.103±0.007n N,与正常细胞+丁香酸组相比显着减少。结论:石斛酚在沉默MCT12的细胞吸收量显着减少,丁香酸在沉默OAT1的HLECs的吸收量显着减少,表明石斛酚和丁香酸分别经转运蛋白MCT12和OAT1转运吸收,转运过程中石斛酚与MCT12、丁香酸与OAT1的相互结合和作用力引起细胞粘滞力发生明显改变。
崔艺蕾[6]（2020）在《TGF-β2通过自噬调控EMT在后发性白内障中的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:探索TGF-β2通过自噬调控上皮间充质转化（EMT）在后发性白内障中的作用及其机制,为后发性白内障的防治提供新思路。方法:在人晶状体上皮细胞中,运用PCR、Western blot、免疫荧光法检测不同浓度TGF-β2对自噬相关蛋白LC3、P62、Atg5、Beclin-1表达的影响,运用透射电镜法观察自噬体的形成,从而探究TGF-β2对自噬及自噬流的影响。在加或不加入TGF-β2受体抑制剂SB431542后观察TGF-β2对自噬的改变。在运用雷帕霉素诱导自噬或3-MA抑制自噬的条件下检测EMT相关标记物的表达情况。结果:TGF-β2在人晶状体上皮细胞中特异性的诱导自噬及自噬流的发生,并且随着浓度增高,自噬水平增加,即出现自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1表达增多、P62表达减少,同时电镜下观察到自噬体数量相对于对照组明显增多。自噬增强促进EMT的发生、自噬受阻抑制EMT的发生。结论:本研究首次发现TGF-β2在人晶状体细胞中诱导自噬发生,而自噬对EMT具有调控作用。因此,TGF-β2介导的自噬作为一个潜在的作用机制,为深入了解后发性白内障的发病机制提供了研究基础,为后发性白内障的预防及药物治疗提供新方向。
高文静[7]（2020）在《糖尿病兔行小切口基质透镜取出术后角膜结构的观察》文中研究指明目的:观察不同血糖水平的糖尿病兔飞秒激光小切口基质透镜取出术（Small incision lenticule extraction,SMILE）后的角膜结构变化,为临床糖尿病患者是否可行SMILE手术提供理论依据。方法:30只新西兰大白兔预饲养1w,随机选取26只静脉注射四氧嘧啶（Alloxan,ALX）制作糖尿病兔模型,余为正常对照组（4只）。选取造模成功的8只,通过调整胰岛素用量以控制血糖水平,将其分为持续高糖组（4只）和血糖控制组（4只）。成模2w后三组均行SMILE手术,于术前、术后1d、1w、4w、12w行裂隙灯显微镜、眼前节光学相干断层扫描（Anterior segment optical coherence tomography,AS-OCT）、共聚焦显微镜（In vivo confocal microscopy,IVCM）检查。采用SPSS 25.0软件对检查数据进行统计学分析,P<0.05具有统计学差异。结果:1.裂隙灯检查:术后1d,三组结膜均无充血,未见结膜囊分泌物,角膜切口对合好;术后1w,仅持续高糖组1只眼切口附近角膜帽上1/4水肿,余角膜透明;术后4w,三组角膜均透明。2.AS-OCT:术前三组的中央角膜厚度（Central corneal thickness,CCT）无统计学差异,三组各时间点的实际CCT均较理论CCT厚,但组间无统计学差异。血糖控制良好的糖尿病兔与正常兔的角膜厚度偏差量（△CT）均随术后时间延长增加,术后12w最大。3.IVCM:持续高糖组术后各层细胞及神经纤维的形态及排列较血糖控制组与正常对照组不规则,血糖控制组与正常对照组间无明显差异。术前三组间的前基质细胞密度、内皮细胞密度（Endothelial cell density,ECD）均无统计学差异。（1）组间比较:持续高糖组的整体前基质细胞密度低于血糖控制组及正常对照组,且有统计学差异;血糖控制组的与正常对照组比较无统计学差异。三组间ECD无统计学差异。（2）不同时间点比较:高糖组的前基质细胞密度和ECD均随时间延长显着降低。血糖控制组和正常对照组的细胞密度随时间的变化趋势无差异:术后1w的前基质细胞密度均较术前降低,随后趋于稳定;两组术后的ECD均较术前无统计学差异。结论:1.高血糖水平是造成SMILE术后角膜结构变化的不良影响因素。2.血糖控制良好的糖尿病兔行SMILE手术是安全、有效的。
田根全[8]（2019）在《活血通络利水方对RIR大鼠视网膜神经纤维层厚度及AQP4，GLAST，GS表达的影响》文中研究指明目的观察活血通络利水方对急性视网膜缺血再灌注（retinal ischemia reperfusion,RIR）损伤模型大鼠的视网膜神经纤维层的保护作用,以及对水通道蛋白-4（Aquaporin-4,AQP4）、L-谷氨酸/L-天冬氨酸转运体（L-gluta-mate/Laspartate transporter,GLAST,也称EAAT1）以及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）表达的影响。方法实验一:25只BN雄性大鼠,随机抽取5只,造高眼压模型,用光学相干断层扫描仪（OCT）观察5只BN大鼠视网膜的神经纤维层厚度随时间的变化情况,找出其变化规律;根据上述实验结果,选择6小时和8周为两个时间观察点,将20只BN雄性大鼠,随机分为4组,分别为正常对照组,模型对照组、中药对照组、银杏叶片对照组,造模给药,然后用OCT观察4组BN大鼠视网膜的神经纤维层厚度随时间的变化情况,来检测中药和银杏叶片的效果。实验二:28只SD雄性大鼠随机分为7组,第一组是正常对照组,其余6组为模型对照组,模型对照组分别选取造模后6小时、12小时、1天、3天、1周、2周的6个时间点的大鼠。然后按6个时间点麻醉处死提取视网膜组织,进行West Blot实验,找出AQP4、GLAST以及GS表达最显着的时间点。2根据上述结果,选择造模后6小时为时间观察点;将16只SD雄性大鼠随机分为4组,为模型对照组、中药对照组、银杏叶片对照组,造模给药6小时后,进行麻醉处死大鼠,提取视网膜组织,进行West Blot实验,从而对比正常对照组、模型对照组、中药对照组、银杏叶片对照组之间AQP4、GLAST以及GS的表达高低的变化关系。结果实验一:1在6小时的时候,神经纤维层厚度增强,表示现在还处于水肿期,而在4周、8周、12周时厚度降低,表明大鼠的由于高眼压造成了神经纤维层的变薄。2采用中药和银杏叶干预后,发现在6小时时其神经纤维层厚度变薄;8周时神经纤维层厚度变薄程度减轻。实验二:1在AQP4、GLAST以及GS表达最显着的时间点为6h,其余时间点比较无显着意义。2在6h时,模型对照组视网膜组织中的AQP4表达最低,中药组与银杏叶片对照组AQP4表达高于模型对照组,但是低于正常对照组,中药组和银杏叶片对照组的差异无显着意义;中药组与银杏叶片对照组GLAST与GS表达低于模型对照组但是高于正常对照组,中药组和银杏叶片对照组的差异无显着意义。结论1活血通络利水方能减轻视网膜缺血再灌注损伤的视网膜初期的水肿程度和视网膜视神经纤维层厚度;长期观察能减少视神经纤维层变薄,保护视神经。活血通络利水方能提高视网膜缺血再灌注损伤AQP4、GS和GLAST的表达水平和活性,从而起到保护视网膜组织的作用。2活血通络利水方能提高视网膜缺血再灌注损伤后AQP4、GS和GLAST的表达水平和活性,从而保护视网膜组织。图5幅;表9;参81篇。
白梦天,康刚劲,徐曼华,李茂娇,彭正红,吴剑,李韵[9]（2018）在《生姜提取物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠晶状体的保护作用》文中研究表明目的探讨生姜提取物对链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病大鼠晶状体的保护作用。方法 60只SD大鼠随机分为A组（正常对照组）、B组（糖尿病组）、C1组(糖尿病+生姜灌胃50 mg·kg-1组)、C2组(糖尿病+生姜灌胃100mg·kg-1组)、C3组(糖尿病+生姜灌胃300 mg·kg-1组),每组各12只。除A组腹腔注射等体积生理盐水外,其余各组均一次性腹腔注射STZ 65 mg·kg-1。动物模型建立成功后,立即予以C1、C2、C3组大鼠生姜提取物灌胃,A、B组给予等量生理盐水灌胃。观察大鼠成模前与成模后4周、8周、12周时血糖、晶状体变化情况。成模后4周、8周、12周分批处死大鼠并立即取出晶状体,ELISA检测晶状体醛糖还原酶（aldose reductase,AR）含量;Western blot检测糖基化终末产物（glycosylation end products,AGEs）的表达;超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性测定试剂盒检测SOD活性,丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量测定试剂盒检测MDA含量;TUNEL法检测晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）凋亡率,扫描电镜观察晶状体超微结构变化。结果糖尿病大鼠晶状体SOD活性呈下降趋势,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。除A、C3组外,其余各组大鼠晶状体MDA含量变化在成模后4周、8周、12周时差异均有统计学意义（P=0.003、0.000、0.017）。B组大鼠AR持续性增高（P=0.003）。C1、C2、C3组大鼠晶状体AR含量呈下降趋势,差异均有统计学意义（P=0.007、0.000、0.000）。C1、C2、C3组大鼠晶状体AGEs表达情况差异均有统计学意义（均为P<0.05）。扫描电镜发现,B组大鼠晶状体皮质纤维破坏程度呈进行性加重,C1、C2、C3组大鼠皮质破坏程度随灌胃浓度的增加而呈减轻趋势。A组大鼠LECs凋亡率无明显差异性变化（P=0.191）,其余大鼠LECs的凋亡呈现上升趋势,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论生姜提取物灌胃可延迟糖尿病大鼠晶状体混浊时间并减慢其进展速度,并有一定的浓度依赖性,这可能是通过抑制醛糖还原酶活性、氧化应激反应、AGEs的产生以及晶状体上皮细胞凋亡等途径实现的。
代杰[10]（2017）在《硒对半乳糖性白内障的干预作用及机理》文中认为半乳糖性白内障与糖尿病性白内障合称为“糖性白内障”。半乳糖性白内障大鼠作为一种实验性动物模型,常用于糖性白内障发病机理的研究以及抗白内障药物的筛选。大量研究发现半乳糖性白内障的发生发展与晶状体上皮细胞的凋亡及晶状体的氧化损伤有着密切联系。适量补硒可以提高机体的抗氧化能力,硒蛋白R（SelR）作为蛋氨酸亚砜还原酶家族中唯一的硒蛋白,其保护细胞抵抗氧化损伤的生物学功能已见报道。但是,SelR和一些常用的硒补充剂如ebselen（依布硒啉）,在抑制半乳糖性白内障的发生发展上所起到的保护作用及其潜在的作用机制依然鲜为人知。本文以人晶状体上皮（hLE）细胞SRA01/04和半乳糖诱导的白内障大鼠为研究对象,采用基因沉默技术探讨了SelR在保护hLE细胞抵抗氧化损伤和细胞凋亡上所起的作用,并调查了Na2SeO3和ebselen对半乳糖性大鼠的晶状体中氧化应激的调控和对SelR蛋白表达的影响,以及对半乳糖大鼠肝、肾、脑中氧化还原平衡的影响。主要研究结果如下:（1）采用蛋白质印迹、流式细胞术和荧光显微镜等方法研究了SelR基因沉默对半乳糖诱发的h LE细胞凋亡的影响,调查了细胞内的氧化应激水平,并对线粒体膜电位、细胞色素c向胞质的释放以及caspase-3酶活的变化进行了分析。结果显示,半乳糖和SelR沉默均可诱导hLE细胞产生氧化应激。当半乳糖作用于SelR基因沉默细胞时,葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的蛋白表达水平显着升高,线粒体膜电位明显降低,并伴随着线粒体细胞色素c向胞质的释放;与此同时,细胞凋亡率和caspase-3酶活也明显升高。这些结果表明,SelR可保护细胞和线粒体抵抗半乳糖诱导的氧化应激、内质网应激和细胞凋亡,暗示了硒作为微量元素在保护h LE细胞中可能发挥着重要作用。（2）为了探索Na2SeO3和ebselen在预防和减缓糖性白内障的形成和发展上所起的作用,我们在透射电镜（TEM）下对半乳糖模型大鼠的晶状体纤维细胞（LFC）和晶状体上皮细胞（LEC）进行形态观察,并调查了大鼠晶状体中的氧化应激水平以及一些蛋白质的表达水平,如SelR、15 kDa硒蛋白（Sep15）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、过氧化氢酶（CAT）、β-晶状体蛋白,醛糖还原酶（AR）和GRP78。结果表明,过量的半乳糖注射使大鼠的晶状体细胞形态受到损伤并导致白内障的形成,然而,Na2SeO3和ebselen的补充能明显缓解LFC和LEC超微结构的损伤。此外,Na2SeO3和ebselen的补充可以明显减轻大鼠晶状体内的氧化损伤,并增加SelR、Sep15、SOD1、CAT和β-晶状体蛋白的表达以及减少AR和GRP78的蛋白质表达。这些研究结果首次揭示了Na2SeO3和ebselen在半乳糖模型大鼠中的抗白内障潜力,并为Na2SeO3和ebselen在糖性白内障中所起的作用及作用机制提供重要的新见解。（3）在给大鼠腹腔注射10 g/kg BW半乳糖30天后成功得到半乳糖性白内障大鼠模型;在给大鼠腹腔注射半乳糖的同时分别注射1 mg/kg BW Na2SeO3和3mg/kg BW ebselen,30天后取其肝、肾、脑用于后续研究。采用试剂盒测定了半乳糖性白内障模型大鼠中肝、肾、脑中GPx的活性及MDA、TSH、PC含量的变化。结果显示模型大鼠的肝和肾中GPx活性和TSH含量显着降低,MDA和PC水平大幅度提高,说明大鼠的肝和肾中均发生了严重的氧化损伤;但Na2SeO3和ebselen的补充则使GPx活性和TSH水平升高,MDA和PC水平降低,说明Na2SeO3和ebselen能在一定程度上保护肝脏和肾脏抵抗半乳糖诱导的氧化应激;而大鼠的脑组织中GPx活性及MDA、PC、TSH含量无明显变化。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 理论探讨 |
| 第一节 阴虚证动物模型研究进展 |
| 一、模拟病因病机建立阴虚证动物模型 |
| 二、模拟临床表现建立阴虚证动物模型 |
| 三、不足与展望 |
| 第二节 “阴主濡润”的理论源流与内涵 |
| 一、“阴主濡润”的理论源流 |
| 二、“阴主濡润”的理论内涵 |
| 第三节 AQPs的研究概述 |
| 一、AQPs的分子结构 |
| 二、AQPs的分类、分布及生理功能 |
| 第四节 基于“阴主濡润”理论探讨AQPs与口干的相关性 |
| 一、AQPs与阴主濡润的关系 |
| 二、AQPs与唾液分泌的关系 |
| 三、AQPs在口干中的应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 阴虚津亏动物模型建立与评价 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 AQP1、AQP5在阴虚津亏模型小鼠唾液腺中的表达及意义 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 阴虚津亏模型小鼠“口干”症状的分子机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 本课题受如下项目资助 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 RNA解旋酶 |
| 1.1.1 DEAD-box蛋白概述 |
| 1.1.2 DEAD-box蛋白结构 |
| 1.1.3 DEAD-box蛋白的生化功能 |
| 1.2 DEAD-box基因的研究进展 |
| 1.2.1 DEAD-box基因的生物学功能 |
| 1.2.2 DEAD-box蛋白与人类疾病 |
| 1.2.3 昆虫DEAD-box基因 |
| 1.3 飞蝗肠道和生殖系统发育 |
| 1.3.1 飞蝗肠道发育 |
| 1.3.2 雌性飞蝗生殖发育 |
| 1.4 本文研究内容及意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究目的和意义 |
| 1.4.3 技术路线图 |
| 第二章 飞蝗DEAD-box家族基因分离和分子特性研究 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 LmDDXs序列获得和命名 |
| 2.1.2 LmDDXs基因组结构分析 |
| 2.1.3 LmDDXs氨基酸推导与功能域分析 |
| 2.1.4 DDXs系统发育树构建 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 LmDDXs序列搜索 |
| 2.2.2 LmDDXs氨基酸序列推导与分析 |
| 2.2.3 LmDDXs基因结构分析 |
| 2.2.4 LmDDXs的系统发育分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 飞蝗DEAD-box家族基因的表达特性及功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 飞蝗饲养 |
| 3.1.2 实验药品及主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 不同发育龄期飞蝗的收集 |
| 3.2.2 飞蝗不同组织解剖 |
| 3.2.3 RNA提取 |
| 3.2.4 飞蝗不同龄期和不同组织cDNA模板制备 |
| 3.2.5 RT-qPCR引物设计 |
| 3.2.6 LmDDXs基因的表达分析 |
| 3.2.7 dsRNA合成引物设计 |
| 3.2.8 dsRNA体外合成 |
| 3.2.9 dsRNA注射 |
| 3.2.10 LmDDXs基因沉默效率检测及表型观察 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LmDDXs基因在飞蝗不同发育阶段的表达分析 |
| 3.3.2 LmDDXs基因在飞蝗不同组织部位的表达分析 |
| 3.3.3 LmDDXs基因的功能分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 LmDDX47在飞蝗肠道中的功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试昆虫及果蝇S2 细胞培养 |
| 4.1.2 实验仪器及试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 LmDDX47的mRNA表达特性 |
| 4.2.2 S2细胞瞬时转染LmDDX47及亚细胞定位观察 |
| 4.2.3 肠道的组织学观察 |
| 4.2.4 RNA原位杂交 |
| 4.2.5 透射电镜观察 |
| 4.2.6 LmDDX47RNA干扰 |
| 4.2.7 TUNEL凋亡检测 |
| 4.2.8 Histone3细胞增殖检测 |
| 4.2.9 Western blot |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 干扰LmDDX47对飞蝗肠道发育的影响 |
| 4.3.2 LmDDX47在中肠组织中的mRNA表达特性 |
| 4.3.3 LmDDX47的亚细胞定位 |
| 4.3.4 下调LmDDX47导致飞蝗肠道的组织学变化 |
| 4.3.5 下调LmDDX47导致肠道上皮细胞过度凋亡 |
| 4.3.6 下调LmDDX47引起飞蝗肠道干细胞增殖变化 |
| 4.3.7 下调LmDDX47后飞蝗肠道细胞的超微结构变化 |
| 4.3.8 下调LmDDX47导致飞蝗肠道蛋白修饰的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 飞蝗DEAD-box家族基因在卵巢发育中的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 飞蝗饲养 |
| 5.1.2 实验药品及主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 成虫飞蝗组织解剖 |
| 5.2.2 不同发育天数成虫飞蝗卵巢的收集 |
| 5.2.3 cDNA模板制备 |
| 5.2.4 RNA干扰及表型分析 |
| 5.2.5 RT-qPCR检测与数据分析 |
| 5.2.6 卵巢和卵小管图像采集 |
| 5.2.7 苏木精伊红染色 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LmDDXs基因在飞蝗卵巢发育中的功能 |
| 5.3.2 LmDDX3在飞蝗卵巢发育中的功能 |
| 5.3.3 LmDDX6在飞蝗卵巢发育中的功能 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 蒸馏水对人晶状体上皮细胞的活性影响及清除作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 蒸馏水对人晶状体上皮细胞作用的分子机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 药物预防白内障术后晶状体囊膜混浊的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录:中英文缩略词对照 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 基金项目 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 研究背景及立题依据 |
| 1、药物分子跨膜转运蛋白筛选的研究进展 |
| 2、药物分子与跨膜转运蛋白相互作用的研究进展 |
| 3、晶状体上皮细胞跨膜转运蛋白的研究进展 |
| 4、石斛酚、丁香酸的研究进展 |
| 第二章 实验内容 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 候选跨膜转运蛋白的筛选 |
| 2.2 药物溶液配置 |
| 2.3 HLECs培养与细胞计数 |
| 2.4 基因沉默 |
| 2.5 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR) |
| 2.6 蛋白印迹实验(Western blot) |
| 2.7 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC) |
| 2.8 原子力扫描探针显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM) |
| 2.9 数据分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 石斛酚、丁香酸的候选跨膜转运蛋白 |
| 3.2 RNAi沉默OAT1和MCT12 |
| 3.2.1 OAT1和MCT12 的基因表达 |
| 3.2.2 OAT1和MCT12 的蛋白表达 |
| 3.3 OAT1和MCT12 沉默对石斛酚、丁香酸吸收量的影响 |
| 3.4 石斛酚与 MCT12,丁香酸与 OAT1 的相互作用力 |
| 4、讨论 |
| 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略语对照表 |
| 在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 TGF-β2在人晶状体上皮细胞中诱导自噬发生 |
| 3.2 TGF-β2在人晶状体上皮细胞内促进自噬流进行 |
| 3.3 在人晶状体上皮细胞中探究自噬与EMT的关系 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 转化生子因子β在后发性白内障的发病机制及其防治中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 糖尿病患者的角膜屈光手术 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 活血通络利水方对RIR大鼠视神经纤维层厚度的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物、药物、仪器耗材以及实验试剂 |
| 1.1.2 大鼠视网膜缺血—再灌注损伤模型的制作 |
| 1.1.3 动物分组及给药方法 |
| 1.1.4 检测方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠视网膜缺血再灌注损伤后神经纤维层厚度随着时间变化的趋势 |
| 1.2.2 活血通络利水方对造模后BN大鼠视神经纤维层厚度的影响 |
| 第2章 活血通络利水方对RIR大鼠AQP4、GLAST、GS的分子蛋白表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、药物、仪器耗材以及实验试剂 |
| 2.1.2 大鼠视网膜缺血—再灌注损伤模型的制作与动物分组及实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Westernblot检测造模后与造模服用通络利水方后AQP4、GLAST、GS的分子蛋白表达水平的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 造模与阳性对照药的选择 |
| 2.3.2 活血通络利水方对视网膜神经纤维层的影响 |
| 2.3.3 活血通络利水方对AQP4 的影响 |
| 2.3.4 缺血、缺氧时GLAST与 GS的生理功能及活血通络利水方对其的影响 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第3章 综述 视网膜缺血再灌注的分子机制与治疗 |
| 3.1 视网膜缺血再灌注损伤 |
| 3.1.1 视网膜缺血再灌注损伤的概念 |
| 3.1.2 视网膜缺血再灌注中谷氨酸浓度变化及兴奋毒性 |
| 3.1.3 Müller细胞与谷氨酸 |
| 3.1.4 水通道蛋白(AQP4)与谷氨酸的关系 |
| 3.1.5 视网膜水肿 |
| 3.1.6 视网膜缺血再灌注损伤时与神经纤维层厚度的关系 |
| 3.2 视网膜缺血再灌注损伤的中西医治疗 |
| 3.2.1 视网膜缺血再灌注损伤机制 |
| 3.2.2 西医的治疗 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 动物模型的建立 |
| 1.2.2 大鼠晶状体混浊的分级标准 |
| 1.2.3 晶状体上皮细胞荧光TUNEL染色 |
| 1.2.4 Western blot检测晶状体AGEs表达 |
| 1.2.5 SOD活性与MDA含量测定 |
| 1.2.6 ELISA法检测晶状体AR含量 |
| 1.2.7 扫描电镜观察晶状体纤维形态变化 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠空腹血糖水平 |
| 2.2 大鼠晶状体混浊变化 |
| 2.3 大鼠晶状体SOD活性、MDA含量变化 |
| 2.4 大鼠晶状体AR含量变化 |
| 2.5 大鼠晶状体AGEs表达变化 |
| 2.6 大鼠晶状体超微结构的变化 |
| 2.7 大鼠LECs凋亡情况 |
| 3 讨论 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 糖性白内障发病机理 |
| 1.3 硒与白内障 |
| 1.4 硒蛋白R与 15kDa硒蛋白 |
| 1.5 问题的提出和研究内容 |
| 参考文献 |
| 2 Sel R对半乳糖诱导眼晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 3 亚硒酸钠和Ebselen对半乳糖性白内障大鼠晶状体中氧化应激的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 4 补硒对半乳糖大鼠肝、脑、肾氧化还原平衡的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 5 全文总结 |
| 5.1 主要研究结果 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 课题展望 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 攻读博士学位期间完成的主要论文 |
| 附录Ⅱ 主要缩写词表（按字母顺序） |
