王进宇[1]（2021）在《基于双膦酸盐的递药策略及抗肿瘤治疗的研究》文中研究指明骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,常见于少年儿童。骨肉瘤恶性程度极高,尽管新的化疗手段使该疾病五年生存率从10%～20%有效提高至65%～70%,但仍有部分患者发生转移或肿瘤复发后迅速致死。骨肉瘤最常见的转移部位为肺部,其次为骨头。随着靶向药物的应用和影像学技术的发展,骨肉瘤进展期患者生存时间明显延长,但是后期其脑转移的发生率越来越高。肿瘤转移是一个多连级的细胞生物学过程的最终产物,其涉及癌细胞解剖学上的远端器官扩散,同时对新的组织微环境慢慢适应。包括肿瘤细胞基因遗传改变,非肿瘤间质细胞的富集。这些方面协同刺激为初期转移细胞提供了所需特征。双膦酸盐（bisphosphonates,BPs）对各类骨疾病以及钙代谢性疾病具有治疗作用。于体内可对羟基磷灰石（HAP）特异性靶向进而靶向骨组织,目前已经广泛应用于骨质疏松,肿瘤骨转移等方面。双膦酸盐产生活性的必要条件是P-C-P的基本结构,因为其独特的物理化学性质,其定量方式一般为消解法,柱前或者柱后色谱衍生化检测。虽然该化合物的鉴定方法已经成熟,但其定量方法仍存在检测步骤繁琐,仪器设备昂贵等问题。鉴于此,本论文围绕双膦酸盐的特性,改进了双膦酸盐的检测方法,并利用其生物学作用,设计了一系列纳米药物,抑制肿瘤的转移及治疗肿瘤的应用。（1）双膦酸盐的改进定量方法从药物分析的角度来看,双膦酸盐药物极性高,大多数双膦酸盐没有生色团,不易挥发,因此无法用液相/气相色谱直接检测。本章节基于传统的定磷方法,通过醇类改进原有的定磷试剂,实现改进定磷试剂直接与双膦酸盐发生显色反应。该方法条件温和,反应简单易操作,不需要在极端条件下,即可在短时间内发生显色反应。随后考察了反应时间,反应温度,不同醇,醇含量对显色反应的影响。最后在660 nm处,计算吸光度与双膦酸盐浓度的线性关系。该改性定磷试剂与双膦酸盐的显色具有良好的线性关系,可用于双膦酸盐类药物的含量检测。（2）羟基磷灰石的制备及其负载利塞膦酸钠在抗肿瘤中的应用利用仿生合成筛选高生物相容性针状羟基磷灰石以及Si掺杂花状羟基磷灰石。FTIR,XRD,XPS,TEM,SEM用于表征合成的纳米HAP。该生物相容性良好的HAP用于吸附利塞膦酸钠,并研究载利塞膦酸钠的HAP在体外抗血管生成及抗肿瘤转移的作用。（3）骨靶向阿仑膦酸钠-肝素偶联物递药系统将靶向骨的阿仑膦酸钠与肝素（Heparin）结合,Heparin是CD44v3的配体,CD44v3在许多类型的肿瘤细胞中过表达。初步结果显示,体内阿仑膦酸钠-肝素（ALN-Heparin,AH）治疗对骨转移部位肿瘤的生长具有显着的治疗作用。AH除了减少肿瘤引起的骨溶解外,小鼠中胫骨近端的肿瘤大小也明显减少。AH保留了其组分ALN在体内抗再吸收和在体外抑制破骨细胞形成的最重要能力。另一方面,尽管AH含有肝素,但AH不会延长APTT,同时提高其生物利用度。（4）利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒的制备及其在抗肿瘤治疗中的应用制备利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁超顺磁纳米粒（RIS-FeNPs）纳米粒粒径均一,在溶剂中稳定性良好。利用红外,XRD,透射电镜振动样品磁强计对该纳米粒进行表征。体内外结果表明,该磁性纳米粒虽然对肿瘤细胞的生长只有较低的抑制作用,但是可以抑制肿瘤细胞的迁移功能,抑制血管生成。体内靶向结果显示该磁性纳米粒可以很好的携带RIS通过外加磁场主动靶向至肿瘤部位,靶向至肿瘤部位后,测温探头可以检测到磁热过程中肿瘤部位的明显的升温。RIS-FeNPs的体内实验结果也表明该超顺磁纳米粒可以抑制肿瘤的迁移与转移。该RIS-FeNPs通过磁热作用可以改善肿瘤微环境,下调肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的比例。（5）利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒制备的磁靶向脂质体用于治疗骨肉瘤的研究利用脂质体包裹制备的RIS-FeNPs,并负载脱盐阿霉素。各项物理化学表征结果显示,该方法制备的RFe/DOXLipo粒径均一,脂质体粒径在200nm左右,分散性良好,脂质体能够很好的包裹RIS-FeNPs,未染色的电镜中,RIS-FeNPs呈类似葡萄串结构。并且该脂质体在体外稳定性实验中,在10%胎牛血清环境中稳定性良好,37℃条件下药物缓慢释放。利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒制备的磁靶向脂质体（RFe/DOX Lipo）在外部固定磁场下具有良好的肿瘤靶向性,证明了磁靶向递药策略的可行性。在体内药效实验中,RFe/DOXLipo+M组小鼠肿瘤的生长得到有效的抑制,体内治疗结果表明RIS-FeNPs 联合 DOX 治疗策略的可行性。在体内治疗机制的考察中,肿瘤内相关蛋白表达和免疫因子的免疫组化结果显示两者联合不仅能够抑制肿瘤血管生成,还能重极化肿瘤内M2型巨噬细胞,RFe/DOXLipo+M组小鼠几乎没有检测到M2型巨噬细胞（m（?））的标志物CD206的表达,同时增大了 M1型m（?）的比例（iNOS的表达）。Tunel的结果显示,RFe/DOXLipo+M组肿瘤凋亡明显,表明RFe/DOXLipo可以诱导肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的生长。免疫组化实验结果证明了 RFe/DOXLipo联合磁靶向治疗能够重塑K7肿瘤免疫微环境,重极化或者清除M2型巨噬细胞,可以抑制肿瘤的肺部以及肝脏转移。本研究中构建的RFe/DOXLipo载药系统安全有效,副作用低。联合磁靶向治疗策略在肿瘤治疗、抑制肿瘤转移有着良好的效果,具有潜在的应用前景。（6）利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒制备的磁靶向脂质体磁热疗法克服骨肉瘤的研究利用制备的RFe/DOXLipo脂质体联合磁热治疗K7原位骨肉瘤。该脂质体在交变磁场中可以升温至45℃。体内结果表明,RFe/DOXLipo联合磁热治疗,仅需三次治疗即可完全抑制肿瘤的生长。流式结果表明,RFe/DOXLipo联合磁热治疗可以降低肿瘤微环境（TME）中M2型m（?）的占比,减少Treg细胞的占比,增大CD8+TNF-α+T与CD8+Ki67+T这2类细胞的占比从而改善肿瘤微环境。免疫组化结果显示,联合治疗抑制了肿瘤血管的生成。脏器HE切片表明,RFe/DOX Lipo联合磁热治疗可以抑制肿瘤的转移。CT结果表明RFe/DOXLipo联合磁热治疗可以显着抑制骨吸收作用。RFe/DOX Lipo联合磁热治疗策略在肿瘤治疗、抑制肿瘤转移有着良好的效果,具有潜在的应用前景。
郭雪峰[2]（2021）在《基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死临床与实验研究》文中研究指明目的:1.观察补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死临床疗效,为其临床应用提供直观量化依据;2.基于网络药理学从分子水平探究补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的潜在活性成分及具体药理作用机制;3.基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠模型的作用机制。材料与方法:1.补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的临床疗效观察研究选取辽宁中医药大学附属医院骨二科收治的78例激素性股骨头坏死患者作为研究对象,研究时限为2018年09月至2019年10月,采用随机数字法将符合要求患者随机分为观察组和对照组,每组各39例。对照组给予仙灵骨葆胶囊口服,观察组给予补正续骨丸口服。两组患者均连续治疗3个月。观察两组患者治疗前后的Harris髋关节功能评分、VAS评分、SF-36评分、髋关节影像学指标与不良反应发生情况,检测两组患者治疗前后血常规、肝功能、肾功能指标变化情况。2.基于网络药理学探讨补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的分子机制研究应用BATMAN-TCM分析工具检索补正续骨丸的活性化合物与预测靶点,选择Dig See数据库、OMIM数据库、Gene Cards数据库对激素性股骨头坏死疾病靶点进行预测,利用Draw Venn Diagram筛选得到补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死核心靶点,利用STRING数据库构建核心靶点PPI网络,通过Cytoscape 3.7.1构建补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的化合物—疾病—靶点调控网络,基于DAVID数据库对核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。3.基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠疗效机制研究采用随机数字表法将成年雄性SD大鼠分为空白组、模型组、西药对照组、补正续骨丸低剂量组（中药低剂量组）、补正续骨丸中剂量组（中药中剂量组）、补正续骨丸高剂量组（中药高剂量组）,每组12只。通过注射用甲泼尼龙琥珀酸钠联合脂多糖制备激素性股骨头坏死模型。造模成功后,空白组和模型组大鼠每日二次等量生理盐水灌胃,西药对照组0.9mg/kg阿仑膦酸钠片混悬液每日一次灌胃,中药低剂量组0.045g/kg补正续骨丸混悬液每日二次灌胃,中药中剂量组0.09g/kg补正续骨丸每日二次灌胃,中药高剂量组0.18g/kg补正续骨丸混悬液每日二次灌胃,连续灌胃12周后采集大鼠血清并取出双侧股骨头,采用HE染色方法观察各组大鼠股骨头组织病理变化情况;ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平;Western-blotting法检测各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平;免疫组化法法检测各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平;qRT-PCR法检测各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平。结果:1.补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的临床疗效观察研究两组患者在性别、年龄、病程、ARCO分期、患病部位等方面的人口统计学资料与临床特征资料比较显示差异无统计学意义（P>0.05）。治疗结束后,观察组临床有效率达79.49%（31/39）明显高于对照组[56.41%（22/39）],差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗结束后,两组患者的Harris髋关节功能评分、SF-36评分均较治疗前显着升高（P<0.05）;且观察组对于Harris髋关节功能评分、SF-36评分的上升程度显着优于对照组（P<0.05）。治疗结束后,两组患者的VAS评分均较治疗前显着降低（P<0.05）;且观察组对于VAS评分的下降程度显着优于对照组（P<0.05）。治疗结束后,观察组髋关节影像学指标结果有效率达84.62%（33/39）明显高于对照组[61.54%（24/39）],差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组患者不良反应发生率达2.56%（1/39）,对照组不良反应发生率达7.69%（3/39）,两组患者不良反应发生率比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.基于网络药理学探讨补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的分子机制研究通过BATMAN-TCM分析工具检索得到补正续骨丸活性化合物75种,活性化合物对应靶点548个;通过检索Dig See、OMIM、Gene Cards 3个疾病靶点数据库,最终纳入与激素性股骨头坏死发生发展相关靶点427个。利用Draw Venn Diagram将548个补正续骨丸活性化合物对应靶点与427个激素性股骨头坏死疾病靶点进行映射,并将其上传至STRING数据库以构建PPI网络,最终筛选到补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的30个核心靶点。利用Cytoscape 3.7.1构建补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的化合物—疾病—靶点调控网络可知,21个核心靶点能与不少于两个活性化合物相连接,41个活性化合物能与不少于两个核心靶点相连接。利用DAVID 6.8对补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的30个核心靶点进行GO功能富集分析可知功能途径主要涉及类固醇激素受体活性、氧化还原酶活性、脂质反应、类固醇激素反应、细胞增殖调节、活性氧代谢过程、内膜系统、线粒体、细胞器等方面。利用DAVID 6.8对补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的30个核心靶点进行KEGG通路富集分析可知通路途径主要涉及HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、破骨细胞分化、TGF-β信号通路、雌激素信号通路、TNF信号通路、细胞凋亡等方面。3.基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠疗效机制研究各组大鼠股骨头病理形态学观察显示,空白组可见骨小梁结构完整、形态正常、排列规则,且骨小梁内空骨陷窝出现较少,软骨层较为坚厚,脂肪空泡较为少见;模型组可见骨小梁结构出现明显稀疏变细、排列极为散乱、连续性中断,且部分骨小梁出现坏死,骨小梁内出现大量空骨陷窝,软骨层较为薄弱,脂肪细胞数量形态明显增多增大或者相互融合后形成大片的脂肪空泡;西药对照组可见骨小梁结构稍显变细,排列尚为规则,偶有中断发生,骨小梁内出现空骨陷窝,软骨层相对较为坚厚,脂肪细胞存在堆积现象,脂肪空泡较为多见;中药低剂量组可见骨小梁结构略变细、排列较为散乱、部分中断,骨小梁内可见空骨陷窝增多,软骨层较为薄弱,脂肪空泡多见;中药中剂量组可见骨小梁结构变细,排列尚为规则,偶有中断发生,骨小梁内出现空骨陷窝,软骨层相对较为坚厚,脂肪细胞存在堆积现象,脂肪空泡较为多见;中药高剂量组可见骨小梁较为完整、排列尚规则,骨小梁内可见空骨陷窝,软骨层相对较厚,存在脂肪空泡。各组大鼠股骨头组织空骨陷窝率结果显示,与空白组比较,其余各组股骨头组织空骨陷窝率显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药各剂量组股骨头组织空骨陷窝率显着降低（P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组股骨头组织空骨陷窝率显着升高（P<0.01）,中药高剂量组股骨头组织空骨陷窝率显着降低（P<0.01）。各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显示,与空白组比较,其余各组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药各剂量组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着降低（P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着升高（P<0.01）,中药高剂量组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着降低（P<0.01）。各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显示,与空白组比较,其余各组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药中剂量组、中药高剂量组股骨头组织TLR4、MyD88蛋白表达水平显着降低（P<0.01）,西药对照组、中药各剂量组股骨头组织NF-κB p65蛋白表达水平显着降低（P<0.05或P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,中药高剂量组股骨头组织MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显着降低（P<0.05或P<0.01）;与中药中剂量组比较,中药高剂量组股骨头组织TLR4蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平显示,与空白组比较,其余各组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药各剂量组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65mRNA表达水平显着降低（P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。结论:1.补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死患者临床疗效确切、安全可靠,可有效改善激素性股骨头坏死患者髋关节功能、缓解激素性股骨头坏死患者疼痛症状、提升激素性股骨头坏死患者生活质量,值得临床进一步推广使用。2.基于网络药理学初步探讨并验证了补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死具有多成分-多靶点-多通路的整体方向调节的作用特点,预测得到TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控炎症反应过程可能是补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的潜在作用机制。3.补正续骨丸可显着改善激素性股骨头坏死大鼠模型股骨头病理学形态与降低空骨陷窝率,下调激素性股骨头坏死大鼠模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平和股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白与mRNA表达水平,其作用机制则是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路进而减少炎症反应从而发挥防治作用。
李彦锦[3]（2021）在《淫羊藿苷防治兔髋臼骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变及其机制的研究》文中研究指明背景:髋臼骨折继发创伤性关节炎是髋臼骨折最常见的并发症,除了早期的西医对症治疗和晚期的人工关节置换之外,目前尚缺乏合理有效的预防和治疗方法。淫羊藿是祖国医学中常用中草药,性温,味辛、甘,归肝、肾经,具有补肾壮阳、祛风除湿、益精健骨的功效,在漫长的中医药历史发展中,淫羊藿长期被用于治疗骨关节疾病,特别是“骨痿”（即骨质疏松症）的治疗。其提取物淫羊藿苷具有多重生物活性,对创伤性关节炎早期软骨下骨骨质疏松性病变具有潜在的利用价值。本课题通过现代实验技术研究髋臼骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变特点及其机制,观察淫羊藿苷的防治疗效并分析其作用机制,为开发利用中医药预防和治疗此类疾病提供新的思路。第一部分兔髋臼后壁骨折继发创伤性关节炎动物模型的建立与验证目的:建立一种模拟人髋臼骨折继发创伤性关节炎的实验动物模型并进行验证,为探索髋臼骨折继发创伤性关节炎病变机制及相关体内实验奠定基础,同时也为开发利用中医药预防和治疗此类疾病提供体内实验的有效模型。方法:选取正常成年雄性新西兰兔36只,编号后以随机数字表法分为三组:假手术组（Sham组,n=12）、非内固定组（Non-ORIF组,n=12）和内固定组（ORIF组,n=12）。确认骨骺闭合并排除下肢畸形后开展实验。通过预钻孔联合落锤撞击法制作标准髋臼后壁骨折模型,模拟车祸“仪表盘”式高能量损伤所致髋臼后壁骨折。Sham组仅显露左侧髋臼后侧骨面,不进行骨折造模;Non-ORIF组骨折造模后不予复位和固定;ORIF组骨折造模后直视下解剖复位并以钢板螺钉内固定。术后第3周、第6周和第6月对各组完成X线片、处死取材和组织病理学分析,对比观察各组病变特点,并采用影像学半定量评分和OARSI评分进行量化比较。结果:本组实验24只模型兔中,21只（87.5%）呈单纯后壁骨折,骨折类型保持了较高的一致性和可重复性。与Sham组相比,Non-ORIF组和ORIF组随时间进展表现出进行性的关节退变,特别是Non-ORIF组,PTOA病变发生早且快,第3周即呈现软骨退变和关节间隙变窄,第6周可见明显软骨磨损、软骨下骨硬化、大量骨赘增生,与临床髋臼骨折继发PTOA病变出现早进展快的特点相符。第6月Non-ORIF组髋关节肥大畸形,软骨严重退变剥脱,臼窝变浅,股骨头变扁并半脱位,也与临床常见髋臼骨折继发创伤性关节炎晚期病变高度相似。与Non-ORIF组相比,虽然ORIF组影像学半定量评分无显着差异,但组织病理学特点显着改善,骨软骨结构层次得到了较好的保护,软骨退变程度明显减轻,第6月OARSI评分较Non-ORIF组显着降低,显示出ORIF对创伤性关节炎具有积极的改善作用。结论:本研究采用预钻孔联合落锤撞击法制备兔髋臼后壁骨折继发创伤性关节炎模型,骨折呈现出较高的一致性和可重复性,骨折后第3周和第6周髋关节病变符合髋臼骨折继发PTOA发病早进展快的特点,第6月病变特点也与临床常见髋关节PTOA晚期病变高度相似。本模型为进一步研究髋臼骨折继发PTOA的病理特点及发病机制提供了一种新的选择,同时也为开发中医药预防和治疗此类疾病提供了体内实验模型。第二部分髋臼后壁骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变特点与机制研究目的:研究髋臼骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变特点并分析内在机制。方法:选取正常成年雄性新西兰兔48只,编号后以随机数字表法分为三组:假手术组（Sham组,n=16）、非内固定组（Non-ORIF组,n=16）和内固定组（ORIF组,n=16）,造模同第一部分,Sham组右侧髋关节作为空白对照组（Control组,n=16）。术后第3天、第3周、第6周和第6月对各组兔模型摄X线片,采集血清后处死取材,完成Micro CT扫描、组织病理学和生化分析。动态比较各组在如下方面的变化:Micro CT分析髋臼软骨下骨微结构改变,ELISA法检测血清骨吸收标志物CTXI和骨形成标志物P1NP、BALP,Rt-PCR和Western Blot法检测软骨下骨相关基因和蛋白表达,TRAP染色比较软骨下骨破骨细胞数量,TUNEL法比较软骨下骨细胞凋亡。结果:Mico CT显示Non-ORIF组骨折后第3周、第6周软骨下骨骨密度降低、骨量减少、骨小梁厚度减小、骨小梁间隙增大,同时软骨下骨板厚度减小、密度降低、孔隙率增大,骨质疏松性改变显着;第6月时骨质疏松性改变明显缓解。与Sham组相比,Non-ORIF组血清CTXI浓度从第3天至第3周显着增加,至第6周增幅回落;第3天至第6周血清P1NP和BALP浓度随时间进展显着降低。与Control组和Sham组相比,Non-ORIF组软骨下骨第3天、第3周RANKL基因和蛋白表达显着增加而OPG表达减少,第6周RANKL增幅回落,OPG表达回升,第3周TRAP（+）多核细胞数量较Sham组显着增加;第3天、第3周软骨下骨Caspase3和Bax表达显着增加,Bcl-2表达减少,骨细胞高度特异SOST基因和Sclerostin蛋白表达显着减少,第6周各基因和蛋白改变趋势缓解;TUNEL显示第3周软骨下骨骨细胞凋亡数量较Sham组显着增加。与Non-ORIF组相比,ORIF组Micro CT显示第3周、第6周软骨下骨骨质疏松性改变显着改善;各时间点CTXI浓度明显降低,P1NP和BALP浓度增加,RANKL表达减少而OPG表达增加,TRAP（+）多核细胞数量明显减少;Caspase3和Bax表达减少,Bcl-2表达增加,SOST基因和Sclerostin蛋白表达显着增加,TUNEL显示软骨下骨骨细胞凋亡显着减少。此外,Micro CT显示ORIF组第6月软骨下骨呈现骨硬化改变,Tb.BMD、BVF、Tb.Th、Ct.Th均显着高于Sham组,同时Tb.Sp显着降低。结论:破骨细胞过度激活和其介导的骨重建是导致兔髋臼骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨骨质疏松性改变的重要作用因素,且与骨细胞凋亡密切相关。软骨下骨改变与软骨退变密切联系,是不可分割的有机整体,契合中医整体观在PTOA病理诊断中的指导意义。切开复位内固定术有利于恢复髋关节的稳定性,改善关节生物力学环境,避免骨细胞进一步凋亡,抑制破骨细胞分化激活和软骨下骨破坏,有利于改善PTOA病变。第三部分淫羊藿苷防治髋臼骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变及其机制的研究目的:观察淫羊藿苷防治髋臼骨折继发PTOA的疗效,并分析其作用机制,为开发利用中医药预防和治疗此类疾病提供新的思路。方法:选取正常成年雄性新西兰兔64只,编号后以随机数字表法分为四组:假手术组（Sham组,n=16）、非内固定组（Non-ORIF组,n=16）、内固定组（ORIF组,n=16）和淫羊藿苷组（ICA组,n=16）,造模同第一部分,Sham组右侧髋关节作为空白对照组（Control组,n=16）。ICA组自造模当天起以淫羊藿（60mg/kg/day）连续灌胃给药3周,其余各组同时以等量生理盐水灌胃,每日一次。于术后第3天、第3周、第6周和第6月对各组兔模型摄X线片,采集血清后处死取材,完成Micro CT扫描、组织病理学和生化分析。动态比较各组在如下方面的变化:组织病理学改变和OARSI评分,Micro CT分析髋臼软骨下骨微结构改变,ELISA法检测血清骨吸收标志物CTXI和骨形成标志物P1NP和BALP,Rt-PCR和Western Blot法检测软骨下骨相关基因和蛋白表达,TRAP染色比较软骨下骨破骨细胞数量。结果:与ORIF组相比,虽然ICA组第6月组织病理学OARSI评分无显着差异（P>0.05）,但ICA组能进一步改善软骨下骨早期骨质疏松性改变,第3周时Tb.BMD显着升高,Tb.Sp显着降低;第6周时Tb.BMD、Tb.Th、Ct.Th均显着增加,Ct.Po显着下降。与ORIF组各时间点相比,ICA组血清CTXI浓度进一步降低,P1NP和BALP浓度进一步增加,软骨下骨中RANKL表达减少而OPG表达增加,第3周TRAP（+）多核细胞数量明显减少;同时各时间点Caspase3和Bax表达较ORIF组进一步减少,Bcl-2表达增加,SOST基因和Sclerostin蛋白表达也显着增加。ICA组第6月软骨下骨硬化改变较ORIF组明显改善,Tb.BMD、BVF、Tb.Th均显着降低。结论:淫羊藿苷能显着改善髋臼骨折继发PTOA早期软骨下骨病变,其对PTOA的治疗作用体现了中医整体观在治疗此类疾病中的指导作用,即改善软骨下骨病变有利于减轻关节软骨的退变,达到局部与整体协调统一的治疗效果。淫羊藿苷不仅能抑破骨细胞的分化激活,还能显着改善成骨活性,这些作用可能与抑制骨细胞凋亡有关,具体机制需进一步研究论证。
毛昀[4]（2021）在《补肾类中药调节乳腺癌骨转移生态位的作用机制研究》文中研究表明骨转移是晚期乳腺癌患者常见并发症,好发于椎骨、骨盆以及长骨干骺端等部位,伴有疼痛、病理性骨折、高钙血症等骨相关事件,治疗手段包括骨保护剂、化疗、放疗、中医药等,其中双膦酸盐和地诺单抗作为骨保护剂,在骨转移的治疗中具有良好的临床疗效,并有助于早期乳腺癌的辅助治疗。而骨转移机制研究方面,相关研究提示骨转移出现临床症状前,肿瘤细胞能够打破骨微环境中成骨细胞和破骨细胞构成的骨稳态状态,从而形成骨转移生态位,这与乳腺癌细胞和成骨细胞的相互调控、生态位中免疫抑制、缺氧状态等具有相关性。中医药在防治乳腺癌骨转移方面确有疗效,能够早期防治骨转移的发生,延缓骨转移进展,改善患者生活质量。研究团队总结全国名老中医李佩文临床用药经验时发现归肾经中药对于骨转移的防治具有较好的临床疗效,大鼠实验进一步证实归肾经药防治骨转移的疗效远好于归其它经药物。在明确不同归经药物对骨转移的不同作用机制基础上,提出了归肾经中药不同药性（寒、热）防治骨转移的疗效存在差异的科学假设,故从调节骨转移生态位的角度进一步探索补肾阴、补肾阳、阴阳双补法的疗效差异。目的:1.归纳和总结骨转移相关文献,结合临床经验阐述骨转移病理变化的中医理论认识和治法策略,通过网络药理学初步探讨补肾类中药的疗效机制。2.通过骨转移动物模型和细胞共培养模型,论证骨转移生态位的变化情况,研究乳腺癌细胞和成骨细胞之间的相互调控关系。3.在探索补肾类中药早期干预骨转移作用机制的基础上,明确补肾阳法、补肾阴法、阴阳双补法等不同中医治法防治骨转移的疗效差异与分子机制。方法:1.系统归纳古代文献对骨肿瘤相关疾病的阐述以及现代医家对骨转移的认识和用药经验,分析归纳其病因、病机以及治法方药,初步提出骨转移病理变化的中医理论认识并对治法用药进行探索;利用网络药理学对补肾类代表药物“淫羊藿-肉苁蓉”进行分析,初步探究补肾类中药的作用机制,为基础实验的开展提供方向。2.利用MDA-MB-231-luc和4T1-luc细胞进行左心室注射、胫骨注射、尾动脉注射等不同方式骨转移造模,通过小动物活体成像技术评价造模成功率以及转移变化过程。3.建立骨转移动物模型,利用活体成像技术、Micro-CT等技术,从血清骨转换标志物、破骨细胞计数、淋巴细胞亚群表达等方面探索不同补肾类治法（补肾阳法、补肾阴法和阴阳双补法）防治骨转移的疗效差异。4.采用骨转移动物模型、乳腺癌细胞和成骨前体细胞共培养模型,利用免疫组化染色、蛋白印迹法、实时荧光PCR等技术验证补肾类中药对乳腺癌细胞间质-上皮转化、Dkk-1/BMP2信号通路关键蛋白和mRNA的调节作用,明确补肾类中药调节骨转移生态位的作用机制。结果:1.骨转移病理变化的中医理论认识:骨转移的病机为“正虚邪入、搏结伤骨成瘤”,病位在骨,具有本虚标实的特点,病理过程可概括为肾虚精亏、癌邪入骨、正邪搏结、引邪发病四个阶段;而在治疗策略上,在“先安未受邪之地”理论的指导下,将骨转移的治疗分为初、中、末三期,不同时期给予不同的治疗策略。2.网络药理学分析:补肾类中药（淫羊藿-肉苁蓉）可通过干预间隙连接、黏附连结等方式影响乳腺癌细胞、成骨细胞的存活、分化和成熟等,并对Dkk-1、BMP2、CDH1（E-cad）、CDH2（E-cad）、Runx2等基因及其表达的蛋白具有调节作用。3.骨转移不同造模方式比较:MDA-MB-231-luc细胞左心室注射法能够较好模拟骨转移的早期病理过程,成功率约50%,活体成像显示造模后20天左右观察到转移部位荧光显像;胫骨注射法成功率可达100%,对小鼠损伤较小;尾动脉注射法造模时癌细胞多聚集于肺部并形成肺转移。4T1-luc细胞胫骨注射法和尾动脉注射法造模均能形成骨转移,其中胫骨注射组瘤体生长速度快、负荷大,而尾动脉注射造模时癌细胞聚集于小鼠尾背部,形成局部骨转移。4.不同补肾类治法防治骨转移的疗效不同:建立乳腺癌骨转移胫骨注射模型,通过小动物活体成像和Micro-CT明确补肾类中药能够延缓乳腺癌骨转移的进展,改善骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp）等骨相关参数,促进CD4+、CD8+的表达,降低血清骨转换标志物（BALP、PINP和血钙）水平,抑制破骨细胞活力,其中以阴阳双补方的疗效最为明显（P<0.05）。5.阴阳双补方对骨转移生态位具有调节作用:成骨细胞促进癌细胞的间质-上皮转化,与空白对照组比较,模型组E-cad、N-cad和Cx43的蛋白均呈上调的状态（P<0.05）,阴阳双补方能够下调E-cad和Cx43的表达（P<0.05）,对N-cad的调节作用不明显（P>0.05）。乳腺癌细胞高表达Dkk-1,从而抑制成骨细胞成熟和分化,采用阴阳双补方干预后Dkk-1的表达降低,上调BMP2、β-catenin和Runx2的表达（P<0.05）。6.MDA-MB-231细胞和MC3T3-E1细胞共培养模型验证阴阳双补方改善骨转移生态位的机制:相对于单培养组,共培养模型中MDA-MB-231细胞增殖加快,而MC3T3-E1细胞生长受到抑制,阴阳双补方能够抑制癌细胞、促进成骨前体细胞增殖。通过WB和实时荧光定量PCR分析发现共培养模型中E-cad、N-cad、Cx43和Dkk-1蛋白和基因表达显着上调（P<0.05）,而β-catenin、BMP2、Runx2等成骨性指标表达下降,阴阳双补方能够逆转乳腺癌细胞的间质-上皮转化,并促进MC3T3-E1细胞的成熟和分化。结论:1.骨总结肿瘤相关古代文献的梳理及现代医家临床经验,将骨转移病理变化的中医认识归纳为四个阶段,并将治法分为初、中、末三期,有利于临床骨转移的防治。2.通过网络药理学初步明确“淫羊藿-肉苁蓉”药防治乳腺癌骨转移的作用机制,为后续实验研究提供了一定基础和研究方向。3.采用MDA-MB-231-luc和4T1-luc细胞进行左心室注射、胫骨注射和尾动脉注射进行骨转移造模,其中以胫骨注射法造模成功率最高。4.不同补肾类治法（补肾阳、补肾阴、阴阳双补）对乳腺癌骨转移的防治具有疗效差异,其中阴阳双补方疗效最佳。5.阴阳双补方对骨转移生态位具有调节作用,降低E-cad、N-cad、Cx43、Dkk-1蛋白表达,上调BMP2、β-catenin和Runx2的表达。6.建立乳腺癌细胞和成骨前体细胞共培养模型,阴阳双补方可逆转癌细胞间质-上皮转化、通过Dkk-1/BMP2通路促进成骨细胞的分化和成熟。
文虹杰[5]（2021）在《LncRNANONHSAT009968通过Wnt3a抑制SPA作用下的hBMMSCs成骨分化的机制研究》文中研究指明[背景]骨髓炎是一种骨与髓腔的感染性疾病,可以造成骨及周围软组织坏死。它是骨科领域十分具有挑战性的疾病之一,可由创伤、手术、糖尿病等内科疾病、血源性感染等原因引起。患者往往需要长期住院,反复手术,消耗巨额费用以及大量使用抗生素,有较高的截肢率和致残率,给患者的生活和工作带来较严重的负面影响,产生较大的社会经济和心理压力。尽管在外科手术治疗方面取得了一定程度的进展,但它的发生、发展机制尚不十分清楚,其诊断过程复杂,各种方法治疗效果不佳。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）是骨髓炎最常见的致病菌。目前认为,金黄色葡萄球菌引起骨髓炎发生发展的机制包括病原菌因素和宿主因素。金黄色葡萄球菌通过医源性或血源性途径到达骨骼表面,可以很容易地粘附在软组织、骨骼或金属植入物上。细菌可以通过识别粘附基质分子的微生物表面成分,例如胶原结合蛋白和骨唾液蛋白结合蛋白,通过与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白结合来实现这一目标。目前研究认为SA是引起骨髓炎的主要病原菌,而SA所致骨髓炎中骨生成不足机制尚不清楚。葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A,SPA）是存在于SA细胞壁上的蛋白,是SA的主要毒力成分,SPA在SA促进骨髓炎发生过程中发挥重要的作用。以往研究主要集中于对SA的菌体以及其毒力因子SPA对成骨细胞的凋亡和破骨细胞增殖的影响,但是SPA对人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMMSCs）的成骨分化能力影响以及机制尚未见相关报道。因此,本研究团队前期对SPA作用下hBMMSCs成骨分能力的影响做了相关研究,发现SPA可显着抑制hBMSC的成骨分化能力,提示毒力因子SPA刺激可产生模拟体内的炎症环境。近年来随着表观遗传学的发展和深入,越来越多的研究表明非编码RNA通过各种信号通路及调控因子影响着hBMMSCs成骨分化。虽然蛋白质编码基因在hBMMSCs成骨分化中的作用已经得到了广泛的研究,但在hBMMSCs的成骨分化中,非编码RNA的功能尚不十分清楚。非编码RNA被认为在hBMMSCs成骨分化中发挥关键作用,包括染色质修饰、转录因子结合、内源性能力机制和其他后转录机制。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类新的非编码转录本,长度超过200个核苷酸。最近,多项研究表明lncRNA通过控制细胞（包括MSC）的命运而广泛参与生长和发育,越来越多的lncRNA通过多种调控因子和信号通路促进或抑制hBMMSC成骨分化。本研究前期研究表明lncRNANONHSAT009968能够抑制SPA作用下hBMMSCs成骨分化的能力,但是对其调控机制还不清楚。本项目前期通过Cis-100K分析发现Wnt3a是lncRNANONHSAT009968作用的靶基因之一,且在hBMMSCs的成骨诱导过程中添加SPA处理能够抑制Wnt3a的表达,而在该过程中抑制lncRNANONHSAT009968的表达能够促进Wnt3a的表达。因此,我们推测lncRNANONHSAT009968调控SPA作用下hBMMSCs成骨分化的机制可能与Wnt3a的表达有关。[目的]（1）通过体外构建Wnt3a干扰和过表达的hBMMSCs,探讨Wnt3a是否影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化能力。（2）通过体外构建Wnt3a干扰和lncNONHSAT009968干扰的hBMMSCs,探索lncRNANONHSAT009968是否通过Wnt3a影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化。（3）通过构建慢性骨髓炎动物模型探讨lncRNANONHSAT009968对骨髓炎状态下hBMMSCs成骨分化和骨缺损修复能力的影响。（4）通过荧光素酶实验分析lncRNANONHSAT009968是如何与Wnt3a启动子上顺式作用元件的结合调控Wnt3a的转录水平,阐明lncRNA NONHSAT009968对Wnt3a表达的调控机制。通过以上体内、外实验,揭示LncNONHSAT009968对感染环境下hBMMSCs成骨分化和骨缺损修复能力的作用和可能的调控机制,为骨髓炎及感染性骨缺损的诊治提供实验依据和新的思路。[方法]1.细胞水平研究Wnt3a影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化能力构建Wnt3a过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装;感染hBMMSCs后,qRT-PCR及Western blot检测Wnt3a的表达情况。利用SPA（1μg/ml）持续处理病毒感染的hBMMSCs,并进行成骨诱导7、14、21天,进行成骨相关基因和蛋白:Ⅰ型胶原蛋白（Collagen type Ⅰ alpha 1 chain,COL1A1）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、侏儒相关转录因子 2（runt-related transcription factor-2,Runx2）和经典Wnt信号通路相关基因Wnt3a、β-catenin、糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）检测;并用茜素红染色检测钙结节以及检测碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）评估细胞成骨诱导的情况。2.细胞水平研究lncRNA NONHSAT009968通过Wnt3a影响SPA作用下hBMM-SCs的成骨分化构建Wnt3a shRNA慢病毒载体,并进行慢病毒包装;感染hBMMSCs/NONHSAT-009968shRNA 后,荧光定量 PCR 及 Western blot 检测Wnt3a的表达情况;利用 SPA（1μg/ml）持续处理Wnt3a shRNA及NONHSAT009968 shRNA病毒联合感染的hBMMSCs细胞,并进行成骨诱导7、14、21天,进行成骨相关基因和蛋白COL1A1、OPN、Runx2和Wnt3a、β-catenin、GSK-3β检测;茜素红染色以及ALP检测评估细胞成骨诱导的情况。3.动物水平分析lncRNANONHSAT009968对骨髓炎状态下hBMMSCs成骨分化能力影响建立兔骨髓炎并骨缺损模型,通过通过体内实验证明沉默lncRNA NONHSAT 009968的hBMMSCs对骨生成的影响;后期大体观察、组织形态学、显微CT对各组成骨能力及骨端愈合情况进行定性和定量评价。qRT-PCR和Western-blot检测成骨相关基因和蛋白COL1A1、骨钙素（osteocalcin,OCN）、OPN 和 Runx2 的表达以及 Wnt3a、β-catenin、GSK-3β 的表达。4.LncRNANONHSAT009968靶向调控Wnt3a的分子机制研究PCR扩增Wnt3a的启动子序列,构建启动子序列系列缺失荧光素酶表达载体;通过荧光素酶实验检测过表达NONHSAT009968对不同长度Wnt3a启动子活性的影响;分析NONHSAT009968在Wnt3a启动子上可能的作用位点。[结果]1.应用pLent-CMV-P2A-PURO慢病毒感染hBMMSCs成功构建Wnt3a过表达hBMMSCs稳定转染细胞株;应用pLent-U6-GFP-PURO慢病毒感染hBMMSCs成功构建LncRNANONHSAT009986敲减hBMMSCs稳定转染细胞株;应用pLent-U6-RFP-BLASTICIDIN慢病毒感染hBMMSCs成功构建Wnt3a敲减hBMMSCs稳定转染细胞株。2.过表达Wnt3a可以显着提高成骨相关基因COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin的表达,而降低GSK-3β的表达,促进成骨相关蛋白COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin的表达,而降低GSK-3β的表达,促进钙结节沉积,提高ALP的表达,改善SPA抑制的hBMMSCs的成骨分化。3.同时敲减LncRNANONHSAT009968与Wnt3a可以显着降低成骨相关基因COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin 的表达,而提高 GSK-3β的表达,降低成骨相关蛋白COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin的表达,而提高GSK-3β的表达,减少钙结节沉积,降低ALP的表达,逆转单独敲减LncRNANONHSAT009968对SPA作用下hBMMSCs促成骨分化作用。4.对于感染性骨缺损的修复,敲减LncRNA NONHSAT009968的hBMMSCs与羟基磷灰石复合支架构建组织工程骨可以显着提高成骨相关基因COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin 的表达,而降低 GSK-3β的表达,促进成骨相关蛋白 COL1A1、OCN、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin 的表达,而降低GSK-3β的表达,促进钙结节沉积,提高ALP的表达。显微CT（Micro CT）成骨相关指标以及病理组织形态计量学成骨相关指标显示出更好的促进成骨的作用,但是没有产生明显的临床修复效果。5.Wnt-NC+lncRNA-NC 组与 Wnt-NC+lncRNA 过表达组、Wnt2+lncRNA-NC组与 Wnt2+lncRNA过表达组、Wnt3+lncRNA-NC 组与 Wnt3+lncRNA 过表达组之间相对荧光素酶活性无明显差异（P>0.05）;而Wntl+lncRNA-NC组与Wnt1+lncRNA过表达组之间相对荧光素酶活性存在显着差异（P<0.05）。[结论]1.Wnt3a对体外SPA作用下的hBMMSCs的成骨分化产生重要调节作用;2.LncRNANONHSAT009968 通过 Wnt3a 对 SPA 作用下 hBMMSCs 的成骨分化产生抑制作用;3.LncRNANONHSAT009968在体内、外感染炎症条件下hBMMSCs的成骨过程中,能抑制骨生成,进而可能影响慢性骨髓炎的发生发展;4.LncRNANONHSAT009968可能通过与Wnt3a启动子结合而抑制其转录过程,从而抑制Wnt3a表达,进而影响hBMMSCs的成骨分化。
林文俐[6]（2020）在《微波消融联合骨水泥成形术治疗溶骨性骨转移瘤安全性及疗效分析》文中研究说明第一部分:微波消融联合骨水泥成形术治疗溶骨性骨转移瘤安全性及疗效分析提高患者的生存时间,寻求一种安全、有效的治疗方式是势在必行。热消融可以有效的缓解疼痛,甚至可以作为骨转移瘤放射治疗和吗啡治疗的替代疗法。射频消融是一种正弦电流,电流流经的区域受到离子搅动,通过离子之间的摩擦引起组织加热,从而使肿瘤细胞达到坏死。微波消融是热消融的另一种方式,其通过引起水分子的高频率振动而产热。射频加热易受组织内自由离子浓度和周围组织电导率的影响,其凝固范围的扩大主要靠传导散热。微波能量是使组织中偶极子在微波场中旋转并不断加速碰撞产生热能,在组织中有一定的穿透力,穿透范围内组织的偶极子均为发热源,受组织内自由离子浓度和周围组织电导率的影响较小,升温快、热场均匀、消融范围大、受热沉降效应影响小等,所以理论上微波消融在骨肿瘤中的凝固范围大于射频消融,并且所需消融时间短,患者耐受度强。据我们调研,国内外尚没有大规模的研究关注微波消融联合骨水泥成形术治疗溶骨性转移瘤的疗效及安全性。研究背景转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因,骨转移是继肺和肝脏之后第三常见的转移部位,大约20%肿瘤患者以骨转移为首发症状就诊。恶性肿瘤一旦扩散到骨骼发生骨转移,即为晚期无法治愈,且会带来一系列相关临床症状如难治性疼痛、骨折、运动能力下降等,严重影响了患者的生活质量。骨转移疼痛不仅发生率高,而且疼痛性质严重,剧烈疼痛的发生率为50%～90%。所以恶性肿瘤骨转移的总体治疗策略是缓解疼痛,恢复功能,提高生活质量为主要目标的姑息治疗。近年来的综合治疗方式,如抗肿瘤化疗、止痛、双磷酸盐、外科手术及放疗等的综合利用,已经在缓解患者疼痛,恢复功能,提高生活质量及延长患者生存等方面作出了贡献。如放疗（外照射）,是治疗骨转移局部疼痛的标准治疗方式,疼痛缓解率可达40～80%,数据显示放疗1月内超过40%的患者疼痛程度减轻一半,约30%患者疼痛完全缓解,但是57%的患者在放疗后4月内出现疼痛反复。对于椎体转移瘤而言,放疗对维持椎体的稳定性效果差。外科手术可以解决脊柱不稳定的问题,可以选择性用于病理性骨折或脊髓压迫的患者,也用于预防治疗某些病理性骨折危险的骨转移病人。但手术创伤大、愈合时间长,并发症发生率可达24%,仅适用于部分一般状况良好,可耐受麻醉及手术的患者。双膦酸盐治疗是肿瘤骨转移的基础用药,可以减缓和延迟骨相关事件的发生。缺陷是长期使用需要补充钙及维生素D,且有下颌骨坏死和肾功能损害的风险,并且双膦酸盐治疗不能取代现有的止痛治疗、放射治疗和其他治疗手段。微创技术的发展为骨转移瘤的治疗提供了多种治疗手段。经皮椎体/骨水泥成形术是在X线或CT引导下将骨水泥注入到病变骨骼。骨水泥在注入骨骼后大约8～10分钟后硬化,在此过程中同时放热,达到止痛、稳定椎体的作用。然而经皮椎体/骨水泥成形术对于恶性肿瘤骨转移的治疗存在一定局限性。骨转移瘤瘤体内压力高,需要高压注入骨水泥,这样不仅容易导致水泥渗漏,还有可能促进肿瘤细胞的血行转移,增加了癌细胞扩散的可能。所以为更好缓解骨转移瘤患者的疼痛,改善患者生活质量,研究目的本研究对27例溶骨性骨转移瘤患者进行了 CT引导下微波消融联合骨水泥成形治疗,观察疼痛缓解、体力状况改善、并发症情况;对椎体转移瘤患者还进行脊柱功能状态、生活质量及脊柱损伤神经功能评分;采用欧洲五维度健康指数量表（EuroQol five Dimensions questionnaire,EQ-5D）指数（采用日本时间权衡法Time Trade-off,TTO获得EQ-5D指数得分）和欧洲癌症研究与治疗组织的生活质量骨转移量表（Europe Organization for Research and Treatment of Cancer Quality of Life Questionnaire-Bone Metastases 22,EORTC QLQ-BM22,简称QLQ-BM22）综合评价患者的生活质量;采用EQ-5D指数和QLQ-BM22评分分别计算出质量调整寿命年（Quality-adjusted life years QALYs）进行生存分析,以探讨微波消融联合骨水泥治疗溶骨性骨转移瘤的安全性及疗效。研究方法收集自2019年1月至2020年8月在山东大学附属济南市中心医院肿瘤科接受微波消融联合骨水泥成形术治疗的27例溶骨性骨转移瘤患者的临床资料。所有入组患者均有有明确的肿瘤病史,病理学诊断,合并疼痛症状;CT或MR显示溶骨性骨转移瘤并且骨转移瘤影像学定位与压痛、叩击痛等疼痛部位一致;其他远处转移如肝、肺转移灶病情稳定,临床无阳性症状;肝肾功能、凝血指标均无穿刺禁忌。微波消融联合骨水泥成形术操作全程在CT引导下进行,治疗前充分告知患者及家属消融联合骨水泥成形治疗的目的、预期疗效、主要风险、可能并发症及相应的应对措施、替代疗法、术前及术后注意事项等,取得患者及家属同意后,签署知情同意书。术前4小时禁饮食、饮水。麻醉采用局部麻醉加止痛方式,严格执行无菌操作技术规范。微波消融功率30～50W,消融时间1.5～15min。消融过程中根据CT结果调整消融针的位置、角度及深度,目的是消融区域覆盖肿块;同时观察患者生命体征、疼痛等情况,根据术中患者耐受程度随时调整消融功率及时间。消融结束,拔出消融针,调制骨水泥,待水泥处于拉丝期时将骨水泥缓慢低压灌注入骨转移瘤消融后部位,骨水泥的用量1.5～9ml。术后即刻CT扫描,观察治疗后骨水泥的位置,评估术中并发症。采用疼痛数字评分（Numerical Rating Scale,NRS）比较患者术前、术后1天、3天、1周、1月、3月、6月疼痛分值变化;采用卡氏体力状况评分（Karnofsky’s Performance Status,KPS）量表、QLQ-BM22 量表、TTO评分、腰痛 Oswestry 功能指数（Oswestry Disability Index,ODI）评分和美国脊髓损伤协会神经学检查（American Spinal Injury Association,ASIA）评分比较患者术前、术后1周、1月、3月、6月各分值的变化。观察是否出现术后并发症。采用EQ-5D指数（即TTO数值）和QLQ-BM22评分作为生存质量得分,乘以各自维持的时间跨度得到QALYs,用以生存分析。研究结果1、截至末次随访,随访时间1～20月,27例溶骨性骨转移瘤患者均按规范性操作,结合患者骨转移瘤的数量及症状决定患者的术部位,其中10例患者同时行2处转移瘤的治疗,17例患者行1处转移瘤的治疗,共计37个手术部位。技术成功率100%。2、27例患者中男19例,女8例;年龄37～80岁,年龄均值65.7±11岁;原发病最多的是肺癌,病理类型最多的是腺癌;肿瘤直径大小（cm）与消融功率及骨水泥用量相关,与消融时间不相关;转移瘤体积（cm3）与消融功率、时间及骨水泥用量均相关;术前疼痛持续时间与消融时间及骨水泥用量的关系,与消融功率无关。3、并发症:所有患者随访时至少1次行强化CT检查,均未见治疗后局部肿瘤复发。无感染发热、再骨折、肺栓塞及截瘫并发症;无围手术期死亡事件及消融后综合征发生。4例发生周围组织渗漏、2例渗入转移瘤周围血管、1例渗入椎管,并发症发生率为18.9%,均为轻微并发症,无主要并发症发生。4、疼痛情况:术前NRS评分3～9分,中位评分为6.52,术后1天NRS中位评分为3.44,NRS中位评分持续下降,术后6月为1.92,P<0.0001,差异有统计学意义。NRS性别、年龄、骨转移瘤的数量、转移瘤的最大直径、转移瘤的体积及术前疼痛持续时间对疼痛均无显着影响（P>0.05）。5、生活质量:KPS中位评分由术前的61.11,术后1周63.70,术后1月64.61,术后3月54.2,再到术后6月的46.67,P>0.05,统计学没有意义。EQ-5D的评估是采用TTO积分换算得出。TTO中位评分术前0.41,术后1周0.58,术后1月0.55,术后3月0.52,术后6月0.45,总体有好转趋势,首先改善的是疼痛不适及焦虑抑郁两项,其次是行动能力,最后是自我照顾能力和日常活动能力,但P>0.05,没有统计学意义。QLQ-BM22中位评分术前的51.81,术后1周40.8,术后1月41.80,术后3月38.29,术后6月38.00,P=0.0013,差异有统计学意义。性别、年龄、骨转移瘤的数量、转移瘤的最大直径、转移瘤的体积及术前疼痛持续时间等与QLQ-BM22不相关（P>0.05）。27例微波消融联合骨水泥治疗的患者中共20例脊柱转移患者,其中有17例胸腰椎转移。对17例胸腰椎转移患者进行ODI评分;对20例脊柱转移患者进行ASIA评分。ODI中位评分术前60.40%,术后1周47.00%,术后1月48.18%,术后3月37.78%,术后6月39.16%,由重度功能障碍,变为中度功能障碍,P>0.05,没有统计学意义。除死亡患者外,余患者ASIA评分在术前、术后1周、术后1月、术后3月及术后6月均无变化。6、生存分析:随访时间为1～20月,7例患者6月内死亡,死于原发疾病进展,2例死于严重肺部感染,1例死于感染性休克。死亡患者存活时间为0.25～9月,中位生存时间为:3.14 ± 3.24月。采用EQ-5D指数和QLQ-BM22评分分别作为生存质量得分。采用EQ-5D指数（即TTO数值）作为生存质量得分时,中位QALYs分值术前0.039,术后1月0.488,术后3月0.0902,术后6月0.142,P<0.0001,差异有统计学意义;采用QLQ-BM22评分作为生存质量得分时,中位QALYs分值术前0.061,术后1月0.032,术后3月0.0653,术后6月0.108,P=0.0002,差异有统计学意义。研究结论1、CT引导下行微波消融联合骨水泥成形治疗溶骨性骨转移瘤,技术成功率高,手术可操作性强。2、骨转移瘤的最大直径、体积及术前疼痛持续时间是微波消融的功率及时间的影响因素,也是骨水泥用量的影响因素。3、微波消融联合骨水泥成形治疗溶骨性骨转移瘤并发症少,安全可靠。4、微波消融联合骨水泥成形可以快速、有效、持久缓解溶骨性骨转移瘤患者的疼痛,提高患者的生活质量,延长患者高质量的生存时间。5、微波消融联合骨水泥成形治疗骨转移瘤,两个治疗方式联合可以相互补充单个治疗方式的缺陷。微波消融术可以减少骨水泥治疗的渗漏并发症,减少骨水泥所致转移瘤细胞沿引流静脉扩散的风险;骨水泥成形术可以减少消融后综合征的发生率。第二部分:生物信息学方法分析不完全射频消融导致结肠癌细胞相关休眠基因的激活研究背景休眠作为一种自然界生物对适应环境的生存策略,普遍存在于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物中。肿瘤为满足自身需求,适应不同的微环境也会存在休眠状态。肿瘤休眠可发生在肿瘤发生发展的各个阶段,如①远处转移:肿瘤细胞从原发部位到转移部位,大都经历了一段时间的休眠;②术后复发或转移前潜伏期:20%-45%乳腺癌、前列腺癌患者术后数年或数十年再复发;③治疗后无症状带瘤生存患者的无疾病进展期等。肿瘤休眠的特点是癌细胞进入生长停滞状态,细胞周期停滞在G0/G1期,低表达Ki-67和增殖细胞核抗原（PCNA）,新陈代谢低,具有活跃的耐药机制等。肿瘤休眠可分为肿瘤块休眠和肿瘤细胞休眠或细胞休眠。肿瘤休眠细胞相对于亲代细胞有不同的表达谱。肿瘤休眠时AKT被抑制,可以激活阻止细胞周期的周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和p27,从而抑制细胞生长。EGFR突变的非小细胞肺癌在TKI治疗后,可以诱导肺癌细胞休眠,并且这些休眠的细胞具有耐药性。缺氧也可以诱导休眠。所以,肿瘤休眠可能是肿瘤进化过程中的一种自然状态。休眠的肿瘤细胞可以发展出非特异性的抵抗细胞死亡机制,如下调JAK/STAT通路,上调GAS6、BMP4/7及TGF β2的表达等。休眠肿瘤细胞的存在可能是患者预后差的原因之一。所以,对肿瘤休眠的深入研究,可以了解疾病未来进展信息;可以作为药物治疗后肿瘤细胞逃避凋亡并存活的机制。肿瘤热消融是指利用热产生的生物学效应直接导致靶肿瘤发生凝固性坏死的原位灭活技术。目前临床常用的热消融主要是射频消融（RFA）及微波消融（MWA）。热消融不仅可以减轻肿瘤负荷、缓解肿瘤引起的症状及提高患者生存质量,而且与其他抗肿瘤药物联合使用可以提高局部控制率、延长患者生存。尽管热消融在肿瘤治疗中有许多优点,但是在某些患者中的治疗效果仍具挑战性。包括实现大于3cm肿瘤的完全消融;热消融可能与更高的肿瘤复发率有关,部分原因是难以实现大于5mm的消融周缘等。研究发现不全射频消融（iRFA）可以促进肿瘤生长。可能的促癌机制有:①iRFA后的正常肝组织可以增加促癌因子IL-6,HGF,c-Met及VEGF等的生成,从而发挥促肿瘤生长的作用;②体外实验发现,大鼠乳腺癌细胞、人乳腺癌、结肠癌等细胞受中度高温后,IL-6、TNFα、STAT3和HGF等因子表达升高,细胞增殖加快,以此推测热消融过程中,遇到中等温度的消融周边区域肿瘤细胞可能是被诱导激活;③iRFA促进间质中VEGF的升高,导致微血管生成;还可以通过活化VEGF上游驱动因子,如IL-6、HGF和c-Met,间接导致以VEGF驱动的微血管生长增殖。④iRFA诱导的自噬有促癌作用。总之多项研究表明iRFA可以促进残余肿瘤细胞的生长,那么iRFA是否可以导致肿瘤休眠细胞的激活,目前尚无报道。研究目的本研究从GEO上下载GSE138224数据集进行分析,识别差异基因,将差异基因表达数据进行功能分析、功能聚类,以探讨不全射频消融对结肠癌基因表达水平的影响及高表达基因的功能分析,有利于明确热消融后肿瘤复发的原因、丰富肿瘤耐药机制、寻找新的抗肿瘤治疗靶点。研究方法1、本研究从GEO上下载GSE138224数据集,利用NetwrokAnalyst网站,通过EdgeR方式,设为logFC（fold change）>l,adj.P<0.05为有统计学意义的数据,得出差异表达基因（DEGs）。2、将DEGs进行KEGG分析和GO分析,P<0.05有统计学意义。3、利用STRINNG数据库分析差异基因蛋白互作网络（PPI）及确定核心基因。置信度分值设为900以上为有统计学意义,关键PPI网络选择标准为节点>3,贡献度≥10。研究结果1、将6个样本中的高通量数据进行标准化后,得到16161个基因,从其中得到656个DEGs,其中637个下调基因,19个上调基因。热消融的目的是将肿瘤细胞杀灭,引起肿瘤细胞的凝固性坏死,所以大部分基因的表达下调为治疗后正常现象,相反出现了上调基因,说明可能存在复发因素,因此研究iRFA后上调基因的表达更具有临床意义。2、从上调基因的KEGG分析可以看出差异基因参与的信号通路有toll-样受体信号通路、TNF信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性等;上调基因GO分析结果中G0:BP聚集在免疫效应过程,JAK-STAT通路级联反应、STAT蛋白酪氨酸磷酸化过程,STAT蛋白酪氨酸磷酸化的调控等方面;值得注意的是Cc15基因参与调控JAK-STAT信号通路;上调的差异基因GO:MF分析基因主要富集在酶激活物活化、趋化因子活化及激酶激活物活性等。DEGs中的上调基因在GO:CC分析时没有取得有统计意义的结果。3、得出3个关键PPI网络,休眠相关基因Bmp4和Ccl5作为核心基因分别位于关键PPI网络中;且Bmp4是下调基因,Cc15是上调基因。研究结论1、与未经处理的结肠癌细胞相比,iRFA后肿瘤细胞存在高表达基因,这些高表达基因可能是iRFA术后肿瘤复发的原因。2、iRFA处理后的结肠癌细胞高表达肿瘤休眠相关基因Cc15及低表达休眠抑制基因BMP4。3、iRFA处理后的结肠癌细胞高表达肿瘤休眠相关相关JAK/STAT信号通路。4、iRFA处理后的结肠癌细胞高表达Cc15可能通过JAK/STAT信号通路激活休眠肿瘤细胞。
李照彦[7]（2020）在《PPARγ启动子突变在股骨头坏死BMSCs成脂成骨转分化中的作用及其分子机制研究》文中研究表明背景:股骨头坏死（Osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是由遗传易感因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病,病变骨髓腔往往充填了大量脂肪组织,因而脂代谢紊乱早已被公认为ONFH核心发病环节。随着ONFH发病率的逐年增加及对人类健康威胁的日益突出,ONFH的分子发病机制愈来愈成为骨科领域关注的热点。鉴于动物实验及临床研究已充分证实,高脂环境可以抑制成骨细胞的分化,高脂血症后骨髓内脂肪细胞增多增大压迫股骨头微血管引起骨细胞缺血性坏死,较早就推测成脂与成骨的转分化异常可能在ONFH发生发展中起关键作用,但一直不清楚脂肪蓄积的分子机理。近年对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）分化微环境的研究,惹人注目地发现了关键转录因子PPARγ（peroxisome proliferator activated receptorγ）在调节成脂、成骨分化中的关键作用。作为成脂分化的主调控器,PPARγ在脂肪细胞、BMSCs分化序贯的分子级联事件中,被广泛应用作为成脂分化的标志。本项目团队最近应用质谱技术对ONFH病例对照体系的研究率先发现,PPARγ基因启动子rs2920502突变（CC型）与中国汉族人群ONFH发病风险显着相关,且同步分析发现ONFH患者血清甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）含量及LDL-c/HDL-c比值显着升高,高密度脂蛋白（HDL-c）含量显着减低,尤为重要的是这个启动子突变CC基因型显着相关于ONFH患者血清TG水平,首先证实了作为脂肪形成主调节器的PPARγ基因启动子突变显着相关于ONFH发病风险及其脂代谢紊乱。ONFH分子机理研究的标志性进展是确认了多个易感基因相关于ONFH风险,但由于缺乏突变基因的功能验证,难以确认其在ONFH发生中的作用。鉴于PPARγ对成骨与成脂分化的独特调节作用,以及项目团队的PPARγ基因启动子突变介入ONFH发病风险的新发现,PPARγ很可能在启动及加重ONFH病变股骨头脂肪蓄积的分子事件中起关键作用。为进一步阐述PPARγ启动子突变在ONFH发生中的分子机理,本研究建立了ONFH病例对照体系,体外分离与培养入组病例BMSCs,进行PPARγ启动子rs2920502位点基因分型,系统研究不同PPARγ启动子rs2920502位点分型对BMSCs成脂成骨转分化作用的影响;不同PPARγ启动子rs2920502位点分型对BMSCs PPARγ转录与翻译水平表达的影响;PPARγ启动子突变对BMSCs成脂成骨转分化作用涉及的关键分子标志物的影响及PPARγ基因启动子突变对其活性影响的荧光素酶报告基因验证。解析PPARγ启动子突变与ONFH脂肪蓄积之间的内在关系,阐述PPARγ启动子突变引起ONFH脂肪蓄积的分子机制,为建立ONFH的分子水平防治对策提出科学依据及潜在分子靶点,促进分子病因学研究与ONFH的临床防治及早对接。研究方法:1.采集关节外科54例ONFH手术患者骨髓血10ml,32例股骨颈骨折手术患者骨髓血10ml,采用梯度离心法分离BMSCs,应用低糖DMEM培养基贴壁培养BMSCs。应用相差显微镜观察细胞形态学及生长情况。2.应用流式细胞仪对BMSCs进行细胞表面抗原及细胞周期检测,CCK-8方法检测细胞增殖能力。3.应用Sanger测序法对54例ONFH组和32例对照组BMSCs进行PPARγ启动子rs2920502位点的基因分型。4.应用成脂、成骨分化诱导试剂盒诱导培养的BMSCs向成脂成骨分化。应用茜素红染色、油红O染色及定量萃取的方法对BMSCs成脂成骨分化能力进行分析。5.应用qRT-PCR、Western blot方法检测PPARγ及成脂成骨关键基因在BMSCs成脂成骨过程中的表达。6.应用PCR技术分别从具有rs2920502 GG型与CC型的BMSCs细胞DNA基因组克隆PPARγ基因启动子片段,将获取的启动子片段重组入荧光素酶报告基因慢病毒表达载体,构建成能够检测具有rs2920502不同分型的启动子在细胞内调控基因表达活性的慢病毒载体。7.应用293FT细胞完成了慢病毒的包装与制备,应用流式细胞仪计算慢病毒滴度。将包装慢病毒感染BMSCs细胞,通过荧光显微镜观察病毒感染情况。8.通过双荧光素酶活性检测评估不同PPARγ启动子rs2920502基因型的启动子活性。实验结果:1.成功分离培养了来自54例ONFH患者和32例股骨颈骨折手术患者股骨干近端骨髓血的BMSCs,培养的BMSCs符合间充质干细胞形态学特征,细胞表面CD73、CD90及CD105抗原表达阳性,CD34和CD45抗原表达阴性。ONFH与对照组患者分离培养的BMSCs细胞周期无显着统计学差异,ONFH组BMSCs增殖能力略低于对照组,但两组间无显着统计学差异。2.油红O与茜素红染色及其定量分析显示,ONFH BMSCs成脂分化能力显着强于对照组（P<0.05）,ONFH组BMSCs成骨能力显着弱于对照组（P<0.05）;qRT-PCR检测BMSCs成脂成骨分化相关基因表达结果,ONFH组BMSCs成脂相关标志物PPARγ、维甲酸受体α（RXRα）、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPα）、脂蛋白脂酶（LPL）及脂肪酶（Adipsin）表达量显着高于对照组（P<0.05）。ONFH组BMSCs成骨相关标志物果蝇同属Runt相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP2）、骨桥蛋白（OPN）、锌指结构转录因子（Osterix）的表达量显着低于对照组（P<0.05）,阐述了ONFH BMSCs成脂成骨转分化障碍的特点及其关键分子靶点。3.首次完成了ONFH病例对照体系BMSCs PPARγ启动子rs2920502的基因分型,ONFH组BMSCs rs2920502分型分布为GG型32例,GC型19例,CC 3例,对照组rs2920502分型分布GG型16例,GC型15例,CC型1例。基因分型的结果与本项目组前期在361例ONFH病例对照体系外周血单个核细胞（PBMC）基因组分型结果的分布趋势一致,为进一步阐述PPARγ启动子突变对成脂成骨转分化的影响奠定了关键基础。4.不同基因分型BMSCs成脂成骨分化能力结果显示,ONFH组和对照组BMSCs PPARγ启动子rs2920502 CC型成脂能力显着高于GG型（P<0.05）,而成骨能力显着低于GG型（P<0.05）,率先阐述了PPARγ启动子突变影响BMSCs成脂成骨分化能力的科学证据。5.PPARγ启动子突变对其基因表达影响的研究结果发现,BMSCs在成脂诱导后第7天,两组BMSCs CC型PPARγ表达量均显着高于GG型和GC型（P<0.05）;在成脂诱导后第14天,ONFH组CC型PPARγ表达量显着高于GG型和GC型,对照组CC型PPARγ表达量也显着高于GG型（P<0.05）。ONFH组和对照组之间BMSCs不同基因分型的PPARγ表达量分析发现,在成脂第7天,ONFH组GC型和CC型PPARγ表达量均显着高于对照组GC型和CC型,在成脂第14天,ONFH组GG型、GC型及CC型PPARγ表达量均显着高于对照组GG型、GC型及CC型（P<0.05）,率先提出了PPARγ启动子突变影响其基因表达的实验证据。6.PPARγ启动子突变相关的关键分子标志物研究结果发现,成脂诱导后,ONFH组和对照组BMSCs CC型成脂标志物RXRα、CEBPα、LPL表达量显着高于GG型（P<0.05）。在成骨诱导后,ONFH组和对照组BMSCs CC型成骨标志物RUNX2表达量显着低于GG型（P<0.05）,ONFH组BMSCs CC型成骨标志物Osterix表达量亦显着低于GG型（P<0.05）。而且,成脂诱导后ONFH组GG型、GC型及CC型RXRα、CEBPα、LPL及Adipsin表达量均显着高于对照组GG型、GC型及CC型（P<0.05）。成骨诱导后ONFH组GG型、GC型及CC型成骨标志物RUNX2、BMP2、OPN、ALP及Osterix表达量均显着低于对照组GG型、GC型及CC型（P<0.05）,率先阐述了PPARγ启动子突变引起ONFH BMSCs成脂成骨转分化异常的关键分子靶点。7.成功构建了PPARγ启动子rs2920502慢病毒表达载体LV-pPPARγ-GG和LV-pPPARγ-CC,通过酶切、基因测序鉴定证实序列及插入方向正确,并实现了慢病毒载体在293FT细胞的成功包装,慢病毒滴度为3.49 x108 TU/mL。荧光素酶活性检测结果显示,慢病毒载体感染BMSCs在转染72h后,转染LV-pPPARγ-GG和LV-pPPARγ-CC慢病毒颗粒的细胞荧光素酶活性无明显差异。在成脂诱导第7天、第10天及第14天,LV-pPPARγ-CC荧光素酶活性明显高于转染LV-pPPARγ-GG慢病毒载体组,率先阐述了PPARγ启动子rs2920502突变引起PPARγ启动子活性增强,不仅为阐述ONFH成脂成骨转分化障碍的分子机制提出了创新思路,也为ONFH人群的分子水平防治提出了潜在分子靶标。本研究结果提示,PPARγ启动子正常功能维持PPARγ成脂分化主调节器作用,主导BMSCs分化微环境及其主要靶分子的功能朝向成骨分化的方向,成脂分化受抑;而PPARγ基因启动子rs2920502突变（CC型）后,导致启动子活性亢进及PPARγ基因表达增强与功能紊乱,引起PPARγ主导BMSCs的分化微环境调控成骨及成脂分子开关的系统功能紊乱,改变BMSCs分化微环境的主导分化方向,使成骨分化障碍,成脂分化凸显,在环境因素影响下,股骨头局部骨髓腔脂肪组织渐进性蓄积,引起ONFH的发生发展。本研究结果率先解析了PPARγ启动子突变后引起ONFH BMSCs成脂与成骨转分化障碍,并通过其关键分子靶点引发与加重ONFH的脂肪蓄积,解析PPARγ启动子突变—调控分子谱异常—ONFH脂肪蓄积之间的内在关系,阐述PPARγ启动子突变引起ONFH脂肪蓄积的分子机制,为建立ONFH的分子水平防治对策提出科学依据及关键分子靶点,为进一步用于ONFH的易感人群筛查及早期干预,促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接奠定了科学基础。
李豫皖[8]（2020）在《Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究》文中指出研究背景/目的:目前在构建骨组织工程中血管形成的作用越来越受到广泛关注,但在构建骨组织工程中,血管形成和成骨分化之间的分子机制目前尚未阐明。人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC）是一种来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞具有向成骨细胞,成软骨细胞和成脂细胞等多系分化的能力,hAMSCs也具有良好的血管生成能力;Schnurri-3（Shn3）也称为人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白-3（human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 3,HIVEP3）属于BMP/TGF-?的同源物家族。由于Shn3在成骨细胞中的缺失导致Runx2蛋白水平升高进而增强骨形成;骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9）具有显着上调间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）中的各种成骨分化过程中成骨相关因子的表达也能够刺激血管生成相关因子表达。然而,目前Shn3是否能够调节以及如何调节BMP9诱导的hAMSCs在体内外成骨分化和血管形成尚不清楚。基于此,在本课题研究中探讨Shn3是否参与调节BMP9在体内和体外诱导的hAMSCs向成骨分化和血管形成作用的影响及其信号通路和分子机制。方法:（1）胰酶/胶原酶联合消化方法分离并培养hAMSCs,倒置相差显微镜观察其形态改变;使用第3代hAMSCs,通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞表面分子标志物的表达;免疫荧光染色鉴定hAMSCs中波形蛋白和CK-19的表达,检测对第3代hAMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化潜能。（2）通过构建重组腺病毒（adenovirus,Ad）外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）（Ad-RFP）转染第3代hAMSCs后,观察转染效率,并使用qRT-PCR检测Shn3基因在细胞中的表达情况;使用碱性磷酸酶染色和生化定量检测第3、5和7天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的早期成骨分化效应;使用茜素红S染色和骨矿化定量观察第14和21天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的晚期骨矿化的作用,并使用qRT-PCR检测第7天时过表达Shn3对BMP9诱导的成骨相关基因Runx2（Runt related transcription factor 2）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）、I型胶原（Collagen type I,COL-I）、和成骨相关转录因子OSX（Osterix）的mRNA表达水平。（3）通过使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染技术,设BMP9组,Sim-Shn3组,BMP9+Sim-Shn3组和BMP9+Shn3组,分别转染第3代hAMSCs在24h后,将细胞打入裸鼠皮下形成裸鼠体内异位骨化的模型,在4周左右时收取异位骨块样本,并通过Micro-CT（μ-CT）对骨块扫描并行分析,对骨块行固定、包埋和切片染色,使用Masson’s Trichrome三色染色、H&E染色（hematoxylin and eosinstaining）对切片行骨小梁数量和分布进行分析,番红O固绿染色（Safranin O-fast green staining）染色观察异位成骨内软骨形成情况。使用免疫组织化学染色对各实验组异位骨块切片行染色观察,主要观察异位骨块内成骨相关指标包括OCN和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）以及血管形成相关分子如血管生成素-1（Angiopoietin 1,ANGPT1）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在异位骨块中的数量和分布情况。（4）使用细胞免疫组化技术观察过表达或沉默Shn3腺病毒转染细胞后,对BMP9诱导的第3代hAMSCs血管分化指标VEGF的表达及分布。使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,与人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs）在Transwell小室内共培养,其中腺病毒转染的hAMSCs在上层,HUVECs细胞在下层,使用基质胶（Matrigel）铺于板底,观察HUVECs细胞的小管形成能力,简介检测过表达或沉默Shn3对BMP9诱导的hAMSCs血管形成能力。（5）使用电纺聚乳酸-羟基乙酸(poly（lactic-co-glycolic acid,PLGA）共聚物支架材料,将过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）对支架材料的机构和搭载细胞后的细胞长入情况进行观察和分析。通过使用上述支架材料搭载转染腺病毒后的各实验组细胞,在培养48h后,将PLGA-细胞复合物移植入小鼠背部皮下组织内,在5周后,收集小鼠背部皮下移植物样本,并对样本行大体观察移植物在体内的血管长入情况,之后对移植物样本行免疫组织荧光染色,观察其血管性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF）在移植物内的表达和分布。（6）使用蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,其成骨分化相关指标OCN、OPN和Runx2的蛋白表达水平;通过使用Western blot技术,检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对BMP/Smads经典的信号（Smad-1/5/8）进行蛋白印迹检测其表达;通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对成骨相关转录因子Runx2和VEGF的直接作用关系。结果:（1）使用胰酶和II型胶原酶联合消化方法可以一次性获得大量形态均一的hAMSCs;通过细胞传代之后到第3代hAMSCs时,hAMSCs可稳定表达波形蛋白,而低表达CK-19;流式细胞检测第3代hAMSCs细胞表面分子标志物符合MSCs鉴定的表型。第3代hAMSCs具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。（2）重组腺病毒外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Ad-RFP）成功转染第3代hAMSCs后,且qRT-PCR结果显示Shn3在72h左右达到峰值。ALP染色和碱性磷酸酶活性结果显示,在第3、5和7天时,外源性过表达Shn3减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应,而沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应;茜素红S染色和骨矿化定量结果提示在第14和21天时,外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的hAMSCs晚期骨矿化和钙结节的形成;qRT-PCR结果显示在第7天时,外源性过表达Shn3下调了BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关因子包括Runx2、BSP、COL-I和OSX的mRNA表达。（3）在上述Shn3抑制BMP9诱导的hAMSCs体外成骨分化的基础上,进一步研究了Shn3对BMP9诱导的裸鼠皮下异位骨形成的成骨分化的影响。使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染BMP9诱导的第3代hAMSCs细胞后制造的裸鼠异位成骨模型中,大体观察结果和micro-CT结果显示,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组异位成骨的骨体积减小。与其他组相比,BMP9+Sim-Shn3组具有较强的异位成骨能力。Micro-CT的分析结果显示外源性Shn3表达增加了BMP9在hAMSCs中诱导异位骨块的平均骨密度,相反,外源性过表达Shn3降低了BMP9诱导的hAMSCs异位骨形成的平均骨密度。骨组织形态学定量分析显示骨体积/总体积（Bone volume/total volume,BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular number,Tb.N）,骨小梁厚度（Trabecular thickness,Tb.Th）和骨密度（Bone mineral density,BMD）与BMP9组相比,在BMP9+Sim-Shn3组有显着增加,相反,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组的上述参数有不同程度的下降,但骨小梁分离度在各组中无明显差异。组织化学染色结果显示与BMP9组相比,Sim-Shn3可增加了BMP9诱导的异位成骨中小梁骨数量和骨基质的形成。而外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的骨基质形成,同时免疫组化染色结果显示沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的异位骨化中成骨相关因子OCN和OPN以及血管形成相关因子ANGPT1和VEGF的表达,但外源性过表达Shn3基因抑制了此种效应。（4）细胞免疫组化染色结果显示,在第7天是,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs血管分化相关指标VEGF的表达;免疫荧光染色结果显示HUVECs细胞表达内皮粘蛋白（Endomucin,EMCN）、CD31、VEGF和vWF分子的表达;在与HUVECs细胞使用Transwell共培养诱导小管形成实验结果同样显示,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs间接小管形成的能力。（5）在使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜结果显示,细胞在PLGA电纺支架中生长情况良好,多数细胞能够贴壁;PLGA-细胞复合物移植入小鼠皮下的血管形成实验样本大体观察结果显示,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的皮下血管长入,且样本的免疫荧光染色结果提示,较其他各组中,沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的血管形成相关分子vWF的表达。（6）Western blot结果显示,在第7天是,较其他各组,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关指标包括OCN、OPN和Runx2的蛋白水平表达;外源性过表达BMP9增强了Smad1/5/8的磷酸化水平,同时Sim-Shn3显着增强了BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化表达。ChIP分析结果表明,转录因子Runx2能够在BMP9诱导的hAMSC中与VEGF启动子区域相结合。且免疫沉淀和免疫印迹结果表明外源性沉默Shn3的表达能够增强BMP9诱导的细胞中转录因子Runx2对其下游分子VEGF启动子的活性,证明了转录因子Runx2与VEGF分子之间的直接作用关系。结论:（1）人羊膜间充质干细胞具有MSCs的基本表型,具有向多系分化的能力包括成骨、成软骨及成脂细胞的潜能。（2）外源性沉默Shn3基因表达能够增强BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化,而外源性过表达Shn3基因表达则减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化。在外源性沉默Shn3表达后,能够加强BMP9诱导的hAMSCs在体外的血管形成。（3）通过沉默Shn3基因表达可以在体内外促进BMP9诱导的早期和晚期成骨分化以及血管形成的这一过程中,这可能是通过增强BMP/Smads信号来介导,并且Shn3在参与调节BMP9诱导的hAMSCs成骨分化和血管形成的双向效应中,Shn3通过调节关键成骨转录因子Runx2,激活其下游分子VEGF以促进BMP9诱导的hAMSCs的成骨和血管生成方面,Shn3发挥了重要的作用。
王雅丽[9]（2020）在《经直肠超声及超声造影在前列腺癌骨转移中的研究》文中研究指明目的探讨经直肠前列腺二维超声钙化征象、彩色多普勒血流参数及超声造影参数与前列腺癌骨转移的相关性。方法收集整理2017年9月至2020年1月内蒙古自治区人民医院泌尿外科确诊为前列腺癌的患者117例的相关临床及影像学资料,比较前列腺癌骨转移（BM）组与非骨转移（NBM）组经直肠前列腺二维超声钙化征象、彩色多普勒血流参数及超声造影参数差异。结果（1）117例前列腺癌患者发生骨转移49例,非骨转移68例,前列腺回声72.6%表现为不均质低回声,前列腺体积骨转移组与非骨转移组对比无差别（P>0.05）。（2）前列腺癌骨转移组患者血清TPSA及f PSA均高于非骨转移组（P<0.001）;随着Gleason评分等级递增,骨转移组人数占比上升（P<0.05）,69.4%（34/49）的骨转移患者集中于4-5级,而70.6%（48/68）的非骨转移患者集中于1-3级（P=0.002）。（3）前列腺癌患者前列腺钙化经直肠超声总检出率为77.8%,骨转移组中微钙化患者占42.9%（21/49）高于非骨转移组11.8%（8/68）（P=0.001）;骨转移组钙化灶数量≥20个患者占60.0%（24/40）高于非骨转移组27.5%（14/51）（P=0.001）;骨转移组钙化直径≤1mm占比高于非骨转移组,钙化直径≥2mm占比低于非骨转移组（P<0.05）;骨转移组钙化面积高于非骨转移组（P=0.002）。（4）前列腺癌骨转移组彩色多普勒超声血流参数RI、S/D高于非骨转移组（P<0.05）。（5）前列腺癌骨转移组超声造影参数PI、AUC高于非骨转移组（P<0.05）。（6）随着Gleason评分等级增加,微钙化组骨转移人数占比上升,85.7%（18/21）集中于Gleason评分4-5级（P=0.008）。结论前列腺癌经直肠二维超声微钙化特征、彩色多普勒血流参数及超声造影参数与骨转移具有一定相关性,含微钙化的骨转移患者Gleason评分等级较高,于前列腺微钙化处增加靶向穿刺取材更容易获得高级别的前列腺癌组织病理标本,为临床判断和发现骨转移提供更多有价值的信息。
刘新月[10]（2020）在《骨巨细胞瘤单细胞测序方法的建立及数据分析初步探索》文中研究指明目的骨巨细胞瘤作为亚洲人群多发的一种骨肿瘤,其对骨组织破坏能力强、致侵袭能力强、易复发、残率高且具有一定的转移性,寻找其骨侵蚀破坏的机制及新的治疗靶点成为该肿瘤的研究重点。目前关于骨巨细胞瘤的研究多为临床方面对术式的探索或病例回顾性研究,基础研究方面也多集中于破骨细胞的RNAK信号通路等,因此本研究将重点关注于剖析骨巨细胞瘤肿瘤组织细胞构成以实现对组织内细胞间异质性的分析,结合基因测序技术实现对肿瘤组织中造成骨侵蚀的多核破骨细胞样巨细胞与破骨细胞的分离,并对两者的差异表达基因进行生物学分析,探索对骨巨细胞瘤诊断治疗、预后评估及侵袭转移有重要影响的基因及其机制。方法本研究采用的测序方法为单细胞转录组测序技术,作为在二代测序技术上发展起来的新一代测序技术,单细胞测序可以实现组织内不同细胞单独分离、单独测序、单独建库的目标,同时也提高了基因表达水平测序的精确度,弥补了传统转录组测序方法中信号呈均值、易忽略少数细胞的不足之处,真正达到了在单个细胞水平上解析瘤内细胞异质性,为肿瘤的发生发展机制研究和诊疗方面开辟了新方向,提供了新思路。本研究将骨巨细胞瘤组织通过组织处理-组织解离-过滤检测的步骤将肿瘤组织处理至数量与活性均合格的细胞悬液并进行测序建库,对数据进行标准化过滤、线性转化、降维等处理,进行细胞聚类分析,将所有细胞按基因表达分类为12个细胞群。由于目前并没有关于单细胞测序技术在定义细胞类型上的明确方法,因此本研究在查询多个数据库及相关资料后,首次使用了在定义每个细胞群类型时,调取细胞差异表达基因并一一查询基因信息,同时通过采集数据库中细胞标记基因再对照本数据的查询定义方法,将12个不同细胞群分别进行定义命名,两种方向互相验证共同作用提高了严谨性及准确度,并填补了骨巨细胞瘤单细胞测序技术在定义细胞方法上的空白。在确定破骨细胞样巨细胞群和破骨细胞群后,本研究提取了这两个细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因,并对这些基因进行GO基因注释（分子功能+生物学功能）查询,寻找破骨细胞样巨细胞的过度骨吸收特性有关的重要基因。结果通过单细胞测序技术和生物学分析技术将肿瘤组织内细胞分群聚类后,确定了本研究所选取的骨巨细胞瘤中具有的细胞类型包括:NKT细胞、成骨细胞、浆细胞、B细胞、巨细胞、巨噬细胞、T细胞、基质细胞、单核细胞、破骨细胞、少量肌细胞、破骨细胞前体细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞。在确定细胞类型后,提取了破骨细胞样巨细胞和破骨细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因各50个,通过韦恩图比对发现两细胞群的差异表达基因中重合部分超过半数（27个）,对这些功能同表达基因进行热图展示分析后,发现破骨细胞表达较高的基因包括CA2、ATP6V1E1、CKB、SPP1、ATP6V1C1、ATP6V1G1、GLRX、CSTB、ATP6V0E1、MATK、RAC2、SLC9B2、ATP6V1B2、CHCHD10、TCIRG1、ATP6V1H、ATP6V1F、RALA、ACP5、CTSD、CD68,而相比之下,共同基因中（50）,巨细胞表达较高的基因包括TKT、SNX10、MMP9、CD84、RGS10、CTSK。对每个基因进行GO基因注释及查询后发现,在破骨细胞表达较高的基因中,基因SPP1除了正性调控骨吸收外,还参与了成骨细胞分化和骨化的过程,这是维持骨组织中成骨沉积-骨吸收稳态的重要环节,而巨细胞内SPP1的表达却较低。基因MATK参与了Erb B2（HER2基因）信号通路,而在研究中报道过骨肿瘤中的基因Erb B2的过表达伴有患者肺转移,也标志了较差的预后。在巨细胞表达较高的基因中,基因CTSK参与了负调控膜内骨化、骨吸收和软骨发育的生物学过程,这些功能可能是造成巨细胞骨破坏的机制,在研究中也报道过AKT/NFATc1/CTSK轴在颅骨发育过程中促进破骨细胞生成和骨吸收,而在骨巨细胞瘤中CTSK对于破骨细胞和骨吸收的机制并没有阐明。另一巨细胞表达较高的基因为基因SNX10,其生物学功能包括调节骨矿化、破骨细胞分化、骨吸收等与破骨细胞类功能,而且有研究显示基因SNX10参与破骨细胞激活,SNX10突变将造成破骨细胞功能障碍,进而影响骨质硬化,但基因SNX10在骨巨细胞瘤中对破骨细胞的作用机制并没有相应研究阐述。结论本研究通过对单细胞技术实验方法、数据的处理分析,定义细胞方法的探索和掌握,达到了对骨巨细胞瘤单个细胞层面和基因层面的剖析,分析定义了该肿瘤的所含细胞类型并初步确定了四个最可能造成肿瘤骨侵蚀特性的基因SPP1、MATK、CTSK和SNX10,弥补了当前骨巨细胞瘤研究领域的缺陷。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肿瘤微环境 |
| 1.3 肿瘤转移 |
| 1.4 肿瘤的治疗策略 |
| 1.4.1 被动靶向 |
| 1.4.2 主动靶向 |
| 1.4.3 免疫治疗 |
| 1.5 骨肉瘤 |
| 1.6 双膦酸盐药物 |
| 1.6.1 双膦酸盐类药物分析方法 |
| 1.6.2 双膦酸盐的生物利用度 |
| 1.6.3 双膦酸盐的生物学作用 |
| 1.6.3.1 骨质疏松症 |
| 1.6.3.2 肿瘤骨转移以及并发的高钙血症 |
| 1.6.3.3 双膦酸盐官能团化的应用 |
| 1.6.4 双膦酸盐的作用机理 |
| 1.7 论文的研究内容和创新点 |
| 1.7.1 主要研究内容 |
| 1.7.2 论文创新点 |
| 第二章 双膦酸盐的改进定量方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 BPs含量测定反应的探究 |
| 2.2.4 溶液配制 |
| 2.2.5 改进定磷试剂与磷酸盐的显色反应 |
| 2.2.6 改进定磷试剂与阿仑膦酸钠的显色反应 |
| 2.2.6.1 反应时间对显色反应的影响 |
| 2.2.6.2 反应温度对显色反应的影响 |
| 2.2.6.3 醇含量对显色反应的影响 |
| 2.2.6.4 不同醇对显色反应的影响 |
| 2.2.6.5 改进定磷试剂与利塞膦酸钠的显色反应 |
| 2.3 BPs含量测定反应 |
| 2.3.1 BPs含量测定反应探究结果 |
| 2.3.2 改进定磷试剂与阿仑膦酸钠的显色反应 |
| 2.3.3 反应时间对显色反应的影响 |
| 2.3.4 反应温度对显色反应的影响 |
| 2.3.5 醇含量对显色反应的影响 |
| 2.3.6 不同醇对显色反应的影响 |
| 2.3.7 改进定磷试剂与利塞膦酸钠的显色反应 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 羟基磷灰石的制备及其负载利塞膦酸钠在抗肿瘤中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.1.1 试剂与耗材 |
| 3.2.1.2 仪器 |
| 3.2.1.3 实验细胞 |
| 3.2.2 壳寡糖为模版合成的载药HAP及其抗肿瘤研究 |
| 3.2.2.1 模版法制备HAP的合成方法 |
| 3.2.2.2 模版法制备的HAP的表征 |
| 3.2.2.3 模版法制备的HAP的生物相容性研究 |
| 3.2.2.4 模版法制备的HAP的载药性能测定 |
| 3.2.2.5 载药HAP的抗血管生成实验 |
| 3.2.2.6 载药HAP的细胞划痕实验 |
| 3.2.3 花状Si掺杂HAP的合成及其抗肿瘤研究 |
| 3.2.3.1 花状Si掺杂HAP的合成 |
| 3.2.3.2 花状Si掺杂HAP的表征 |
| 3.2.3.3 花状Si掺杂HAP的载药性能测定 |
| 3.2.3.4 载药Si掺杂HAP的抗血管生成实验 |
| 3.2.3.5 载药Si掺杂HAP的细胞划痕实验 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 壳寡糖为模版合成的载药HAP及其抗肿瘤研究结果 |
| 3.3.1.1 模版合成的HAP的表征 |
| 3.3.1.2 载药HAP的抗血管生成结果 |
| 3.3.1.3 载药HAP的细胞划痕结果 |
| 3.3.2 花状Si掺杂HAP的载药性能及抗肿瘤结果 |
| 3.3.2.1 花状Si掺杂HAP的表征 |
| 3.3.2.2 载药花状Si掺杂HAP的抗血管生成结果 |
| 3.3.2.3 载药花状Si掺杂HAP的细胞划痕结果 |
| 3.3.3 两种羟基磷灰石的对比 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 骨靶向阿仑膦酸钠-肝素偶联物递药系统 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与仪器 |
| 4.2.1.1 试剂与耗材 |
| 4.2.1.2 主要仪器 |
| 4.2.1.3 实验细胞 |
| 4.2.1.4 实验动物 |
| 4.2.2 实验步骤 |
| 4.2.2.1 缩合剂的合成 |
| 4.2.2.2 AH的合成及表征 |
| 4.2.2.3 AH的体外实验 |
| 4.2.2.4 AH耦合物的体内实验 |
| 4.2.2.5 AH耦合物与HAP相互作用的分子动力学模拟 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AH偶联物的表征 |
| 4.3.1.1 红外谱图 |
| 4.3.1.2 核磁谱图 |
| 4.3.2 AH偶联物体外实验结果 |
| 4.3.2.1 细胞毒性实验 |
| 4.3.2.2 体外破骨细胞实验 |
| 4.3.3 AH偶联物体内结果 |
| 4.3.3.1 凝血实验 |
| 4.3.3.2 AH对骨溶解的抑制作用 |
| 4.3.3.3 AH对人乳腺癌转移的抑制作用 |
| 4.3.4 AH耦合物与HAP相互作用的分子动力学模拟结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒的制备及其在抗肿瘤治疗中的应用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料与仪器 |
| 5.2.1.1 试剂与耗材 |
| 5.2.1.2 主要仪器 |
| 5.2.1.3 实验细胞 |
| 5.2.1.4 实验动物 |
| 5.2.2 实验步骤 |
| 5.2.2.1 利塞膦酸钠修饰的Fe_3O_4纳米粒的制备 |
| 5.2.2.2 RIS-FeNPs纳米粒含量的测定 |
| 5.2.2.3 RIS-FeNPs纳米粒的表征 |
| 5.2.2.4 RIS-FeNPs纳米粒的体外实验 |
| 5.2.2.5 RIS-FeNPs纳米粒的体内实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 RIS-FeNPs的表征 |
| 5.3.1.1 形貌分析 |
| 5.3.1.2 红外拉曼光谱分析 |
| 5.3.1.3 XRD晶型分析 |
| 5.3.1.4 RIS-FeNPs的饱和磁化强度 |
| 5.3.1.5 RIS-FeNPs的磁热性能 |
| 5.3.1.6 RIS-FeNPs的稳定性测试 |
| 5.3.2 RIS-FeNPs的体外实验结果 |
| 5.3.2.1 细胞摄取 |
| 5.3.2.2 细胞摄取升温 |
| 5.3.2.3 细胞毒性结果 |
| 5.3.2.4 细胞划痕及Transwell迁移实验结果 |
| 5.3.2.5 血管生成抑制 |
| 5.3.3 RIS-FeNPs体内实验结果 |
| 5.3.3.1 RIS-FeNPs的磁靶向作用 |
| 5.3.3.2 RIS-FeNPs的体内磁热作用 |
| 5.3.3.3 RIS-FeNPs的体内药效学研究 |
| 5.3.3.4 肿瘤转移研究 |
| 5.3.3.5 体内免疫指标 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒制备的磁靶向脂质体用于治疗骨肉瘤的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 材料与仪器 |
| 6.2.1.1 试剂与耗材 |
| 6.2.1.2 主要仪器 |
| 6.2.1.3 实验细胞 |
| 6.2.1.4 实验动物 |
| 6.2.2 实验步骤 |
| 6.2.2.1 阿霉素磁靶向脂质体的制备及表征 |
| 6.2.2.2 RFe/DOX Lipo的体外研究 |
| 6.2.2.3 RFe/DOX Lipo的体内研究 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 脂质体的表征 |
| 6.3.1.1 RFe/DOX Lipo的DLS粒径和透射电镜下形态学观察 |
| 6.3.1.2 RFe/DOX Lipo饱和磁化强度测试 |
| 6.3.1.3 RFe/DOX Lipo血清稳定性和药物释放 |
| 6.3.2 脂质体的体外实验 |
| 6.3.2.1 细胞毒性 |
| 6.3.2.2 细胞摄取 |
| 6.3.3 体内实验 |
| 6.3.3.1 磁性脂质体在动物体内分布 |
| 6.3.3.2 RFe/DOX Lipo体内药效学研究 |
| 6.3.3.3 Micro-CT对胫骨处的表征 |
| 6.3.3.4 Micro-CT对胫骨处的三维重建 |
| 6.3.3.5 磁性脂质体体内的抗肿瘤机理 |
| 6.3.3.6 磁性脂质体体内安全性评价 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 利塞膦酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒制备的磁靶向脂质体磁热疗法克服骨肉瘤的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验部分 |
| 7.2.1 材料与试剂 |
| 7.2.1.1 试剂与耗材 |
| 7.2.1.2 主要仪器 |
| 7.2.1.3 实验细胞 |
| 7.2.1.4 实验动物 |
| 7.2.2 实验步骤 |
| 7.2.2.1 磁靶向脂质体的表征 |
| 7.2.2.2 RFe/DOX Lipo的体外实验 |
| 7.2.2.3 RFe/DOX Lipo的肿瘤磁热疗法的体内研究 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 RFe/DOX Lipo的表征 |
| 7.3.1.1 RFe/DOX Lipo的磁热性能 |
| 7.3.1.2 RFe/DOX Lipo的磁热释放作用 |
| 7.3.2 RFe/DOX Lipo磁热的体内结果 |
| 7.3.2.1 RFe/DOX Lipo体内磁热红外图 |
| 7.3.2.2 Micro-CT对胫骨处的表征 |
| 7.3.2.3 Micro-CT对胫骨的三维重建图像 |
| 7.3.2.4 RFe/DOX Lipo磁靶向磁热的药效学研究 |
| 7.3.2.5 RFe/DOX Lipo磁靶向磁热的机理研究 |
| 7.3.2.6 RFe/DOX Lipo安全性评价 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 附录一 缩略语(Abbreviations) |
| 附录二 CT定量分析 |
| 附录三 CT定量分析 |
| 参考文献 |
| 攻读博士研究生期间发表及待发表的论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的临床疗效观察研究 |
| 材料与方法 |
| 试验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 基于网络药理学探讨补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠疗效机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 中药治疗股骨头坏死的临床应用现状研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 非创伤性股骨头坏死信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表(Abbreviation) |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 兔髋臼后壁骨折继发创伤性关节炎动物模型的建立与验证 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验动物及材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 术中和术后大体情况 |
| 2.2 标本大体观 |
| 2.3 影像学特点与评分 |
| 2.4 组织病理学特点与评分 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中医骨伤科学对髋臼骨折病因的认识与治疗 |
| 3.2 本实验动物模型的应用基础 |
| 3.3 本实验动物模型的设计特点 |
| 3.4 本实验动物模型的特点及ORIF的疗效 |
| 3.5 本实验动物模型的不足 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 髋臼后壁骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变特点与机制研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验动物及材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4 统计方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 MicroCT扫描 |
| 2.3 血清ELISA生化检测 |
| 2.4 Rt-PCR基因检测 |
| 2.5 Western Blot组织蛋白检测 |
| 2.6 破骨细胞TRAP染色 |
| 2.7 凋亡细胞TUNEL荧光法检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中医整体观指导分析软骨下骨病变与PTOA的内在联系 |
| 3.2 兔髋臼骨折继发PTOA早期软骨下骨微结构变化特点 |
| 3.3 兔髋臼骨折继发PTOA早期软骨下骨生化改变 |
| 3.4 骨细胞凋亡在兔髋臼骨折继发PTOA早期软骨下骨病变中的作用 |
| 3.5 ORIF对兔髋臼骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变的作用 |
| 3.6 本部分研究的不足 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 淫羊藿苷防治髋臼骨折继发创伤性关节炎早期软骨下骨病变及其机制的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物及材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4 统计方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 影像学和组织病理学特点与评分 |
| 2.3 MicroCT扫描 |
| 2.4 血清ELISA生化检测 |
| 2.5 Rt-PCR基因检测 |
| 2.6 Western Blot组织蛋白检测 |
| 2.7 破骨细胞TRAP染色 |
| 3.讨论 |
| 3.1 淫羊藿苷治疗兔髋臼骨折继发PTOA的影像学和组织病理学评估 |
| 3.2 淫羊藿苷对兔髋臼骨折继发PTOA早期软骨下骨微结构的作用 |
| 3.3 淫羊藿苷对兔髋臼骨折继发PTOA早期软骨下骨的生化改变 |
| 3.4 淫羊藿苷改善兔髋臼骨折继发PTOA早期软骨下骨病变的机制 |
| 3.5 本部分研究的不足 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 (一):综述 软骨下骨早期病变在创伤性关节炎中的作用及中医药治疗现状 |
| 一、创伤性关节炎概述 |
| 二、软骨下骨早期病变在创伤性关节炎中的作用 |
| 三、中医药在创伤性关节炎治疗中的应用与研究 |
| 参考文献 |
| 附录 (二):课题资助情况 |
| 附录 (三):攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 早期骨转移生态位变化的研究进展 |
| 1 肿瘤细胞在骨转移生态位中的定植、存活和活化 |
| 2 肿瘤细胞对骨细胞的调节作用 |
| 3 成骨细胞在溶骨性骨转移早期发展中的作用 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 综述二 双膦酸盐和地诺单抗治疗乳腺癌骨转移研究进展 |
| 1 双膦酸类药物治疗乳腺癌研究进展 |
| 2 地诺单抗治疗乳腺癌研究进展 |
| 3 总结 |
| 参考文献 |
| 综述三 关于骨肿瘤的历史沿革和现代医家认识 |
| 1 历史沿革 |
| 2 现代名家对骨转移病机治法的认识和用药经验 |
| 3 总结 |
| 参考文献 |
| 下篇 中医理论探讨及实验研究 |
| 前言 |
| 研究一 骨转移中医防治理论探讨及补肾类中药网络药理学初步分析 |
| 1 乳腺癌骨转移中医病机治法探讨 |
| 2 “淫羊藿-肉苁蓉”治疗乳腺癌骨转移的作用机制探讨 |
| 3 小结 |
| 研究二 乳腺癌骨转移不同造模方式比较 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 研究三 不同补肾类治法干预乳腺癌骨转移疗效差异观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 研究四 阴阳双补方调节骨转移生态位的机制探索 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 研究五 细胞共培养模型验证阴阳双补方调节骨转移生态位的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 乳腺癌骨转移生态位变化机制 |
| 2 中医药防治骨转移归经、药性理论探索 |
| 3 不同补肾类治法防治乳腺癌骨转移的疗效差异 |
| 4 补肾类中药调节骨转移生态位的机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 缩略词表（以字母顺序排列） |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 细胞水平研究Wnt3a影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化能力 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 细胞水平研究LncRNA NONHSAT009968通过Wnt3a影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 动物水平分析LncRNA NONHSAT009968对骨髓炎状态下hBMMSCs成骨分化能力影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 LncRNA NONHSAT009968靶向调控Wnt3a的分子机制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 非编码RNA对骨髓间充质干细胞成骨分化影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
| 第一部分:微波消融联合骨水泥成形术治疗溶骨性骨转移瘤安全性及疗效分析 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录1 疼痛数字评分(Numerical Rating Scale,NRS)量表 |
| 附录2 卡氏体力状况评分(Karnofsky's Performance Status,KPS)量表 |
| 附录3 欧洲五维度健康指数(EuroQol five Dimensions questionnaire,EQ-5D)量表 |
| 附录4 日本的时间权衡法(Time Trade-off,TTO)积分换算表 |
| 附录5 欧洲癌症骨转移患者生活质量量表 |
| 附录6 Oswestry功能指数(Oswestry Disability Index,ODI)量表 |
| 附录7 美国脊髓损伤协会神经学检查评分 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 生物信息学方法分析不完全射频消融导致结肠癌细胞相关休眠基因的激活 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 ONFH病例对照体系建立、成脂成骨能力的研究及PPARγ启动子rs2920502 位点在BMSCs中基因分型 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 ONFH病例对照组体系的建立 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器设备 |
| 2.1.4 实验试剂配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BMSCs分离、培养及扩增 |
| 2.2.2 BMSCs冻存及复苏 |
| 2.2.3 BMSCs表面抗原及细胞周期检测 |
| 2.2.4 BMSCs增殖能力检测 |
| 2.2.5 BMSCs成骨分化能力检测及定量分析 |
| 2.2.6 BMSCs成脂分化能力检测及定量分析 |
| 2.2.7 PPARγ基因rs2920502 基因测序分型结果 |
| 2.2.8 统计分析方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 入组患者基本信息 |
| 2.3.2 BMSCs形态学特征 |
| 2.3.3 ONFH组及对照组BMSCs表面抗原表达相一致 |
| 2.3.4 ONFH组及对照组BMSCs细胞周期无显着差异 |
| 2.3.5 ONFH组和对照组BMSCs增殖能力无明显差异 |
| 2.3.6 ONFH患者BMSCs成脂分化能力增强 |
| 2.3.7 ONFH患者BMSCs成骨分化能力减弱 |
| 2.3.8 PPARγrs2920502 位点基因分型结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 PPARγ启动子突变对BMSCs成脂成骨分化的影响及其分子标志物的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要实验试剂 |
| 3.1.2 主要实验仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BMSCs总 RNA提取 |
| 3.2.2 逆转录及实时荧光定量PCR |
| 3.2.3 引物设计 |
| 3.2.4 BMSCs成脂、成骨诱导染色及定量分析方法 |
| 3.2.5 碱性磷酸酶活性检测 |
| 3.2.6蛋白免疫印迹实验 |
| 3.2.7 统计分析方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PPARγ启动子rs2920502 位点CC型 BMSCs成脂分化能力增强 |
| 3.3.2 PPARγ启动子rs2920502 位点CC型 BMSCs成骨分化能力减弱 |
| 3.3.3 PPARγ启动子rs2920502 位点CC型 BMSCs成脂诱导后PPARγ表达上升 |
| 3.3.4 PPARγ启动子rs2920502 位点CC型 BMSCs成脂相关标志物表达上升 |
| 3.3.5 PPARγ启动子rs2920502 位点CC型 BMSCs成骨相关标志物表达下降 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 PPARγ基因启动子突变对启动子活性影响的体外验证研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要实验试剂 |
| 4.1.2 主要实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒载体构建流程 |
| 4.2.2 慢病毒包装制备 |
| 4.2.3 慢病毒滴度检验 |
| 4.2.4 慢病毒感染目的细胞 |
| 4.2.5 荧光素酶活性测定 |
| 4.2.6 统计分析方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PPARγ启动子序列分析结果 |
| 4.3.2 PPARγ启动子PCR扩增结果 |
| 4.3.3 重组慢病毒载体质粒电泳结果 |
| 4.3.4 重组慢病毒载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 4.3.5 重组慢病毒载体质粒测序结果 |
| 4.3.6 慢病毒包装结果 |
| 4.3.7 慢病毒感染BMSCs结果 |
| 4.3.8 PPARγ启动子活性的荧光素酶报告基因分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与创新 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.1 综述1 PPARγ基因在关键骨关节疾病中的研究进展 |
| 1.1.1 PPARγ基因结构及功能 |
| 1.1.2 PPARγ与成脂成骨转分化研究进展 |
| 1.1.3 PPARγ与关键骨关节疾病 |
| 1.1.4 结语 |
| 1.2 综述2股骨头坏死分子发病机制研究进展 |
| 1.2.1 ONFH病因及早期治疗措施 |
| 1.2.2 ONFH基因多态性研究进展 |
| 1.2.3 ONFH与非编码RNA研究进展 |
| 1.2.4 BMSCs成脂成骨转分化异常在ONFH分子发病机理中的研究进展 |
| 1.2.5 结语 |
| 参考文献 |
| 博士研究生指导组成员和课题基金资助项目 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 羊膜间充质干细胞分离、提取与鉴定及其多向分化潜能的实验研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Shn3对BMP9 诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成的作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成中的信号机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:成骨分化和血管形成中分子的偶联机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的主要学术成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床资料结果分析 |
| 2.2 前列腺癌骨转移组与非骨转移组经直肠超声及超声造影参数结果分析 |
| 2.2.1 经直肠二维超声前列腺钙化对比分析 |
| 2.2.2 经直肠彩色多普勒超声血流参数对比分析 |
| 2.2.3 经直肠超声造影参数对比分析 |
| 2.3 前列腺癌骨转移患者不同钙化类型Gleason评分对比分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 前列腺癌骨转移影像学诊断研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、单细胞转录组测序实验方法的探索及数据初步整理 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 主要分析软件 |
| 1.1.5 主要实验方法 |
| 1.1.6 分析方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 测序结果初步整理分析 |
| 1.2.2 质量检测及标准流程处理结果 |
| 1.2.3 特征选择及降维处理结果 |
| 1.2.4 细胞聚类结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 使用单细胞测序技术研究肿瘤的必要性 |
| 1.3.2 单细胞悬液制备和保存的注意事项 |
| 1.3.3 主成成分分析数量的选择 |
| 1.4 小结 |
| 二、定义细胞类型 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 筛选出各cluster的差异表达基因 |
| 2.2.2 有明确标注marker gene的细胞类型 |
| 2.2.3 根据差异表达基因尝试定义细胞类型 |
| 2.2.4 根据数据库marker gene对照数据确定细胞类型 |
| 2.2.5 细胞类型确定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、骨巨细胞瘤内巨细胞与破骨细胞的表达差异 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 研究方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 提取差异表达基因 |
| 3.2.2 基因注释 |
| 3.2.3 两者差异基因对比 |
| 3.2.4 差异基因功能注释 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 骨巨细胞瘤在基因组学方面的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
