静脉用卵磷脂的制备

一、静脉用卵磷脂的制备（论文文献综述）

汪春燕^[1]（2021）在《葛根素脂质微球注射液的制备及质量评价》文中研究说明葛根素是从豆科植物野葛干燥根中提取的一种异黄酮类化合物,现代研究表明其对心脑血管疾病有显着治疗效果,临床应用较多的是葛根素注射液。葛根素注射液因释药速度过快,刺激性大,不良反应时有发生;且溶解性低,常需加入助溶剂（丙二醇）,有研究表明丙二醇的加入会加重葛根素溶血不良反应的发生。鉴于葛根素注射剂出现的问题,需要一种更安全的载药系统来避免类似问题出现。本课题尝试将葛根素以磷脂复合物的形式制成葛根素脂质微球注射液,并对制备的脂质微球的理化性质及稳定性进行考察,于大鼠体内进行药动与药效学评价,以尝试获得葛根素新的给药方式——葛根素脂质微球注射液,更好地满足临床安全用药需求。药物的处方前研究是药物制剂成功的关键,采用高效液相色谱法建立葛根素体外分析检测方法,测定了葛根素于不同p H值缓冲液中的表观溶解度、正辛醇/水系统的油水分配系数以及在不同注射用长链脂肪酸甘油脂（LCT）与注射用中链脂肪酸甘油脂（MCT）配比下溶解度。结果显示,葛根素于水与油中溶解度均不高。稳定性实验提示葛根素于强光与高温下不稳定。葛根素脂质微球的处方优化采用了单因素考察与星点设计--曲面效应法,制备工艺采用单因素考察法进行优化。葛根素脂质微球优化处方为:葛根素磷脂复合物中蛋黄卵磷脂1.40g,普朗尼克188 0.20g,LCT 3.00g,MCT 17.00g,吐温80 0.15g,油酸钠0.05g;制备工艺为:初乳油相与水相于70℃混合后,于高压均质机中以13000r/min剪切10min制得,初乳于高压均质机中70 MPa压力下均质8次得到稳定终乳。采用透射电镜观察了葛根素脂质微球的外观形态,利用纳米粒度仪测定葛根素脂质微球的粒径、粒径分布以及ζ-电位。葛根素脂质微球的载药量采用高效液相色谱法测定,包封率采用葡聚糖凝胶G-50（Sephadex G-50）微型柱离心法测得。测得葛根素脂质微球的粒径为242.0nm,PDI为0.130,ζ-电位为-33.1m V,包封率为93.00%,载药量为5.00mg/ml。葛根素脂质微球稳定性考察主要通过离心加速试验、冷冻-加热循环试验及长期稳定性来进行。结果表明,葛根素脂微球注射液可以长时间保持稳定。葛根素脂质微球的PH值、稀释后的黏度、渗透压摩尔浓度等指标均符合药典关于注射乳剂的的基本要求。以葛根素注射液为参比制剂,将葛根素脂质微球于大鼠体内进行药动与药效学评价。药动学研究表明,葛根素脂质微球注射液可显着提高葛根素的生物利用度,半衰期以及血药达峰浓度。药效学通过线栓法,建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤（MCAO）模型,评价指标选择对神经功能的缺损评分、脑梗死百分比、脑组织含水量、脑匀浆炎性因子以及细胞间粘附分子（ICAM-1）的影响水平,考察对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。结果表明,葛根素脂质微球注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。结论:在优化处方配比下,通过两步高压均质法制得的葛根素脂质微球注射液性质稳定,各项指标均符合药典中关于注射乳剂的基本要求。药代动力学实验表明葛根素脂质微球注射液在大鼠体内的半衰期,达峰浓度及生物利用度显着高于葛根素注射液。药效学实验证明,葛根素脂质微球注射液对大鼠MCAO所引起损伤保护作用较好。由此可见,葛根素脂质微球注射液作为葛根素新的给药体系,值得进一步研究,为更好的服务临床做准备。

马永昌^[2]（2021）在《活性氧清除性纳米粒治疗中性粒细胞哮喘的作用与机制研究》文中指出哮喘是常见的肺部疾病之一,其死亡率在我国高达36.7/10万人,居全球首位,其中患有严重哮喘的患者约3%-10%,主要以中性粒细胞浸润为主。目前,临床用于哮喘治疗的药物对中性粒细胞哮喘效果不佳,且大多数具有耐药性或不良反应。氧化应激失衡与中性粒细胞哮喘病理进程息息相关,过量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）会降低糖皮质激素在中性粒细胞哮喘中的疗效,同时还能刺激组胺的释放,导致内皮细胞的损伤和脱落、破坏β-肾上腺素能受体的功能,导致气道受损重塑、呼吸阻力增加、肺功能低下。研究表明,靶向中性粒细胞相关介质或中性粒细胞介导的炎症反应是哮喘治疗的新策略。中性粒细胞通过释放DNA、组蛋白和蛋白酶等组装形成的胞外网状结构捕捉杀灭病原体,但过量的中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）形成是许多炎症反应和自身免疫性疾病的发病机制。因此,设计并研发安全高效、生物相容性良好、能够靶向至肺部中性粒细胞、兼具活性氧清除和抑制NETs形成的纳米药物可能具有良好的中性粒细胞哮喘防治效果。本课题拟通过抑制中性粒细胞的氧化应激、减少NETs形成来控制局部炎症反应,减轻气道重塑,改善肺功能,从而达到治疗中性粒细胞哮喘的目的。基于此,我们通过将Tempol（Tpl）和苯硼酸频哪醇酯（PBAP）共价连接到环糊精（β-CD）上成功构建了活性氧清除性纳米粒TPCN及线粒体靶向性纳米粒TTPCN。分别考察了TPCN与TTPCN在中性粒细胞哮喘中的靶向效果与治疗作用,并深入探究了其抗中性粒细胞哮喘的作用机制,初步研究发现,抑制NETs形成能够减少其对na（?）ve T细胞的NETs捕获和包裹,对Treg/Th17细胞平衡产生有益影响。方法1.活性氧清除性纳米粒TPCN的构建与表征Tpl被CDI活化后,与β-CD在4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下通过共价键结合得到TCD。随后将经CDI活化的PBAP在DMAP催化下,与TCD共价结合得到活性氧清除性材料TPCD。通过红外光谱（FT-IR）与核磁共振氢谱（1H NMR）分析验证TPCD的结构。通过改良的纳米沉淀/自组装法制备活性氧清除性纳米粒TPCN。以卵磷脂和DSPE-m PEG2000的水溶液为水相,将TPCD的甲醇溶液在剧烈搅拌下逐滴加入到水相中自组装得到TPCN。通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察TPCN的外观并采用粒度仪测定TPCN的粒径分布及表面电位。2.TPCN在中性粒细胞哮喘中的靶向治疗作用评价通过LPS和OVA滴鼻吸入及OVA和Al（OH）3腹腔注射致敏小鼠,OVA激发建立中性粒细胞哮喘模型。通过尾静脉注射和雾化吸入Cy7.5/TPCN,采用活体成像系统探究TPCN在中性粒细胞哮喘肺部的靶向能力。利用Cy5/TPCN,通过流式细胞术分析尾静脉注射和雾化吸入给药后TPCN在肺组织白细胞中的分布。分别按照尾静脉注射和雾化吸入的给药方案给予中性粒细胞哮喘小鼠不同药物治疗。治疗结束后,取肺部灌洗液,检测中性粒细胞含量、氧化应激相关指标H2O2、MPO和炎症因子TNF-α、IL-1β、Il-17、KC水平。取肺组织,进行免疫荧光染色、H&E染色和PAS染色。通过小动物肺功能仪检测小鼠的呼吸阻力。3.线粒体靶向性纳米粒TTPCN在中性粒细胞哮喘中的靶向治疗作用评价通过纳米沉淀/自组装法制备得到不同比例STPP修饰的Cy5/TTPCN并采用粒度仪测定不同纳米粒的粒径分布。尾静脉注射不同比例STPP修饰的Cy5/TTPCN后,采用活体成像技术探究在中性粒细胞哮喘肺部达到最佳靶向性的STPP最优比例。将Cy5/TTPCN与A549细胞和中性粒细胞共孵育后,采用Mito Tracker Green标记细胞线粒体,通过共聚焦显微镜考察TTPCN与线粒体的共定位情况。按照尾静脉注射的给药方案给予中性粒细胞哮喘小鼠TTPCN与TPCN治疗。实验结束后,通过测定肺部灌洗液中中性粒细胞含量和H2O2、MPO、KC、TNF-α、IL-1β水平评价TTPCN的疗效。通过肺部H&E染色与PAS染色观察TTPCN对缓解气道狭窄、抑制粘液分泌和炎性细胞浸润等方面的作用。4.TPCN抗哮喘作用机制研究4.1 TPCN体外生物学效应研究将不同浓度的Cy5/TPCN与A549细胞和中性粒细胞孵育不同时间后,流式细胞术与激光共聚焦显微镜考察细胞对TPCN的摄取。通过流式细胞术与激光共聚焦显微镜考察TPCN对PMA刺激中性粒细胞产生活性氧的抗氧化作用,并进一步探究TTPCN的抗氧化能力。通过ELISA分析TPCN对PMA刺激中性粒细胞分泌TNF-α、KC和IL-1β的抗炎作用。通过Transwell实验探讨TPCN对中性粒细胞迁移的影响。4.2 TPCN对中性粒细胞哮喘肺部转录组基因的调节作用通过基因测序技术分析中性粒细胞哮喘小鼠较正常组与TPCN治疗组的转录组差异基因,并采用q RT-PCR技术验证基因测序结果,为进一步探究TPCN抗哮喘机制提供基因学相关证据。4.3 TPCN体外抑制中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的作用研究将不同浓度TPCN与中性粒细胞孵育后,加入PMA刺激中性粒细胞产生NETs。通过荧光法、ELISA和WB测定NETs主要成分（ds DNA、NE、MPO和cit H3）含量变化。进一步采用激光共聚焦显微镜观察TPCN体外抑制NETs形成的作用。4.4 TPCN体内抑制NETs形成的作用研究通过给予中性粒细胞哮喘小鼠不同剂量的TPCN治疗后,分别提取肺部灌洗液和肺组织。通过荧光法和ELISA测定肺部灌洗液中ds DNA与NE的含量,采用WB和激光共聚焦显微镜考察cit H3和NE在小鼠肺组织中的表达。4.5 TPCN调节中性粒细胞哮喘体内的免疫失衡中性粒细胞哮喘小鼠在给予生理盐水与TPCN治疗后,处死小鼠,取肺组织和脾脏。通过消化研磨肺组织和脾脏,提取得到单细胞悬液,并采用流式细胞仪检测Treg细胞和Th17细胞。4.6 TPCN通过抑制NETs形成调节Treg细胞分化的作用及机制研究将提取的na（?）ve CD4+T细胞在Treg细胞分化条件下分别与中性粒细胞和NETs共孵育并进行Treg细胞染色,通过流式细胞仪检测NETs对Treg细胞分化的影响。将TPCN与PMA刺激的中性粒细胞共孵育后,加入na（?）ve CD4+T细胞并在Treg细胞分化条件下继续培养,行Treg细胞染色并采用流式细胞仪检测。另外,将培养后的细胞固定脱水喷金后,通过扫描电子显微镜观察NETs对T细胞的包裹作用。5.TPCN与TTPCN的初步生物安全性评价将不同浓度的TPCN和TTPCN与A549细胞孵育不同时间后,CCK8检测细胞活性。Balb/c雌性小鼠连续7天分别雾化吸入50 mg/kg和100 mg/kg的TPCN后,监测体重变化并于一周后取外周血及主要脏器,检测血常规和肝肾功,脏器进行H&E染色。将肺组织研磨后,测定H2O2、MPO、TNF-α和IL-1β的含量。将TPCN分别与PMA刺激的中性粒细胞和中性粒细胞哮喘小鼠肺组织匀浆液共孵育,通过核磁共振仪和MADLI-TOF检测水解产物。结果1.通过核磁氢谱和红外光谱确证了TPCD的成功合成。由TPCD制备的TPCN呈边缘规则,大小形态均一的球形,平均粒径为80 nm,表面电位平均为-19 m V。2.通过尾静脉注射和雾化吸入后,TPCN能在中性粒细胞哮喘小鼠肺部达到有效蓄积,并被肺部中性粒细胞特异性摄取。在中性粒细胞哮喘模型中,TPCN显着降低肺泡灌洗液中ROS和MPO水平及中性粒细胞含量。同时,TPCN能够有效抑制多种炎症因子的分泌。此外,TPCN可减轻肺组织水肿、炎性细胞浸润、粘液分泌和气道阻力。3.经过线粒体靶向单元修饰后,纳米粒在中性粒细胞哮喘肺部的靶向能力得到了显着性提高。激光共聚焦显微镜观察到TTPCN与细胞线粒体的良好共定位。在中性粒细胞哮喘模型中,与TPCN相比,TTPCN能更有效降低肺泡灌洗液中ROS、KC、TNF-α、IL-1β和MPO的含量及中性粒细胞含量。H&E和PAS染色也显示TTPCN具有更好的疗效。4.在细胞水平,TPCN能够被A549细胞和中性粒细胞有效摄取,并呈现时间和浓度依赖性。TPCN能显着抑制PMA诱导的中性粒细胞内ROS生成,并降低促炎细胞因子KC、TNF-α和IL-1β的过表达。与TPCN共孵育后,中性粒细胞的迁移能力明显减弱。另外,与TPCN相比,TTPCN抑制中性粒细胞内ROS产生的能力更优。5.基因测序结果显示:与正常小鼠相比,中性粒细胞哮喘小鼠肺组织中与NETs密切相关的Elane和Mpo基因均显着上调,经TPCN干预后两者可恢复正常。并进一步通过q RT-PCR得以证实。6.在细胞水平,PMA刺激中性粒细胞后,NETs的特征成分ds DNA、NE、MPO和cit H3的含量显着升高,而TPCN干预后可显着降低这些成分的表达水平,并呈现一定的剂量依赖性。此外,激光共聚焦显微镜观察到中性粒细胞释放的胞外ds DNA和cit H3呈纤维状。相比之下,TPCN可显着降低NETosis程度和cit H3面积。7.动物实验表明,中性粒细胞哮喘小鼠肺部灌洗液中ds DNA和NE含量及肺组织中NE和cit H3水平显着高于正常小鼠。然而,经TPCN治疗后,肺泡灌洗液和肺组织中ds DNA、NE和cit H3表达明显降低。与正常小鼠相比,中性粒细胞哮喘小鼠肺和脾中Treg细胞计数明显下降,Th17细胞含量升高,Treg/Th17细胞比例显着降低。TPCN治疗后,Treg细胞升高,Th17细胞下降,有效恢复了Treg/Th17细胞的比例。8.细胞实验表明,NETs显着抑制了na（?）ve T细胞向Treg细胞的分化,而正常中性粒细胞对Treg细胞分化没有明显影响。TPCN通过减少NETs形成恢复Treg细胞分化。扫描电镜观察到na（?）ve T细胞被NETs完全覆盖,但TPCN可显着减少T细胞表明的NETs涂层。9.体外初步的安全性实验表明,即使是高剂量的TPCN和TTPCN,对A549细胞也没有明显的细胞毒性。体内实验表明,雾化吸入大剂量的TPCN后,小鼠的体重增长、脏器指数和血常规等没有明显改变,主要脏器未见明显微结构破坏或炎性细胞浸润。此外,肺组织中H2O2、MPO、TNF-α和IL-1β水平未见异常变化。TPCN在PMA诱导的中性粒细胞和中性粒细胞哮喘小鼠肺组织匀浆液中水解代谢生成了β-CD和其他水溶性分子。结论1.由β-CD、Tpl和PBAP成功构建了活性氧清除材料TPCD,并制备了活性氧清除性纳米粒TPCN。2.TPCN可特异性分布于中性粒细胞哮喘小鼠肺部中性粒细胞中。在中性粒细胞哮喘中,TPCN通过尾静脉注射和雾化吸入后均表现出良好的治疗作用:减轻氧化应激和炎症反应,抑制粘液高分泌,逆转气道重塑和改善肺功能。3.使用线粒体靶向单元进行表面修饰后,TTPCN在中性粒细胞哮喘中的肺部靶向能力和体疗效显着增强。4.通过对TPCN抗中性粒细胞哮喘作用机制的研究发现,TPCN可显着抑制中性粒细胞的氧化应激、炎症反应与细胞迁移。同时,TPCN可有效抑制NETs形成,调节Treg/Th17细胞平衡维持免疫稳态。此外,TPCN可通过减少NETs对na（?）ve T细胞的包裹和抑制NETs中DNA/蛋白质成分对T细胞的不利影响调节恢复NETs所导致的Treg细胞分化减少。5.在体内外安全性实验中,TPCN均表现出良好的生物安全性综上所述,本研究表明通过纳米疗法介导中性粒细胞氧化应激和炎症反应精确抑制NETosis和促进免疫内稳态是防治中性粒细胞哮喘的可靠策略。此外,鉴于中性粒细胞的重要病理作用,ROS-NETs-Treg/Th17通路可能成为治疗严重哮喘和其他中性粒细胞炎症相关的感染性和非感染性肺部疾病的新靶点,如成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺炎、囊性纤维和COVID-19。

黎宇盛^[3]（2021）在《阿瑞匹坦亚微乳注射液的研究》文中研究表明阿瑞匹坦属于NK-1受体拮抗剂（NK-1RA）,主要用于预防和治疗由化疗引起的急性或延迟性恶心呕吐。CINVANTI?是由美国Merck公司开发的浓度为7.2mg/m L的静脉乳剂,但该乳剂采用的是过滤除菌而非热压灭菌。由于过滤除菌技术存在一些缺陷,本文通过对原研处方和制备工艺的优化,制备出可热压灭菌的安全稳定的阿瑞匹坦亚微乳注射液。本文的主要研究内容如下:阿瑞匹坦亚微乳注射液的处方前研究。建立了阿瑞匹坦HPLC体外分析方法,并对阿瑞匹坦的溶解度、稳定性和油水分配系数进行了考察。发现阿瑞匹坦的溶解度随着p H的增大而增大,阿瑞匹坦在中性和碱性介质中较稳定,油水分配系数随着p H的增大而减小。阿瑞匹坦亚微乳注射液的处方工艺研究。通过单因素和正交实验对处方和工艺进行了考察,确定最佳处方为:油相:阿瑞匹坦0.72%、HS15 2.16%、蛋黄卵磷脂E80 2.88%、大豆油8.0%。水相:甘油2.5%、HS15 1.0%、蛋黄卵磷脂E80 2.5%、吐温80 1.0%、泊洛沙姆188 1.6%、精氨酸0.1%、油酸钠0.05%。最佳制备工艺条件:剪切温度为70℃,剪切速度为10000rpm,剪切时间为10min,均质温度为20℃,均质压力为800 bar,均质次数7次,灭菌温度121℃,灭菌时间15min。制备出的亚微乳为均匀乳状液,具有不错的稳定性。阿瑞匹坦亚微乳注射液理化性质和稳定性研究。本品的外观为均一乳白色,流动性好且无挂壁,无漂油、分层及析出等不稳定现象。其平均粒径、PDI、p H值、Zeta电位、药物含量、包封率分别为156.9nm、0.106、8.38、-34.97 m V、99.15%、97.73%。通过透射电镜观察,亚微乳大小均一,呈现较为完整均匀的球状,粒径为150nm左右。阿瑞匹坦亚微乳注射液和参比亚微乳（下简称APT亚微乳）在12h和96h的药物释放度分别为43.72±1.97%和38.05±1.43%,90.84±1.42%和88.75±1.70%,表明阿瑞匹坦的释放较慢。将本品分别放置在高温、低温、光照、冷冻条件下10天考察其稳定性,在高温及冷冻条件下亚微乳的稳定性较差,乳剂应冷藏避光保存。考察了乳剂经6±2°C和25±2°C条件下储存6个月的稳定性,各项理化性质无显着变化,均在合格范围内,结果表明乳剂稳定性良好。阿瑞匹坦亚微乳注射液的质量评价及安全性初步评价。将制剂含量、平均粒径、p H值、游离脂肪酸值、甲氧基苯胺值、过氧化值和甘油含量等作为质量评价指标。测定结果表明,阿瑞匹坦亚微乳注射液的各项指标都合格。通过溶血性试验、血管刺激性试验和大鼠舐足试验初步评价本品的安全性,表明本品不会引起溶血,同时无血管刺激性和肌肉刺激性。阿瑞匹坦亚微乳注射液实验动物体内药动学及组织分布研究。选取阿托伐他汀钙作为内标,建立了HPLC体内分析方法。以APT亚微乳作为参比,对本品在实验动物体内的药动学和组织分布情况进行了考察。药动学实验结果表明,两者具有类似的体内代谢特点,APT亚微乳和阿瑞匹坦亚微乳注射液AUC0-24h、T1/2、Cmax分别为110.54±21.89mg/L·h和104.70±11.87mg/L·h、4.51±0.48h和4.31±0.41h、37.18±1.79μg/m L和37.22±1.62μg/m L,前者以上三个参数分别是后者的1.06倍、1.05倍、0.99倍。组织分布实验结果表明,与阿瑞匹坦亚微乳注射液组相比,APT亚微乳组在各时间点下组织中药物浓度更高,各时间点组织中药物浓度排列依次为肝>脾>肾>肺>心。

张涵恕^[4]（2020）在《乙醇泡沫硬化剂及泡沫制备完成标志的发明》文中认为背景静脉畸形是一种良性疾病,好发于头颈部,是先天性静脉发育异常导致的疾病,不仅造成疼痛,影响美观,还对吞咽、呼吸等重要生理功能造成不良影响,严重的静脉畸形可因感染、压迫呼吸道等危及患者生命。它具有不断发展的特征,随着时间的推移,病变会不断变大,尤其是在青春期。在治疗巨大、复杂的静脉-畸形时,临床医师往往面临巨大的挑战,需要考虑个体情况、疾病特征等多方面因素针对性制定合适、恰当的治疗方案,故静脉畸形治疗应遵循多学科综合治疗。其治疗手段主要包括手术切除、硬化治疗、介入疗法等。其中,硬化治疗是一种治疗静脉畸形的常用方法,治疗效果良好,临床应用广泛,但具有治疗后易复发的缺点。临床常见的用于治疗静脉畸形的硬化剂包括聚多卡醇、博来霉素、十四烷基硫酸钠和无水乙醇等。其中无水乙醇复发率最低,但其并发症严重且发生率最高,临床应用难度较高。目的对无水乙醇硬化疗法进行改进,研制一种用于治疗静脉畸形的乙醇泡沫,在保证无水乙醇治疗效果的同时,显着降低严重并发症发生率。方法通过体外实验筛选合适用于硬化治疗的乙醇浓度范围。细胞实验选取了人脐静脉内皮细胞模拟静脉畸形内皮细胞,利用细胞增殖实验CCK-8确定具有硬化治疗效果的乙醇最低浓度;利用抗凝处理后的血液进行血栓凝固实验,筛选无血栓形成的乙醇最高浓度。然后,通过添加聚山梨醇酯80、蛋黄卵磷脂和透明质酸并优化其配比,制备出稳定的乙醇泡沫。最后,通过体内实验,评估乙醇泡沫硬化治疗的有效性和耐受性。使用兔耳缘静脉作为静脉畸形的动物模型,初步观察乙醇泡沫的血管闭锁效果和并发症。在动物实验安全有效的基础上进行临床试验,进一步观察治疗效果和耐受性。结果在体外实验中确定了适用于硬化治疗的乙醇浓度,为30%-60%。在该浓度范围内,使用聚山梨醇酯80、蛋黄卵磷脂和透明质酸联合制备出了稳定的乙醇泡沫,并得到了合适配比。在动物实验中,乙醇泡沫组闭塞血管作用明显,并发症较无水乙醇组轻微且发生率远低于无水乙醇组。在临床试验中,接受乙醇泡沫硬化治疗的患者均获得了满意的治疗效果,轻微肿胀是唯一观察到的的并发症。结论乙醇泡沫是一种新型泡沫硬化剂,它可以用于治疗静脉畸形。背景泡沫硬化疗法是一种治疗脉管畸形的有效方法,其利用泡沫阻塞血流,防止硬化剂被稀释的同时,增加了硬化剂与血管壁的接触面积,延长了接触时间,从而达到了更好的治疗效果。进行泡沫硬化治疗时,影响治疗效果的关键性因素是泡沫硬化剂的稳定性。泡沫的稳定性受多种因素影响,其中包括制备方法、温度、气液比等。传统的泡沫制备方法是Tessari方法,完成泡沫制备的标志是快速推注20次,但快速推注20次是否是判断泡沫制备完成的最佳标志,以及可否用于所有类型的硬化泡沫尚不清楚。在临床工作中,我们发现推注多次后,泡沫制备过程中的杂音存在消失的现象,但尚无文献报道这一现象。目的本研究旨在探索泡沫制备过程中杂音消失这一现象能否作为泡沫制备完成的标志,并探讨其与快速推注20次的适用范围。方法所有泡沫均用Tessari方法制备。分别将快速推注20次和制备过程中杂音消失作为泡沫制备完成的标志,完成对不同类型、浓度的博来霉素泡沫、聚多卡醇泡沫及十四烷基硫酸钠泡沫的制备,通过比较泡沫半衰期并在光学显微镜下观察泡沫外观评价各组间泡沫稳定性差异,探讨不同泡沫硬化剂泡沫制备完成的最佳标志及不同标志的适用范围。结果不同的标志适用于不同类型的硬化剂。1%的聚多卡醇泡沫的制备过程中杂音不能消失,快速推注20次后即可得到最稳定的泡沫,快速推注20次可作为其泡沫制备完成的标志。十四烷基硫酸钠泡沫在推注18次时杂音消失,快速推注20次及推注过程中杂音消失均可作为其判断泡沫制备完成的标志。本研究中其它类型的泡沫均在快速推注40次左右时杂音消失且得到的泡沫稳定性高于快速推注20次,推注过程中的杂音消失可作为这些硬化剂泡沫制备完成的标志。结论判断泡沫制备完成时,应根据所使用的泡沫硬化剂选择推注次数或者杂音消失作为标志。

张润军^[5]（2019）在《pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究》文中指出研究背景:心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。据估计,心血管病每年可导致1790万人死亡,约占全球死亡总数的31%。研究表明,血管炎症与多种心血管疾病的发病机制密切相关,如动脉粥样硬化、心肌梗死、再狭窄、颅内动脉瘤和主动脉瘤、卒中和外周动脉疾病。通过调节参与炎症反应的不同分子和细胞过程,已经有大量的治疗方法被研究用来预防和治疗心血管病。尽管在临床前研究方面取得了重大成果,但大多数已检测的抗炎药物的理想疗效尚未在临床实践中得到充分证明。在很大程度上,这可能与治疗分子递送到血管炎症部位的效率低下有关,这是由于它们的非特异性分布和从循环中被快速消除造成的。即使是炎症血管内局部吸收的药物,由于扩散不受控制,滞留时间也很短。近年来,基于纳米粒的靶向治疗被认为是一种很有前景的策略,可以特异性地递送不同的治疗和成像药物,用于检测或治疗血管炎症。尤其广泛的纳米粒已被设计作为靶向载体治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、缺血再灌注损伤、严重的肢体缺血、再狭窄、腹主动脉瘤和缺血性卒中。在这些例子当中,聚合脂质纳米粒、脂质体、重组高密度脂蛋白、来源于细胞的囊泡、无机纳米粒和金属纳米粒以及混合纳米粒被用于递送治疗药物,从小分子药物、多肽/蛋白质到核酸,治疗与血管炎症相关的心血管疾病。除了通过受损的内皮细胞层或EPR效应被动靶向到血管病变部位,纳米粒还可通过调节它们的物理性质（如几何结构和顺应性）,分子基团的修饰或特殊细胞膜的功能化,使血管靶向效率得到进一步提高。另一方面,可以根据血管炎症部位异常变化的生物化学信号,设计合成纳米粒的组成成份,有针对性地释放药物载荷。然而,这些血管靶向纳米治疗的转化仍然具有很大的挑战性。虽然直接调控抗原特异性亲和力可以增强纳米粒在血管的聚集,但仅用分子基团修饰后,纳米粒的靶向效率仍然非常有限。对于以细胞膜为基础的仿生策略衍生的纳米药物治疗,其相对复杂的配方流程和不明确的成分可能会妨碍其后续的大规模生产和临床研究。此外,需要进一步改进对感兴趣的血管病变部位的不可控的释放。越来越多的证据表明,双重或多重刺激响应性纳米粒能够在其作用的部位更精准地控制负载药物的释放,大大提高了药物的递送效率。在这方面,对多种生物化学信号或生物化学/物理信号敏感的纳米粒已被广泛用于肿瘤、糖尿病、炎症等多种疾病的靶向治疗。然而,基于这些响应性纳米粒治疗的临床转化并不简单,在很大程度上主要是由于更复杂的药物研发,尤其是在可重复性和质量控制方面。此外,针对目前大多数靶向血管的响应性纳米载体,体内安全性是另外一个重要的问题,尤其对于慢性疾病的治疗,因为大多数静脉注射纳米粒被单核吞噬细胞系统清除并聚集于肝脏和脾脏等器官。因此,亟待开发能够响应与血管炎症相关的生物化学信号,具有理想的靶向能力和良好的药物控释性能且更为有效和安全的纳米药物递送平台。通过对环糊精的化学功能化,最近开发了一系列在酸性和氧化应激条件下具有高度可调控水解行为的响应性材料。体外细胞培养和不同动物模型的在体实验研究结果证明,基于这些载体材料构建的纳米粒对低pH值和高ROS刺激具有较好的响应性及良好的生物安全性。鉴于血管内皮损伤后局部存在炎症微酸性环境和增高的氧化应激,通过整合优化活性氧和pH响应性的环糊精材料的比例,构建活性氧和pH双响应性纳米粒,可以作为一种新型有效和安全的纳米平台,用于血管炎症部位的药物递送。此外,结合分子靶向策略还可以进一步增强血管的靶向性和体内双响应性纳米粒治疗的有效性。本研究课题基于前期合成的pH响应性和活性氧（ROS）响应性的载体材料,以雷帕霉素为模型药物,构建了pH和ROS双响应的纳米药物递送系统,在大鼠颈动脉球囊损伤的血管炎症模型中,通过与非响应性、pH或ROS单一响应性纳米粒治疗比较,考察和评价了pH和ROS双响应性纳米粒的治疗优势以及双响应性主动靶向载药纳米粒在体防治血管再狭窄的效果。研究内容:1.基于β-CD的载体材料的合成1.1 pH响应性β-环糊精材料（ACD）的合成先将1 g β-CD 溶解在8 mL无水DMSO中,然后加入4 mL的2-甲氧基丙烯（MP）,磁力搅拌溶解并与有机试剂充分混匀,最后加入16 mg的吡啶对甲苯磺酸盐（PTS）。室温条件下反应3 h,然后加入0.3 mL三乙胺终止反应。得到的产物加超纯水沉淀,离心,洗涤3次冻干得到白色粉末。1.2 活性氧响应性β-环糊精材料（OCD）的合成将5.55 g 4-PBAP加入到36 mL无水二氯甲烷（DCM）中充分溶解,然后加入7.65 g 1,1’-羰基二咪唑（CDI）。室温条件下磁力搅拌反应0.5 h,再加入40 mL DCM,用30 mL超纯水洗涤三次。再用饱和NaCL洗涤有机相,无水Na2SO4干燥,真空浓缩得到 CDI 活化的 PBAP（CDI-PBAP）。随后,将 250 mg β-CD 和 1.52 g CDI-PBAP 加入至20 mL无水二甲基亚砜中,再加入800 mg DMAP反应过夜。最后,加入超纯水沉淀、离心收集,洗涤三次后冻干得到白色粉末。采用FT-IR和1H NMR对合成的上述两种响应性载体材料进行表征。2.不同纳米粒的制备采用纳米沉淀/自组装法制备基于不同材料的载RAP纳米粒。具体过程如下:精确称取 50 mg PLGA,ACD,OCD或ACD/OCD以不同的质量比混合（80:20、60:40、50:50、40:60、20:80）的载体材料和10 mg RAP共同溶于2 mL有机溶剂中,得到有机相。对于PLGA和ACD纳米粒,使用乙腈;OCD纳米粒,使用无水甲醇;ACD/OCD采用1:1（v/v）无水甲醇和乙腈混合溶剂制备有机相。另将0.6 mL卵磷脂无水乙醇溶液（10mg/mL）和9 mg DSPE-PEG2000溶解在10 mL的去离子水中,油浴加热至65℃ 1 h。然后,将有机相缓慢加入至上述的预热溶液中,磁力搅拌2 h。最后获得的纳米粒溶液用去离子水透析24 h,冻干后即得到不同的载RAP纳米粒（RAP/ACD NP,RAP/AOCD NP,RAP/OCD NP及RAP/PLGA NP）。空白纳米粒,Cy5或Cy7.5荧光标记的纳米粒均通过类似的方法制备获得3.不同纳米粒的表征不同NPs在水溶液中的粒径及粒径分布,Zeta电位通过马尔文粒径仪检测。取新鲜制备的纳米混悬液,滴加到载膜铜网上,室温晾干后透射电子显微镜下观察纳米粒子形态并拍照采集图像。同样将制备好的纳米粒混悬液滴加至云母片,喷金晾干后采用透射电子显微镜观察纳米粒形态并拍照采集图像。载RAP纳米粒在加入适量无水甲醇和乙腈混合溶液后离心,取上清通过高效液相色谱法（HPLC）检测RAP载药量。此外,Cy5或Cy7.5的含量通过荧光光谱仪测定。4.不同空白纳米粒体外水解实验将不同的纳米粒分别分散于pH 5、pH 6、pH 7.4以及加入1 mM H202 0.01 M的PBS缓冲液中。37℃孵育不同时间后,于设定时间点采集样品测定纳米粒溶液在500 nm波长处的透光率。最后,根据透光率计算纳米粒的水解百分比。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验将新鲜制备冻干的pH/ROS双响应性载RAP纳米粒5 mg分别分散在8 mL不同pH值（pH 5、pH 6、pH 7.4）以及加入 1 mM H2O2 0.01 M 的 PBS 缓冲液中,置于37℃孵箱内震荡混匀。在既定的不同时间点,将含有纳米粒的溶液以19118 g离心,取适量上清液并补充等量相同介质。HPLC检测RAP药物浓度,绘制纳米粒的药物累积释放曲线。单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP仍用相同的方法检测其不同时间点的累积药物释放量,绘制相应药物释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验将鼠主动脉血管平滑肌细胞株（MOVAS）以2×105个/孔的密度接种于12孔板中,孵育24小时后,去除培养基并加入相同浓度的Cy5荧光标记的不同纳米粒,在37℃条件下与平滑肌细胞孵育不同的时间。观察前,用溶酶体探针LysoTracker Green染色标记晚期核内体和溶酶体,DAPI染色细胞核。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察并采集荧光图像。同样,在平滑肌细胞孵育24小时后,加入不同浓度梯度的Cy5标记基于不同载体制备的纳米粒与细胞共同孵育6小时后,考察细胞对纳米粒的剂量依赖性吞噬。另外,通过流式细胞术定量细胞对Cy5标记的不同纳米粒的吞噬,荧光活化细胞分选（FACS）测定荧光强度。考察孵育时间及纳米粒剂量对血管平滑肌细胞吞噬行为的影响。7.不同载雷帕霉素纳米粒体外抑制rVSMCs增殖和迁移的作用研究MOVAS细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组仅加入PDGF-BB,继续培养24h后,用CCK-8法检测细胞活性。采用8 μm孔径的Transwell小室评价载不同RAP纳米粒对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs迁移的影响。将MOVAS细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中。37℃卵孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP 及 RAP/AOCD NP）与平滑肌细胞共同孵育。阳性对照组加入PDGF-BB,而正常对照组不加PDGF-BB和游离的雷帕霉素。6 h后,胰酶消化收集细胞,200μL培养基重悬,将不同治疗组的细胞分别加至Transwell上室,下室则加入600 μL含0.5%FBS和20 ng/mL PDGF-BB的培养基。孵箱内静置8 h后,用棉签轻轻擦去Transwell膜上方未迁移的细胞。4%多聚甲醛固定细胞,0.1%结晶紫染色。最后光学显微镜下观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞的数量并进行统计学分析。8.细胞周期检测MOVAS细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组加入PDGF-BB。细胞与不同载药纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化并收集细胞,70%乙醇固定,4℃孵育过夜。通过洗涤后,将不同载药纳米粒干预的细胞与RNase在37℃条件下孵育30分钟,然后用碘化丙啶在4℃避光条件下进行细胞染色30分钟。最后通过流式细胞术检测平滑肌细胞在G1、S、G2/M期的比例并进行统计分析。9.免疫印迹分析将MOVAS细胞分别与不同载RAP纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化细胞,加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,然后4℃条件下,12000 g离心30 min,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,进一步通过Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将含有50 μg蛋白的样本在10%十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭,在4℃条件下,将膜与一抗体孵育过夜:（1）Cyclin D1 抗体,稀释1:200;（2）p27kip1抗体,稀释1:250;（3）β-actin抗体,稀释1:1000。然后在37℃条件下,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育1 h,二抗稀释倍数为1:1500。洗涤三次后,通过增强型化学发光试剂盒荧光成像显示特异性条带,同时进行半定量分析。10.不同纳米粒的细胞毒性实验研究将MOVAS细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,加入不同浓度梯度的空白纳米粒（PLGA NP,ACD NP,OCD NP及AOCD NP）,共同孵育24 h后,CCK-8法检测细胞的活性。11.SD大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型的建立雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉起效后,颈部脱毛备皮,消毒,行颈前部正中切口,钝性分离皮下软组织及颈前肌肉组织,暴露颈动脉分叉,游离左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉,将2F Fogarty取栓球囊导管由颈外动脉切口插入至颈总动脉近心端,PTCA压力泵以适当压力充盈球囊,旋转并回撤球囊至颈外动脉,重复三次,完全剥脱颈总动脉血管内皮。然后,尾静脉注射伊文思蓝评价血管内皮损伤情况。12.颈动脉损伤部位酸性炎症微环境和氧化应激水平的考察与评价采用细胞内pH荧光探针BCECF-AM对颈动脉损伤部位组织的pH值变化进行定性评价。在颈动脉球囊损伤模型建立后,于不同时间点取材损伤的颈动脉组织,O.C.T.包埋后,冰冻组织切片（8 pm）。然后,用10 μM ROS荧光探针DCFDA或5μM超氧阴离子荧光探针DHE分别对组织切片进行染色,检测球囊损伤局部组织ROS及超氧阴离子水平。另外,采用相应诊断试剂盒分别对损伤局部组织过氧化氢（H202）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性进行检测。ELISA试剂盒分别检测丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。同样,典型促炎细胞因子α-肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1 β（IL-1 β）的表达水平也通过ELISA试剂盒分别检测。13.靶向Ⅳ型胶原的双响应性载RAP纳米粒的构建将靶向血管内皮下Ⅳ型胶原的多肽（KLWVLPKGGGC-Am）溶解在含有5 mmol/L EDTA的中性PBS缓冲液中,以二硫键/TCEP摩尔比1:1的比例,加入适量的TCEP断键溶液还原。然后,将多肽和DSPE-PEG-MAL以5:4的摩尔比,在4%乙醇溶液中,室温条件下磁力搅拌反应4h,合成KLWVLPKGGGC-DSPE-PEG三嵌段共聚物,未结合的游离肽通过透析去除。最后,将载体材料OCD/ACD以80:20质量比,DSPE-PEG-peptide/DSPE-PEG以1:9摩尔比混合,采用纳米沉淀自组装的方法,制备靶向IV型胶原的双响应性载RAP纳米粒。14.靶向纳米粒体外胶原结合实验的研究将Ⅳ型胶原溶解在0.25%醋酸中,配制浓度为0.5 mg/mL的胶原溶液。将100μL胶原溶液加入到96孔板中,4℃条件下孵育过夜。在胶原涂层或没有胶原涂层的孔板中先用50%血清封闭1 h后,再加入100μL用25%牛血清配制的Cy7.5荧光标记的双响应性靶向纳米粒（Cy7.5/TAOCD NP）,纳米粒浓度（0.2 mg/ml）。孵育1 h后,用包含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。最后,通过IVIS光谱系统观察并拍摄孔板荧光图像。15.纳米粒体内靶向血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉分别注射Cy7.5荧光标记的不同纳米粒（Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/ACD NP,Cy7.5/OCD NP 及 Cy7.5/AOCD NP）,在体循环8 h后,取材完整的颈动脉及主要脏器,进行小动物活体荧光成像（IVIS）观察纳米粒在血管内皮损伤部位的荧光强度及组织分布情况并进行定量分析。另外,在颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5荧光标记的双响应性纳米粒（Cy7.5/AOCD NP）,在预设不同观察时间点取材损伤的颈动脉组织,离体成像观察和定量分析荧光强度,评价纳米粒的靶向和滞留时间变化情况。16.靶向纳米颗粒与损伤颈动脉的特异性结合的评价在大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉注射Cy5荧光标记的靶向纳米粒（Cy5/TAOCD NP,25 μg/kg）。在体循环0.5 h后,给予安乐死,取材颈动脉组织,Tissue-Tek O.C.T.包埋,冰冻组织切片（5μm）,FITC标记的抗体染色血管内皮下IV型胶原,DAPI染核后,盖玻片封片,通过CLSM观察颈动脉组织荧光分布及靶向纳米粒与胶原共定位情况。17.不同载雷帕霉素纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤的疗效评价将30只雄性SD大鼠随机分为6组（n=5）,包括假手术组（正常组）、生理盐水治疗组（模型组）,以及RAP/PLGA纳米粒组、RAP/ACD纳米粒组、RAP/OCD纳米粒组及RAP/AOCD纳米粒组。除假手术组外,其余各组大鼠均按上述方法实施颈动脉球囊损伤。在颈动脉球囊血管成形术后,分别于术后即刻（0d）,4 d,8 d,12 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同载RAP纳米粒。在另一项单独设计的实验研究中,RAP/AOCD纳米粒或RAP/TAOCD纳米粒在大鼠颈动脉球囊损伤后即刻（0 d）,5 d,10 d分别以终浓度1 mg/kg的RAP经尾静脉注射给药。在血管成形术后第14 d,给予大鼠安乐死。原位灌注后取材损伤的颈动脉段及主要脏器,进行组织学和免疫组化研究,考察相关标志物表达水平。18.双响应性纳米粒的急性毒性和载雷帕霉素纳米药物治疗对SD大鼠的长期毒性评价实验12只雄性SD大鼠（180-250g）随机分为4组（n=3）。在AOCD纳米粒组,尾静脉注射不同剂量（250、500或1000 mg/kg）AOCD纳米粒。正常对照组给予尾静脉注射生理盐水。仔细观察各组动物的相关毒性症状和行为活动状况。在规定的时间点称量检测体重变化。在给药后第14 d,给予大鼠实施安乐死,即刻采集血样进行血液学和生化相关指标分析。收集主要脏器并称重,分析计算脏器指数（每只大鼠的器官重量与体重之比）,同时制作组织切片H&E染色观察其病理变化。健康雄性SD大鼠16只,体重（180-250 g）随机分为4组（n=4）。空白纳米粒组按11.5 mg/kg AOCD NP治疗（相当于RAP纳米粒的治疗剂量1 mg/kg）,另外两组分别按1 mg/kg RAP/AOCD NP或 3 mg/kg RAP/AOCD NP,尾静脉注射,每周 2 次,连续 12周。正常对照组大鼠则给予静脉注射生理盐水。治疗期间,每天动态观察各组动物死亡率、外貌、全身状况和行为异常等情况。每周记录食物和水的消耗以及体重变化情况。第12周,给予安乐死。采集血液样本,化验分析具有代表性的血液学和生化指标。取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾并称重计算脏器指数。同时制备组织学切片,H&E染色观察病理变化。另外,用抗CD3抗体和抗CD19抗体对脾脏组织切片进行免疫组化染色,评价长期载RAP纳米药物对SD鼠免疫功能的影响。19.双响应性载雷帕霉素纳米粒长期治疗后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的定量研究实验将24只雄性C57BL/6J小鼠（18-22 g）随机分为4组（n=6）。正常对照组给予生理盐水,空白纳米粒组按11.5 mg/kg（相当于载RAP纳米粒治疗剂量1 mg/kg）剂量尾静脉注射AOCD NP。另外两组小鼠分别给予RAP/AOCD NP,1 mg/kg或3 mg/kg,尾静脉注射,每周2次,连续给药12周。在治疗期间,观察小鼠的一般身体状况的任何变化,包括外貌,摄食、饮水,行为活动及死亡率等。第12周,对小鼠实施安乐死。取脾脏并将分离的脾脏组切成小块,加入无菌PBS缓冲液,对组织进行彻底研磨,然后在淋巴细胞分离培养基中离心收集细胞。将FITC标记的抗CD3抗体及PE标记的抗CD19抗体在4℃条件下,与脾脏组织提取的淋巴细胞共同避光孵育30 min后,用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞2次,PBS缓冲液重悬细胞。最后,采用流式细胞仪对脾脏组织中T细胞和B细胞的百分率进行定量分析,评价RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统的影响。研究结果:1.pH和ROS双响应性纳米粒的制备基于β-环糊精（β-CD）,通过单步缩醛化反应合成pH响应性的载体材料（ACD）,傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱检测证实ACD被成功合成。根据ACD 1H NMR谱计算,环缩醛与线性缩醛的摩尔比约为0.62,缩醛化度约为90%。此外,（OCD）通过在β-CD分子上将氧化敏感性苯硼酸酯单元4-PBAP以羰基键合的方式引入β-CD合成ROS响应性载体材料,1H NMR谱证实,每个β-CD分子大约有7个PBAP单元。采用改良的纳米沉淀/自组装法制备基于上述两种不同响应性的载体材料的双响应性纳米粒,将ACD和OCD以不同重量配比,构建了 pH/ROS双响应性纳米粒。基于ACD/OCD的不同纳米粒,在质量比为 100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80、0:100 时,分别命名为 ACD NP、AOCD8020 NP、AOCD6040 NP、AOCD5050 NP、AOCD4060 NP、AOCD2080 NP和OCD NP。透射电镜（TEM）观察,在不考虑组成分差异的情况下,所制备的纳米粒均为球形,形态规则,粒径均一。马尔文粒径电位检测显示所有制备的纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到186±4 nm。不同纳米粒的粒径分布相对较窄。提示ACD与OCD载体材料具有良好的混合相容性。2.不同双响应性纳米粒的体外水解特性基于载体材料ACD和OCD构建的pH/ROS双响应纳米粒的体外水解,在含有1mM H2O2及不同pH值的PBS缓冲液中进行。对于ACD NP,在pH 5或pH 6的微酸性条件下均表现出明显的快速水解,而H2O2的存在对其水解几乎无任何影响,具有良好的响应低pH的特性。相对于ACD NP,OCD NP的水解则与pH无关,在H202存在的条件下,OCD NP水解迅速。相比在不同的pH值,OCD NP在pH值为5、6或7.4时均表现出类似的水解特性。基于载体材料ACD和OCD构建的双响应性纳米粒,它们的水解行为依赖于pH和H202,通过在含有1 mM H2O2及不同pH条件的PBS缓冲液中,比较基于不同比例ACD和OCD载体材料制备的双响应性纳米粒水解试验的结果,提示基于ACD/OCD的纳米粒具有pH和ROS双重响应的能力。AOCD2080 NP和AOCD8020 NP在1 mM H2O2和pH 5、6或7.4环境中,表现出更为理想的双响应的特性。此外,在H202存在的情况下,AOCD2080 NP在不同pH值条件下表现出较好的水解行为,因此,AOCD2080纳米粒进一步被用于后续的课题研究。采用基于ACD和OCD的复合材料,成功地构建了 pH/ROS双响应性纳米药物递送平台。值得注意的是,通过改变ACD/OCD的质量比,可以很容易地调控制备得到的纳米载体的精确的水解敏感性。3.pH和ROS双响应性载药纳米粒的制备和表征通过不同响应性空白纳米粒制备响应的载RAP纳米粒。同时,利用PLGA制备了非响应性载药纳米粒作为对照。与相应的空白纳米粒相似,四种载药纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到179±6 nm。RAP/PLGA纳米粒、RAP/ACD纳米粒、RAP/OCD纳米粒、RAP/AOCD纳米粒的载药量分别为4.5±0.4%、9.4±0.2%、8.2±0.1%、8.7±0.4%。通过体外药物释放实验研究检测了不同纳米药物的响应性释放行为。对于RAP/AOCD NP,与中性（pH=7.4）PBS缓冲液相比,RAP的释放在微酸性（pH=5或pH=6）PBS缓冲液中明显加快。同时,无论在上述三种不同pH值的PBS缓冲液中,在1mM H2O2存在的条件下都显着增加了载药纳米粒的药物释放速度。因此,RAP/AOCD NP表现出理想的pH/ROS双响应的释药能力,这与相应的空白纳米粒AOCD2080 NP的双响应性水解特性相吻合。另外,单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP药物释放也同样符合相应纳米载体的水解性能。通过利用基于pH响应性和ROS响应性材料设计的纳米复合材料可以简单、成功地构建出pH/ROS双响应性载RAP纳米粒。4.体外rVSMCs对双响应纳米粒的摄取Cy5标记的双响应性纳米粒（Cy5/AOCD NP）与VSMCs孵育1 h后,VSMCs中的荧光信号随着Cy5/AOCD纳米粒的剂量的增加而明显增强,提示细胞对纳米粒的内吞呈现剂量依赖性的特点。与激光共聚焦显微镜观察结果一致,流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）定量进一步证实了 VSMCs对Cy5/AOCD NP的有效细胞摄取呈剂量依赖的方式。在相同剂量的Cy5/AOCD NP下,随着孵育时间的延长,Cy5荧光在VSMCs中的分布也随之增加。而且,通过溶酶体探针Lysotracker对晚期核内体和溶酶体进行染色,发现血管平滑肌中内吞Cy5/AOCD NP从核内体/溶酶体转运到细胞质中（核内体/溶酶体逃逸现象）。同样,FACS的分析表明,随着孵育时间的增加,VSMCs内吞Cy5/AOCDNP的作用增强。这些结果充分表明,大鼠VSMCs可以有效地内吞基于ACD和OCD材料构建的pH/ROS双响应性纳米粒。在酸性和氧化应激微环境的亚细胞细胞器中,与pH响应性或ROS响应性的纳米粒相比,双响应性纳米粒能够更快地释放负载的药物分子。5.双响应性载药纳米粒的体外生物学效应不同响应性纳米粒的细胞毒性均较PLGA纳米粒低。载雷帕霉素纳米粒在相对低剂量下具有较低的细胞毒性。经RAP原料药和不同的RAP纳米粒治疗24小时,可显着抑制VSMCs的迁移。值得注意的是,与游离RAP相比,所有载药纳米粒都显示出明显更强的抑制VSMCs迁移效果。此外,响应性载药纳米粒对VSMCs迁移的抑制作用比非响应性载药纳米粒（RAP/PLGA NP）更为显着。值得注意的是,双响应性纳米药物治疗（RAP/AOCD NP）的抑制血管平滑肌细胞增殖的效果最好,与单一响应性纳米粒治疗相比差异显着。而且,不同载药纳米粒治疗对细胞周期的影响的实验表明,载RAP纳米粒主要通过抑制细胞G1/S的转化从而抑制VSMCs的增殖。载RAP纳米粒使细胞周期停滞在G1期的机制研究表明,双响应性载RAP纳米粒抑制VSMCs增殖通过上调p27Kip1和下调cyclin D1表达使细胞停滞于G1期。6.双响应性载RAP纳米粒在体靶向治疗血管再狭窄以大鼠颈动脉球囊损伤为模型,建立大鼠血管炎症性疾病模型,并通过Evan’s蓝染色证实明显的内皮剥脱损伤。pH敏感性荧光探针检测颈动脉损伤局部pH值的变化显示:正常动脉显示明显的绿色荧光,而球囊损伤后第1、7、14天分离的动脉组织荧光信号明显较弱,表明损伤动脉中存在相对酸性的微环境。用DHE和DCFHDA荧光探针对大鼠颈动脉冰冻组织切片进行染色,与正常动脉相比,球囊损伤后第1天颈动脉荧光强度轻度升高。而在损伤后第7天和第14天,可以观察到明显的增强荧光。这些结果证实动脉损伤部位存在氧化应激,很大程度与炎症的进展有关。双响应性纳米粒对损伤颈动脉的靶向性研究表明,纳米粒对内皮损伤的颈动脉具有靶向性,定量分析显示,非响应性纳米粒和响应性纳米粒治疗组间差异并无统计学意义。载RAP纳米粒给血管再狭窄治疗带来不同程度的获益,颈动脉管腔面积显着增加,而内膜面积和增殖指数明显减少,中膜面积无明显变化。在各组载RAP纳米粒的治疗中,双响应性载药纳米粒疗效最佳。在不同的载RAP纳米粒治疗后,免疫组织化显示:总α-SMA阳性细胞数量明显减少。此外,所有纳米药物治疗组的PCNA均显着降低,但以RAP/AOCD NP组的效果最好。MMP-2结果与PCNA相似。而且,在给予响应性载药纳米粒治疗的大鼠动脉中的8-OHdG表达显着降低。定量分析显示,在双响应性载药纳米粒治疗后,动脉组织中典型的氧化应激相关标志物,包括H202、MDA和MPO的水平显着降低。另一方面,损伤颈动脉SOD活性明显降低,经RAP/AOCD NP治疗后,SOD活性得到有效恢复。同时,与模型组相比,组织损伤部位的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）1 β的表达水平在RAP/AOCD NP治疗后也发生了显着降低。7.pH和ROS双响应性靶向Ⅳ型胶原的载药纳米粒的制备与表征通过巯基-马来酰亚胺键合,将多肽KLWVLPKGGGC与DSPE-PEG结合。通过类似改良的纳米沉淀法/自组装法成功构建了靶向Ⅳ型胶原、p H-/RO S-双响应性纳米粒（TAOCDNP）。经TEM和SEM检测,TAOCDNP呈球形,具有较窄的粒径分布。平均流体力学直径131 nm,Zeta电位-27.2±0.3 mV。雷帕霉素可以包载到TAOCD NP中,形成一种靶向、双响应性载药纳米粒（RAP/TAOCD NP）,球形结构、粒径分布窄,能够有效负载雷帕霉素。8.TAOCD NP的体内外靶向能力评价与非靶向NPs（AOCD NP）相似。共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示VSMCs对Cy5/TAOCD NP的吞噬呈剂量依赖性和时间依赖性方式。这些结果证实了靶向肽的加入对AOCD NP的细胞摄取行为没有显着影响。Cy7.5/TAOCD NP在体外对ⅣV型胶原的粘附表明,引入到TAOCD NP上的靶向肽维持了其对ⅣV型胶原的特异性结合能力。TAOCD NP在体靶向能力表明,Cy7.5/TAOCD NP组在血管内皮损伤部位的荧光强度明显高于Cy7.5/AOCD NP组。动脉组织切片的显微镜观察也显示Cy5/TAOCD NP有相对较强的荧光。大鼠颈动脉冰冻组织切片Ⅳ型胶原抗体免疫荧光染色显示损伤动脉中Ⅳ型胶原（绿色荧光）与红色Cy5荧光共定位,而正常动脉中未见Cy5荧光。总之,这些结果证明,经靶向Ⅳ型胶原多肽修饰可显着增强pH和ROS双响应性纳米载体对损伤颈动脉的被动靶向聚集。9.双响应性载RAP靶向纳米粒靶向治疗血管再狭窄颈动脉H&E染色显示,RAP/AOCD NP或RAP/TAOCD NP治疗均能明显抑制血管新生内膜增生。与RAP/AOCD NP治疗组相比,RAP/TAOCD NP组在增加管腔面积、减少内膜面积及降低增殖指数方面均有显着差异。同样,免疫组化分析显示,与RAP/AOCD NP相比,RAP/TAOCD NP能更有效抑制VSMCs在血管内膜的增殖,显着降低了 MMP-2和8-OHdG的表达。这些结果表明,pH-/ROS-双响应性纳米药物治疗的体内防治血管再狭窄效果可以通过靶向单元修饰进一步增强。10.安全性评价将不同浓度的AOCD NP与红细胞孵育2 h,即使在浓度为2 mg/mL时,直接观察和定量分析均未见溶血。体内急性毒性试验显示,所有AOCD NP组均正常摄食和饮水,无异常行为。所有AOCD NP治疗大鼠的脏器指数（主要脏器）均与生理盐水组相当。此外,AOCD NP组血常规及肝功能,生化等相关指标与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义此外,对主要脏器的病理组织切片H&E染色表明,AOCD NP治疗的大鼠没有明显的病理改变。另外,对双重响应性载药纳米粒（RAP/AOCD NP）也进行了体内安全性研究。生理盐水组与空白纳米粒（AOCDNP）组及RAP/AOCDNP组脏器指数无显着差异。同样,经AOCD NP或RAP/AOCD NP治疗的大鼠在血常规及肝肾功能相关的生物标志物方面与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H&E染色切片显示几乎没有损伤。此外,鉴于RAP的免疫抑制活性,长期应用双响应载RAP纳米粒对大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量无明显影响。而且,对C57BL6J小鼠进行类似的纳米粒长期给药治疗后,流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量,结果显示在RAP/AOCD NP作用下,小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量并没有显着变化。这些结果提示,相对低剂量的RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统没有显着的负面影响。总体而言,AOCDNP和RAP/AOCD NP均具有出良好的生物安全性。研究结论:1.通过联合基于β环糊精合成的pH响应性和ROS响应性材料,同时设计了一种简单和有效的方法成功构建了 pH和ROS双响应的纳米载体。2.通过优化pH响应性材料（ACD）和ROS响应性材料（OCD）的投料质量比,制备了最佳的pH和ROS响应能力的纳米粒。3.双响应性纳米粒AOCD NP能够有效地负载RAP,在低pH值或ROS较高的环境下,触发RAP/AOCD NP释放负载的RAP。RAP/AOCD NP可以通过被rVSMCs有效内吞并在亚细胞细胞器的敏感释放,增强药物分子在细胞内的递送。相比于游离RAP,非响应性和单响应性载RAP纳米粒,RAP/AOCD NP显着的抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.AOCD NP能够靶向聚集在大鼠颈动脉球囊损伤的部位,通过在动脉损伤部位被动靶向和触发释放RAP,与其他载药纳米粒比较,RAP/AOCD NP在大鼠中表现出更理想的抗再狭窄作用。5.通过靶向ⅣV型胶原多肽的修饰,进一步提高了AOCD NP的靶向能力,成功制备了 pH/ROS双响应的靶向纳米递送平台TAOCD NP。负载RAP的TAOCD NP比相比RAP/AOCD NP,更有效地抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成。6.AOCD NP和RAP/AOCD NP均具有良好的生物安全性。本课题研究设计的pH/ROS双响应纳米载体和构建的纳米药物递送系统有望进一步用于治疗血管再狭窄和其他与血管炎症相关的心血管疾病。

孙爱萍^[6]（2019）在《蟾酥提取物长循环纳米脂质体系统的构建及其药物动力学研究》文中认为目的:本研究首先对蟾酥原料药物进行提取与纯化,获得其主要药效组分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基。以主要药效组分为模型药物,长循环纳米脂质体为载体,运用现代制剂技术,研制其长循环纳米脂质体;并对所制备长循环纳米脂质体的理化性质、体外释药特征及药物动力学和组织分布学进行研究,为探索药物肝靶向给药提供新思路、新方法和新技术。方法:1.本试验是在参考前期学者研究成果的基础上,采取甲醇提取法、氯仿萃取法和硅胶柱层析分离的方法纯化华蟾酥毒基和脂蟾毒配基2种有效作用成分,显着提高了药效成分的含量以增强治疗作用。2.本试验是在单因素试验的基础上,采用薄膜分散-高压匀质法制备蟾酥提取物长循环纳米脂质体,选取包封率为主要考察指标,采用星点-效应面法设计蟾酥提取物长循环纳米脂质体的最佳制备处方及工艺。3.将制备好的蟾酥提取物长循环纳米脂质体采用透射电镜、粒径分析仪、Zeta电位仪等对其外观、粒径、Zeta电位等理化性质进行考察。4.采用正向动态透析方法研究蟾酥提取物长循环纳米脂质体的体外释放特性;5.采用蟾酥提取物原料药溶液为对照组进行蟾酥提取物普通脂质体和蟾酥长循环纳米脂质体在大鼠体内的药物动力学和小鼠体内的组织分布学研究。结果:1.蟾酥提取纯化的最佳工艺:直径与柱高比值为2:14,上样量与吸附剂的比值为1:7,洗脱剂环己烷—氯仿—酮比值为4:3:3,采用该纯化工艺所得的蟾毒配基的总含量达到65.58%。2.蟾酥提取物长循环纳米脂质体的制备的最佳工艺:卵磷脂与蟾酥提取物比为7:1,卵磷脂与胆固醇比为3.5:1,超声时间为40 min,水化温度为60℃,载药介质为pH 6.8 PBS缓冲液,高压均质机压力为100MPa。3.在此工艺条件下,制备的蟾酥长循环纳米脂质体的蟾毒配基包封率为85.12%,粒径115nm,Zeta电位为-47.28mV。4.在选取pH 6.8释放介质中测得的蟾酥原料药的累积释放率在48 h时已释放完全,而蟾酥提取物普通脂质体和蟾酥提取物长循环纳米脂质体的累积释放率分别为79.63%、74.45%。5.药物代谢动力学研究表明蟾酥提取物原料药溶液组、普通脂质体组和蟾酥提取物长循环纳米脂质体组均符合二室模型,测得的普通脂质体的t1/2β为蟾酥原料药溶液对照组的3.77倍,长循环纳米脂质体的t1/2β为原料药溶液对照组的8.76倍。组织分布中普通脂质体在肝、肺脏器中分布的药物总量分别为蟾酥提取物原料药溶液对照组的1.709倍、1.764倍,长循环纳米脂质体在肝、肺脏器中分布药物总量分别是蟾酥提取物原料药溶液组的2.953倍、2.4714倍。此研究说明长循环纳米脂质体在体内循环与滞留的效果优于普通脂质体,有利于药物的富集,且靶向作用更为显着。结论:1.本研究通过单因素试验与星点-效应面法结合优选出最佳制备工艺。2.建立的高效液相色谱法测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血药浓度方法简单、合理,为蟾酥及蟾酥制剂的安全用药及研发提供了药动学理论依据与支持。3.蟾酥提取物长循环纳米脂质体可将药物有效地输送于肝、肺脏病变部位,达到缓释和靶向的治疗目的,为探索药物靶向给药及新药的研发提供新思路。

钟桂凤^[7]（2019）在《基于质量源于设计理念制备脂溶性维生素脂肪乳》文中研究表明脂溶性维生素脂肪乳,是临床上应用十分广泛的肠外营养制剂,由互不相容的两相制成的一种热力学不稳定的体系。其物理性质受到众多因素的影响,容易导致乳滴聚集,而产生严重不良反应。因此,脂溶性维生素脂肪乳被列为高风险制剂。为了降低该制剂的制备和用药风险,本文采用药品质量源于设计（Quality by design,QbD）的理念,优化并制备脂溶性维生素脂肪乳,并对其质量控制方法、稳定性和安全性进行研究。第一章脂溶性维生素脂肪乳的QbD评价随着药品质量管理研究的不断深入,QbD理念被广泛运用于药物研发、仿制药研究与申报等制药领域。本章采用了QbD这一理念,对脂溶性维生素脂肪乳进行研究,目的在于优化处方和工艺,提高药品质量,缩短研究周期并降低生产成本。首先,建立脂溶性维生素脂肪乳的质量目标;根据其自身性质和质量分析工具确定关键的质量属性（Critical quality attributes,CQAs）,主要包括:药物含量、平均粒径、多分散系数（Polydispersity index,PDI）、大于5μm的大乳粒值（The volume-weighted percentage of fat greater than 5μm,PFAT5）、流变学性质、溶血磷脂和重金属含量;采用风险评估确定影响质量的关键可变因素为:油相、乳化剂、稳定剂、高压均质和灭菌工艺;对关键因素进行实验设计,优化处方和工艺参数,开发控制策略,以提高产品质量,并对全过程进行实时监控,持续改进工艺,确保质量的稳定性。第二章中心复合设计法优化脂溶性维生素脂肪乳的制备基于上述QbD评价,采用微射流高压均质技术制备脂溶性维生素脂肪乳。对影响脂肪乳质量的处方和工艺变量进行单因素考察。处方上,选用10%（w/v）注射用大豆油和中链甘油三酯（1:1,w/w）作为油相,采用Lipoid E-80为乳化剂,加入0.03%（w/v）的油酸钠作为稳定剂。在工艺方面,采用微射流均质机Mini DeBEE制备脂肪乳,121oC高压8 min为灭菌工艺。根据单因素考察结果可知,Lipoid E-80用量、均质压力和次数是影响产品质量的关键因素,对此采用中心复合设计法（Central composite design,CCD）进行实验设计,以平均粒径、PDI和PFAT5为评价指标,确定最佳的处方工艺为:1.2%（w/v）的Lipoid E-80为乳化剂,均质压力为10,000 psi,均质次数3次。第三章脂溶性维生素脂肪乳的质量控制方法研究为保证药品质量,对脂溶性维生素脂肪乳的质量控制方法进行研究。首先,通过对高效液相和超高效液相色谱法的定量限,线性范围,检测时间和成本进行比较,建立了一种简单、高效、可同时测定脂肪乳中的四种脂溶性维生素的含量测定方法。并测定了脂肪乳的粒径、Zeta电位、大乳粒PFAT5值、溶血磷脂含量、流变学性质和重金属含量,结果表明脂溶性维生素脂肪乳的粒径约217 nm,PDI值为0.125,Zeta电位为-35 mV,PFAT5小于0.05%,溶血磷脂小于0.5 mg mL-1,粘度小于21 mPa·s,重金属小于0.1 ppm(0.1μg mL-1),显示出良好的安全性和稳定性,满足脂肪乳的质量要求。第四章脂溶性维生素脂肪乳的安全性研究在安全性研究方面,进行了体外溶血性试验,结果表明脂溶性维生素脂肪乳在3小时内不发生红细胞溶血和凝聚,制剂可供注射使用。并且,对脂溶性维生素脂肪乳的溶媒稳定性和器材相容性进行研究,首先建立了一种高灵敏的液相质谱联用法测定脂肪乳中药物的含量,并考察粒径和PFAT5值的变化,结果表明脂溶性维生素脂肪乳在溶媒和输液器中24小时内药物含量、粒径和PFAT5值均无明显变化,显示出良好的稳定性和相容性。第五章脂溶性维生素脂肪乳的稳定性研究对脂溶性维生素脂肪乳的物理稳定性进行考察,通过影响因素试验、加速试验和长期放样试验可知,在40oC、60oC高温条件下,脂溶性维生素脂肪乳的外观不变,在指标范围内,pH值降低,药物含量降低,粒径增大;在4,000 lux强光10天、25±2oC加速12个月和6±2oC长期18个月试验期间,各指标满足质量标准要求,表明脂溶性维生素脂肪乳的稳定性良好。最后,本实验考察了脂溶性维生素脂肪乳在不同生物介质中的稳定性,以粒径及PDI值为评价指标,结果表明模拟生物介质中,葡萄糖和白蛋白对粒径和PDI值无影响,盐含量和粘度的增加可使脂肪乳的粒径和PDI值增大。结论:为了降低脂溶性维生素脂肪乳的风险,本文运用QbD理念,采用微射流高压均质技术结合中心复合设计法优化和制备脂肪乳。建立了一种可同时测定四种脂溶性维生素的含量测定方法,并增加溶血磷脂、PFAT5、流变学和重金属含量项目的测定,提升脂肪乳的质量标准。此外,通过溶血性试验,溶媒稳定性试验,器材相容性试验,制剂稳定性试验和生物介质稳定性试验,进一步地提高脂溶性维生素脂肪乳的安全性和稳定性。

郑巧^[8]（2019）在《二芥酰磷脂酰胆碱的质量研究》文中提出二芥酸磷脂酰胆碱是一种人工合成磷脂,是布比卡因脂质体和丙泊酚脂质体制剂中一种重要的药用辅料,且在制剂组分中用量占比最高。合成磷脂是通过化学改性或全合成得到的磷脂,与天然磷脂相比性质更加稳定,是制备脂质体制剂的关键辅料。在胆固醇的辅助下,选择不同的合成磷脂,可以满足不同药物成分的要求,从而成功制备出脂质体。磷脂的纯度和杂质含量对脂质体制剂的稳定性以及药效、药物安全性十分重要。因此,合成磷脂的质量研究在脂质体质量及工艺评价中发挥着重要作用。然而,二芥酰磷脂酰胆碱目前未收载于任何数据库中,对其系统性的质量研究目前还处于空白状态。基于此,本研究参考同类辅料药典收录标准和各项技术指导原则,首次对自制的二芥酸磷脂酰胆碱开展了系统的质量研究,开发了二芥酸磷脂酰胆碱主要成分和杂质的分析方法,并制定了二酰磷脂酰胆碱质量标准,为二酰磷脂酰胆碱的质量控制提供了可靠依据。主要工作内容如下:首先,本文通过外观、引湿性试验、溶解度试验,考察了二芥酰磷脂酰胆碱的性状特点;并通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱、质谱多种鉴定手段进行了化学结构的确证。其次,建立了合成二芥酰磷脂酰胆碱的主要原料芥酸的气相色谱分析方法。根据二芥酰磷脂酰胆碱的结构特征与合成工艺特点,其原料芥酸中含有潜在的微量其他脂肪酸杂质（如油酸等）,此类脂肪酸也可参与甘油磷酸胆碱的工艺反应,生成对应的脂肪酸磷脂酰胆碱,作为二芥酸磷脂酰胆碱的类似物,较难在薄层色谱中加以区分。因此本研究中首次增加了对脂肪酸纯度(C22:1)的考察,采用间接检测的方法,将芥酸从产品分子中水解后酯化,经有机相萃取后,采用气相色谱直接进样检测,并进行方法学研究与验证,该检测项目的增加可应用于同类合成磷脂的质量研究中,能进一步提高对合成磷脂的质量控制。再次,建立了二芥酰磷脂酰胆碱有关物质和溶剂残留的检测方法。二芥酰磷脂酰胆碱及其主要杂质亦无紫外特征吸收,且蒸发光散射检测器的灵敏度差、线性范围窄,因此对于二芥酰磷脂酰胆碱的杂质控制难以用高效液相色谱-紫外检测器或蒸发光散射检测器进行。故采用薄层色谱法,硫酸铜磷酸溶液喷淋后加热显色,可见光检测,并对该步骤进行方法学验证,从而建立有关物质检测方法。同样参考多批次产品的检测数据和ICH Q3C指导原则所列溶剂安全限度,针对工艺中使用到的溶剂二氯甲烷、三氯甲烷和丙酮,采用气相色谱顶空进样法检测了溶剂的残留量并进行方法学验证,方法的专属性、重复性、线性和准确度均符合要求。最后,建立了二芥酰磷脂酰胆碱的高效液相色谱含量测定方法,使用的检测器为-通用型蒸发光散射检测器（ELSD）。对方法学进行了验证,包括专属性、线性、精密度等。并根据二芥酰磷脂酰胆碱作为注射剂辅料的要求,添加了致热物质检查,即建立了内毒素检查方法,且进行了系统的方法学验证,该方法可以用于企业内部快速检查内毒素。

杨金龙^[9]（2019）在《基于水淬灭荧光探针研究注射用脂肪乳体内命运》文中研究表明本课题同时使用P2探针荧光标记和HPLC药物定量的方法研究了注射用脂肪乳的体内命运。由于P2荧光探针的独特的水淬灭特性,其荧光信号就代表了完整脂肪乳纳米粒子的信号。首先,使用不同的方法制备了P2标记的营养型脂肪乳和丙泊酚脂肪乳注射液,并考察了其各自的体外稳定性,验证了荧光标记方法的可靠性。与此同时,建立了丙泊酚体内样品的HPLC分析方法,并验证了其可靠性和准确性。荧光分析结果表明所有脂肪乳制剂的纳米粒子注射后都很快从血液中清除,药动学曲线近似于“L”形。脂肪乳纳米粒子注射后主要被肝脏、脾脏、肺脏等RES器官所摄取,不同组别之间由于磷脂的差异,摄取的量有一定的差异,12 h后脂肪乳纳米粒子绝大部分都被清除出至体外。然而,通过测定血浆和脏器中的丙泊酚药物浓度,发现药物的体内行为与纳米粒子完全不一致。给药后,丙泊酚快速从脂肪乳中释放出来分布于各个脏器中,甚至能够快速突破血脑屏障和血睾屏障,在脑部和睾丸中大量聚集,1 h后体内丙泊酚药物基本被代谢完毕。脂肪乳纳米粒子和药物的所展现出的差异化体内命运为今后的脂肪乳纳米给药系统的发展提供了理论基础。

蒋苗苗^[10]（2019）在《丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的制备、表征及其药动学参数研究》文中提出奥扎格雷是一种血栓素A2（TXA2）合成酶抑制剂,可以通过抑制血小板聚集,扩张血管,有效抑制脑血栓的形成,被批准用于治疗心脑血管疾病。丹皮酚容易透过血脑屏障,可以通过抗炎和抗氧化的作用减少栓塞,从而改善血液循环。目的:为寻找更好的抗血小板聚集、治疗血栓的药物,以预防或治疗血小板聚集引起的心脑血管疾病,本课题以丹皮酚与奥扎格雷为前药设计合成丹皮酚-奥扎格雷偶联物（paeonol-ozagrel conjugate,POC）,为了延长POC在体内的作用时间,制备POC的PEG化脂质体（POC-PLs）及普通脂质体（POC-NLs）。方法:（1）本课题采用药物拼合的原理将奥扎格雷与丹皮酚以酯键的方式进行拼合,设计合成了偶联物POC。通过1H NMR、13C NMR、质谱对产物进行鉴定,确定产物的化学结构,并测定POC的熔点、吸收波长、溶解度及lgP值等基本性质。（2）采用乙醇注入法制备POC-NLs及POC-PLs,并用单因素考察结合正交设计优化该脂质体的制备处方及工艺。采用超滤离心法结合HPLC法进行测定脂质体的包封率,纳米激光粒度仪测定粒径、多分散系数及电位值,透析电镜观察脂质体形态,体外释放对药物在释放介质中的释放性能包括释放度和释放曲线进行测定,MTT法对POC原料药、POC-NLs及POC-PLs的安全性进行初步判断了解。（3）建立POC体内全血的分析方法,确立了以乙腈沉淀蛋白作为全血生物样品的前处理方法,采用LC-MS/MS法测定全血生物样品中POC含量,采用尾静脉给药的方式,对POC原料药、POC-NLs和POC-PLs在大鼠体内的药动学参数进行研究。结果:（1）通过1H NMR、13C NMR、质谱对产物进行鉴定,确证了化合物POC的结构,通过实验测定POC易溶于甲醇、乙醇,微溶于乙酸乙酯,难溶于水,熔点为74-76℃,最大吸收波长为280 nm,在饱和正辛烷-磷酸盐体系中的lgP值为2.66。（2）根据单因素及正交实验确认了POC-NLs和POC-PLs两种脂质体的处方和工艺,最优处方和工艺下POC-NLs最优POC-PLs的包封率大于95%,POC-NLs的平均粒径在100 nm左右,平均Zeta电位-15 mV左右,外观圆整;POC-PLs的包封率大于95%,平均粒径在50 nm左右,平均Zeta电位-28 mV左右,稳定性较好。POC原料药在体外3 h时累积释放率达到89.50%,POC-NLs在48 h累积释放率为84.75%,而POC-PLs在48h仅达到72.28%。细胞毒性实验表明当POC浓度小于80μg·mL-1时,POC原料药、POC-NLs及POC-PLs对PC12细胞无毒性作用,随着浓度升高,POC对PC12产生毒性作用,且POC-PLs的毒性作用高于POC-PLs与POC原料药。尾静脉给药后POC-PLs的t1∕2较POC-NLs组提高了1.99倍,较原药组提高了5.46倍。结论:综上所述,本文通过拼合原理合成了一种新的化合物POC,并通过乙醇注入法合成了POC-NLs和POC-PLs两种脂质体,对制剂的体外质量评价表明两种制剂均符合要求,体内外实验表明,POC-PLs较POC-NLs具有更加明显的缓释效果,有助于延长POC在体内的循环时间。

二、静脉用卵磷脂的制备（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、静脉用卵磷脂的制备（论文提纲范文）

（1）葛根素脂质微球注射液的制备及质量评价（论文提纲范文）

（2）活性氧清除性纳米粒治疗中性粒细胞哮喘的作用与机制研究（论文提纲范文）

（3）阿瑞匹坦亚微乳注射液的研究（论文提纲范文）

（4）乙醇泡沫硬化剂及泡沫制备完成标志的发明（论文提纲范文）

（5）pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究（论文提纲范文）

（6）蟾酥提取物长循环纳米脂质体系统的构建及其药物动力学研究（论文提纲范文）

（7）基于质量源于设计理念制备脂溶性维生素脂肪乳（论文提纲范文）

（8）二芥酰磷脂酰胆碱的质量研究（论文提纲范文）

（9）基于水淬灭荧光探针研究注射用脂肪乳体内命运（论文提纲范文）

（10）丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的制备、表征及其药动学参数研究（论文提纲范文）

四、静脉用卵磷脂的制备（论文参考文献）

• [1]葛根素脂质微球注射液的制备及质量评价[D]. 汪春燕. 江西中医药大学, 2021(01)
• [2]活性氧清除性纳米粒治疗中性粒细胞哮喘的作用与机制研究[D]. 马永昌. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
• [3]阿瑞匹坦亚微乳注射液的研究[D]. 黎宇盛. 广东药科大学, 2021(02)
• [4]乙醇泡沫硬化剂及泡沫制备完成标志的发明[D]. 张涵恕. 山东大学, 2020(09)
• [5]pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究[D]. 张润军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
• [6]蟾酥提取物长循环纳米脂质体系统的构建及其药物动力学研究[D]. 孙爱萍. 山东中医药大学, 2019(05)
• [7]基于质量源于设计理念制备脂溶性维生素脂肪乳[D]. 钟桂凤. 福建医科大学, 2019(07)
• [8]二芥酰磷脂酰胆碱的质量研究[D]. 郑巧. 东南大学, 2019(07)
• [9]基于水淬灭荧光探针研究注射用脂肪乳体内命运[D]. 杨金龙. 上海应用技术大学, 2019(02)
• [10]丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的制备、表征及其药动学参数研究[D]. 蒋苗苗. 安徽中医药大学, 2019