田大川[1]（2021）在《兖州及周边地区肉鸭常见疫病流行病学调查》文中认为随着国内需求增加,近几年肉鸭养殖规模不断扩大。兖州及周边地区是传统肉鸭养殖基地,肉鸭年出栏5000多万只。但是在肉鸭养殖规模扩大的同时,常伴随许多疫病的流行,主要包括鸭病毒性肝炎、鸭短喙与侏儒综合征、鸭坦布苏病毒病、圆环病毒病、鸭腺病毒病等病毒病,并伴有鸭疫里默氏杆菌病严重流行。上述疫病的流行给当地肉鸭养殖业带来了巨大危害,严重阻碍肉鸭养殖业的健康发展。为进一步了解兖州及周边地区肉鸭疫病的流行状况,为肉鸭疫病防控提供理论依据,特开展肉鸭常见疫病流行病学调查。本研究自2019年至2020年,从兖州及周边地区肉鸭养殖场临床病例中采集病料321份,据临床表现检测怀疑的相应疾病,采用病理剖检、病理组织学观察、PCR或RT-PCR等方法检测。鸭圆环病毒检出率为52.14%（61/117）、鸭短喙与侏儒综合征检出率为27.02%（20/74）、鸭病毒性肝炎检出率为26.87%（36/134）、鸭坦布苏病毒病检出率为18.00%（25/139）、鸭腺病毒病检出率为33.33%（15/45）、鸭疫里默氏杆菌检出率为70.83%（51/72）。检测结果显示,兖州及周边地区鸭圆环病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭短喙与侏儒综合征、鸭坦布苏病毒病、鸭腺病毒病病等病毒病广为流行,鸭传染性浆膜炎普遍发生,并存在多种病原混合感染现象,肉鸭养殖前期主要发生病毒性肝炎、鸭短喙与侏儒综合征和圆环病毒病,中期以坦布苏病毒、腺病毒感染为主,鸭传染性浆膜炎病主要发生于中后期,并存在与多种病原混合感染现象。经调查分析,上述疫病的发生主要与垂直感染、环境病原污染、生物安全不健全、饲养管理不当、免疫预防不科学、疫病防治有误有关。本研究进一步丰富了兖州及周边地区肉鸭疫病流行病学资料,为当地肉鸭疫病诊断防治提供了理论依据,有助于肉鸭养殖业的健康发展。
廖先喆[2]（2021）在《某屠宰场生猪源潜在致病菌的分离鉴定及生物学特性分析》文中认为食品安全是我国基本民生问题,动物源性食品作为食品的重要组成部分,在加工时严格检疫才能保障其质量安全,动物在屠宰过程中受到环境源性污染或胴体本身携带致病菌,不仅给食品安全带来威胁还有可能影响公共卫生。目的:为了调查新疆某生猪屠宰场大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌、波氏杆菌对屠宰猪的污染情况并分析检出致病菌对公共卫生、食品安全及畜牧业发展的潜在威胁。对屠宰场屠宰过程中存在的问题提出科学合理的建议,为动物性食品安全提供有力保障。方法:现场采集该屠宰场当日屠宰生猪鼻咽拭子180份分离巴氏杆菌和波氏杆菌,宰后猪胴体拭子180份分离大肠杆菌和沙门菌,利用选择培养基分别对大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌、波氏杆菌进行分离培养并通过形态学观察和生化试验进行初步鉴定,再利用PCR技术进一步鉴定并检测四种致病菌的耐药基因和毒力基因,结合动物致病性试验和药敏试验,分析耐药性和毒力。结果:分离出大肠杆菌22株,分离率为12.22%（22/180）;沙门菌7株,分离率为3.89%（7/180）;巴氏杆菌1株,分离率为0.56%（1/180）,波氏杆菌2株,分离率为1.11%（2/180）。大肠杆菌和波氏杆菌对抗生素存在耐药的比例较高,分别为36.67%,46.43%;沙门菌和巴氏杆菌对抗生素敏感的比例较高,分别为45.24%,36.36%。大肠杆菌检出的5个耐药基因分别为tetB、TEM、ermB、Sul2、floR,检出率为45.46%（5/11）,沙门菌检出的3个耐药基因分别为sul II、tetG、aad A1,检出率为27.27%（3/11）,巴氏杆菌检出的6个耐药基因分别为oxA-1、ermA、tetA、dfrA5、sul1、sul3,检出率为54.55%（6/11）,波氏杆菌检出的2个耐药基因分别为tetB、CTXM,检出率为50.00%（2/4）。大肠杆菌检出的2个毒力基因分别为iutA、fyuA,检出率为22.22%（2/9）;沙门菌检出的14个毒力基因分别为spvB、spiA、pagC、msgA、sipB、prgH、spaN、orgA、tolC、sitC、lpfC、sifA、sopB、pefA,检出率为93.33%（14/15）;巴氏杆菌检出的13个毒力基因分别为ptfA、pfhA、sodA、sodC、tbpA、nanB、nanH、ompA、PlpB、PmHAS、exbB、tonB、hgbA,检出率为86.67%（13/15）;波氏杆菌检出的2个毒力基因分别为DNT、flaB,检出率为66.67%（2/3）。大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌、波氏杆菌的半数致死量分别为109.33、109.27、108.68、109.03。结论:从该屠宰场生猪鼻咽拭子及宰后猪胴体拭子上检出沙门菌、巴氏杆菌和波氏杆菌说明出场猪肉存在一定食品安全隐患,屠宰加工环境有待改善。建议屠宰场严格按照我国《生猪屠宰检疫规程》对送宰生猪进行检疫。
万明[3]（2020）在《一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药基因簇解析》文中研究表明鸭疫里默氏杆菌病又叫鸭传染性浆膜炎,是由鸭疫里默氏杆菌引起的水禽的一种接触性急性败血性传染病。1～8周龄的雏鸭易感,死亡率极高,成年鸭一般不感染此病。鸭疫里默氏杆菌的传播途径较多,可以通过饮水、垫料等传播,携带病原菌的成年鸭也成为该病的重要传播者。随着养鸭业的不断发展,对鸭疫里默氏杆菌病的防治工作越来越重视,疫苗、药物都是防控本病的重要方法,但是由于鸭疫里默氏杆菌的血清型众多,且各个血清型之间没有交叉保护,疫苗防控本病具有一定的局限性,所以药物是防控本病的主要方式。但随之也带来严重的耐药问题,不仅对养鸭业产生影响,也对人类公共健康带来潜在威胁。本研究从河北省、湖北省和浙江省部分种鸭场采集300余份血液和心、肝、脑等组织样品,分离鸭疫里默氏杆菌,进行生化鉴定及PCR鉴定、耐药性检测,同时对分离到的菌株进行平板计数,设计动物试验测定半数致死量,最后根据半数致死量的菌液浓度开展动物回归试验。对试验动物的肝脏、脾脏、脑、法氏囊组织HE染色观察病理学变化并测定血清转氨酶活性;利用测序技术对获得的菌株进行基因组测序并对测序结果进行生物信息学分析,筛选耐药基因、探讨其可能的耐药机制。试验结果显示,经分离鉴定成功获得1株鸭疫里默氏杆菌,命名为RBT-1株。测定其半数致死量是9.759×1010CFU/m L;攻毒后分别于1dpi（Day Post Infection,dpi）、3dpi、5dpi、7dpi采样检测发现,感染组雏鸭的肝、脾、法氏囊和脑等组织均有不同程度的损伤,肝细胞局部坏死、少量炎性细胞浸润,脾脏出血,法氏囊腔内上皮细胞变形脱落,而对照组雏鸭无明显组织病变;且从感染组雏鸭的脑组织中分离到鸭疫里默氏杆菌。耐药性分析结果显示,鸭疫里默氏杆菌分离株RBT-1对氨苄西林、链霉素、多粘菌素B和复方新诺明耐药,对头孢哌酮、阿米卡星、新霉素、多西环素、诺氟沙星、环丙氟哌酸高度敏感。全基因组测序结果显示,RBT-1株含有ATP结合盒（ABC）抗生素外排泵、介导抗生素耐药的fus E家族、ABC-F ATP结合盒核糖体保护蛋白、耐抗生素异亮氨酸-t RNA合成酶（ile S）、Lpx基因、抗氨基水杨酸胸苷合酶、介导磺胺耐药的fol P基因、介导抗生素外排系统的MFS家族和介导喹诺酮类耐药的gyr B基因。综上所述,本研究通过分离鉴定获得一株鸭疫里默氏杆菌RBT-1,经动物回归试验证明该菌株具有致病性;耐药性和全基因组测序分析发现,其携带的抗性基因与耐药性有一定关系,但其耐药现象较严重,提示河北省、湖北省和浙江省等地区鸭场在临床用药上存在不合理用药现象。本研究结果有望为这些地区防控鸭疫里默氏杆菌病提供技术指导。
包细明[4]（2019）在《鸭主要病原菌耐药性分析及噬菌体的分离鉴定》文中研究表明鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）、大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）和沙门氏菌（Salmonella enteriditis,SE）是严重危害养鸭业发展的细菌性疾病,能导致鸭大批死亡,造成巨大经济损失。本研究针对生产上鸭常发病原菌RA、E.coli、Pm和SE进行多重PCR检测技术研究,为鸭四种病原菌的混合感染和鉴别诊断提供技术支撑。药物治疗是应对细菌性疾病的主要措施,由于抗菌药物滥用,导致细菌耐药性增加,对鸭场发病鸭进行病原菌分离鉴定,并对分离菌进行耐药表型、耐药基因检测,掌握分离菌耐药状况,为临床用药提供科学指导。食品动物无抗养殖,亟待寻找抗生素的替代品,噬菌体被广泛关注。以鸭RA、E.coli、Pm和SE为宿主菌,进行噬菌体分离鉴定及生物学特性研究,为噬菌体的研发、应用奠定基础。1.鉴别鸭源四种常见病原菌多重PCR方法的建立及应用参考GenBank中SE inv A基因序列、RA Omp A基因序列、Pm kmt1基序列和E.coli Pho A基因序列,分别设计4对特异性引物,提取四种细菌DNA,优化引物浓度与退火温度,建立了多重PCR方法,且进行了特异性、敏感性和重复性试验,并应用于临床样本检测。结果:设计的4对引物能分别扩增出与预期大小相符的目的片段;扩增SE inv A基因片段、RA Omp A基因片段、Pm kmt1基片段和E.coli Pho A基因片段大小分别为830 bp、664 bp、456 bp和261 bp,与参考基因的同源性分别为98.98%、99.68%、98.76%和98.33%;优化引物浓度为SE inv A0.25μmol/L、RA ompA 0.2μmol/L、Pm kmt1 0.15μmol/L和E.coli phoA 0.2μmol/L;退火温度为51.4℃;多重PCR方法仅能扩增出沙门氏菌、鸭疫里默式杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌的特异性条带,而对葡萄球菌、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒的核酸扩增结果均为阴性;可检测到SE 8.6 pg、RA 4.4 pg、Pm 6.0pg和E.coli 10 pg;58份临床病料核酸样本中检测出RA 12.07%（7/58）,E.coli12.07%（7/58）,SE+RA双阳性3.45%（2/58）,RA+E.coli核酸双阳性6.90%（4/58）,Pm+E.coli核酸双阳性5.18%（3/58）。表明建立的SE-RA-Pm-E.coli多重PCR方法具有特异性强,敏感性高、快速简便等特点,可应用于RA、E.coli、Pm和SE临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。2.鸭致病菌分离鉴定及耐药性分析采集临床病料进行病原菌的分离培养,经形态观察、生化鉴定、PCR检测和动物感染试验对分离菌进行鉴定;采用K-B纸片法对分离菌进行20种抗菌药物的敏感性试验,PCR方法对分离菌进行氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类以及大环内酯类抗菌药物共16种耐药基因进行检测。结果:分离出6株菌落光滑湿润、微隆起、边缘整齐、呈半透明状,染色见两端顿圆的革兰氏阴性短小杆菌;6株分离菌氧化酶和触酶试验均为阳性,且均可分解尿素,不发酵乳糖和麦芽糖,部分菌株可发酵葡萄糖（1/3）和蔗糖（1/6）,甘露醇、甲基红试验、VP试验、硫化氢产生、硝酸盐还原和枸橼酸盐试验均为阴性,不水解赖氨酸;SE-RA-Pm-E.coli多重PCR检测出RA特异性条带,PCR扩增细菌16S rRNA基因,扩增产物测序结果与NCBI上公布的鸭疫里默氏杆菌的同源性均在98%以上;分离菌株感染雏鸭致死率100%（18/18）,可确定6株分离菌均为致病性的鸭疫里默氏杆菌,命名为RA-SS1（2018）、RA-SS2（2018）、RA-SS3（2018）、RA-SS4（2018）、RA-SS5（2018）、RA-SS6（2018）;在选择的20种抗菌药物中,RA-SS1对氧氟沙星和磺胺异恶唑敏感,RA-SS2对头孢氨苄和磺胺异恶唑敏感,RA-SS3对头孢氨苄敏感,RA-SS4对青霉素、氧氟沙星、头孢他啶、头孢曲松、头孢氨苄、磺胺异恶唑和利福平敏感,RA-SS5对头孢氨苄和利福平敏感,RA-SS6对头孢他啶、头孢氨苄和利福平敏感;在选择的16种耐药基因中RA-SS1检测出aac（6’）-Ib、aph（3’）-IIa、rmt C、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS2检测出aac（6’）-Ib、aph（3’）-IIa、rmt C、qnr A、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS3检测出rmt C、β-DHA、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS4检测出aph（3’）-IIa、rmt C、β-OXA、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS5检测出aph（3’）-IIa、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因;RA-SS6检测出aac（6’）-Ib、aph（3’）-IIa、rmt C、oqx A、oqx B和erm F基因。3.鸭主要病原菌噬菌体分离鉴定及生物学特性研究分别以沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌为宿主菌,采集养殖场污水、粪便和垫料样品,采用双层琼脂平板法分离噬菌体,电镜观察噬菌体形态,并对噬菌体的宿主谱、效价、温度和pH稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线及体外抑菌效果等生物学特性进行研究。结果:在沙门氏菌为宿主菌的双层琼脂平板上可见边缘整齐、直径约为12 mm的透明噬菌斑,而以E.coli、Pm和RA为宿主菌的双层琼脂平板未见噬菌斑;电镜观察噬菌体呈蝌蚪状,头部平面呈六边形,直径约100 nm,尾部长约125 nm,直径约20 nm,分离噬菌体命名为Bp S（Bacteriophage of Salmonella enteriditis,Bp S）;测定Bp S效价为1.10×10100 pfu/mL;Bp S在温度30℃50℃能保持较高的活性,且30℃活性最高;pH在69,Bp S能保持较高活性,且pH值为7时活性最高;最佳感染复数（muhiplieity of infection,MOI）为0.01;Bp S生长潜伏期为20 min,裂解期为70 min,平均裂解量为42 pfu/cell;在3 h内Bp S对SE有较强抑菌作用。结论:本研究成功建立了快速鉴别检测SE、E.coli、Pm和RA的多重PCR方法;从病死鸭体内分离到6株鸭疫里默氏杆菌,对氧氟沙星、头孢曲松、头孢氨苄、磺胺异恶唑和利福平等抗菌药物有较高的敏感性,对阿莫西林、恩诺沙星、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、阿奇霉素、红霉素和新霉素抗菌药物具有较强的耐药性;成功分离鉴定1株沙门氏菌噬菌体,并进行了生物学特性研究。
王正中[5]（2019）在《鸭疫里默氏菌二价灭活苗的研制（血清2型和11型）》文中认为鸭疫里默氏菌病是危害养鸭业的重要传染病。该病常发于18周龄的雏鸭,感染鸭常呈现败血性症状,心脏、肝脏、气囊有纤维素性渗出物。目前已报道有21种血清型,且相互之间无交叉保护性。疫苗接种成为预防该病的重要手段。本研究首先对20132018年分离的227株鸭疫里默氏菌进行了血清型鉴定,其主要流行血清型已经变化为2型、11型。同时发现了新的血清型,该血清型目前呈小范围流行。随后,从血清2型流行地区菌株中选出23株、血清11型流行地区的菌株中选出24株进行了复壮,经细菌的分离鉴定后保存并用于后续研究。分别选择出3株强毒株对其毒力进行了评估。结果为血清2型菌株RCAD0383、RCAD0385、RCAD0570的半数致死量分别为3.34×104CFU,1.40×107CFU,1.74×106CFU;血清11型菌株RCAD0191、RCAD0306、RCAD0436的半数致死量分别为4.89×105 CFU,3.29×104 CFU,4.37×104 CFU。从而选择RCAD0383、RCAD0570、RCAD0306、RCAD0436作为后期试验的攻毒菌株,攻毒剂量均为100×LD50。选择7株血清2型和9株血清11型鸭疫里默氏菌分别制备为灭活油乳剂疫苗,将其接种于7日龄雏鸭,并于21日龄时采用攻毒菌株进行攻毒保护的测定。在7、14、21日龄称量其体重并采集分离血清,使用间接ELISA测定其抗体水平。结果表明,血清2型、11型疫苗均在免疫后产生了较高的抗体水平,且有较高的保护率。同时,注射该疫苗对鸭的正常生长无任何影响。从而筛选出保护率最高的疫苗株RCAD0570（血清2型）、RCAD0352（血清11型）。随后测定了其最佳免疫剂量,结果为血清2型RCAD0570的最佳免疫剂量为10100 CFU/0.5 mL/只,血清11型RCAD0352的最佳免疫剂量为5×109 CFU/0.5 mL。最后评估了白油佐剂、水佐剂、铝佐剂制备的灭活疫苗的免疫保护效果。结果显示,白油佐剂疫苗的抗体水平为最高,保护率为8/10、9/10。该疫苗适用于实际生产。综上,本研究发现鸭疫里默氏菌血清2型、11型成为新的流行血清型。同时,依据疫苗免疫保护效果,成功筛选出鸭疫里默氏菌血清2型、11型二价灭活疫苗的制苗用菌株RCAD0570、RCAD0352。最后,研制出鸭疫里默氏菌不同佐剂二价灭活疫苗,确定鸭疫里默氏菌二价灭活油乳剂疫苗可获得80%、90%的保护率。
姚明[6]（2019）在《鸭易感病毒检测方法的建立与应用研究》文中提出我国是养鸭大国,我国鸭的存量占世界总存量的63.76%。然而随着我国养鸭业的发展,由于饲养密度过大、缺乏有效管理,人类和动物之间的流动性增强以及环境污染等原因,近年来鸭的病毒感染情况越来越严重,对养鸭业造成了巨大经济损失。其中危害较为严重的病毒有禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、鹅细小病毒（GPV）、鸭肝炎病毒1型（DHAV-1）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、禽腺病毒4型（FAdV-4）、鸭瘟病毒（DEV）等。本研究对以上常见的病毒从病原学、流行病学、临床症状及病理变化等方面进行了介绍,并对临床上这些病毒常见的检测方法及其优缺点进行了比较;同时本研究开发了基于核酸检测技术PCR检测方法,并将该技术应用于鸭病毒的检测,对临床上鸭病的检测与防控具有重要意义。试验一、七种鸭病毒单重PCR检测方法的建立本实验针对临床上鸭易感的7种病毒病,在GenBank下载各自的毒株序列进行比对,在其保守基因的保守区设计7对特异性引物,然后对单重PCR方法进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果显示本方法特异性强,重复性好。FAdV和DHAV的检测限为 1×103copies/μL,DEV、DTMUV、NDV和GPV 的检测限为 1×102 copies/μL,AIV的检测限为1×101 copies/μL,敏感性较高。试验二、七种鸭病毒的多重PCR检测方法的建立在单重PCR的基础上,通过优化不同的引物组合及引物的浓度、退火温度、镁离子浓度、酶和dNTP浓度等条件,我们又建立了多重PCR方法同时检测这7种鸭病毒。结果显示,最优的Mg2+浓度为4 mM,最优的Taq酶浓度为0.05 U/μL,最优的dNTP浓度为0.32mM,最优的退火温度为57℃。特异性试验显示,这7对引物对其他病原无特异性扩增;多重方法的敏感性达到1×104 copies/μL,基本满足临床检测要求;本方法的重复性良好;同时建立了共感染模型,对临床样品的检出率为18%,结果与单重PCR的结果一致。试验三、三种鸭病毒的多重Real-time PCR检测方法的建立本实验在传统PCR的基础上开发了多重Real-time PCR方法同时检测3种鸭病毒。结果表明,该多重Real-time PCR方法具有高度的特异性;AIV和NDV的检测限为1×103 copies/μL,DTMUV的检测限为1×102 copies/μL;批内差的变异系数（CV）小于2%,批间差CV值小于5%,说明该方法重复性较好。
李兆华[7]（2011）在《山东省部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其与鸭圆环病毒共感染的检测》文中提出鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的接触性传染病,该病又称为新鸭病、鸭疫综合征、传染性浆膜炎和鸭疫巴氏杆菌病等。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等,发病率高,病死率也高。耐过鸭多成僵鸭,生长迟缓,造成极大的经济损失,是目前危害养鸭业的主要传染病之一。药物治疗作为最主要的防治手段,却常常因为该菌极易产生耐药性而导致治疗失败,带来不必要的经济损失,因此开展对该菌的耐药性及耐药基因方面的研究尤为重要。（一）山东省部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定对2009年6月-2010年12月自山东省潍坊、泰安、临沂、烟台、青岛、济南等地区的部分鸭场无菌采集疑似鸭疫里默氏杆菌感染病死鸭的肝脏、心脏,等病料划线接种进行细菌的分离培养,取纯化培养的典型菌落进行菌落形态观察和染色镜检,同时挑取典型菌落按Edwards PR等（Edwards,1972）的方法进行生化试验,对分离菌株加以鉴定。根据已发表序列建立了种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物对分离菌株做进一步鉴定。结果分离到19株鸭疫里默氏杆菌。通过玻片凝集试验、琼脂扩散试验对分离菌株进行了血清型鉴定,分离得到的菌株中有4株为RA1型,15株为RA2型。对分离菌株在樱桃谷雏鸭进行了动物回归试验,发病鸭主要临床症状为缩颈,嗜眠,精神不振,共济失调,采食减少,排黄绿色粪便,眼流出粘液样分泌物,48h后出现死亡,120h后全部死亡。病死鸭剖检,可见心包炎,气囊炎,肝脏肿大,肝脏表面有一层薄膜状的纤维素性渗出物,脾脏肿大,出血。肝脏、心脏病理组织学变化与与临床表现一致。（二）鸭疫里默氏杆菌山东分离株耐药性检测与分析将试验一中分离菌株按纸片扩散法进行针对丁胺卡那、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、氨苄青霉素、青霉素、链霉素等9种药敏的药敏试验,结果表明：山东各地区鸭疫里默氏杆菌耐药情况均很严重,对卡那霉素、丁胺卡那、青霉素、新霉素有很强的耐受力,对红霉素敏感度最高,其次为氨苄青霉素和四环素。所有受试菌株对红霉素最为敏感,。整个山东地区的多重耐药现象极其严重,四耐、五耐菌株所占的比例最大,占总菌株数的63.16%。没有一株细菌是单纯耐受一种抗生素的。（三）鸭疫里默氏杆菌病鸭群中鸭圆环病毒的共感染从本研究鉴定为鸭疫里默氏杆菌阳性鸭的19份样品的脾脏及法氏囊等脏器中按常规方法提取总DNA,根据文献设计合成了一对用于DuCV扩增约228bp的特异性检测引物,对上述19份DNA样品进行了PCR扩增并对扩增产物进行了克隆和测序验证,结果在19份DNA样品有8份显示DuCV为阳性。病理学分析认为,DuCV感染侵害免疫组织表现为淋巴细胞萎缩、坏死等,从而增加了其它细菌或病毒感染的可能性。本研究也从一个侧面说明了DuCV的流行传播很可能是鸭疫里默氏杆菌等细菌病高发病率和致死率的诱因之一。
程增青[8]（2011）在《鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及二价灭活疫苗的研制》文中研究说明鸭传染性浆膜炎病是由鸭疫里默氏杆菌引起的接触性传染病。该病以2-8周龄鸭最易感,呈急性或慢性败血症。患病鸭常出现眼、鼻分泌物增多、拉稀、共济失调、头颈震颤等症状。剖检以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎部分病例出现干酪性输卵管炎、结膜炎、关节炎,死亡率10%～80%,耐过鸭生长迟缓、饲料报酬显着下降。由于该病可通过污染的饲料、饮水、飞沫、尘土等经呼吸道、消化道和皮肤损伤等途径传播,在发病鸭场持续存在,难以扑灭,因此被认为是造成养鸭业经济损失最严重的疫病之一。通过2008年对山东临沂、青岛等地的疑似鸭传染性浆膜炎病死鸭进行细菌分离,共分离细菌14株,经形态特征、生化特性、培养特性、PCR鉴定和血清定型表明14株均为鸭疫里默氏杆菌,其中6株为血清1型、5株为血清2型,其余三株未定型。用分离株制备新鲜菌液,调整菌液浓度为1×109CFU/ml,对两周龄雏鸭进行回归动物试验,攻毒后10日内试验鸭全部不同程度的发病和死亡。药敏试验显示分离菌对菌必治、头孢氨苄、氟苯尼考、庆大霉素、头孢噻肟、先锋霉素VI比较敏感,而大部分菌株对泰乐菌素、氟哌酸、四环素、氧氟沙星、环丙沙星、复方新诺明存在一定程度的耐药性。选取免疫原性良好的血清1型RA-sd3菌株和血清2型RA-sd2菌株,制备鸭疫里默氏杆菌高免血清,并建立了用于检测鸭血清中鸭疫里默氏杆菌抗体的微量凝集试验（Microagglutination test, MAT）方法。在96孔V型微量反应板中,用50μL0.85%的灭菌生理盐水将50u L待检血清进行倍比稀释后,加入50μ L凝集抗原（OD600值=1.452）,放置湿盒中37℃反应4h,即可观看反应结果。制备的凝集抗原在4℃条件下可保存5个月。此方法特异、敏感、成本较低、简单易行便于推广使用。选用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型RA-sd3菌株和2型RA-sd2菌株接种胰蛋白胨大豆肉汤培养基,收获培养物,调节菌量为1.2×1010CFU/ml,用终浓度为0.3%的甲醛溶液灭活后等量混合,按照水相：油相=1：2的比例乳化制备鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗。用安全检验合格的疫苗颈部皮下免疫3-7日龄雏鸭,0.3ml/只,21天后攻毒保护率可达9/10以上,免疫保护期可维持两个月。
周祖涛[9]（2009）在《鸭疫里氏杆菌免疫诊断方法及在感染鸭肝脏差异表达基因的研究》文中提出鸭疫里氏杆菌（Riemerella anantipestifer,RA）病是由鸭疫里氏杆菌引起的雏鸭的一种急性、接触性败血性传染病,是严重危害我国养鸭业的重要传染病之一。鸭疫里氏杆菌血清型复杂,各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护,这给使用全菌灭活疫苗或弱毒疫苗进行该病的免疫防治带来了诸多困难。临床分离菌株的鉴定和血清定型及鸭群鸭疫里氏杆菌抗体的监测,对了解鸭疫里氏杆菌的流行情况和制定有效的免疫计划以及评价疫苗免疫效果具有重要意义。鸭疫里氏杆菌在入侵宿主后,迅速在感染位点定居、繁殖,经血液扩散到全身各组织器官,引起全身多发性浆膜炎并发展为败血症。而目前对鸭疫里氏杆菌如何在宿主体内生存、繁殖和逃避免疫系统监视并致病的分子机制知之甚少。本研究针对我国流行的血清1型鸭疫里氏杆菌的42kD外膜蛋白OmpA进行了克隆、表达和免疫原性研究,探索外膜蛋白OmpA的免疫保护作用及其作为包被抗原建立用于鸭疫里氏杆菌分子流行病学调查的ELISA诊断方法;在此基础上,利用选择性捕获转录序列技术对鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏基因差异表达进行了研究,为进一步开展了鸭疫里氏杆菌致病分子机理的研究,阐明雏鸭腹腔广泛性浆液渗出的分子机制奠定基础。本研究取得的结果如下:1.鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的制备和应用用本实验室鉴定、保存的血清1型鸭疫里氏杆菌云梦分离株（RA-YM）制备了RA平板染色诊断抗原,该抗原与鸭流感、鸭瘟、鸭肝炎、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的等5种病原的阳性血清无交叉反应;染色抗原平板凝集试验与琼脂免疫扩散试验（AGID）对RA疫苗免疫鸭的抗体检出率结果表明,在疫苗免疫后12天,平板凝集法即可检测到RA抗体,检出率为30%,AGID在免疫后31天才能检测到抗体,检出率为10%,而平板凝集法的检出率为80%,平板凝集法抗体检出率明显高于AGID,且染色抗原平板凝集试验比AGID的灵敏度高3个滴度;不同批次的平板染色诊断抗原检测的阳性率基本相当,在凝集程度上有较小的差异,表明不同批次平板染色诊断抗原具有良好的重复性。以RA-YM和纯化的鸭IgG为免疫原免疫鸭和兔,制备了鸭抗1型RA和兔抗鸭IgG的高免血清,平板凝集试验检测鸭抗RA-YM高免血清的效价为1:32,兔抗鸭IgG高免血清的琼扩效价为1:64。以制备的鸭抗血清1型RA血清对分离自湖北省不同地区的23株鸭疫里氏杆菌进行血清型鉴定,结果均为血清1型,表明我省目前流行的RA主要是血清1型。将制备的兔抗鸭IgG高免血清纯化后,经辣根过氧化物酶（HRP）标记,制备出特异性强、免疫学活性高的兔抗鸭IgG-HRP,工作浓度为1:4000,为下一步建立一种用于RA流行病调查的间接ELISA诊断方法奠定了基础。2.鸭疫里氏杆菌OmpA基因的克隆、表达及重组OmpA蛋白免疫保护性试验研究根据RA15型CVL110/89株OmpA基因序列（GeneBank登录号:AF104936）合成特异性引物,PCR扩增了RA-YM株OmpA基因,克隆到pMDl8-T,获得重组质粒pT-OmpA并进行了测序;将OmpA克隆到pGEX-KG,构建了重组原核表达质粒pGEX-OmpA,转化E.coli BL21后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量为68kD,表达产物主要以包涵体形式存在,Western-blot证实表达产物具有良好的生物学活性。将重组表达的OmpA蛋白以0.5mg、1.0mg、1.5mg三个免疫剂量分别与弗氏完全佐剂乳化后免疫7日龄樱桃谷肉鸭,17日龄以同样剂量加强免疫,二免后8天攻毒（3×106CFU/只）,在攻毒24h后蛋白免疫组和未免疫空白组均发病,动物试验结果表明重组表达的OmpA不能起到保护作用。3.鸭疫里氏杆菌间接OmpA-ELISA检测方法的建立及初步应用用大肠杆菌表达的重组蛋白OmpA建立了RA抗体OmpA-ELISA检测方法,方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为0.81μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:160。通过检测84份鸭疫里氏杆菌病阴性血清,确定该方法的阴阳性临界值为0.22。用该方法检测鸭流感,鸭瘟,鸭肝炎,鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌的标准阳性血清OD450值均小于临界值0.22,表明该方法与其它病原抗体无交叉反应,特异性强。重复性试验表明OmpA-ELISA检测方法的批内重复和批间重复的变异系数均小于10%。用建立的OmpA-ELISA检测方法和平板凝集分别对213份送检血清进行检测,结果表明OmpA-ELISA检测方法的敏感性为95.77%,二者的符合率为62.91%。将湖北汉川、荆州和武汉市江夏区、黄陂区等地送检的472份鸭血清采用建立的OmpA-ELISA检测方法进行检测,结果表明RA抗体阳性率为64.6%,说明建立的间接OmpA-ELISA检测方法能够很好的应用于临床RA抗体检测。4.应用选择性捕获转录序列技术（SCOTS）筛选鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏中差异表达的基因的研究根据RAD-24105株16S rRNA基因序列（GeneBank登录号:AY871819）,合成特异性引物,PCR扩增了RA-YM株16S rRNA基因,克隆到pMD18-T,获得重组质粒pT-16SrDNA并进行测序,结果表明克隆的RA-YM株16S rRNA为1479bp,其GeneBank登录号为FJ031240。比对分析Genbank中已公布的表皮葡萄球菌（GeneBank登录号:NC002737）,多杀巴氏杆菌（GeneBank登录号:NC002663）、大肠杆菌（GeneBank登录号:NC000913）和噬二氧化碳单胞菌（GeneBank登录号:AY661855）23S rRNA基因序列的保守区域,利用Primer premier 5.0设计3对引物,分3段分别扩增了23S rRNA基因,克隆到pMD18-T,获得重组质粒pT-23S2、pT-23S1和pT-23S3并进行测序,拼接结果表明克隆的RA-YM株23S rRNA为2655bp,其GeneBank登录号为FJ031241。对生物素标记的RA-YM基因组DNA和构建好的RA-YM核糖体rDNA质粒（pT-16SrDNA,pT-23S-1rDNA和pT-23S-3rDNA）超声破碎,凝胶电泳结果表明破碎产物大小为100-2000bp。以血清1型RA-YM感染9日龄樱桃谷肉鸭,提取感染鸭肝脏的总RNA和TSB培养基中生长的RA-YM的总RNA,经SuperScriptTMⅢRTase反转录,Klenow酶合成cDNA第二链后,记为体内感染cDNAs（in vivo cDNAs）和RA-YM体外培养cDNAs（in vitro cDNAs）。对in vivo cDNAs和in vitro cDNAs进行3轮SCOTS,得到均一化的RA-YM在体内感染时转录的cDNAs和在TSB培养时转录的cDNAs,通过3轮差异杂交选择性捕获RA-YM在感染鸭肝脏中差异表达的基因,将RA-YM在感染鸭肝脏中差异基因的PCR产物克隆到pMD18-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞,通过PCR和斑点杂交,从文库中筛选出187个差异克隆,经序列测定和比对分析获得了48个RA-YM在感染鸭肝脏中差异表达的基因。Real-time RT-PCR对甘氨酸裂解酶T亚基,尿黑酸1,2-加氧酶,天冬氨酸转氨酶,触酶,磷酸盐转运蛋白,二肽肽酶Ⅳ,肽酶M28,和RA46等8个基因的差异表达情况进行验证,结果表明与生长于TSB培养基RA的基因表达水平相比,这8个基因在RA感染过程中的表达水平上调1.44-4.62倍,t-检验分析表明8个基因的表达水平差异显着。根据基因功能,将48个基因分为六类:合成与代谢,适应性调节,应激,转运系统,蛋白酶和5个未知功能序列。本研究初步揭示了RA在感染鸭肝脏的基因表达情况,获得的差异表达基因对研究RA在宿主体内的存活、增殖及持续感染具有重要的作用。本研究筛选到二肽肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidaseⅣ,DPPⅣ）可能是RA重要的毒力因子。DPPⅣ是一种丝氨酸蛋白酶,能特异性水解氨基端第二位是脯氨酸的多肽。牙龈卟啉单胞菌的DPPⅣ能够降解结缔组织以及介导牙龈卟啉单胞菌与纤粘蛋白的粘附,缺失dppⅣ基因的牙龈卟啉单胞菌的毒力明显降低。格氏链球菌的DPPⅣ可以酶解P物质,协同胞外精氨酸蛋白酶酶解缓激肽,导致血管通透性的变化及感染的内皮组织平滑肌的收缩。雏鸭感染鸭疫里氏杆菌后,主要病理变化是全身各组织器官的浆膜面出现广泛性的纤维素性渗出,RA感染严重损伤了雏鸭的血管内皮系统,导致血管通透性的增高。因此,二肽肽酶Ⅳ可能是RA关键的毒力因子。下一步研究将克隆、表达和缺失RA的dppⅣ基因,以及利用酵母双杂交系统筛选和鉴定与DPPⅣ互作的宿主蛋白,为进一步研究dppⅣ对RA的毒力以及RA的致病机理奠定基础。
贾云飞[10]（2009）在《鸭疫里默氏杆菌与鸭病毒性肝炎病毒的分离鉴定与卵黄抗体的制备研究》文中进行了进一步梳理本研究以鸭疫里默氏杆菌和鸭病毒性肝炎病毒为研究对象,首先从郑州郊区某鸭场采集病鸭,分离得到鸭疫里默氏杆菌,经生化鉴定、血清型鉴定、RA的药物敏感性试验与病原性试验,证明分离得到的为Ⅰ型RA菌株。将此分离株分别在血清肉汤与鸭胚上进行增菌培养,结果表明其在鸭胚上的增菌培养效果明显优于血清肉汤。将所得菌液经0.5 %福尔马林灭活后,加入氢氧化铝胶作为佐剂,安检合格后保存。又从郑州郊区某鸭场采集病鸭,分离得到鸭病毒性肝炎病毒。并通过血清中和试验、病毒的血凝性测定、动物回归试验等证明分离到的确实为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒,其EID50为10-4.81。将鸭疫里默氏杆菌和鸭病毒性肝炎病毒分别灭活后混合制成油乳佐剂,经过无菌检验、安全检验后对50只健康高产蛋鸡进行免疫,经鸡胸和腿部皮下及肌肉多位点注射,于第10 d和20 d分别接种2 ml和4 ml。免疫后每日收集鸡蛋,编号后于4℃保存。采用双向免疫扩散和免疫电泳测定免疫后鸡卵黄中鸭疫里默氏杆菌和鸭病毒性肝炎病毒抗体含量及其效价的变化,结果表明,母鸡初次免疫后第10天卵黄中即可测出相应抗体,第20天（第二次免疫）后抗体效价明显提高。取第二次免疫后第10天到第40天的卵黄,进行IgY的提取。取卵黄粗提物行免疫电泳/扩散进行抗体鉴定,其可与制备的DHV、RA抗原出现明显的沉淀反应。并对提取得到的IgY进行蛋白含量测定,其最终浓度为2.258 mg/mL。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭圆环病毒病 |
| 1.1.1 病原学及致病机制 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 病理变化 |
| 1.1.4 免疫防控 |
| 1.2 鸭病毒性肝炎 |
| 1.2.1 病原学及致病机制 |
| 1.2.2 临床症状 |
| 1.2.3 病理变化 |
| 1.2.4 免疫防控 |
| 1.3 鸭短喙与侏儒综合征(新型鸭细小病毒病) |
| 1.3.1 病原学及发病机理 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 病理变化 |
| 1.3.4 免疫防控 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒病 |
| 1.4.1 病原学及发病机制 |
| 1.4.2 临床症状 |
| 1.4.3 病理变化 |
| 1.4.4 免疫防控 |
| 1.5 鸭腺病毒病 |
| 1.5.1 病原学及发病机理 |
| 1.5.2 临床症状 |
| 1.5.3 病理变化 |
| 1.5.4 免疫防控 |
| 1.6 鸭疫里默氏杆菌病 |
| 1.6.1 病原学及发病机理 |
| 1.6.2 临床症状 |
| 1.6.3 病理变化 |
| 1.6.4 免疫防控 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂及配制 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鸭病料取样 |
| 2.2.2 鸭疫里默氏杆菌分离 |
| 2.2.3 病原检测 |
| 2.2.4 HE切片制作 |
| 2.2.5 胶回收连接转化 |
| 2.2.6 提取质粒 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 剖检及病理组织学观察 |
| 3.1.1 鸭圆环病毒病 |
| 3.1.2 鸭病毒性肝炎 |
| 3.1.3 鸭短喙与侏儒综合征 |
| 3.1.4 鸭坦布苏病毒病 |
| 3.1.5 鸭腺病毒病 |
| 3.1.6 鸭疫里默氏杆菌病 |
| 3.2 RT-PCR 检测结果 |
| 3.3 临床发病情况统计 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 动物性食品安全 |
| 1.1 我国动物性食品安全的现状与问题 |
| 1.1.1 人畜共患病 |
| 1.1.2 兽药残留 |
| 1.2 动物源性食品安全的影响 |
| 1.2.1 对人体健康的影响 |
| 1.2.2 对畜牧业发展的影响 |
| 2 动物屠宰 |
| 2.1 屠宰检疫 |
| 2.2 我国生猪屠宰检疫规程 |
| 2.2.1 监督查验 |
| 2.2.2 检疫申报 |
| 2.2.3 宰前检查 |
| 2.2.4 同步检疫 |
| 2.2.5 检疫记录 |
| 3 大肠杆菌 |
| 3.1 病原学特点 |
| 3.2 流行病学特点 |
| 3.3 致病性 |
| 3.4 毒力因子 |
| 3.4.1 菌毛 |
| 3.4.2 内毒素 |
| 3.4.3 肠毒素 |
| 3.4.4 类志贺毒素 |
| 3.5 耐药性 |
| 4 沙门菌 |
| 4.1 病原学特点 |
| 4.2 流行病学特点 |
| 4.3 致病性 |
| 4.4 毒力因子 |
| 4.4.1 毒素 |
| 4.4.2 鞭毛 |
| 4.4.3 菌毛 |
| 4.4.4 毒力岛 |
| 4.5 耐药性 |
| 5 巴氏杆菌 |
| 5.1 病原学特点 |
| 5.2 流行病学特点 |
| 5.3 致病性 |
| 5.4 诊断及防控 |
| 5.4.1 猪巴氏杆菌病的诊断 |
| 5.4.2 猪巴氏杆菌病的防控 |
| 6 波氏杆菌 |
| 6.1 病原学特点 |
| 6.2 流行病学特点 |
| 6.3 致病性 |
| 6.4 诊断及防控 |
| 6.4.1 猪波氏杆菌病的诊断 |
| 6.4.2 猪波氏杆菌病的防控 |
| 7 小结 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 新疆某屠宰场大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌及波氏杆菌的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验样品 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 分离纯化 |
| 2.2.1 大肠杆菌的分离纯化 |
| 2.2.2 沙门菌的分离纯化 |
| 2.2.3 巴氏杆菌与波氏杆菌的分离纯化 |
| 2.3 分离菌形态学观察 |
| 2.4 分离菌生理生化特性鉴定 |
| 2.5 PCR鉴定及序列测定 |
| 2.5.1 PCR鉴定 |
| 2.5.2 样品连接 |
| 2.5.3 转化 |
| 2.5.4 制作进化树 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 培养基培养结果 |
| 3.2 分离菌形态学观察结果 |
| 3.3 分离菌生理生化特性鉴定结果 |
| 3.4 PCR鉴定结果 |
| 3.5 序列测定及同源性比对 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌 |
| 4.2 沙门菌 |
| 4.3 巴氏杆菌 |
| 4.4 波氏杆菌 |
| 5 小结 |
| 试验二 新疆某屠宰场大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌及波氏杆菌的耐药性分析 |
| 1 材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 药敏试验 |
| 2.2 耐药基因鉴定 |
| 2.2.1 大肠杆菌耐药基因鉴定 |
| 2.2.2 沙门菌耐药基因鉴定 |
| 2.2.3 巴氏杆菌耐药基因鉴定 |
| 2.2.4 波氏杆菌耐药基因鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 药敏试验结果 |
| 3.1.1 大肠杆菌药敏试验结果 |
| 3.1.2 沙门菌药敏试验结果 |
| 3.1.3 巴氏杆菌药敏试验结果 |
| 3.1.4 波氏杆菌药敏试验结果 |
| 3.2 耐药基因鉴定结果 |
| 3.2.1 大肠杆菌耐药基因鉴定结果 |
| 3.2.2 沙门菌耐药基因鉴定结果 |
| 3.2.3 巴氏杆菌耐药基因鉴定结果 |
| 3.2.4 波氏杆菌耐药基因鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌 |
| 4.2 沙门菌 |
| 4.3 巴氏杆菌 |
| 4.4 波氏杆菌 |
| 5 小结 |
| 试验三 新疆某屠宰场大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌及波氏杆菌的致病力分析 |
| 1 材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 毒力基因鉴定 |
| 2.1.1 大肠杆菌毒力基因鉴定 |
| 2.1.2 沙门菌毒力基因鉴定 |
| 2.1.3 巴氏杆菌毒力基因鉴定 |
| 2.1.4 波氏杆菌毒力基因鉴定 |
| 2.2 动物致病性试验 |
| 2.2.1 菌落计数 |
| 2.2.2 计算半数致死量 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 毒力基因鉴定结果 |
| 3.1.1 大肠杆菌毒力基因鉴定结果 |
| 3.1.2 沙门菌毒力基因鉴定结果 |
| 3.1.3 巴氏杆菌毒力基因鉴定结果 |
| 3.1.4 波氏杆菌毒力基因鉴定结果 |
| 3.2 动物致病性试验结果 |
| 3.2.1 菌落计数结果 |
| 3.2.2 半数致死量计算结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大肠杆菌 |
| 4.2 沙门菌 |
| 4.3 巴氏杆菌 |
| 4.4 波氏杆菌 |
| 5 小结 |
| 第三章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌病发现历史 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 鸭疫里默氏杆菌分子生物学 |
| 1.4 鸭疫里默氏杆菌诊断方法 |
| 1.5 鸭疫里默氏杆菌流行病学特性 |
| 1.6 鸭疫里默氏杆菌病主要症状和病变 |
| 1.7 鸭疫里默氏杆菌的耐药检测 |
| 1.8 鸭疫里默氏杆菌病的防治 |
| 1.9 本试验研究的目的和意义 |
| 2 试验一 鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 试验二 鸭疫里默氏杆菌分离株RBT-1的耐药性试验 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 试验三 鸭疫里默氏杆菌分离株RBT-1的全基因组测序及分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表文章 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 新型抗菌剂研究进展 |
| 前言 |
| 试验研究 |
| 第一章 鉴别鸭源四种常见病原菌多重PCR方法的建立及应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 细菌核酸提取 |
| 2.3 单一PCR扩增及产物鉴定 |
| 2.4 多重PCR方法条件优化 |
| 2.5 多重PCR特异性试验 |
| 2.6 多重PCR敏感性试验 |
| 2.7 多重PCR方法重复性试验 |
| 2.8 多重PCR方法应用于临床样本 |
| 3 结果 |
| 3.1 单一PCR扩增及产物鉴定结果 |
| 3.2 多重PCR方法条件优化结果 |
| 3.3 多重PCR特异性试验结果 |
| 3.4 多重PCR敏感性试验结果 |
| 3.5 多重PCR方法重复性试验结果 |
| 3.6 多重PCR方法临床应用结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸭致病菌分离鉴定及耐药性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌分离培养 |
| 2.2 分离菌革兰氏染色镜检 |
| 2.3 分离菌的生化鉴定 |
| 2.4 分离菌的PCR鉴定 |
| 2.5 分离菌动物感染试验 |
| 2.6 分离菌药敏试验 |
| 2.7 分离菌耐药基因检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 细菌分离培养结果 |
| 3.2 分离菌革兰氏染色镜检结果 |
| 3.3 分离菌生化鉴定结果 |
| 3.4 分离菌PCR鉴定结果 |
| 3.5 分离菌动物感染试验结果 |
| 3.6 分离菌药敏试验结果 |
| 3.7 分离菌耐药基因检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 鸭常见病原菌噬菌体分离鉴定及生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 宿主菌的培养 |
| 2.2 噬菌体分离 |
| 2.3 噬菌体纯化 |
| 2.4 噬菌体形态学观察 |
| 2.5 噬菌体效价测定 |
| 2.6 噬菌体pH稳定性测定 |
| 2.7 噬菌体温度稳定性测定 |
| 2.8 噬菌体最佳感染复数测定 |
| 2.9 噬菌体一步生长曲线测定 |
| 2.10 噬菌体体外抑菌试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 噬菌体验证结果 |
| 3.2 噬菌体分离纯化结果 |
| 3.3 噬菌体电镜形态观察结果 |
| 3.4 噬菌体效价测定结果 |
| 3.5 噬菌体pH稳定性测定结果 |
| 3.6 噬菌体温度稳定性测定结果 |
| 3.7 噬菌体最佳感染复数测定结果 |
| 3.8 噬菌体一步生长曲线测定结果 |
| 3.9 噬菌体体外抑菌试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读硕士期间发表论文情况 |
| 附录二 主要培养基、溶液及试剂配制 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 鸭疫里默氏菌的研究概况 |
| 1.1.1 鸭疫里默氏菌的病原学 |
| 1.1.2 鸭疫里默氏菌的血清型 |
| 1.2 鸭疫里默氏菌疫苗的研究概况 |
| 1.2.1 鸭疫里默氏菌灭活疫苗 |
| 1.2.2 鸭疫里默氏菌弱毒疫苗 |
| 1.2.3 鸭疫里默氏菌亚单位疫苗 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第2章 2013~2018 年鸭疫里默氏菌临床分离株血清型调查 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株和血清 |
| 2.1.2 试验试剂及配制 |
| 2.1.3 试验仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病原的分离 |
| 2.2.2 PCR鉴定 |
| 2.2.3 血清型鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 病原的分离鉴定 |
| 2.3.2 血清型鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 鸭疫里默氏菌血清2 型、11 型灭活油乳剂疫苗的研制 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株和试验动物 |
| 3.1.2 试验试剂及配制 |
| 3.1.3 试验仪器设备 |
| 3.1.4 软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 鸭疫里默氏菌血清2 型、11 型菌株复壮 |
| 3.2.2 攻毒菌株的筛选及其半数致死量的测定 |
| 3.2.3 灭活油乳剂疫苗的制备与检验 |
| 3.2.4 免疫保护试验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 鸭疫里默氏菌血清2 型、11 型菌株复壮 |
| 3.3.2 攻毒菌株的筛选及其半数致死量的测定 |
| 3.3.3 灭活油乳剂疫苗的检验 |
| 3.3.4 免疫保护试验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 鸭疫里默氏菌血清2 型、11 型二价灭活疫苗的研制 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株和试验动物 |
| 4.1.2 试验试剂及配制 |
| 4.1.3 试验仪器设备 |
| 4.1.4 软件 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 灭活疫苗制备与检验 |
| 4.2.2 最佳免疫剂量的测定 |
| 4.2.3 不同佐剂RA二价灭活疫苗的比较 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 灭活疫苗的检验 |
| 4.3.2 最佳免疫剂量的测定 |
| 4.3.3 不同佐剂RA二价灭活疫苗的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸭病毒病的研究进展 |
| 1 常见鸭病毒病的概述 |
| 1.1 禽流感病毒的研究进展 |
| 1.2 新城疫病毒的研究进展 |
| 1.3 鸭肝炎病毒的研究进展 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒的研究进展 |
| 1.5 鹅细小病毒的研究进展 |
| 1.6 禽腺病毒的研究进展 |
| 1.7 鸭瘟病毒的研究进展 |
| 2 鸭病毒病的检测方法 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 血清学技术检测 |
| 2.3 分子生物学检测 |
| 3 本课题研究目的及意义、主要内容 |
| 3.1 研究的目的及意义 |
| 3.2 研究的主要内容 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 七种鸭病毒单重PCR检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒核酸提取 |
| 2.2 引物设计合成 |
| 2.3 标准质粒的构建 |
| 2.4 单重PCR方法的建立 |
| 2.5 单重PCR方法的特异性 |
| 2.6 单重PCR方法的敏感性 |
| 2.7 单重PCR方法的重复性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 七种病毒的重组质粒 |
| 3.2 单重PCR的建立 |
| 3.3 单重PCR的特异性 |
| 3.4 单重PCR的敏感性 |
| 3.5 单重PCR的重复性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 七种鸭病毒的多重PCR检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 样品的采集 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒核酸提取 |
| 2.2 引物设计合成 |
| 2.3 标准质粒的构建 |
| 2.4 多重PCR方法的优化与建立 |
| 2.5 多重PCR方法的特异性 |
| 2.6 多重PCR方法的敏感性 |
| 2.7 多重PCR方法的重复性 |
| 2.8 多重PCR方法的应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 七种病毒的重组质粒 |
| 3.2 多重PCR反应体系的优化 |
| 3.3 多重PCR方法的特异性 |
| 3.4 多重PCR方法的敏感性 |
| 3.5 多重PCR方法的重复性 |
| 3.6 多重PCR方法共感染模型的建立 |
| 3.7 多重PCR方法检测临床样品 |
| 4 讨论 |
| 第四章 三种鸭病毒的多重Real-time PCR检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒RNA提取及反转录 |
| 2.2 引物、探针的设计合成 |
| 2.3 标准质粒的构建 |
| 2.4 三重Real-time PCR方法的优化与建立 |
| 2.5 三重Real-time PCR方法的特异性 |
| 2.6 三重Real-time PCR方法的敏感性 |
| 2.7 三重Real-time PCR方法的重复性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 三重Real-time PCR方法的优化与建立 |
| 3.2 三重Real-time PCR方法的特异性 |
| 3.3 三重Real-time PCR方法的敏感性 |
| 3.4 三重Real-time PCR方法的重复性 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 硕士期间研究成果 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌研究进展 |
| 1.1.1 鸭疫里默氏杆菌病流行历史 |
| 1.1.2 病原 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 临床症状 |
| 1.1.5 病理变化 |
| 1.1.6 免疫原性 |
| 1.1.7 诊断 |
| 1.1.8 防治 |
| 1.1.9 细菌耐药性 |
| 1.2 鸭圆环病毒研究进展 |
| 1.2.1 鸭圆环病毒的发现 |
| 1.2.2 鸭圆环病毒的危害 |
| 1.2.3 鸭圆环病毒的基因组 |
| 1.2.4 鸭圆环病毒的诊断 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料采集 |
| 2.1.2 主要试剂、培养基及仪器 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌的分离培养 |
| 2.2.2 细菌的鉴定 |
| 2.2.3 血清型的鉴定 |
| 2.2.4 分子生物学鉴定 |
| 2.2.5 动物回归试验 |
| 2.2.6 细菌的培养、计数 |
| 2.2.7 药敏试验 |
| 2.2.8 组织DNA的提取 |
| 2.2.9 DuCV引物的涉及与合成 |
| 2.2.10 PCR反应条件 |
| 2.2.11 电泳检测 |
| 2.2.12 PCR产物的回收与定量 |
| 2.2.13 DNA的连接反应 |
| 2.2.14 TG1大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.15 连接产物的转化 |
| 2.2.16 质粒DNA的提取 |
| 2.2.17 重组质粒DNA的酶切鉴定 |
| 2.2.18 阳性克隆序列测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细菌的培养特性 |
| 3.2 细菌的鉴定 |
| 3.2.1 染色镜检 |
| 3.2.2 生化试验 |
| 3.3 血清学鉴定 |
| 3.4 分子生物学鉴定 |
| 3.5 动物回归试验 |
| 3.6 细菌的培养与计数 |
| 3.7 药敏试验结果 |
| 3.8 DuCV检测结果 |
| 3.9 DuCV的序列分析 |
| 3.10 DuCV的阳性率及分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 鸭疫里默氏杆菌的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病原的命名与分类地位 |
| 1.2 形态及染色特征 |
| 1.3 培养特性 |
| 1.4 理化特征 |
| 1.5 血清学特征 |
| 1.6 致病性 |
| 2 鸭传染性浆膜炎病的研究进展 |
| 2.1 流行特点 |
| 2.2 临床症状 |
| 2.3 病理变化 |
| 2.4 诊断方法 |
| 2.5 防治措施 |
| 第二章 鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 鸭疫里默氏杆菌检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病原学研究进展 |
| 1.1 分类地位 |
| 1.2 生物学特性 |
| 1.3 血清型 |
| 1.4 病原分子生物学 |
| 2 临床学研究进展 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 临床症状及病理学研究 |
| 2.2.1 临床剖检症状 |
| 2.2.2 组织病理学研究 |
| 2.2.3 血清生化指标变化 |
| 2.3 诊断方法 |
| 2.3.1 细菌分离鉴定 |
| 2.3.2 琼脂凝胶免疫扩散试验 |
| 2.3.3 凝集试验 |
| 2.3.4 荧光抗体法 |
| 2.3.5 间接ELISA检测 |
| 2.3.6 PCR检测 |
| 2.3.7 间接血凝试验 |
| 2.3.8 间接免疫组织化学法 |
| 3 防治 |
| 3.1 药物防治 |
| 3.2 疫苗防治 |
| 3.2.1 鸭疫里氏杆菌灭活菌苗的研究 |
| 3.2.2 鸭疫里氏杆菌弱毒活菌苗的研究 |
| 3.2.3 鸭疫里氏杆菌亚单位疫苗 |
| 3.2.4 鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌二联苗的研究 |
| 4 细菌基因差异表达研究技术进展 |
| 4.1 体内表达技术 |
| 4.2 代表性差别分析技术 |
| 4.3 信号标签诱变技术 |
| 4.4 差异荧光诱导技术 |
| 4.5 体内诱导抗原技术 |
| 4.6 DNA微阵列技术 |
| 4.7 选择性捕获转录序列 |
| 4.7.1 SCOTS技术的原理 |
| 4.7.1.1 细菌基因组的提取及核糖体rDNA的克隆 |
| 4.7.1.2 细菌的体外培养及体内感染 |
| 4.7.1.3 RNA的提取及cDNA合成 |
| 4.7.1.4 选择性捕获转录序列 |
| 4.7.2 SCOTS技术的优缺点 |
| 4.7.2.1 SCOTS技术的优点 |
| 4.7.2.2 SCOTS技术的缺点 |
| 第二章 鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的制备和应用 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 血清 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的制备 |
| 2.2.2 鸭疫里氏杆菌阳性血清的制备 |
| 2.2.2.1 鸭疫里氏杆菌免疫原的制备 |
| 2.2.2.2 鸭疫里氏杆菌免疫原的乳化 |
| 2.2.2.3 动物免疫 |
| 2.2.3 鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的特异性试验 |
| 2.2.4 鸭疫里氏杆菌平板染色抗原的敏感性试验 |
| 2.2.4.1 抗体检出率试验 |
| 2.2.4.2 染色抗原平板凝集试验与琼脂免疫扩散试验的对比 |
| 2.2.5 鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的使用方法及结果判断 |
| 2.2.6 鸭疫里氏杆菌临床分离菌株血清型鉴定 |
| 2.2.6.1 待检菌株抗原的制备 |
| 2.2.6.2 血清学鉴定 |
| 2.2.7 兔抗鸭IgG抗体的制备 |
| 2.2.7.1 鸭血清IgG的粗提 |
| 2.2.7.2 粗提鸭血清IgG的纯化 |
| 2.2.7.3 鸭IgG的乳化 |
| 2.2.7.4 家兔的免疫 |
| 2.2.7.5 兔抗鸭IgG的粗提与纯化 |
| 2.2.8 辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸭IgG的制备 |
| 2.2.8.1 兔抗鸭IgG HRP的标记 |
| 2.2.8.2 兔抗鸭IgG-HRP效价的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的特异性 |
| 3.2 鸭疫里氏杆菌平板染色诊断抗原的敏感性 |
| 3.3 平板凝集染色诊断抗原的重复性 |
| 3.4 鸭疫里氏杆菌临床分离菌株血清型鉴定结果 |
| 3.6 兔抗鸭IgG血清抗体水平及纯化后的浓度 |
| 3.7 兔抗鸭IgG-HRP工作浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭疫里氏杆菌抗体检测 |
| 4.2 鸭疫里氏杆菌血清分型 |
| 4.3 关于免疫程序 |
| 5 结论 |
| 第三章 鸭疫里氏杆菌OmpA基因的克隆、表达及重组OmpA蛋白免疫保护性试验研究 |
| 1 目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 工具酶及主要试剂 |
| 2.2 主要溶液的配制 |
| 2.2.1 抗生素类 |
| 2.2.2 细菌培养基 |
| 2.2.3 质粒抽提相关溶液 |
| 2.2.4 SDS-PAGE相关溶液 |
| 2.2.5 Western blot相关溶液 |
| 2.2.6 其它试剂的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 鸭疫里氏杆菌复苏及基因组提取 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 鸭疫里氏杆菌OmpA基因的扩增 |
| 2.3.4 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.3.5 PCR产物的克隆 |
| 2.3.6 感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 2.3.7 连接产物的转化 |
| 2.3.8 质粒的小量制备 |
| 2.3.9 阳性克隆鉴定 |
| 2.3.10 鸭疫里氏杆菌OmpA序列测定和分析 |
| 2.3.11 重组表达质粒pGEX-OmpA的构建 |
| 2.3.12 诱导表达 |
| 2.3.13 SDS-PAGE检测和Western-blot分析 |
| 2.3.14 重组GST-OmpA蛋白的纯化 |
| 2.3.14.1 鉴定蛋白表达的形式(可溶性表达或形成包涵体) |
| 2.3.14.2 包涵体的溶解和复性 |
| 2.3.15 重组表达GST-OmpA蛋白的免疫保护性试验 |
| 2.3.15.1 动物免疫 |
| 2.3.15.2 攻毒剂量的确定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭疫里氏杆菌OmpA基因的克隆与测序 |
| 3.1.1 鸭疫里氏杆菌OmpA基因PCR扩增结果 |
| 3.1.2 目的片段的克隆及鉴定 |
| 3.1.3 鸭疫里氏杆菌OmpA基因序列测定与分析 |
| 3.2 表达载体pGEX-OmpA构建与鉴定 |
| 3.3 表达产物的SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定 |
| 3.4 重组OmpA蛋白的免疫保护性试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 鸭疫里氏杆菌间接OmpA-ELISA检测方法的建立和初步应用 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 表达菌株和质粒 |
| 2.1.2 血清 |
| 2.1.3 包涵体提取用缓冲液的配制 |
| 2.1.3 ELISA相关溶液的配制 |
| 2.1.4 主要实验器材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 包涵体提取 |
| 2.2.2 包涵体的溶解和复性 |
| 2.2.3 间接OmpA-ELISA操作步骤 |
| 2.2.4 间接OmpA-ELISA最佳抗原包被量和血清稀释度的选择 |
| 2.2.5 间接OmpA-ELISA判断标准的确定 |
| 2.2.6 间接OmpA-ELISA特异性试验 |
| 2.2.6.1 交叉性试验 |
| 2.2.6.2 阻断试验 |
| 2.2.6.3 细菌裂解液的处理 |
| 2.2.7 间接OmpA-ELISA重复性试验 |
| 2.2.8 间接OmpA-ELISA方法与平板凝集方法的对比试验 |
| 2.2.9 包被抗原保存期的测定 |
| 2.2.10 间接OmpA-ELISA诊断方法的初步应用 |
| 2.2.10.1 重组表达GST-OmpA蛋白免疫血清效价检测 |
| 2.2.10.2 临床送检血清检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2 间接OmpA-ELISA的判断标准 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.3.1 交叉性试验 |
| 3.3.2 阻断试验 |
| 3.3.3 细菌裂解液的应用 |
| 3.4 重复性试验 |
| 3.5 间接OmpA-ELISA方法与平板凝集方法的对比试验 |
| 3.6 包被抗原保存期的测定 |
| 3.7 间接OmpA-ELISA的临床应用 |
| 3.7.1 重组表达GST-OmpA蛋白免疫血清效价检测 |
| 3.7.2 临床送检血清检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组表达蛋白的提取和复性 |
| 4.2 包被抗原 |
| 4.3 间接OmpA-ELISA检测方法 |
| 5 结论 |
| 第五章 应用选择性捕获转录序列技术筛选鸭疫里氏杆菌在感染鸭肝脏中差异表达基因的研究 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RA-YM基因组的提取和生物素标记 |
| 2.2.1.1 RA-YM基因组的提取 |
| 2.2.1.2 RA-YM基因组的生物素标记 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.2.1 RA-YM16S rRNA基因引物 |
| 2.2.2.2 RA-YM23S rRNA基因引物 |
| 2.2.2.3 SCOTS引物 |
| 2.2.2.4 Rea-time RT-PCR引物 |
| 2.2.3 RA-YM 16S rDNA和23S rDNA基因的扩增 |
| 2.2.3.1 RA-YM 16S rRNA基因的扩增 |
| 2.2.3.2 RA-YM 23S rDNA基因的扩增 |
| 2.2.3.3 PCR产物回收与纯化 |
| 2.2.3.4 PCR产物的克隆与测序 |
| 2.2.3.5 感受态细胞制备(氯化钙法) |
| 2.2.3.6 连接产物的转化 |
| 2.2.3.7 质粒的小量制备(碱裂解法提取质粒) |
| 2.2.3.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.3.9 RA-YM 16S rDNA和23S rDNA基因的序列分析 |
| 2.2.4 生物素标记的RA-YM基因组和核糖体质粒的破碎 |
| 2.2.5 试验动物感染及感染组织样品采集 |
| 2.2.6 总RNA的提取 |
| 2.2.6.1 组织总RNA的提取 |
| 2.2.6.2 细菌总RNA的提取 |
| 2.2.7 总RNA的RNase-free DNase Ⅰ消化 |
| 2.2.8 双链cDNA的合成 |
| 2.2.8.1 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.8.2 cDNA第二链合成 |
| 2.2.8.3 双链cDNA纯化与回收 |
| 2.2.9 双链cDNA的扩增与回收 |
| 2.2.9.1 双链cDNA的扩增 |
| 2.2.9.2 双链cDNA的扩增产物的纯化与回收 |
| 2.2.10 选择性捕获转录序列(SCOTS) |
| 2.2.10.1 cDNAs样品杂交 |
| 2.2.10.2 选择性捕获转录序列的回收 |
| 2.2.11 感染过程中差异表达基因的选择性富集 |
| 2.2.12 差异表达基因PCR产物的克隆 |
| 2.2.13 感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 2.2.14 连接产物的转化 |
| 2.2.15 SCOTS克隆的PCR鉴定 |
| 2.2.16 斑点杂交 |
| 2.2.16.1 探针制备 |
| 2.2.16.2 斑点杂交筛选阳性克隆 |
| 2.2.17 阳性SCOTS克隆的测序及分析 |
| 2.2.18 Real-time RT-PCR验证差异表达基因 |
| 2.2.18.1 cDNA合成 |
| 2.2.18.2 Real-time RT-PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RA-YM基因组的提取 |
| 3.2 RA-YM16S rDNA基因的克隆与测序 |
| 3.2.1 RA-YM16S rDNA基因扩增结果 |
| 3.2.2 重组质粒pT-16S rDNA的鉴定 |
| 3.2.3 RA-YM16S rRNA基因的序列 |
| 3.3 RA-YM23S rDNA基因的扩增与测序 |
| 3.3.1 RA-YM23S rDNA基因的扩增(分三段扩增) |
| 3.3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.3.3 RA-YM23srRNA基因的序列 |
| 3.4 生物素标记的RA-YM基因组及核糖体质粒的破碎 |
| 3.5 总RNA的提取及纯化 |
| 3.5.1 组织总RNA的提取和纯化 |
| 3.5.2 细菌总RNA的提取和纯化 |
| 3.6 双链cDNAPCR扩增 |
| 3.7 选择性捕获转录序列结果 |
| 3.7.1 第1轮SCOTS PCR扩增结果 |
| 3.7.2 第2轮SCOTS PCR扩增结果 |
| 3.7.3 第3轮SCOTS PCR扩增结果 |
| 3.8 感染过程中差异表达基因的选择性富集结果 |
| 3.9 差异表达基因的克隆 |
| 3.10 斑点杂交筛选结果 |
| 3.11 差异表达基因的Real-time RT-PCR验证结果 |
| 3.12 基因归类分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 生物合成和代谢 |
| 4.2 适应性反应和相关调节 |
| 4.3 适应性调节 |
| 4.4 蛋白酶 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的主要论文 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 试验一 鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与增菌培养研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验三 鸭疫里默氏杆菌与鸭病毒性肝炎病毒高免卵黄抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
