陈曦[1]（2021）在《基因Ⅵ型NDV HN蛋白新毒力位点的鉴定及弱毒疫苗候选株的构建》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的给世界养禽业造成极大危害的烈性传染病。迄今为止,已经在250多种鸟类以及少数的哺乳动物上发现了NDV的感染。为了适应庞大的宿主类型,与其它单股负链RNA病毒一样,NDV通过基因突变产生了大量的变异体,表现在多种多样的基因型。除宿主因素外,NDV的毒力主要是由其基因编码的膜融合蛋白（Fusion protein,F）裂解位点（Cleavage site,cs）决定的。虽然,基因Ⅵ型NDV的Fcs为强毒株类型,但有些毒株在鸡上表现出弱毒株特性,这表明基因Ⅵ型NDV的毒力可能受到其它毒力因子的影响。基因Ⅵ型NDV是一类宿主和抗原变异的病毒,易感宿主是鸽子,与用来生产并免疫我国家禽的ND疫苗的基因II型或ⅥI型NDV的同源性不高,常用的ND疫苗在鸽子上仅能提供部分保护。目前,缺少针对基因Ⅵ型的ND疫苗用以防控鸽子被NDV感染。因此,开展基因Ⅵ型NDV毒力的研究,并在此基础上研发针对该基因型的ND弱毒疫苗,对鸽源NDV的防控具有重要意义。本研究具体实验内容及结果如下:1.两株毒力差异较大的同源NDV毒株的生物学特性比较为了获得自然突变致弱的NDV毒株,实验室前期将一株分离自朱鹮的、中等毒力的基因Ⅵ型NDV毒株（CI10）在鸡胚中进行连续传代,多次传代后,发现传代株（CE16）的致病能力显着降低。为了对传代株有更加清楚的了解,本研究对CE16的生物学特性和致病性进行了全面的分析;与CI10相比,CE16产生的蚀斑大小缩小了约50%;在细胞上的增殖能力降低至原来的1/30;致病指数ICPI由1.04降至0.35,MDT由86 h延长至120 h以上;对鸡的致病性试验也显示CE16未能引起明显的临床症状,死亡率由100%降至0。为了进一步研究上述生物学表型及毒力改变的分子机制,本研究对两株毒株的全基因组序列进行了测序分析。结果显示,两毒株全长均为15192个核苷酸（Nucleotide,nt）,F蛋白序列完全一致且含有强毒株特征的Fcs。根据F基因的系统发育分析,两株毒株均属于基因Ⅵ型NDV。分子特征比较发现,与CI10相比,CE16基因上有6个nt的替换导致5个氨基酸（Amino acid,aa）的突变,这些突变位点分布于核衣壳蛋白（Nucleoprotein,NP）（A426T）、HN蛋白（A215G和T430A）以及聚合酶蛋白（Large polymerase protein,L）（E1694V和R1767G）。鉴于HN蛋白与NDV膜融合活性有关,而NP和L与病毒的增殖活性有关。推测上述表型差异的原因是由这5个位点上氨基酸的突变导致的。进一步的蛋白质3D结构模型预测分析发现:HN215的突变未引起明显的结构改变;HN430的突变使序列结构由β折叠变为无规则卷曲;L1694的突变显着改变了蛋白质结构;L1767的突变将α螺旋变成无规则卷曲。尽管NP426位没有相应的蛋白结构,但其位于NP蛋白中影响NP和磷蛋白（Phosphoprotein,P）互作的不规则区域内。上述结果为研究NDV毒力的分子机制提供了参考。2.基因Ⅵ型NDV CE16株反向遗传操作系统的构建为了研究CE16毒力减弱的分子机制以及研制基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株,本研究以在鸡胚上连续传代致弱产生的NDV CE16株为骨架,构建基于T7启动子的基因Ⅵ型NDV反向遗传操作系统。首先,本研究选择经过改造的用于NDV拯救的克隆载体p BR322作为骨架载体,将病毒基因组全长c DNA分为8个不同带重复序列的亚基因片段,并采用酶切连接的方法,在该载体上成功组装出病毒的c DNA全长。为了获得精确的病毒全基因组序列末端,本研究分别在基因组c DNA的5’端引入T7 RNA聚合酶启动子、在3’端引入丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus,HDV）RNA核酶序列以及T7 RNA聚合酶终止子,构成NDV CE16全基因组c DNA的克隆质粒p BR322-CE16。同时将CE16株的NP、P和L的编码区序列克隆至p CAGGS表达载体上构建辅助质粒p CAGGS-NP、p CAGGS-P以及p CAGGS-L。最后,将上述构建好的全长c DNA质粒和三个辅助质粒共转染人喉表皮样癌（Hep-2）细胞,同时感染能够表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒（MVA-T7）。培养4天（dpi）后,分别收集细胞上清液及细胞,接种SPF鸡胚中进一步扩大培养,并利用血凝试验（Hemagglutination assay,HA）检测病毒滴度。经过上述方法,本研究成功获得了一株r CE16重组毒株,在鸡胚中连续传至10代后,仍具有良好的遗传稳定性。与CE16相比,r CE16在合胞体形成以及细胞中的增殖动力学均未发生明显改变;ICPI和MDT由原来的0.35和>120 h变为0.33和>120 h,毒力也未发生明显变化。因此,上述结果表明本研究成功构建了基于T7启动子的基因Ⅵ型NDV反向遗传操作体系,为后续研究NDV毒力的分子机制以及弱毒活疫苗提供了技术手段。3.利用反向遗传操作技术鉴定HN蛋白新毒力位点NDV的HN蛋白是影响毒力及致病性的重要毒力因子。为了研究CE16毒株HN蛋白上aa 215和aa 430的突变在NDV生物学特性及致病性改变中的作用。本研究首先构建了wt CE16、wt CI10、G215A及A430T的野生（wild type,wt）以及单位点突变HN蛋白。对4种HN蛋白表达效率、红细胞的吸附（Hemadsorption,HAd）能力、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）活性、促细胞膜融合活性以及促F蛋白裂解能力等生物学功能进行评价分析。结果显示,4种HN蛋白在细胞表面的表达效率基本一致,表明氨基酸的突变未对HN的表达产生影响。其它生物学研究发现,与wt CE16相比,A430T和wt CI10的HAd活性分别降低了27.5%和29.9%、NA活性分别升高了78.3%和95.5%、融合指数分别增加了56.6%和66.3%、F蛋白裂解指数也分别增加了40.9%和51.4%。而G215A的HAd活性升高了19.6%、NA活性升高了17.9%、融合指数增加了12.9%、F蛋白裂解指数增加了5%,但未产生显着的差异。上述结果从蛋白水平证明了HN430是影响HN生物学活性的一个重要功能位点。为了进一步研究HN430位对病毒的影响,本研究将A430T通过点突变的方式引入到p BR322-CE16中,构建p BR322-CE16-HNA430T。通过病毒拯救成功获得了r CE16-HNA430T,在鸡胚中连续传至10代后,仍具有良好的遗传稳定性。与r CE16相比,r CE16-HNA430T重组毒株产生合胞体的能力增强了约40%、HAd能力增强了约50%、NA活性提高了约130%、增殖能力增强了约8倍左右。致病指数结果显示:ICPI由0.33升至1.38,MDT由>120h缩短至86 h;对鸡的致病性试验也显示r CE16-HNA430T能引起严重的临床症状以及100%死亡率,证明r CE16-HNA430T的致病性显着增强。因此,本研究鉴定到HN430位氨基酸位点是有别于已经鉴定过的在细胞膜融合、病毒增殖和致病性等方面有重要作用的新毒力位点。上述结果为HN蛋白功能位点的研究奠定了基础。4.利用反向遗传操作技术构建基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株目前,鸽子上常用的ND疫苗为鸡用的传统疫苗,与鸽子中流行的基因Ⅵ型NDV遗传距离约为20%。虽然NDV只有一个血清型,但基因型和抗原的不匹配使得传统疫苗不能完全防控流行株的感染和扩散。因此,为了研究专门针对鸽流行NDV毒株的弱毒活疫苗,本研究利用基因Ⅵ型NDV CE16弱毒株为研究对象,通过反向遗传操作技术将p BR322-CE16的Fcs由强毒型的112RRQKR/F117替换为传统疫苗株La Sota的112GRQGR/L117。通过病毒拯救获得r CE16-La（Fcs）,F基因测序发现该毒株含有弱毒型Fcs序列,并且感染细胞后无合胞体形成。对拯救毒株的生物学特性、致病性和遗传稳定性检测发现:r CE16-La（Fcs）在鸡胚上具有良好的增殖活性,HA效价为29,病毒含量高于108EID50/m L;致病性结果显示ICPI由0.33进一步降低至0、MDT仍>120 h,表明Fcs的突变使该基因Ⅵ型传代弱毒株的毒力进一步降低;分别在鸡胚中连续传15代、在鸽子脑中传5代后测定鸡胚第5、10和15代次以及鸽子脑的第1、3和5代次病毒的毒力及Fcs序列,结果显示该毒株在鸡胚传代过程中毒力未发生明显改变（ICPI:0～0.05）,在鸽子中未引起任何临床症状,并且每代次病毒的Fcs序列均未发生回复突变,证明该毒株具有良好的毒力和遗传稳定性。为了验证r CE16-La（Fcs）的攻毒保护效率,本研究将该毒株和La Sota分别对鸽子进行一免和二免,然后对免疫后血清中抗体的产生、基因Ⅵ型强毒攻毒后的保护能力以及排毒情况进行检测。结果显示,r CE16-La（Fcs）免疫鸽子28 dpi后,对基因Ⅵ型强毒株抗原的HI效价约为211,而La Sota产生的HI效价约为28.5;在接种基因Ⅵ型强毒株后均未发生任何的临床症状或死亡,表明r CE16-La（Fcs）和La Sota具有相同的免疫保护效力;此外,对攻毒后口腔和泄殖腔拭子中病毒的检测发现,r CE16-La（Fcs）能显着降低拭子阳性率以及缩短排毒时间。综上所述,r CE16-La（Fcs）在鸡胚中具有良好的增殖活性,并且毒力和遗传稳定性均符合OIE疫苗株标准;此外,与La Sota相比r CE16-La（Fcs）在免疫后产生的血清抗体在同源毒株做抗原时能产生更强的中和抗体活性,并且在同源强毒株给鸽子攻毒后能产生更强的攻毒保护率。虽然传代次数较短不能保证r CE16-La（Fcs）的毒力是否会返强,但根据前面的研究结果,只要Fcs和HN蛋白430的氨基酸不同时发生突变,就能确保该r CE16-La（Fcs）为弱毒株。因此,相比其它只突变了Fcs的基因Ⅵ型的弱毒疫苗株,本研究研发的疫苗候选株可能更稳定,更适合用来生产弱毒疫苗。
邹桂莲,张文婷,赵宗正,王红琳,汪宏才,罗玲,张蓉蓉,张腾飞,罗青平,邵华斌,温国元,商雨,杨烨[2]（2021）在《利用昆虫表达系统表达新城疫病毒TS09-C耐热株的HN蛋白胞外区》文中研究说明前期研究表明新城疫病毒（NDV）HN蛋白为病毒热稳定性的主要影响因子。为了进一步研究HN蛋白的热稳定性以及影响其热稳定性的结构特征,研究利用杆状病毒表达了NDV TS09-C耐热株的HN蛋白的胞外区,将两个拷贝的TS09-C株HN胞外区基因分别插入到载体p Fast Bac-dual的PH启动子和p10启动子下游,在HN蛋白的N端连接上杆状病毒EGT基因的分泌信号肽和His标签。通过转座和病毒拯救试验获得表达HN蛋白的重组杆状病毒r Ac-t TS/HN2。蛋白表达结果表明,NDV HN蛋白表达在细胞内,并没有分泌到细胞外,且在细胞内主要以可溶形式存在。研究实现了NDV HN蛋白在昆虫细胞内可溶性表达,为后续的HN蛋白的热稳定性研究和NDV耐热机制研究奠定了基础。
姚舜禹[3]（2020）在《表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价》文中研究表明新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）是1927年在英国纽卡斯尔首次出现的一种禽类病毒,主要伤害病禽的消化系统和呼吸系统,甚至导致死亡,是严重威胁全球家禽养殖业的病原之一。应用疫苗是防控新城疫病毒感染的有效手段,现有NDV疫苗所用毒株大多为上世纪50年代开发的毒株所构建,与目前导致新城疫疫情的毒株间已有较大的遗传差距,因此需要开发新的新城疫疫苗。本研究构建了锚定型表达包含NDV融合蛋白（fusion glycoprotein,F）与血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase,HN）截短体蛋白的重组酿酒酵母菌株,研究了其表达特性,并通过对动物免疫初步评价了重组酵母菌株作为候选疫苗的免疫效力。主要结果如下:1.NDV F和HN基因的扩增与转录单位构建:根据抗原表位分析,并结合他人的研究成果,选择新城疫F基因第241位碱基至888位碱基以及HN基因的第25位碱基至528位碱基序列,应用生物信息学技术分析这部分片段的一,二,三级结构组成和特点,确定其氨基酸序列,等电点和亲疏水性等理化性质,构建系统进化树,并连接到酿酒酵母表达载体（POT）中,构建带有抗原表位的转录单位。2.NDV F与HN蛋白在酿酒酵母表面的表达及鉴定:采用Yeast Fab Assembly的技术,通过II型内切酶的识别位点与其切割位点不同的特点将转录单位与同源臂和Leu营养筛选标记串联,利用Li Ac转化法将其整合到ST1814-G酵母基因组。经营养缺陷型筛选、PCR基因型验证、Western Blot分析,免疫荧光鉴定,证实成功构建了NDV F与HN蛋白串联展示于酵母细胞表面的菌株,通过生长曲线检测,结合Western Blot灰度分析结果,证实重组蛋白在36小时表达量最高。与阴性对照组相比,外源蛋白F与HN的表达对宿主菌的酵母菌生长影响不大。3.重组酵母菌的免疫效果评价:构建HN蛋白的原核表达载体,并表达纯化HN原核蛋白,以其来检测动物实验鸡血清的Ig G含量,ELISA实验结果证明重组酵母免疫后的鸡血清中的Ig G含量明显高于喂食原始酵母菌（ST1814G）的阴性对照组,表明重组酵母有一定的免疫原性。综上所述,本研究构建的串联表达新城疫病毒F和HN蛋白的重组酿酒酵母菌株,动物免疫结果证实该菌株可诱导产生特异性抗体,表明重组菌具有免疫保护性,可作为NDV预防的潜在候选疫苗进行工业开发。
刘颖[4]（2020）在《副粘病毒融合蛋白连接区结构与功能研究》文中研究说明第一部分人副流感病毒3型F蛋白HRB连接区结构与功能研究研究背景:人副流感病毒3型（human parainfluenza virus type3,HPIV3）为副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒属（Paramyxovirus）病毒家族中的一种重要病毒,可引起5岁以下婴幼儿下呼吸道感染,导致支气管炎和肺炎。在病毒性呼吸道感染患者中,HPIV3的临床阳性检出率仅次于呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytial virus,RSV）。HPIV3为包膜病毒,其遗传物质为不分节段的单负链RNA（-ssRNA）。HPIV3病毒包膜上锚定有两种与病毒毒力密切相关的蛋白,血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）和融合蛋白（fusionprotein,F）。HPIV3 的病毒包膜与宿主细胞膜的融合是病毒感染宿主细胞的关键步骤,该过程由HN蛋白协助,在F蛋白的介导下完成。HN蛋白与宿主细胞膜上唾液酸（sialic acid,SA）受体结合后,HN蛋白激活F蛋白,继而F蛋白发生一系列不可逆构象改变,由融合前构象转变为融合后构象,在这个过程中驱动病毒包膜与宿主细胞膜的融合。F蛋白融合前三维晶体结构为一“蘑菇样”同源三聚体结构,结构域DⅠ,DⅡ,DⅢ构成蛋白头部的主体,HRB七重复基序构成蛋白的茎部。有文献表明,DⅡ与HRB之间存在一段低电子密度区,将其定义为HRB连接区,也称为F蛋白的L3连接区。虽然有大量研究对融合肽（fusion peptide,FP）,跨膜区（transmembraneregion,TM）,DⅠ,DⅡ以及DⅢ结构域的功能有所报道,但是对HRB连接区功能的研究却很少涉及。本部分研究以HPIV3 F整段HRB连接区为研究对象,探讨其结构特征,以及在介导膜融合过程中所发挥的重要作用。研究目的:研究HPIV3 F蛋白HRB连接区功能,阐明HPIV3 F蛋白HRB连接区影响膜融合功能的机制,为将来以HRB连接区为靶点的特异性药物设计以及构建对HRB连接区改造的减毒活疫苗提供参考,从而为HPIV3相关感染的治疗与预防奠定理论基础。研究方法:1.HPIV3 F蛋白HRB连接区嵌合（Chimera）、缺失（Deletion）突变体的构建:利用已知的副流感病毒5型（parainfluenza virus type 5,PIV5）F蛋白融合前构象的3D结构,采用SWISS-MODEL同源建模的方法,确定HPIV3 F蛋白HRB连接区的在整个多肽链上的相对位置与氨基酸范围。经过HPIV3 F蛋白与NDV、MV、HPIV1的F蛋白HRB连接区氨基酸序列两两比对后,利用重叠延伸PCR法分别用以上三种病毒F的HRB连接区序列替换对应的HPIV3 F HRB连接区序列,获得HPIV3 F的HRB连接区嵌合的3个嵌合突变体质粒,同时利用相同的方法获得HPIV3 F的HRB连接区缺失的1个缺失突变体质粒。研究中涉及的所有突变体质粒都经测序确认。2.突变体F蛋白在细胞内的表达:应用Thermo Fisher Scientific公司的阳离子转染试剂TurboFect Transfection Reagent将pBSK+空载体、野生型wt F质粒以及各突变体重组质粒分别转染BHK-21细胞系,利用重组痘苗病毒瞬时表达系统表达相应的突变体蛋白。3.F蛋白突变体介导膜融合活性的检测:染料转移实验和合胞体形成实验对突变体介导膜融合活性进行半定量检测,内容物混合实验对突变体介导膜融合活性进行定量检测。4.F蛋白突变体表达情况的检测:间接免疫荧光对突变体蛋白的表达情况进行定性检测,流式细胞术对突变体蛋白在细胞表面的表达效率进行定量检测。5.F蛋白突变体水解活性的检测:使用蛋白免疫印迹方法检测各突变体酶切水解活化的情况。6.统计学方法:用GraphPad Prism7.0软件采用非配对t检验对突变体F蛋白与野生型F蛋白的测定结果进行统计学比较,P<0.05认为其差别有统计学意义。研究结果:1.成功构建HPIV3 FHRB连接区3个嵌合突变体:Ch-NDV-L3、Ch-MV-L3、Ch-HPIV1-L3和1个缺失突变体:De-L3,并在突变体C端添加His组氨酸标签。2.HPIV3F蛋白HRB连接区嵌合及缺失突变体介导膜融合活性测定在染料转移实验中,野生型wtF引起引起染料转移事件平均数为98.0,Ch-HPIV1-L3则降低至29.7,其他三个突变体未能引起明显的染料转移事件。在内容物混合实验中,四个突变体引起细胞内容物混合的能力降低为wt F的16.5%～23.5%。合胞体形成实验中,除Ch-HPIV1-L3形成合胞体能力略弱于wt F外,其余3个突变体的合胞体形成能力降至wt F的5%以下。3.HPIV-3 F蛋白HRB连接区嵌合及缺失突变体表达情况测定间接免疫荧光发现抗His标签单抗检测到了添加了 His标签的全部突变体及wt F-His,而使用抗HPIV3 F蛋白单抗仅检测到了 wtF。继而采用流式细胞术,使用抗His标签单抗检测突变体蛋白在细胞表面的表达情况发现,发现带有His标签的突变体蛋白均成功表达于细胞表面,与wt F-His相较,其表达水平并没有明显的统计学差异。蛋白免疫印迹结果显示wt F-His、Ch-MV-L3-His、Ch-HPIV1-L3-His可以被水解为有活性的F1片段,而Ch-NDV-L3-His、De-L3-His则不能被水解,仍然为无活性的F0片段。结论:HPIV3 F蛋白HRB连接区氨基酸的嵌合与缺失突变对于F蛋白介导膜融合的活性影响显着,说明HRB连接区对于F蛋白正常发挥介导膜融合功能具有非常重要的作用。HRB连接区对膜融合活性的影响是通过改变F蛋白融合前构象的稳定性来实现。同时,HRB连接区还能影响F蛋白前体F0上蛋白酶识别位点的暴露,而F0被水解为有活性的F1是F执行膜融合功能的前提条件。第二部分人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅡ连接区结构与功能研究研究背景:人副流感病毒（humanparainfluenzaviruses,HPIV）为副粘病毒科副粘病毒属的主要成员之一,是引起社区获得性肺炎的重要病原体,特别是导致婴幼儿肺炎和下呼吸道疾病。根据其遗传学和血清学特点,HPIV可以分为分为1～4型,其中人副流感病毒3型（human parainfluenza virus type 3,HPIV3）是5岁以下婴幼儿下呼吸道感染的主要病因,仅次于呼吸道合胞病毒。目前,仍然没有有效的预防和治疗手段。HPIV3为不分段的单负链RNA基因组的包膜病毒。病毒包膜与靶细胞膜的融合为病毒感染的关键步骤,继而病毒将其基因组注射入宿主细胞并启动病毒复制周期。病毒的融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）是病毒进入细胞的决定因素。HN结合细胞膜上唾液酸受体,引发同源F蛋白构象变化,继而驱动膜融合。F蛋白由多个重要的蛋白结构域构成。在DⅠ与DⅡ结构域之间存在类似于“铰链”结构的连接区,即DⅠ-DⅡ连接区,也称为L1连接区,该连接区可能参与了 F蛋白介导膜融合过程中的构象转换。本课题组前期已经对HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的关键氨基酸进行了定位,但尚未对DⅠ-DⅡ连接区的整体功能进行研究。研究目的:探讨HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区在介导膜融合过程中的作用,阐述DⅠ-DⅡ连接区影响F蛋白介导膜融合活性的机制。研究方法:以已知的PIV5病毒的F蛋白融合前构象的3D结构为模板,采用SWISS-MODEL同源建模的方法,确定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的氨基酸范围。通过多重序列比对来确定NDV,MV,HPIV1 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对应的碱基序列。然后使用重叠延伸PCR的方法,用NDV,MV,HPIV1 F的DⅠ-DⅡ连接区对应的碱基序列替换HPIV3 DⅠ-DⅡ连接区碱基序列,构建缺失或者嵌合的突变体。同时,在所有的突变体的C端添加His标签。采用重组痘苗病毒表达系统于BHK-21细胞系中分别表达野生型F蛋白以及各突变体蛋白。采用染料转移法测定其半融合活性,合胞体形成实验和内容物混合实验分别定性和定量测定其膜融合活性。采用间接免疫荧光定性检测突变体蛋白的表达情况,流式细胞术定量分析各突变蛋白在细胞表面的表达效率,蛋白免疫印迹检测突变体蛋白水解情况。用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析,实验数据以x±-s表示,应用非配对t检验对突变体与wt F的测定结果进行比较,P<0.05认为其差别有统计学意义。研究结果:1.成功构建HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区3个嵌合突变体:Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,Ch-HPIV1-L1;1个缺失突变体:De-L1。在所有突变体蛋白C端成功添加His标签。2.HPIV3的F蛋白嵌合及缺失突变体融合活性测定与同源HN共转染后,与野生型F蛋白比较,所有突变蛋白显示合胞体形成水平均不同程度降低。Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,De-L1几乎丧失了他们形成合胞体的能力,小于wtF水平的5.0%。而Ch-HPIV1-L1合胞体形成能力略微降低,最终仍具有形成合胞体的能力。四个突变体（Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,Ch-HPIV1-L1,De-L1）内容物混合能力仅保留 wt F 的 13.1%,12.4%,61.8%和 12.7%。Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,De-L1很大程度降低了染料转移水平,都在wt F水平的4.4%以下。嵌合突变体的Ch-HPIV1-L1的染料转移程度也降低至wt F的30.6%水平。3.HPIV-3 F蛋白嵌合及缺失突变体表达情况测定使用抗HPIV3 wtF单克隆抗体进行间接免疫荧光检测中发现,除突变体Ch-HPIV1-L1以外,突变体Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1和De-L1均未检测到荧光信号。使用抗His标签单克隆抗体进行间接免疫荧光检测中发现所有添加His标签的突变体均检测到荧光信号,表明成功所有标记的突变蛋白的表达。使用抗His标签单克隆抗体进行FACS检测发现,所有突变体均产生一定比例表达His标签突变蛋白的阳性细胞,为wtF组的100.0%～105.1%之间,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.HPIV-3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的嵌合与缺失突变会导致膜融合能力的减弱甚至丧失。突变对膜融合能力的影响在融合的初期即可发生。这种影响的程度与氨基酸替换的数量相关。2.HPIV-3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区突变不影响F蛋白在细胞表面的表达效率,因此突变未对F蛋白在细胞内的转运过程产生影响,但是会干扰F蛋白的折叠或/和构象变化。DⅠ-DⅡ连接区在融合前虽然为自由卷曲状态,但其仍然参与F蛋白激活后的构象变化,甚至起到很重要的作用。第三部分新城疫病毒F蛋白HRB连接区关键氨基酸定位及功能研究研究背景:新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的是一种禽类烈性传染病,具有传染性强,病死率高的特点,严重危害家禽养殖业。NDV可感染几乎所有的禽类,其中鸡最为易感,常为致死性感染,而水禽感染后可不引起明显症状,成为病毒的储存池。哺乳动物对NDV有较强的抵抗力,但人偶有感染而患结膜炎。NDV毒株的毒力差异较大,根据鸡感染后的发病严重程度,可将NDV毒株分为四种致病型:强毒株,中等毒株,低毒株和无毒株。NDV属于副粘病毒科,副粘病毒属。与该科中其他病毒一样,NDV有包膜,其遗传物质为单股不分节段的负链RNA。其基因组从3’端到5’端依次编码六种结构蛋白,分别为核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神-经氨酸酶（HN）和大聚合酶（L）。此外,P基因在转录过程中通过RNA编辑作用产生两种非结构蛋白,V和W蛋白。病毒基因组转录和复制的活性模板为核糖核蛋白复合物（RNP）,其由NP蛋白包裹基因组RNA并与P和L蛋白结合。现已知的NDV全基因组有三种长度,分别为15186,15192或15198nt,均符合6个核苷酸倍数的规律。NDV的病毒包膜与宿主细胞膜的融合是病毒感染宿主细胞的关键步骤,两者膜发生融合后,病毒遗传物质进入细胞,完成病毒的生命周期。而该过程由位于病毒包膜上的HN蛋白协助,融合蛋白F介导。作为副粘病毒属的一种重要病毒,NDVF蛋白与副粘病毒属其他种类病毒的F蛋白具有高度相似的结构特征。本部分研究以NDV F蛋白HRB连接区为研究对象,探讨其在F蛋白介导膜融合过程中所发挥的重要作用,同时定位HRB连接区内起到关键作用的氨基酸。研究目的:研究NDVF蛋白HRB连接区的功能,阐明NDVF蛋白HRB连接区影响F介导膜融合的机制,同时定位HRB连接区内关键氨基酸。研究方法:利用已知的PIV5病毒的F蛋白融合前构象的3D结构,采用SWISS-MODEL同源建模的方法,确定NDVF蛋白HRB连接区的氨基酸范围,采用同源序列比对的方法确定L436、E439、1450、S453这四个位点氨基酸为保守氨基酸。然后采用定点突变与菌内同源重组相结合的方法对以上4个点位氨基酸进行突变,构建NDVF蛋白HRB连接区单氨基酸突变体重组质粒。采用重组痘苗病毒表达系统于BHK-21细胞中瞬时表达NDV野生型F蛋白以及各单氨基酸突变体蛋白。采用染料转移实验、合胞体形成实验以及内容物混合实验对突变体介导膜融合活性进行半定量、定量检测。采用间接免疫荧光对突变体蛋白的表达情况进行检测。采用蛋白免疫印迹对各突变体酶切水解活化的情况进行检测。最后使用非配对t检验对突变体F蛋白与野生型F蛋白的测定结果进行统计学比较,P<0.05认为其差别有统计学意义。研究结果:1.成功构建NDVF蛋白HRB连接区中保守氨基酸位点的6个单氨基酸突变体:L436A、L436T、E439A、I450A、S453A、S453N。2.NDVF蛋白HRB连接区单氨基酸突变体的融合活性测定L436A和I450A几乎丧失合胞体形成能力,仅仅为野生F的1.96%和1.33%。L436T和S453A合胞体小而少,合胞体形成能力降低至野生型的31.5%和45.6%。S453N突变后合胞体形成能力反而升高至野生型的115.7%。突变体E439A合胞体形成能力无明显的变化。L436A和I450A的半融合能力丧失,L436T、E439A,S453A,S453N均观察到明显的半融合现象。L436A、L436T、I450A的内容物混合能力降至野生型的52.14%,73.11%和51.93%。S450突变为丙氨酸（A）后,其内容物混合能力为野生型83.65%,而突变为该位点HPIV3 F蛋白所对应的天冬酰胺（N）,其内容物混合能力上升为野生型的143.58%。3.NDV F蛋白HRB连接区单氨基酸突变体表达情况测定间接免疫实验中,转染L436T,E439A,S453A和S453N质粒的BHK-21细胞中检测到明亮的绿色荧光,而转染L436A和I450A质粒的细胞只存在散在的弱荧光信号。非还原蛋白免疫印迹发现所有突变体都能被水解活化为F1,但表达量相对于野生型F蛋白均明显减少,且突变体之间蛋白表达量也差异明显。结论:NDVF蛋白HRB连接区氨基酸的突变对于F蛋白介导膜融合的活性影响显着,说明HRB连接区对于F蛋白正常发挥介导膜融合功能具有非常重要的作用,其中L436以及1450氨基酸为关键氨基酸。
赵冉[5]（2020）在《新城疫病毒入侵鸡巨噬细胞的分子机制研究》文中研究说明巨噬细胞是新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染的主要靶细胞之一。研究发现,定位于早期内体中的鸡干扰素诱导跨膜蛋白-1能够抑制NDV在鸡巨噬细胞系（HD11）中的复制,表明NDV可能通过内吞途径入侵鸡巨噬细胞,但NDV进入鸡巨噬细胞的分子机制目前仍不清楚。本研究以NDV强毒株F48E9感染HD11细胞为模型,揭示NDV入侵鸡巨噬细胞的分子机制。通过过表达野生型（WT）和功能突变体（DN）动力蛋白dynamin以及敲低dynamin的表达发现NDV感染HD11细胞需要dynamin的参与。鉴于dynamin是网格蛋白（CME）和小窝蛋白（Cav ME）介导的内吞通路的重要分子,用CME抑制剂chlorpromazine处理,过表达DN EPS15以及敲低网格蛋白的表达发现NDV进入HD11细胞不依赖于CME。而用Cav ME相关抑制剂MβCD、nystatin、PMA处理,过表达DN小窝蛋白（caveolin-1）和敲低其表达能够抑制NDV的进入和复制,并且NDV和caveolin-1存在共定位。表明NDV进入HD11细胞依赖于Cav ME。另外,用巨胞饮抑制剂处理HD11细胞,对病毒的吸附、进入、复制均无影响,说明NDV感染HD11细胞不依赖于巨胞饮途径。本研究继续探索了Rab蛋白在NDV的进入和运输过程中的作用。结果发现DN Rab5的表达能够抑制NDV的感染,敲低Rab5的表达能够抑制NDV的进入和复制,而Rab7的表达对NDV的感染没有影响,并且Rab5与NDV存在共定位。Rab5和Rab7是参与早期和晚期内体运输的关键分子,本研究进一步检测了NDV在内体中的定位。结果发现NDV入侵细胞后定位于早期内体。表明NDV通过Cav ME入侵巨噬细胞,并通过依赖Rab5的方式定位于早期内体中。NDV HN蛋白中存在2个受体结合位点。其中site II可能与NDV通过内吞途径入侵细胞有关。本研究建立了NDV强毒株F48E9的反向遗传操作系统,由于HN蛋白516位氨基酸是site II的关键位点,本研究拯救获得了HN蛋白516位突变的病毒,命名为r F48E9-516A。用Cav ME相关抑制剂处理HD11细胞,然后接种r F48E9-516A。结果发现Cav ME相关抑制剂均能抑制r F48E9-516A的复制,表明NDV进入HD11细胞所利用的Cav ME不依赖于HN蛋白的site II位点。进一步用内吞通路抑制剂对鸡原代巨噬细胞、成纤维细胞系DF-1和肝细胞系LMH进行处理并接种NDV。结果表明,NDV能够通过Cav ME进入鸡原代巨噬细胞和LMH细胞。而NDV通过依赖p H和动力蛋白的CME进入DF-1细胞,并且巨胞饮也参与了NDV进入DF-1细胞的过程。此外,用内吞通路抑制剂处理HD11细胞后,接种3种不同毒力的NDV,结果发现NDV进入HD11细胞的内吞途径在不同毒力的毒株之间没有差异。综上所述,本研究首次证实了NDV能够通过依赖于p H和动力蛋白的Cav ME进入鸡巨噬细胞,并且Rab5在NDV的运输和早期内体定位中发挥重要作用。本研究结果有助于深入理解NDV入侵宿主巨噬细胞的机制,并为研制新型预防或治疗制剂提供了理论基础。
金忠元[6]（2020）在《新城疫LaSota疫苗株HN蛋白优势B细胞表位及V蛋白单克隆抗体的研究》文中研究表明新城疫是由（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的可致禽类感染和死亡的急性传染病。新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶（HN）和V蛋白均是NDV的毒力因子,与病毒的致病性密切相关。HN蛋白作为重要的宿主保护性抗原可以诱导机体产生中和性抗体,是临床上疫苗设计和免疫检测的靶蛋白。目前HN蛋白的抗原表位尚未完全阐明,对HN蛋白的抗原表位及中和性表位研究有助于深入了解HN蛋白的抗原特性,为NDV表位疫苗的设计提供思路。V蛋白在病毒复制,致病性及拮抗干扰素方面具有非常重要的作用,然而因缺乏V蛋白单克隆抗体使许多研究变得非常困难,包括对V蛋白抗原表位的了解也极其少。因此,制备V蛋白单克隆抗体可以对V蛋白生物学特性的研究提供有力的工具。本研究首先对HN蛋白优势抗原表位进行筛选鉴定,其次进行V蛋白单克隆抗体的制备,增进了对病毒蛋白抗原表位的了解,为NDV的致病机理研究和疫苗研发提供一定支持。主要研究内容及结果如下:1. HN蛋白优势B细胞表位的筛选和鉴定（1）优势抗原表位（IDE）的筛选。利用La Sota株鸡超免抗血清靶向HN蛋白进行肽扫描分析,筛选出5个优势抗原表位区域。将其分别融合RFP基因进行真核表达,同时合成抗原多肽,通过IFA和Dot Blot验证,表明5个抗原区均是HN蛋白的IDE。（2）IDE免疫原性的分析。合成IDE多肽免疫小鼠,制备IDE抗血清。通过Dot Blot、IFA、ELISA、和Western Blot结果表明5个IDE均能够刺激小鼠产生高水平的抗体并能够特异性结合HN蛋白,其具有较好的免疫原性。IDE1、IDE2、IDE3和IDE4的抗血清能识别Calss II和Class I类毒株且其表位氨基酸序列高度保守,而IDE5抗血清只能识别Class II类毒株,其可用于鉴别此两类毒株。（3）IDE中和表位的鉴定。体外病毒中和实验结果显示IDE4抗血清对弱毒株La Sota具有部分中和活性,对强毒株F48E9和JS17的作用相对较弱,而其它IDE抗血清没有中和活性。此结果表明IDE4（242-256aa）是潜在的中和抗原表位。2. La Sota疫苗株V蛋白单克隆抗体的研究（1）单克隆抗体的制备。原核表达V蛋白C端功能域（CTD）,纯化后免疫小鼠。进行细胞融合后,应用ELISA、IFA和Western Blot进行筛选,共获得两株阳性杂交瘤细胞5C5和6D4,均能特异性识别V蛋白。（2）5C5单克隆抗体的特性。单抗5C5仅能特异性识别La Sota（基因II型）,而不能识别Class I类毒株（Pigeon/QH-1/Ch/14）及Class II类强毒株SX10（基因VI型）、JS17（基因VII型）、F48E9（基因IX型）。表明该单抗可用于鉴别基因II型疫苗株和强毒株。采用真核系统表达V蛋白的截短体分析表明其识别V蛋白的线性表位为146TSDSTAGEST 155,该表位处于V-CTD的可变区,其氨基酸序列在各毒株中差异较大。综上所述,本研究利用肽扫描技术鉴定出NDV HN蛋白的5个线性优势抗原表位和HN蛋白的潜在中和性抗原表位IDE4（242-256aa）。利用单克隆抗体技术获得了V-CTD的单抗,并鉴定出单抗5C5识别V蛋白的线性抗原表位146 TSDSTAGEST 155,该表位具有毒株特异性。为NDV的HN蛋白抗原表位和疫苗研发及V蛋白的功能研究提供基础支撑。
闫传琦[7]（2020）在《两株新城疫病毒HN蛋白介导膜融合活性差异的研究》文中研究指明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）所引发的一种严重危害世界养禽业的传染病,可分为强毒株、中毒株和弱毒株三种毒株,其中强毒株可100%致死感染家禽。NDV上的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白和融合（F）蛋白均是位于病毒粒子囊膜表面的糖蛋白,它们的相互作用是发挥膜融合形成合胞体的关键。而HN蛋白在NDV的生命周期中主要发挥受体结合、促膜融合、神经氨酸酶（NA）活性,已有研究表明,NDV的致病性和膜融合与HN蛋白有关。本实验室前期从野鸟体内分离的两株NDV（NDV-Blackbird和NDV-Dove）同源性极高,F蛋白序列完全相同且裂解基序均为112R-R-Q-R-R↓F117（强毒株和中毒株的裂解基序）,HN蛋白上仅有5个氨基酸突变（AAs:54、110、116、469与522）,但毒力测定发现NDV-Blackbird是强毒,NDV-Dove是弱毒,而且它们在细胞上产生的合胞体大小差异显着。为了探究这5个氨基酸变异对两株NDV膜融合活性的影响及影响途径,本论文从以下几方面展开研究:1. 两株NDV的生物活性分析将两株NDV分别感染BHK21细胞24 h后,通过Image J软件分别统计它们所产生的40个合胞体的直径用以比较膜融合活性的差异,发现NDV-Blackbird产生的合胞体明显大于NDV-Dove。通过蚀斑法测定接毒后不同时间点的病毒滴度来检测它们在DF-1细胞中的增殖情况,发现NDV-Blackbird的增殖速度明显快于NDV-Dove。同时,在感染BHK21细胞24 h后,利用血吸附（HAd）试验和神经氨酸酶（NA）检测试剂盒分别检测了它们的受体结合和神经氨酸酶活性,发现NDV-Blackbird的受体结合和神经氨酸酶活性均明显高于NDV-Dove。综上所述,研究结果表明,两株NDV膜融合活性的差异可能与增殖能力差异和HN蛋白功能活性差异相关。2. 两株NDV的HN蛋白差异位点分析通过统计两株NDV编码结构蛋白中的差异氨基酸,并利用Py MOL软件分别构建HN蛋白的三维结构模型,对HN蛋白上差异氨基酸的位置进行了分析。同时,收集Gen Bank中裂解基序均为112R/K-R-Q-R/K-R↓F117的763株NDV的序列信息,利用Lasergene7.1软件分析它们的完整HN蛋白序列,确定了5个位置的主要氨基酸种类。研究表明,5个氨基酸突变分别位于HN蛋白的不同位置,这些氨基酸的突变发生在主要氨基酸之间。3. HN突变体蛋白的细胞膜表面表达效率分析将HN突变体和野生型质粒转染进BHK21细胞24 h后,通过间接免疫荧光（IIFA）和流式细胞术（FCM）对HN突变体蛋白的表达水平和细胞膜表面表达效率分析后发现,所有的HN突变体和野生型蛋白均成功表达,且在细胞膜表面的表达效率没有显着差异。4. HN突变体蛋白的生物活性分析为了排除病毒增殖能力对膜融合活性的影响,利用融合PCR技术构建5个HN单突变体质粒,将其HN突变体和野生型质粒分别与F质粒共转染BHK21细胞36 h后,通过Image J软件分别统计它们所产生的40个合胞体的面积用以比较促膜融合活性的差异,发现NDV-Blackbird的HN蛋白比NDV-Dove拥有更强的促膜融合能力,而突变体中T522I没有影响,G54S、F110L、G116R和A469V具有不同程度的影响,其中F100L和G116R影响较大。通过western blotting检测F蛋白的裂解情况,发现F蛋白的裂解程度没有差异,说明HN突变体蛋白对F蛋白裂解的刺激程度没有差异。同时检测单独转染HN突变体质粒24 h后的HAd和NA活性,发现两株NDV HN蛋白的HAd和NA活性差异显着;5个突变对HAd活性具有不同程度的影响;F110L、G116R、A469V与T522I显着影响NA活性,G54S没有影响。以上结果表明,5个突变对HN蛋白的功能活性都有特定的影响,这两株NDV膜融合活性的差异可能正是与这些功能活性的变化有关,而与HN蛋白对F蛋白裂解的刺激无关。综上所述,我们发现HN蛋白对NDV的膜融合活性确实具有重要的影响,HN蛋白上5个突变可能使受体结合、神经氨酸酶与促膜融合活性在蛋白和病毒水平上达到了一种平衡状态,最终引起了两株NDV膜融合活性的差异。而L110、R116、V469与I522均为影响HN蛋白相应功能活性的关键氨基酸,这些都为后期NDV的致病性研究和减毒疫苗的研发提供了新的思路。
李旭锋[8]（2020）在《新城疫病毒HN蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类急性、高度接触性传染病,其主要临床表现为浆膜黏膜出血、呼吸困难、下痢及神经紊乱等。该病传播速度快、致死率高、接触传染性强、分布广泛,对全球家禽业造成了重大影响。尽管弱毒疫苗和灭活疫苗接种家禽是预防和控制新城疫最有效的方法,但全球商业家禽群中新城疫的不断暴发表明,常规疫苗接种不足以控制这种疾病。因此,需要研发更加安全、可靠的新城疫新型疫苗。HN蛋白是新城疫病毒的主要结构蛋白,是新城疫病毒免疫应答的主要靶点,具有良好的免疫原性,可诱导机体产生免疫应答,一直是新城疫亚单位疫苗的研究热点。毕赤酵母表达系统具有生长速度快、翻译后修饰、分泌表达、易于遗传操作等显着优势,是理想的外源蛋白表达体系。本研究我们选择毕赤酵母表达系统对HN蛋白进行表达,并以SPF鸡为试验动物,检测了 HN蛋白的免疫原性。主要进行以下几方面工作:1.HN重组蛋白的表达和鉴定为获得具有免疫原性的HN蛋白,本研究将优化的HN基因胞外区序列克隆入毕赤酵母表达载体pPICZaA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZaA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性克隆。对阳性菌液进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,结果表明HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达。通过对诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度和诱导培养基初始pH进行优化,探索最佳表达条件,Dot-blot检测结果表明,在28℃条件下,培养基初始pH为7.0,用0.5%甲醇诱导5天,HN蛋白的表达量最高。2.HN重组蛋白的纯化和活性鉴定通过镍柱亲和层析对HN重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE鉴定,镍柱一步纯化的HN重组蛋白纯度可达90%,经BCA试剂盒测定其表达量为25 mg/L。对纯化后HN重组蛋白进行活性鉴定,间接ELISA结果显示,HN重组蛋白能与NDV阳性血清特异性结合,表明其活性良好。利用去糖基化酶PNGase-F处理HN重组蛋白,结果显示HN重组蛋白存在糖基化修饰。3.HN重组蛋白的免疫效果评价将纯化的HN重组蛋白配合弗氏佐剂进行乳化后,免疫SPF鸡,免疫后每周采血检测血清中NDV抗体效价和血凝抑制抗体效价,且抗体效价分别最高达到212.4和26.2,表明HN重组蛋白可以刺激SPF鸡产生高水平的体液免疫应答。另外,检测了二免后21天鸡血清中IL-2和IFN-γ的含量,结果显示免疫后的SPF鸡产生了一定水平的细胞免疫应答。二免后第21天对免疫鸡进行攻毒,结果表明HN重组蛋白免疫组对SPF鸡的免疫保护率为70%,并能减少病毒对组织器官的损伤,具有成为ND亚单位疫苗的潜力。综上,本研究成功建立了NDVHN重组蛋白毕赤酵母高效表达体系,且获得了高纯度且活性较好的HN重组蛋白,免疫SPF鸡可对新城疫强毒攻击产生70%的保护。为后续新城疫亚单位疫苗的研发及新城疫检测试剂的研制奠定了一定基础。
林宇宁,张磊,梁莹,樊晓晖[9]（2020）在《新城疫病毒7793 HN蛋白在昆虫SF9细胞中的表达研究》文中进行了进一步梳理本实验对新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV） 7793 HN蛋白在杆状病毒表达系统中表达进行研究。提取病毒RNA并将其逆转录成cDNA,经PCR同义点突变在HN基因片段中加入NcoⅠ/XhoⅠ酶切位点,通过该酶切位点将HN基因克隆至穿梭载体p FastBac1质粒以构建重组质粒pFastBac1HTB-HN,然后用脂质体转染pFastBac1HTB-HN杆粒至昆虫SF9细胞。28℃无菌培养含pFastBac1HTB-HN杆粒的SF9细胞48 h,收集细胞培养上清液中的第一代病毒,感染SF9细胞,置28℃无菌培养60 h,收集细胞培养上清液,离心去除细胞碎片,取上清液中的第二代病毒,继续感染SF9细胞,置28℃无菌培养72 h,收集SF9细胞,用SDSPAGE和Western blotting验证HN蛋白的表达。SDS-PAGE和Western blotting均显示HN杆粒感染的SF9细胞成功表达了HN蛋白。本研究结果为进一步研究NDV7793-HN蛋白的抗肿瘤作用提供可靠试验依据。
董炳梅[10]（2019）在《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用》文中指出鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可在多种原代或传代细胞系上复制增殖,但不同毒株或亚型对宿主细胞均存在偏嗜性。为了筛选适于鸡新城疫（Newcastle disease,ND）疫苗生产的传代细胞系,本研究将我国ND疫苗株NDVⅠ系与Lasota株分别接种BHK-21、Vero、Hela、鸡肝癌细胞（LMH细胞）与DF-1细胞,通过对细胞病变的观察,结合对细胞培养物细胞半数感染量(Median cell culture infective dose,TCID50)和HA效价的测定,对比确定适于NDVⅠ系与Lasota株生长的传代细胞系。结果显示,NDVⅠ系与Lasota株在Vero、BHK-21、DF-1、Hela与LMH细胞上均可增殖,并引起典型的细胞病变,但不同毒株适应细胞的能力不同。较适于NDVⅠ系增殖的细胞系依次为Hela、BHK-21与DF-1细胞;较适于NDV Lasota株增殖的细胞系依次为Hela、LMH与BHK-21细胞。本研究证明了NDVⅠ系与Lasota株均可在LMH细胞上增殖,并产生典型的细胞病变,且LMH细胞更适于NDVⅠ系的增殖培养。NDV侵染细胞的第一步是病毒与细胞膜表面的唾液酸受体结合,NDV的唾液酸受体主要包括Neu5Ac-α-2,3Gal-β-1,4Glc（SAα2,3Gal）和Neu5Ac-2-S-α-2,6Gal10Me（SAα2,6Gal）,两种受体在宿主组织器官中的分布及表达丰度的不同对病毒的宿主范围和毒力等方面具有重要影响。为了在分子水平解释NDVⅠ系与Lasota株对不同细胞系的偏嗜性,本研究首先应用激光共聚焦显微镜对2种唾液酸受体在BHK-21等5种细胞上的分布进行了观察,结果显示,BHK-21、LMH、DF-1、Hela与Vero细胞内均存在TSA-R SAα2,6Gal与SAα2,3Gal,且主要分布于细胞膜与细胞质中;在细胞核部分,BHK-21细胞核有SAα2,3Gal受体分布,而DF-1细胞核中两种受体均有分布。其次,本研究应用流式细胞仪对5种细胞膜表面的两种唾液酸受体进行了定量分析,结果显示5种细胞表面SAα2,3Gal受体的含量显着高于SAα2,6Gal受体,提示5种细胞主要以SAα2,3Gal受体为主;按由多到少排列,SAα2,3Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、BHK-21、DF-1、LMH与Vero细胞;SAα2,6Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、LMH、BHK-21、Vero与DF-1细胞。结合NDVⅠ系与Lasota株在不同细胞上的增殖特性的比较,可判断NDVⅠ系更易与SAα2,3Gal受体结合,NDV Lasota株更易与SAα2,6Gal受体结合。NDV虽然可在多种细胞上增殖培养,但效价普遍较低,不能达到生产要求。NDV的两种唾液酸受体分别为SAα2,3Gal和SAα2,6Gal,而介导两种唾液酸受体形成的酶类分别是ST3Gal转移酶和ST6Gal转移酶,因此唾液酸转移酶对唾液酸受体在细胞表面的表达具有重要作用,而细胞表面受体表达丰度的高低对病毒入侵与增殖具有决定性作用。因此,为了提高NDV细胞培养效价及进一步确定不同唾液酸受体对NDV细胞培养的影响,本研究以PCI-neo为载体,在成功构建唾液酸转移酶PCI-neo-ST3与PCI-neo-ST6质粒的基础上,应用脂质体转染的方法将其分别转染BHK-21细胞,共获得22株BHK-ST3细胞与17株BHK-ST6细胞;进而将NDV Lasota株分别接种以上细胞,通过HA效价及TCID50的测定,分别获得了较适于NDV Lasota株增殖的BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞克隆株。流式细胞仪检测发现,BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞表面相应的唾液酸受体表达丰度均有显着提高,且BHK-ST6-15细胞较BHK-ST3-22细胞更适合于NDV Lasota株的增殖。为了提高NDV在BHK-ST6-15细胞株的增殖效价,本研究在对应用BHK-ST6-15贴壁细胞增殖培养NDV Lasota株的条件进行优化的基础上,一方面将BHK-ST6-15细胞进行低血清悬浮培养的驯化;另一方面对NDV Lasota株在悬浮培养的BHK-ST6-15细胞上增殖条件进行了优化。结果显示,成功实现了BHK-ST6-15细胞的低血清悬浮培养,应用该细胞增殖培养NDV Lasota株,其细胞培养液效价可达108.375 TCID50/0.1 mL,显着高于BHK-ST6-15贴壁细胞,从而为实现NDV Lasota株细胞悬浮培养产业化生产奠定了良好基础。我国家禽活疫苗的生产主要依靠接种SPF鸡胚制备而成,该工艺主要存在批次间稳定性差、家禽外源病毒污染的风险和鸡胚废弃物无害化处理等问题,因此,影响着家禽活疫苗的生产。为替代传统鸡胚生产工艺、提升产品质量与效益,本研究应用全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗,并根据《中华人民共和国兽药典》2015年版三部的要求对其进行检测。结果显示,NDV Lasota株活疫苗各项指标均符合要求,可完全替代传统鸡胚生产工艺。同时,该技术具有技术成熟、自动化程度高、安全性强、产品质量稳定等优点,且显着降低了生产成本、提高了经济效益,从而为全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗奠定了良好基础。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 NDV病原分子生物学研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)毒力因子 |
| 1.1.1 新城疫(Newcastle disease,ND)概述 |
| 1.1.2 NDV的分类及分子病原学 |
| 1.1.3 NDV的感染增殖 |
| 1.1.4 NDV表型及遗传多样性 |
| 1.1.5 NDV的毒力 |
| 1.2 NDV反向遗传操作技术简介 |
| 1.3 NDV疫苗研究进展 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 两株毒力差异较大的同源NDV毒株的生物学特性比较 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、实验动物和毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的纯化 |
| 2.2.2 病毒致病指数 |
| 2.2.3 蚀斑形成试验及病毒滴度测定 |
| 2.2.4 病毒在细胞上的增殖规律 |
| 2.2.5 动物试验 |
| 2.2.6 病毒核酸提取及反转录 |
| 2.2.7 病毒基因组序列的测定 |
| 2.2.8 序列的拼接及比对分析 |
| 2.2.9 遗传进化分析 |
| 2.2.10 蛋白3D结构预测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的致病指数 |
| 2.3.2 病毒的生物学特性 |
| 2.3.3 病毒对4周龄SPF鸡的致病性试验 |
| 2.3.4 病毒基因组特征及差异氨基酸位点的突变频率 |
| 2.3.5 遗传进化分析 |
| 2.3.6 NDV HN和L蛋白结构模型 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 基因Ⅵ型NDV CE16株反向遗传操作系统的构建及评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒、质粒载体和单抗 |
| 3.1.2 SPF 鸡和SPF 鸡胚 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成及次基因片段的扩增与测序 |
| 3.2.2 CE16株全基因组cDNA克隆质粒的构建 |
| 3.2.3 辅助质粒的构建 |
| 3.2.4 辅助质粒的功能性验证 |
| 3.2.5 rCE16的拯救 |
| 3.2.6 间接免疫荧光鉴定rCE16的增殖 |
| 3.2.7 rCE16与CE16增殖特性及形成合胞体能力的比较 |
| 3.2.8 rCE16致病性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 分段扩增CE16全基因组序列的PCR结果 |
| 3.3.2 p BR322-CE16质粒的构建 |
| 3.3.3 辅助质粒序列的PCR及酶切鉴定结果 |
| 3.3.4 利用微基因组系统验证辅助质粒 |
| 3.3.5 rCE16在基因水平的验证 |
| 3.3.6 rCE16的间接免疫荧光结果 |
| 3.3.7 rCE16与CE16在细胞中产生的膜融合特性及增殖动力学比较 |
| 3.3.8 rCE16与CE16的毒力分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 利用反向遗传操作技术鉴定HN蛋白新毒力位点 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 主要试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 质粒的构建 |
| 4.2.2 间接免疫荧光技术验证HN蛋白的表达 |
| 4.2.3 HN蛋白的生物学活性检测 |
| 4.2.4 pBR322-CE16-HNA430T的构建 |
| 4.2.5 rCE16-HNA430T的拯救及鉴定 |
| 4.2.6 rCE16-HNA430T和rCE16生物学活性比较 |
| 4.2.7 rCE16-HNA430T和rCE16的致病性比较 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 质粒的表达鉴定 |
| 4.3.2 HN蛋白的生物学活性分析 |
| 4.3.3 拯救毒株在基因水平的验证及遗传稳定性评价 |
| 4.3.4 病毒的生物学特性分析 |
| 4.3.5 病毒的致病指数 |
| 4.3.6 病毒对4周龄SPF鸡的致病性试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 利用反向遗传操作技术构建基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒、质粒载体和单抗 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 主要试剂配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 pBR322-CE16-La(Fcs)全长cDNA质粒的构建 |
| 5.2.2 rCE16-La(Fcs)的拯救及鉴定 |
| 5.2.3 rCE16-La(Fcs)的致病性和病毒滴度测定 |
| 5.2.4 rCE16-La(Fcs)的Fcs序列测定和遗传稳定性分析 |
| 5.2.5 rCE16-La(Fcs)在鸽子上的免疫效果评价 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 病毒的拯救 |
| 5.3.2 rCE16-La(Fcs)的毒力测定 |
| 5.3.3 rCE16-La(Fcs)的Fcs序列的鉴定以及传代稳定性评价 |
| 5.3.4 血清中抗体水平研究 |
| 5.3.5 rCE16-La(Fcs)对PPMV-1/SX-01/15攻毒鸽子后的保护效率 |
| 5.3.6 强毒株攻毒后的排毒情况 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.主要试剂 |
| 2.主要仪器 |
| 3.主要溶液的配制 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 病毒、载体和细胞 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒RNA的提取和RT-PCR扩增目的片段 |
| 1.2.2 p FB-t TS/HN2质粒的构建 |
| 1.2.3 重组杆状病毒基因组p Ac-t TS/HN2的构建 |
| 1.2.4 重组杆状病毒r Ac-TS/HN2的拯救 |
| 1.2.5 间接免疫荧光试验（IFA) |
| 1.2.6 SDS-PAGE和Western blotting鉴定外源蛋白的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的片段的扩增结果 |
| 2.2 p FB-t TS/HN2质粒的构建结果 |
| 2.3 重组杆状病毒基因组p Ac-t TS/HN2的构建及鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒r Ac-t TS/HN2的拯救及滴度测定结果 |
| 2.5 间接免疫荧光（IFA）鉴定结果 |
| 2.6 SDS-PAGE和Western blotting鉴定外源蛋白的表达结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 HN蛋白表达设计和重组杆状病毒构建 |
| 3.2 HN蛋白的表达鉴定 |
| 4 结论 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 新城疫病毒的发现 |
| 1.1.2 新城疫病毒的理化性质与基因组结构 |
| 1.1.3 新城疫病毒的类型 |
| 1.1.4 新城疫病毒的致病性与感染后临床症状 |
| 1.2 新城疫病毒检测技术 |
| 1.2.1 血清学检测 |
| 1.2.2 分子生物学技术检测 |
| 1.3 新城疫病毒疫苗主要类型 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 载体疫苗 |
| 1.3.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3.4 纳米粒子递送疫苗 |
| 1.3.5 生物佐剂疫苗 |
| 1.4 酿酒酵母表达系统 |
| 1.4.1 酿酒酵母表面展示表达系统 |
| 1.4.2 酿酒酵母表达系统的特点及应用 |
| 1.5 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 目的和意义 |
| 第2章 新城疫病毒F与HN基因酿酒酵母表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验用毒株、质粒及引物 |
| 2.2.2 实验用主要试剂 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.3.2 新城疫病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 目的基因的扩增与克隆 |
| 2.3.5 目的片段纯化回收 |
| 2.3.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 |
| 2.3.7 PCR回收产物的酶切及与载体的连接 |
| 2.3.8 连接产物的转化与鉴定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.4.2 新城疫病毒F与HN基因的克隆 |
| 2.4.3 重组质粒验证 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 新城疫病毒F与HN蛋白片段在酿酒酵母表面的表达及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验用酵母质粒、引物和菌株 |
| 3.2.2 实验用主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液和培养基配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PCR反应体系 |
| 3.3.2 酶切构建转化体系 |
| 3.3.3 酵母转化 |
| 3.3.4 酵母基因组提取 |
| 3.3.5 Western blot鉴定 |
| 3.3.6 F与HN蛋白片段酿酒酵母表面展示菌株生长曲线 |
| 3.3.7 免疫荧光 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 酵母转化构建NDV F和 HN蛋白片段表面展示菌株 |
| 3.4.2 重组菌株验证 |
| 3.4.3 新城疫病毒F与HN蛋白酿酒酵母表面展示菌株的生长曲线 |
| 3.4.4 新城疫病毒F与HN蛋白的表达鉴定 |
| 3.4.5 蛋白表达免疫荧光结果 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 新城疫病毒F/HN酿酒酵母表面展示疫苗免疫效果评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用主要试剂 |
| 4.2.2 主要溶液和培养基配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 原核表达载体构建 |
| 4.3.2 蛋白纯化 |
| 4.3.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 新城疫病毒HN蛋白原核表达载体构建 |
| 4.4.2 新城疫病毒HN原核蛋白的纯化 |
| 4.4.3 新城疫病毒血清抗体的ELISA检测 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 人副流感病毒3型F蛋白HRB连接区结构与功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅡ连接区结构与功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第三部分 新城疫病毒F蛋白HRB连接区关键氨基酸定位及功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 创新与不足 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 新城疫病毒简介 |
| 1.1.2 新城疫病毒基因组结构和编码蛋白的主要功能 |
| 1.2 病毒入侵细胞机制研究进展 |
| 1.2.1 网格蛋白介导的病毒入侵 |
| 1.2.2 小窝蛋白介导的病毒入侵 |
| 1.2.3 巨胞饮和其他内吞作用介导的病毒入侵 |
| 1.2.4 Rab蛋白在病毒入侵细胞中的作用 |
| 1.3 副黏病毒入侵细胞的机制 |
| 1.4 NDV入侵细胞的机制 |
| 1.5 病毒感染巨噬细胞的意义 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 NDV进入HD11 细胞依赖动力蛋白 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 Dynasore和 chlorpromazine处理对NDV吸附的影响 |
| 2.2.2 Dynasore和 chlorpromazine处理对NDV进入的影响 |
| 2.2.3 Dynasore和 chlorpromazine处理对NDV复制的影响 |
| 2.2.4 Tfn的摄取和NDV感染试验 |
| 2.2.5 过表达dynamin和 EPS15 功能突变体对NDV感染的影响 |
| 2.2.6 siRNA介导的dynaminⅡ蛋白敲低及效果检测 |
| 2.2.7 敲低dynamin II和 clathrin heavy chain表达对NDV进入和复制的影响 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 NDV感染HD11 细胞依赖于dynamin |
| 2.3.2 NDV感染HD11 细胞不依赖于clathrin介导的内吞作用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 NDV通过依赖胆固醇和小窝蛋白的内吞作用进入HD11 细胞 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 病毒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 MβCD,nystatin和 PMA处理对NDV吸附的影响 |
| 3.2.2 MβCD,nystatin和 PMA处理对NDV进入的影响 |
| 3.2.3 MβCD,nystatin和 PMA处理对NDV复制的影响 |
| 3.2.4 CTB的摄取和NDV感染试验 |
| 3.2.5 过表达caveolin-1 功能突变体对NDV感染的影响 |
| 3.2.6 siRNA介导的caveolin-1 蛋白敲低及效果检测 |
| 3.2.7 敲低caveolin-1 蛋白对NDV进入细胞和复制的影响 |
| 3.2.8 NDV与 caveolin-1 在细胞中的共定位检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 NDV进入HD11 细胞依赖于胆固醇 |
| 3.3.2 PMA抑制NDV进入HD11 细胞 |
| 3.3.3 MβCD,nystatin和 PMA抑制 NDV在 HD11 细胞中的复制 |
| 3.3.4 NDV通过caveolin-1 介导的内吞途径进入HD11 细胞 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 NDV进入HD11 细胞不依赖巨胞饮作用 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 病毒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 EIPA和 wortmannin处理对NDV吸附的影响 |
| 4.2.2 EIPA和 wortmannin处理对NDV进入的影响 |
| 4.2.3 EIPA和 wortmannin处理对NDV复制的影响 |
| 4.3 试验结果 |
| EIPA和 Wortmannin不影响NDV在 HD11 细胞中的吸附,进入和复制 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 Rab5 蛋白和内体在NDV感染巨噬细胞中的作用 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 病毒和细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 过表达Rab5、Rab7 及其突变体对Tfn摄取的影响 |
| 5.2.2 过表达Rab5、Rab7 及其突变体对NDV感染的影响 |
| 5.2.3 siRNA介导的Rab5和Rab7 蛋白敲低及效果检测 |
| 5.2.4 敲低Rab5和Rab7 表达对NDV进入和复制的影响 |
| 5.2.5 NDV与 Rab5和Rab7 的共定位分析 |
| 5.2.6 NDV与早期内体和晚期内体的定位分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 过表达Rab5 突变体抑制Tfn的摄取和NDV的感染 |
| 5.3.2 过表达Rab7 突变体抑制Tfn的摄取但不影响NDV的感染 |
| 5.3.3 敲低Rab5 的表达抑制 NDV的进入和复制 |
| 5.3.4 NDV与 Rab5 存在共定位分布 |
| 5.3.5 NDV定位于早期内体 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 HN蛋白site II在 NDV通过内吞途径进入HD11 细胞中的作用 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 病毒,细胞和鸡胚 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 NDV F48E9 全长c DNA的构建 |
| 6.2.2 HN基因突变全长c DNA的构建 |
| 6.2.3 病毒的拯救及生物学特性鉴定 |
| 6.2.4 Caveolin-1 介导的内吞通路抑制剂对r F48E9和r F48E9-516A复制的影响 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 拯救病毒r F48E9和r F48E9-516A的鉴定及生物学特性 |
| 6.3.2 HN蛋白的第二个受体结合位点不参与NDV通过内吞途径进入HD11 细胞中的过程 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 毒株和细胞类型对NDV通过内吞通路入侵的影响 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 病毒和细胞 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 Caveolin-1 介导的内吞通路抑制剂对不同NDV毒株在HD11 细胞中复制的影响 |
| 7.2.2 内吞通路抑制剂对NDV在鸡原代巨噬细胞中复制的影响 |
| 7.2.3 内吞通路抑制剂对NDV在 DF-1和LMH细胞中复制的影响 |
| 7.3 试验结果 |
| 7.3.1 NDV进入HD11 细胞的内吞方式无毒株特异性 |
| 7.3.2 NDV通过caveolin-1 介导的内吞通路进入鸡原代巨噬细胞 |
| 7.3.3 NDV采用不同的方式入侵不同的细胞 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒HN蛋白抗原表位及V蛋白功能 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.2 HN蛋白的结构与功能 |
| 1.2.1 HN蛋白的结构 |
| 1.2.2 HN蛋白的功能 |
| 1.3 抗原表位概述 |
| 1.3.1 抗原表位概念及分类 |
| 1.3.2 B细胞线性抗原表位的鉴定方法 |
| 1.3.3 抗原表位的应用 |
| 1.4 V蛋白的结构与功能 |
| 1.4.0 V蛋白的结构 |
| 1.4.1 V蛋白的功能 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 新城疫病毒疫苗株LaSota HN蛋白B细胞优势抗原表位的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞、载体和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 La Sota疫苗株全病毒鸡超免抗血清的制备 |
| 2.2.2 HN蛋白肽扫描 |
| 2.2.3 HN蛋白B细胞优势抗原表位的鉴定 |
| 2.2.4 HN蛋白优势抗原表位抗原性和免疫原性的鉴定 |
| 2.2.5 HN蛋白优势抗原表位的特性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HN抗原表位肽扫描 |
| 2.3.2 HN蛋白B细胞优势抗原表位的鉴定 |
| 2.3.3 HN优势抗原表位抗原性和免疫原性的鉴定 |
| 2.3.4 HN蛋白IDE抗血清对NDV的作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 La Sota疫苗株V蛋白CTD单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、细胞、载体和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 新城疫病毒V-CTD的原核表达 |
| 3.2.2 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.3 单克隆抗体特性的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 V-CTD蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.3.2 单抗细胞的筛选与鉴定 |
| 3.3.3 单抗的特性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒研究概述 |
| 1.1.1 病毒的结构 |
| 1.1.2 病毒的分类 |
| 1.1.3 病毒的蛋白及其主要功能 |
| 1.2 新城疫病毒的膜融合机制 |
| 1.3 新城疫病毒的复制与转录 |
| 1.3.1 病毒的吸附与侵入 |
| 1.3.2 病毒的转录与复制 |
| 1.3.3 子代病毒的组装与出芽 |
| 1.4 新城疫病毒HN蛋白研究进展 |
| 1.4.1 HN蛋白的结构 |
| 1.4.2 HN蛋白的功能 |
| 1.4.3 HN蛋白对毒力和膜融合机制的影响 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 两株NDV生物特性分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 SPF鸡胚 |
| 2.1.2 细胞与毒株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器及常用试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的蚀斑纯化 |
| 2.2.2 病毒的扩增 |
| 2.2.3 病毒滴度测定 |
| 2.2.4 病毒的增殖规律测定 |
| 2.2.5 膜融合指数定性和定量分析 |
| 2.2.6 受体结合活性定性和定量分析 |
| 2.2.7 神经氨酸酶活性分析 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 蚀斑纯化 |
| 2.3.2 膜融合指数测定 |
| 2.3.3 病毒的增殖规律测定 |
| 2.3.4 受体结合活性定性和定量分析 |
| 2.3.5 神经氨酸酶活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 HN突变体蛋白生物特性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 数据材料 |
| 3.1.2 统计分析软件 |
| 3.1.3 细胞、载体与菌株 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器及常用试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 五个氨基酸位点的位置确定 |
| 3.2.2 五个位点氨基酸种类的保守性分析 |
| 3.2.3 引物设计与合成 |
| 3.2.4 HN、F基因真核表达载体构建 |
| 3.2.5 HN突变体真核表达载体构建 |
| 3.2.6 HN突变体蛋白促融合活性定性和定量分析 |
| 3.2.7 Western blotting检测HN突变体与F蛋白表达 |
| 3.2.8 HN突变体蛋白受体结合活性定性和定量分析 |
| 3.2.9 HN突变体蛋白神经氨酸酶活性分析 |
| 3.2.10 IIFA试验定性检测HN突变体蛋白表达 |
| 3.2.11 FCM试验定量检测HN突变体蛋白表达效率 |
| 3.2.12 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 五个差异氨基酸统计及位置展示 |
| 3.3.2 五个位点氨基酸种类的保守性分析 |
| 3.3.3 HN、F基因真核表达载体构建 |
| 3.3.4 HN突变体真核表达载体构建 |
| 3.3.5 HN突变体蛋白表达效率分析 |
| 3.3.6 HN突变体蛋白促融合活性分析 |
| 3.3.7 Western blotting检测HN突变体与F蛋白表达 |
| 3.3.8 HN突变体蛋白受体结合活性定性和定量分析 |
| 3.3.9 HN突变体蛋白神经氨酸酶活性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 新城疫的概述 |
| 1.1.1 新城疫的发现及流行 |
| 1.1.2 新城疫的临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 新城疫的诊断与检测 |
| 1.2 新城疫病毒的研究进展 |
| 1.2.1 新城疫病毒的分子病原学特征 |
| 1.2.2 新城疫病毒的基因组结构 |
| 1.2.3 新城疫病毒编码的结构蛋白 |
| 1.2.4 新城疫病毒的感染机制 |
| 1.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 新型疫苗 |
| 1.3.3 问题和展望 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达体系简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达体系的优势 |
| 1.4.3 毕赤酵母在重组亚单位疫苗研制中的应用 |
| 1.5 目的和意义 |
| 第二章 新城疫病毒HN蛋白的表达和鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 质粒和菌株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.2 重组载体的转化与鉴定 |
| 2.3.3 HN重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 2.3.4 诱导条件优化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 2.4.2 HN重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.4.3 诱导条件优化 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 新城疫病毒HN蛋白的纯化及其免疫效果评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.2.4 试验动物 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 HN重组蛋白的纯化 |
| 3.3.2 HN重组蛋白的活性鉴定 |
| 3.3.3 HN重组蛋白的糖基化分析 |
| 3.3.4 动物免疫试验 |
| 3.3.5 攻毒保护试验 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 HN重组蛋白的纯化 |
| 3.4.2 HN重组蛋白的活性鉴定 |
| 3.4.3 HN重组蛋白的糖基化分析 |
| 3.4.4 免疫效果评价 |
| 3.4.5 攻毒保护效果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 1 结果与分析 |
| 1.1 PCR检测HN基因片段点突变 |
| 1.2 pFastBac1HTB-HN的构建 |
| 1.3 表达的目的蛋白检测 |
| 1.4 Western blotting鉴定 |
| 2 讨论 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 病毒株、鸡胚和细胞 |
| 3.2 工具酶和主要试剂 |
| 3.3 引物设计与合成 |
| 3.4 目的基因的突变 |
| 3.5 目的基因的扩增 |
| 3.6 重组质粒pFastBac1HTB-HN的构建 |
| 3.7 重组杆粒pFastBac1 HTB-HN的鉴定 |
| 3.8 NDV7793-HN的真核表达 |
| 3.9 Western blotting鉴定目的蛋白 |
| 作者贡献 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 副黏病毒概述 |
| 1.2 NDV的病原学概述 |
| 1.3 NDV分子生物学特性 |
| 1.4 NDV在宿主细胞内的复制增殖 |
| 第二章 新城疫病毒受体研究进展 |
| 2.1 病毒受体特性 |
| 2.2 NDV的唾液酸受体 |
| 2.3 与唾液酸受体相关的酶类 |
| 2.4 影响NDV与受体结合的因素 |
| 2.5 NDV唾液酸受体的分布 |
| 2.6 NDV培养特性 |
| 第三章 新城疫疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗--基因工程疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 不同细胞系培养NDV特性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 唾液酸受体SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal在不同细胞系表达的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达唾液酸转移酶细胞株的建立与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV Lasota株在BHK-ST6-15 细胞上培养条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BHK-ST6-15 全悬浮细胞培养的NDV Lasota株活疫苗的试验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
