百度学术可以找到参考文献,输入关键词，在输入年份，就能找到相对应的参考文献。如果不知道参考文献格式要求，可以百度搜，参考文献自动生成器。直接按着填就出来了。百度搜索参考文献自动生成器，按着里面填，点生成参考文献就出来了。作者.题名[D].所在城市:保存单位,发布年份.李琳.住院烧伤患者综合健康状况及其影响因素研究[D].福州:福建医科大学,2009.其他的：作者.题名[J].刊名,年,卷(期):起止页码.沈平,彭湘粤,黎晓静,等.临床路径应用于婴幼儿呼吸道异物手术后的效果[J].中华护理杂志,2012,47(10):930-932.作者.书名[M]. 版次.出版地: 出版者,出版年:起止页码.胡雁.护理研究[M].第4版.北京:人民卫生出版社,2012:38.作者.题名[N].报纸名,出版日期(版次).丁文祥.数字革命与国际竞争[N].中国青年报,2000-11-20(15).作者.题名[EB/OL].网址,发表日期/引用日期(任选).世界卫生组织.关于患者安全的10个事实 [EB/OL].其他： [R]、[P]、[A]、[C]、[Z]等。 1、论文题目：要求准确、简练、醒目、新颖。 2、目录：目录是论文中主要段落的简表。（短篇论文不必列目录） 3、提要：是文章主要内容的摘录，要求短、精、完整。字数少可几十字，多不超过三百字为宜。 4、关键词或主题词：关键词是从论文的题名、提要和正文中选取出来的，是对表述论文的中心内容有实质意义的词汇。关键词是用作机系统标引论文内容特征的词语，便于信息系统汇集，以供读者检索。 每篇论文一般选取3-8个词汇作为关键词，另起一行，排在“提要”的左下方。 主题词是经过规范化的词，在确定主题词时，要对论文进行主题，依照标引和组配规则转换成主题词表中的规范词语。 5、论文正文： （1）引言：引言又称前言、序言和导言，用在论文的开头。 引言一般要概括地写出作者意图，说明选题的目的和意义, 并指出论文写作的范围。引言要短小精悍、紧扣主题。 〈2）论文正文：正文是论文的主体，正文应包括论点、论据、 论证过程和结论。主体部分包括以下内容： a.提出-论点； b.分析问题-论据和论证； c.解决问题-论证与步骤； d.结论。 6、一篇论文的参考文献是将论文在和写作中可参考或引证的主要文献资料，列于论文的末尾。参考文献应另起一页，标注方式按《GB7714-87文后参考文献著录规则》进行。 中文：标题--作者--出版物信息（版地、版者、版期）：作者--标题--出版物信息 所列参考文献的要求是： （1）所列参考文献应是正式出版物，以便读者考证。 （2）所列举的参考文献要标明序号、著作或文章的标题、作者、出版物信息。本回答由提问者推荐
一、文献综述概述 文献综述是研究者在其提前阅读过某一主题的文献后，经过理解、整理、融会贯通，综合分析和评价而组成的一种不同于研究论文的文体。综述的目的是反映某一课题的新水平、新动态、新技术和新发现。从其历史到现状，存在问题以及发展趋势等，都要进行全面的介绍和评论。在此基础上提出自己的见解，预测技术的发展趋势，为选题和开题奠定良好的基础。 好的文献综述，不但可以为下一步的学位论文写作奠定一个坚实的理论基础和提供某种延伸的契机，而且能表明写作者对既有研究文献的归纳分析和梳理整合的综合能力，从而有助于提高对学位论文水平的总体评价。（摘自《应用写作》杂志2004年12期，《怎样撰写硕士学位论文的文献综述》） 二、文献综述的格式 文献综述的格式与一般研究性论文的格式有所不同。这是因为研究性的论文注重研究的方法和结果，而文献综述介绍与主题有关的详细资料、动态、进展、展望以及对以上方面的评述。因此文献综述的格式相对多样，但总的来说，一般都包含以下四部分：即前言、主题、总结和参考文献。撰写文献综述时可按这四部分拟写提纲，再根据提纲进行撰写工作。 前言部分，主要是说明写作的目的，介绍有关的概念及定义以及综述的范围，扼要说明有关主题的现状或争论焦点，使读者对全文要叙述的问题有一个初步的轮廓。 主题部分，是综述的主体，其写法多样，没有固定的格式。可按年代顺序综述，也可按不同的问题进行综述，还可按不同的观点进行比较综述，不管用那一种格式综述，都要将所搜集到的文献资料归纳、整理及分析比较，阐明有关主题的历史背景、现状和发展方向，以及对这些问题的评述，主题部分应特别注意代表性强、具有科学性和创造性的文献引用和评述。 总结部分，与研究性论文的小结有些类似，将全文主题进行扼要总结，提出自己的见解并对进一步的发展方向做出预测。 参考文献，因为它不仅表示对被引用文献作者的尊重及引用文献的依据，而且也为评审者审查提供查找线索。参考文献的编排应条目清楚，查找方便，内容准确无误。关于参考文献的使用方法，录著项目及格式与研究论文相同，不再重复。 三、文献综述规定 1. 为了使选题报告有较充分的依据，要求硕士研究生在论文开题之前作文献综述。 2. 在文献综述时，研究生应系统地查阅与自己的研究方向有关的国内外文献。通常阅读文献不少于30篇 3. 在文献综述中，研究生应说明自己研究方向的发展历史，前人的主要研究成果，存在的问题及发展趋势等。 4. 文献综述要条理清晰，文字通顺简练。 5. 资料运用恰当、合理。文献引用用方括号"[ ]"括起来置于引用词的右上角。 6. 文献综述中要有自己的观点和见解。鼓励研究生多发现问题、多提出问题、并指出分析、解决问题的可能途径。 7. 文献综述不少于3000字。 四、注意事项 ⒈ 搜集文献应尽量全。掌握全面、大量的文献资料是写好综述的前提，否则，随便搜集一点资料就动手撰写是不可能写出好的综述。 ⒉ 注意引用文献的代表性、可靠性和科学性。在搜集到的文献中可能出现观点雷同，有的文献在可靠性及科学性方面存在着差异，因此在引用文献时应注意选用代表性、可靠性和科学性较好的文献。 ⒊ 引用文献要忠实文献内容。由于文献综述有作者自己的评论分析，因此在撰写时应分清作者的观点和文献的内容，不能篡改文献的内容。 ⒋ 参考文献不能省略。有的科研论文可以将参考文献省略，但文献综述绝对不能省略，而且应是文中引用过的，能反映主题全貌的并且是作者直接阅读过的文献资料。 参考文献是在学术研究过程中,对某一著作或论文的整体的参考或借鉴.征引过的文献在注释中已注明,不再出现于文后参考文献中. (1)文后参考文献不编序号,仅在文末按其重要程度或参考的先后顺序排列. (2)文后参考文献不注页码. (3)文后参考文献的著录项目及次序与注释基本相同.如: 【参考文献】： [1]慕亚平：《当代国际法原理》，中国科学文化出版社2003年版； [2]李红云：《人道主义干涉的发展与联合国》，载于《北大国际法与比较法评论》第一卷; [3]程晓霞：《国际法》，中国人民大学出版社1999年版; [4]李勇：《15万篇免费论文网》，/13/4/20071231/34302.html1.文献综述就是要用概括的话，把论文内容综合地写出来。相当于浓缩的论文。有了综述，看稿人就可以不用看原稿，直接看综述。这对于一些时间很紧张的人来说，比如参加评审的教授，很方便了。2.参考文献就是写在论文后面的，把在论文中参考过的那些书以及作者都写上。3.别人的论文中总有好多批注，然后在每页的下面写上一些东西，这叫脚注。把一些需要另外说明的，容易引起起义的东西说明白。本回答被提问者采纳
表示该文献在杂志的第15卷第11期。杂志是按时间段出版的，VOL15(11)给出了该期杂志的出版时间。本回答由网友推荐
1、论文题目：要求准确、简练、醒目、新颖。 2、目录：目录是论文中主要段落的简表。（短篇论文不必列目录） 3、提要：是文章主要内容的摘录，要求短、精、完整。字数少可几十字，多不超过三百字为宜。 4、关键词或主题词：关键词是从论文的题名、提要和正文中选取出来的，是对表述论文的中心内容有实质意义的词汇。关键词是用作机系统标引论文内容特征的词语，便于信息系统汇集，以供读者检索。 每篇论文一般选取3-8个词汇作为关键词，另起一行，排在“提要”的左下方。 主题词是经过规范化的词，在确定主题词时，要对论文进行主题，依照标引和组配规则转换成主题词表中的规范词语。 5、论文正文： （1）引言：引言又称前言、序言和导言，用在论文的开头。 引言一般要概括地写出作者意图，说明选题的目的和意义, 并指出论文写作的范围。引言要短小精悍、紧扣主题。 〈2）论文正文：正文是论文的主体，正文应包括论点、论据、 论证过程和结论。主体部分包括以下内容： a.提出-论点； b.分析问题-论据和论证； c.解决问题-论证与步骤； d.结论。 6、一篇论文的参考文献是将论文在和写作中可参考或引证的主要文献资料，列于论文的末尾。参考文献应另起一页，标注方式按《GB7714-87文后参考文献著录规则》进行。 中文：标题--作者--出版物信息（版地、版者、版期）：作者--标题--出版物信息所列参考文献的要求是： （1）所列参考文献应是正式出版物，以便读者考证。 （2）所列举的参考文献要标明序号、著作或文章的标题、作者、出版物信息。本回答由网友推荐你好你大约多少个字？ 自己构思。首先要确定课题，然后搜集资料、文献，再列出论文框架，就可以动手写作了。要么直接找人写，去哪【 天 下 文 库 】 看下，我去年的论文是在那写的，还不错。什么时候要？需要写开题报告吗？我帮助你是培养和造就适应建设现代化文明监狱、文明劳教所所需要的专门人才，适应监狱、劳教管理和生产第一线需要的政治素质高、组织纪律严明和专业知识扎实，技能过硬的人民警察的一门专业课程。论文摘要是全文的精华，是对一项科学研究工作或技术实践的总结，对研究目的、方法和研究结果的概括。 摘要置于主体部分之前，目的是让读者首先了解一下论文的内容，以便决定是否阅读全文。一般来说，这种摘要在全文完成之后写。字数限制在200～350字之间。内容包括研究目的、研究方法、研究结果和主要结论。也就是说，摘要必须回答“研究什么”、“怎么研究”、“得到了什么结果”、“结果说明了什么”等问题。 简短精炼是学术期刊论文摘要的主要特点。只需简明扼要地将研究目的、方法、结果和结论分别用1～2句话加以概括即可。 论文摘要又称文摘，是论文的重要组成部分，它是以提供文献内容梗概为日的，不加评论和补充解释，简明、确切地记述文献重要内容的短文。摘要应具有独立性和自明性，并拥有与文献同等量的主要信息，即不需阅读全文，就可获得重要的信息。摘要通常置于文题之后，文章之首。在论文发表后，论文摘要常被文献检索系统所收集。 摘要由目的、方法、结果和结论四部分组成。目的部分应简要说明研究的目的，说明提出问题的缘由，表明研究的范围及重要性；方法部分应说明研究课题的基本设计，使用了什么材料和方法，如何分组对照，研究范围以及精确程度，数据是如何取得的以及经过何种统计学方法处理；结果部分要列出研究的主要结果和数据，有什么新发现，说明其价值及局限，叙述要具体、准确，并需给出结果的可信值和统计学显著性检验的确切值；结论部分应简要说明、论证取得的正确观点极其理论价值或应用价值，是否值得推荐或推广等。追问
大概四千左右吧，我就是缺少文献资料撒，20天之后要，我不想要那种网上有的会重复的给您，搞 定，成的，哦，。 给你
百度学术可以找到参考文献,输入关键词，在输入年份，就能找到相对应的参考文献。如果不知道参考文献格式要求，可以百度搜，参考文献自动生成器。直接按着填就出来了。 百度搜索参考文献自动生成器，按着里面填，点生成参考文献就出来了。 参考文献标准格式参考文献类型：专著［M］，论文集［C］，报纸文章［N］，期刊文章［J］，学位论文［D］，报告［R］，标准［S］，专利［P］，论文集中的析出文献［A］电子文献类型：数据库［DB］，计算机［CP］，电子公告［EB］电子文献的载体类型：互联网［OL］，光盘［CD］，磁带［MT］，磁盘［DK］A：专著、论文集、学位论文、报告［序号］主要责任者.文献题名［文献类型标识］.出版地：出版者，出版年.起止页码（可选）［1］刘国钧，陈绍业.图书馆目录［M］.北京：高等教育出版社，1957.15-18.B:期刊文章［序号］主要责任者.文献题名［J］.刊名，年，卷（期）：起止页码［1］何龄修.读南明史［J］.中国史研究，1998,(3):167-173.［2］OU J P，SOONG T T，et al.Recent advance in research on applications of passive energy dissipation systems［J］.Earthquack Eng,1997,38(3):358-361.C:论文集中的析出文献［序号］析出文献主要责任者.析出文献题名［A］.原文献主要责任者（可选）.原文献题名［C］.出版地：出版者，出版年.起止页码［7］钟文发.非线性规划在可燃毒物配置中的应用［A］.赵炜.运筹学的理论与应用——中国运筹学会第五届大会论文集［C］.西安：西安电子科技大学出版社，1996.468.D：报纸文章［序号］主要责任者.文献题名［N］.报纸名，出版日期（版次）［8］谢希德.创造学习的新思路［N］.人民日报，1998-12-25（10）.E：电子文献[文献类型/载体类型标识]：[J/OL]网上期刊、[EB/OL]网上电子公告、[M/CD]光盘图书、[DB/OL]网上数据库、[DB/MT]磁带数据库［序号］主要责任者.电子文献题名［电子文献及载体类型标识］.电子文献的出版或获得地址，发表更新日期/引用日期［12］王明亮.关于中国学术期刊标准化数据库系统工程的进展［8］万锦.中国大学学报文摘（1983-1993）.英文版［DB/CD］.北京：中国大百科全书出版社，1996.作者.题名[D].所在城市:保存单位,发布年份.李琳.住院烧伤患者综合健康状况及其影响因素研究[D].福州:福建医科大学,2009. 其他的：作者.题名[J].刊名,年,卷(期):起止页码.沈平,彭湘粤,黎晓静,等.临床路径应用于婴幼儿呼吸道异物手术后的效果[J].中华护理杂志,2012,47(10):930-932. 作者.书名[M]. 版次.出版地: 出版者,出版年:起止页码.胡雁.护理研究[M].第4版.北京:人民卫生出版社,2012:38. 作者.题名[N].报纸名,出版日期(版次).丁文祥.数字革命与国际竞争[N].中国青年报,2000-11-20(15). 作者.题名[EB/OL].网址,发表日期/引用日期(任选).世界卫生组织.关于患者安全的10个事实 [EB/OL].其他： [R]、[P]、[A]、[C]、[Z]等。本回答由网友推荐要哪个方面的呢？
牛瘤胃积食也叫急性瘤胃扩张，是由于瘤胃内积滞过多的粗饲料，引起胃体积增大，瘤胃壁扩张，瘤胃正常的消化和运动机能紊乱的疾病，触诊坚硬，瘤胃蠕动音减弱或消失，下面我们就一起来看一看牛瘤胃积食的防治方法吧！牛瘤胃积食的症状牛发病初期，食欲、反刍、嗳气减少或停止，鼻镜下燥，表现为拱腰、回头顾腹、后肚踢腹、摇尾、卧立不安。触诊时瘤胃胀满而坚实呈现砂袋样，并有痛感。叩诊呈浊音。听诊瘤胃蠕动音初减弱，以后消失。严重时呼吸困难、呻吟、吐粪水，有时从鼻腔流出。加不及时治疗，多因脱水、中毒、衰竭或窒息而死广。牛瘤胃积食的病因1、过多采食容易膨胀的饲料，如豆类、谷物等。2、采食大量未经铡断的半干不湿的甘薯秧、花生秧、豆秸等。3、突然更换饲料，特别是由粗饲料换为精饲料又不限量寸，易致发本病。4、因体弱、消化力不强，运动不足，采食大量饲料而又是饮水不足所致。5、瘤胃弛缓、瓣胃阻塞、创伤性网胃炎、真胃炎和热性能病等也可继发。牛瘤胃积食的治疗1、按摩疗法：在牛的左肷部用手掌按摩瘤胃，每次5～10分钟，每隔30分钟按摩一次。结合灌服大量的温水，则效果更好。2、腹泻疗法：硫酸镁或硫酸钠500～800克，加水1000毫升，液体石蜡油或植物油1000～1500毫升，给牛灌服，加速排出瘤胃内容物。3、促蠕动疗法：可用兴奋瘤胃蠕动的药物，如10%高渗氯化钠300～500毫升，静脉注射，同时用新斯的明20～60毫升，肌注能收到好的治疗效果。4、洗胃疗法：用直径4～5厘米、长250～300厘米的胶管或塑料管一条，经牛口腔．导入瘤胃内，然后来回抽动，以刺激瘤胃收缩，使瘤胃内液状物经导管流出。若瘤胃内容物不能白动流出，可在导管另一端连接漏斗，向瘤胃内注温水3000～4000毫升，待漏斗内液体全部流入导管内时，取下漏斗并放低牛头和导管，用虹吸法将瘤胃内容物引出体外。如此反复，即可将精料洗出。5、静脉补液法：病牛饮食欲废绝，脱水明显时，应静脉补液，同时补碱，如25%的葡萄糖500～1000毫升，复方氯化钠液或5%糖盐水3～4升，5%碳酸氢钠液500～1000毫升等，一次静脉注射。6、切开瘤胃疗法：切开瘤胃疗法重症而顽固的积食，应用药物不见效果时，可行瘤胃切开术，取出瘤胃内容物。
（1）病原主要给过量适口性强的饲料，如新鲜青草、块根（茎）类饲料和精饲料等。饲草方式变换过急，由舍饲突然转为放牧，或由放牧突然转为舍饲，剧烈的变换饲料使羊不适应。长时间的运动不足，则降低羊消化功能。以上都是瘤胃积食的原发性因素。（2）症状采食过量饲料后不久即出现症状，不愿行动，精神沉郁，腹围增大，左腹部隆起，有腹痛感，反刍减少或停止，嗳出恶臭味的气体及呻吟声。触诊瘤胃内容物坚实，拳压有压痕；叩诊呈浊音，若继发臌胀，则有臌音。发病初期瘤胃蠕动音增加，后期减少或消失。鼻镜干燥，呼吸、脉搏均增快，结膜潮红。病后期，瘤胃内容物腐败分解产生有毒物质，可引起中毒。此时病羊四肢发抖，常卧地呈昏迷状态。（3）治疗轻者绝食1～2天，勤给水喝，按摩瘤胃，每次10～15分钟，可自愈。①用盐类和油类泻剂配合后灌服，如硫酸镁50克，石蜡油80毫升或加水溶解内服。②5%氯化钠溶液50～100毫升，静脉注射，对兴奋瘤胃活动有良好的作用。③止酵药：来苏儿或福尔马林1～3毫升，或鱼石脂1～3克，加水适量内服。④强心药：可用10%安钠咖1～2毫升或20%樟脑水3～5毫升皮下或肌肉注射。⑤中药：神曲9克，山楂6克，大黄9克，研为末，开水冲服。⑥若瘤胃内容物多而坚硬，一般泻药不易奏效时，应及早施行瘤胃开术，取出胃内食物。（4）预防喂适口性强的饲料时，要限制数量，由少渐多。详情关于论文中参考文献的问题：1】文末所写的参考文献均应在文中直接引用。正文中没有直接引用但研究过程中参考的不必写上并编号。2】所引用的参考文献最好是原话，也可转述及归纳。3】论文中所需要涉及的一些如欧几里得的《几何原本》、康托尔的“集合论”等一些原论文出处可以不标出，因为这些成果众所周知。
[1] 王立英.《关于后进生转化教育的思考及对策初探》[J].教育研究.2007年第2期[2] 李巨涛.《论小学后进生的教育与转化》[J].黑河学刊.2007年11月[3] 张海燕,郑传才.《罗杰斯的人本主义思想及其人格理论在后进生教育和转化中的应用》[J].教育探索. 2007年第10期[4] 韩素梅.《苏霍姆林斯基的教育观与“后进生”转化》[J].科技资讯.2007年第2期[5] 高小泉.《素质教育观下中职后进生问题的再探索》[N].珠海城市职业技术学院学报.2007年3月[6] 谌启标，王晞.《班级管理与班主任工作》[M].福建教育出版社. 2007年08月[7] 万玮.《班主任兵法》[M].华东师范大学出版社. 2005年04月[8] 魏书生.《班主任工作漫谈》[M]. 漓江出版社. 2005年06月这是我上次写这个论文的时候的参考文献，希望对你有帮助。
（1）病原主要给过量适口性强的饲料，如新鲜青草、块根（茎）类饲料和精饲料等。饲草方式变换过急，由舍饲突然转为放牧，或由放牧突然转为舍饲，剧烈的变换饲料使羊不适应。长时间的运动不足，则降低羊消化功能。以上都是瘤胃积食的原发性因素。（2）症状采食过量饲料后不久即出现症状，不愿行动，精神沉郁，腹围增大，左腹部隆起，有腹痛感，反刍减少或停止，嗳出恶臭味的气体及呻吟声。触诊瘤胃内容物坚实，拳压有压痕；叩诊呈浊音，若继发臌胀，则有臌音。发病初期瘤胃蠕动音增加，后期减少或消失。鼻镜干燥，呼吸、脉搏均增快，结膜潮红。病后期，瘤胃内容物腐败分解产生有毒物质，可引起中毒。此时病羊四肢发抖，常卧地呈昏迷状态。（3）治疗轻者绝食1～2天，勤给水喝，按摩瘤胃，每次10～15分钟，可自愈。①用盐类和油类泻剂配合后灌服，如硫酸镁50克，石蜡油80毫升或加水溶解内服。②5%氯化钠溶液50～100毫升，静脉注射，对兴奋瘤胃活动有良好的作用。③止酵药：来苏儿或福尔马林1～3毫升，或鱼石脂1～3克，加水适量内服。④强心药：可用10%安钠咖1～2毫升或20%樟脑水3～5毫升皮下或肌肉注射。⑤中药：神曲9克，山楂6克，大黄9克，研为末，开水冲服。⑥若瘤胃内容物多而坚硬，一般泻药不易奏效时，应及早施行瘤胃开术，取出胃内食物。（4）预防喂适口性强的饲料时，要限制数量，由少渐多。详情
浅谈蛋白质折叠的有关问题 [关键字]生物 大分子 分子伴侣 蛋白质的折叠 识别 结合 生物大分子的结构与功能的研究是了解分子水平的先象的基础。没有对生物大分子的结构与功能的认识，就没有分子生物学。正如没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传达传递的中心法则，也就没有今天的分子生物学。结构分子以由第一分子进入对复和物乃至多亚基，多分子复和体结构研究。同时，过去难以研究的分子水平上的生命运动情况也随着研究的深入和技术手段的发展而逐渐由难点变为热点。蛋白质晶体学研究已从生物大分子静态（时间统计）的结构分析开始进入动态（时间分辨）的结构分析及动力学分析。第十三届国际生物物理大会的25个专题讨论会中有一半以上涉及蛋白质的结构与功能，而“结构与功能”又强调“动力学（Dynamics）”，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系，以及对大分子相互作用的贡献。 蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题，在这一领域中，近年来的新发现对新生肽段能够自发进行折叠的传统概念做了根本的修正。这其中，X射线晶体衍射和各种波谱技术以及电子显微镜技术等发挥了极其重要的作用。第十三届国际生物物理大会上，Nobel奖获得者Ernst在报告中强调指出，NMR用于研究蛋白质的一个主要优点在于它能极为详细的研究蛋白质分子的动力学，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系。目前的NMR技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。蛋白质大分子的结构分析也不仅仅只是解出某个具体的结构，而是更加关注结构的涨落和运动。例如，运输小分子的酶和蛋白质通常存在着两种构象，结合配体的和未结合配体的。一种构象内的结构涨落是构象转变所必需的前奏，因此需要把光谱学，波谱学和X射线结构分析结合起来研究结构涨落的平衡，构象改变和改变过程中形成的多种中间态，又如，为了了解蛋白质是如何折叠的，就必须知道折叠时几个基本过程的时间尺度和机制，包括二级结构（螺旋和折叠）的形成，卷曲，长程相互作用以及未折叠肽段的全面崩溃。多种技术用于研究次过程，如快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）。 一、新生肽段折叠研究中的新观点 长期以来关于蛋白质折叠，形成了自组装（self-assembly）的主导学说，因此，在研究新生肽段的折叠时，就很自然的把在体外蛋白质折叠研究中得到的规律推广到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽段折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽链，不需要别的分子的帮助，不需要额外能量的补充，就应该能够自发的折叠而形成它的功能状态。 1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。九十年代一类具有新的生物功能的蛋白，分子伴侣（Molecularchaperone）的发现，以及在更广泛意义上说的帮助蛋白质折叠的辅助蛋白(Accessoryprotein)的提出，说明细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。 二、蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用 蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次级键共同作用。因此新生肽段在一边合成一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成熟蛋白中不存在不该有的结构，他们常常是一些疏水表面，它们之间很可能发生本不应该有的错误的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自组装学说，每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程，为了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有帮助正确途径的竞争机制，分子伴侣就是这样通过进化应运而生的。它们的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的，与之结合，生成复和物，从而防止这些表面之间过早的相互作用，阻止不正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，这样必然促进折叠向正确方向进行。（从哲学的观点说，似乎很容易驳斥自组装学说，它违背了矛盾的普遍性原理，试想，如果蛋白质的每一步折叠均是正确的，充分的，必要的，岂不是在无任何矛盾的前提下，完成了复杂的最稳定构象的形成，即完成了由量变到质变的伟大飞跃，从无活性的肽链变成有活性的功能蛋白，这显然是违背哲学基本原理的。换一个角度想，生物进化的过程本来就充满着不定向的变异，这些变异中有适应环境的，也有不适应环境的，“物竞天择”，自然的选择淘汰了那些不适应的，保留了那些适应的。蛋白质分子的折叠不也与此类似吗？我想，蛋白质的一级结构只是肽链折叠并形成功能蛋白的特定三维结构的内因，实际上，多肽链在形成活性蛋白的每一步，都有潜在的可能形成“不正确”的折叠，如果没有象分子伴侣或其它帮助蛋白等外部因素的作用，多肽链也永远不能折叠成为活性蛋百。） 三，分子伴侣的作用机制 分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。有的分子伴侣具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有细菌Pseudomonascepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侣”。它是由基因limA编码的，与酯酶的基因LipA只隔3个碱基，可能是进化过程中发生的基因分裂造成的。而一般的分子伴侣识别特异性不高，它是怎样识别需要它帮助的对象的呢？现在只能说分子伴侣识别非天然构象，而不去理会天然的构象。由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽段的折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合，如硫氰酸酶（Rhodanese）分子α-helix的疏水侧面。但是只有β-sheet结构的蛋白质才可为分子伴侣识别。 最近关于识别机制有较大的进展。Bip是内质网管腔内的分子伴侣，用一种affinitypanning的方法检查Bip与有随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hymotif与Bipj结合最强，Hy最多的是Trp、Leu、Phe，即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够进行结合。还有一种较普遍的说法是分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule）。另一方面，分子伴侣本身与肽结合部位的结构分析最近也有些进展。譬如，PapD的晶体结构表明，多肽结合在它的β-sheet区。GroEL中，约40kD的153-531结构域是核苷酸的结合区。 分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。非常盛行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚`体形式而形成中心空洞的结构，用电子显微镜已经观察到由二圈层圆面包圈形组成的十四体GroEL分子和一个一层圆面包圈的七体GroES分子协同作用形成中空的非对称笼状结构（cagemodel），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。但是不久前一个日本实验室发现GroEL的一个亚基，甚至其N端去除78个氨基酸残基的50kD片段，已经不能再组装成十四体结构，都有确定的分子伴侣功能。由此，我想:也许环状分子伴侣并非每个部位都是有效的结合部位，也就是说，该二层圆面包圈组成的十四体GroEL分子只有一个或若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球体结构结合，而其余部位起识别作用，就像一个探测器一样，整个十四体GroEL分子以圈层或笼状结构”包裹”在多肽链的主链上，以旋进方式再多肽链的链体上运动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现疏水结构或所谓的熔球体结构等新生肽链折叠过程中暂时暴露的错误结构，经信号转导，多聚体的结合部位便与之结合，生成复合物，抑制不正确的折叠。以上完全是我个人的猜想，是基于上述两个试验现象的矛盾而试图作一番解释。至于为什么假设以旋进方式在多肽链上运动，我并没有相应的根据，只是觉得这应该是一个动态过程，因此作了一番狂妄的假想,另外，我觉得也许可以用X射线衍射来探测一下分子伴侣GroEL和GroES组成的笼状结构，看看它的a×b×c是否足以容纳多肽链的某一段，或者它的内部和外部的疏水性质和其他一些物化性质如何，也许可以找到支持或驳斥上述假设的证据。 以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不久前又出现了一个新名词“DNAchaperones”，DNA分子伴侣，这种分子伴侣是与DNA相结合并帮助DNA折叠的。在这种复合物中，DNA分子包围在蛋白质分子的表面，既是高度有序的，又是在一定程度上结构已有所改变的。DNA与蛋白的这种相互作用对DNA的转录，复制以及重组都十分重要;或如在核小体中，对DNA的包装是必须的。DNA在溶液中的结构有相当的刚性，必须克服一个能障才能转变成它的蛋白复合物中的结构，分子伴侣的作用就是帮助DNA分子进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的，可逆的在形成复合物之后便解离下来。因此，不论是DNA分子伴侣还是蛋白分子伴侣，都与DNA和蛋白的相互作用有关，与基因调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐明中心法则当前主要问题有密切关系。 四、分子伴侣和酶的区别 与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个，一个是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI);另一个是肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二硫键与新生肽段的折叠密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳定性和功能发挥也有重要作用。PDI定位在内质网管腔内，含量丰富，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。同时，它是目前发现的最为突出的多功能蛋白，除了二硫键的异构酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚基;又是微粒体内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还是一种糖基化位点结合蛋白(gkycisylationsitebindingprotein)等。其中，最引人注目的还是它有与多肽结合的能力，可以结合具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特异性较低，主要是与肽的主链相作用，但对巯基尚有一些偏爱。按照分子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白，但是我国上海生物物理研究所最近提出不同的看法，认为蛋白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。 蛋白质分子中天然二硫键的形成要求这些在肽链上往往处于不相邻位置的巯基，首先通过肽链一定程度的折叠，才能相互接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链的自身折叠是一个慢过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成却是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异性的与各种不同肽链相结合的能力，在内质网中以极高的浓度存在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被磷酸化的蛋白，这些都已经符合了分子伴侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键异构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分折叠的肽段的结合，阻止错误的折叠途径，促进正确的中间物生成，帮助肽链折叠是相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得以形成;然后催化巯基的氧化或二硫键的异构而形成天然二硫键。他们认为蛋白质二硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能不是相互排斥，而是密切相关，协调统一的。分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之间，大概不应该，也不能够划一条绝对的分界线。我想:酶的最主要特性就是催化生化反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽段的错误构象结合，从而阻止肽链不正确的非功能的折叠途径，促使其向正确的折叠方向反应，这难道不可以理解成间接的催化肽链的折叠吗?从表观上看，抑制不正确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。所以，我本人也很赞成他们的观点。最近的试验已经为这一假说提供了很好的证据。PDI明显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性股过程中的严重聚合，有效的提高它的复性效率，与典型的分子伴侣GroE系统对甘油醛3-磷酸脱氢酶复性的效应极其相似。 五、分子伴侣的结构 目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是E.coli的PapD，帮助鞭毛蛋白折叠的分子伴侣。还有HSP70的N端结构域，即ATP结合域也以有晶体结构。用电子显微镜已经清楚的看到了GroEL的十四聚体和GroEL的七聚体的四级结构，象两个圆形中空的面包圈叠在一起，用NMR以及各种溶液构象变化是研究分子伴侣作用机制的有效手段。 六、分子伴侣研究的实际应用 分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识，同时也一定会增加我们与自然斗争的能力和自身生存的能力。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。另一方面，利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必将对大幅度提高人类生活水平起重要作用。 [参考书目] 1.李宝健主编，面向21世纪生命科学发展前沿，广东科技出版社，1996年11月第一版：93-104页 2．郝柏林刘寄星主编，理论物理与生命科学，上海科学技术出版社，1997年12月第一版：29-58页 3．中国生物物理代表团，从第十三届国际生物物理大会看生物物理学研究的现状和趋势，生物物理学报，1999年第十五卷第四期：826-827页你看下（微生物前沿）上的文献吧，
瘤胃 分子 文献 参考文献 论文 结构 伴侣
