GB 47893-2010《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》
2、现行有效新国标：
原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：
推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。
扩展资料
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。
这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胚杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群主要包括畅杆菌科中韵埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、魔雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，不形成芽孢。
在35～37℃条件下，48 小时内能发酵乳糖声酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，埃希氏菌属教俗称为典型大肠杆菌。
大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7～30 天后在环境中的变异。
所以食品中检出大肠菌群J表示食品受动人寝温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。
参考资料：百度百科-大肠杆菌
本回答被网友采纳进入无菌室步骤：
1，进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。2，关灯后0•5小时后放可进入。3，进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套
实验步骤：
1， 进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）
2， 准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。3， 直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）4， 再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）5， 再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）6， 再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液7， 更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）8， 再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）9， 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）10， 把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）11， 梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样12， 如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）13， 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中 ，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。14， 再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准）15， 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16， 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
拓展资料：
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胚杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
本回答被网友采纳进入无菌室步骤1． 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。2． 关灯后0•5小时后放可进入。3． 进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套实验步骤1， 进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）2， 准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。3， 直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）4， 再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）5， 再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）6， 再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液7， 更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）8， 再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）9， 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）10， 把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）11， 梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样12， 如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）13， 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中 ，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。14， 再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准）15， 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16， 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。参考资料：GB/T4789baidu{font-size:14px;line-height:1t{color: #006633;font-size:14px;text-decoration:none;}a5℃的含有荧光底物的培养基上连续培养24h，而后能产生分解荧光底物——葡萄糖醛酸酶，从而释放出荧光产物，进而使培养基在紫外光照射下产生特征荧光。此方法可被用来对原样品中的菌落数作统计学估计。
在单料或双料乳糖胆盐发酵管内发酵，分离培养试验，利用伊红美蓝培养皿分离，接着是在乳糖发酵管中进行二次发酵，最后通过芽孢染色、革兰氏染色、显微镜观察等来完成。多管发酵法对试验条件要求不高，成本低，但是检测时间较长，容易受其他条件干扰，进而影响到测定结果的精确度。
扩展资料：
注意事项：
1、检样时注意无菌操作。
2、稀释时采用的稀释液可以用磷酸盐缓冲液或生理盐水，接种时可采用九管法，设置三个梯度，分别为001g/mL、024及美国公共健康联合会检测乳制品检测方发（SMEDP）一致的效果。TEMPO系统根据阳性空的大小和数目来推算出原始样本中大肠杆菌群数目。
扩展资料：
多管发酵法是一种检测水体中大肠杆菌的传统方法，这种方法是在441温箱：36±1℃。 13 恒温水浴 :445℃。 15 显微镜。17 平皿:直径为90mm。 19 吸管。 111 玻璃珠:直径约5mm。 113 酒精灯。 11乳糖胆盐发酵管:按GB 47899规定。 228中43乳糖发酵管:按GB 478910规定。 228中45磷酸盐缓冲稀释液:按GB 478922规定。 27革兰氏染色液:按GB 47892规定。 311112乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 34证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 31用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见35±02结果报告 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
如果是测食品中的菌落总数可以参照GB4789 FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］ 1材料和方法 1 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司2方法 11表达载体的构建 根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列5 μL，25 mmol/L MgCl2 25 μL，4× dNTP混合物（每种25 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶0 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点 12融合蛋白的诱导表达 将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3） 13蛋白表达形式的分析 取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 8 14融合蛋白的纯化 将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱0），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8 取收集液，进行SDSPAGE分析2 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验 经磁力吸附后，弃上清5 mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析1原核表达载体的构建及鉴定 扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为2 2 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的E 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分 2 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达 SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）4CGGBP1与5′d（CGG）293′重复序列 双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉 3讨论 关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］ 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》第一法：大肠菌群MPN 计数法。第二法：大肠菌群平板计数法。两种方法适用于各类食品中大肠菌群的计数。大肠菌群（Coliforms）是一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其存在肠道致病菌的可能性。常以大肠菌群作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。第一法：进入无菌操作室前应更换无菌实验服，戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后，将镊子在酒精灯外焰充分灼烧，夹取适量酒精棉全面擦拭双手，然后才能进行实验操作。酒精易燃，因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离，防止出现危险，待手上的酒精挥发后，再进行实验操作。样品的稀释：取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上，将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻，准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻，在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋，将均质袋放入拍击式均质器中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。注意：样品匀液的pH值应在65之间，必要时可用1mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。均质完毕后，将均质袋置于样品框中。用记号笔依次在无菌试管上做好样品和稀释度标记。用无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中。稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀，制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时，注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面；每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。初发酵试验：每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL。注意，当接种量超过1mL，则用双料LST肉汤，双料LST肉汤是指配置时除蒸馏水外其他成分加倍的培养基。本次试验中，前三管无菌试管中加入10mL十倍样品稀释液，培养基为双料LST肉汤；第4～6管加入十倍稀释液1mL，培养基为单料肉汤；第7～9管加入百倍稀释液接种1mL，培养基为单料肉汤；接种前后试管口均需用酒精灯灼烧片刻，接种后及时振摇均匀。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。接种完毕后，将LST肉汤管置于培养箱中36℃±1℃条件下培养24h±2h。24h±2h后，观察试管中的倒管内是否有气泡产生，产气者进行复发酵试验；如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验，未产气者报告为大肠菌群阴性。复发酵试验：进行复发酵试验时，先将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，接种完毕后应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，36℃±1℃下培养48h±2h。36℃±1℃培养48h±2h后，观察产气情况，若试管中的倒管内有气泡，计为大肠菌群阳性管，否则计为大肠菌群阴性。四 结果报告按确证的大肠菌群LST阳性管数，参照GB 47895mm或更大。证实实验：先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内，振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，于36℃±1℃条件下培养24h～48h。培养完毕后，观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者，即可报告为大肠菌群阳性。四 结果报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。理化项目 水分、灰分、相对密度、酒精度，pH值、总酸、酸度、总碱度、酸价、过氧化值，比旋光度、折光率、粒度、细度、折射率、熔点，净含量、新鲜度、完整率、干粒重、干燥物、溶剂残留量、可溶性固形物、总固形物、非脂乳固体、全乳固体；甲醛、次硫酸氢钠甲醛、羰基价、挥发性盐基氮、三甲胺氮、咖啡因、丙二醛、氨基酸态氮、脲酶、总脂、脂肪酸、L-羟脯胺酸、米酵菌酸、过氧化苯甲酰、黄曲霉毒素B1、苯并[a]芘，甲醇、乙醇、杂醇油、二氧化硫、明矾、丙酸钙、丙酸钠、亚硝酸盐 ；重金属及其他化学元素铅、砷（含无机砷）、汞（含甲基汞）、铜、铬、镉、锡、锰、钾、钠、钙、镁、铝、锌、铁、磷、硒、氟、氯、溴、碘等；食品添加剂防腐剂：山梨酸、苯甲酸等着色剂：胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄、诱惑红、亮蓝甜味剂：糖精钠、甜蜜素、木糖醇等抗氧化剂：叔丁基羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、植酸、TBHQ漂白剂：亚硫酸盐、二氧化硫护色剂：硝酸盐、亚硝酸盐面粉处理剂：过氧化苯甲酰水分保持剂：磷酸盐等农药残留含量测试有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类、避蚊胺、氨基甲酸酯类等400余种测试兽药残留含量测试氯霉素、土霉素、金霉素、四环素、硝基呋喃、磺胺类、盐酸克伦特罗等微生物检测：细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌、大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、致病菌等营养标签检测保健成分（黄酮类、皂苷类、苯丙素类、萜类及挥发油、SOD酶活）、营养标签成分表（中国、香港、美国和加拿大、欧盟、日本）以上是我们青岛科标生物实验室针对食品的部分检测项目，可以参考一下。追问你让我看哪点好呀？用大肠杆菌显色培养基，检测原理：蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;十二烷基硫酸钠抑制革兰氏阳性菌;混合显色底物分别与大肠菌群和大肠杆菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上大肠菌群产生橙红色的菌落，大肠杆菌产生蓝绿色的菌落。资料出自环凯官网。本回答被提问者采纳快速就是分子诊断试剂盒，LB培养基
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