肝移植保存-再灌注损伤研究现状

一、肝移植体保存—再灌注损伤的研究现状（论文文献综述）

王宏^[1]（2021）在《基于代谢产物分析建立供肝质量评估列线图的临床研究》文中指出研究背景肝移植是终末期肝病唯一有效的治疗手段,但其复杂的术后并发症仍是棘手的难题[1]。供肝质量、受体全身情况、手术技术和围术期治疗方案是决定术后并发症发生率和严重程度的四个重要因素。随着肝移植手术操作步骤的逐步规范和围术期治疗方案的日趋成熟,技术瓶颈和供受体管理不再是困扰各移植团队的主要难题。但在肝源长期供不应求的背景下,各移植中心纷纷尝试诉诸于扩展接纳标准以增加供肝的利用率,导致供肝质量参差不齐[2]。若供肝质量欠佳,即使未发生与手术技术和治疗方案相关的并发症,受体仍面临罹患早期移植物功能障碍（Early allograft dysfunction,EAD）的风险。EAD是肝移植术后早期常见并发症,发病率从10.8%到36.3%不等[3],且很大程度上取决于供肝的质量。EAD意味着受体死亡的风险增加10.7倍,供肝功能丧失的风险增加7.4倍[4]。罹患EAD的受体更易经历急性排斥反应、败血症等并发症,导致ICU停留和总住院时间延长,医疗费用陡增,严重影响患者预后[5,6]。鉴于现有文献报道的各类供肝质量评估方法缺乏统一标准且各自存在难以避免的缺陷,探索一种快速、客观、可量化的供肝质量评估手段,是各移植中心的重要任务。研究目的用代谢组学分析方法对代表供肝不同组织损伤程度的生物标记物含量进行检测分析以构建并验证一个供肝质量评估列线图模型,同时分析这些生物标记物含量变化与供肝缺血时间的关系。研究方法根据研究设计的纳排标准共纳入2018年6月至2020年8月在我院首次实施原位全肝移植术的100个病例,其中前69例为训练组用于模型构建,后31例用于模型验证。每例供肝均在获取时和再灌注后先后采集A（获取时）、B（再灌注后）两组标本,以是否发生EAD为分组变量,先对训练组中B组标本灌注液透明质酸（Hyaluronic acid,HA）、胆汁乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）和供肝组织溶血磷脂酰胆碱（Lysophosphatidylcholine,LPC）的含量进行分析,构建一个评估供肝质量的列线图模型,通过AUC检测该列线图模型预测准确性和判别能力,并利用校准曲线验证其预测值与实际观测值之间的一致性;再用验证组数据对其进行验证。建模及验证完毕后,通过分析A、B两组标本中3种损伤性生物标记物含量和病理形态学指标的变化与缺血时间的回归关系,得出相应的回归方程,进一步增强模型的临床应用价值。研究结果训练组中27例发生EAD,发病率为39%,验证组中9例发生EAD,发病率为29%。单因素分析结果表明,供肝中灌注液HA、胆汁LDH和肝组织LPC含量均是EAD的3个危险因素,可用于评估供肝质量,被进一步纳入Logistic回归分析和列线图模型构建;基于现有样本量及数据,经模型建立和校正,当评分大于76时,术后发生EAD概率大于60%,提示供肝质量欠佳。训练组AUC为0.96,验证组AUC为0.97,均大于0.7,两组的校准曲线均显示较好的一致性,提示该列线图模型具有较好的稳定性、敏感性、特异性和准确性,且经队列验证表明预测性能良好。此外研究结果还显示,A组标本中供肝组织病理形态学评分范围在0-2分,基本表现为正常的镜下病理学形态;B组供肝组织病理形态学评分虽高于A组,但也仅仅表现为轻中度损伤;EAD组病理形态学评分均高于非EAD组,有统计学差异,但同样只局限于轻中度损伤,提示在可控缺血时间内预测意义不大。A、B两组标本中3种损伤性生物标记物含量变化与缺血时间均呈正相关,基于现有样本量及数据分别得出其最佳回归方程分别为:YLPC=-7554+22.64×t-0.1692×X0+0.000345×t×X0;YHA=36.03+0.8427×X0+1.878×t-0.0007731×X0×t;YLDH=-0.0006564+0.8949×X0+0.02051×t（Y为B组标本检测值,X0为A组标本检测值,T为缺血时间）。研究结论:1、我们基于对3个代表供肝关键组织损伤的生物标记物进行检测和分析,构建了一个评估供肝质量、预测EAD的列线图评分模型。经AUC检测、校准曲线拟合和队列验证,该模型表现出良好的预测性能和判别能力,具有较好的稳定性、敏感性、特异性和准确性。当评分达到76时,受体术后发生EAD风险大于60%,提示供肝质量欠佳。2、入组3个生物标记物随缺血时间变化的回归方程的建立,使得移植外科医师在获取时即可对相应标本进行检测,并根据预计的缺血时间估算再灌注后的取值,结合列线图评分模型评估供肝状态,预测EAD发生风险,增强了该模型的临床应用价值。

朱宏伟^[2]（2021）在《SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律》文中研究表明[目 的]构建SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,探索肝移植缺血再灌注损伤后不同时间节点大鼠粪便菌群的变化规律,分析肝移植缺血再灌注损伤引起粪便菌群改变的可能机制,进而为将来从肠道菌群的角度对肝移植缺血再灌注损伤进行干预与治疗时提供指导。[方法]采用自体原位肝移植的方法构建大鼠肝脏的缺血再灌注损伤动物模型,其中模型组（M组）根据术后取材时间节点不同又分为M1、M4、M7、M10、M14、M21、M28七个组,并建立假手术组（S组）进行对照。术前分别对以上8组（n=5）大鼠进行血液、粪便标本的搜集。假手术组（S组）在术后第1天进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集,模型组（M组）分别对应于术后第1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d进行肝脏、肠管、血液及粪便标本的采集。大鼠血液进行ALT、AST、TBIL、WBC、NEUT、LYM指标的检测,从血液学角度对肝脏损伤、胆汁淤积及全身炎症情况进行评估与分级。制作并观察肝脏、回盲部肠管病理切片,从病理学角度了解肝脏组织、肠管黏膜的损伤情况。采用高通量基因测序对大鼠新鲜粪便进行检测,了解AOLT缺血再灌注损伤后粪便菌群谱的变化规律。[结 果]1、本次研究采用自体原位肝移植的方法构建肝移植缺血再灌注损伤的动物模型,建模成功率100%。在肝移植缺血再灌注损伤术后第1天,ALT、AST、TBIL指标均较假手术组明显升高,差异皆具有明显统计学意义（P<0.05）。肝脏组织病理图片显示,M1组肝脏组织呈现出较重损伤,Suzuki’ s评分3分,以上结果均证实AOLT动物模型能反映出肝脏的IRI情况,是研究肝移植IRI的理想动物模型。2、AST、ALT、TBIL与肝脏组织病理在AOLT缺血再灌注损伤术后的变化规律基本保持一致。其中,模型组M1中的AST、ALT、TBIL在术后第1天分别为 776.20±298.79、241.00±66.21 和 2.90±2.00,它们显着高于假手术组（S）及其余各模型组,与各组间比较均存在明显差异（P<0.05）,其余各模型组与假手术组（S）之间未见明显差异。由各组AST、ALT、TBIL的变化趋势图和肝脏组织的病理图片可以看出SD大鼠在经历AOLT缺血再灌注后,术后早期（第1天）肝组织损伤、胆汁淤积最为明显,进行到术后中期时肝脏的损伤明显减轻,至术后晚期（第28天）已经完全恢复至术前正常水平。3、通过对大鼠血液WBC、NEUT、LYM指标进行检测以及回盲部肠管组织病理切片的观察,我们发现AOLT缺血再灌注损伤也可导致肠管组织的损伤与炎症反应的产生,且两者的变化平行发生。各模型组中WBC、NEUT、LYMD的值均显着高于假手术组（S）,且与假手术组（S）比较的P值均小于0.05。其中由各指标的变化趋势和回盲部肠管组织病理图片可以看出炎症反应及肠道黏膜损伤在肝移植术后早期即可发生,但程度较轻;在移植术后中期（第4-14天）呈现出先增加后逐渐递减的趋势,以第7-14d炎性反应及肠道黏膜损伤表现得尤其显着;至术后晚期（第28天）观察结束时炎性指标仍略高于术前正常水平,肠道黏膜呈现轻度损伤,但均较术后中期明显好转。4、SD大鼠正常情况下粪便内菌群在门的水平上以拟杆菌门和厚壁菌门为主,且它们的比值约为1。在属的水平层面,正常大鼠粪便菌群丰度占比排名前五（丰度均>1%）的菌群依次为:乳杆菌属（Lactobacillus）、普氏菌属（Prevotella）、颤螺菌属（Oscillospira）、疣微菌科瘤胃球菌属（RuminococcaceaeRuminococcus）、拟杆菌属（Bacteroides）。在经历肝移植IRI后,大鼠粪便内菌群呈现出明显规律性的变化。在门的水平上,厚壁菌门在术后早期（第1天）明显增加,而术后中期（第4天）开始逐渐减少,至术后晚期时（第28天）又开始出现出现增加趋势,而拟杆菌门在此时则完全表现出与厚壁菌门截然相反的变化趋势。在属的层面上,肝移植缺血再灌注术后早期（第1天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属、拟杆菌属、Blautia的丰度在总菌群中的比例显着增加,普氏菌属、颤螺菌属则明显减低。粪便菌群Alpha多样性分析显示此时菌群的多样性降低。术后中期（第4天）乳杆菌属、疣微菌科瘤胃球菌属开始逐渐降低,普氏菌属、颤螺菌属开始增加,拟杆菌属和Blautia在此期间则先后呈现先增后减的变化趋势,菌群的多样性也开始逐渐增加。至术后晚期（第28天）观察结束时疣微菌科瘤胃球菌属、颤螺菌属、拟杆菌属及Blautia基本恢复至术前水平,普氏菌属在总菌群中的比重仍高于乳杆菌属,但它们之间的差距在进一步缩小,呈现出向术前趋于一致的变化趋势,菌群的多样性仍高于术前水平。[结论]1、SD大鼠自体原位肝移植IRI模型是研究肝移植IRI的理想模型。2、自体原位肝移植IRI可引起粪便内菌群发生变化,且该变化具有明显的规律性。3、大鼠肝脏的IRI在AOLT术后早期表现得最为严重,但恢复也较为迅速。术后中、后期主要表现为AOLT缺血再灌注损伤继发的炎症及肠道管损伤,AOLT缺血再灌注损伤后大鼠粪便菌群的变化与肠道损伤及全身炎症具有一定的相关性。

陈三洋^[3]（2020）在《TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中研究说明背景:肝脏移植是治疗终末期肝脏疾病的唯一有效方法。缺血再灌注（I/R）损伤在肝脏移植过程中不可避免,是肝移植术后移植物功能障碍的重要原因。研究报道,缺血再灌注损伤可导致肝移植术后早期移植物功能不良、原发性移植物无功能、缺血型胆道损伤、移植术后肝癌复发以及重症监护时间显着延长等。此外,缺血再灌注损伤还可导致移植术后急性肾损伤及移植术后心律失常。现阶段,临床上为减轻肝脏缺血再灌注损伤,提高手术成功率以及患者存活率,常采用的方法有缺血预处理或通过药物预处理等,但上述方法均存在一定的局限性。因此,当前仍迫切需要进一步阐明肝脏缺血再灌注损伤发生发展过程中的机制,以期为其治疗提供新靶点以及新思路。目前,国内外研究一致认为肝脏缺血再灌注损伤分为缺血和再灌注两个典型的阶段,具有独特的组织损伤机制。在缺血阶段随着ATP的可用性降低,ATP依赖的离子通道开始失效,细胞代谢率下降,无氧糖酵解激活,肝细胞迅速死亡。再灌注损伤涉及直接和间接的细胞毒性机制,在此阶段肝脏产生活性氧刺激炎症反应,包括巨噬细胞和中性粒细胞浸润和细胞因子的产生,最终造成肝细胞凋亡、坏死。所以,过度的炎症反应和广泛的细胞凋亡是肝脏缺血再灌注损伤过程中的两个重要因素。因此,如何减轻肝脏缺血再灌注损伤过程炎症反应和细胞凋亡对于提高供体质量,改善肝脏移植预后尤为重要。TRIM家族蛋白在调控细胞增殖和凋亡、先天免疫和炎症反应等多种生物学过程发挥重要作用,该家族蛋白结构包含由RING结构域、B-box结构域和卷曲螺旋结构域组成的三结构域。TRIM27作为TRIM家族蛋白的一种,于1988年首次报道为RET原癌基因的融合蛋白。研究报道,TRIM27通过抑制由IKKα/β/ε介导的NF-κB和IFN激活来负调节抗病毒和炎症反应。此外,敲低TRIM27可通过上调p-p38诱导卵巢癌细胞的细胞凋亡。但是,TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中是否以及如何发挥作用尚不清楚。因此,研究TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中的作用有利于阐明肝脏缺血再灌注损伤的机制,为肝脏缺血再灌注损伤的保护奠定理论基础和提供新的药物靶点。本研究分为三个部分从体内、体外及临床水平探讨了 TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制,为临床肝脏缺血再灌注损伤的保护奠定理论基础和提供新的药物靶点。第一部分:TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中的表达相关性研究目的:探索TRIM27在肝脏缺血再灌注损伤中的表达相关性。方法:1.1收集临床肝脏移植病人供体肝脏冷灌注前及移植肝脏恢复灌注后关腹前的肝组织样本,通过Western-blot、免疫组化及RT-PCR检测TRIM27的蛋白及基因水平表达变化。1.2建立小鼠肝脏缺血再灌注模型,通过Western-blot、免疫组化及RT-PCR检测小鼠肝脏缺血再灌注后的肝组织中TRIM27的蛋白及基因水平表达变化。1.3建立肝细胞缺氧/复氧模型,通过Western-blot检测肝细胞缺氧/复氧后TRIM27的表达变化。结果:在临床肝移植样本中,与供体肝脏灌注前的肝组织样本相比,肝移植恢复灌注后的肝组织中TRIM27基因及蛋白的表达显着下调;与假手术组相比,小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的肝组织中TRIM27基因及蛋白的表达显着下调;与对照组相比,肝细胞缺氧/复氧后TRIM27的蛋白表达显着下调。结论:TRIM27在肝脏缺血再灌注后表达显着下调,提示其在肝脏缺血再灌注损伤中发挥重要作用。第二部分:TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤中炎症反应和细胞凋亡的调控作用研究目的:探索在TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤过程中炎症反应和细胞凋亡的调控作用。方法:1.检测TRIM27对小鼠肝脏缺血再灌注后肝损伤的调控作用1.1构建Trim27基因敲除（Trim27-KO）小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot检测TRIM27的敲除效率;通过全自动生化分析仪检测小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的含量;通过苏木素-伊红染色（H&E）评估小鼠肝组织坏死面积和坏死程度。1.2构建肝细胞特异性TRIM27转基因（Trim27-HTG）小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot检测TRIM27的表达;通过全自动生化分析仪检测小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的含量;通过H&E染色评估小鼠肝组织坏死面积和坏死程度。2.检测TRIM27对小鼠肝脏缺血再灌注损伤过程炎症反应的调控作用2.1采用Trim27-KO及WT小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过CD1 lb免疫荧光检测小鼠肝组织中炎症细胞浸润;通过RT-PCR检测肝组织中Tnfα、Il6、IL11b、Ccl2、Cxcl2等炎症因子的基因表达;通过Western-blot检测NF-κB信号通路相关分子的蛋白表达。2.2通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR及Western-blot检测TRIM27敲低效率;通过RT-PCR检测Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子的基因表达。2.3采用Trim27-HTG及NTG小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过CD1 1b免疫荧光检测肝组织炎症细胞浸润;通过RT-PCR检测肝组织中Tnfα、Il6、Il1b、Ccl2、Cxcl2等炎症因子的基因表达;通过Western-blot检测NF-κB信号通路相关分子的蛋白表达。2.4通过慢病毒感染构建TRIM27过表达的稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR及Western-blot检测TRIM27的过表达效率;通过RT-PCR检测Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子的基因表达。3.检测TRIM27对小鼠肝脏缺血再灌注损伤过程细胞凋亡的调控作用3.1采用Trim27-KO及WT小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过TUNEL免疫荧光及c-CASPASE-3免疫组化检测肝组织细胞凋亡;通过RT-PCR检测肝组织中Bad、Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达;通过Western-blot检测肝组织中BAX、BAD、BCL2及c-CASPASE-3等凋亡相关蛋白的表达。3.2通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR检测Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达。3.3采用Trim27-HTG及NTG小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过TUNEL免疫荧光及c-CASPASE-3免疫组化检测肝组织细胞凋亡;通过RT-PCR检测肝组织中Bad、Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达;通过Western-blot检测肝组织中BAX、BAD、BCL2及c-CASPASE-3等凋亡相关蛋白的表达。3.4通过慢病毒感染构建TRIM27过表达的稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR检测Bαx、Bcl2等凋亡相关基因的表达。结果:1.TRIM27显着减轻肝脏缺血再灌注后肝损伤与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清转氨酶（ALT、AST）显着升高,肝组织坏死面积显着扩大;与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清转氨酶（ALT、AST）显着降低,肝组织坏死面积显着减小。2.TRIM27显着抑制肝脏缺血再灌注损伤过程的炎症反应与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中CD11b阳性炎症细胞浸润明显加重,肝组织中Tnfα、Il6、Il1b Ccl2、Cxcl2等炎症因子的基因表达显着上调,NFκB信号通路被激活;与对照组相比,TRIM27敲低组肝细胞缺氧/复氧后Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子基因表达显着上调。与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中CD1 1b阳性炎症细胞浸润明显减少,肝组织中Tnfα、Il6、Il1b、Ccl2、Cxcl2等炎症因子基因表达显着下调,NFκB信号通路被抑制;与对照组相比,TRIM27过表达组肝细胞缺氧/复氧后Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子基因表达显着下调。3.TRIM27显着抑制肝脏缺血再灌注损伤过程的细胞凋亡与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中TUNEL及c-CASPASE-3 阳性凋亡细胞显着增多,肝组织中促凋亡分子BAX、BAD、c-CASPASE-3基因和蛋白表达显着上调,抗凋亡因子BCL2基因和蛋白表达显着下调;与对照组相比,TRIM27敲低组肝细胞缺氧/复氧后促凋亡因子Bax基因表达显着上调,抗凋亡因子Bcl2基因表达显着下调。与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中TUNEL及c-CASPASE-3阳性凋亡细胞显着减少,肝组织中促凋亡因子BAX、BAD、c-CASPASE-3基因和蛋白表达显着下调,抗凋亡因子BCL2基因和蛋白的表达显着上调;与对照组相比,TRIM27过表达组肝细胞缺氧/复氧后促凋亡因子Bax基因表达显着下调,抗凋亡因子Bcl2基因表达显着上调。结论:TRIM27可以显着抑制肝脏缺血再灌注损伤过程的炎症反应和细胞凋亡从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。第三部分:TRIM27通过TAK1-JNK/p38信号轴调控肝脏缺血再灌注损伤的机制研究目的:阐明TRIM27通过TAK1-JNK/p38信号轴调控肝脏缺血再灌注损伤的分子机制。方法:1.通过高通量测序探索TRIM27调控肝脏缺血再灌注损伤的可能机制1.1 通过高通量测序筛选Trim27-KO及WT组小鼠肝脏缺血再灌注后肝组织中差异基因;通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析富集Trim27敲除后差异基因相关信号通路变化;通过热图分析参与基因探针富集分析（GSEA）途径的炎症基因的表达变化。1.2采用Trim27-KO及WT小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot 检测肝组织中 ASK1、TAK1、ERK、JNK、p38 等 MAPK 信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化;通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过Western-blot检测TAK1、JNK、p38等MAPK信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化。1.3采用Trim27-HTG及NTG小鼠,建立肝脏缺血再灌注损伤模型。通过Western-blot 检测肝组织中 ASK1、TAK1、ERK、JNK、p38 等 MAPK 信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化;通过慢病毒感染构建TRIM27过表达的稳转肝细胞系,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过Western-blot检测TAK1、JNK、p38等MAPK信号通路相关分子总蛋白和磷酸化蛋白的变化。2.检测TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的调控是否依赖于TAK12.1通过慢病毒感染构建TRIM27敲低稳转肝细胞系,同时加入TAK1抑制剂NG25,建立肝细胞缺氧/复氧模型。通过RT-PCR检测Tnfα、Il6、Il1b等炎症因子以及Bax、Bcl2等凋亡相关基因的表达。2.2通过细胞免疫荧光,在激光共聚焦显微镜下观察TRIM27和TAK1在肝细胞中的共定位;通过免疫共沉淀（Co-IP）实验检测TRIM27和TAK1的是否互作;通过GST-pulldown实验检测TRIM27和TAK1的直接相互作用;通过mapping实验检测TRIM27和TAK1相互作用的具体结构域。3.检测TAB2/3在TRIM27-TAK1介导的肝脏缺血再灌注损伤中的作用3.1 在 HEK293T 细胞中转染 Myc-Ub、HA-TAK1 和 Flag-TRIM27 质粒,检测TRIM27对TAK1泛素化水平的影响。3.2通过免疫共沉淀实验检测TRIM27和TAB2/3的相互作用。3.3 在 HEK293T 细胞中梯度转染 Myc-TRIM27 及 HA-TAB2 或 Flag-TAB3,检测TRIM27对TAB2/3蛋白稳定性的影响。3.4 在 HEK293T 细胞中梯度转染 Myc-TRIM27 及 HA-TAB2 或 Flag-TAB3,同时分别加入DMSO、MG132、CQ,检测TRIM27影响TAB2/3蛋白稳定性的的途径。3.5在HEK293T细胞中检测TRIM27对TAB2/3介导的TAK1泛素化激活的影响,以及肝细胞缺氧/复氧后TRIM27在TAB2/3介导的TAK1磷酸化激活中的作用。结果:1.TRIM27抑制肝脏缺血再灌注损伤后TAK1-JNK/p38信号通路的激活高通量测序发现和WT组相比,Trim27-KO小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的肝组织中存在大量差异基因,同时MAPK信号通路显着富集,ASK1和TAK1表达显着上调。Western-blot发现与WT组相比,Trim27-KO组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中p-TAK1、p-JNK、p-p38蛋白表达显着上调;与对照组相比,TRIM27敲低组肝细胞缺氧/复氧后p-TAK1、p-JNK、p-p38的蛋白表达显着上调。与NTG组相比,Trim27-HTG组小鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝组织中p-TAK1、p-JNK、p-p38的蛋白表达显着下调;与对照组相比,TRIM27过表达组肝细胞缺氧/复氧后p-TAK1、p-JNK、p-p38的蛋白表达显着下调。2.TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的调控作用依赖于TAK1TRIM27敲低可以显着促进肝细胞缺氧/复氧后的炎症反应和细胞凋亡,加入TAK1抑制剂NG25之后可以抵消TRIM27敲低的促炎和促凋亡作用。TRIM27和TAK1在肝细胞细胞质共定位;免疫共沉淀和GST-pulldown实验证实TRIM27和TAK1可以直接相互作用;Mapping实验证实TRIM27的C端的133-513氨基酸序列和TAK1的N端1-480的氨基酸序列相互结合。3.TRIM27通过降解TAB2/3抑制TAK1的激活TRIM27可以抑制TAK1的K630位点的泛素化水平;TRIM27分别和TAB2/TAB3互作;TRIM27可以通过溶酶体途径降解TAB2/3;TRIM27可以抑制TAB2/3介导的TAK1的泛素化和磷酸化激活。结论:TRIM27通过降解TAB2/3进而抑制TAK1-JNK/p38信号通路从而调控肝脏缺血再灌注损伤。

薛郑泽^[4]（2020）在《PACAP在肝缺血再灌注损伤中的作用和机制研究》文中研究表明背景:作为一种非外源性抗体依赖的炎症反应,缺血再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury,IRI）是器官获取、器官移植、部分器官切除、创伤及休克等临床实践中难以避免的重要并发症。在肝移植的临床实践中,早期阶段肝脏缺血再灌注损伤常引起肝脏的功能丧失以及功能障碍,同时可能增加急性与慢性排斥反应事件的发生风险,以至最终的移植物衰竭,而进一步加重我国移植供体短缺的现状。在缺血再灌注损伤的过程中,局部血供受阻,肝细胞能量代谢障碍、氧化应激产物的生产,外周中性粒细胞和巨噬细胞的聚集浸润几个过程相互作用,加重了组织损伤并成为导致器官功能丧失的主要原因。作为细胞饥饿状态下的应对措施,自噬通过溶酶体降解受损细胞器和畸形蛋白质,完成细胞内的自我消化,为饥饿的细胞提供必需的底物（氨基酸,脂质和游离脂肪酸）,以维持能量代谢和生物合成。由于肝脏富含溶酶体,因此自噬功能失调与多种肝脏疾病（肝脏IRI,非酒精性脂肪性肝炎和肝癌）有关。在肝移植中,热缺血和冷缺血均主要中断血流/氧气供应,消耗肝细胞三磷酸腺苷并产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）。肝细胞的严重饥饿状态触发自噬信号传导,自噬激活后为细胞提供可重复使用的单体来维持细胞稳态。在IRI过程中,免疫系统与神经系统存在广泛互相作用并形成相互调节机制以维持动态平衡。IRI引起的炎症激活下丘脑系统性神经内分泌调节和区域性神经激素应激反应。神经调节通过刺激迷走神经活动来放大、监测和调节免疫反应,这是一个重要的反馈性回路;在刺激消除后,神经系统又会负性调节局部免疫反应以促进局部环境重回稳态。由ADCYAP1基因编码的垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）正是连接免疫与神经调节的桥梁。PACAP是血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptid,VIP）/胰高血糖素/分泌素家族的成员,在促体垂体区域起神经递质和神经调节剂的作用,并参与促性腺激素的旁分泌和自分泌调节。我们曾报道PACAP和其所有三种受体在IR应激肝脏中表达,并影响肝脏对IR损伤敏感性。而外源性PACAP神经肽也通过减少IR-肝中的中性粒细胞/巨噬细胞集聚和负性调控促炎症介质来调节局部先天性免疫。环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP response element-bing protein,CREB）曾被报道在感染和胰岛素抵抗中发挥先天性免疫调控作用,通过调节的巨噬细胞极化分型消弱TLR4信号通路介导的炎症反应。我们之前也发现,PACAP可以通过增强c AMP-PKA通路与CREB活性来抑制巨噬细胞NF-κB活性。最近,报道称CREB在肝脏自噬调节中有促进脂质自噬降解的功能。Kruppel样因子4（Kruppel-like factor 4,KLF4）是KLF家族至关重要的调控自我更新的转录因子,在增殖、分化和体细胞重编程中发挥着多种调节作用。同时,KLF4通过与Stat6协同诱导M2相关基因表达,并弱化NF-κB激活因子抑制M1表型,对巨噬细胞的极化分型产生影响。另一方面,KLF4通过促进自噬而延长了线虫的寿命,改善小鼠的老年性血管功能障碍,并与CREB在结核分枝杆菌中协同调节免疫的功能引起了我们的研究兴趣。本研究试图阐明在模拟真实临床实践的延长肝冷藏时间后行同系小鼠原位肝移植手术模型中,PACAP介导自噬活动的对肝细胞保护作用,并探讨其在肝脏IRI中促进自噬活动对分子机制,为PACAP在肝移植临床实践中保护肝脏的应用提供理论支持。目的:本研究旨在通过模拟真实临床实践中肝脏供体经过长时间冷藏后行原位肝移植术的小鼠原位肝移植模型来探究PACAP介导肝细胞自噬对肝脏活性的影响与机制。课题假设外源性PACAP通过增强肝细胞内自噬活性,为IR刺激下营养障碍的肝细胞供给细胞代谢所需的底物与能量,以此发挥保护肝细胞的作用。首先,我们想知道PACAP神经肽是否以及如何通过自噬依赖的方式对长时间冷脏的肝脏起保护作用。随后,我们研究了PACAP介导的自噬是否可以在基于临床实践的小鼠原位肝移植模型中保持肝细胞的活力,并促进肝的再生/修复。最后,我们探讨了在肝脏IRI中,PACAP介导的CREB和KLF4共激活对促进肝细胞自噬活动起关键作用,并为将PACAP应用于肝移植的临床实践提供理论支持。方法:1.动物。8-12周雄性C57BL/6野生型小鼠（WT）。2.原位肝移植模型。将C57BL/6供体小鼠的肝移植物在4℃UW溶液中保存20 h,然后原位移植到同基因C57BL/6小鼠中。在进行肝移植时以及再灌注之前对受体组予以PBS、PACAP38,或3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理。观察OLT术后存活,并在移植后6小时和24小时收集血清和OLT样品。3.部分肝脏热缺血再灌注损伤模型。用无创伤性夹子夹住肝头叶的动脉和门静脉（占全肝的70%血供）90分钟。单剂量PACAP38、CRP-CREB相互作用抑制剂（CREB抑制剂）或KLF4抑制剂（Kenpaullone）于热缺血前1小时静脉注射。再灌注后6小时收集缺血性肝组织和血清样品。4.肝细胞损伤与功能检测。测定小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平,用以对其进行肝脏受缺血再灌注损伤严重程度的评估。5.组织病理学。获取肝脏样本制成4μm标本,用H&E染色,对肝脏结构损伤情况进行双盲法分析。6.碘化丙锭（PI）染色。PI染色（Thermo Fisher）用于通过结合DNA检测死细胞。将红色荧光图像与明亮视野图像合并以进行盲目评估。7.Real time PCR。提取组织或细胞RNA,用PCR技术对肝脏细胞因子及趋化因子表达情况进行研究和分析,并对PACAP下游分子、自噬和再生修复相关基因进行检测,分析其表达状态。8.Western blot。提取组织或细胞蛋白质,用免疫印迹技术分析OLT模型及IRI模型中关键蛋白在细胞核与细胞质中表达的情况。9.免疫荧光染色。用于分析肝细胞LC3、p CREB和KLF4表的情况。10.ALT/LDH试验。测定体外原代肝细胞培养液中的ALT/LDH水平,用以测定体外培养的原代肝细胞的损伤情况。11.细胞培养。肝胶原酶灌注原位消化后,通过Percoll梯度离心分离原代肝细胞,然后在胶原蛋白包被的平板中培养。12.统计分析。所有实验中的结果均以平均值±标准差（SD）的形式进行表示。并认为p<0.05为有显着统计学意义的差异。结果:1.PACAP可减轻肝冷IRI并并提高小鼠原位移植术后生存率。首先,我们研究了在小鼠同系OLT模型中,给予PACAP神经肽能否对长时间冷藏后行原位肝移植术的供体肝脏其保护作用并延长移植物存活时间。与PBS对照组的41.7%存活率相比,PACAP给药组中91.7%的受体小鼠在OLT后14天仍然存活。由于冷IRI对肝细胞的损伤在再灌注后6h达到高峰,我们在6 h和24 h评估了OLT和血清样品。PACAP显着降低了IRI-OLT,表现为s ALT水平降低和肝脏组织学的完整。2.PACAP促进肝脏自噬。在IR损伤的肝脏中,PACAP增强肝细胞自噬活动。PACAP处理组中自噬关键成分（LC3,Beclin-1和Atg5）的表达量明显高于对照组。同样,PACAP神经肽增加了LC3的表达水平,降低了p62的水平,并促进LC3 I至LC3 II的转化,这被认为是自噬途径中的关键活性步骤。OLT术后6小时肝脏移植物中自噬体的电子显微照片也直观的印证了这个结果。3.PACAP在OLT模型中介导的细胞保护/再生作用依赖于自噬。接着,我们使用自噬抑制剂3-MA来阻断PACAP介导的肝自噬活性,从而验证其在肝脏体内稳态中的重要性。3-MA可阻断IR应激OLT中自噬体的形成。3-MA处理后,LC3I,LC3 II和Beclin-1表达下降,并恢重现OLT中的肝脏IRI,即s ALT水平升高与肝组织学的破坏。另外,我们发现PACAP介导的自噬对肝细胞再生功能有促进作用,提高了PCNA,Ki67,表皮生长因子（EGF）,肝细胞生长因子（HGF）及其受体c-Met的表达;而自噬抑制则消除了这种效果。4.PACAP介导的自噬可防止肝细胞死亡。在过氧化损伤模型中,PACAP处理增强肝细胞核和细胞质中LC3的诱导和积累,保护肝细胞免受氧化应激损伤而凋亡。而自噬抑制作用加剧了肝细胞在该模型中的损害。5.PACAP-CREB轴对于肝脏IRI中PACAP功能至关重要。正如我们在肝IRI中发现PACAP激活PKA-c AMP-CREB信号通路,我们在肝脏OLT中也检测到p CREB的激活,在原代肝细胞体外过氧化损伤模型中观察到一致的结果。不仅如此,我们在小鼠IRI模型中发现,抑制CREB功能可以消除PACAP介导对小鼠肝脏的保护作用。6.PACAP介导的肝细胞自噬需要CREB。相对于PACAP处理促进了肝脏IRI中的肝自噬,PACAP与CREB抑制剂共同给药后,在小鼠IRI模型和原代肝细胞氧化应激中均未能激活自噬相关基因的表达,这说明PACAP介导的肝细胞自噬是CREB依赖的。此外,CREB抑制剂消除了PACAP介导的肝细胞再生活动。7.PACAP-CREB信号通路在肝脏IRI中调控KLF4。与对照组相比,PACAP增强了肝脏IRI模型和体外肝细胞过氧化损伤中的KLF4基因的转录和蛋白质表达。然后,我们在肝IRI模型中使用KLF4抑制剂。与PACAP-CREB阻断类似,抑制KLF4减弱了PACAP介导的细胞保护作用,并恢复了IR诱导的肝细胞损伤,如升高的s ALT水平和肝病理损伤。此外,KLF4的阻断促进了被PACAP-CREB通路下调的促炎性细胞因子,也抑制保护性细胞因子IL-10的表达。8.KLF4对于PACAP-CREB介导的肝细胞自噬通路中不可或缺。KLF4阻断显着减少了肝IRI模型里PACAP处理组原本丰富的肝细胞自噬活动与再生活动。同样,原代肝细胞过氧化模型中PACAP介导的自噬活性和保护作用也被KLF4抑制剂消弱,出现肝细胞损伤与凋亡增加的现象。结论:1.在原位肝移植模型中,PACAP介导的肝细胞自噬活动具有提高肝移植存活率并减轻缺血再灌注损伤的作用。同时有助于提高OLT中肝细胞修复再生功能,减轻IR介导的细胞损伤,减少细胞凋亡/坏死。2.在缺血再灌注损伤中,PACAP通过CREB-KLF4信号通路调节肝细胞自噬功能,发挥对肝细胞的保护作用。同时,在IR肝脏中,PACAP-CREB-KLF4信号通路的完整性对自噬介导的肝细胞保护作用至关重要。

王华翔^[5]（2019）在《公民死亡器官捐献与司法途径标准供肝移植后相关并发症的比较分析》文中提出目的比较公民死亡器官捐献（DCD）供肝与司法途径标准供肝（SCD）受体移植术后患者相关并发症的发生情况,评估公民死亡器官捐献供肝的疗效。方法收集自2009年1月至2017年12月在厦门大学附属东方医院进行的296例原位肝移植手术患者的临床资料,其中SCD来源197例,DCD来源99例,采用倾向评分匹配法（PSM）均衡两组受体术前、术中协变量后比较两组患者术后肝功能恢复、胆道并发症、急性肾损伤、感染及相关病原体、急性排斥反应、血管并发症的发生以及患者的术后生存情况。结果经过1:1匹配后两组共有89对病例纳入研究,两组患者术后肝功能恢复有明显差异,DCD供肝来源组患者肝功能较SCD组肝功能恢复慢。DCD组和SCD组术后移植物功能恢复不良（EAD）的发生率分别为39.3%、17.9%,差异有统计学意义（P=0.002）,原发性移植物无功能（PNF）的发生率两组分别为7.9%、3.4%,发生率无统计学差异（P=0.193）。DCD组和SCD组术后胆道并发症（BC）发生率分别为19.1%和15.7%,差异无统计学意义（P=0.553）。DCD组和SCD组的AKI发生率分别为48.3%、32.6%,发生率有统计学差异（P=0.031）;DCD和SCD两组患者的感染并发症发生率分别为59.6%、42.7%,差异有统计学意义（P=0.025）,其中腹腔感染发生率分别为47.2%、32.6%（P=0.040）;肺部感染发生率分别为30.3%、23.6%（P=0.311）;术后感染病原体耐药率分别为48.2%、48.5%（P=0.968）;ACR发生率分别为25.8%、13.5%,差异有统计学意义（P=0.041）;两组患者术后血管并发症的发生率分别为8.9%、5.6%,差异无统计学意义（P=0.232）。DCD组患者术后1、2、3年生存率为80%、73%、70%,SCD组患者术后1、2、3年生存率分别为85%、78%、72%,两组患者术后生存率差异没有统计学意义（P=0.673）。结论DCD供肝较SCD供肝来源相比,移植后受体肝功能恢复较慢,术后EAD、AKI、ACR、腹腔感染等相关并发症发生率较高。术后原发性移植物无功能、胆道并发症、肺部感染、血管并发症以及术后存活情况DCD组与SCD组无明显差异。

曾宪鹏^[6]（2019）在《小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究》文中进行了进一步梳理目的:由于器官来源不足,心脏死亡（donation after circulatory death,DCD）供肝等质量不佳的肝脏被应用于临床,为弥补冷保存（cold storage,CS）不能修复供肝质量的缺陷,肝脏低温携氧机械灌注（hypothermic oxygenated machine perfusion,HOPE）技术逐渐被使用。然而鉴于缺乏合适的研究模型,HOPE作用的分子机制尚不明晰。为此,我们拟建立小鼠肝脏HOPE模型,在探究合适灌注参数的基础上,应用该模型阐明HOPE对DCD供肝的保护作用机制。方法:对比应用不同流量HOPE灌注正常肝脏及热缺血30分钟肝脏的效果,验证小鼠肝脏HOPE系统的稳定性与有效性,并探寻适合的灌注流量。应用体外常温非载血复灌系统,阐明自噬在HOPE对DCD供肝中的作用。通过体外常温载血复灌系统与基因工具鼠,分析P选择素是否参与HOPE对DCD供肝的保护作用。结果:当HOPE流量不小于0.3 ml/min·g时,该系统能在正常小鼠肝脏中达到完全灌注。在流量为0.1-0.5 ml/min·g条件下,HOPE能发挥明显优于CS的DCD供肝保护作用。与CS相比,经历了HOPE的DCD供肝能够激活自噬体的生成,自噬蛋白表达与自噬体数量明显增加,然而应用自噬抑制剂后,HOPE的保护作用被消除。在炎症反应方面,P选择素敲除能够减轻DCD供肝损伤程度,其与野生型小鼠HOPE的作用机制类似。此外,比较P选择素敲除小鼠HOPE与CS对DCD供肝效果发现,P选择素敲除小鼠HOPE在拥有抗炎作用的基础上还能减轻DNA与氧化应激损伤。结论:我们成功建立了稳定的小鼠肝脏HOPE系统,阐明了HOPE可通过激活自噬及P选择素依赖与非依赖途径发挥对DCD供肝的保护作用。

刘忠忠^[7]（2019）在《辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究》文中研究说明第一部分:辛伐他汀预处理在大鼠全肝缺血再灌注损伤中的作用及潜在机制研究目的:全肝缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）包括肝脏和肠道的热缺血损伤,是肝移植过程中一个错综复杂并不可避免的病理过程,可导致肝移植预后不良。然而,目前改善肝脏IRI的手段有限。本研究探讨辛伐他汀预处理大鼠全肝IRI中的作用及机制。方法:建立一个大鼠全肝热缺血30 min的模型模拟全肝IRI;36只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组、IRI对照组（IRI-Con组）和辛伐他汀预处理组（IRI-Sim组）。IRI对照组和辛伐他汀预处理组分别为大鼠建立全肝热缺血30min之前予以0.1%DMSO和1mg/kg辛伐他汀腹腔注射预处理;于再灌注6h和24h收集血液和肝脏标本以待下一步检测,每组两个时间点各6只（n=6）。结果:与IRI对照组相比,辛伐他汀预处理组能显着降低血清ALT和AST水平以及改善肝脏组织病理形态损伤;辛伐他汀预处理组增加了Kruppel样因子2（Kruppel-like factor 2,KLF2）及其下游保护分子磷酸化内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）和血栓调节蛋白（thrombomodulin,TM）的表达（p<0.05）;进一步发现辛伐他汀预处理能影响肝组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和脂质过氧化物（malondialdehyde,MDA）活性（p<0.05）减轻氧化应激损伤,降低肝细胞凋亡水平并能减少高迁移率蛋白b1（high-mobility group box-1,HMGB1）、toll样4受体（toll-like receptor 4,TLR4）、CD68、肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor a,TNF-a）、白介素1β（interleukin-1,IL-1β）和IL-6表达（p<0.05）抑制炎症反应。结论:辛伐他汀预处理能通过KLF2介导的保护机制减轻全肝IRI;辛伐他汀可能作为一种潜在预防治疗的药物拮抗临床肝脏IRI。第二部分:辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝中缺血再灌注损伤中的作用及机制研究目的:严重的肝脏IRI是导致肝移植近远期疗效差的主要原因之一。如何有效优化心脏死亡（donors after circulatory death,DCD）供肝的质量减轻肝脏IRI是移植领域研究的热点。本研究探讨供体辛伐他汀预处理优化大鼠DCD供肝的作用及机制研究。方法:建立大鼠心脏停跳30 min模拟DCD供肝的模型;24只雄性SD大鼠随机分为4组:正常肝脏组（NP组）、正常肝脏冷保存组（CSP组）、DCD对照组DCD-Con组)和DCD肝脏辛伐他汀预处理组（DCD-Sim组）。NP组和CSP组均为无热缺血损伤的供肝;DCD-Con组和DCD-Sim组分别为大鼠建立心脏停跳热缺血30 min之前予以0.1%DMSO和1 mg/kg辛伐他汀腹腔注射预处理;除了NP组,其他三组均在UW液中冷保存24 h;之后四组全部通过常温复灌系统评价肝脏质量;在肝脏体外常温复灌1h内收集灌注液和组织标本用于研究检测,每组各6只（n=6）。结果:与DCD对照组相比,辛伐他汀预处理组能显着降低灌注液ALT和AST水平,增加胆汁和ATP生成以及减轻肝脏组织形态学损伤;辛伐他汀预处理组增加了KLF2及其下游保护分子磷酸化e NOS、TM和血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）表达（p<0.05）;进一步发现辛伐他汀预处理组能改善肝组织SOD和MDA活性（p<0.05）减轻氧化应激损伤,减少HMGB1、TLR4、CD68、TNF-a、IL-1β、IL-6和ICAM-1基因水平表达（p<0.05）抑制炎症反应并且增加抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值减轻肝细胞凋亡水平。结论:供体辛伐他汀预处理能通过KLF2介导的保护机制减轻DCD肝脏的IRI;以上数据表明辛伐他汀可为临床优化DCD肝脏质量提供潜在的保护效应。

张黎^[8]（2019）在《CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究》文中指出第一部分大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒载体的构建及鉴定[目 的]构建大鼠CaMKⅡγ基因的过表达及干扰慢病毒载体并鉴定,为下一步探讨慢病毒介导CaMKⅡγ基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及其在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤的作用提供基础。[方 法]根据大鼠CaMKⅡγ目的基因的mRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ目的基因,构建大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,根据本课题组前期实验中已筛出的干扰效率最高的siRNA序列构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγyshRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞并进行测序验证,随后转染293T细胞进行慢病毒包装并用绝对定量qPCR测定慢病毒滴度。应用Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定大鼠CaMKⅡγ过表达的有效性。根据不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A,将其分为生理盐水空白对照组（CON组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体组（CON-mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒载体组（mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒空载体组（CON-shCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒载体组（shCaMKⅡγ组）,应用Western Blot检测各组CaMKⅡγ蛋白表达情况。[结 果]成功构建了大鼠CaMKIIⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体蛋白的表达。根据已知干扰效率最高的siRNA序列成功构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγshRNA慢病毒空载体。绝对定量qPCR测定大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体、大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体滴度均为2E+9TU/mL。不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A 48h后,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ蛋白表达最高,shCaMKⅡγ的CaMKⅡγ表达最低,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ表达高于CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01）,shCaMKⅡγ组的 CaMKⅡγ表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。[结 论]大鼠CaMKⅡγ基因的过表达慢病毒在293T细胞中构建成功并表达,大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体在293T细胞中构建成功。大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中蛋白表达显着增加,而大鼠CaMKⅡγ干扰慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中的蛋白表达量显着下降,为后续研究CaMKⅡγ作为靶基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及在大鼠DCD肝移植术缺血-再灌注损伤的作用提供基础。第二部分建立SD大鼠DCD原位肝移植模型[目 的]建立稳定的SD大鼠DCD原位肝移植模型并确定在本课题后续实验中SD大鼠DCD原位肝移植模型的最佳热缺血时间。[方 法]本实验通过Kamada“二袖套”法,控制不同热缺血时间（热缺血Omin、热缺血15min及热缺血30min）建立SD大鼠DCD原位肝移植模型,并通过移植术后存活时间及肝脏变化确定本实验最佳动物模型热缺血时间。[结 果]供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型术后7d的生存率分别为90%、80%及60%,随着热缺血时间延长,肝脏损伤加重,肝功能ALT、AST及TBIL逐渐升高,肝脏病理切片结果显示肝细胞从轻度水肿到点状坏死,再从桥接样坏死到大片状坏死。[结 论]在SD大鼠DCD原位肝移植模型中,热缺血时间的长短是直接影响供肝质量的关键因素,随着热缺血时间延长,供肝肝功能损伤逐渐加重,与病理结果一致,术后受体存活率随热缺血时间延长而显着下降。经过对比,热缺血15min是建立SD大鼠DCD原位肝移植模型并为后续进一步试验的理想造模时间,既可保证移植术后受体有一定的存活率,又可观察后续慢病毒干预对肝损伤是否有效。第三部分CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]用第二部分建立的供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型,三组分别于肝移植术后1d、3d及7d处死20只大鼠,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、CytC的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ蛋白表达,探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[结 果]三组移植术后1dCa2+水平达到高峰,术后3d Ca2+下降,到术后7d Ca2+又逐渐升高,同一时点,热缺血15min组及30min组Ca2+浓度水平高于热缺血Omin组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例随时间延长逐渐升高,提示线粒体膜势能下降比例逐渐升高,术后1d,三组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.01）。Tunel检测肝细胞凋亡比例随时间延长逐渐升高,术后1d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,热缺血15min组与热缺血Omin组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）且热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血15min组（P<0.05）。Western Blot测CaaM、CaMKⅡγ、AIF及Cyt C蛋白表达随热缺血时间延长而逐渐增加（P<0.05,P<0.01）,同一时点,热缺血15min组及30min组的蛋白表达高于热缺血Omin组,QRT-PCR及免疫组化测CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA及 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与 Western Blot 结果趋势大致相同。[结 论]热缺血时间是影响供肝质量的关键因素,SD大鼠DCD原位肝移植术后,供肝热缺血时间越长,供肝功能损伤越重,移植术后Ca2+浓度逐渐升高,从分子、蛋白及组织水平验证了随热缺血时间的延长,CaM及CaMKⅡγ表达增加,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,线粒体膜势能下降细胞比例增加,AIF及CytC从线粒体内释放,线粒体凋亡增加,由线粒体凋亡引起的肝细胞凋亡随之增加。第四部分慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]建立热缺血15min SD大鼠DCD原位肝移植模型,每只大鼠术中通过门静脉按1.0×108TU/mL注射CaMKⅡγ过表达及其对照慢病毒。（mCaMKⅡγ组、CON-mCaMKⅡγ组）、CaMKⅡγ干扰及其对照慢病毒（shCaMKⅡγ组及CON-shCaMKⅡγ组）、生理盐水（CON组）转染移植肝脏,于术后1d、3d、7d分别处死20只大鼠。取血清行肝功能检测,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、Cyt C的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ的蛋白表达,电镜检测肝组织中肝细胞、线粒体的超微结构变化。[结 果]CaMKⅡγ过表达慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为83.3%、78.3%及70.0%,而CaMKⅡγ干扰慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为98.3%、93.3%及88.3%,提示干扰CaMKⅡγ的表达对大鼠DCD肝移植术后肝损伤是保护因素,可提高大鼠DCD肝移植术后生存率。肝功能结果示:血清 ALT、AST 术后各时点 mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,血清TBIL于术后1d各组无显着差异,术后3d及7d结果同血清ALT、AST。移植术后Ca2+浓度于术后1d达到高峰,各组间无显着差异,术后3d逐渐下降,术后7d再次升高,术后3d及7d,mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例在术后1d及3d,shCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）,术后 7d,mCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。Tunel法测肝细胞凋亡结果示:术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例低于CON-shCaMKⅡγ组（p<0.01）。Western Blot 测 CaM、CaMKⅡγ、AIF 蛋白表达于术后 1d,mCaMKⅡγ组表达高于 CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01,P<0.05）,术后 3d 及 7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,CytC蛋白表达于术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）。QRT-PCR 测 CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA 的表达及免疫组化测 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与Western Blot结果趋势相同。电镜结果可见mCaMKⅡγ组出现超微结构损伤,肝细胞肿胀及坏死、线粒体肿胀、嵴消失,而shCaMKⅡγ组受损形态明显改善,肝细胞大致正常,线粒体或肝细胞轻微肿胀,CON组、CON-mCaMKⅡγ组、CON-shCaMKⅡγ组可见肝组织轻微的超微结构损伤,随时间推移,mCaMKⅡγ组损伤逐渐加重,shCaMKⅡγ组损伤逐渐减轻。[结 论]DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致CaMKⅡγ异常表达,可通过激活Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路诱导线粒体损伤,上调CaMKⅡγ可使Ca2+水平升高,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,使线粒体膜势能下降,线粒体通透性增加进而导致线粒体肿胀、破裂及凋亡,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质可启动线粒体凋亡,进一步促进肝细胞凋亡;而下调CaMKⅡγ则可使Ca2+水平降低,减少线粒体膜势能下降,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质减少,进而减少线粒体凋亡及其诱导的肝细胞凋亡,对SD大鼠DCD原位肝移植术后的肝功能损伤有保护作用。CaMKⅡγ过表达在DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致的线粒体凋亡中起主导作用,特异性干扰CaMKⅡγ表达可特异性调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路,有效改善SD大鼠DCD原位肝移植术后肝损伤及提高术后移植大鼠存活率。

宋虎^[9]（2019）在《miR-101调控mTOR信号通路介导自噬参与肝脏缺血/再灌注损伤的机制研究》文中研究表明目的:肝脏缺血/再灌注损伤（LIRI）是肝脏移植以及肝脏外科手术中常见的并发症,对肝脏外科手术的效果以及术后患者肝功能的恢复有着巨大的影响。多少年来,如何减少肝脏损伤,尽最大可能做到对肝脏的保护并且提高患者预后,一直是肝脏手术中研究的热点以及难点。近年来,对于LIRI具体机制的相关研究不断增多,然而尚未完全阐明。本研究通过探索小鼠LIRI中miR-101的表达情况以及细胞自噬活性的变化来探讨miR-101介导自噬在小鼠LIRI中的作用,进而揭示miR-101在LIRI中自噬调节的潜在功能和机制,以期为LIRI的临床治疗和研究提供一种新的思路。方法:建立小鼠肝脏节段性（70%肝叶夹闭）缺血以及再灌注损伤模型,血生化指标检测小鼠血清中转氨酶（ALT、AST）含量的变化,HE染色观察小鼠肝脏组织病理学损伤变化,TUNEL试剂盒检测小鼠肝脏细胞凋亡情况,免疫组化观察小鼠肝脏细胞增殖与凋亡情况,qRT-PCR检测各组miR-101、AMPK mRNA、mTOR mRNA 的变化情况,Western Blot 检测各组 AMPK、mTOR、p-mTOR、P62、Caspase-3 与 LC3 的表达情况。小鼠预先给予 miR-101 agomir/antagomir 以及自噬抑制剂3-MA处理后进一步验证miR-101在LIRI中的作用。使用miR-101 mimics/inhibitor转染AML12细胞,并建立细胞缺氧/复氧（H/R）模型来体外模拟LIRI,通过共聚焦显微镜与免疫荧光观察AML12细胞内自噬情况变化,qRT-PCR 检测各组 miR-101、AMPK mRNA、mTOR mRNA 的变化情况,Western Blot 检测各组 AMPK、mTOR、p-mTOR、P62、Caspase-3 与 LC3 的表达情况。使用自噬激活剂雷帕霉素以及自噬抑制剂3-MA预先处理AML12细胞后建立H/R模型进一步明确自噬对H/R处理诱导AML12细胞存活能力的影响以及miR-101通过影响自噬表达对LIRI产生的作用。结果:小鼠肝脏发生缺血/再灌注后,血清AST/ALT表达水平有所升高,且在再灌注12 h达到峰值;病理检测发现,再灌注后肝组织发生水肿肿胀、脂肪变性、空泡样变、片状坏死、中性粒细胞浸润和肝窦淤血等表现,而且这些病理改变随着再灌注时间的加长逐渐加重,在再灌注12 h时损伤最为严重;免疫组化以及TUNEL检测LIRI后肝细胞的增殖和凋亡情况发现,再灌注后细胞凋亡明显增加,细胞增殖水平明显降低;qRT-PCR结果示,再灌注后miR-101以及mTOR的表达含量逐渐下降,而AMPK的表达含量不断增加;Western Blot示AMPK、Caspase-3、LC3蛋白水平随着缺血/再灌注时间的延长逐渐增加,相反mTOR、p-mTOR以及P62的表达则随着缺血/再灌注时间的延长逐渐减少。在体内过表达miR-101后,缺血/再灌注导致的病理损伤以及细胞凋亡情况明显减轻,且mTOR的基因与蛋白水平均增加,相反AMPK的基因与蛋白水平明显下降,加用自噬抑制剂3-MA后miR-101的这种减轻肝损伤的表现更加显着。通过体外培养小鼠正常肝细胞AML12并建立H/R模型来体外模拟LIRI,研究发现,自噬水平的升高与肝细胞的损伤程度成正相关。当使用了 miR-101激动剂后自噬水平被抑制,肝细胞损伤明显减轻;共聚焦结果示,过表达miR-101后自噬体以及自噬溶酶体数量显着减少,且免疫荧光提示P62蛋白发生堆积无法降解;MTT结果显示,细胞发生缺氧/复氧时细胞存活率均有所下降。当使用雷帕霉素促进自噬的表达以及雷帕霉素和miR-101抑制剂共同作用下时,细胞的存活率显着下降。相反使用自噬抑制剂3-MA处理细胞后,细胞的存活率明显有所提升。qRT-PCR结果显示,细胞在缺氧/复氧后,过表达miR-101促进mTOR的表达并抑制 AMPK 的表达;Western Blot 结果示,过表达 miR-101 后 AMPK、Caspase-3、LC3的表达水平在明显降低,相反mTOR蛋白水平显着升高;当使用雷帕霉素以及miR-101抑制剂后mTOR、p-mTOR以及P62表达水平下降,Caspase-3、LC3表达增加,自噬水平升高。结论:肝脏发生缺血/再灌注损伤时miR-101的表达显着下降,AMPK的表达明显升高,且mTOR的表达受到抑制,进而自噬表达上调,加重肝脏损伤。因此miR-101可抑制自噬的表达进而减轻小鼠LIRI,促进受损肝组织的恢复。在小鼠LIRI中miR-101可通过调控AMPK-mTOR信号通路来减轻细胞自噬对于肝脏组织的损伤。

魏宝龙^[10]（2019）在《高通量检测功能性热缺血期细胞因子评估DCD大鼠供肝质量的可行性研究》文中指出【目的】（1）建立大鼠功能性热缺血心脏死亡（F-WIT-DCD）肝移植模型;（2）描述DCD大鼠不同功能性热缺血时间下缺血及再灌注期细胞因子变化;（3）探究功能性热缺血期细胞因子变化评估DCD大鼠供肝质量的可行性。【方法】本研究分为三部分,第一部分为大鼠F-WIT-DCD肝移植模型的建立。第一步,学习并训练大鼠活体原位肝移植手术;第二步,模拟临床中MaastrichtⅢ型心死亡肝移植手术情况,通过剪开膈肌的方法诱导大鼠血氧停滞,颈动脉动态监测大鼠动脉压,获取大鼠血压波动下降特征,记录大鼠进入功能性热缺血阶段的时间点;第三步,建立稳定的大鼠F-WIT-DCD肝移植模型。第二部分为DCD大鼠缺血及再灌注期细胞因子变化规律。根据功能性热缺血时长,实验共分4个组:（1）活体肝移植对照组（LT,n=4）;（2）功能性热缺血0分钟组（0min,n=10）;（3）功能性热缺血15分钟组（15min,n=10）;（4）功能性热缺血30分钟组（30min,n=10）。LT组无缺血处理,其余组供鼠经历不同功能性热缺血时间,肝移植术后再灌注6小时。取材分两阶段,热缺血末及再灌注6小时,获取供肝组织及外周血（用于第三部分研究）。采用Luminex?200检测缺血再灌注损伤相关细胞因子的变化情况,包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12（p70）、IL-13、IL-17A、IL-18、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、GRO/KC、IFN-γ、MCP-1、MIP-1α、MIP-3α、RANTES、TNF-α和VEGF。统计学处理采用SPSS 22.0对各个细胞因子浓度水平做单因素方差分析,p<0.05认定为组间具有显着差异;采用R 3.5.2绘制热图分析细胞因子缺血期及再灌注期浓度水平变化情况。第三部分为功能性热缺血期细胞因子评估DCD大鼠供肝质量的可行性探究。供肝组织采用丙二醛（MDA）试剂盒及超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒检测其水平变化情况;另一部分肝组织做H&E染色平片。外周血经低温超高速离心制备血清样品,检测丙氨酸转氨酶（ALT）及天冬氨酸转氨酶（AST）水平变化情况。该部分统计学处理采用Graph Pad Prism 6.0对ALT、AST、SOD、MDA做t检验处理,数据以均数-标准差（x±s）表示。根据H&E染色观察供肝病理情况,并根据结果建立肝损伤评分。功能性热缺血期细胞因子浓度数据,以SIMCA14.1对细胞因子行主成分分析（PCA）探究特异性细胞因子;结合肝损伤评分及特异性细胞因子做ROC回归曲线探究评估供肝质量最佳组合指标。【结果】在大鼠F-WIT-DCD肝移植模型的建立过程中,大鼠剪开膈肌后血压一过性波动上升约10mm Hg后逐渐下降,约4分30秒血压下降至50mm Hg,选定该血压时点作为供鼠进入功能性热缺血阶段的标志。大鼠经历不同时间长短的功能性热缺血处理后行原位肝移植,手术完成后约1-2小时苏醒,基础状态良好,活动度稍差,可自由饮水。探究DCD大鼠缺血及再灌注期细胞因子变化规律发现（1）在热缺血末共17种细胞因子表现出组间显着性差异（p<0.05）,包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、M-CSF、MIP-3α、TNF-α、VEGF和MCP-1。这些细胞因子均随功能性热缺血时间的延长,呈现逐渐下降的趋势,其下降幅度并不相同;（2）再灌注6小时后,所有细胞因子均不具有组间显着性差异;（3）各组间细胞因子在缺血期及再灌注期变化幅度及变化时间不同。根据第三部分结果发现（1）血清AST、ALT随着功能性热缺血时间延长而逐渐上调,侧面印证了随缺血时间延长,肝脏损伤逐渐加重;（2）肝组织中SOD随着功能性热缺血时间延长而逐渐上升,MDA逐渐下调,反映了缺血再灌注损伤过程中氧化应激情况逐渐加重;（3）H&E染色观察发现随着功能性热缺血时间延长,供肝损伤程度逐渐加重;（4）主成分分析获知,功能性热缺血期最有代表性的细胞因子为IL-2、IFN-γ、TNF-α;（5）做ROC回归曲线发现联合IL-2、IFN-γ、TNF-α评估供肝质量敏感度高于任意单一指标。【结论】（1）大鼠F-WIT-DCD肝移植模型该模型稳定可靠,可充分模拟MaastrichtⅢ型临床情况,适合研究心脏死亡肝移植术中各类病理生理情况。（2）供肝组织细胞因子在功能性热缺血期间即发生浓度改变。（3）功能性热缺血期细胞因子联合指标可用来评估供肝质量。

二、肝移植体保存—再灌注损伤的研究现状（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、肝移植体保存—再灌注损伤的研究现状（论文提纲范文）

（1）基于代谢产物分析建立供肝质量评估列线图的临床研究（论文提纲范文）

（2）SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律（论文提纲范文）

（3）TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）PACAP在肝缺血再灌注损伤中的作用和机制研究（论文提纲范文）

（5）公民死亡器官捐献与司法途径标准供肝移植后相关并发症的比较分析（论文提纲范文）

（6）小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究（论文提纲范文）

（7）辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（8）CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究（论文提纲范文）

（9）miR-101调控mTOR信号通路介导自噬参与肝脏缺血/再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）

（10）高通量检测功能性热缺血期细胞因子评估DCD大鼠供肝质量的可行性研究（论文提纲范文）

四、肝移植体保存—再灌注损伤的研究现状（论文参考文献）

• [1]基于代谢产物分析建立供肝质量评估列线图的临床研究[D]. 王宏. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
• [2]SD大鼠自体原位肝移植缺血再灌注损伤后粪便菌群的变化规律[D]. 朱宏伟. 昆明医科大学, 2021(02)
• [3]TRIM27对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 陈三洋. 郑州大学, 2020(02)
• [4]PACAP在肝缺血再灌注损伤中的作用和机制研究[D]. 薛郑泽. 浙江大学, 2020(01)
• [5]公民死亡器官捐献与司法途径标准供肝移植后相关并发症的比较分析[D]. 王华翔. 厦门大学, 2019(01)
• [6]小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究[D]. 曾宪鹏. 武汉大学, 2019(06)
• [7]辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究[D]. 刘忠忠. 武汉大学, 2019(08)
• [8]CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究[D]. 张黎. 昆明医科大学, 2019(05)
• [9]miR-101调控mTOR信号通路介导自噬参与肝脏缺血/再灌注损伤的机制研究[D]. 宋虎. 天津医科大学, 2019(02)
• [10]高通量检测功能性热缺血期细胞因子评估DCD大鼠供肝质量的可行性研究[D]. 魏宝龙. 天津医科大学, 2019(02)