饶敏[1]（2021）在《hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究》文中认为背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,是全球第三大癌症致死原因。我国胃癌的发病率及死亡率均高于世界平均水平。胃癌病程隐匿,目前早期诊断及治疗的手段仍有局限。circRNA成为近年肿瘤研究的热点,其可作为竞争性内源RNA与miRNA结合,参与相应mRNA的表达调控。circRNA-miRNA-mRNA网络这一全新基因表达调控模式与肿瘤包括胃癌的发生发展关系密切。而外泌体中的circRNA,存在于肿瘤微环境及各种体液中,不仅是肿瘤细胞与其微环境之间信息交流的桥梁,也因其方便检测而被认为是潜在的肿瘤生物标志物。许多研究已经探索了它们在胃癌诊断以及新型治疗中的可能应用。近年来,多项高通量分析关注了胃癌组织和体液中差异表达的circRNA（DE circRNA）,但血浆外泌体目前尚无研究报道。因此,本研究希望通过高通量RNA测序检测出胃癌患者血浆外泌体中的DE circRNA,进而通过体内外功能实验筛选出在胃癌进展中发挥重要功能的circRNA,从而帮助阐明胃癌的发病机制,并为胃癌的诊断和治疗提供新的线索。研究方法:（1）使用exoEasy Maxi Kit（Qiagen）从胃癌（GC）患者及健康对照（HC）血浆中分离外泌体,通过Western blot和透射电子显微镜对外泌体性状进行鉴定;而后通过高通量RNA测序和生物信息学分析,筛选外泌体中差异表达的circRNA;并通过GO和KEGG分析预测DE circRNA可能的发挥的功能和参与的信号通路;通过RT-q PCR对高通量测序结果加以验证,并筛选出进行功能研究的circRNA。（2）通过统计学分析评估GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。（3）利用circBase数据库查询（http://www.circbase.org）hsa＿circ＿0014606的序列、亲本基因及染色体定位。使用NCBI的基因组工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）进行基因组序列比对。利用Circ Bank数据库（http://www.circbank.cn/）查询hsa＿circ＿0014606的翻译和修饰信息。（4）构建过表达和敲减hsa＿circ＿0014606的慢病毒载体,包装慢病毒,感染GC细胞建立稳定细胞株。通过CCK8实验检测GC细胞增殖;通过Annexin VAlexa Fluor 488/PI染色检测细胞凋亡;通过划痕愈合实验检测细胞迁移能力;通过基质胶包被的Transwell实验检测细胞侵袭能力。（5）使用PMA刺激THP-1细胞使其分化为M0巨噬细胞,与GC细胞外泌体共培养后通过RT-q PCR检测M1巨噬细胞的标志性分子IL-12和i Nos,以及M2巨噬细胞的标志性分子IL-10和Arg-1,从而确定巨噬细胞的极化方向。（6）通过生物信息学分析预测hsa＿circ＿0014606的靶标miRNA及其下游靶基因;双荧光素酶报告实验验证它们之间的结合和相互作用。（7）使用NCD免疫缺陷小鼠构建了GC移植瘤模型以确定hsa＿circ＿0014606在体内对GC细胞成瘤的影响,及其对靶标miRNA及其下游靶基因的影响。研究结果:（1）我们采集了5名GC患者和5名健康供者的外周血样本,并从血浆中成功分离出外泌体。通过高通量RNA测序,在所有血浆外泌体样品中共检测到67,880个circRNA,筛选出1,060个在GC中差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。（2）GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。（3）RT-q PCR结果显示选定的6个上调的circRNA在GC细胞和/或GC组织中显着上调;其中hsa＿circ＿0014606上调最为稳定及显着。（4）GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。（5）hsa＿circ＿0014606来自YY1AP1（YY1 associated protein 1）基因,为外显子-内含子circRNA（EIciRNA）。其可能具有编码蛋白质的能力。（6）体外实验证实过表达hsa＿circ＿0014606促进GC细胞增殖、迁移和侵袭;敲减hsa＿circ＿0014606促进GC细胞凋亡。（7）AGS细胞外泌体能够促进THP-1细胞向M2巨噬细胞方向极化;过表达hsa＿circ＿0014606后的AGS细胞外泌体进一步促进了M2极化,而敲减hsa＿circ＿0014606则抑制了M2极化。（8）miRNA-194-5p是hsa＿circ＿0014606的靶miRNA,其在GC组织中表达下调,在AGS细胞中过表达hsa＿circ＿0014606可显着抑制其表达。（9）双荧光素酶报告实验证实hsa＿circ＿0014606可与miRNA-194-5P结合。（10）YAP1被预测为miRNA-194-5p的靶基因,双荧光素酶报告实验证实YAP1可与miRNA-194-5p结合,后者能够促进其转录本降解。（11）hsa＿circ＿0014606促进AGS细胞NCD小鼠体内成瘤,且可下调miRNA-194-5p并上调YAP1的表达。结论:通过高通量RNA测序,我们在GC患者血浆外泌体样品中筛选出1,060个差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了与GC发生发展密切相关的生物过程和通路,如细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。RT-q PCR证实了高通量测序的结果,且提示血浆外泌体中表达上调的circRNA很可能来自肿瘤组织和细胞。hsa＿circ＿0014606在GC组织和细胞中上调最为显着,其在患者血浆外泌体中的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。功能研究表明hsa＿circ＿0014606可能作为miRNA-194-5p的海绵,上调YAP1的表达,在GC细胞内发挥促进增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡的功能,并可进入GC细胞外泌体促进共培养的巨噬细胞向M2表型极化,从而促进GC的发生发展。
张安志[2]（2021）在《肿瘤相关巨噬细胞介导IL-6/STAT3通路调控胃腺癌细胞干性的作用机制初探》文中研究表明目的:探讨胃癌肿瘤微环境中M2型巨噬细胞通过IL-6/STAT3信号通路介导肿瘤细胞干性在胃癌演进过程的作用机制。方法:运用生物信息学CIBERSORT对TCGA中胃癌数据进行筛选并分析肿瘤微环境中各免疫细胞的分布特征;应用多重荧光免疫组化（m IHC）标记并验证关键免疫细胞在胃癌进展和预后评估中的作用。应用免疫组化法检测胃癌干性标记物（CD44,ALDH1）的表达情况,分析其在胃癌浸润、转移及预后判断中的作用。运用无血清培养法富集胃癌细胞（AGS,MKN-45）中球体细胞,q RT-PCR、Westerblot技术检测其干性指标（CD44,ALDH1）的表达;利用佛波酯（PMA）以及IL-4/IL-13诱导单核细胞（THP-1）转化为M2型巨噬细胞并用q RT-PCR检测其表型;胃癌细胞（AGS,MKN-45）及成球细胞分别和M2型巨噬细胞共培养,q RT-PCR、Westerblot技术和细胞功能实验（CCK8和Transwell迁移、侵袭实验）分别检测并分析M2型巨噬细胞对胃癌细胞、球体细胞干性（CD44,ALDH1）特征和恶性生物学行为的影响;应用生物信息学和二代测序NGS筛选M2型肿瘤相关巨噬细胞参与胃癌干性调控的因子和信号通路并用q RT-PCR进行验证,应用中和抗体及STAT3通路抑制剂分析M2型肿瘤相关巨噬细胞介导STAT3通路在胃癌干性调控中的作用。结果:1.生物信息学数据显示胃癌肿瘤微环境不同表型的巨噬细胞、T细胞及嗜酸性粒细胞等与正常组织存在明显分布差异性（P均<0.05）,其中各亚型巨噬细胞（M0,M1和M2）、CD8+T细胞、活化的肥大细胞和静息树突状细胞均与肿瘤Grade分级密切相关（P均<0.05）;M2型巨噬细胞和嗜酸性粒细胞均与肿瘤Stage分期密切相关（P均<0.05）;生存分析发现M2型巨噬细胞与患者不良预后关系密切（P<0.05）,CD8+T细胞和活化的CD4+记忆T细胞与患者预后较好密切相关（P均<0.05）。多重荧光免疫组化（m IHC）显示CD4+T细胞、CD8+T细胞和Tregs细胞的浸润与胃癌Grade分级密切相关,CD8+T细胞和CD163+M2型肿瘤相关巨噬细胞的浸润与胃癌Stage分期密切相关,M2型肿瘤相关巨噬细胞数量的增加还与胃癌淋巴结转移密切相关（P均<0.05）;生存分析显示Tregs细胞和M2型肿瘤相关巨噬细胞的高度浸润与胃癌患者的不良预后关系密切（P均<0.05）,CD4+T细胞和CD8+T细胞的高度浸润与胃癌患者预后较好密切相关（P均<0.05）。2.胃癌干性指标（CD44,ALDH1）的表达明显高于癌旁正常组织（P均<0.05）,CD44,ALDH1的表达与M2型肿瘤相关巨噬细胞呈明显正相关（P均<0.05）,且其过表达与肿瘤淋巴结转移、Stage分期和组织分级等临床参数密切相关（P均<0.05）。3.胃癌无血清成球细胞CD44和ALDH1的表达明显高于本底细胞（AGS,MKN-45）（P均<0.05）;与M2型巨噬细胞共培养的胃癌细胞（AGS,MKN-45）,其CD44,ALDH1的表达明显增强,增殖、侵袭和迁移能力均明显提高（P均<0.05）;与M2型巨噬细胞共培养的胃癌成球细胞,其CD44,ALDH1的表达也明显增强,恶性生物学行为也均明显提高（P均<0.05）。4.二代测序转录组数据显示胃癌细胞在和M2型巨噬细胞共培养后,JAK-STAT、PI3K/AKT、NF-KB等信号通路处于明显激活状态,体外共培养体系验证发现STAT3信号通路更为相关,应用Stattic阻滞STAT3信号通路,发现M2型巨噬细胞介导胃癌细胞（AGS,MKN-45）及成球细胞CD44,ALDH1的表达明显下调,其增殖、侵袭和迁移能力均明显下降（P均<0.05）。5.通过文献和分析转录组数据确定IL-6和IL-10可能是STAT3通路激活的重要因素,并通过q RT-PCR实验确定IL-6为介导STAT3通路的关键因子,随后利用实验进一步证实了抑制IL-6/STAT3通路会促使M2型巨噬细胞介导胃癌细胞（AGS,MKN-45）的干性标记表达明显下调,其增殖、侵袭和迁移能力也出现明显下降（P均<0.05）。结论:（1）胃癌肿瘤微环境高密度M2型肿瘤相关巨噬细胞和Tregs细胞的分布特征预示肿瘤的高侵袭性和患者的不良预后;（2）M2型肿瘤相关巨噬细胞介导IL-6/STAT3信号通路参与胃癌细胞干性的调控及肿瘤的演进过程。
肖唱[3]（2021）在《Hsa＿circ＿0035505在胃癌中的表达及与miR-582-3p/CREB5的相关性研究》文中提出目的:胃癌是对人类健康的主要危害,研究表明,90%的早期胃癌患者可以通过切除来治愈。然而,现有的肿瘤标志物,如癌胚抗原、糖类抗原19-9等在胃癌诊断中的阳性率较低。因此,探索更加有效的胃癌诊断和治疗的分子靶标将具有重要意义。环状RNA（circular RNAs,circ RNAs）是近年来发现的在真核细胞中广泛存在的非编码RNA,可作为分子“海绵”吸附miRNA和转录调节因子。近年来,circ RNAs的异常表达在包括胃癌在内的许多人类疾病中得到报道。目前关于hsa＿circ＿0035505在胃癌中的研究未见报道,本研究拟检测hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞及组织中的表达,进一步分析其表达与胃癌患者临床病理因素的关系,并初步研究其在胃癌演进过程中可能发挥作用的分子机制。研究方法:1.收集2017年-2020年肿瘤外科手术切除的胃癌及配对非癌组织标本213例,所有标本均来源于中国医科大学附属第一医院肿瘤外科。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞和213例胃癌及配对正常胃粘膜组织中的表达情况,分析其与胃癌临床病理因素的相关性。2.通过qRT-PCR检测miR-582-3p在33例、CREB5在78例胃癌及配对正常胃粘膜组织中的表达情况,对hsa＿circ＿0035505、miR-582-3p和CREB5在33例匹配胃癌组织中的表达进行Spearman相关性分析。对CREB5的表达与78例胃癌患者临床病理因素相关性进行分析。Western blot检测胃癌及配对正常胃粘膜组织中CREB5蛋白的表达情况。Kaplan-Meier方法用于分析胃癌患者的预后。3.通过qRT-PCR检测PXDN和AKT在45例胃癌及配对正常胃粘膜组织中的表达情况,并对AKT和CREB5、PXDN在45例匹配胃癌组织中的表达分别进行Spearman相关性分析。并利用TCGA和GEO数据库对CREB5和PXDN共同表达时对胃癌患者临床病理因素和预后进行统计分析。利用c Bio Portal和Metascape数据库预测CREB5和PXDN的生物学功能。4.采用Graph Pad Prism 5.0.1作图,SPSS 19.0版软件进行数据处理。计量资料的比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.通过qRT-PCR检测hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞系及213例胃癌及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞和组织中的表达升高;其高表达与胃癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移和p TNM分期等病理因素有关。2.qRT-PCR检测miR-582-3p在胃癌细胞系及33例胃癌及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:miR-582-3p在胃癌细胞系中表达降低;与配对正常胃粘膜组织相比,miR-582-3p在胃癌组织中的表达水平显着降低。qRT-PCR检测CREB5在胃癌细胞系及78例胃癌组织及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:CREB5在胃癌细胞系中的表达升高;与配对正常胃粘膜组织相比,CREB5在胃癌组织中的表达水平显着升高。其高表达与胃癌患者的年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和p TNM分期等病理因素有关。Western blot结果显示:与配对正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中CREB5的蛋白水平明显升高。Kaplan-Meier分析结果显示:与CREB5低表达组相比,CREB5高表达组的中位总体生存时间（OS）和中位首次进展时间（FP）均显着缩短。相关性分析结果显示:在33例胃癌组织中,hsa＿circ＿0035505的表达与miR-582-3p的表达呈负相关,miR-582-3p的表达与CREB5的表达成负相关,hsa＿circ＿0035505与CREB5在胃癌组织中的表达成正相关。3.通过qRT-PCR检测PXDN在45例胃癌组织及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:PXDN在GC组织中的表达上调。CREB5和PXDN在GC组织中的表达呈正相关关系。二者共同高表达与胃癌患者的年龄、肿瘤部位、WHO组织学分型、Borrmann分型、Lauren分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移和p TNM分期等病理因素密切相关。与CREB5和PXDN低表达的胃癌患者相比,CREB5和PXDN高表达的胃癌患者显示出较差的总体生存时间;与单基因高表达组相比,CREB5和PXDN共同表达的胃癌患者预后更差。AKT与CREB5、PXDN在胃癌组织中的表达均呈正相关关系。Metascape网站富集分析结果显示,CREB5相关基因和PXDN相关基因均参与血管发育、细胞形态发生和分化和细胞外基质粘附等生物过程。结论:1.Hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞和组织中的表达升高,其高表达与胃癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移和p TNM分期等病理因素有关。提示hsa＿circ＿0035505可能在胃癌的演进过程中起促进作用。2.CREB5在胃癌细胞和组织中的表达上调,其高表达与胃癌患者预后不良相关。Hsa＿circ＿0035505可能通过结合miR-582-3p,调节CREB5的表达进而参与胃癌的进展过程。3.PXDN在胃癌组织中的表达上调。CREB5和PXDN可能通过调控PI3K/AKT途径的激活在胃癌中发挥癌基因的作用,有望成为候选的诊断生物标志物或潜在的治疗靶标。
杨婷[4]（2021）在《烯醇化酶ENO1作为代谢分子开关调节胃癌细胞干性特征的作用与机制的研究》文中指出胃癌是全球发病率排名第五,致死率排名第三的恶性肿瘤。虽然目前医疗在不断发展,针对胃癌的治疗方法也在不断更新,但是由于肿瘤存在转移、复发和耐药等恶性行为使得胃癌患者预后差,五年生存率不及30%。目前认为肿瘤干细胞是肿瘤细胞中的一小部分亚型,其与肿瘤转移、复发和耐药等恶性行为息息相关。由于肿瘤干细胞的存在使得肿瘤细胞群体呈现出干性特征,促使肿瘤出现一系列恶性事件。本研究中,我们首先将胃癌细胞系SNU16和PAMC-82进行无血清悬浮培养（sphere培养）用以富集胃癌干细胞（spheroid细胞）。与亲本细胞相比,spheroid细胞具有更强的干性特征,所以spheroid细胞被认为是胃癌干细胞,我们发现烯醇化酶ENO1在spheroid细胞中的表达量显着高于亲本细胞,提示ENO1可能与胃癌细胞的干性相关。我们分别构建了稳定过表达和敲降ENO1的胃癌细胞系并检测其干性特征的变化。我们发现ENO1能够促进胃癌细胞的自我更新能力,致瘤能力,迁移侵袭能力以及降低其对化疗药物的敏感性。同时我们发现ENO1能够促进胃癌细胞中干性基因CD44,OCT4,Nanog和Sox2的表达。因此,ENO1能够显着促进胃癌细胞的干性。我们利用ENO1的抑制剂ENOblock处理胃癌细胞系,发现ENOblock能够明显降低胃癌细胞的干性,其作用等同于敲低ENO1的表达量,进一步证实ENO1对胃癌细胞干性特征的促进作用,ENO1是维持胃癌干细胞的重要分子。ENO1是糖酵解途径的一个非限速酶,但是我们发现ENO1能够独立调控胃癌细胞系的糖酵解水平,是糖酵解途径的一个重要的分子开关。我们检测了过表达和敲降ENO1的稳定胃癌细胞系中糖酵解水平的变化,发现ENO1可以显着提高胃癌细胞的葡萄糖消耗量、乳酸生成量以及ATP生成量,并且通过胞外酸化率检测实验发现ENO1能够明显提高胃癌细胞的糖酵解速率,所以ENO1能够显着促进胃癌细胞的糖酵解水平。为了进一步证实ENO1对糖酵解途径的调控作用,我们利用抑制剂ENOblock抑制了 胃癌细胞系中ENO1的功能并检测细胞内糖酵解水平的变化。我们发现ENOblock能够明显降低胃癌细胞的葡萄糖消耗量、乳酸生成量以及ATP生成量,并且通过胞外酸化率检测实验发现ENOblock能够显着降低胃癌细胞的糖酵解速率,进一步证实了 ENO1具有促进胃癌细胞糖酵解水平的作用。我们利用糖酵解抑制剂2-DG抑制胃癌细胞的糖酵解水平后发现胃癌细胞的自我更新能力、迁移侵袭能力以及耐药能力都下降,所以抑制了糖酵解水平能够抑制胃癌细胞的干性。我们同时利用2-DG分别处理稳定过表达和敲降ENO1的胃癌细胞系后发现2-DG能够回复ENO1表达量变化引起的胃癌细胞干性变化,所以我们得出结论:ENO1是通过促进糖酵解水平从而促进了胃癌细胞的干性。ENO1通过促进胃癌细胞系糖酵解水平提高了 ATP的生成量,由于AMPK能够被越来越大的AMP/ATP 比率激活,我们通过检测过表达和敲降ENO1的稳定胃癌细胞系中AMPK的变化,以及ENOblock或者2-DG处理胃癌细胞系后AMPK的变化,证实了 ENO1促进了胃癌细胞系糖酵解水平后使得ATP的产生量提高,从而抑制了 AMPK的激活,进而激活了 mTOR。我们利用AMPK的激动剂AICAR处理过表达ENO1的胃癌细胞系,发现AICAR能够部分回复ENO1表达量变化引起的胃癌细胞干性特征的改变。因此,ENO1是部分通过调控AMPK发挥促进胃癌细胞系干性的作用。此外,我们发现外源乳酸能够通过调控P13K/AKT/mTOR通路显着促进胃癌细胞的干性。我们检测了过表达和敲降ENO1的稳定胃癌细胞系中PI3K/AKT/mTOR通路的变化,以及ENOblock或者2-DG处理胃癌细胞系后PI3K/AKT/mTOR通路的变化,发现ENO1促进了胃癌细胞糖酵解水平后使得乳酸生成量提高,从而激活了 PI3K/AKT通路,进而激活了 mTOR。我们使用PI3K的抑制剂LY294002处理过表达ENO1的胃癌细胞系,发现LY294002能够部分回复ENO1表达量变化引起的胃癌细胞干性的改变。我们使用PI3K的激动剂740Y-P处理敲降ENO1的稳定胃癌细胞系,也发现740Y-P能够部分回复ENOI表达量变化引起的胃癌细胞干性的改变。因此,ENO1是部分通过调控PI3K/AKT通路发挥促进胃癌细胞系干性的作用。由于AMPK与PI3K/AKT通路都能够调控mTOR,我们使用mTOR的抑制剂Rapamycin处理过表达ENO1的胃癌细胞系,发现Rapamycin几乎能够全部回复ENO1表达量变化引起的胃癌细胞干性的改变;我们使用mTOR的激动剂MHY1485处理敲降ENO1的胃癌细胞系,发现MHY1485几乎能够全部回复ENO1表达量变化引起的胃癌细胞干性的改变。因此,ENO1通过促进胃癌细胞系的糖酵解水平提高了 ATP和乳酸的生成量,从而调控了 AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR通路协同促进胃癌细胞系的干性。我们应用胃癌患者临床标本制备的组织芯片分析ENO1与临床指标的相关性,结果发现ENO1的表达量越高患者生存率越小,ENO1的表达量越低患者的生存率越高,ENO1与胃癌患者临床预后息息相关。ENO1有望成为胃癌干细胞的生物标志物以及治疗的新靶点。本研究的主要结论是:ENO1通过促进胃癌细胞系的糖酵解水平,提高了 ATP和乳酸的生成,从而抑制了 AMPK并且促进了 PI3K/AKT的激活,两者协同促进了mTOR的激活,进而促进了胃癌细胞系的干性。
赵江桥[5]（2021）在《LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究旨在分析lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的表达情况及与患者预后的关系,探究lncRNA LIFR-AS1对胃癌的影响及其参与的分子机制,为临床诊断、治疗及预后评估胃癌提供可靠的理论基础和新的方向。方法:1.通过RNA-seq测序分析,发现在胃癌中存在lncRNA LIFR-AS1表达的下调;通过样本表达分析,进一步证明lncRNA LIFR-AS1在数据库胃癌样本、胃癌组织和细胞系中的表达变化。2.研究lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的功能分析,主要通过过表达lncRNA LIFR-AS1分析lncRNA LIFR-AS1表达对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和肿瘤形成的影响。3.通过分子生物学、细胞生物学等手段探究lncRNA LIFR-AS1对胃癌作用的具体机制。结果:1.为了鉴定胃癌中的基因差异表达谱,我们对4组胃癌组织及其相应的癌旁组织进行了组织微阵列分析（tissue microarray analysis）,结果与癌旁组织相比,发现lncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈低表达;此外,我们还发现miR-4698、Cdc25B、CD133、SOX2、NANOG、ER等基因在胃癌中呈高表达。为了进一步证明我们测序结果的可靠性,我们通过qPCR进一步检测了胃癌组织及对应的癌旁组织中这些基因在RNA水平的表达变化,结果发现与测序结果一致,lncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈低表达,miR-4698、Cdc25B、CD133、SOX2、NANOG、ER等基因在胃癌中呈高表达。这些结果表明胃组织从正常状态转变为具有侵袭性的恶性胃癌不仅存在编码蛋白基因的改变,也存在大量非编码RNA（lncRNA、miRNA）的改变,其中lncRNA LIFR-AS1的变化尤为明显。接下来,我们将以lncRNA LIFR-AS1为重点研究对象,探讨该lncRNA对胃癌发生和发展的意义及具体的分子机制。为了研究lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的生物学作用,我们从TCGA中获取正常和肿瘤组织的基因表达数据,通过分析,我们发现与正常组织相比,lncRNA LIFR-AS1在胃癌组织表达下调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。利用RT-qPCR检测了lncRNA LIFR-AS1在41个GC组织和邻近组织中的表达情况,结果发现lncRNA LIFR-AS1在GC组织的确呈低表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。我们还进一步分析了lncRNA LIFR-AS1表达与胃癌临床特征的关系,结果发现,lncRNA LIFR-AS1在分化更低、恶性程度更高、淋巴转移更明显的胃癌组织中下调更为明显,且差异具有统计学意义（P<0.05）。之后,我们利用TCGA数据库分析了lncRNA LIFR-AS1表达与胃癌患者总体生存时间的关系。结果发现,lncRNA LIFR-AS1高表达的患者总体生存时间显着高于lncRNA LIFR-AS1低表达的胃癌患者,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,我们还分析了lncRNA LIFR-AS1在人正常胃粘膜细胞GES-1和胃癌细胞系（MKN45和AGS）中的表达情况,结果发现,lncRNA LIFR-AS1在MKN45和AGS细胞中的表达低于GES-1细胞,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明lncRNA LIFR-AS1的表达与胃癌的发生和发展呈负相关,lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌的进展。2.通过Lipofectamine（?）3000转染法将lncRNA LIFR-AS1转染到胃癌细胞MKN45和AGS中,通过qPCR检测lncRNA LIFR-AS1的表达情况。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1转染后在MKN45和AGS中的表达显着上调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。接下来,我们将用这两株过表达了lncRNA LIFR-AS1的胃癌细胞株进行增殖、凋亡、侵袭、转移以及肿瘤形成等细胞生物学功能的检测。我们利用CCK-8和Ed U试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS增殖的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的增殖,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的增殖。我们利用克隆形成试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS克隆形成的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞克隆的形成,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的克隆形成。我们利用流式细胞技术检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS凋亡的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着促进胃癌细胞的凋亡,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够促进胃癌细胞的凋亡。我们利用Transwell试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS侵袭的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的侵袭,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的侵袭。我们利用细胞划痕试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS迁移的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的迁移,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的迁移。我们利用裸鼠皮下成瘤模型检测lncRNA LIFR-AS1表达对MKN45细胞肿瘤形成的影响,利用Tunel染色法检测肿瘤中细胞的凋亡情况,利用Ki67染色法检测肿瘤中细胞的增殖情况。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制MKN45细胞肿瘤的形成,并且lncRNA LIFR-AS1过表达后肿瘤细胞Ki67信号明显减弱,Tunel信号显着增强,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌细胞肿瘤的形成,抑制胃癌细胞的增殖,促进胃癌细胞的凋亡。3.我们预测miR-4698在lncRNA LIFR-AS1中的预结合位点。为了验证lncRNA LIFR-AS1和miR-4698预测的序列结合位点,我们进行了荧光素酶报告基因检测,进一步确认它们之间的关联。结果显示,转染LIFR-AS1-WT和miR-4698模拟物后,MKN45和AGS细胞的荧光素酶活性降低,且差异具有统计学意义（P<0.05）。值得注意的是,过表达lncRNA LIFR-AS1降低了miR-4698在MKN45和AGS细胞中的表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,与正常组织和细胞相比,miR-4698在胃癌组织和胃癌细胞系中表达上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关检验显示,lncRNA LIFR-AS1与miR-4698呈负相关。以上结果表明,lncRNA LIFR-AS1与miR-4698之间存在负相关,lncRNA LIFR-AS1可能通过下调miR-4698抑制胃癌的发生。Target Scan揭示MTUS1的3’-UTR包含miR-4698的互补区域。用miR-4698模拟物和MTUS1-WT或MTUS1-MUT片段共转染后,评估荧光素酶活性的变化。结果显示miR-4698模拟物和MTUS1-WT共转染的细胞荧光素酶活性受到抑制,且差异具有统计学意义（P<0.05）。miR-4698过表达和抑制载体（miR-4698模拟物和miR-4698抑制剂）转染胃癌细胞后,监测miR-4698和MTUS1之间的相关性。miR-4698模拟物转染细胞后miR-4698表达明显增强,miR-4698抑制剂转染细胞则抑制miR-4698的表达。Western-blot结果显示,miR-4698过表达可抑制MTUS1表达,miR-4698抑制则可增加MTUS1表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,通过qPCR检测,我们发现与正常组织和细胞相比,MTUS1在胃癌组织和胃癌细胞系（MKN45和AGS）中表达下调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关检验进一步证实了MTUS1与miR-4698之间存在负相关关系,MTUS1与lncRNA LIFR-AS1之间存在正相关关系。以上结果表明,MTUS1是miR-4698新的潜在靶基因,同时也受到lncRNA LIFR-AS1的正向调控。用pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1表达载体转染细胞,进而探索下游相关信号通路的改变。值得注意的是,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够显着抑制胃癌细胞系（MKN45和AGS）中MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。接下来,我们利用si-MTUS1载体转染胃癌细胞抑制MTUS1表达,探讨lncRNA LIFR-AS1与MTUS1的关系。结果发现,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够显着上调胃癌细胞系MKN45和AGS细胞中MTUS1的表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。相比之下,抑制MTUS1的表达能够显着增加MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1共转染后,si-MTUS1逆转了胃癌细胞系（MKN45和AGS）中MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明,在胃癌细胞中过表达的lncRNA LIFR-AS1能够通过上调MTUS1抑制MEK/ERK信号通路的激活。本研究还发现,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdc25B的表达。与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达可促进胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdk1的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1共转染后si-MTUS1逆转了胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdc25B的表达抑制和Cdk1的磷酸化诱导。以上结果表明,lncRNA LIFR-AS1可能通过抑制Cdc25B活性促进Cdk1的磷酸化。我们通过Western-blot和免疫组化分析了lncRNA LIFR-AS1表达对MKN45形成的肿瘤组织中MEK/ERK信号通路活性的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达不仅能够促进MTUS1的表达,还能抑制MEK和ERK的磷酸化,这进一步表明lncRNA LIFR-AS1通过上调MTUS1抑制MEK/ERK信号通路的激活。结论:LncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈异常低表达,且与患者的预后有关。在胃癌中,lncRNA LIFR-AS1通过下调miR-4698、上调MTUS1而抑制MEK/ERK信号通路的激活,促进细胞的凋亡,抑制细胞的增殖、侵袭和转移以及肿瘤的形成。因此,lncRNA LIFR-AS1可以作为胃癌治疗的潜在靶点。
李亚[6]（2020）在《新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究》文中研究说明我国是胃癌大国,中西医结合治疗是我国胃癌综合治疗的独特模式。临床实践证实采用新加良附方（高良姜、香附、穿山龙）联合化疗针对进展期胃癌较单纯化疗具有更高的临床缓解率和更优的生活质量。机制研究发现新加良附方抗胃癌作用与调控凋亡相关基因表达有关,但其上游调控机制尚未明确。基于前期基础,本研究拟从microRNA角度,深入探讨新加良附方及穿山龙主要成分薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路及miR-34a凋亡相关靶基因的调控作用和对凋亡信号通路的激活作用,明确新加良附方及薯蓣皂苷元的作用机制,为新加良附方治疗胃癌提供基础研究依据。目的通过体内外实验明确新加良附方及成分薯蓣皂苷元对人胃癌细胞功能的抑制作用,基于miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路,明确新加良附方及薯蓣皂苷元抗胃癌作用机制。方法1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究①新加良附方及薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:CCK-8实验检测新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞增殖的作用,流式细胞术检测新加良附方及薯蓣皂苷元对胃癌细胞周期及凋亡的调控作用,划痕实验检测新加良附方抑制胃癌细胞迁移作用;②新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:qPCR检测正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞miR-34a表达,慢病毒感染构建过表达mi R-34a的胃癌HGC-27细胞,CCK-8方法检测过表达miR-34a胃癌HGC-27细胞增殖功能,划痕实验检测过表达mi R-34a胃癌细胞迁移能力,并通过qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a基因水平影响;③新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:qPCR方法检测过表达miR-34a后HGC-27细胞miR-34a/SIRTl/p53通路及miR-34a靶基因表达水平,qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a靶基因及Caspase凋亡通路的作用,Western blot检测新加良附方、薯蓣皂苷元对Caspase凋亡通路作用。2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究BSP方法检测胃癌细胞miR-34a甲基化水平,并构建HGC-27胃癌细胞荷瘤小鼠模型,设正常对照组、模型组、新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、5-Aza-CdR组、中剂量联合组及高剂量联合组,药物干预18天,观察裸鼠一般状态;测量移植瘤长短径,计算瘤体积和抑瘤率,观察裸鼠生存期;qPCR方法检测miR-34a表达情况;Western blot方法检测miR-34a/SIRT1/p53相关蛋白表达及Caspase凋亡通路情况。结果1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验:新加良附方呈浓度及时间依赖性地抑制HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖;新加良附方提高G1期HGC-27细胞,降低G2期细胞;新加良附方可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;与对照组比较,新加良附方组除24h 4mg/mL浓度外,其余各组均可抑制胃癌HGC-27细胞迁移功能,作用呈时间及浓度依赖性;新加良附方可显着抑制MGC80-3细胞迁移功能,作用呈时间依赖性,差异有统计学意义;各浓度新加良附方24h及48h均可抑制AGS细胞迁移;薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:薯蓣皂苷元呈时间及浓度依赖性地抑制胃癌HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖作用,差异有统计学意义;薯蓣皂苷元干预后胃癌细胞周期无明显改变;薯蓣皂苷元可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:HGC-27、MGC80-3及AGS细胞中miR-34a相对表达量显着低于正常细胞GES-1,p<0.05;与阴性对照组相比较,过表达miR-34a后,HGC-27细胞增殖能力受到显着抑制,并可显着抑制其迁移能力;新加良附方及薯蓣皂苷元干预后,HGC-27及AGS细胞miR-34a表达水平升高,p<0.01;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:过表达miR-34a显着上调p53并下调SIRT1表达水平,可提高Bax及Caspase-3 mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平;新加良附方及薯蓣皂苷元干预可提高p53表达,降低SIRT1表达水平,并可上调Bax及Caspase-3的mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平,p<0.01,差异有统计学意义;Z-VAD-FMK可降低新加良附方及薯蓣皂苷元诱导的HGC-27细胞凋亡;新加良附方作用后可降低Caspase-9、Caspase-3前体水平,升高活化Caspase-3的表达水平;2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究胃癌细胞HGC-27在miR-34a各位点甲基化水平均较高,选取HGC-27细胞构建胃癌荷瘤小鼠模型,药物干预后观察到新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及中剂量联合组、高剂量联合组裸鼠状态较好,反应灵敏,活动及饮食、饮水量正常,5-Aza-CdR组裸鼠一般状态较差。5-Aza-CdR组裸鼠体重于实验给药第8天后逐渐下降,第11天其体重低于新加良附方高剂量组,差异有统计学意义,第15天,其体重低于模型组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及高剂量联合组,p<0.05,第18天,其体重低于其余各组,p<0.05,差异有统计学意义。5-Aza-CdR组抑瘤率为32.08%,与模型组比较,p>0.05,差异无统计学意义,中剂量联合组抑瘤率为35.00%,高剂量联合组抑瘤率为37.18%,与模型组相比较,p<0.05,差异有统计学意义。模型组平均生存时间为46.33±10.50天,新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、中剂量联合组及高剂量联合组裸鼠均未出现死亡现象,平均生存时间为57.00±0.00天,具有延长荷瘤裸鼠生存时间的趋势,5-Aza-CdR组裸鼠平均生存时间为40.33±7.37天,生存时间较模型组短。除新加良附方中剂量组外,其余各治疗组均可提高胃癌miR-34a表达,以联合组作用最为显着;新加良附方中剂量、高剂量、薯蓣皂苷元及高剂量联合组均可显着增加p53蛋白的表达,且药物干预各组均可显着抑制SIRT1 蛋白的表达,可降低 Bcl-2、Survivin 表达,并提高 Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 及 Caspase-3 底物 Cleaved PARP 蛋白的表达。结论1.miR-34a表达水平异常与胃癌发生密切相关;2.新加良附方可抑制胃癌细胞增殖及迁移、调节细胞周期、诱导凋亡,其成分薯蓣皂苷元可抑制胃癌细胞增殖,并诱导胃癌细胞凋亡,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶基因及激活Caspase凋亡通路相关;3.新加良附方联合5-Aza-CdR可抑制胃癌裸鼠移植瘤生长,并可改善裸鼠一般状态,有维持体重、延长其生存时间的趋势,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶蛋白及Caspase凋亡信号通路相关。
吴帅[7]（2020）在《miR-492通过DNMT3B促进胃癌细胞对顺铂耐药和转移的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景在世界范围内每年大约有一百万人被诊断为胃癌,其中东亚地区属于胃癌的高发区域,每年约有738,000人死于胃癌,这些都使得胃癌在肿瘤发病率中位于第四并且死亡率位于第二,同时胃癌也导致过高的肿瘤经济负担。2000年后,几项大规模的对照研究显示辅助化疗对胃癌患者的生存有益。这些研究表明,胃癌切除术后接受辅助治疗的患者的生存率高于单纯接受手术的患者。随后的许多研究也发现了辅助化疗对胃癌患者的有益作用。因此,近20年来胃癌的辅助化疗得到了研究和临床的重视,已成为胃癌切除后晚期的标准治疗方案之一。对于晚期胃癌来说,含铂方案的化疗是晚期胃癌的标准治疗,但是有的患者会出现耐药,目前关于胃癌铂类耐药的具体机制还不明确,其中化疗诱导的肿瘤干细胞表达是铂类治疗失败的原因之一。因此加强对胃癌耐药机制的研究,寻找切实可行的预防治疗途径,是胃癌研究的重要方向之一。miRNAs是一种长度约为18-24个核苷酸的非编码单链小分子物质,广泛存在于真核生物中,是一组不参与蛋白编码的短序列RNA,其通过与靶基因mRNA的3′UTR结合抑制其翻译或诱导其降解,从而发挥对蛋白翻译的调控作用。到目前为止,已经发现了超过2500个miRNAs（miRbase数据库）,它们的异位表达与肿瘤的增殖、侵袭、转移、生长和凋亡有关。随后越来越多的的研究也发现致瘤性miRNA（onco-miRNA）和抑瘤性miRNA（suppressor miRNA）在胃癌进展中发挥重要作用。之前的研究发现miR-492在多种肿瘤中促进肿瘤细胞的增殖、转移、耐药以及与肿瘤干细胞相关。本研究的主要目的是明确miR-492在胃癌中的表达,以及对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及对铂类治疗的影响,进一步具体明确miR-492的作用机制,同时为胃癌的发生、发展以及耐药提供新的视角。方法:1.胃癌组织和胃癌细胞株中miR-492表达的检测以及胃癌组织中的miR-492表达量与预后的关系采用RT-PCR的方法对胃癌组织和胃癌细胞株（SNU-5、MGC-803、AGS和SGC-7901）和胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中miR-492的表达进行检测、定量分析。采用Kaplan-Meier曲线分析miR-492的表达量与患者OS的相关性。2.miR-492对胃癌细胞株增殖、转移、凋亡的影响及其机制采用CCK-8、流式凋亡检测、Transwell检测分别转染miR-492mimic和inhibitor后细胞的增殖转移能力;蛋白印迹、免疫荧光、流式分选、RT-PCR验证miR-492对细胞干性标志物和DNMT3B的影响;采用RT-PCR的方法对胃癌组织中miR-492和DNMT3B的表达进行检测,分析二者的相关性。3.miR-492通过DNMT3B调控胃癌细胞干性的机制采用慢病毒人为的对DNMT3B实施干扰,WB进行验证;CCK-8、流式凋亡、Transwell检测DNMT3B对胃癌细胞增殖转移能力的影响;蛋白印迹、免疫荧光、流式分选、RT-PCR验证miR-492对细胞干性标志物的影响;成球能力分析胃癌细胞系的干性。4.miR-492通过DNMT3B对胃癌耐药的影响给予裸鼠皮下注射胃癌细胞和转染了miR-492 inhibitor的胃癌细胞构建皮下移植瘤,测量肿瘤大小绘制生长曲线,流式分选检测CD133表达,免疫组化检测增殖指数。5.统计方法使用SPSS 22.0进行统计分析。计数资料用M±SD表示,计量资料用中位数和范围表示,两组间比较采用t检验,Kaplan-Meier,Log rank用于生存分析,P<0.05认为有统计学意义。结果:1.miR-492在肿瘤组织和肿瘤细胞系中处于高表达状态（P<0.05）。进一步分析了miR-492表达的高低和患者预后的关系,发现miR-492高表达与患者预后差的相关,miR-492表达越高的患者预后越差（P=0.0287）。2.miR-492促进胃癌细胞的增殖、转移和抗凋亡,并且是通过增加胃癌细胞的干性来增加增殖、转移和抗凋亡;发现miR-492对DNMT3B的表达存在调控作用,其机制是miR-492与DNMT3B的转录启动子结合抑制了DNMT3B的转录。3.DNMT3B可以抑制CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1在胃癌中的表达,减少胃癌细胞球的数量,并且miR-492通过抑制DNMT3B参与调控CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1,具体机制为:miR-492与DNMT3B的启动子结合抑制了DNMT3B的转录,DNMT3B的下调,导致CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1启动子区域的甲基化下调从而增加了CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1的转录。4.miR-492促进肿瘤生长,在抑制miR-492后肿瘤的增长被减慢（P<0.05）,但是在抑制DNMT3B的表达后这一抑制现象被部分逆转。结论:1.miR-492在胃癌组织和胃癌细胞系中高表达;2.miR-492通过调控胃癌细胞干性转换增加了胃癌细胞的增殖、转移和抗凋亡能力;3.miR-492通过负向调节DNMT3B,使得后者DNMT3B对CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1启动子的甲基化水平降低,导致肿瘤细胞干性增加,从而增加了胃癌细胞的增殖、转移和抗凋亡能力;4.miR-492通过DNMT3B调控胃癌细胞干性参与对顺铂的耐药。
修一冉[8]（2019）在《LGR5、β-catenin和E-cadherin在胃癌组织中的表达及与临床病理特征的关系》文中研究表明目的检测LGR5、β-catenin和E-cadherin在胃癌组织和癌旁正常黏膜组织中的表达情况,分析三者与临床病理因素的关系及三者表达的相关性,从而期待能为胃癌的诊断、治疗及预后提供依据。方法规范化收集2013年1月至2018年1月经内蒙古医科大学附属医院病理科确诊的胃癌病人139例及距癌组织2cm远的正常胃黏膜组织139例纳入本实验。所有胃癌病例经病理证实均为原发性胃癌,所选患者术前均无辅助放疗、化疗及内分泌治疗史,制成病理石蜡切片。运用免疫组织化学方法检测胃癌组织及癌旁正常黏膜组织中LGR5、β-catenin和E-cadherin的表达,分析三者的表达与胃癌的临床病理特征之间的关系及三者之间是否存在相关性。采用SPSS13.0对数据进行统计分析。结果1.LGR5蛋白的阳性表达率,胃癌组织（61.87%）明显高于癌旁正常黏膜组织（28.06%）（P<0.05）,LGR5蛋白在胃癌组织中主要表达于细胞质或细胞膜上。β-catenin蛋白的阳性表达率,癌旁正常黏膜组织（92.09%）明显高于胃癌组织（51.80%）（P<0.05）,β-catenin蛋白在胃癌组织中细胞膜表达缺失,或出现细胞质、细胞核异常染色。E-cadherin蛋白的阳性表达率,癌旁正常黏膜组织（94.96%）明显高于胃癌组织（53.96%）（P<0.05）,E-cadherin蛋白在胃癌组织中细胞膜着色不连续、点状、间断状。2.LGR5蛋白的阳性表达率与胃癌分化程度、是否存在淋巴结转移以及TNM分期相关。LGR5蛋白的阳性表达率,高中分化组（73.87%）明显高于低分化组（48.48%）（P<0.05）;有淋巴结转移组（75.71%）明显高于无淋巴结转移组（47.83%）（P<0.05）;Ⅰ+Ⅱ期胃癌（69.14%）明显高于Ⅲ+Ⅳ期胃癌（51.72%）（P<0.05）。但与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度及是否存在远处转移无关（P>0.05）。3.β-catenin蛋白的阳性表达率与胃癌分化程度、浸润深度、是否存在淋巴结转移以及TNM分期相关。β-catenin蛋白的阳性表达率,高中分化组（73.97%）明显高于低分化组（27.27%）（P<0.05）;未侵及浆膜层组（63.64%）明显高于侵及浆膜层组（31.37%）（P<0.05）;无淋巴结转移组（75.36%）明显高于有淋巴结转移组（28.57%）（P<0.05）;Ⅰ+Ⅱ期胃癌（72.84%）明显高于Ⅲ+Ⅳ期胃癌（22.41%）（P<0.05）。但β-catenin蛋白表达情况与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小及是否存在远处转移无关（P>0.05）。4.E-cadherin蛋白的阳性表达率与胃癌分化程度、浸润深度、是否有远处转移以及TNM分期相关。E-cadherin蛋白的阳性表达率,高中分化组（79.45%）明显高于低分化组（25.76%）（P<0.05）;未侵及浆膜层组（64.77%）明显高于侵及浆膜层组（35.29%）（P<0.05）;无远处转移组（68.25%）明显高于有远处转移组（42.11%）（P<0.05）;Ⅰ+Ⅱ期胃癌（64.20%）明显高于Ⅲ+Ⅳ期胃癌（39.66%）（P<0.05）。但E-cadherin蛋白表达情况与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小及是否存在淋巴结转移无关（P>0.05）。5.139例胃癌组织中,有26例LGR5蛋白和β-catenin蛋白同时阳性表达,有7例同时阴性表达,Spearman等级相关分析结果显示LGR5蛋白与β-catenin蛋白的阳性表达呈负相关（r=-0.550,P<0.05）。139例胃癌组织中,有39例LGR5蛋白和E-cadherin蛋白同时阳性表达,有17例同时阴性表达,Spearman等级相关分析结果显示LGR5蛋白和E-cadherin蛋白的阳性表达呈负相关（r=-0.220,P<0.05）。139例胃癌组织中,有52例E-cadherin蛋白和β-catenin蛋白同时阳性表达,有44例同时阴性表达,Spearman等级相关分析结果显示E-cadherin蛋白与β-catenin蛋白的阳性表达呈正相关（r=0.380,P<0.05）。结论1.LGR5蛋白在胃癌组织中高表达,而在癌旁正常黏膜组织中低表达,提示LGR5蛋白可能为胃癌干细胞标志物,它可能能作为检测早期胃癌的一个有用的生物学标志物。2.β-catenin蛋白和E-cadherin蛋白在癌旁正常黏膜组织中高表达,而在胃癌组织中低表达,提示β-catenin蛋白和E-cadherin蛋白表达下降可能参与了胃癌发生发展过程。3.LGR5蛋白的表达与胃癌分化程度、是否存在淋巴结转移以及TNM分期相关,提示LGR5蛋白在胃癌的发展过程中可能起重要作用。4.β-catenin蛋白的表达与胃癌分化程度、浸润深度、是否存在淋巴结转移以及TNM分期相关,提示β-catenin蛋白在胃癌的发生发展转移中可能起重要作用。5.E-cadherin蛋白的表达与胃癌分化程度、浸润深度、是否有远处转移以及TNM分期相关,提示E-cadherin蛋白可能在胃癌的发生发展转移中起重要作用,它表达下降可能导致胃癌细胞具有恶性侵袭性并易于转移发生。6.胃癌组织中,LGR5蛋白与β-catenin蛋白和E-cadherin蛋白的表达呈负相关,提示LGR5蛋白在胃癌组织中细胞膜表达的增多可能受β-catenin蛋白及E-cadherin蛋白的调节。这可能对于肿瘤的恶性转化及侵袭性生长具有重要提示意义。7.胃癌组织中,β-catenin蛋白与E-cadherin蛋白的表达呈正相关,提示在胃癌的发展过程中,β-catenin蛋白与E-cadherin蛋白可能存在某种机制相互作用。联合检测LGR5蛋白与β-catenin蛋白和E-cadherin蛋白有可能对临床早期诊断和评估胃癌的侵袭转移潜能有重要意义。
徐骏飞[9]（2019）在《SPOP在胃癌中的表达和功能研究及miRNA-543对其的靶向调控》文中提出研究背景和目的:胃癌,是目前主要恶性肿瘤之一,虽然近年来我国在胃癌防治工作中取得了很大进步,治疗效果也已经发生了巨大的变化,但是5年的生存率仍然很低,究其原因还是因为对胃癌发生发展的具体机制不清楚。胃癌干细胞是一些具有干细胞特性的细胞,与肿瘤恶性程度、耐药及转移高度相关。SPOP基因是一种高度保守性的基因,其缺失可能引起肿瘤的发生和发展,前期研究已经发现SPOP在很多实体肿瘤中扮演着重要的角色,但是在胃癌干细胞中的地位及作用目前仍然不清。众所周知,蛋白表达过程有多种机制参与其中,而miRNA在肿瘤的发生和发展进程中可以通过对细胞增殖、分化、凋亡的调控起作用。但具体是通过何种途径调控细胞,也不是很清楚。本研究目的在于探讨SPOP在胃癌中的表达和功能,以及miRNA-543对其的靶向调控的相关途径,为胃癌的治疗提供一些新的思路。研究方法:1、对胃癌细胞株MKN-45运用悬浮培养法培养胃癌干细胞并予以分离,采用免疫荧光、Western blot对干细胞标记物鉴定并进行动物实验检测胃癌干细胞的成瘤能力。2、分别使用Western blot及实时定量PCR对胃癌及癌旁正常组织中SPOP的表达进行检测。3、分析胃癌组织SPOP的表达与临床病理特征等因素的关系。4、检测SPOP在胃癌细胞株MKN-45球体细胞与贴壁细胞中的表达。5、通过将SPOP过表达慢病毒转染球体细胞,使用Western blot检测过表达SPOP在肿瘤干细胞的标记物（Oct3/4、Sox2和CD44）表达情况,以及相应的成球能力。6、通过将过表达SPOP的球体细胞和对照的球体细胞分别接种于裸鼠,观察成瘤情况。7、选取了 36对胃癌及癌旁组织使用实时定量PCR检测miRNA-543及SPOP的表达情况,然后采用Spearman相关系数分析进行数据统计分析,得出胃癌组织中miRNA-543与SPOP的表达水平的相关性。8、通过荧光素酶报告基因实验证实SPOP是否在胃癌中是miRNA-543直接的靶点。9、通过实时定量PCR及Western blot分析,转染了 miRNA-543 mimic的MKN-45和AGS相比于对照组,miRNA-543及SPOP mRNA和蛋白的表达情况;以及转染了 miRNA-543 inhibitor 的 MKN-45 和 AGS 相比于对照组,miRNA-543 及SPOP mRNA和蛋白的表达情况。10、通过转染 miRNA-543 mimic、miRNA-543 inhibitor 以及 miRNA-543 inhibitor+SPOP siRNA后,观察细胞迁移和侵袭情况。11、通过 Western blot 检测转染了 miRNA-543 mimic、miRNA-543 inhibitor 后的MKN45和AGS细胞中SPOP、E-cadherin及vimentin蛋白的表达水平,说明EMT在此过程中起到的作用。研究结果:1、成功培养并分离出的悬浮球体细胞,随着时间的推移,球体细胞逐渐增多,球体不断增大。2、分别使用免疫荧光、Western blot分析悬浮球体细胞与贴壁细胞干细胞标记物CD44、Sox2和Oct3/4的表达差异。发现悬浮球体细胞具有肿瘤干细胞特性,并且其成球能力、干细胞标志物的表达等均比贴壁细胞显着增高,致瘤能力也较贴壁细胞显着增强。3、分别使用Western blot及实时定量PCR对胃癌及癌旁正常组织SPOP的表达进行检测,结果显示,胃癌组织SPOP蛋白、SPOP mRNA表达水平显着低于其对应癌旁组织,起到抑癌基因的作用。4、分析60例胃癌组织SPOP表达与临床病理特征的关系,发现胃癌组织SPOP的表达与肿瘤TNM分期（P=0.038）、分化程度（P=0.029）、浸润深度（P=0.009）、淋巴结转移（P=0.001）有关,差异具有显着统计学意义,与患者的性别、年龄、肿瘤大小及是否存在远处转移无明显相关性。对SPOP表达、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、性别、年龄、肿瘤部位及分化程度等临床病理参数与胃癌患者生存期分别进行Cox回归单因素分析,结果显示SPOP表达（P<0.001）、TNM分期（P<0.001）、浸润深度（P=0.007）、淋巴结转移（P=0.034）及分化程度（P=0.041）是影响胃癌患者生存时间的因素,差异均有统计学意义。将上述影响胃癌患者生存时间有意义的因素导入Cox 比例风险模型分析,发现SPOP表达（P=0.002）、TNM分期（P=0.018）及分化程度（P=0.010）是影响胃癌生存时间的独立因素。采用Kaplan-Meier法分析SPOP表达与胃癌患者生存时间的关系,分析结果显示SPOP高表达患者与低表达患者生存时间有显着差异,高表达组患者的5年生存率高于低表达组,差异有统计学意义（P=0.036）。5、我们通过将SPOP过表达慢病毒转染球体细胞,即在新鲜培养液中加入SPOP过表达慢病毒的转染球体细胞,以空载慢病毒处理的球体细胞作为对照,14天后观察比较转染SPOP后球体细胞形成子代球体的情况,并计算两组细胞的克隆球形成率。结果显示SPOP蛋白在胃癌干细胞中的表达明显低于贴壁细胞（P<0.05）,SPOP mRNA在胃癌干细胞中的表达也明显低于贴壁细胞（P<0.05）。6、通过将SPOP过表达慢病毒转染球体细胞,发现过表达SPOP能显着抑制肿瘤干细胞标记物（Oct3/4、Sox2和CD44）的表达,而且成球率也被显着抑制了。将过表达SPOP的球体细胞和对照的球体细胞分别接种于裸鼠,可见过表达SPOP能显着抑制肿瘤生长（P<0.05）。7、我们选取了 36对胃癌组织及胃癌癌旁组织使用实时定量PCR检测miRNA-543及SPOP的表达情况,miRNA-543在癌组织中的表达要强于癌旁组织（P<0.001）。SPOP mRNA则在癌组织中的表达则前一致（P<0.001）。并采用Spearman相关系数进行数据统计分析,得出胃癌组织中miRNA-543与SPOP的表达水平呈负相关（P<0.001）。8、通过荧光素酶报告基因实验证实SPOP是胃癌中miRNA-543直接的靶点。9、通过 qPCR 及 Western blot,在 MKN-45 及 AGS 细胞中转染了 miRNA-543 mimic可显着减少SPOP mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,转染miRNA-543 inhibitor后,MKN-45和AGS细胞的SPOP mRNA和SPOP蛋白水平均显着上升。（P<0.05）。10、通过转染miRNA-543 mimic及inhibior,可得出miRNA-543对胃癌细胞迁移和侵袭产生影响。并通过Western blot分析显示转染miRNA-543 mimic的细胞中SPOP和E-钙黏蛋白的表达减少,波形蛋白水平上调,转染miRNA-543 inhibitor结果相反。因此表明miRNA-543诱导胃癌细胞EMT。研究结论:1、通过悬浮培养法培养出的球体细胞,具有肿瘤干细胞的特性,有比贴壁细胞更强的成瘤能力。2、SPOP在胃癌中是抑癌基因,且在胃癌球体细胞中表达比贴壁细胞更明显。SPOP可以作为胃癌生存时间的独立因素。3、miRNA-543在胃癌中起促进作用,呈负相关靶向调控SPOP,且经证实EMT在其调控过程中起重要作用。
徐其银[10]（2019）在《miR-338-3p靶向SIRT2调控Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌细胞迁移和侵袭的机制研究》文中研究指明胃癌作为消化道常见的恶性肿瘤,多因胃上皮细胞的恶性转化而发生,是世界上第四大恶性肿瘤。2012年,全球新出现的胃癌患者在94万左右,其中至少有70万人因胃癌而死亡。胃癌的诱发因素十分复杂,幽门螺杆菌的定植,肥胖,特异性的饮食习惯等都可能是胃癌发生的原因,其早期症状不明显,大多数患者确诊时就处于肿瘤转移的中晚期治疗阶段,中位生存时间多在4-11个月,5年生存率则让人难以接受,还不足10%。虽然几年来早期诊断方法如内镜诊断和影像学诊断,以及治疗方法取得了许多革新,患者的整体存活率有所改善。但远处转移性胃癌患者的治疗仍面临巨大挑战,晚期胃癌患者的死亡多归因于腹膜种植,血行转移和淋巴结转移,因而,有必要探讨胃癌进展的作用机制,阐明胃癌细胞增殖、侵袭等生物学过程的发生原理。大量研究表明,非编码RNA对于胃癌的演变不可或缺。非编码RNA是不编码蛋白质,基于长度,非编码RNA被分成了不同的类别。大RNA包括长的非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,小核仁RNA,环状RNA,tRNA和rRNA,其长度都大于50核苷酸。小RNA包括微小RNA（microRNA,miRNA）,siRNA和piRNA,其长度均小于50核苷酸。目前,miRNA在胃癌中扮演的角色逐渐被研究者们所揭示。最近,miR-338-3p被发现在乳腺癌、肝细胞癌等癌症中出现异常的低表达,外源性的miR-338-3p的人为表达可造成癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力发生显着改变。目前还没有研究就miR-338-3p在胃癌中的作用和分子机制进行确切的报道,为此本研究将胃癌患者的临床组织标本和体外培养的胃癌细胞作为研究对象,对miR-338-3p在胃癌中的表达和功能进行了分析,结合生物信息学和双荧光素酶报告实验寻找miR-338-3p的下游靶基因,以探明胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的可能生物学机制,为miR-338-3p作为预测胃癌转移的分子标志和相关胃癌治疗靶向药物的开发提供理论基础。本研究主要包括:第一章MIR-338-3P在胃癌中的表达及功能分析目的:探究miR-338-3p在胃癌细胞、组织中的表达情况,分析miR-338-3p对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:选择于2016年2月至2018年3月在宜宾市第一人民医院医院接受手术的31例胃癌患者,收集胃癌组织和相应的邻近组织（距肿瘤组织≥5cm）的标本;体外培养GES-1,MGC-803,HGC-27,MGC-803,SGC-7901,BGC-823细胞系。qRT-PCR检测胃癌细胞、组织和正常胃粘膜细胞、组织中miR-338-3p表达差异,以对照mimics,miR-338-3p mimics转染胃癌细胞,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。结果:1、胃癌组织中miR-338-3p的表达较正常胃黏膜组织下调（P<0.05）,胃癌细胞系MGC-803,HGC-27,MGC-803,SGC-7901,BGC-823中miR-338-3p的表达水平显着低于GES-1胃粘膜上皮细胞（P<0.05）;2、miR-338-3p mimics转染后HGC-27细胞,miR-338-3p的表达水平显着增加（P<0.05）;3、与miR-con组相比,培养48h及72h时,miR-338-3p组的细胞增殖活性显着降低（P<0.05）;4、与miR-con组相比,miR-338-3p组能促进细胞的凋亡（P<0.05）;5、与miR-con组相比,miR-338-3p组HGC-27细胞迁移和侵袭能力显着下降（P<0.05）。结论:miR-338-3p在胃癌细胞、组织中较正常胃粘膜细胞、组织明显下调,miR-338-3p上调,可促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第二章MIR-338-3P靶基因的生物信息学分析及功能验证目的:寻找miR-338-3p的下游靶基因,并分析其对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:选择于2016年2月至2018年3月在宜宾市第一人民医院接受手术的31例胃癌患者,收集胃癌组织和相应的邻近组织（距肿瘤组织≥5cm）的标本;体外培养GES-1,MGC-803,HGC-27,MGC-803,SGC-7901,BGC-823细胞系。结合生物信息学预测结果选定SIRT2是miR-338-3p的候选靶基因,qRT-PCR、Western blot检测胃癌细胞、组织和正常胃粘膜细胞、组织中SIRT2 mRNA、蛋白表达差异,直线回归分析SIRT2表达与miR-338-3p表达的相关性,以对照mimics,miR-338-3p mimics转染胃癌细胞,qRT-PCR、Western blot检测胃癌细胞SIRT2 mRNA、蛋白表达,双荧光素酶报告实验检验miR-338-3p是否能直接调控SIRT2,人为沉默SIRT2表达,MTT实验检测胃癌细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。结果:1、SIRT2在胃癌组织中mRNA表达较正常胃黏膜组织明显升高（P<0.05）,Western blot实验也证实SIRT2蛋白表达在胃癌组织中明显升高;2、SIRT2的表达水平与miR-338-3p负相关（r2=0.1017,P<0.05）;3、miR-338-3p组SIRT2mRNA表达较相应对照明显降低,anti-miR-338-3p组SIRT2mRNA表达则较相应对照明显升高（P<0.05）,Western blot检测SIRT2蛋白表达也出现类似结果;4、在双荧光素酶报告基因实验中,野生型SIRT2 3’-UTR与miR-338-3p mimics共转染后荧光素酶活性显着降低（P<0.05）,但SIRT2 3’-UTR突变体与miR-338-3pmimics共转染后,荧光强度不明显变化（P>0.05）;5、与si-con组相比,培养48h及72h时,SIRT2组的细胞增殖活性显着降低（P<0.05）;6、与SIRT2组比较,si-SIRT2组能促进细胞的凋亡（P<0.05）;7、与si-con组相比,si-SIRT2组HGC-27细胞迁移和侵袭能力显着下降（P<0.05）。结论:SIRT2是miR-338-3p直接调控的下游靶基因,其表达在胃癌细胞、组织中较正常胃粘膜细胞、组织明显上调,SIRT2下调,可促进胃癌细胞凋亡,可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第三章MIR-338-3P调控胃癌细胞迁移和侵袭的分子机制目的:进一步分析miR-338-3p/SIRT2功能轴对胃癌增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用,探究Wnt/β-catenin信号通路对于miR-338-3p/SIRT2调控的反应性。方法:以mimics con,miR-338-3p mimics,inhibitor con,miR-338-3p inhibitor,对照siRNA,SIRT2 siRNA,miR-338-3p mimics和pcDNA 3.1空载体,miR-338-3p mimics和pcDNA 3.1-SIRT2过表达载体转染HGC-27细胞中并分别标记为miR-Con组,miR-338-3p组,anti-miR-con组,anti-miR-338-3p组,si-con组,si-SIRT2组,miR-338-3p+Ctrl组和miR-338-3p+SIRT2组,qRT-PCR检测各组细胞miRNA表达,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot实验检测蛋白表达。结果:1、转染miR-338-3p mimics后,胃癌细胞SIRT2表达较miR-con组明显降低（P<0.05）,共转染pcDNA 3.1空载质粒的miR-338-3p-Ctrl组SIRT2表达与miR-338-3p组无明显差异（P>0.05）,而共转染pcDNA 3.1-SIRT2的miR-338-3p+SIRT2组SIRT2蛋白表达较miR-338-3p-Ctrl组明显升高（P<0.05）,而miR-338-3p+SIRT2组SIRT2蛋白表达较miR-con组无明显差异（P>0.05）;2、miR-338-3p组胃癌细胞增殖能力较miR-con组明显降低（P<0.05）。miR-338-3p+SIRT2组胃癌细胞增殖能力则有一定程度的恢复（P<0.05）;3、与miR-con组相比miR-338-3p组、miR-338-3p+SIRT2组和miR-338-3p+Ctrl组明显促进细胞的凋亡（P<0.05）;miR-338-3p+Ctrl组与miR-338-3p组细胞的凋亡无明显差异（P>0.05）;miR-338-3p+SIRT2组与miR-338-3p组细胞的凋亡能力明显降低,有差异（P<0.05）;4、miR-338-3p组胃癌细胞迁移、侵袭能力较miR-con组明显降低（P<0.05）,miR-338-3p+SIRT2组胃癌细胞迁移、侵袭能力则有一定程度的恢复（P<0.05）;5、si-SIRT2组Wnt、β-catenin蛋白表达较si-con组明显降低（P<0.05）。结论:SIRT2上调可部分逆转miR-338-3下调引起的胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭抑制,Wnt/β-catenin信号通路是miR-338-3p/SIRT2调控胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭抑制的下游信号通路之一。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CircRNAS的分类和特征 |
| 1.2.1 circRNAs的分类和生物发生 |
| 1.2.2 circRNAs的特征 |
| 1.3 CIRCRNAS在胃癌中的作用机制和生物学功能 |
| 1.3.1 胃癌中circRNAs的表达概况 |
| 1.3.2 circRNAs在胃癌中的作用机制 |
| 1.3.3 circRNAs对胃癌细胞生物学功能的影响 |
| 1.3.4 circRNAs在 GC中发挥作用的信号通路 |
| 1.3.5 外泌体circRNAs在 GC中的功能 |
| 1.3.6 circRNAs研究的公共数据库 |
| 1.4 CircRNAS在胃癌中的应用 |
| 1.4.1 circRNAs作为胃癌的生物标志物 |
| 1.4.2 circRNAs作为GC治疗靶点 |
| 1.4.3 外泌体circRNAs在 GC诊断和治疗中的应用价值 |
| 1.5 问题和展望 |
| 第2章 胃癌中差异表达的CIRCRNAS |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 患者和样本收集 |
| 2.2.2 细胞 |
| 2.2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分离外泌体 |
| 2.3.2 透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态 |
| 2.3.3 Western blot检测外泌体标志物 |
| 2.3.4 提取外泌体RNA |
| 2.3.5 RNA文库构建和测序 |
| 2.3.6 鉴定差异表达的circRNA |
| 2.3.7 GO(Gene ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome)分析 |
| 2.3.8 逆转录实时定量 PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 血浆外泌体的分离和鉴定 |
| 2.4.2 GC患者血浆外泌体中差异表达的circRNA |
| 2.4.3 DE circRNA的 GO和 KEGG富集 |
| 2.4.4 RT-qPCR验证DE circRNA的表达 |
| 2.4.5 GC患者血浆外泌体中hsa_circ_0014606 的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中发挥促癌作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 hsa_circ_0014606 序列分析 |
| 3.3.2 慢病毒包装和感染 |
| 3.3.3 GC细胞增殖实验 |
| 3.3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.3.5 划痕愈合实验 |
| 3.3.6 Transwell实验 |
| 3.3.7 THP-1 细胞分化和极化实验 |
| 3.3.8 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 hsa_circ_0014606 的亲本基因和剪接结构 |
| 3.4.2 hsa_circ_0014606在GC细胞中的过表达和敲减 |
| 3.4.3 过表达hsa_circ_0014606 促进GC细胞增殖和存活 |
| 3.4.4 hsa_circ_0014606 促进GC细胞迁移和侵袭 |
| 3.4.5 外泌体hsa_circ_0014606 促进THP-1 细胞向M2 巨噬细胞方向极化 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中的作用靶标 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞和实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 靶标miRNA和 mRNA预测 |
| 4.3.2 RT-qPCR |
| 4.3.3 荧光素酶报告实验 |
| 4.3.4 NCG小鼠体内成瘤实验 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 预测的靶标miRNA |
| 4.4.2 hsa_circ_0014606 对候选靶标miRNA表达水平的影响 |
| 4.4.3 hsa_circ_0014606 可与miRNA-194-5p直接结合 |
| 4.4.4 YAP1是miRNA-194-5p的靶基因 |
| 4.4.5 hsa_circ_0014606 促进GC细胞NCD小鼠体内成瘤 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法(Materials& Methods) |
| 1.材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 生信筛选 |
| 2.2 多重免疫组织化学(multiplexed immunohistochemistry,m IHC)染色分析 |
| 2.3 免疫组织化学技术(immunohistochemistry) |
| 2.4 培养基及主要试剂配制 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 细胞功能学实验 |
| 2.7 Western Blot实验 |
| 2.8 Quantificational real time-PCR实验 |
| 2.9 胃癌细胞转录组测序分析 |
| 3.统计学分析 |
| 结果(Results) |
| 1.胃癌肿瘤微环境中关键免疫细胞的分布与胃癌进展及预后的相关性 |
| 1.1.生物信息学数据分析免疫细胞在胃癌微环境中的分布特征 |
| 1.2.胃癌肿瘤微环境中关键免疫细胞的空间分布特征 |
| 1.3.关键免疫细胞的空间分布情况和胃癌患者预后密切相关 |
| 2.胃癌组织中肿瘤干性特征与肿瘤相关巨噬细胞的协同效应在肿瘤进展和预后判断中的作用 |
| 2.1.CD44在胃癌组织中的表达及其临床病理学意义 |
| 2.2.ALDH1在胃癌组织中的表达及其临床病理学意义 |
| 2.3.CD44、ALDH1的表达与胃癌患者预后之间的相关性 |
| 2.4.M2型肿瘤相关巨噬细胞与胃癌组织CD44、ALDH1表达之间的相关性 |
| 3.胃癌成球细胞具有干细胞样细胞的特征 |
| 3.1.无血清成球实验诱导胃癌成球细胞 |
| 3.2.胃癌球体细胞具有肿瘤干细胞特性 |
| 3.3.胃癌球体细胞具有更强的增殖能力 |
| 4.M2型巨噬细胞诱导及表型鉴定 |
| 4.1.诱导THP-1为M2型巨噬细胞 |
| 4.2.M2型巨噬细胞表型鉴定 |
| 5.M2型巨噬细胞增强胃癌细胞的干性特征并影响其恶性生物学行为 |
| 5.1.M2型巨噬细胞增强胃癌细胞的迁移能力 |
| 5.2.M2型巨噬细胞增强胃癌细胞的侵袭能力 |
| 5.3.M2型巨噬细胞增强胃癌细胞的增殖能力 |
| 5.4.M2型巨噬细胞促进胃癌细胞的干性特征 |
| 5.5.M2型巨噬细胞能够促进胃癌干性特征球体细胞的形成 |
| 5.6.M2型巨噬细胞能够促进胃癌球体细胞的迁移能力 |
| 5.7.M2型巨噬细胞能够促进胃癌球体细胞的侵袭能力 |
| 5.8.M2型巨噬细胞能够促进胃癌球体细胞的增殖能力 |
| 6.M2型TAMs通过IL-6/STAT3信号通路介导肿瘤细胞干性促进胃癌的恶性生物学行为转化 |
| 6.1.M2型TAMs调控胃癌肿瘤细胞干性关键基因及信号通路的筛选 |
| 6.2.M2型巨噬细胞介导JAK2-STAT3信号通路促进胃癌肿瘤细胞干性特征的形成 |
| 6.3.M2型巨噬细胞介导JAK2-STAT3信号通路促进胃癌干性特征球体细胞的迁移能力 |
| 6.4.M2型巨噬细胞介导JAK2-STAT3信号通路促进胃癌干性特征球体细胞的侵袭能力 |
| 6.5.M2型巨噬细胞主要通过IL-6介导JAK2-STAT3信号通路促进胃癌细胞干性特征的形成 |
| 6.6.抑制IL-6/STAT3通路对共培养后胃癌细胞干性的影响 |
| 6.7.抑制IL-6/STAT3通路对共培养后胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 6.8.抑制IL-6/STAT3通路对共培养后胃癌细胞侵袭能力的影响 |
| 6.9.抑制IL-6/STAT3通路对共培养后胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献(References) |
| 文献综述 STAT3在肿瘤微环境中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:Hsa_circ_0035505 在胃癌组织中的表达及临床病理意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 胃癌细胞和组织RNA提取及反转录 |
| 2.3.3 qRT-PCR检测 |
| 2.3.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Hsa_circ_0035505 的测序结果 |
| 3.2 胃癌细胞和组织中hsa_circ_0035505 的表达显着上调 |
| 3.3 Hsa_circ_0035505 表达与胃癌患者临床病理因素的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Hsa_circ_0035505、mi R-582-3p和 CREB5 轴在胃癌中的相关性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 胃癌细胞和组织RNA提取及反转录 |
| 2.3.3 qRT-PCR检测 |
| 2.3.4 蛋白提取 |
| 2.3.5 Western Blot实验 |
| 2.3.6 Kaplan-Meier plotter数据库 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MiR-582-3p在胃癌细胞及组织中的表达显着降低 |
| 3.2 CREB5 mRNA在胃癌细胞及组织中的表达显着升高 |
| 3.3 胃癌组织中CREB5的蛋白水平升高 |
| 3.4 胃癌组织中CREB5表达与胃癌临床病理因素的关系 |
| 3.5 CREB5高表达与胃癌患者预后呈负相关 |
| 3.6 胃癌组织中hsa_circ_0035505与mi R-582-3p、CREB5表达的相关性 |
| 3.6.1 胃癌组织中hsa_circ_0035505与mi R-582-3p表达呈负相关 |
| 3.6.2 胃癌组织中mi R-582-3p与 CREB5表达呈负相关 |
| 3.6.3 胃癌组织中hsa_circ_0035505与CREB5表达呈正相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:胃癌组织中CREB5和PXDN表达的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 qRT-PCR检测 |
| 2.3.2 TCGA和GEO数据库 |
| 2.3.3 cBioPortal和Metascape数据库 |
| 2.3.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PXDN在胃癌组织中的表达显着升高 |
| 3.2 胃癌组织中CREB5与PXDN的表达呈正相关 |
| 3.3 CREB5和PXDN共同表达与胃癌临床病理因素的关系 |
| 3.4 CREB5和PXDN共同高表达与胃癌患者预后不良相关 |
| 3.5 胃癌组织中AKT与 CREB5、PXDN的表达呈正相关 |
| 3.6 CREB5和PXDN的生物功能预测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 非编码RNA在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一. 实验材料 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验动物 |
| 3. 免疫组织芯片 |
| 4. 主要试剂 |
| 5. 抗体 |
| 二. 实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 构建稳定感染细胞系 |
| 3. Western Blotting实验 |
| 4. 免疫组织化学实验 |
| 5. 葡萄糖消耗量检测实验 |
| 6. 细胞内乳酸生成量检测 |
| 7. ATP生成量的检测 |
| 8. 胞外酸化率检测实验 |
| 9. 肿瘤细胞自我更新能力检测 |
| 10. 肿瘤细胞致瘤能力检测 |
| 11. 肿瘤细胞的侵袭能力检测 |
| 12. 肿瘤细胞的迁移能力检测 |
| 13. 肿瘤细胞的耐药能力检测 |
| 14. 统计学分析方法 |
| 实验结果 |
| 一. ENO1可能与胃癌细胞的干性特征相关 |
| (一) Sphere培养富集得到的spheroid细胞是胃癌干细胞 |
| (二) ENO1在spheroid细胞中的表达量相比亲本细胞显着上调 |
| 二. ENO1能够促进胃癌细胞的干性 |
| (一) ENO1能够显着促进胃癌细胞系的干性特征 |
| (二) ENO1能够促进胃癌细胞系的干性相关特征 |
| (三) ENO1的抑制剂ENOblock能够抑制胃癌细胞系的干性特征 |
| 三. ENO1通过上调胃癌细胞系的糖酵解水平促进胃癌细胞的干性 |
| (一) ENO1能够独立调控胃癌细胞系的糖酵解水平 |
| (二) ENO1的抑制剂ENOblock能够抑制胃癌细胞系的糖酵解水平 |
| (三) 应用2-DG抑制糖酵解水平能够显着抑制胃癌细胞的干性 |
| (四) 2-DG能够回复ENO1表达量改变引起的胃癌细胞干性特征的变化 |
| 四. ENO1提高了胃癌细胞内ATP和乳酸的生成量进而通过AMPK/mTOR通路和PI3K/AKT/mTOR通路协同促进胃癌细胞的干性 |
| (一) ENO1提高了ATP的生成量后通过调控AMPK/mTOR通路发挥促进胃癌细胞干性特征的作用 |
| (二) ENO1提高了胃癌细胞乳酸生成后调控PI3K/AKT/mTOR通路发挥作用 |
| (三) AMPK的激动剂AICAR和PI3K的抑制剂LY294002对胃癌细胞干性的协同作用 |
| 五.ENO1与胃癌临床预后的关系 |
| (一) ENO1在胃癌组织中高表达 |
| (二) ENO1表达量与胃癌患者临床指标的相关性分析 |
| (三) ENO1表达量与胃癌患者的预后显着相关 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点自我评价 |
| 参考文献 |
| 胃癌干细胞功能和临床应用的研究进展 （文献综述） |
| 参考文献 |
| 基金资助情况 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LncRNA LIFR-AS1影响胃癌发生的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在胃癌中的作用及其临床应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药抗胃癌基础研究现状与进展 |
| 1 中药有效成分基础研究 |
| 2 单味中药基础研究 |
| 3 复方基础研究 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌相关miRNA研究现状与展望 |
| 1 miRNA在胃癌发生发展中的作用研究 |
| 2 miRNA在胃癌诊断治疗中的作用研究 |
| 3 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究 |
| (一) 新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (二) 薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (三) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (四) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 miR-492在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达特征分析和对患者预后的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 MiR-492与胃癌细胞生物学功能的关系 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-492 通过DNMT3B调控胃癌细胞的干性 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 miR-492 通过DNMT3B参与了胃癌细胞对顺铂的耐药 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:miRNA在胃癌发生发展以及诊断治疗中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 SPOP在胃癌中的表达及其临床意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 胃癌中MIRNA-543通过靶向SPOP调控细胞的迁移和侵袭 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 胃癌干细胞及MIRNAS对胃癌的影响 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间科研课题 |
| 攻读博士研究生期间的科研成果 |
| 致谢 |
| 英文缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 miR-338-3p在胃癌中的表达及功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 miR-338-3p靶基因的生物信息学分析及功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-338-3p调控胃癌细胞迁移和侵袭的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 不足与展望 |
| 文献综述:非编码RNA和胃癌 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
