赵超越[1]（2021）在《小鼠不同发育时期胚胎来源的新型胚胎干细胞系的建立与生物学特性研究》文中进行了进一步梳理小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,mESCs）是从小鼠囊胚的内细胞团分离获得。本研究室建立的培养体系“Activin A+BMP4+CHIR99021+LIF”（ABC/L）获得的小鼠多能干细胞（ASCs）具有高甲基化、四倍体补偿能力、且由单细胞可得到嵌合体小鼠。本研究首次利用ABC/L培养体系建立来源于不同发育时期胚胎的干细胞系,包括2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚及E 5.5早期原肠胚,然后对建立的ABC/L胚胎干细胞系（ABC/L-ESCs）的多能性进行检测及研究,最后将已建立的细胞系进行多聚甲醛损伤后,观察细胞的抗损伤情况。具体实验结果如下:1.利用ABC/L培养体系建立来源于不同发育时期胚胎的干细胞系利用ABC/L建立不同发育时期的小鼠新型胚胎干细胞,包括2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚、E 5.5原肠胚,建系率分别是12.5%、25%、10.9%、28.6%、10%和6.67%。结果显示ABC/L-ESCs的AP染色均为阳性。通过细胞生长曲线和单细胞形成克隆效率与对照组（2i/L-ESCs）相比较,ABC/L-ESCs的生长速率及单细胞形成克隆效率较高。2.新型胚胎干细胞系的生物特性及多能性分析通过核型分析鉴定ABC/L-ESCs（来源于2-细胞）染色体数目为40条的比例为77.22%。在RNA表达水平上,与对照组2i/L-ESCs相比,ABC/L-ESCs的多能性基因Oct4和Sox2表达显着较高。其中,中胚层的标记基因T表达水平在不同时期来源的干细胞系中表达有如下特点:升高（来源于2-细胞）-降低（来源于4-细胞）-升高（来源于8-细胞）-降低（来源于桑葚胚）,表明T基因可能在胚胎不同发育时期中起着不同的作用。同时部分细胞系（来源于2-细胞、8-细胞和桑葚胚）高表达DNA甲基化相关的基因（Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L）。通过免疫荧光染色显示多能性蛋白OCT4和SOX2在所有ABC/L-ESCs中表达,且部分细胞系表达中胚层标志蛋白T,这与RT-q PCR的结果一致。体外分化实验证明ABC/LESCs（来源于2-细胞）具有分化为三胚层的能力,同时细胞系可嵌合至小鼠的胎儿和卵黄囊组织。3.ABC/L-ESCs抗损伤能力的检测将相同数量的来源于囊胚期ABC/L-ESCs和2i/L-ESCs置于不同浓度的多聚甲醛中,对细胞进行损伤实验。在恢复的第4天后,发现ABC/L-ESCs存活数量显着多于2i/L-ESCs存活数量。在相同浓度和相同时间损伤后,Western Blotting证明与2i/L-ESCs相比较ABC/L-ESCs表达低水平的p-H2AX（DNA损伤标志性蛋白）,两者在恢复和对损伤反应的时间完全不同,ABC/L-ESCs比2i/L-ESCs在面对PFA损伤后反应更加敏感且抗损伤能力更强。综上所述,ABC/L干细胞培养体系能够维持来源于不同发育时期胚胎建立的干细胞系的自我更新、多能性及体外分化能力,与2i/L-ESCs相比较具有更强的抗损伤能力。本研究为研究维持干细胞自我更新及多能性提供了新思路,并且还可以为干细胞治疗疾病提供了新途径。
张云峰[2]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中进行了进一步梳理绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
蔡泽坡[3]（2021）在《c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中的研究》文中提出多能干细胞具有自我更新和向三胚层细胞分化的潜能,是细胞命运调控机理研究的理想细胞模型,在再生治疗方面具有广阔应用前景。然而,在实际应用到临床上时仍存在很多问题,主要原因包括对多能干细胞在命运决定过程中的机理研究还不够透彻,多能性维持与退出调控机制仍未清楚。本实验室前期研究结果表明c-Jun通过调控Ss18形成相变等途径显着影响小鼠胚胎干细胞多能性维持与退出,同时作为核心多能性基因Oct4的“平行镜面因子”拮抗多能性获得,并提出了体细胞与多能干细胞的界面假说。然而,c-Jun在人胚胎干细胞命运决定过程中所起的作用还知之甚少,与小鼠体系存在哪些异同点仍不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建c-Jun敲除的人胚胎干细胞系,结合形态特征、检测多能性基因表达与畸胎瘤形成等实验判断,发现c-Jun敲除对人胚胎干细胞多能性维持和三胚层分化早期阶段没有显着影响。为了进一步确定c-Jun在人胚胎干细胞多能性退出及其向三胚层后期终末谱系功能细胞分化过程中的功能调控作用,本研究分别通过人胚胎干细胞定向分化至心肌细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、神经细胞、体节前体细胞、定型内胚层细胞,发现c-Jun敲除显着抑制人胚胎干细胞向心肌细胞分化,但促进向肝脏细胞分化,这与已报道的c-Jun敲除小鼠抑制肝细胞分化、对心肌细胞分化无影响的表型不同。另外,c-Jun敲除对人胚胎干细胞向定型内胚层细胞、体节前体细胞、肾脏细胞以及神经细胞分化没有显着影响,这与已报道的c-Jun敲除小鼠对这些细胞发育分化没有影响的表型一致。本研究对c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中所起的作用进行了初步研究,为进一步探索多能干细胞命运决定以及比较研究c-Jun在不同物种的谱系功能细胞命运调控中的作用机制奠定理论基础,对未来多能干细胞更加安全有效应用于临床研究与疾病治疗具有重要的理论指导意义。
牛宝华[4]（2021）在《调控Wnt和Activin/Nodal信号高效建立和悬浮扩增人多能干细胞》文中研究表明多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。由于PSCs具有无限增殖和分化成不同三胚层细胞的能力,使得它在研究胚胎或器官发育、疾病模型构建、细胞治疗、药物研发及毒性测试等方面具有重要的应用价值。而目前在多能干细胞应用过程中,干细胞的数量和质量控制方面存在问题。解决多能干细胞应用过程中的阻碍需要有一个稳定的培养体系作为支撑,从而可以在体外生产大量、高质量的人PSCs。虽然目前有很多体系用于人PSCs的培养,比如:MEF-CM、KSR/bFGF、m Te SR、E8、NHSM、5i LAF、t2i LGǒ、LCDM等等。然而不同培养体系以及这些体系下培养的细胞,在不同程度上存在些问题。第一,体系成分复杂且存在异源蛋白,制约了临床转化应用;第二,体系不支持单细胞传代,或者单细胞传代时细胞存活率低,导致培养低效,不利于基因编辑和单细胞克隆的筛选,从而限制多能干细胞的应用;第三,干细胞在培养过程中产生自发分化,影响了细胞的质量;第四,部分体系会导致多能干细胞的基因组不稳定,遗传印记丢失,给其应用带来安全隐患;第五,体系不支持规模化的扩增或者在进行规模化扩增时产量低,难以满足细胞应用时的数量要求。第六,部分体系对多能干细胞的兼容性差。这些问题极大地限制了PSCs的应用。建立新的培养体系对于多能干细胞的高质量生产、高效建立和大规模扩增具有重要意义,可以推动多能干细胞的应用。现研究表明多能干细胞的自我更新和多向分化潜能受到不同的信号通路调节。比如,啮齿类和灵长类胚胎发育过程中,Wnt信号通路控制细胞命运决定和组织形态发生,调控多能干细胞的增殖或分化。Activin/Nodal信号通路,在灵长类的胚胎发育中可以直接调控多能性转录因子Nanog等的表达,而且在人的多能干细胞中也可以维持干细胞的自我更新和促进其增殖,因此该信号无论在体内还是体外对人的多能性维持有着重要作用。总的来说,Wnt和Activin/Nodal信号通路在调控人干细胞的多能性中起着重要作用,然而Wnt和Activin/Nodal信号能否被精确调控以协同维持多能干细胞的自我更新还不清楚。在本研究中,我们利用可以调控Wnt和Activin/Nodal这两个信号通路的小分子和生长因子的不同浓度组合,去筛选新的多能干细胞培养体系。最终我们筛选得到一个新的多能干细胞培养体系,命名为AIC体系（10ng/ml Activin-A,2μM IWP2和0.6μM CHIR）。该体系成分明确且无异源成分,利于临床转化应用。该体系可以协同调控Wnt和Activin/Nodal信号通路来维持多能干细胞的自我更新。AIC体系支持从囊胚或者以体细胞重编程方式直接建立新的干细胞系,在建立新干细胞系的效率上比现在常用体系的建系效率更高,同时也支持现有干细胞系转换到AIC培养体系。而且,AIC体系可以支持饲养层、无饲养层（基质胶:Matrigel,玻连蛋白等）和悬浮三种培养模式,满足不同的实验需求。同时,AIC体系还支持高效的悬浮扩增,4天可以增殖25倍左右,为干细胞的大规模培养奠定了一定的基础;AIC体系培养的多能干细胞的活力好、单细胞克隆效率高（>90%）,利于基因编辑等操作应用;AIC体系培养的细胞均一性高,无自发分化,提高了细胞质量。AIC体系下长期培养的干细胞保持了基因组的稳定性,保证其安全性;同时AIC体系,对不同的干细胞系兼容性很好,可以维持不同的干细胞系的多能性。我们还初步探索了Wnt和Activin/Nodal信号通路对干细胞多能性的维持机制。总之,通过调控Wnt和Activin/Nodal信号建立的AIC体系可以解决现有多能干细胞培养体系存在的问题,进而解决多能干细胞应用过程中对细胞质量和数量的要求,有利于建立GMP级的干细胞,为多能性干细胞的临床转化与应用奠定基础。
尹姝媛[5]（2020）在《猪早期胚胎和胚胎干细胞体外培养体系优化的研究》文中提出目前已经有很多关于猪多能性干细胞的报道,但尚未获得有效的培养体系可以支持干细胞长时间稳定传代并实现生殖嵌合。胚胎质量和培养体系对胚胎干细胞的成功构建都具有重要意义。早期胚胎发育需要核心转录因子和相关信号通路共同发挥作用,而胚胎干细胞建立的过程相当于在体外添加化合物和细胞因子维持内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）的多能性并提供营养物质维持其生长和增殖的过程。因此,本研究根据各阶段胚胎测序数据筛选出调控ICM发育相关通路的激活剂,再通过在猪早期胚胎体外培养液和胚胎干细胞培养液中添加该类小分子,最终确定其对猪早期胚胎质量和胚胎干细胞多能性的影响,主要结果如下:1.通过对不同发育时期猪体内胚胎转录组数据进行分析并富集信号通路,结果表明:ICM形成过程中,WNT信号通路、cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路等参与调控ICM形成。在猪孤雌胚胎培养过程中分别添加富集到信号通路的小分子,筛选到CHIR99021和rpIL6可以促进囊胚发育。2.组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6验证其对孤雌囊胚质量的作用。结果表明:囊胚率（49.23±8.40%v.s.32.34±4.15%,P<0.05）、囊胚孵化率（16.19±1.96%v.s.10.25±1.12%,P<0.05）、ICM细胞数（7.72±2.30 v.s.4.28±1.60,P<0.01）提高,多能性基因OCT4（P<0.01）、SOX2（P<0.01）和NANOG（P<0.05）以及使WNT通路和JAK-STAT通路相关基因也上调表达。此外,此体系显着提高胚胎干细胞建系效率（KOFL体系:34.70±4.77%v.s.25.12±2.10%,P<0.05;LCDMIV体系:37.82±2.56%v.s.25.26±3.18%,P<0.01）。3.用体外受精胚胎验证组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6的作用。结果表明此体系可以提高体外受精胚胎囊胚率（28.47±2.16%v.s.19.65±4.02%,P<0.05）、ICM细胞数（6.60±1.50 v.s.4.50±0.89,P<0.01）、囊胚孵化率（12.03±1.73%v.s.7.27±0.79%,P<0.05）,及OCT4（P<0.01）、SOX2（P<0.05）和NANOG（P<0.01）的表达。4.基于KOFL体系筛选提高细胞多能性的胚胎干细胞培养体系。结果表明:LCDM体系和添加rpIL6的LCDM体系都可以支持猪多能性干细胞维持,提高多能性基因OCT4、SOX2和REX1的表达;在KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可以提高单细胞传代能力,细胞增殖能力和多能性基因OCT4、SOX2和KLF4的表达。5.用细胞转化筛选的体系进行从头建系并进行再次优化。结果表明:pPSCs-LCDMIV支持单细胞传代,多能性基因OCT4（P<0.05）、SOX2（P<0.01）和NANOG（P<0.01）相对于pPSCs-KOFL的表达更高,细胞可传15代以上;pEPSC体系可以利用巴马品种的猪体内胚胎构建的胚胎干细胞系,细胞可以长时间稳定传代并维持较高的多能性,且具有分化为三胚层的能力;KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin,维持高hLIF浓度并撤除bFGF组成LSCFors体系或者维持高bFGF浓度并降低hLIF浓度组成F-LSCFors体系,两个体系均可支持从头建系,多能性基因SOX2、NANOG和KLF4表达升高,但OCT4激活受限,细胞多能性部分提高。6.通过转录组数据筛选pPSCS-LSCFors和pPSCS-F-LSCFors中表达的信号通路,结果表明:LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAKSTAT信号通路和MAPK信号通路等上调表达,F-LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等上调表达,参与调控细胞多能性。以上结果表明,WNT信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路和PI3K-AKT信号通路等对于猪早期胚胎发育和胚胎干细胞多能性具有重要的调控作用。猪早期胚胎体外培养过程中激活WNT信号通路和JAK-STAT信号通路可以促进囊胚形成并提高囊胚质量。在猪胚胎干细胞培养过程中,添加细胞因子或化合物激活cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等对胚胎干细胞多能性的提高和细胞增殖具有重要的意义。本研究优化了猪早期胚胎和猪胚胎干细胞的培养体系,有利于获得更多优质胚胎及多能性提高的胚胎干细胞系。
祝振硕[6]（2020）在《OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制》文中指出猪既是一种在我国畜牧业生产中占有极大比重的重要经济动物,同时还是生物医学中常用的理想医学模型。然而猪多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）的建系仍未完全成功,并且对其多能调控机制的了解尚不清楚。因此,深入研究猪多能干细胞的多能调控机制,将为猪多能干细胞的建系提供理论基础。H3K9甲基化修饰是重要的表观抑制标记,在小鼠上的研究表明其是重编程过程中重要的表观障碍。而组蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM3B可通过羟基化作用去除H3K9me1/2来维持干细胞的自我更新能力。因此,研究两者在猪多能干细胞中的功能机制,将更深入了解H3K9甲基化对多能干细胞的调控方式,并有利于解决当前猪内源多能调控网络激活不完全的问题。在本研究中,我们以实验室已建立的以药物介导的外源基因表达的猪诱导性多能干细胞为实验材料,分析了H3K9甲基化修饰状态转换对其自我更新能力的影响,并揭示了以KDM3A/KDM3B/OCT4/SOX2为核心的H3K9去甲基化调控机制。实验结果如下:1.全基因组水平的H3K9的低甲基化状态对于猪i PSCs多能性的维持至关重要。本研究以DOX-i PSCs为研究对象,通过撤去DOX及LIF、b FGF、CHIR99021、SB431542,使i PSCs逐渐丧失多能态。研究发现猪i PSCs在该培养条件下,逐步丧失克隆形态且AP染色呈现阴性。外源多能基因已完全沉默,且内源多能基因OCT4、SOX2、LIN28A、NANOG表达量显着下调。此外,在这一分化进程中细胞整体的H3K9me1/2/3水平显着升高,而H3K4 me1/2/3的整体水平显着下降。这些结果表明H3K9甲基化修饰与猪多能干细胞多能性维持紧密相关。2.饲养层细胞与外源多能基因协同维持i PSCs整体H3K9低甲基化状态。我们进行了一系列的体系筛选,结果表明当撤去饲养层细胞（Feeder free,F-）时,i PSCs整体H3K9甲基化水平升高。进一步分析显示在无饲养层体系下,不添加DOX（Feeder and DOX free,FD-）会使i PSCs的H3K9甲基化水平进一步升高。此外,核心多能基因（OCT4/SOX2）整体蛋白水平也显着下降,同时细胞表达外胚层与中胚层的分化标记。EDU染色试验与Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测表明,细胞增殖能力快速下降且出现凋亡现象。转录组测序分析表明Feeder通过促进SOX家族的基因转录来维持猪i PSCs多能性。以上结果表明Feeder可能通过降低猪i PSCs中多能性相关基因区域的H3K9甲基化修饰,进而激活多能基因的表达,维持多能性。并且由DOX所控制的核心转录因子也可能参与了这一调控过程。3.猪i PSCs多能性丧失过程中,H3K9甲基化阻碍关键多能转录因子与其下游靶基因的互作。对正常培养的与FD-处理下的DOX-i PSCs进行H3K9me2/3的Ch IP-seq分析,结果表明整体H3K9甲基化丰度在FD-处理中显着升高。进一步Motif分析显示在FD-特异的H3K9me2区域富集出OCT4、SOX2、ESRRB等多能转录因子的结合模序,而正常培养条件下特异的甲基化区域富集出c-Jun、ATY13等体细胞特异基因结合模序。进一步将Ch IP数据与转录组测序数据联合分析显示,H3K9甲基化不但参与了分化进程中多能基因的沉默进程,同时在多能态下,也参与了体细胞相关基因的沉默。这些试验结果表明核心多能转录因子激活下游基因进程中,多能性相关基因区域的H3K9去甲基化是必要的。4.组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/KDM3B与核心转录因子OCT4/SOX2形成转录驱动复合物维持干细胞多能态。我们在DOX-i PSCs中进行了KDM3A与KDM3B的干扰试验,结果表明两者在H3K9去甲基化作用上存在功能互补现象,只有同时下调两者表达,猪i PSCs的H3K9me2/me3水平才会显着上升,细胞增殖也受到严重抑制并发生凋亡现象,AP染色呈现阴性。此外,过表达试验显示两者均可以显着降低细胞整体的H3K9甲基化水平,但两者之间存在一些表型差异。过表达KDM3A有效的提升了细胞的增殖与抗凋亡能力并促进了多能相关基因的表达,但过表达KDM3B却轻微抑制了细胞的增殖能力且对多能性无显着影响。为进一步解析多能转录因子与H3K9去甲基化作用的关系,我们首先通过单因子回补试验证明了DOX-i PSCs的维持主要依赖于OCT4与SOX2的足量表达。Ch IP-seq分析显示两者共同作用于基因间区与内含子区域的增强子激活多能性相关基因与通路维持多能态,但OCT4/SOX2并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达。将H3K9me2/3与OCT4/SOX2的Ch IP-seq进行联合分析,发现在FD-处理后大约20%的OCT4/SOX2的结合区域发生了H3K9me2。对KDM3A与KDM3B使用免疫共沉淀联用质谱分析技术（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS）来鉴定并分析两者的关联蛋白。结果表明两者之间存在直接的相互作用,进一步分析发现KDM3A与KDM3B的互作蛋白分别包含有SOX2与OCT4,且富集出大量染色质重塑蛋白,如HMG家族的HMGB2、HMGA1等。这些证据表明OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合物形成一个转录驱动复合物定向激活多能相关基因的表达。综上所述,本研究揭示了以KDM3A和KDM3B为核心的H3K9去甲基化作用在多能性维持中的重要作用,发现了组蛋白去甲基化酶通过形成蛋白复合体的形式来发挥转录激活作用。此外,我们还证明了组蛋白去甲基化的定向作用是通过与多能性转录因子的结合来实现的,这一转录激活机制不仅为猪多能干细胞的建系工作提供了理论基础,而且丰富了人类对于表观遗传激活机制领域的理解。
石磊[7]（2020）在《基于基因编辑构建表达β2m-HLA-G融合蛋白的低免疫原性人胚胎干细胞》文中研究说明人多能干细胞（human pluripotent stem cells,hPSCs）具有在体外维持环境下自我更新及在特定分化条件下分化为三胚层细胞谱系的能力。因此,hPSCs可以作为理想的种子细胞为再生医学提供细胞移植所需的各类功能谱系。然而,hPSCs及其分化产生的功能谱系具有免疫原性,即移植由hPSCs分化获得的细胞/组织会诱发受体患者体内的同种异体免疫排斥反应,造成移植物的死亡。因此,构建低免疫原性hPSCs已经成为推动细胞替代治疗的核心环节。作为哺乳动物中普遍存在的最有效的同种异体免疫抑制案例,绒毛外滋养层细胞与母体子宫蜕膜直接接触,但是母胎屏障的存在有效地保护了作为同种异体抗原的胎儿免受来自母体免疫系统的攻击。母胎屏障的分子机制与人类白细胞抗原（human leukocyteantigen,HLA）直接相关。而绒毛外滋养外胚层细胞具有不表达HLA-A,-B,低表达HLA-C,高表达HLA-G蛋白质的特点。已有研究证明,该蛋白质分子能够抑制NK细胞、T细胞、DC细胞等多种免疫细胞的激活与杀伤作用。为了构建HLAⅠ表达缺失的hPSCs,我们设计了 B2M基因敲除的编辑方案。B2M是HLAⅠ型分子细胞膜定位的关键分子,敲除B2M的hPSCs的细胞膜表面将不表达任何HLAⅠ型分子。我们首先构建了一个高效、可精确控制且无需供体质粒的双gRNAs基因敲除系统,即通过将一对gRNAs与CRISPR/Cas9共同导入hPSCs,人为造成基因组相邻两个位点产生DSB,这两个DSB的平末端通过无缝连接后,可以产生一个提前终止密码子,从而阻止了非内源性蛋白质的翻译。利用这套双gRNAs敲除系统,我们成功的在人类多能干细胞中敲除了包括SMAD3和β-Catenin在内的十几个基因。另外,针对多个基因的敲除结果显示双gRNAs敲除系统可以同步对多个基因进行高效敲除。对于敲除非编码RNA,我们通过引入双gRNAs切除整段转录MIR1193的DNA序列实现了对该miRNA的敲除以及特异性切除MALAT1启动子核心区域的方案实现了对该lncRNA的敲除。我们设计的双gRNA敲除策略高效,适合敲除编码与非编码基因,可以实现多基因同步敲除,并且敲除后的基因产物可以进行精确预测。基于这一原理,我们成功的使用双gRNA基因敲除系统构建了内源性B2M基因敲除的低免疫原性hPSCs。为了构建细胞膜表面经典型HLAⅠ分子缺失,但是表达非经典型HLA-G的hPSCs,我们通过同源重组方案在人类胚胎干细胞内源性B2M基因的终止密码子位置插入了一段编码连接肽（G4S）4与HLA-G1的DNA序列,并在此细胞系的基础上,利用慢病毒载体,将一段编码B2M-（G4S）3-HLA-G5融合蛋白质的DNA序列引入该细胞系。我们的研究结果证明,B2M敲除hPSCs的细胞膜表面缺失β2m以及HLAⅠ分子。而过表达HLA-G的细胞系则成功表达β2m-HLA-G1与β2m-HLA-G5,其中流式细胞分析检测证明β2m-HLA-G1可以到达细胞膜表面且该融合蛋白的表达受内源性B2M基因启动子的调控,可以响应IFN-y的刺激。Western blot分析证明β2m-HLA-G5可以被分泌到细胞外培养环境中。同时,由于游离内源性β2m蛋白质的缺失,经典型HLAI蛋白质复合物无法完成组装,导致基因修饰后的人类胚胎干细胞系细胞膜表面缺失HLA-A、-B、-C蛋白质。体外与体内的同种异体免疫学实验证明上述表达HLA-G细胞系相较于野生型人类胚胎干细胞具有明显的低免疫原性。相比于B2M基因缺失的细胞系而言,表达HLA-G的细胞系能够更加有效的抑制NK细胞的激活。另外,β2m-HLA-G5分泌蛋白可以显着抑制野生型人类胚胎干细胞对NK细胞的激活,并且可以有效调控免疫细胞分泌的炎症因子。综上所述,我们成功构建了双gRNAs基因编辑系统,实现了在人类多能干细胞中高效,可预测的基因敲除。同时,我们成功实现了在人类多能干细胞中表达膜定位与分泌型的HLA-G蛋白,并且同时阻断了经典型HLAI分子在细胞膜表面的分布。该细胞系可以有效抑制T细胞、NK细胞诱导的免疫排斥,同时可以调节移植物周围的免疫环境,从而为广泛适用型细胞移植物提供了重要的细胞来源。
相立峰[8]（2020）在《人胚胎原肠前动态发育研究》文中认为伴随工业水平的进步和生活水平的提高,不良的生活环境、不健康的饮食习惯和日益增加的生存压力等导致育龄夫妇的精子与卵子质量急速下降,不孕不育已成为威胁生殖健康的一个重要问题。当胚胎发育至第7天,人胚胎需植入母体的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件,由于材料的无法获得以及缺乏相应技术导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎植入失败以及在此阶段的发育异常是导致早期流产的主要原因。因此,对人胚胎原肠前发育过程的研究将为我们理解生命起源、探索早期胚胎发育动态变化过程和分子调控机制提供重要的理论依据。2016年的两篇报道在小鼠胚胎体外培养的基础上,建立了着床后人胚胎体外2D培养体系,该体系能够将胚胎在体外培养至13天,并观察到一些谱系分离的现象。然而2D条件下胚胎存在一些重要缺陷,如2D培养的胚胎是扁平的,缺乏体内3D的拓扑结构;虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活,但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱,导致很多细胞类型（羊膜上皮）、腔（羊膜腔、卵黄囊）和结构（基底膜、前后轴、原条）无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到。因此,这些缺陷限制了2D体系很难真正模拟体内胚胎的发育,无法揭示胚胎在该阶段的发育事件和机制。为了克服以上这些缺陷,我们开展了本论文的研究。我们在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下,利用临床上捐献的胚胎,通过改善培养基和培养方法,开发了一个三维（3D）人囊胚培养体系,并采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条原基阶段。这些3D胚胎能高度地模拟体内胚胎的发育,经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构,包括胚胎双层胚盘、羊膜（amnion）、基底膜（basal membrane）、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条前体。利用这个体系,我们揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件:（1）通过单细胞转录表达谱的分析,揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络。（2）羊膜上皮细胞（AME）是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系,不同于啮齿类动物,人AME发生于原条形成之前,但其特性和分子机制不清楚。我们发现:与上胚层细胞相比,AME显着地下调多能性基因,其形成与基底膜的缺失显着相关,并有独特的分子表达谱。（3）首次阐明细胞滋养层（cytotrophoblast）、绒毛外细胞滋养层（extravillous cytotrophoblast）和合胞体滋养细胞（syncytiotrophoblast）在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子,揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能。（4）揭示了上胚层细胞（PSCs,多能干细胞）着床后将很快从naive到primed状态的转变。PSCs从着床至第14天期间保持相对的稳定状态,而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的。（5）通过人和非人灵长类胚胎的转录组分析,发现非人灵长类和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异,而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。本论文利用独创的人胚胎体外3D培养体系详细阐述了胚胎在发育过程中谱系的分离、羊膜腔的形成、羊膜上皮的分离、卵黄囊的形成、胚胎极性的产生和原条的形成等发育学事件。本论文回答了EPI多能性的维持和转化、羊膜上皮的形成机制、滋养层分化发育的机制等科学问题。本研究成果为胚胎的早期发育和干细胞的相关研究提供了新的模型,为组织再生和器官再生提供了研究的理论基础,为研究胚胎因素的着床失败和早期流产提供了理论支持,为不孕症治疗和辅助生殖技术中现存问题的解决提供了研究思路和研究方向。
康宇[9]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中提出哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
卢琴[10]（2020）在《孤雌生殖人类胚胎干细胞技术的专利适格性研究》文中认为传统人类胚胎干细胞（HESC）技术不可避免需要破坏人胚胎才能获取HESC。随着干细胞技术的发展,开始出现回避伦理争议的新技术。其中,孤雌生殖HESC技术通过孤雌激活人卵母细胞,无需精子参与就能形成孤雌囊胚,从中获取HESC。大多数国家认为该技术回避了传统技术破坏胚胎的伦理争议,并且具有重大的医学价值。随着科学和伦理的发展变化,2019年11月我国新修正的《专利审查指南》放宽了HESC技术的专利审查标准,但仅仅规定了“利用未经体内发育的受精14天以内的人胚胎”获取HESC的相关发明不违背社会公德,可以授予专利。却未提及孤雌生殖HESC技术在我国能否具备专利适格性的问题。因此,本文将对该新技术的专利适格性问题进行研究。首先,介绍孤雌生殖HESC技术相比其他技术的优势。分析2016年我国知识产权局判定孤雌囊胚属于人胚胎,孤雌生殖HESC技术违背社会公德,因而不具备专利适格性而引发的争议案例。指出2019年《专利审查指南》修正后依然未能解决争议问题。其次,通过分析传统HESC技术与孤雌生殖HESC技术专利适格性审查中具有代表性的司法案例,梳理新旧技术发展的脉络,考察干细胞技术发达的美、欧、中、澳等国家对新旧两类技术的专利适格性认定,同时从传统技术的专利审查中获取对新技术有益的借鉴经验。再次,从我国利益平衡、伦理道德、干细胞产业政策导向和产业发展需要等方面出发,为论证我国应当授予孤雌生殖HESC技术专利权保护的正当性和必要性提供依据。最后,得出孤雌生殖HESC技术在我国具备专利适格性的结论。我国对该新技术的专利审查经验尚不成熟。笔者结合我国的实际情况,以前文作为基础和铺垫,为我国《专利审查指南》提供相应的完善建议。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小鼠早期胚胎干细胞研究进展 |
| 1.1.1 小鼠早期胚胎发育 |
| 1.1.2 小鼠早期胚胎干细胞的建立 |
| 1.1.3 小鼠早期胚胎干细胞的多能性 |
| 1.1.4 小鼠早期胚胎干细胞的异质性 |
| 1.2 小鼠早期胚胎干细胞的相关信号通路 |
| 1.2.1 TGFβ在维持多能性的信号通路 |
| 1.2.2 LIF/STAT3 相关信号通路 |
| 1.2.3 WNT相关信号通路 |
| 1.3 mESCs中 DNA损伤概述 |
| 1.3.1 mESCs应对DNA损伤 |
| 1.3.2 p-H2AX |
| 第二章 利用ABC/L建立来源于不同发育时期胚胎的干细胞系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂及材料 |
| 2.2.1 主要使用试剂 |
| 2.2.2 主要使用仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养液的配制 |
| 2.3.2 不同时期早期胚胎收集及建立ABC/L胚胎干细胞系 |
| 2.3.3 ABC/L-ESCs生长曲线绘制 |
| 2.3.4 ABC/L-ESCs基因组的GOF/GFP鉴定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 对ABC/L-ESCs建系效率的研究 |
| 2.4.2 不同时期建立ABC/L-ESCs形态鉴定 |
| 2.4.3 不同ABC/L-ESCs的生长曲线 |
| 2.4.4 不同ABC/L-ESCs的单细胞克隆形成能力检测 |
| 2.5 结论及讨论 |
| 第三章 ABC/L胚胎干细胞系的多能性及生物特性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要使用试剂 |
| 3.2.2 主要使用仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 碱性磷酸酶染色(AP染色) |
| 3.3.2 核型鉴定 |
| 3.3.3 干细胞的荧光定量PCR |
| 3.3.4 免疫荧光染色 |
| 3.3.5 胚胎干细胞的体外自发分化 |
| 3.3.6 tdTomato质粒转染细胞 |
| 3.3.7 嵌合体胚胎制作 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 碱性磷酸酶鉴定结果 |
| 3.4.2 核型鉴定结果 |
| 3.4.3 实时荧光定量PCR结果 |
| 3.4.4 免疫荧光染色结果 |
| 3.4.5 体外分化RT-qPCR结果 |
| 3.4.6 嵌合体结果 |
| 3.4.7 小鼠2-细胞胚胎在ABC/L和2i/LIF中发育结果统计 |
| 3.5 结论及讨论 |
| 第四章 ABC/L早期胚胎干细胞系的抗损伤能力检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂及材料 |
| 4.2.1 主要使用试剂 |
| 4.2.2 主要使用仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 培养液的配制 |
| 4.3.2 胚胎干细胞损伤实验 |
| 4.3.3 蛋白质免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ABC/L-ESCs损伤后形态学变化 |
| 4.4.2 ABC/L-ESCs损后存活统计 |
| 4.4.3 ABC/L-ESCs损伤后Western Blotting检测 |
| 4.5 结论及讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 多能干细胞 |
| 1.2 c-Jun与细胞命运调控 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂耗材 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 确定敲除策略,设计sgRNA |
| 2.2.2 构建质粒PX330-sgRNA-PURO |
| 2.2.3 sgRNA切割活性鉴定 |
| 2.2.4 将sgRNA质粒转入h ESCs中 |
| 2.2.5 PCR鉴定基因型 |
| 2.2.6 测序 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.8 蛋白质印迹法 |
| 2.2.9 RNA-seq文库构建与分析 |
| 2.2.10 人胚胎干细胞向肝细胞分化 |
| 2.2.11 人胚胎干细胞向体节前体细胞分化 |
| 2.2.12 人胚胎干细胞向肾脏细胞分化 |
| 2.2.13 人胚胎干细胞向心肌细胞分化 |
| 2.2.14 人胚胎干细胞向神经细胞分化 |
| 2.2.15 畸胎瘤检测 |
| 2.2.16 HE染色 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 用于敲除c-Jun的 sgRNA质粒的构建 |
| 3.2 sgRNA切割效率验证 |
| 3.3 c-Jun敲除人胚胎干细胞的构建及其对多能性维持的影响 |
| 3.3.1 .c-Jun敲除人胚胎干细胞的构建 |
| 3.3.2 .畸胎瘤检测c-Jun敲除人胚胎干细胞向三胚层早期分化 |
| 3.3.3 .RNA-seq检测比较分析c-Jun敲除人胚胎干细胞转录组变化 |
| 3.4 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向不同胚层谱系终末分化的影响 |
| 3.4.1 c-Jun敲除显着促进人胚胎干细胞向肝细胞分化 |
| 3.4.2 c-Jun敲除显着抑制人胚胎干细胞向心肌细胞分化 |
| 3.4.3 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向体节前体细胞分化没有显着影响 |
| 3.4.4 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向肾脏细胞分化没有显着影响 |
| 3.4.5 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向神经细胞分化没有显着影响 |
| 讨论与总结 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 人多能干细胞诱导分化为骨骼肌相关细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多能干细胞概述 |
| 1.2 多能干细胞的应用 |
| 1.3 多能干细胞应用的支撑——多能干细胞的建立及培养 |
| 1.3.1 多能干细胞的多能性维持——培养体系的发展 |
| 1.3.2 多能性干细胞培养方式的发展 |
| 1.4 多能干细胞和胚胎中Epiblast的信号通路与多能性调控 |
| 1.4.1 多能干细胞和胚胎中Epiblast的Wnt信号通路与多能性调控 |
| 1.4.2 多能干细胞和胚胎中Epiblast的Activin/Nodal信号通路与多能性调控 |
| 1.5 论文的立题依据和主要研究内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料来源 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 主要试剂及其配制方法 |
| 2.1.4 主要抗体 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.1.6 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MEF培养及其饲养层制备 |
| 2.2.2 传统体系(KOSR/bFGF)下的胚胎干细胞建系及其培养 |
| 2.2.3 传统体系(KOSR/bFGF)下的iPSCs建系及其培养 |
| 2.2.4 贴壁细胞(2D培养)免疫荧光染色 |
| 2.2.5 正交实验 |
| 2.2.6 畸胎瘤实验 |
| 2.2.7 石蜡切片及其HE染色 |
| 2.2.8 单细胞克隆实验 |
| 2.2.9 流式分析 |
| 2.2.10 Western Blot |
| 2.2.11 细胞周期分析 |
| 2.2.12 AIC体系下多能性干细胞的培养 |
| 2.2.13 AIC体系下iPSCs的建立 |
| 2.2.14 耗氧率测试 |
| 2.2.15 AIC体系下,多能性干细胞的无饲养层建系 |
| 2.2.16 碱性磷酸酶染色(AP染色) |
| 2.2.17 生长曲线绘制 |
| 2.2.18 不同培养体系(AIC或者E8、StemFlex)下多能性干细胞的悬浮培养 |
| 2.2.19 台盼蓝染色 |
| 2.2.20 细胞球(3D培养)的冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.2.21 多能性干细胞团块的直径定量 |
| 2.2.22 染色体核型分析 |
| 2.2.23 转录组分析 |
| 2.2.24 用e-SNP分析检测染色体重复 |
| 2.2.25 应用e-SNP分析检测LOH |
| 2.2.26 Pluri Test分析 |
| 2.2.27 染色体20q11.21增益的测定 |
| 2.2.28 TP53 突变基因组序列 |
| 2.2.29 GSEA |
| 2.2.30 三胚层体外分化 |
| 2.2.31 嵌合体实验 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 新多能干细胞培养体系的摸索与建立 |
| 3.2.1 传统培养体系(KOSR/bFGF)下多能干细胞的建立 |
| 3.2.2 Wnt和 Activin信号对多能干细胞的调控作用 |
| 3.2.3 新的多能干细胞培养体系(AIC)的建立 |
| 3.3 AIC体系及其多能干细胞的特性探索 |
| 3.3.1 AIC支持多能干细胞在饲养层上高效建立及扩增 |
| 3.3.2 AIC体系下支持PSC无饲养层高效衍生及单细胞扩增 |
| 3.3.3 AIC体系支持多能干细胞的高效稳定悬浮扩增 |
| 3.3.4 Stem Flex(SF)和E8 的悬浮培养及与AIC多能干细胞的比较 |
| 3.3.5 AIC多能干细胞保持基因组稳定性 |
| 3.3.6 AIC多能干细胞的基因表达特征 |
| 3.4 Wnt and Activin/Nodal信号维持干细胞多能性的机制探索 |
| 3.5 AIC多能干细胞的功能验证 |
| 3.6 AIC多能干细胞的应用 |
| 第四章 结论 |
| 第五章 讨论与展望 |
| 5.1 多能性干细胞培养体系的建立 |
| 5.2 AIC多能干细胞的发育潜能 |
| 5.3 多能性干细胞的信号通路调控 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
| 附录B 医学伦理证明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用中英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 猪早期胚胎发育的相关研究 |
| 1.3 多能性干细胞的分类 |
| 1.3.1 干细胞的多能性等级分类 |
| 1.3.2 干细胞来源分类 |
| 1.4 胚胎干细胞的生物学特征 |
| 1.4.1 形态学特征 |
| 1.4.2 多能性特征 |
| 1.4.3 遗传可操作性 |
| 1.5 猪胚胎干细胞建系影响因素进展研究 |
| 1.5.1 胚胎种类 |
| 1.5.2 胚胎接种方法 |
| 1.5.3 饲养层细胞 |
| 1.5.4 培养体系 |
| 1.5.5 传代方法 |
| 1.6 胚胎干细胞多能性通路研究 |
| 1.6.1 JAK-STAT信号通路 |
| 1.6.2 PI3K-AKT信号通路 |
| 1.6.3 WNT信号通路 |
| 1.6.4 MAPK信号通路 |
| 1.6.5 TGF-β信号通路 |
| 1.6.6 Na?ve和 Primed细胞多能性调控差异 |
| 1.7 .胚胎干细胞鉴定方法 |
| 1.7.1 形态学鉴定 |
| 1.7.2 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)染色 |
| 1.7.3 核型分析 |
| 1.7.4 实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,q RT-PCR) |
| 1.7.5 免疫荧光(Immunofluorescence staining,IF)染色 |
| 1.7.6 免疫印迹(Western blotting,WB) |
| 1.7.7 体外分化能力 |
| 1.7.8 畸胎瘤形成 |
| 1.7.9 嵌合体实验 |
| 1.8 胚胎干细胞应用前景及存在的问题 |
| 1.8.1 胚胎干细胞的应用前景 |
| 1.8.2 胚胎干细胞存在的问题 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料和动物 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪卵母细胞体外成熟培养 |
| 2.2.2 猪孤雌胚胎获取 |
| 2.2.3 猪体外受精胚胎获取 |
| 2.2.4 猪体内胚胎获取 |
| 2.2.5 饲养层细胞制备 |
| 2.2.5.1 小鼠胎儿成纤维细胞原代分离 |
| 2.2.5.2 小鼠胎儿成纤维细胞传代培养及冻存 |
| 2.2.6 猪胚胎干细胞系构建及培养 |
| 2.2.6.1 猪胚胎干细胞系的构建 |
| 2.2.6.2 猪胚胎干细胞的传代培养 |
| 2.2.6.3 猪胚胎干细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.7 多能性鉴定 |
| 2.2.7.1 碱性磷酸酶染色 |
| 2.2.7.2 核型分析 |
| 2.2.7.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.7.4 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.7.5 RNA提取 |
| 2.2.7.6 反转录 |
| 2.6.7.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 拟胚体形成 |
| 2.2.9 脂质体转染 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 试验设计 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同发育时期的猪体内胚胎的转录组分析 |
| 3.2 hLIF、rpIL6、CHIR99021、bFGF、BMP4、PD0325901 以及SB431542 等对猪孤雌胚胎囊胚发育的影响 |
| 3.3 不同浓度的CHIR99021及WNT通路的抑制剂IWR1 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.4 不同浓度的rpIL6及JAK-STAT通路的抑制剂AZD1480 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.5 组合添加CHIR99021和rpIL6 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.6 组合添加CHIR99021和rpIL6 对猪IVF胚胎发育的影响 |
| 3.7 LCDM体系干细胞系构建及多能性鉴定 |
| 3.7.1 LCDM相关体系转化 |
| 3.7.2 LCDM相关体系孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.8 pEPSC体系胚胎干细胞建系多能性鉴定 |
| 3.8.1 pEPSC体系优化 |
| 3.8.2 pEPSC体系的猪孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.8.3 pEPSC体系的猪体内胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.9 KOFL体系中添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可获得多能性提高的干细胞系 |
| 3.10 LSCFors体系胚胎干细胞构建及多能性鉴定 |
| 3.10.1 LSCFors体系转化 |
| 3.10.2 LSCFors体系孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.11 F-LSCFors体系胚胎干细胞构建及多能性鉴定 |
| 3.11.1 F-LSCFors体系细胞转化 |
| 3.11.2 F-LSCFors体系的孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.12 LSCFors和 F-LSCFors体系细胞基因表达差异分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪早期胚胎体外培养液的优化 |
| 4.2 猪胚胎干细胞体外培养液的优化 |
| 5 小结 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新之处 |
| 5.3 本研究的不足 |
| 5.4 本研究的下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 多能干细胞研究进展 |
| 1.1 多能干细胞的建立及分类 |
| 1.1.1 多能干细胞的概述 |
| 1.1.2 胚胎干细胞研究进展 |
| 1.1.3 细胞重编程的研究进展 |
| 1.1.3.1 诱导性多能干细胞的建立 |
| 1.1.3.2 猪诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.2 多能干细胞的维持机制研究 |
| 1.2.1 多能性核心转录因子的研究进展 |
| 1.2.1.1核心转录因子Oct4 |
| 1.2.1.2核心转录因子Sox2 |
| 1.2.2 多能性调控通路 |
| 1.2.2.1 细胞因子维持多能性 |
| 1.2.2.2 小分子抑制剂维持多能性 |
| 1.2.2.2.1 Wnt信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.2 MAPK/Erk信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.3 TGFβ/SMAD信号通路抑制剂SB431542 |
| 1.2.2.3 MEF饲养层细胞 |
| 第二章 H3K9甲基化修饰的研究进展 |
| 2.1 细胞重编程过程中的表观遗传调控 |
| 2.1.1 表观遗传学 |
| 2.1.2 DNA甲基化修饰 |
| 2.1.2 组蛋白共价修饰 |
| 2.1.3.1 组蛋白乙酰化修饰 |
| 2.1.3.2 组蛋白甲基化修饰 |
| 2.2 H3K9甲基化及功能 |
| 2.3 多能态建立过程中H3K9甲基化的作用 |
| 2.3 组蛋白去甲基化酶的研究进展 |
| 2.4 组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的研究进展 |
| 2.5 多能态建立过程中组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的作用 |
| 2.6 小结与展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪iPSCs多能态转换过程中H3K9 甲基化的变化规律 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 撤去DOX及多能培养体系对猪DOX-i PSCs的影响 |
| 3.2.2 piPSCs多能性丧失过程中H3K9与H3K4 甲基化修饰水平的变化 |
| 3.2.3 筛选影响H3K9甲基化的主要因素 |
| 3.2.4 F-与FD-处理下pi PSCs表型检测 |
| 3.2.5 F-与FD-处理下pi PSCs多能基因检测 |
| 3.2.6 F-与FD-处理下pi PSCs组蛋白甲基化修饰水平的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Feeder与外源基因协同维持猪i PSCs多能性机制解析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 转录组测序揭示F-与FD-组的基因表达变化 |
| 4.2.2 功能富集分析揭示整个分化过程中转录变化 |
| 4.2.3 H3K9me2/me3 在基因组上的分布情况 |
| 4.2.4 Ch IP-seq分析分化过程中H3K9me2和H3K9me3 的变化情况 |
| 4.2.5 多能性丧失过程中H3K9 甲基化motif变化分析。 |
| 4.2.6 H3K9甲基化与转录组联合分析揭示其作用机理 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 KDM3A与 KDMB协同调节H3K9 甲基化修饰维持猪多能性调控网络 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料与耗材 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 KDM3A与 KDM3B共干扰导致猪i PSCs丧失多能性 |
| 5.2.2 猪i PSCs中共干扰KDM3A与 KDM3B后的转录组变化 |
| 5.2.2 干扰KDM3A与 KDM3B抑制PI3K-AKT信号通路影响多能性 |
| 5.2.4 KDM3A与 KDM3B过表达对猪i PSCs多能性的影响 |
| 5.2.5 转录组测序揭示KDM3A与 KDM3B过表达的分子作用机制 |
| 5.2.6 KDM3A过表达可抑制F-处理下引发的细胞分化 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转录因子OCT4与SOX2 是维持猪i PSCs多能性调控网络的核心 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试验材料与耗材 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同DOX浓度下猪i PSCs的表型变化 |
| 6.2.2 筛选维持猪iPSCs多能性的关键转录因子 |
| 6.2.3 无DOX下过表达OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性 |
| 6.2.4 Ch IP-seq揭示OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性机理 |
| 6.2.5 转录因子之间调控网络建立 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 OCT4/SOX2 与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B互作维持猪i PSCs多能性 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 试验材料与耗材 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 OCT4与SOX2 并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达 |
| 7.2.2 H3K9去甲基化作用与核心转录因子之间的协同关系 |
| 7.2.3 转录调控水平揭示KDM3A与 OCT4/SOX2 之间的协作关系 |
| 7.2.4 IP-MS揭示KDM3A与 KDM3B的蛋白互作网络 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点及下一步研究方向 |
| 创新点 |
| 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 多能干细胞的免疫原性分子 |
| 1.1.1 主要组织相容性抗原(Major Histocompatibility Antigens,MHC) |
| 1.1.2 次要组织相容性抗原(Minor Histocompatibility Antigens, mH) |
| 1.1.3 ABO抗原 |
| 1.1.4 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Immunoglobulin-like Receptors,KIR) |
| 1.2 HLA-G |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 1.4 已发表的构建低免疫原性胚胎干细胞技术 |
| 2 双gRNA基因编辑系统的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器设备及耗材 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基及常用试剂配方 |
| 2.2.4 细胞系及质粒 |
| 2.2.5 抗体 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 感受态细菌制备 |
| 2.3.2 感受态细菌转化 |
| 2.3.3 质粒小量抽提 |
| 2.3.4 质粒中量抽提 |
| 2.3.5 细胞内RNA抽提 |
| 2.3.6 RNA反转录 |
| 2.3.7 qPCR检测 |
| 2.3.8 免疫荧光染色 |
| 2.3.9 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot) |
| 2.3.10 细胞基因组DNA抽提 |
| 2.3.11 小鼠MEF细胞制备 |
| 2.3.12 hESCs的复苏 |
| 2.3.13 hESCs传代 |
| 2.3.14 靶向gRNA设计 |
| 2.3.15 gRNA质粒构建 |
| 2.3.16 gRNA效率检验 |
| 2.3.17 hESC电转 |
| 2.3.18 hESCs神经定向分化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 双gRNA基因编辑系统可以在hPSCs中实现高效、可预测的基因敲除 |
| 2.4.2 双gRNA基因编辑系统可以在hPSCs中一次性针对多个基因实现高效、可预测的基因敲除 |
| 2.4.3 双gRNA基因编辑系统可以在hPSCs中高效、可预测地敲除非编码RNA |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 低免疫原性人类胚胎干细胞构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器设备及耗材 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 培养基及常用试剂配方 |
| 3.2.4 细胞系及质粒 |
| 3.2.5 抗体 |
| 3.2.6 实验使用gRNA统计 |
| 3.2.7 实验使用引物统计 |
| 3.2.8 HLA配型统计 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 B2M-(G4S)_4-HLA-G1及Lenti-B2M-(G_4S)_3-HLA-G5质粒构建 |
| 3.3.2 Southern Blot |
| 3.3.3 小鼠畸胎瘤注射,切片及HE染色 |
| 3.3.4 流式细胞分析 |
| 3.3.5 人类胚胎干细胞向心肌细胞定向分化 |
| 3.3.6 外周血分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC) |
| 3.3.7 混合淋巴反应(Mixed lymphocytes reaction,MLR) |
| 3.3.8 NK-92细胞培养及传代 |
| 3.3.9 JEG-3细胞培养及传代 |
| 3.3.10 PBMC细胞体外激活检测 |
| 3.3.11 NK-92细胞体外激活检测 |
| 3.3.12 慢病毒包装及感染 |
| 3.3.13 同种异体人类PBMC的预激活 |
| 3.3.14 同种异体PBMCs介导的体内免疫反应 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 通过基因编辑手段在hPSCs中实现经典型HLAI蛋白表达缺失与非经典型膜结合/分泌型HLA-G蛋白表达 |
| 3.4.2 B2M~(mHLAG)、B2M~(m/sHLAG) hESCs成功表达HLA-G,B2M~(null)、B2M~(mHLAG)、B2M~(m/sHLAG) hESCs均缺失膜结合经典型HLAⅠ类分子 |
| 3.4.3 体外实验中B2M~(null),B2M~(mHLAG)和B2M~(m/sHLAG) hPSCs及其分化所得心肌细胞表现出低免疫原性 |
| 3.4.4 体内实验中B2M~(null),B2M~(mHLAG)和B2M~(m/sHLAG)细胞表现出低免疫原性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历及博士期间研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境因素与生殖健康 |
| 1.1.1 环境污染与生殖健康 |
| 1.1.2 生活方式与配子发生 |
| 1.1.3 胚胎体外培养环境压力与表观遗传改变 |
| 1.2 早期胚胎发育概述 |
| 1.2.1 早期胚胎发育 |
| 1.2.2 多能干细胞与胚胎发育 |
| 1.3 着床前胚胎发育 |
| 1.3.1 辅助生殖技术现状 |
| 1.3.2 着床前胚胎发育过程 |
| 1.3.3 着床前胚胎基因调控 |
| 1.4 着床后胚胎发育 |
| 1.4.1 胚胎2D体外培养体系的建立 |
| 1.4.2 着床后胚胎发育过程 |
| 1.4.3 着床后胚胎发育转录因子调控 |
| 1.4.4 人类胚胎干细胞模型 |
| 1.5 信号通路在胚胎发育及干细胞中的研究 |
| 1.5.1 Wnt信号通路与胚胎发育 |
| 1.5.2 TGF-β/Activin/Nodal信号通路对胚胎发育的作用 |
| 1.6 论文的立题依据及主要研究内容 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料来源 |
| 2.1.2 主要试剂及配制方法 |
| 2.1.3 使用抗体 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胚胎样品的准备 |
| 2.2.2 胚胎体外培养 |
| 2.2.3 Matrigel浓度的选择 |
| 2.2.4 全胚染色 |
| 2.2.5 胚胎冰冻切片及切片染色 |
| 2.2.6 共聚焦显微镜拍照 |
| 2.2.7 单细胞消化分离 |
| 2.2.8 细胞测序过程 |
| 2.2.9 测序结果分析 |
| 第三章 人胚胎原肠前动态发育研究实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 人胚胎体外3D培养体系的建立 |
| 3.2.1 人胚胎体外培养体系探索 |
| 3.2.2 着床后胚胎发育过程是谱系动态变化的过程 |
| 3.3 EPI动态发育研究 |
| 3.3.1 EPI发育过程是naive向 primed转变的过程 |
| 3.3.2 EPI发育阶段互相联系又各自表达不同基因 |
| 3.3.3 人类与非人灵长类EPI发育既有差异又有保守性 |
| 3.4 着床后胚胎关键结构的形成 |
| 3.4.1 羊膜上皮是从EPI中迁移出来的一群独特的细胞 |
| 3.4.2 胚胎前后轴及原条前体的形成 |
| 3.5 滋养层细胞发育是分化发育的过程 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 人胚胎体外培养体系的突破 |
| 4.2 本研究填补了着床后人胚胎发育分子机制的空白 |
| 4.3 胚胎发育过程是多能性细胞从naive到 primed态转变过程 |
| 4.4 人类胚胎与其他物种胚胎发育的差异 |
| 4.5 人胚胎发育过程中特殊结构的形成 |
| 4.6 滋养层细胞发育分化 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
| 附录 B 医学伦理证明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 选题背景及意义 |
| 第二节 文献综述 |
| 一、国内研究现状 |
| 二、国外研究现状 |
| 第三节 研究内容及研究方法 |
| 一、研究内容 |
| 二、研究方法 |
| 第四节 创新点 |
| 第二章 我国孤雌生殖HESC技术的专利审查及现存问题 |
| 第一节 孤雌生殖HESC技术与传统技术的比较 |
| 一、孤雌生殖HESC技术的相关概念 |
| 二、HESC的获取来源 |
| 三、孤雌生殖HESC技术的优势 |
| 四、孤雌生殖HESC技术在我国的专利授权情况 |
| 第二节 《专利审查指南》修改前对孤雌生殖HESC技术的专利适格性认定 |
| 一、湖南光琇公司孤雌生殖HESC技术的专利复审案 |
| 二、专利适格性判断的法律依据 |
| 第三节 《专利审查指南》修改后依然存在的问题 |
| 一、新修正条款 |
| 二、最大的亮点 |
| 三、现存的问题 |
| 本章小结 |
| 第三章 传统与孤雌生殖HESC技术的专利适格性争议 |
| 第一节 干细胞领域专利适格性的判断模式 |
| 一、欧洲模式 |
| 二、美国模式 |
| 第二节 传统HESC技术的专利适格性争议 |
| 一、传统HESC技术的伦理争议 |
| 二、WARF案发明在美、欧、中的专利适格性认定 |
| 三、城户常雄案发明在美、欧、中的专利适格性认定 |
| 第三节 孤雌生殖HESC技术的专利适格性争议 |
| 一、孤雌生殖HESC技术的伦理争议 |
| 二、欧洲认定孤雌生殖HESC技术具有专利适格性 |
| 三、澳大利亚认定孤雌生殖HESC技术具有专利适格性 |
| 四、孤雌生殖HESC技术在其他国家的专利授权情况 |
| 本章小结 |
| 第四章 我国授予孤雌生殖HESC技术专利权保护的正当性与必要性 |
| 第一节 授予专利权保护的正当性 |
| 一、符合利益平衡要求 |
| 二、符合中国伦理指南的指导原则 |
| 三、符合不断变化的社会公德内涵 |
| 第二节 授予专利权保护的必要性 |
| 一、干细胞产业的政策导向 |
| 二、干细胞产业发展的需要 |
| 本章小结 |
| 第五章 对我国孤雌生殖HESC技术专利审查制度的完善建议 |
| 第一节 孤雌生殖HESC技术在我国具有专利适格性 |
| 一、不属于科学发现 |
| 二、不属于疾病的诊断和治疗方法 |
| 三、HESC及其制备方法不属于不可专利的主题 |
| 四、不属于人胚胎的工商业目的的运用 |
| 第二节 对《专利审查指南》的完善建议 |
| 一、在专利审查中将14天研究期限适用于孤雌囊胚 |
| 二、允许以现存孤雌干细胞系进行研究的成果可专利 |
| 三、对具体条款的修改建议 |
| 本章小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
