邵琦,张才,李鹏飞,宋新茹,李元晓,王玉琴[1]（2020）在《牛肝干细胞的分离培养与鉴定》文中研究指明该实验旨在分离牛肝干细胞,培养观察其生长特性,为比较医学研究及开发牛肝脏体外研究工具提供实验基础。实验采用改良的离体两步胶原酶灌流法,结合密度梯度离心分离牛肝干细胞,观察细胞形态及生长特性,并利用免疫荧光染色和PCR对牛肝干细胞相关标志物进行鉴定。实验分离的细胞接种48 h开始贴壁分裂,随后呈集落样生长,表现出干细胞的特性,低密度下培养504 h后细胞呈肝细胞样分化。正常接种密度的细胞可传至P3代,HE染色可见细胞均为单核,核浆比大,呈幼稚低分化状态;免疫荧光染色和PCR结果均显示,该细胞表达甲胎蛋白AFP、上皮细胞黏附蛋白（EpCAM）、造血干/祖细胞表面标志CD34、干细胞因子受体蛋白（c-kit）、细胞角蛋白CK18、CK19。结果表明,该研究分离了一种具有明显干细胞特征,并表达成熟肝细胞和胆管上皮细胞表面标志物的牛肝干细胞。
王亚萍,孔祥平,刘光泽,卓丽,高洪波,唐小平,佟明华[2]（2018）在《GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植》文中认为背景:近年研究证实,干细胞移植的成功与否、移植后细胞功能的发挥均与体内微环境密切相关。正常生理情况下,肝脏不易接受外源性细胞,因此,在目前的细胞移植研究中,通常会先建立一个移植动物模型,通过造成宿主肝脏的损伤或降低宿主肝脏的免疫反应等方式,为外源细胞的植入和增殖创造一个良好的移植条件。目的:观察GFP转基因小鼠胎肝干细胞在脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐/倒千里光碱联合1/3肝切除（L-CL2MDP/RS/PH）模型大鼠肝脏内的定植和分布情况。方法:（1）以孕15 d GFP转基因小鼠为供体,分离培养胎肝干细胞,荧光显微镜观察GFP表达,并行免疫细胞化学鉴定;（2）将30只SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组腹腔注射倒千里光碱溶液（30 mg/kg,共2次,每次间隔2周）,术前1 d每只大鼠静脉注射1 m L脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐（L-CL2MDP）溶液,行1/3部分肝脏切除后经脾内移植GFP转基因小鼠胎肝干细胞,对照组用生理盐水分别代替L-CL2MDP和倒千里光碱溶液,不进行1/3部分肝脏切除;（3）移植后3,15,30 d取出两组大鼠肝脏行冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP阳性肝干细胞在大鼠肝脏的分布,并通过免疫组化染色方法检测抗小鼠C-Kit抗体在移植大鼠肝内的表达。结果与结论:（1）镜下观察分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态。培养5 d后细胞体积逐渐增大,呈类圆形或梭形,荧光显微镜下可见绿色荧光,免疫细胞化学检测第3代肝干细胞表达CD34、AFP;（2）胎肝干细胞移植后3 d在荧光显微镜下发现实验组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,移植后30 d大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达;（3）移植后3,15,30 d在实验组大鼠肝脏组织可见C-Kit阳性细胞表达;（4）结果表明,GFP转基因小鼠胎肝干细胞成功移植于L-CL2MDP/RS/PH模型大鼠脾内,植入的细胞能够在大鼠肝脏中存活,并出现不同程度增殖。
姚浩[3]（2017）在《肝外胆管系统中CD63+干细胞的识别鉴定及其修复肝脏损伤能力的研究》文中提出肝脏干细胞是一类具有自我更新能力并可分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的肝脏原始细胞,它们参与肝脏发育、生长和损伤修复与再生的过程。在前期的研究中,我们发现肝干细胞作为细胞移植的治疗用细胞与成熟肝细胞等其它类型细胞相比至少有以下优点:1)肝脏干细胞植入受体后增殖能力强并有重构肝干细胞巢的潜能;2)肝干细胞可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞和其他间质细胞;3)体外对肝干细胞的培养和扩增比成熟肝细胞相对容易;4)肝干细胞为原始未分化状态细胞,相对于其他细胞,免疫原性很低。因此,我们认为肝干细胞很可能是理想的肝脏疾病治疗用细胞的来源。然而,现有的研究已经知道存在于肝脏内的干细胞的数量极少,再加上正常肝脏组织的来源很不容易,所以在基于肝干细胞肝脏疾病治疗中多元的治疗用细胞来源则是一个值得解决的问题。鉴于肝内和肝外胆管在发育上、功能上和空间上的连续性,以及其它实验室关于肝外胆管中有干性细胞存在的报道,我们意识到了利用肝外胆管组织来解决肝脏疾病治疗用干细胞来源匮乏的可能性。基于这一考虑,本研究希望回答两个基本的生物学问题:1)肝外胆管中的什么细胞是真正的干细胞?2)它们是否具有类似的肝干细胞生物学特性和修复肝脏损伤的能力?肝外胆管组织包括胆囊、囊管、左右肝管、肝总管和胆总管。有研究表明,正常肝外胆管系统中存在干/前体细胞（Biliary tree stem/progenitor cells,BTSCs）,并认为这些细胞具有分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞或胰腺内分泌细胞等类型细胞的多项分化潜能。Rohan Manohar等人在小鼠胆囊中发现并鉴定EpCAM+CD49fhi的上皮细胞具有干细胞的特征;Guido Carpino等人则利用EpCAM阳性细胞符合干细胞的特性,从人的胆囊内分离出EpCAM+K7+Lgr5+Sox17+Pdx1+的内胚层干细胞,发现分离获得的这些细胞表现出未分化细胞的特征,并且在体外具有自我更新能力以及可以被诱导分化为多种类型的细胞。然而,这些研究中“干性细胞”群体依赖表面标志物EpCAM,而这个标志物不能区分胆管上皮细胞和干细胞,具有异质性,且针对这些细胞只是简单检测了一些指标,并未深入研究细胞的相关特性。总结起来,现有研究存在的主要问题有:1)缺少肝外胆管系统干细胞的特异性分子标志;2)缺少肝外胆管系统干细胞的体外培养体系;3)体内损伤修复能力不明确。本研究围绕以上问题展开研究,试图为肝外胆管系统中干细胞是否可以作为供体细胞在临床上治疗肝病中提供线索。我们实验室前期的研究表明CD63是肝内胆管干细胞特异性的表面分子标志物。因此,针对目前缺少肝外胆管系统干细胞的特异性分子标志,我们尝试以CD63为线索,来探讨小鼠和人肝外胆管系统中是否有细胞表达CD63,以及这些细胞是否具有干细胞的特性和修复肝脏损伤的能力。首先,通过原位免疫组织化学染色分别检测小鼠和人的肝外胆管内是否有细胞表达CD63,以及这些CD63+细胞是否共表达肝干细胞的分子标志。第二,以CD63为分选标志利用流式分选技术分离纯化肝外胆管系统内的细胞,并对这些细胞的体外培养体系及生物学特性进行鉴定。第三,将分离获得的CD63细胞移植到肝损伤动物模型当中,观察其是否具有再殖并修复疾病损伤的能力。对于小鼠肝外胆管系统的研究发现:1)原位免疫组化染色显示,小鼠肝外胆管系统存在干性细胞,且这些细胞共表达肝干细胞分子标志CK19、EpCAM和Alb,但不表达间质相关分子标志αSMA;我们利用IV型胶原酶和胰酶联合处理消化小鼠肝外胆管组织,利用肝干细胞培养基Scm A可以将这些细胞在体外进行稳定扩增,且这些细胞在基因和蛋白水平均表达EpCAM、CK19、Alb、N-cadherin、Sox9、Pan-CK和E-Cadherin等肝干细胞分子标志,体外诱导分化实验表明这些细胞能被诱导分化为成熟肝细胞样细胞;2)鉴于CD63可以作为肝内肝干细胞特异性的分子标志,我们首先在原位鉴定了小鼠肝外胆管组织中存在CD63+细胞,且这些细胞共表达肝干细胞分子标志EpCAM、CK19、Alb和Lgr5;继而通过流式分选将小鼠肝外胆管内CD63+细胞分离纯化后,基于前期建立的肝干细胞培养基条件,通过改良后添加生长因子:b FGF和VEGF,可以将这些细胞在体外稳定培养和增殖（大于30代）;3)通过抽提RNA和细胞免疫荧光染色实验发现,这些小鼠肝外胆管CD63+细胞在基因水平和蛋白水平表达CK19、Sox9和EpCAM等肝干细胞分子标志;4)体外诱导实验显示,小鼠CD63+细胞可以被诱导为具有合成糖原、吲哚菁绿的摄入和排出及具有LDL受体等成熟肝细胞的功能和表型,以及能够形成囊管状结构（且囊管结构内的细胞具有极性）和运输罗丹明等成熟胆管上皮细胞的功能;5)将标记了绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠CD63+细胞移植入延胡索酰乙酰乙酸脱氢酶（Fumarylacetoacetate hydrolase,Fah）基因缺陷（Fah-/-）小鼠模型中,发现这些细胞不仅可以分化为成熟肝细胞来再殖入受损的肝脏（再殖效率可高达19.69%）,还可以分化为胆管上皮细胞（再殖效率可高达10.85%）,这也是首次在Fah-/-小鼠体内观察到有移植的干细胞可以分化为胆管上皮细胞。说明小鼠肝外胆管系统中CD63+细胞确实是真正的干细胞,其不仅具有肝干细胞基本特性,而且具有较好的修复肝脏损伤的能力。对于人肝外胆管系统的研究发现:1)与小鼠结果类似,在人的胆囊、囊管和胆总管中均有细胞表达CD63,且这些CD63+细胞共表达肝干细胞分子标志;2)通过I型胶原酶消化的方法可以获得肝外胆管组织的单细胞悬液,体外培养的这些细胞具有上皮样形态和高核质比等干细胞特征,且在体外可以增殖3代以上;3)以CD63为分选标志通过流式分选前后的肝外胆管细胞在基因和蛋白水平均表达肝干细胞相关分子标志。说明在人肝外胆管内存在干细胞,但是具体的分离纯化和体外培养体系还需要深入的研究。综上所述,本研究发现了肝外胆管系统中干细胞的特异性表面分子标志,明确了其存在的空间位置,建立了其干细胞直接从肝外胆管组织中分离培养的技术体系,实现了其干细胞增殖与分化特性的研究。进而,完成了其干细胞在肝脏损伤小鼠模型中的再殖效率和治疗作用的评估。这些研究成果的取得,正面地回答了我们最初关于“肝外胆管干细胞是否可以作为肝脏疾病治疗用干细胞来源”的问题,为肝脏疾病研究中细胞来源匮乏问题的解决提供了一个新的思路。
李云[4]（2016）在《成年小鼠肝干细胞的分离与鉴定》文中研究指明目的:目前普遍认为可以在体内分化形成肝细胞和胆管上皮细胞并且具有自我更新能力的细胞为肝干细胞。然而,迄今为止已被报道的肝干细胞表面标志物较少,有关标志物尚待理清,同时关于肝干细胞的年龄相关性的研究目前尚处在初级阶段。本文的目的是:利用实验动物C57BL/6J小鼠,分离鉴定了真正具有分化和自我更新能力的肝脏干细胞亚群,为深入了解肝干细胞及其临床应用奠定基础。通过分析比较青年（2-3月龄）、中年（10-12月龄）和老年（22-24月龄）小鼠肝干细胞含量、细胞周期、分化和自我更新能力,旨在阐明肝干细胞功能的年龄相关性变化,并通过青年和老年组肝干细胞基因表达谱分析,为探究肝脏干细胞衰老调控机制及潜在调控因子奠定基础。方法:（1）小鼠肝脏细胞的分离与单细胞悬液的制备:断颈法处死C57BL/6J小鼠后,取肝脏组织并通过机械剪碎和胶原酶Ⅳ消化处理及细胞筛过滤获得单细胞悬液。（2）小鼠肝干细胞流式分析及分选:新鲜制备的肝脏单细胞悬液经抗表面标志蛋白抗体染色孵育后,通过流式细胞分析仪分析潜在的肝干细胞靶细胞群表型及含量,通过流式细胞分选仪分选靶细胞群。（3）肝干细胞的体外增殖与分化:将分选得到的靶细胞群经完全培养基诱导培养,培养结束后用抗标志蛋白荧光抗体染色,通过荧光显微镜观察分化及增殖状况。（4）细胞周期测定:新鲜分离的细胞首先经抗表面标志蛋白抗体染色,然后经Fixation/Permeabilization固定渗透,再进行7-AAD染色,通过流式细胞分析仪分析肝干细胞的周期分布。（5）基因表达检测:分离得到的靶细胞提取总RNA,检测RNA质量与纯度,逆转录合成cDNA,制备基因芯片。（6）基因表达谱分析:Go分析、pathway分析。（7）统计方法:采用SPSS19.0统计软件对实验数据进行“独立样本T检验”分析,统计结果以平均值±标准差表示。结果:（1）分离的肝脏组织制备成单细胞悬液,经抗表面标志蛋白荧光抗体组合染色孵育,经流式分析,小鼠肝脏组织细胞中可能存在三个潜在的肝干细胞亚群,分别为Lin-CD45-Sca-1+CD49f+、Lin-CD45-Sca-1-CD49f+、Lin-CD45-Sca-1+CD49f,在肝脏组织细胞中的比例分别为 1.17%±0.18%,0.13%±0.02%,0.57%±0.023%。（2）对潜在的三个干细胞亚群进行体外增殖、分化培养和免疫荧光鉴定,确定Lin-CD45-Sca-1-CD49f+、Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群具有体外增殖和分化能力,同时进行周期分布比较,相比于肝脏组织细胞,Lin-CD45-Sca-1-CD49f+、Lin-CD45-Sca-1+CD49f靶细胞群中有更多的细胞进入到了细胞分裂期（3.64%±0.14%VS5.73±0.41%,P<0.01;3.64%±0.14%VS7.16%±1.04%,P<0.01）,这也说明这两群细胞呈现出了更为活跃的增殖和分化的状态,故确定Lin-CD45-Sca-1-CD49f+、Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群可能为潜在的肝干细胞群。（3）小鼠肝干细胞功能的年龄相关性变化:Lin-CD45-Sca-1-D49f+细胞以及Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞随着鼠龄的增加,该细胞的含量呈现增高的趋势;相对于青年鼠,中年、老年鼠中的 Lin-CD45-Sca-1-CD49f+、Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群处于 S 和 G2/M 期的比例增加;青年小鼠 Lin-CD45-Sca-1-CD49f+、Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群的分化能力明显高于老年小鼠Lin-CD45-Sca-1-CD49f+、Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群的分化能力。（4）通过基因芯片结果分析,初步筛选出一些与年龄相关性有关的差异基因。结论:本研究从细胞表型、体外增殖与自我更新潜能、体外分化能力和细胞周期几个方面,基本确认了小鼠肝脏组织中Lin-CD45-Sca-1-CD49f+和Lin-CD45-Sca-1+CD49f细胞群为肝内潜在的前体细胞或祖细胞亚群。对肝干/祖细胞的年龄相关性研究发现靶细胞群在中年和老年组中的含量增加,但分化潜能降低,故衰老的肝脏组织功能退行性变化可能主要是由肝干细胞功能降低所致,而非干细胞含量的减少。肝干细胞衰老受到严格的表观遗传修饰,涉及的潜在调控因子往往与细胞的自我更新相关。同时通过基因芯片筛选与肝干细胞年龄相关性基因,提升对LSC/PCs衰老的行为变化及其调节机理的认识,为今后了解人肝干细胞衰老及其与年龄依赖性肝脏疾病发生的内在联系提供极具价值的资料和线索。
张增光,秦鸣放[5]（2015）在《Cx43基因干扰对鼠胎肝干细胞培养的优化效应》文中研究说明背景:胎肝干细胞具有分化成肝细胞、胆管细胞的潜能,参与肝脏的修复与重建,是肝细胞的重要来源,但是人体的胎肝干细胞含量极少,如何获取一定数量和较高纯度的胎肝干细胞是目前研究的热点。目的:构建能有效抑制大鼠胎肝干细胞Cx43基因表达的siR NA载体,探讨抑制Cx43表达对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养鼠胎肝干细胞,设计及合成靶向Cx43的siR NA序列（Cx43-siR NA）以及阴性对照序列（NC-si RNA）,采用电转法转染大鼠胎肝干细胞,即为实验组和对照组,未转染的胎肝干细胞为空白组。应用real-time PCR和Western blot法检测转染前后鼠胎肝干细胞Cx43基因和蛋白的表达;细胞生长曲线、CCK-8法观察细胞生长增殖情况;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论:转染Cx43-siR NA后,实验组与对照组、空白组相比Cx43基因和蛋白水平表达均明显降低,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞减少,S期细胞数增多,差异有显着性意义（P<0.05）,结果表明通过电转法转染靶向Cx43的si RNA能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。
杨夏彤,许鸣,郭婉薇,付延玉[6]（2014）在《肝源性肝干细胞及对肝癌治疗的研究应用》文中研究说明肝干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的肝内成体干细胞,与肝脏发育和再生修复密切相关。肝干细胞所具有的无限自我更新与双向分化能力使它成为治疗终末期肝病及制备生物人工肝最理想的细胞来源。从肝脏中存在干细胞样细胞的提出,到动物体内卵圆细胞的分离成功,再到人成体肝源性干细胞的发现,人们对肝干细胞的认识在不断深入,尤其是人成体肝源性肝干细胞的发现,为肝干细胞的临床应用提供了更广阔的空间,并可能为肝癌靶向治疗提供新的靶点,具有重要的临床意义。
王亚萍[7]（2013）在《鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究》文中研究表明第一章一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法背景干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中；根据其发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。肝干细胞（hepatic stem cell,HSC）是成体干细胞的一种,可分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞。跟据其起源的不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞,前者主要包括肝卵圆细胞、小肝细胞,后者主要起源于骨髓干细胞和胚胎干细胞。目前研究肝干细胞已成为世界范围的热点,由于它具有来源广泛、增殖能力强、移植细胞体积小等传统肝细胞无可比拟的优点,可以预测它将替代肝脏移植和肝细胞移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源。正是由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势,因此探讨如何获得高纯度的肝干细胞及其特异性的标志物有重要的现实意义。正常情况下,体内肝干细胞多处于静息期,数量极少,分离时常先经药物或手术造成肝脏损伤,肝脏灌流或联合细胞分离液分离来获得肝干细胞,操作复杂且成本较高。相比较传统的肝干细胞分离培养方法而言,本实验室首次采用先机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,简单的离心分离法和胰蛋白酶选择性消化法相结合,从孕15天大鼠胎肝组织中成功分离出肝干细胞。此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。目的改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法1、购清洁级别近交系孕15天SD大鼠,利用械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进行进一步的纯化,得到较为纯化的肝干细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。2、将卵圆细胞接种于预先用0.2%明胶处理的盖玻片上置于24孔培养板中,37℃,5%CO2孵箱培养24小时,至细胞长成单层后行免疫荧光化学检测。细胞消化传代,对P10代细胞进行免疫组织化学检测。分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物CD34、C-Kit、0V6、CK19的表达情况结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形。经1-2次差异性消化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白（AFP）抗原、OV6、细胞角蛋白（CK）19呈阳性表达,不表达ALB。P10代肝干细胞C-Kit、 CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。结论此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为深入研究肝干细胞生物学特性和进行体内移植实验提供了物质基础。第二章大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用背景长期以来,成熟肝细胞和卵圆细胞在损伤肝的再生中如何发挥作用一直是肝干细胞研究领域的核心问题,对两者在损伤肝再生中的作用也有着不同的观点。一方面,有报道认为部分肝切除（partial hepatectomy, PH）后大鼠肝可在二周内再生并恢复至原来大小,有人连续进行了12次PH后发现仍能完成肝再生：这种肝再生多被认为是单独由成熟肝细胞分裂增殖完成的。另一方面,在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering’s管的卵圆细胞（OVC）被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞。目前,为研究成体肝脏中肝干细胞的增殖、分化,研究者们采用各种不同的方法抑制肝细胞增殖,并采用药物（如CCl4）或肝部分切除术等诱导肝脏急性损伤,以激活肝脏干细胞。从而研究肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。本研究鉴于RS是公认的能长期抑制成熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂,而PH又能给予强烈的肝再生需求,我们建立了肝脏切除及其联合应用倒千里光碱导致肝脏急性损伤的大鼠模型,通过对Rs/PH和1/3PH后肝再生过程中成熟肝细胞和卵圆细胞的比较病理学研究,并依据研究中观察到的一系列现象,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。目的联合应用倒千里光碱（RS）和肝脏1/3切除术（1/3PH）建立大鼠肝损伤模型。观察大鼠肝损伤后肝细胞和卵圆细胞增殖情况,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。方法1、30只大鼠随机分为2组,每组15只。倒千里光碱／肝脏1/3切除组（RS/PH组）：取150g左右SD大鼠,腹腔注射倒千里光碱溶液30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周。肝脏1/3切除组（1/3PH组）：用生理盐水代替倒千里光碱,腹腔注射30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周,第2次腹腔注射4周后,两组大鼠行肝脏1/3切除术。2、分别于术后第3、7、14、20天处死大鼠,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,采用苏木精-伊红染色,BrdU注射及BrdU免疫荧光化学检测,CK19、 C-Kit免疫组织化学检测观察两组大鼠术后不同时间点肝脏病理形态变化、细胞增殖情况和CK19、C-kit免疫组化检测情况结果RS/PH组大鼠术后20d体质量仍低于术前,肝脏增大明显小于1/3PH组,HE染色示胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性,汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生；1/3PH组术后20d体质量恢复接近术前,肝脏损害较RS/PH组轻,Brdu免疫荧光示成熟肝细胞大量增生,术后14d见肝OVC增生,多出现在肝细胞索中,形态和免疫组化标记与RS/PH组OVC一致。结论成功构建了倒千里光碱联合肝脏1/3切除术的急性肝损伤大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞和成熟肝细胞增殖的现象,证实肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内外源肝干细胞及成熟肝细胞共同作用的结果。第三章GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究背景各种原因引起的急、慢性肝功能衰竭的发病率和死亡率很高,已成为威胁肝病患者生命的主要原因。目前,原位肝移植（OLT）已被证明是治疗各种肝功能失代偿期、肝功能衰竭期最有效的治疗方法,但因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后并发症多等限制了OLT的广泛应用。近年来,新的干预性治疗不断出现,肝细胞移植已开始应用于一些动物模型和人类临床实验,但由于肝细胞来源不充足,人们仍然希望能够获得大量更安全的细胞来源。肝干细胞的移植为此开拓了新的途径,肝干细胞是一种多能干细胞,它具有自我更新、高度增殖及向肝细胞和胆管细胞分化的能力,在体内可以分化为肝细胞和胆管细胞,参与肝脏的发生发育及损伤后修复等生理病理过程。若能将其大量扩增后再进行移植,就可能从量上解决细胞来源短缺的问题。肝干细胞移植相对于肝细胞具有更大的优势：（1）肝干细胞具有更大的增殖能力,植入受体后增殖能力强,较少的移植细胞数就能达到较好的增殖效果；（2）移植肝内后能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,对肝组织结构重建及功能恢复更为有利,更为重要的是,肝细胞增殖需要受肝存在选择压力,而肝干细胞在正常肝脏环境中就能大量增殖,为受体肝脏的再生及肝功能恢复提供机会；（3）肝干细胞分化不成熟,免疫原性更弱,Kubota等研究表明肝母细胞中不表达经典的MHC-1分子,在肝干细胞同种异体移植时能引起免疫逃逸。移植失败现象较肝细胞移植少,对受体影响小；（4）肝干细胞直径（10-12μm）较肝细胞（20-35μm）小,更容易通过肝窦到达肝脏各叶,使其定植及扩增效率增加。而肝细胞移植浓度较高时部分细胞则不能通过汇管区小血管。因此肝干细胞可以作为生物型人工肝和肝细胞移植最理想的细胞来源,从而在肝病基因治疗中发挥重要作用,并有望成为取代严重肝功能衰竭患者肝移植的替代疗法,具有很大的研究前景。本研究对L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠进行GFP转基因小鼠胎肝干细胞移植,结果表明本实验室建立的肝干细胞系能够成功植入L-CL2MDP/RS/PH大鼠肝脏中,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。而在未作预处理的正常大鼠肝脏中未见GFP+肝干细胞。虽然我们并不能明确移植的胎肝干细胞在肝内增殖程度,但从肝脏中GFP阳性的细胞比例比较,L-CL2MDP/RS/PH实验组比正常对照组具有明显的优势。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。今后我们将扩展这一研究成果,努力与临床实践相结合,并回答移植研究中尚待解决的排斥免疫学机制问题。目的1、从荧光转基因小鼠胎肝中获得稳定表达GFP蛋白的肝脏干细胞2、联合应用L-CL2MDP/RS/PH,建立适合肝脏干细胞移植的大鼠动物模型,进一步提高肝干细胞的移植效率。方法：1、孕15d绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,体重40-60g,SPF级150g左右SD雄性大鼠30只,GFP转基因小鼠胎肝干细胞的分离、体外培养与传代及免疫组化鉴定2、建立L-CL2MDP/RS/PH动物模型,将分离的胎肝干细胞通过脾脏注射移植到大鼠肝脏,检测细胞移植后GFP蛋白的表达,以及免疫组化检测C-Kit、 AFP明确移植的肝干细胞在肝脏内是否增殖。结果1、倒置显微镜下见分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态。接种培养瓶24h细胞开始贴壁并伸展；培养5d后细胞体积增大,呈梭形或多角形,荧光显微镜可观察到细胞发出绿色荧光。传代3次后,细胞状态良好,在荧光显微镜下可见炫目的绿色荧光,免疫组化检测P3代细胞CD34、AFP呈阳性表达,。2. HSCs经脾脏移植后3d在荧光显微镜下观察两组大鼠的肝脏冰冻切片,发现L-CL2MDP/RS/PH组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,细胞大小为正常肝细胞的1/3-1/2,与周围细胞相比,呈现高亮度的绿色荧光；而对照组大鼠肝内未见GFP阳性细胞。移植后30d移植大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达,阳性细胞成团聚集、局灶状分布,细胞形态与肝细胞相似。结论1、从GFP转基因小鼠肝脏中成功分离出胎肝干细胞,分离的细胞原代形态均一、增殖速度快、传代3次后均可以稳定而强烈表达绿色荧光,为进一步研究提供了良好的示踪工具。2、成功建立了L-CL2MDP/RS/PH的大鼠模型,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。小结1、改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。本研究选择大鼠胚胎肝脏作为细胞来源,采用机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进一步纯化,得到较纯净的大鼠胎肝干细胞。利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物,证实本研究分离培养的细胞具有干细胞特性,是肝干细胞。2、观察倒千里光碱联合肝脏部分切除术（RS/PH）对肝损伤后再生修复的影响。本实验成功构建了倒千里光碱联合肝脏部分切除术导致肝脏急性损伤的大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞增殖的现象,术后H-E染色发现RS/PH组汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生,CK19、c-kit阳性细胞出现在汇管区,特别是小胆管周围,形态与周围胆管细胞相似。而PH组未见以上表现。证实该模型可抑制成熟肝细胞增殖,同时通过刺激肝卵圆干细胞增殖以实现修复。这为研究适用于肝干细胞移植的动物实验模型提供一些有价值的信息。3、肝干细胞移植的成功率低仍是目前国内外研究中亟待解决的一个问题。为了进一步提高肝干细胞在肝脏中的存活,本实验室完成脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐（L-CL2MDP）的制备,通过腹腔注射L-CL2MDP,特异性的清除肝脏及脾脏中的巨噬细胞,并进一步联合应用我们已经构建的倒千里光碱/部分肝切的大鼠肝损伤模型,建立一种新的肝干细胞移植模型。目前,我们从本实验室已有荧光转基因小鼠肝脏分离肝脏干细胞,获得稳定表达GFP的细胞株,将GFP+-LSC细胞通过脾脏注射移植给L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠。观察其在肝内的增殖情况,并对对照组和处理组加以检测及比较,以确定此模型是否能够提高肝干细胞的移植效率。
王亚萍,佟明华,雷香丽,孔祥平,罗显荣[8]（2013）在《一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法》文中研究指明目的改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法采用剪碎酶消化法分离大鼠胎肝干细胞,差速离心结合选择性消化法进行进一步纯化,含10%优等胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物。结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24 h后开始贴壁,5 d后细胞体积增大,呈梭形或多边形。经1～2次差异性消化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示:P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白（AFP）抗原、OV6、细胞角蛋白（CK）19呈阳性表达,不表达Alb。P10代肝干细胞C-Kit、CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。结论大鼠胎肝干细胞分离纯化、培养扩增及鉴定方法简单易行。
黄利华,郭姣,黄佩,纪超,贝伟剑,邓晓君[9]（2010）在《新生大鼠肝干细胞的分离、培养与鉴定》文中提出目的体外分离、培养新生大鼠肝干细胞（HSCs）,并对其生物学特性进行鉴定。方法采用剪碎加酶消化法分离新生大鼠肝干细胞,用体积分数10%胎牛血清的H-DMEM培养液培养。以MTT法检测细胞的增殖情况,以RT-PCR检测肝干细胞特异性标记分子的表达。结果分离的新生大鼠肝干细胞体外培养24h已贴壁,3d左右可见克隆形成,呈铺路石样分布,光镜下细胞为方形或多角形,边缘清楚,细胞核及核仁明显,表达细胞角蛋白CK18、CK19、CK8、甲胎蛋白（AFP）等肝干细胞特异性标记分子,低度表达白蛋白。结论成功分离、鉴定出了新生大鼠肝干细胞,并可在体外条件下进行传代扩增培养。
郭向飞,金敏,陈照立,李君文[10]（2009）在《人胎肝干细胞的分离培养、鉴定及mRNA转录分析》文中认为目的:探讨体外大量扩增培养人胎肝干细胞的方法,研究其形态、特性及mRNA转录情况。方法:采用两步灌流法结合链霉蛋白酶消化及Percoll密度梯度离心法分离12～20周胎龄的胎肝细胞,采用免疫细胞化学染色及RT-PCR方法对分离培养的细胞进行鉴定分析。结果:刚分离的细胞活力在80%以上,原代培养3d开始出现小细胞团,2周后即形成肉眼可见的细胞集落,细胞体积小,核质比大;原代、传代培养的胎肝细胞甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK19）、卵圆标记蛋白OV-6、细胞分化抗原34免疫染色阳性;RT-PCR分析证明胎肝干细胞中AFP、白蛋白、CK19、CK18和八聚体结合蛋白（OCT）-4mRNA的表达。结论:分离了胎肝干细胞,具有肝细胞、胆管细胞及干细胞表面标志及相应的基因表达,为进一步的基础研究奠定了基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 牛肝干细胞的灌流消化、分离 |
| 1.4 牛肝干细胞的纯化 |
| 1.5 牛肝干细胞的原代培养及形态学观察 |
| 1.6 牛肝干细胞的传代培养 |
| 1.7 HE染色 |
| 1.8 聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因 |
| 1.9 细胞免疫荧光染色 |
| 2 结果 |
| 2.1 牛肝干细胞的原代培养及形态学观察 |
| 2.2 牛肝干细胞的传代培养 |
| 2.3 HE染色 |
| 2.4 牛肝干细胞的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肝干细胞的分离 |
| 3.2 肝干细胞的体外培养条件 |
| 3.3 肝干细胞的表面标志 |
| 4 结论 |
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 GFP转基因小鼠胎肝干细胞的分离培养、传代及鉴定 |
| 1.2.2 脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐 (L-CL2MDP) 溶液的制备 |
| 1.2.3 L-CL2MDP/RS/PH大鼠移植模型的建立和实验分组 |
| 1.2.4 GFP转基因小鼠胎肝干细胞的脾内移植 |
| 1.2.5 观察GFP阳性肝干细胞在移植大鼠肝脏的分布 |
| 1.2.6 检测抗小鼠C-Kit抗体在大鼠肝脏中的表达 |
| 2 结果Results |
| 2.1 GFP转基因小鼠胎肝干细胞的形态特征和GFP表达 |
| 2.2 胎肝干细胞的鉴定 |
| 2.3 荧光显微镜下GFP转基因小鼠胎肝干细胞在肝内的分布 |
| 2.4 抗小鼠C-Kit抗体在实验组大鼠肝脏中的表达 |
| 3 讨论Discussion |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、胆管系统中干性细胞的研究背景及现状 |
| （一）肝内胆管系统中干/前体细胞的研究现状 |
| （二）肝外胆管系统中干性细胞的研究现状 |
| 二、本课题的研究背景和方法目的 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、小鼠肝外胆管系统中干性细胞的探索 |
| （一）小鼠肝外胆管系统中存在干性细胞 |
| （二）小鼠肝外胆管系统中干性细胞的分离和培养 |
| （三）小鼠肝外胆管系统中分离的细胞具有肝干细胞特征 |
| 二、CD63可以作为小鼠肝外胆管中干细胞特异性的分子标志 |
| （一）小鼠肝外胆管系统中存在CD63~+细胞 |
| （二）小鼠肝外胆管系统中CD63~+细胞的获取和培养 |
| （三）小鼠肝外胆管系统中CD63~+细胞具有肝干细胞特征 |
| （四）小鼠肝外胆管系统中CD63~+细胞可以修复慢性肝损伤 |
| （五）小鼠肝外胆管 CD63~+细胞不具有致瘤性 |
| 三、人肝外胆管系统中干性细胞的初步研究 |
| （一）人肝外胆管内有存在干性细胞 |
| （二）人肝外胆管系统中干性细胞的分离纯化和体外培养 |
| （三）分离获得的人肝外胆管细胞表达肝干细胞分子标志 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 成体肝干细胞(Liver stem cells,LSCs)的发现与定义 |
| 1.2 肝干细胞的类型 |
| 1.2.1 肝源性肝干细胞 |
| 1.2.2 非肝源性肝干细胞 |
| 1.3 肝脏干细胞在肝病治疗中的应用 |
| 1.3.1 急慢性肝功能衰竭(肝衰竭) |
| 1.3.2 代谢性肝脏疾病 |
| 1.3.3 肝癌 |
| 1.4 肝干细胞的年龄相关性变化 |
| 1.5 肝干细胞治疗面临的问题与应用前景 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 试剂与溶液的配置 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠肝脏细胞的分离 |
| 2.2.2 小鼠肝干细胞的表型分析 |
| 2.2.3 小鼠肝干/祖细胞的流式分选 |
| 2.2.4 体外扩增培养与分化诱导 |
| 2.2.5 细胞免疫荧光 |
| 2.2.6 细胞周期测定 |
| 2.2.7 总RNA提取和质检 |
| 2.2.8 芯片制备 |
| 2.2.9 统计方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 小鼠肝干细胞的表型分析 |
| 3.2 小鼠肝干细胞的体外增殖 |
| 3.3 小鼠肝干细胞的体外分化 |
| 3.4 小鼠肝干细胞的周期分布 |
| 3.5 小鼠肝干细胞年龄相关性变化 |
| 3.5.1 不同年龄段小鼠肝干细胞含量的变化 |
| 3.5.2 不同年龄段小鼠肝干细胞周期分布变化 |
| 3.5.3 不同年龄段小鼠肝干细胞分化能力变化 |
| 3.6 小鼠肝干细胞衰老调控因子的初步筛选 |
| 3.6.1 总RNA提取结果 |
| 3.6.2 芯片扫描结果 |
| 3.6.3 生物信息分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写一览表 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 0引言Introduction |
| 1材料和方法Materialsandmethods |
| 2结果Results |
| 3讨论Discussion |
| 1 肝源性肝干细胞的研究历程 |
| 2 人肝源性干细胞的特点 |
| 2.1 肝脏疾病对人肝源性干细胞的影响 |
| 2.2 人肝源性干细胞的定位 |
| 2.3 人肝源性干细胞的表面标记 |
| 2.4 人肝源性干细胞的分离、培养与鉴定 |
| 3 人肝源性干细胞与肝癌的关系 |
| 4 人肝源性肝干细胞发展前景及面临的问题 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法 |
| 前言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 成果 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 大鼠胎肝干细胞的分离和初次纯化 |
| 1.3.2 大鼠胎肝干细胞的二次纯化 |
| 1.3.3 免疫细胞化学法检测胎鼠肝脏干细胞的OV-6、AFP、CD34、C-Kit、Alb和CK19的表达情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 肝干细胞存活率及形态特征 |
| 2.2 肝干细胞的免疫荧光化学技术检测结果 |
| 2.3 免疫细胞化学 (辣根过氧化物酶法) 检测P10代肝干细胞表面标志 |
| 3 讨论 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 人胎肝干细胞的分离 |
| 1.3 人胎肝干细胞的培养与传代 |
| 1.4 细胞免疫化学鉴定人胎肝干细胞 |
| 1.5 RT-PCR检测人胎肝干细胞mRNA的转录 |
| 2 结果 |
| 2.1 人胎肝干细胞活性鉴定 |
| 2.2 人胎肝干细胞的形态学特点 |
| 2.3 细胞免疫化学染色鉴定人胎肝干细胞 |
| 2.4 RT-PCR检测人胎肝干细胞mRNA转录 |
| 3 讨论 |
