武彩霞[1]（2021）在《骡子诱导多能干细胞生物学特性分析及体外分化的研究》文中研究说明骡是马和驴种间杂交所生的杂种后代,大部分没有生殖能力。目前关于骡不育的原因还没有相关实验证明性结论。2011年,Saitou等人将小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）定向诱导为原始生殖样细胞（Primordial germ cell-like cells,PGCLCs）,成功得到了存活后代,并且在小鼠iPSCs上也得到了相同结果。在之后的研究中,利用不同方法也可将人和马iPSCs定向诱导为PGCLCs。本研究尝试利用干细胞具有多能性、可以长期稳定传代等优势将本实验室建立的可育母骡iPSCs（Fertile mule fibroblasts induced pluripotent stem cells）定向诱导为PGCLCs,为研究骡不育的生殖生物学机制提供科学依据。具体实验结果如下:1.克隆形态与碱性磷酸酶染色结果显示,骡FMF-iPSCs细胞核质比大,细胞之间连接紧密,克隆形态呈不规则扁平状,界限清晰且碱性磷酸酶染色呈阳性。2.核型分析结果显示,骡FMF-iPSCs染色体数目正常2N=63/XX,基因组稳定。3.实时荧光定量PCR及免疫荧光染色结果显示,骡FMF-iPSCs在RNA、蛋白水平均表达多能性标记基因OCT4、SOX2、NANOG。4.体外EBs分化结果显示:骡FMF-iPSCs具有体外分化为三个胚层的潜能,分化产物在RNA水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因HNF4A、HAND1、NESTIN,蛋白水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因GATA6、T、NESTIN。5.骡FMF-iPSCs注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48 h后,组织切片荧光染色结果显示,该细胞系增殖、移动,有贡献到三个胚层与早期PGCs的潜能。6.PGCLCs定向诱导分化结果显示,三种不同诱导方法均可使FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs,RNA水平、蛋白水平分别表达PGCs标记基因NANOS3、BLIMP1、SOX17;VASA、BLIMP1。综上所述:本研究得到了在血清Li F培养体系中长期稳定传代的可育母骡FMF-iPSCs,该细胞系具有自我更新能力和多能性,并维持稳定的基因组特征;这类干细胞体外拟胚体分化具有贡献到三个胚层的潜能,注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48h后干细胞能够增殖、移动,并贡献到三个胚层与PGCs。另一方面,通过三种不同诱导方法均可将FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs。上述研究探讨了骡FMF-iPSCs的干细胞特性及PGCLCs定向分化能力,为杂交动物细胞的干细胞诱导及相关研究提供重要科学依据。
于海帆[2]（2021）在《YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制》文中研究说明蜕膜化是子宫基质细胞增殖并分化为蜕膜细胞的过程,是子宫对正在发生着床的胚胎的响应,也是胚胎发育和成功妊娠的关键过程。蜕膜化缺陷可能导致一系列妊娠疾病,包括反复自然流产和早期妊娠失败。尽管许多转录因子、细胞因子和信号通路已被证实参与胚胎着床和蜕膜化过程,但其潜在的调控机制目前尚不完全清楚。大量研究表明,Yes-相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）参与调控器官大小、干细胞功能、器官再生和肿瘤发展等过程。基因敲除鼠相关研究已证实,YAP/TAZ在哺乳动物胚胎发育过程中发挥重要作用。YAP缺失的胚胎具有致死性,而TAZ缺失的小鼠能够存活,但表现出肾脏发育缺陷。然而,关于YAP/TAZ在子宫蜕膜化过程中的作用及调控机制的研究很少。本课题旨在研究YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机理,为进一步明确哺乳动物胚胎着床及蜕膜化的机制提供依据。在本研究中我们观察到,在小鼠子宫蜕膜化过程中YAP的表达量逐渐升高,并且证实YAP失活会影响子宫基质细胞的增殖和分化,并伴有细胞周期的阻滞。在子宫基质细胞中,Bmp2可通过Bmp I型受体Alk2促进YAP的表达并诱导YAP的核积累,从而增强细胞核内YAP-TEAD转录活性。通过si RNA或添加抑制剂导致YAP失活后可阻碍Bmp2对基质细胞分化的促进作用。使用荧光素酶报告基因分析发现,迁移到细胞核中的YAP可直接结合到Rrm2启动子区域的TEAD序列,并调节Rrm2在基质细胞中的功能。通过检测8-OHd G含量发现,过表达Rrm2可改善YAP失活引起的基质细胞DNA损伤,同时恢复基质细胞分化。进一步分析发现,YAP介导Bmp2对Rrm2表达的调控,而添加Rrm2抑制剂Triapine处理会阻碍Bmp2对基质细胞分化的诱导作用。YAP抑制后显着下调了GR和GPX的活性,进一步导致GSH含量下降,但上述指标在Rrm2过表达组呈现出相反的趋势。通过检测基质细胞内ROS含量、ATP水平、线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位以及线粒体膜通透性转运孔的开放程度,我们发现YAP失活会引起基质细胞发生氧化应激,并进一步导致线粒体功能发生紊乱。同时,YAP的失活通过促进Caspase-3和Bax的表达并抑制Bcl-2的表达从而诱发基质细胞凋亡。然而,GSH可有效的清除升高的ROS水平,并防止YAP失活引起的氧化应激、线粒体功能发生紊乱和细胞凋亡。本研究结果表明,TAZ定位于蜕膜组织中,能够通过靶向Ccnd3和Cdk4以加速细胞周期G1/S的过渡从而促进基质细胞的增殖,同时TAZ可促进基质细胞分化的标志分子Prl8a2和Prl3c1的表达,提高ALP的活性,表明TAZ对蜕膜化的发生至关重要。沉默TAZ会阻碍HB-EGF诱导的基质细胞的增殖和分化。在氧化应激状态下,TAZ通过减少细胞内ROS水平,并通过依赖于Nrf2/ARE/Foxo1的信号通路来增强基质细胞的抗氧化能力,进而保护基质细胞分化免受氧化损伤。TAZ能够增强Nrf2的转录活性,而Nrf2可直接与Foxo1启动子区域的抗氧化反应元件（ARE）结合。此外,TAZ沉默后可导致NOX活性升高从而引起细胞内ROS的积累,而一旦NOX的活性被APO抑制后,基质细胞分化所受的损伤可明显获得挽救。进一步研究表明,ATP水平升高、mt DNA拷贝数增加、线粒体膜电位升高和线粒体超氧化物水平下降共同提示,TAZ可明显恢复基质细胞的线粒体功能。同时,TAZ能够调节线粒体呼吸链复合物I和III的活性,而通过ROT和AA分别抑制其活性后,均可导致TAZ对基质细胞分化的保护作用丧失。另外,在氧化应激过程中,TAZ还可通过上调Bcl-2的表达并抑制Caspase-3的活性及Bax的表达来防止基质细胞发生凋亡。综上所述,本研究表明,YAP/TAZ在小鼠蜕膜化过程中发挥重要作用。我们的结果证实YAP可作为Bmp2的下游调控蛋白,通过TEAD/Rrm2/GSH/ROS信号通路调节子宫蜕膜化过程。TAZ可能通过靶向Ccnd3介导HB-EGF在子宫蜕膜化中的作用,并通过Nrf2/ARE/Foxo1信号通路减轻氧化应激介导的基质细胞分化损伤。
褚新月[3]（2021）在《诱导性心脏祖细胞的生成及其3D水凝胶培养体系的构建》文中进行了进一步梳理心脏疾病是造成人类死亡的主要原因之一,其发病率仅次于癌症,特别是由于冠状动脉阻塞而导致的心肌梗死（Myocardial infarction,MI）,常造成心肌细胞（Cardiomyocytes,CMs）的不可逆损伤或死亡。由于出生后CMs的再生能力很差,目前对于MI仍无有效的根治方法。移植外源性CMs治疗MI需要大量的细胞,容易造成免疫排斥反应,且细胞来源受限。胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,i PSCs）能够分化成为心脏细胞,但由于其体内分化方向难以控制,容易产生异质细胞,甚至引发肿瘤。采用间接谱系转化技术,将体细胞重编程为诱导性心脏祖细胞（Induced cardiac progenitor cells,iCPCs）,因其具有“自我更新”和心脏谱系细胞分化潜能,能够提供大量细胞资源、有效降低致瘤性和分化细胞异质性,具有广阔的应用前景。传统二维（Two-dimension,2D）细胞培养系统因无法精确模拟体内状态,造成大量心脏疾病研究结果无法在实验动物和临床试验中复制重现。运用细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）构建的三维（Three-dimension,3D）培养体系（例如:水凝胶）能够模拟细胞的体内微环境,更有利于开展心脏疾病的研究。壳聚糖是一种由葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺组成的天然多糖,具有无毒、可降解、抗菌和抗真菌等特性,有望降低ECM引入的污染问题,并提升水凝胶的稳定性。因此,本研究通过过表达五种心脏转录因子（Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1）,将人胚肾293T细胞（Human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T细胞）重编程成为iCPCs;应用胶原蛋白、壳聚糖和ECM构建出3D水凝胶细胞培养体系,并探讨了iCPCs在该体系中的细胞行为和诱导分化特性,为心脏疾病的机理研究、药物筛选、模型构建和细胞治疗等奠定了基础。试验一iCPCs的生成与鉴定应用间接谱系转化技术,通过Lipofectamine LTX介导心脏转录因子Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1在HEK-293T细胞中过表达,将其重编程成为iCPCs,并通过形态学观察、免疫细胞化学染色、实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）和诱导分化等方法对所得细胞进行鉴定。结果表明:（1）HEK-293T细胞经重编程后,所得细胞具有与心脏祖细胞（Cardiac progenitor cells,CPCs）相似的形态学特征,细胞呈圆形或椭圆形,无突起;呈现出CPCs特异性标志蛋白:Gata4、Nkx2.5和Irx4的免疫细胞化学染色阳性反应,且各自的阳性细胞率分别为61.36±1.08%、60.97±1.28%和61.73±1.18%;与HEK-293T细胞相比,iCPCs中Irx4、Tbx20、Mesp1和Nkx2.5基因的相对表达量极显着上调（P<0.01）,而Fsp1和Col5A1基因的相对表达量极显着下调（P<0.01）;（2）iCPCs经心脏谱系诱导分化液处理后,能够生成呈短圆柱形、细胞核位于细胞中央的CMs,呈多边形、细胞边缘不规则的内皮细胞（Endotheliocytes,ECs）,以及呈长梭形、无横纹的平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）;分化细胞呈现出CMs特异性标志蛋白——Cardiac actin、ECs特异性标志蛋白—CD31或SMCs特异性标志蛋白—SM-MHC的免疫细胞化学染色阳性反应,其各自的阳性细胞率分别为49.37±84%、48.61±0.74%和47.57±0.77%;分化细胞中c Tn T和Actinin-α1（CMs标志基因）、PEACAM1（ECs的标志基因）和MYL2（SMCs的标志基因）的相对表达量分别极显着高于iCPCs对照组（P<0.01）。因此,过表达Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1能够将HEK-293T细胞重编程成为CPC样细胞,所得iCPCs具备分化成为CMs、ECs和SMCs的能力。试验二iCPCs的3D水凝胶培养体系构建采用胶原蛋白、壳聚糖和ECM,按照不同体积比:4:0:3（对照组）、4:1:3（壳聚糖处理组1）、4:2:3（壳聚糖处理组2）和4:3:3（壳聚糖处理组3）制备水凝胶,通过检测其形态结构、孔隙率、溶胀度和降解率,筛选细胞回收条件,探讨水凝胶对iCPCs行为和分化的影响,旨在构建iCPCs的3D水凝胶培养体系。结果表明:（1）经扫描电子显微镜观察,不同比例组成的3D水凝胶均显示出立体网络结构。对照组水凝胶显示出较大孔径的结构,胶原蛋白分布较为疏松;壳聚糖处理组1的水凝胶呈现出较为致密的结构,孔径大小均一,表面粗糙,各孔隙相互贯通;壳聚糖处理组2和3的水凝胶表现出更小的孔径结构,胶原纤维分布杂乱无序,有大小不等的隆起;（2）壳聚糖处理组1形成水凝胶的孔隙率（99±0.30%）、溶胀度（97±0.87%）、降解率（44±0.03%）以及iCPCs的增殖倍数（58±0.24）和存活率（73±0.60%）均分别极显着高于对照组、壳聚糖处理组2和3（P<0.01）;（3）0.30%胰蛋白酶和0.25%胶原蛋白酶消化同种3D水凝胶回收的细胞数之间无显着性差异（P>0.05）,但均极显着高于0.45%胃蛋白酶处理组（P<0.01）;经不同浓度的胰蛋白酶、胶原蛋白酶和胃蛋白酶消化3D水凝胶后,壳聚糖处理组1的回收细胞数均分别极显着高于其余比例组成的3D水凝胶处理组（P<0.01）;（4）在3D水凝胶中,iCPCs及其诱导分化细胞的形态学特征与2D培养细胞无明显差异,体积稍小;与2D培养体系相比,在3D水凝胶中,iCPCs来源分化细胞:Cardiac actin+CMs、CD31+ECs和SM-MHC+SMCs的数量均极显着上升（P<0.01）,分化细胞的c Tn T、actininα1、PEACAM1和SMCs基因的相对表达量也极显着上调（P<0.01）。因此,宜采用壳聚糖处理组1的方案制备水凝胶进行iCPCs的3D培养,使用0.25%胶原蛋白酶或0.30%胰蛋白酶消化水凝胶回收细胞,3D水凝胶比2D培养体系更有利于iCPCs体外分化成为CMs、ECs和SMCs。结论:利用Lipofectamine LTX介导五种心脏转录因子（Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c和Mesp1）的过表达,可以将HEK-293T细胞重编程成为iCPCs,所得iCPCs具备分化成为CMs、ECs和SMCs的能力;宜采用胶原蛋白、壳聚糖和ECM,按照4:1:3的比例,构建出机械性能强和稳定性高的3D水凝胶,该细胞培养体系支持iCPCs的存活和增殖行为,0.25%胶原蛋白酶或0.30%胰蛋白酶适宜用于消化水凝胶回收细胞;3D水凝胶比2D培养体系更有利于iCPCs分化成为心脏谱系细胞:CMs、ECs和SMCs。iCPCs的生成和3D水凝胶培养体系的建立为解析心脏发育、损伤和修复机制,构建心脏疾病模型,筛选和开发药物,研发细胞治疗新策略等提供了研究平台。
张云峰[4]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中研究表明绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
袁霞[5]（2021）在《CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究》文中研究说明在哺乳动物中,可以通过体细胞核移植、体外受精和胚胎移植等胚胎工程技术以及超低温冷冻技术实现种质资源的保护和物种复原。然而由于禽类为卵生动物,其胚胎发育方式与哺乳动物相比有很大差异,导致这些胚胎工程技术和冷冻保存技术无法在禽类上广泛应用,极大地阻碍了禽类胚胎工程的研究和珍稀物种保护工作。而禽类原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）具有迁移的特性,体外培养的鸡PGCs注入正常孵化的鸡胚血管后可在受体胚胎性腺中增殖并产生了嵌合体鸡,且鸡PGCs移植到鸭早期胚胎中也能够获得嵌合体鸭,表明PGCs的异体/种间移植或许能解决禽类种质资源保存的问题。然而由于分离原代PGCs细胞数量少,且需以牺牲早期胚胎为代价,导致PGCs异种间移植应用并不广泛,禽类种质资源保护仍面临巨大难题。2006年,诱导干细胞技术问世,体细胞经过诱导重编程能够形成与胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）类似的诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPS）,诱导体细胞重编程技术的出现给为珍稀禽类的保种、转基因禽类的生产等研究开辟了新思路,诱导体细胞重编程技术能够为禽类的胚胎工程和转基因工程研究提供新的干细胞来源,诱导重编程所需的禽类体细胞的分离和冷冻技术相对简单,能够短时间获取大量的细胞,并且对个体不会造成较大伤害,因此,若能通过诱导重编程技术将禽类体细胞重编程为iPS并进一步诱导成PGCs,便能极大地解决PGCs分离困难且无法大量获得的难题。目前,诱导体细胞重编程技术已在小鼠、人、大鼠、猪、猴、牛、羊、鸡等多个物种上成功应用。本课题组前期建立了原代PGCs迁移归巢模型并成功产生了后代,同时建立了 CEF诱导鸡iPS并进一步诱导分化为iPGCs的转分化体系,但这一转分化体系的诱导效率较低,且CEF转分化形成的iPGCs细胞是否具有原代PGCs同样的产生后代的能力仍不清楚。因此,本研究利用OCT4、SOX2、NANOG、LIN28（OSNL）因子体系诱导黑羽狼山鸡CEF重编程为iPS,对该体系进行优化,通过BMP4/BMP8b/EGF体系将其诱导分化为iPGCs,进一步通过转录组测序对不同体系诱导获得的iPS细胞及iPGCs进行分析,分别比较其与原代ESCs和PGCs之间的异同,最后通过鸡胚血管移植的技术将黑羽狼山鸡iPGCs移植到受体隐性白羽鸡中,孵化出壳后饲养至性成熟,通过公母鸡自交产生后代,借助微卫星检测以及基因组重测序分析后代鸡是否来源于黑羽狼山鸡iPGCs,为实现PGCs在禽类种质资源保护过程中的广泛应用奠定基础。研究结果如下:（1）鸡iPS诱导体系的优化本研究利用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28A（OSNL）重编程体系对鸡成纤维细胞CEF进行诱导重编程,获得了与ESCs有相似特性的狼山鸡iPS,为碱性磷酸酶染色阳性,表达SSEA-1蛋白,体外能够分化形成类胚体且表达三胚层标记基因。荧光定量结果显示,从诱导重编程的第6天开始,内源性多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等的表达逐渐被激活,而成纤维细胞标记基因Thy-1的表达逐渐被沉默。对重编程过程中不同天数的糖酵解相关基因表达、酶活性、葡萄糖摄取量及乳酸产生量的变化进行检测,结果显示,从诱导的第6天开始,重编程过程中糖酵解相关基因Hk1,Ldha,Glut1,Pfkp表达逐渐上调,并且糖酵解关键限速酶己糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）及果糖-6-磷酸激酶（PFK）活性在诱导第9天均显着增强（P<0.05）。同时,葡萄糖摄取量逐渐增加,乳酸产生量出现极显着堆积（P<0.01）,表明鸡CEF诱导重编程为iPS的过程中糖酵解被激活。此外,随着重编程的进行,氧化磷酸化相关基因Ndufa10及Cox4i1的表达极显着下调（P<0.01）,且鸡iPS细胞的线粒体膜电位与CEF相比出现明显下降,表明氧化磷酸化被抑制。进一步通过添加糖酵解抑制剂和激活剂发现糖酵解能够激活内源多能性基因表达从而促进鸡iPS形成。通过生物信息学分析发现Oct4、Sox2和Nanog三个转录因子在糖酵解关键基因Hk1、Pfkp和Ldha的启动子区有共同的结合位点,双荧光素酶报告实验检测显示过表达Oct4,Sox2,Nanog极显着上调了Hk1、Pfkp和Ldha等基因的转录活性（P<0.01）,且过表达Oct4,Sox2,Nanog能够上调Hk1、Pfkp和Ldha的表达并提高糖酵解水平。因此本研究OSNL体系的基础上筛选了糖酵解激活剂2i-SP来优化iPS诱导体系,结果显示,添加2i-SP后糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Glut1的mRNA表达均上调,葡萄糖摄取量和乳酸产生量也有不同程度的提高。同时添加2i-SP后,诱导产生的iPS克隆数从24.33±2.08极显着增加至47.00±3.61（P<0.01）,流式分析检测SSEA-1阳性细胞比例也从1.59%±0.08极显着升高到11.47%±1.93（P<0.01）,表明2i-SP通过激活糖酵解来促进鸡iPS形成。以上结果表明糖酵解能够协同核心多能性因子促进鸡体细胞诱导重编程,小分子化合物2i-SP能够提高鸡iPS的形成效率。（2）不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究为了比较分析体外诱导重编程形成的鸡iPS细胞与ESCs的转录水平的异同以及添加不同小分子化合物对鸡iPS形成的影响,分析干细胞形成和糖代谢相关因子在不同诱导条件下的表达变化,本研究对不同体系诱导的鸡iPS、CEF及鸡ESCs进行RNA-seq,首先对不同样本的log10（FPKM）进行聚类热图分析,结果显示,重编程后的iPS基因表达模式与ESCs相似。对糖酵解及氧化磷酸化相关基因FPKM值进行聚类热图分析,结果显示iPS（OSNL）中糖酵解相关基因Hk1、Ldha、Pdk3、Pdk4、Pfkp、Slc2al、Hif1a等基因表达水平均高于iPS（OSNL）,而氧化磷酸化相关基因Mdufs1-6,Ndufa1-12等的表达水平均低于CEF,表明CEF诱导重编程为iPS后其代谢方式从氧化磷酸化转变为糖酵解。在iPS（OSNL）组和CEF组中,存在8376个基因差异表达,所有差异表达基因主要富集到细胞代谢相关的条目以及许多与糖代谢、脂代谢、蛋白合成相关的通路。与iPS（OSNL）vs CEF组相比,iPS（OSNL2i-SP）vs CEF组中有1 751个特异上调表达基因,主要富集到细胞生长调节、细胞周期正调控、胚胎骨骼系统形态发生等细胞生长发育调控的相关条目,并且还富集到自噬体、糖:质子转运体活动及碳水化合物代谢过程。（3）鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究本研究通过BMP4/BMP8b/EGF将黑羽狼山鸡iPS诱导分化,获得了 PAS染色阳性且表达Cvh、c-KIT、Blimp1等PGCs标记基因的iPGCs。对鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化进行检测发现在iPS诱导分化为iPGCs的过程中,糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Ldha的表达逐渐下降,并伴随着氧化磷酸化相关基因Ndufa10和Cox4i1表达的逐渐增加,同时葡萄糖摄取量逐渐减少,乳酸产生量也逐渐降低,表明鸡iPS诱导分化为iPGCs的过程中糖酵解被抑制。为了全面解析iPGCs中基因的表达情况;鉴定iPS来源的iPGCs是否具有正常的PGC相似的特性,以及研究iPGCs体外诱导形成过程中的机制,本研究对iPS诱导的iPGCs进行了转录组测序。层次聚类结果显示iPS来源的iPGCs的表达模式接近于原代PGCs。根据筛选出的PGCs标记基因表达情况制作小提琴图,结果显示iPS体外诱导的iPGCs细胞的PGCs标记基因表达模式与原代PGCs相近。在鸡iPGCs（iPS derived）组与PGCs组中,6555个基因存在差异表达,所有差异表达基因主要富集到了一些与糖类、脂类及蛋白质代谢相关的条目以及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸代谢、自噬和PPAR等信号通路,表明这些信号通路在体外诱导iPGCs的过程中可能发挥了重要的调控作用。（4）鸡iPGCs介导类克隆体系的建立本研究将黑羽狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs注射至孵化2.5天的隐形白羽鸡F1的血管中,建立鸡iPGCs介导的类克隆体系,利用F1代公母鸡自交获得了类克隆鸡后代F2,并对F2代类克隆鸡进行了微卫星鉴定。狼山鸡iPGCs经PKH26红色荧光细胞膜表面标记后在显微镜下呈红色荧光,分离移植了 PKH26标记的黑羽狼山鸡iPGCs细胞后的白羽鸡种蛋的生殖嵴,在显微镜下观察到受体鸡胚生殖嵴中PKH26标记的红色荧光。移植了黑羽狼山鸡CEF诱导重编程获得的iPGCs的F1代受体隐性白羽鸡胚共100枚,继续孵化至出壳并存活的F1代受体隐性白羽鸡共45只,饲养至性成熟后进行公母鸡自交,收集所产受精蛋孵化至出壳,记为F2代,共获得517只F2代后代鸡,其中F2代阳性类克隆鸡个数为193只类克隆鸡阳性率为37.33%。F2代继续饲养,至性成熟时进行测交,收集受精种蛋孵化至出壳,鸡为F3代,共获得140只F3代后代鸡,其中阳性类克隆鸡个数为64只,类克隆鸡阳性率为45.71%,接近50%。本研究选择MCW004及MCW104微卫星位点作为黑羽狼山鸡的特异分子标记,对F2代阳性类克隆鸡进行了 MCW004及MCW104位点的微卫星测序检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点的长度均不一,但阳性后代中仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明类克隆鸡为狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs来源的后代。本研究对F2代类克隆鸡自交产生的F3代类克隆鸡同样进行了微卫星检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点长度仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明本研究的CEF转分化为iPGCs介导的类克隆技术能够稳定遗传原供体的遗传特性。
李学亮[6]（2021）在《组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理精子发生过程包括三个阶段,即精原干细胞的自我更新与分化、精母细胞的减数分裂和单倍体圆形精细胞的变形。这一过程受到基因表达的精密调控。条件性敲除胚胎期生殖细胞内的H3K9me2去甲基化酶基因Jmjd1a和Jmjd1b导致基因表达紊乱和精子发生受损。因此,探究组蛋白甲基化修饰对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制,对于雄性不育的诊治具有一定的指导意义。组蛋白甲基转移酶SETDB1能够催化组蛋白H3K9甲基化,在干细胞多能性维持,神经细胞分化等过程中发挥重要作用。然而,SETDB1调控精原干细胞增殖与分化的确切机制仍不清楚。因此,本研究利用细胞免疫荧光,染色质免疫共沉淀,RNA-seq,ATAC-seq和Ch IP-seq等方法探究SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制。主要结果如下:（1）Ed U和细胞流式检测结果显示Setdb1-KD导致小鼠精原干细胞增殖速率降低,细胞周期阻滞在S期。细胞免疫荧光与TUNEL检测结果表明,Setdb1敲低诱导细胞DNA断裂和凋亡水平升高。这表明Setdb1-KD阻碍了精原干细胞增殖,导致细胞凋亡。（2）Setdb1-KD导致精原干细胞NADPH氧化酶4（NOX4）及其配体P22PHOX表达量上升,活性氧水平升高。挽救试验发现,相对于Setdb1敲低组,Setdb1和Nox4同时敲低组的细胞内活性氧含量较低,细胞凋亡增加和增殖速率减慢的表型得到部分挽救。此外,使用活性氧清除剂褪黑色素直接清除细胞内的活性氧,也可以在一定程度上抑制Setdb1-KD诱导的细胞凋亡。这表明NOX4上调介导的活性氧水平升高参与到Setdb1敲低诱导的细胞凋亡和增殖速率减慢。（3）Setdb1-KD导致细胞内p-P38和p-JNK水平升高、FOXO4活化,这表明Setdb1-KD激活了细胞内活性氧下游p38/JNK-FOXO4信号通路。（4）SETDB1-Ch IP-qPCR和H3K9me3-Ch IP-qPCR结果显示,Nox4基因启动子区域几乎没有SETDB1和H3K9me3的富集,说明SETDB1对Nox4的调控不是直接的,有可能是由于Setdb1-KD导致Nox4基因临近处的转座子激活,从而使得NOX4表达量升高。（5）在小鼠精原细胞内,Ythdf2-KO导致SETDB1与H3K9me3修饰水平降低。蛋白质免疫共沉淀结果表明,SETDB1与γH2AX之间相互作用。当发生DNA损伤时,Setdb1-sh RNA介导的Setdb1-KD导致精原细胞的克隆形成能力降低,细胞凋亡增加,γH2AX阳性细胞数增加。同时,当发生DNA损伤时,Ythdf2-KO的精原细胞出现了与Setdb1-KD类似的表型。而且体内试验结果发现,当用DNA损伤药物etoposide诱导发生DNA损伤时,Ythdf2 c KO小鼠(Stra8-Cre,Ythdf2loxp/loxp)睾丸组织平均每个曲细精管内的γH2AX阳性细胞数和c PARP阳性细胞数均高于对照组。这表明在小鼠精原细胞,YTHDF2能够调控Setdb1的表达,且它们均参与DNA损伤应答反应。（6）挽救试验发现,当发生DNA损伤时,在Ythdf2-KO的精原细胞过表达Setdb1,部分挽救了Ythdf2-KO介导的细胞克隆形成能力降低的表型。此外,RNA-seq分析表明,在DNA损伤条件下,SETDB1过表达使得Ythdf2-KO组中部分促凋亡基因转录水平降低。这表明Ythdf2-KO诱导的精原细胞DNA损伤敏感性增加部分是由于SETDB1下调导致的。（7）借助流式细胞术和STA-PUT分选猪精原干细胞和分化精原细胞,结合ATAC-seq,Ch IP-seq和RNA-seq解析猪精原干细胞分化过程中SETDB1,H3K9me3修饰以及染色质可及性变化。RNA-seq分析结果表明,精原干细胞分化过程中有684个基因表达上调,702个基因表达下调。而且,在分化过程中,促分化相关基因c-Kit启动子处的SETDB1和H3K9me3修饰富集水平降低,染色质可及性升高。因此,推测SETDB1可能通过H3K9me3修饰调控促分化相关基因表达,从而调控精原干细胞分化。综上所述,本研究发现SETDB1通过调控NADPH氧化酶NOX4的表达和细胞内的活性氧水平,调控小鼠精原干细胞的存活;Ythdf2-KO导致SETDB1下调,从而诱导DNA损伤敏感性增加;SETDB1通过H3K9me3修饰调控猪精原干细胞分化过程中染色质可及性,引起分化相关基因表达变化,从而调控精原干细胞的分化。本研究为组蛋白甲基化修饰对雄性精子发生的调控机制提供理论参考。
张晖[7]（2021）在《LncRNA NRON通过shp2调控Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化》文中研究说明第一部分LncRNA NRON在小鼠和TOF胚胎心脏中的表达及细胞分布背景:既往研究表明,lncRNA NRON与心肌病、心力衰竭及肿瘤发生等相关,在细胞质中可以作为scaffold与其他蛋白质组成复合体参与蛋白质的失活、转运,或作为“sponge”隔离mi RNA,参与与调节蛋白质的功能。这些研究所关注都是的lncRNA NRON与发育完成后的心脏疾病的关系,到目前为止没有文献报道lncRNA NRON与发育中的心脏或先天性心脏病的关系。法洛四联症（TOF）是复杂先天性心脏病中表型最多且最常见的类型,可以作为和心脏发育相关的研究对象。目的:阐明lncRNA NRON与发育中的心脏及TOF的相关性,并明确其在心肌细胞中的分布。方法:（1）收集C57BL/6J小鼠胚胎期（E9.5,E10.5,E11.5,E13.5天,E14.5）,生后7天（P7）及成年（Adult）的心脏,提取RNA后RT-PCR扩增lncRNA NRON,进行DNA凝胶电泳,构建lncRNA NRON时间表达谱。（2）利用RT-qPCR技术检测lncRNA NRON在C57BL/6J小鼠不同时期的表达量差异,从而明确与小鼠心脏发育时间的关联性。（3）收集人类平均胎龄在20周的正常胚胎心脏和TOF胎儿心脏各8例,取右心室组织提取RNA后RT-qPCR检测lncRNA NRON的表达量,观察两组间是否存在差异以明确lncRNA NRON与TOF的相关性。（4）利用RNAFish及亚细胞分离技术对lncRNA NRON进行心肌细胞亚定位。结果:（1）lncRNA NRON在小鼠胚胎发育的E10.5天开始表达,此后的胚胎期至成年均稳定表达。（2）lncRNA NRON的表达量并不均一,从E10.5至P7,呈现上升趋势,此后至成年时又逐渐下降。（3）与对照组相比,TOF组胚胎心脏中lncRNA NRON呈现明显低表达,差别有统计学意义（P<0.0001）。（4）在hESCs诱导分化的心肌细胞（h ESC-CM,HCM）及AC16人心肌细胞中,80%的NRON定位在细胞核中。结论:（1）lncRNA NRON的表达时间与小鼠心脏发育关键时间窗具有部分重合性,可能参与小鼠心脏的发育。（2）lncRNA NRON低表达和TOF的发生具有相关性。（3）lncRNA NRON主要分布在心肌细胞胞核中,为研究其在胞核中的作用奠定基础。第二部分敲除LncRNA NRON抑制hESCs向正常心肌细胞分化背景:先天性心脏病的发生与心肌分化异常密不可分。既往研究表明,多个和心肌分化相关的核心转录因子（NKX2.5、TBX5、GATA4）及信号通路（Wnt信号通路、TGF-β信号通路）的异常均和TOF的发生相关,提示心肌分化异常在TOF的发生中可能占据主导地位,任何导致心肌分化异常的因素均可能成为TOF的发生原因之一。第一部分研究发现,lncRNA NRON同心脏发育及TOF发生具有相关性,但同心肌分化的关系尚未明确。目的:利用人胚胎干细胞（hESCs）可以向心肌分化的特性研究敲除lncRNA NRON对心肌分化的影响。方法:（1）利用epi CRISPR技术构建hESCs细胞lncRNA NRON敲除株（NRON-KO hESCs）及空载对照细胞株（empty-vector hESCs）,内部引物（238bp）及外部引物（292bp）PCR产物凝胶电泳挑选纯合敲除和杂合敲除株,外部引物PCR产物测序验证敲除成功。（2）对构建好的两组细胞株进行体外诱导分化,电子显微镜观察分化过程中形态差异,细胞免疫荧光观察心肌细胞标志物差异。（3）RT-qPCR检测不同分化时期标志基因的表达差异。结果:（1）从50个单克隆细胞群落中成功挑选出2个纯合敲除细胞株和45个杂合敲除细胞株,外部引物PCR产物测序结果与敲除后连接片段序列一致,证明敲除成功。（2）empty-vector hESCs组细胞在诱导分化第8天开始看到第一簇跳动的心肌细胞,到第12天几乎90%以上的细胞可以看到跳动。而NRON-KO hESCs组细胞在分化期间及结束后始终未发现可以搏动的心肌细胞。细胞免疫荧光证实仅有少数细胞可见c Tn T标记,且荧光量明显低于对照组。（3）RT-qPCR结果显示,早期中胚层标志基因T和MIXL1的表达显着受到抑制（P<0.001）;心脏发育核心转录因子基因NKX2.5、MEF2C和GATA4转录水平在第4天、第6天和第8天时均显着低于对照组（P<0.001）,由此产生的结果是诱导分化的细胞相关的心肌标志物（ANP,BNP,α-MHC,β-MHC,TNNT2及TNNT3）的表达几乎消失（P<0.0001）。结论:敲除lncRNA NRON可以阻碍hESCs向功能性心肌细胞分化,表明lncRNA NRON对hESCs向心肌细胞分化必不可少。第三部分LncRNA NRON促进shp2在细胞核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化背景:shp2蛋白在细胞核中可去磷酸化Parafibromin,促进其与β-catenin形成复合体,从而激活经典Wnt信号通路。我们采用的体外分化方案是通过使用小分子物质调控Wnt/β信号通路即可完成hESCs向心肌分化,且心肌细胞分化效率高达98%。前两部分研究结果提示,lncRNA NRON主要定位在心肌细胞胞核中,敲除lncRNA NRON后hESCs不能分化成功能性心肌细胞。根据分化方案推测敲除lncRNA NRON可能对Wnt/β-catenin信号通路产生了干扰而导致hESCs无法向心肌细胞分化。目的:验证lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控及可能参与的蛋白质,进一步研究NRON参与心肌细胞发育调控及其潜在的机制。方法:（1）RT-qPCR检测诱导分化4天时敲除组与对照组中Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的转录水平,包括cyclin D1,Myc及Axin2。（2）构建NRON过表达质粒载体（pc DNA-NRON）,利用双荧光素酶报告基因检测lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。同时将构建好的NRON-KO hESCs和empty-vector hESCs细胞株分别提取RNA送测序。（3）提取AC16人心肌细胞胞核蛋白,利用RNA Pulldown及质谱分析技术（MS）寻找细胞核内与lncRNA NRON互作的蛋白质,Western blot（WB）验证结果。（4）WB检测对照组与敲除组中与NRON互作的蛋白质表达的差异。（5）利用双荧光素酶报告基因检测与NRON互作蛋白质的抑制剂对lncRNA NRON激活的Wnt/β-catenin信号通路的作用。（6）在AC16人心肌细胞中过表达lncRNA NRON,通过激光共聚焦观察对NRON互作蛋白细胞定位的影响。结果:（1）与empty-vector hESCs相比,Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因cyclin D1,Myc以及Axin2在NRON-KO hESCs组均表现为明显的下调,差别有统计学意义（P<0.001）,而β-catenin的表达未受影响（P>0.05）。（2）与仅转染β-catenin的细胞相比,同时转染pc DNA-NRON和β-catenin的HEK293T细胞的TOPflash活性提高了2倍,差别有统计学意义（P<0.01）。这一现象在仅转染pc DNA-NRON的细胞中也可以见到。（3）对敲除组和空载组细胞进行RNA-seq及KEEG富集分析,发现在NRON-KO hESCs细胞株中表达下调的基因在Wnt信号通路富集。（4）RNA Pulldown-MS发现shp2蛋白与NRON特异性结合,这一结果得到了WB的支持。（5）双荧光素酶报告实验显示由NRON过表达增加的TOPflash活性,在加入shp2的强效抑制剂TNO155后,TOPflash活性急剧下降了10倍以上,且差别有统计学意义（P<0.001）。（6）WB分析显示,shp2蛋白表达量在empty-vector h ESC组与NRON-KO h ESC组之间无差异,提示shp2可能不是NRON的靶基因（target gene）,而是一个伙伴基因（partner gene）。（7）激光共聚焦结果显示在同样密度的AC16心肌细胞中转染pc DNA-NRON,shp2主要聚集在细胞核内,而在转染空载的AC16细胞中,shp2主要聚集在细胞质内。结论:（1）lncRNA NRON可以激活经典的Wnt信号通路。（2）lncRNA NRON在细胞核内与shp2相互作用,通过促进shp2核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与调控心肌分化。
常晓青[8]（2021）在《食蟹猴滋养层干细胞系的建立》文中研究表明胎盘在妊娠期连接母体和胎儿界面,具有许多重要的功能,如营养供应、气体和废物交换等。滋养层干细胞（Trophoblast stem cells,TSCs）是胎盘分化细胞的前体细胞,但是调节滋养层干细胞发育的分子机制目前仍然知之甚少。所以,建立人和非人灵长类动物滋养层干细胞的体外培养模型对于研究早期胎盘发育和滋养层分化过程具有重要意义。本论文从食蟹猴体外延时培养的胚胎中建立了3个食蟹猴滋养层干细胞系,分别命名为食蟹猴E15E20E19-TS细胞。使用免疫荧光染色、PCR以及单细胞测序等方法鉴定,食蟹猴TS细胞表达滋养层的相关标志物:GATA3、TFAP2C、CK7（KRT7）和TEAD4。该食蟹猴TS细胞可以向绒毛膜外滋养层细胞（Extravillous trophoblasts,EVT）和合胞体细胞（Syncytiotrophoblasts,ST）分化。向EVT分化的食蟹猴TS细胞表达EVT侵袭性相关标志物MMP2和N-cadherin,食蟹猴TS细胞向ST分化使用了ST-2D和ST-3D两种不同的培养方法,使用GCM1和E-cadherin免疫荧光染色鉴定,结果显示ST-2D分化细胞具有部分多核的现象,并且向ST的诱导分化会使细胞的细胞膜产生改变,促进部分细胞融合。分化细胞高表达滋养层分化细胞的相关基因:SDC1、ITGA5、MMP2、GCM1和CBG,并且EVT和ST-3D细胞具有分泌孕酮的能力。在异种嵌合的实验中,食蟹猴TS细胞不影响整个嵌合体胚胎的发育,并且仅嵌合到E4.5和E6.4的小鼠嵌合体胚胎的滋养外胚层发育。
贺健[9]（2021）在《单细胞转录组解析人类胚胎造血干细胞与巨核细胞的发育》文中认为哺乳动物血液系统为中胚层起源,在发育早期具有多位点起始、多谱系层级等特征。解析血液发生过程的细胞命运和分子机制对再生医学意义重大。造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）是个体血液系统形成的基础,并且通过自我更新（Self-renewal）和多系分化（Multilineage differentiation）维持个体整个生命周期的血液系统功能。一般认为,胚胎时期的造血干细胞起源于主动脉-性腺-中肾区域（Aorta-gonad-mesonephros,AGM）的背主动脉（Dorsal aorta）腹侧,由一群具有生血潜能的内皮细胞（Hemogenic endothelial cell,HEC）经内皮生血转化（Endothelial to hematopoietic transition,EHT）发育而来。目前关于造血干细胞起源的认识大部分都是基于小鼠,斑马鱼等模式动物的研究。由于早期人胚样本较难获得,以及细胞数量相对较少,人们对于人胚造血干细胞的发生过程仍然知之甚少,尤其是关于HSC前体细胞HEC的特征及其富集策略,亟待通过高效的方法和手段加以解析。本研究中,我们首先对胚胎背主动脉的细胞进行基于10x Genomics平台的单细胞转录组测序（sc RNA-seq）,分析鉴定出一群特异性高表达RUNX1的内皮细胞,功能富集分析该群体具有明显的RNA合成和代谢活跃等特征;通过对差异基因中表面标志分子的筛选,我们推测CD44具有在内皮细胞中富集生血内皮细胞的潜能。随后,我们对背主动脉区域的内皮细胞中CD44+和CD44-的群体进行富集测序（Single cell tagged reverse transcription sequencing,STRT-Seq）,发现CD44+主要富集了动脉内皮细胞,而CD44-主要富集了静脉内皮细胞,并且在动脉内皮细胞中分离出一群表达RUNX1,MYB和ANGPT1的生血内皮细胞,功能富集分析显示这群生血内皮细胞同样表现出显着的核糖体代谢等特征。随后,我们使用STRT-Seq对背主动脉中的CD34+CD45+的造血干祖细胞（HSPC）进行了测序,分析鉴定出一个淋系祖细胞和一个髓系祖细胞亚群,以及三个分别表现为明显动脉特征、细胞周期活跃以及相对成熟的造血干祖细胞亚群。联合所有的内皮细胞和造血干祖细胞群体,我们构建了胚胎背主动脉区内皮生血转化过程中细胞特化的路径,并发现一些基因,如EMCN,PROCR和RUNX1T1会在内皮向造血命运决定的时刻呈现瞬时上调表达的趋势。通过对极早期胚胎体进行测序分析,我们发现了一群同样兼具内皮和生血特征的早期生血内皮细胞。相比于背主动脉生血内皮细胞,早期生血内皮细胞缺乏动脉特征和Notch信号的富集。联合所有的内皮造血细胞进行分析,我们推测早期生血内皮细胞不需要经历类似于背主动脉生血内皮细胞的动脉化过程,而直接分化产生造血细胞。最后,利用配-受体对分析,我们解析了背主动脉区域不同间质,上皮和内皮细胞群体与生血内皮细胞的潜在互作关系,并提示了Notch,BMP4,TGF-beta等信号通路在生血微环境形成过程中潜在的调控作用。同样,我们利用sc RNA-seq解析了人胚发育过程中卵黄囊和胎肝中细胞异质性,明确了其中巨核细胞的转录组特征。通过比较分析,我们发现卵黄囊中的巨核细胞主要呈现糖酵解等特征,而胎肝中的巨核细胞主要呈现周期活跃等特征。进一步地,我们整合并分析了巨核细胞自身的异质性,发现其除了产生血小板的常规巨核细胞亚群,还包含了一群胞外基质特征明显的微环境形成巨核细胞,和一群CD14+免疫调节特性的巨核细胞。通过假时序分析,我们发现这些不同的巨核细胞亚群呈现两种分化模式并且具有不同的转录调控机制。总的来说,我们围绕造血干细胞发生过程和巨核细胞异质性,利用单细胞转录组测序解析了人胚早期造血系统发育的分子细胞图谱。我们首先在背主动脉区域捕获到一群兼具动脉内皮特征和生血特征的造血干细胞;进一步的筛选发现CD44是能够高效富集生血内皮的表面标志分子;随后我们又解析了背主动脉区域造血干祖细胞的异质性,并联合动脉内皮细胞和生血内皮细胞,绘制了内皮生血转化的细胞发育路径和探究了该过程中的分子变化规律;此外,我们在极早期的胚内发现了一群缺乏动脉内皮特征的早期生血内皮细胞;并且通过分析背主动脉区不同细胞群体与生血内皮细胞的互作,在分子水平上阐释了生血微环境异质性;最后,我们解析了巨核细胞的发育位点差异和群体的异质性,及其分化过程的调控模式。这些发现不仅填补了人胚早期血液系统发生过程的知识空缺,同时也为血液相关疾病的治疗尤其是体外血液再生策略提供重要理论基础。
贺霞[10]（2020）在《小分子化合物组合重编程小鼠胚胎成纤维细胞为胚外内胚层样细胞》文中研究表明利用小分子化合物已成功实现了体细胞向诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的转变,经证实在该过程中产生了一种不可缺少的中间阶段细胞,即化学诱导胚外内胚层样细胞（chemical induced extraembryonic endoderm-like,ciXEN）,它们在基因表达模式和分化潜能上与胚胎源性胚外内胚层细胞（embryo-derived extraembryonic endoderm,eXEN）极为相似。但是ciXEN细胞的其它生物学特性和小分子化合物对ciXEN细胞体外维持培养的影响还尚未有系统性报道。本研究以小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）为起始细胞,利用小分子化合物组合,获得无外源基因整合的ciXEN细胞;通过基因组测序、qPCR分析、免疫荧光、悬滴培养和代谢模式分析等验证ciXEN细胞的生物学特性;此外,通过去除培养液中的小分子化合物和bFGF验证其对ciXEN细胞体外维持培养的影响。1.利用小分子化合物组合重编程MEFs获得ciXEN细胞不同数量起始细胞经小分子化合物组合的持续处理,发现细胞逐渐聚集成团并最终形成边缘清晰的克隆;对细胞克隆进行计数时发现以4×104个MEFs进行重编程时获得的细胞克隆数最多,基质胶能将克隆形成率提高31.47±3.86倍,且这些细胞克隆呈Sox17和Foxa2双阳性。挑取的细胞克隆重新贴壁后,从其中能长出大量上皮样细胞。小分子化合物组合消除了成纤维细胞相关基因表达而获得了胚外内胚层细胞基因表达谱,同时该过程伴随着间质上皮转化。ciXEN细胞产生过程中胚外内胚层标记物、上皮相关基因、Sox2和Cxcr4表达量增加,而间质标记基因和成纤维细胞相关基因的表达水平下降,且E-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。此外,该小分子化合物组合作用于小鼠新生成纤维细胞（mouse neonatal fibroblasts,MNFs）后,细胞聚集形成了排列松散的克隆,并证实3×104个MNFs是最适起始细胞密度;另外这些MNFs源性克隆亦呈Sox17和Foxa2双阳性。这些结果表明该小分子化合物组合能实现MEFs向ciXEN细胞的重编程,也适用于MNFs向ciXEN细胞重编程。2.ciXEN细胞生物学特性鉴定对细胞克隆中长出的上皮样细胞进行体外传代扩增,取第5代ciXEN细胞进行后续实验。形态学上,低密度时ciXEN细胞呈强折光性短梭形而高密度时ciXEN细胞则成上皮样。ciXEN细胞表面有微绒毛,其内部超微结构异于MEFs。对第5代ciXEN细胞的基因表达进行分析,发现ciXEN细胞的胚外内胚层标记基因、上皮标记基因、Sox2和Cxcr4的表达水平明显高于MEFs而成纤维细胞标记基因和间质基因的mRNA水平则显着低于MEFs,但不表达Nanog和Oct4。且ciXEN细胞中E-cadherin、Gata4、Foxa2、Sox17、Sox2和vimentin表达呈阳性而Oct4和Nanog表达呈阴性,这与western blot结果相一致。ciXEN细胞具有强增殖能力,能体外扩增至少30代并维持细胞核型稳定,低代次和高代次ciXEN细胞的形态保持不变。在基因表达上,它们维持着胚外内胚层标记物、上皮相关标记基因和Sox2的高水平表达,而不表达多潜能相关基因和成纤维细胞标记物。此外,ciXEN细胞不仅能体外经诱导分化为脏壁内胚层,还能自发分化为外胚层和内胚层源性细胞,尤其是能分化成功能性肝细胞。对ciXEN细胞的转录组进行深入分析时,发现ciXEN细胞的产生过程涉及细胞结构和功能的重塑,同时还伴随着能量代谢的重塑。然而经系列代谢相关分析发现ciXEN细胞不依赖糖酵解供能,且在小分子化合物组合重编程过程中添加促进糖酵解的PS48并未增加细胞克隆形成率。上述结果表明ciXEN细胞尚未达到多潜能阶段且保留一定间质记忆,具有高度增殖能力和向脏壁内胚层和功能性肝细胞分化的可塑性;此外ciXEN细胞的产生过程伴随着能量代谢的重塑,但细胞的代谢模式并未转变成糖酵解。3.研究小分子化合物和bFGF对ciXEN细胞体外培养的影响去除ciXEN细胞维持培养液中的小分子化合物和bFGF后,细胞形态呈圆形上皮样,且诱导胚外内胚层样（induced extraembryonic endoderm-like cells,iXEN）细胞仍维持胚外内胚层基因和上皮基因的高表达而不表达间质基因和成纤维细胞基因,这与免疫荧光结果和western blot结果达成一致。此外,去除小分子化合物和bFGF后培养的iXEN细胞仍能向功能性肝细胞分化。这些结果表明小分子化合物和bFGF不是ciXEN细胞体外维持培养所必不可少的成分。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 骡子部分可育研究进展 |
| 1.1.1 骡子部分可育原因假说 |
| 1.1.2 骡子部分可育实验进展 |
| 1.2 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 1.3 哺乳动物生殖细胞的发生及体外诱导概况 |
| 1.3.1 配子发生 |
| 1.3.2 PGCLCs研究进展 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 骡子iPSCs的培养及生物学特性检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验设备与器材 |
| 2.1.2 实验试剂及抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要试剂配制 |
| 2.2.2 饲养层细胞的制备 |
| 2.2.3 FMF-iPSCs的培养、冻存与复苏 |
| 2.2.4 FMF-iPSCs碱性磷酸酶染色 |
| 2.2.5 FMF-iPSCs核型分析 |
| 2.2.6 FMF-iPSCs实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.7 FMF-iPSCs免疫荧光染色 |
| 2.2.8 FMF-iPSCs中转染红色荧光蛋白 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 feeder生物学特性 |
| 2.3.2 FMF-iPSCs形态学鉴定与碱性磷酸酶染色鉴定 |
| 2.3.3 FMF-iPSCs核型分析鉴定 |
| 2.3.4 FMF-iPSCs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 2.3.5 FMF-iPSCs免疫荧光染色鉴定 |
| 2.3.6 FMF-iPSCs荧光蛋白质粒转染 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 骡子iPSCs体外拟胚体分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验设备与器材 |
| 3.1.2 实验试剂及抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 培养液的配制 |
| 3.2.2 FMF-iPSCs体外拟胚体分化 |
| 3.2.3 EBs实时荧光定量PCR检测 |
| 3.2.4 EBs免疫荧光染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 EBs分化形态学鉴定 |
| 3.3.2 EBs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 3.3.3 EBs免疫荧光染色鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 骡子iPSCs嵌合体制备及定向诱导分化PGCLCs |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备与器材 |
| 4.1.2 实验试剂及抗体 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 主要试剂的配制 |
| 4.2.2 嵌合体制备 |
| 4.2.3 FMF-iPSCs经 AF重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.4 FMF-iPSCs经4i重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.5 FMF-iPSCs经 FTW重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.6 PGCLCs实时荧光定量PCR检测 |
| 4.2.7 PGCLCs免疫荧光染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FMF-iPSCs在 E6.5 天小鼠胚胎中分化能力鉴定 |
| 4.3.2 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs形态学鉴定 |
| 4.3.3 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 4.3.4 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs免疫荧光染色鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 哺乳动物胚胎着床和蜕膜化的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎着床 |
| 1.2 子宫内膜蜕膜化 |
| 1.3 胚胎着床和蜕膜化的调控机制 |
| 1.3.1 类固醇激素及其受体 |
| 1.3.2 细胞因子 |
| 1.3.3 转录因子 |
| 1.3.4 骨形态发生蛋白 |
| 1.3.5 Notch信号通路 |
| 1.3.6 其他因子 |
| 1.3.7 氧化应激 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Hippo信号通路的研究进展 |
| 2.1 Hippo信号通路简介 |
| 2.2 YAP/TAZ的生物学功能 |
| 2.2.1 YAP/TAZ在发育过程中的作用 |
| 2.2.2 YAP/TAZ在再生过程中的作用 |
| 2.2.3 YAP/TAZ与癌症发生 |
| 2.3 Hippo-YAP/TAZ的调节机制 |
| 2.3.1 细胞间接触与细胞形状 |
| 2.3.2 细胞极性与细胞粘附 |
| 2.3.3 Wnt/β-Catenin信号通路 |
| 2.3.4 代谢 |
| 2.3.5 G蛋白偶联受体 |
| 2.4 YAP/TAZ与哺乳动物生殖 |
| 2.5 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 YAP在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 动物模型的建立 |
| 1.1.4 原位杂交 |
| 1.1.5 小鼠子宫蜕膜细胞与基质细胞的分离培养 |
| 1.1.6 免疫荧光染色 |
| 1.1.7 免疫蛋白印迹(Western blot) |
| 1.1.8 荧光定量PCR |
| 1.1.9 基因过表达与沉默 |
| 1.1.10 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.1.11 细胞转染 |
| 1.1.12 细胞增殖 |
| 1.1.13 细胞周期 |
| 1.1.14 细胞凋亡 |
| 1.1.15 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性 |
| 1.1.16 ROS含量检测 |
| 1.1.17 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量检测 |
| 1.1.18 8-OHd G含量检测 |
| 1.1.19 抗氧化系统及Caspase-3 活性检测 |
| 1.1.20 线粒体膜电位和通透性转换孔的检测 |
| 1.1.21 ATP含量检测 |
| 1.1.22 数据统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 YAP m RNA在小鼠早期妊娠子宫中的表达 |
| 1.2.2 YAP在体内和体外人工诱导蜕膜化模型中的表达 |
| 1.2.3 YAP在蜕膜化过程中的作用 |
| 1.2.4 Bmp2 诱导基质细胞中YAP核迁移并增强YAP功能 |
| 1.2.5 YAP通过Rrm2 调控基质细胞的分化 |
| 1.2.6 Bmp2 通过YAP调控Rrm2 的表达 |
| 1.2.7 YAP失活导致基质细胞GSH产生下降并诱导ROS含量升高 |
| 1.2.8 YAP失活导致基质细胞线粒体功能紊乱并抑制蜕膜化 |
| 1.2.9 YAP失活诱导基质细胞凋亡 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TAZ在小鼠早期妊娠子宫中的表达 |
| 2.2.2 TAZ在体内和体外人工诱导蜕膜化模型中的表达 |
| 2.2.3 TAZ在蜕膜化过程中的作用 |
| 2.2.4 TAZ介导HB-EGF对蜕膜化的调节 |
| 2.2.5 TAZ保护基质细胞分化免受氧化损伤 |
| 2.2.6 TAZ通过增强基质细胞的抗氧化能力来抵抗氧化应激对基质细胞分化的损伤 |
| 2.2.7 氧化应激状态下TAZ可保护基质细胞线粒体功能 |
| 2.2.8 TAZ可抑制H_2O_2诱导的基质细胞凋亡 |
| 2.2.9 氧化应激状态下TAZ通过Nrf2/ARE/Foxo1 途径增强基质细胞抗氧化能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表1 基因引物序列 |
| 附表2 siRNA序列 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.iCMs的生成 |
| 1.1 体外重编程 |
| 1.2 体内重编程 |
| 2.iCPCs的生成 |
| 2.1 体外重编程 |
| 2.2 体内重编程 |
| 2.3 转录因子 |
| 2.3.1 Gata4 |
| 2.3.2 Nkx2.5 |
| 2.3.3 Tbx5 |
| 2.3.4 Mesp1 |
| 2.3.5 Baf60c |
| 3.壳聚糖-3D水凝胶 |
| 3.1 壳聚糖的结构和理化性质 |
| 3.2 壳聚糖的生物学特性及应用 |
| 3.3 壳聚糖-3D水凝胶在心脏组织工程中的应用 |
| 4.总结和展望 |
| 第2章 试验部分 |
| 引言 |
| 试验一 iCPCs的生成与鉴定 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品与试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 HEK-293T细胞的培养 |
| 2.1.1 HEK-293T细胞的复苏 |
| 2.1.2 HEK-293T细胞的传代培养 |
| 2.1.3 HEK-293T细胞的冻存 |
| 2.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.3 质粒构建 |
| 2.4 质粒DNA的提取 |
| 2.5 质粒DNA的酶切验证 |
| 2.5.1 1 %琼脂糖凝胶的制备 |
| 2.5.2 样品准备 |
| 2.5.3 酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.6 细胞转染 |
| 2.7 iCPCs的鉴定 |
| 2.7.1 形态学观察 |
| 2.7.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.7.3 RT-qPCR |
| 2.8 iCPCs的体外分化和鉴定 |
| 2.8.1 形态学观察 |
| 2.8.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.8.3 RT-qPCR |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 HEK-293T细胞的体外培养 |
| 3.1.1 形态学观察 |
| 3.1.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.2 质粒DNA提取 |
| 3.2.1 菌液电泳 |
| 3.2.2 酶切验证 |
| 3.2.3 HEK-293T细胞的转染 |
| 3.3 iCPCs的鉴定 |
| 3.3.1 形态学观察 |
| 3.3.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.3.3 RT-qPCR |
| 3.4 iCPCs的体外诱导分化 |
| 3.4.1 形态学观察 |
| 3.4.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.4.3 iCPCs及其体外诱导分化所得细胞的阳性率 |
| 3.4.4 RT-qPCR |
| 4.讨论 |
| 4.1 iCPCs的体外生成 |
| 4.2 iCPCs的体外诱导分化 |
| 5.小结 |
| 试验二 iCPCs的3D水凝胶培养体系构建 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要药品与试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 3D水凝胶的构建及性能表征 |
| 2.1.1 3D水凝胶的制备 |
| 2.1.2 3D水凝胶支架的电镜观察 |
| 2.1.3 3D水凝胶支架孔隙度的测定 |
| 2.1.4 3D水凝胶溶胀率的测定 |
| 2.1.5 3D水凝胶体外降解率的测定 |
| 2.2 3D水凝胶的细胞培养 |
| 2.2.1 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs增殖的影响 |
| 2.2.2 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs存活的影响 |
| 2.2.3 3D水凝胶培养iCPCs回收条件的研究 |
| 2.3 iCPCs在3D水凝胶中的形态学观察 |
| 2.4 iCPCs在3D水凝胶中的诱导分化 |
| 2.4.1 形态学观察 |
| 2.4.2 免疫细胞化学染色 |
| 2.4.3 RT-qPCR |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 3D水凝胶支架的超微结构 |
| 3.2 3D水凝胶支架孔隙率、溶胀率和降解率的测定 |
| 3.2.1 孔隙率的测定 |
| 3.2.2 溶胀率的测定 |
| 3.2.3 降解率的测定 |
| 3.3 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs细胞行为的影响 |
| 3.3.1 细胞增殖 |
| 3.3.2 存活率 |
| 3.4 3D水凝胶中iCPCs回收条件的研究 |
| 3.5 3D水凝胶中iCPCs的形态学观察 |
| 3.6 iCPCs在3D水凝胶中的诱导分化 |
| 3.6.1 形态学观察 |
| 3.6.2 免疫细胞化学染色 |
| 3.7 3D水凝胶中iCPCs诱导分化所得细胞的比率 |
| 3.8 RT-qPCR |
| 4.讨论 |
| 4.1 不同凝胶比例组成对3D水凝胶物理特性的影响 |
| 4.2 不同比例组成3D水凝胶对iCPCs行为的影响 |
| 4.3 3D水凝胶支架中iCPCs回收条件的研究 |
| 4.4 3D水凝胶对iCPCs诱导分化的影响 |
| 5.小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 在读期间发表论文及参加课题参研情况一览表 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 原始生殖细胞(PGCs) |
| 1.1.1 鸡PGCs的起源和迁移 |
| 1.1.2 鸡PGCs的分离和培养 |
| 1.1.3 PGCs细胞的体外诱导 |
| 1.1.4 PGCs的应用 |
| 1.2 细胞重编程 |
| 1.2.1 细胞重编程的研究进展 |
| 1.2.2 体细胞诱导重编程的分子机制 |
| 1.2.3 体细胞诱导重编程体系的优化 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞的应用 |
| 1.3 本课题前期研究发现 |
| 1.4 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 鸡CEF诱导重编程为iPS |
| 2.1.5 鸡iPS的鉴定 |
| 2.1.6 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.1.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.1.8 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用 |
| 2.1.9 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 鸡CEF诱导重编程为iPS及鉴定 |
| 2.2.2 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.2.3 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.2.4 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用研究 |
| 2.2.5 小分子化合物2i-SP优化鸡iPS诱导体系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第3章 不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 细胞分离纯化 |
| 3.1.5 RNA抽提和质量检测 |
| 3.1.6 cDNA文库构建及测序 |
| 3.1.7 RNA-seq数据分析步骤 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 RNA样品检测结果 |
| 3.2.2 测序数据产出统计 |
| 3.2.3 参考序列比对分析 |
| 3.2.4 RNA-seq整体质量评估 |
| 3.2.5 不同体系诱导的iPS细胞相关性分析 |
| 3.2.6 不同体系诱导的iPS细胞差异表达基因筛选 |
| 3.2.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中差异表达基因功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 鸡iPS/ESCs诱导分化为iPGCs |
| 4.1.5 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化研究 |
| 4.1.6 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组测序 |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鸡iPS诱导分化为iPGCs |
| 4.2.2 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化 |
| 4.2.3 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组学研究 |
| 4.2.4 鸡iPGCs (iPS-derived)与PGCs差异表达基因功能分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 鸡iPGCs介导类克隆体系的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器和设备 |
| 5.1.4 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.1.5 类克隆鸡微卫星检测 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.2.2 微卫星检测类克隆鸡品种关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 全文结论与创新点 |
| 论文有待进一步深入研究的问题 |
| 附录 |
| 原始数据表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 精子发生与精原干细胞 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 精原干细胞 |
| 1.3 精原干细胞增殖调控 |
| 1.3.1 GDNF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.2 ETV5 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.3 BCL6B对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.4 ID4 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.5 PLZF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.6 POU5F1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.7 FOXO1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.8 活性氧对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.4 精原干细胞分化调控 |
| 1.4.1 SOX3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.2 STAT3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.3 NGN3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.4 SOHLH1和SOHLH2 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.5 DMRT1 对精原干细胞分化的调控 |
| 第二章 表观修饰与SETDB1 的研究进展 |
| 2.1 组蛋白甲基化 |
| 2.2 H3K9me3 修饰 |
| 2.2.1 H3K9me3 与异染色质形成 |
| 2.2.2 H3K9me3 与细胞命运决定 |
| 2.3 组蛋白甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.1 H3K4 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.2 H3K9 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.3 H3K27 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.4 H3K36 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.5 H3K9 甲基化和DNA甲基化对转座子的调控 |
| 2.4 组蛋白甲基化对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.5 m~6A修饰对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.6 SETDB1 的结构 |
| 2.7 SETDB1 的亚细胞定位 |
| 2.8 SETDB1 对转座子的调控 |
| 2.9 SETDB1 在雄性生殖细胞中的功能 |
| 2.10 研究目的与意义 |
| 试验部分 |
| 第三章 SETDB1 对小鼠精原干细胞存活的调控作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Setdb1 si RNA干扰效率检测 |
| 3.2.2 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞内活性氧水平的影响 |
| 3.2.3 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞存活的影响 |
| 3.2.4 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞增殖速率的影响 |
| 3.2.5 Setdb1-KD诱导活性氧上调的分子机制 |
| 3.2.6 Setdb1-KD通过调节细胞内活性氧水平调控精原干细胞存活 |
| 3.2.7 Setdb1-KD激活活性氧下游信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 SETDB1在Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加过程中的功能 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Ythdf2-KO导致小鼠精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.2 Ythdf2-KO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.3 体内试验说明Ythdf2 cKO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.4 Ythdf2-KO对 H3K9me3 修饰的影响 |
| 4.2.5 Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加的分子机制 |
| 4.2.6 SETDB1与γH2AX具有相互作用 |
| 4.2.7 Setdb1-KD导致精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.8 Setdb1-KD影响DNA损伤修复 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 SETDB1 对猪精原干细胞分化的调控 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 猪精原干细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.2 猪分化精原细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.3 猪精原干细胞分化过程中的基因表达分析 |
| 5.2.4 猪精原干细胞分化过程中染色质可及性变化 |
| 5.2.5 SETDB1 介导的H3K9me3 修饰与染色质可及性之间的关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA NRON在小鼠和TOF胚胎心脏中的表达及细胞分布 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 敲除LncRNA NRON抑制hESC向正常心肌细胞分化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 LncRNA NRON促进shp2在细胞核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 唐氏综合征相关先天性心脏病发生分子机制研究进展 |
| References |
| 致谢 |
| 攻读学位期间完成的学术论文和研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章:食蟹猴TS细胞的建立及其条件的优化 |
| 1.1 绪论 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 实验所用设备及耗材 |
| 1.2.2 实验所需试剂 |
| 1.2.3 实验用到的溶液及培养基的配制 |
| 1.2.4 实验动物 |
| 1.3 食蟹猴TS细胞的建立及培养 |
| 1.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞 |
| 1.3.1.1 小鼠胚胎的获取 |
| 1.3.1.2 小鼠胚胎成纤维细胞的制备 |
| 1.3.1.3 小鼠胚胎成纤维细胞的传代扩大培养 |
| 1.3.1.4 小鼠胚胎成纤维细胞的冻存 |
| 1.3.1.5 小鼠胚胎成纤维细胞的复苏 |
| 1.3.1.6 饲养层细胞(feeder layer cell)的制备 |
| 1.3.2 食蟹猴TS细胞的建立 |
| 1.3.3 食蟹猴TS细胞的培养 |
| 1.3.3.1 细胞计数 |
| 1.3.3.2 食蟹猴TS细胞的传代 |
| 1.3.3.3 食蟹猴TS细胞的冻存 |
| 1.3.3.4 食蟹猴TS细胞的复苏 |
| 1.3.3.5 细胞的支原体检测 |
| 1.3.4 食蟹猴TS细胞的无feeder培养体系培养方法 |
| 1.3.5 免疫荧光染色鉴定方法 |
| 1.3.6 食蟹猴滋养层干细胞的核型检测方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 小鼠胚胎成纤维细胞培养 |
| 1.4.2 食蟹猴TS细胞的feeder培养体系结果 |
| 1.4.3 食蟹猴TS细胞培养条件的优化 |
| 1.4.4 食蟹猴TS细胞的核型鉴定结果 |
| 1.4.5 支原体检测结果 |
| 1.4.6 食蟹猴TS细胞的标记物鉴定结果 |
| 1.4.7 食蟹猴TS细胞相关标记物的鉴定 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 食蟹猴滋养层干细胞的分化 |
| 2.1 绪论 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验所用设备及耗材 |
| 2.2.2 实验所需试剂 |
| 2.2.3 实验用到的溶液及培养基的配制 |
| 2.3 食蟹猴TS分化细胞的培养方法及检测 |
| 2.3.1 EVT细胞的分化方法 |
| 2.3.2 ST细胞的分化方法 |
| 2.3.2.1 ST-2D细胞的分化方法 |
| 2.3.2.2 ST-3D细胞的分化方法 |
| 2.3.3 食蟹猴TS分化细胞的免疫荧光检测 |
| 2.3.4 食蟹猴TS分化细胞的qPCR鉴定 |
| 2.3.5 食蟹猴TS分化细胞的激素测定方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 EVT-TS细胞的培养结果 |
| 2.4.1.1 EVT-TS细胞的生长状态 |
| 2.4.1.2 EVT-TS细胞的免疫荧光染色结果 |
| 2.4.2 ST细胞的培养结果 |
| 2.4.2.1 ST-2D细胞培养结果 |
| 2.4.2.2 染色结果 |
| 2.4.2.3 ST-3D细胞培养结果 |
| 2.4.3 食蟹猴TS分化细胞的qPCR结果 |
| 2.5 食蟹猴TS分化细胞的激素孕酮测定结果 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 食蟹猴TS细胞的异种嵌合体实验 |
| 3.1 绪论 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验所用设备及耗材 |
| 3.2.2 实验所需试剂 |
| 3.2.3 实验用到的溶液及培养基的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠胚胎的获取及培养方法 |
| 3.3.1.1 超数排卵 |
| 3.3.1.2 取2 细胞 |
| 3.3.2 TS-GFP细胞处理 |
| 3.3.2.1 慢病毒GFP标记食蟹猴TS细胞 |
| 3.3.2.2 TS-GFP细胞准备 |
| 3.3.3 小鼠-食蟹猴TS细胞嵌合体的制备 |
| 3.3.3.1 仪器准备 |
| 3.3.4 嵌合体胚胎的免疫荧光染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 食蟹猴TS-GFP细胞 |
| 3.4.2 食蟹猴TS细胞在小鼠胚胎体内的嵌合比率 |
| 3.4.3 食蟹猴TS细胞-小鼠胚胎的嵌合体免疫荧光染色结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 食蟹猴TS细胞的单细胞分析 |
| 4.1 绪论 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验所用设备及耗材 |
| 4.2.2 实验所需试剂 |
| 4.2.3 实验用到的溶液及培养基的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 单细胞的收集 |
| 4.3.2 单细胞的处理 |
| 4.3.3 纯化、建库 |
| 4.3.4 数据处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 送样单细胞的质检结果 |
| 4.4.2 食蟹猴TS细胞单细胞数据 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 早期人胚背主动脉的细胞异质性解析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.3.1 实验样本的获取 |
| 1.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 人胚背主动脉的解剖分离 |
| 1.4.2 单细胞悬液的制备 |
| 1.4.3 流式细胞分选和10x Genomics建库测序 |
| 1.5 数据分析和处理 |
| 1.5.1 测序原始数据预处理 |
| 1.5.2 表达矩阵降维和细胞聚类 |
| 1.5.3 细胞类型识别和差异表达分析 |
| 1.5.4 细胞群体的相关性分析 |
| 1.6 实验结果 |
| 第二章 人胚生血内皮细胞的富集及其转录组特征分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验样本的获取 |
| 2.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验样本的获取 |
| 2.4.2 流式细胞分选及分析 |
| 2.4.3 STRT-seq建库及测序 |
| 2.5 数据处理和分析 |
| 2.5.1 测序原始数据预处理 |
| 2.5.2 降维和聚类,以及差异分析 |
| 2.5.3 基因表达的相关性分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 内皮细胞中CD44~+和CD44~-群体的分选及特征 |
| 2.6.2 RUNX1~+生血内皮细胞的特征鉴定 |
| 2.6.3 生血内皮细胞的特征基因分析 |
| 第三章 人胚背主动脉造血干祖细胞及内皮造血转化的解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验样本的获取 |
| 3.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 组织分离,单细胞悬液制备,流式分选和建库 |
| 3.4.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 3.4.3 内皮生血转化假时序分析 |
| 3.4.4 基因表达模式分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 人胚背主动脉中造血干祖细胞的转录组异质性 |
| 3.5.2 内皮细胞和造血干祖细胞的联合分析 |
| 3.5.3 内皮造血转化过程及其特征规律 |
| 第四章 极早期胚胎体生血内皮的转录组水平解析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料和分析方法 |
| 4.3.1 实验样本的获取和单细胞建库 |
| 4.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 4.3.3 数据分析方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人胚极早期发育阶段的细胞异质性解析 |
| 4.4.2 极早期胚胎内皮和造血细胞异质性解析 |
| 4.4.3 极早期生血内皮和背主动脉生血内皮的差异比较 |
| 第五章 人胚早期背主动脉生血微环境的转录组解析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验设计 |
| 5.3 实验材料和分析软件 |
| 5.3.1 数据样本 |
| 5.3.2 分析软件 |
| 5.4 数据分析方法 |
| 5.4.1 配-受体互相作用分析 |
| 5.4.2 配-受体基因的通路富集分析 |
| 5.4.3 细胞群体互作强度的可视化 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 背主动脉生血内皮与微环境细胞群体互作概览 |
| 5.5.2 内皮细胞群体与生血内皮的互作分析 |
| 第六章 人胚早期巨核细胞的异质性解析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验设计 |
| 6.3 实验材料和分析软件 |
| 6.3.1 数据样本 |
| 6.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 6.4 实验和数据分析方法 |
| 6.4.1 卵黄囊和胎肝的单细胞悬液制备 |
| 6.4.2 流式分选和单细胞建库 |
| 6.4.3 测序数据的预处理和质控 |
| 6.4.4 数据批次校正 |
| 6.4.5 降维,聚类和差异分析 |
| 6.4.6 巨核细胞分化假时序分析 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 人胚卵黄囊细胞群体的鉴定 |
| 6.5.2 人胚胎肝细胞群体的鉴定 |
| 6.5.3 巨核细胞群体的鉴定和差异比较 |
| 6.5.4 巨核细胞群体异质性分析 |
| 6.5.5 巨核细胞的分化路径分析 |
| 第七章 结论和展望 |
| 7.1 人类胚胎造血干细胞产生过程的单细胞解析 |
| 7.2 人类胚胎巨核细胞的发育分化规律 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1篇 文献综述 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 胚外内胚层细胞研究概况 |
| 2.1 ELSCs的定义及种类 |
| 2.2 XEN细胞的生物学特性 |
| 2.3 XEN细胞的培养条件 |
| 2.4 XEN细胞的来源 |
| 2.5 XEN细胞与CR间的联系 |
| 2.6 XEN细胞的应用 |
| 第3章 XEN样细胞在CR中的研究进展 |
| 3.1 体细胞重编程的研究概况 |
| 3.2 CR过程中的XEN样细胞 |
| 3.3 CR过程中MET的作用 |
| 3.4 化学重编程产生ciXEN细胞时小分子化合物的选择 |
| 3.5 ciXEN细胞研究存在的问题 |
| 第4章 CR过程中代谢重塑的研究现状 |
| 4.1 代谢的定义、分类及意义 |
| 4.2 CR过程中的代谢变化 |
| 4.3 XEN细胞的代谢特点 |
| 第4章 问题与展望 |
| 第2篇 实验研究 |
| 第1章 利用小分子化合物组合重编程产生ciXEN细胞 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第2章 ciXEN细胞生物学特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 去除小分子化合物后iXEN细胞生物学特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
