王艺舟[1]（2020）在《中华鲟五种组织细胞系建立及青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定》文中研究指明鱼类细胞系作为理想的体外研究模型,已经成为鱼类生物学研究不可或缺的工具,各个物种不同组织特异性细胞系的分离将为该物种生理学、毒理学、病毒学、基因功能分析、种质资源保护及转基因等领域研究提供特异的、基础的、低成本的研究材料。中华鲟（Acipenser sinensis）是鲟属鱼类中个体最大,生活纬度最南的江海洄游性鱼类,由于过度捕捞、筑坝、航运和污染等人为活动导致中华鲟数量急剧减少,已濒临灭绝。此外,由于其体型巨大,生长缓慢,性成熟周期长等生物学特性导致其种群难以恢复。目前对中华鲟的研究主要集中在形态学、资源生态学和生殖生物学等方面,而在细胞生物学方面研究较少。建立中华鲟组织细胞系有两个重要原因:第一,在细胞水平上保护中华鲟种质资源,第二,中华鲟组织细胞系可作为体外研究模型,支持中华鲟细胞遗传学和生物学等方面的研究。本研究建立了青鱼（Mylopharyngodon piceus）鳍条及中华鲟精巢、肌肉、皮肤、肝脏、鳍条5种组织细胞系,分别命名为MPF、AST、ASM、ASSK、ASL和ASF。目前,MPF传至81代,5种中华鲟组织细胞系均传代到60代,6种细胞的适宜生长温度为28℃,均生长在含有10%FBS、10 ng/m Lβ-FGF、鱼血清和鱼类胚胎提取液的DMEM全培养基中,生长状态良好,MPF的细胞类型为上皮样细胞,中华鲟细胞类型主要为成纤维样细胞和上皮样细胞。染色体分析结果显示青鱼MPF染色体众数为48,属于正常的二倍体细胞;中华鲟细胞染色体众数为264,为多倍体细胞。MPF细胞系的线粒体16s r RNA序列分析结果与NCBI中青鱼的16s r RNA序列相似度高于99%。中华鲟细胞系的18s r RNA序列分析结果与NCBI中中华鲟的18s r RNA序列相似度也均高于99%,这些结果证明了细胞系的来源;通过脂质体转染法、杆状病毒转导法和电穿孔法测试了MPF、AST和ASM 3种细胞的转染效率:MPF的脂质体转染法和电穿孔法的瞬时转染效率分别为8%和24%;脂质体转染法和杆状病毒转导法对中华鲟细胞无效而电穿孔法有效,击穿电压200 V并且击穿时间10 ms时,对中华鲟细胞损伤最小且瞬时转染效率为15%。另外,利用睡美人转座子系统成功构建了转基因AST和ASM细胞系。对青鱼细胞系MPF,进行了基因表达检测和病毒敏感性分析,结果显示,在MPF细胞中存在干细胞标记因子nanog和oct4的表达,说明MPF可能为青鱼鳍条成体干细胞系;MPF细胞对鲤春病毒血症病毒（SVCV）病毒敏感,能产生病变效应,且SVCV可在MPF细胞中大量增殖。青鱼鳍条细胞系的建立不仅可作为研究青鱼基因功能和病毒致病机制的体外工具,为大型淡水鱼类的研究提供理想的体外模型,或许还可以为鱼类干细胞相关基因的功能研究提供材料。通过建立中华鲟细胞系,在细胞水平上保护了珍稀物种中华鲟的种质资源,通过筛选出中华鲟细胞最优的外源基因导入方法,使中华鲟细胞成为研究中华鲟基因功能的理想体外模型。生殖细胞的发育是生物生长发育、繁殖延续的一个重要且复杂的过程,对生殖细胞增殖分化的分子学机理的研究一直是生命科学的重要课题。Dazl是DAZ家族的重要成员,是生殖细胞的重要标记基因,其在大部分脊椎动物的两性生殖细胞中特异表达,其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞的发育和分化过程中发挥着重要作用。青鱼是我国传统的“四大家鱼”之一,其体型大、生长快、口感好且营养价值高,是我国重要的人工养殖品种,但青鱼性成熟周期长,且人工繁殖难度较高。因此对青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定,为研究青鱼生殖细胞的发育和性腺分化提供重要的工具和参考。本研究通过RACE技术在青鱼中克隆了dazl c DNA,序列全长2013 bp,编码216个氨基酸。蛋白序列比对结果显示,其含有RRM（RNA recognition motif）保守区域和一个DAZ重复序列,青鱼Dazl与斑马鱼（Danio rerio）的Dazl序列相似度最高,为85%。通过构建青鱼Dazl重组表达载体诱导Dazl蛋白并制备了兔抗Dazl多克隆抗体,经过验证Dazl抗体可以特异性的识别青鱼Dazl原核表达蛋白、卵巢组织内源蛋白和真核表达蛋白。在组织中,dazl只在青鱼的性腺中表达,组织原位杂交和免疫荧光结果均表明dazl在青鱼的早期卵母细胞中表达,主要分布在I、II和III期卵母细胞的细胞质中。在胚胎发育过程中,dazl在早期胚胎中表达量较高,随着胚胎的发育表达量逐渐降低,到原肠期几乎检测不到表达。整胚原位杂交结果显示dazl在早期胚胎的各个细胞中均表达。通过Tail-PCR技术扩增出1612 bp的青鱼dazl基因5’侧翼区启动子序列,并构建启动子不同区段的荧光素酶报告系统psi-CHECK-1612、psi-CHECK-938和psi-CHECK-303。将它们分别转染到SG3、CIK和SKOV3细胞,利用双荧光素酶报告系统鉴定了青鱼dazl基因核心启动子区域,结果表明-850～+88区域存在青鱼dazl基因的重要调控元件。由于青鱼生殖周期较长,且胚胎卵膜薄,不适合进行基因功能研究,因此我们选取模式生物青鳉（Oryzias latipes）作为替代对象,利用CRISPR/Cas9系统对青鳉dazl基因进行敲除,结果表明青鳉dazl的缺失可能会导致青鳉胚胎中原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）的缺失,在F0代成鱼中发现3尾雌性性腺缺失,结果表明dazl可能参与性腺的形成和发育。本研究中通过分析青鱼dazl基因的表达模式,表明青鱼dazl是与生殖细胞形成和发育相关的重要因子,结合dazl在其他鱼类中的表达及青鳉dazl的敲除结果,为后期青鱼dazl基因功能及其生殖细胞的研究提供参考。综上所述,第一,本研究建立了珍稀濒危物种中华鲟不同组织的细胞系,并对其基本生物学特性进行分析,发现最适于中华鲟细胞的转染方法,建立转基因中华鲟细胞系,在细胞水平上保护了中华鲟的种质资源,并为中华鲟基因功能的研究提供了理想的体外工具。第二,本研究建立青鱼鳍条组织细胞系,对其生物学特性进行了分析,为将来在青鱼细胞系上开展基因功能和病毒致病机制研究奠定了基础。第三,本研究克隆和鉴定了青鱼生殖细胞标记基因dazl,其在胚胎发育的早期和性腺的生殖细胞中表达,另外,青鳉dazl基因的缺失会导致PGCs的缺失,表明其可能在生殖细胞的形成和发育过程中起到关键作用。
周春艳[2]（2020）在《视黄酸信号在斑马鱼咽齿发育及再生过程中的作用》文中认为龋齿、牙周炎及外伤等因素造成的牙齿缺失会大大降低人们的生活品质甚至影响全身健康。目前,临床上关于牙列缺损的措施主要是局部义齿修复或种植牙修复,这种修复方式具有良好的修复效果,但是一些不良后果也无可避免。牙齿再生是一种安全理想的牙齿缺失修复方法,目前对于牙齿再生的探索在组织工程牙方面已取得极大突破及进展,实现了牙根、牙髓等组织甚至全牙再生,而内源性牙齿再生尚处于早期探索阶段。目前对于牙内源性再生的研究由于没有合适的动物模型而受到限制。在本实验中,我们利用斑马鱼可活体成像及实时动态观察的优点进行了牙齿发育及再生的相关分子机制研究,主要探索了视黄酸信号通路在斑马鱼咽齿发育及再生过程中的作用,通过外源性视黄酸及其抑制剂对发育及再生过程中咽齿进行处理,初步探索了该信号通路的作用。另外,课题组成员前期构建的转基因鱼系Tg（dlx2b:Dendra2-NTR）标记发育早期咽齿,经过探索,在本研究中我们成功构建了新的转基因鱼系Tg（scpp5:Dendra2-NTR）,能终生特异性标记斑马鱼咽齿且特异性高,可以使斑马鱼咽齿的研究不受发育时间限制,利于更加深入探索牙齿发育机制。目的:探索视黄酸信号对斑马鱼咽齿发育及再生过程的作用。方法:（1）对处于不同发育时期的斑马鱼胚胎,分别用3×10-7 M的全反式视黄酸（Retinoic Acid,RA）和1×10-7 M的视黄酸抑制剂二乙氨基苯甲醛（exogenous 4-diethylaminobenzaldehyde,DEAB）处理,收集处理后不同时期的胚胎进行原位杂交检测相关基因、茜素红染色和共聚焦显微镜检测等方式,观察视黄酸信号在斑马鱼咽齿发育过程的作用;（2）视黄酸信号对牙齿再生过程的影响,是通过构建视黄酸降解酶及合成酶的过表达鱼hsp:cyp26b1-GFP和hsp:aldh1a2-GFP并分别与转基因系Tg（dlx2b:Dendra2-NTR）杂交,再利用MTZ溶液处理,特异性损伤咽齿后对再生过程中的斑马鱼胚胎进行热激,在再生24 h和再生48 h时收集胚胎检测咽齿再生情况;（3）转基因鱼Tg（scpp5:Dendra2-NTR）的构建,我们从斑马鱼的基因库中克隆出基因scpp5一段长度为4.9 kb的启动子序列,并成功构建pBluescript2KS-scpp5-Dendra2-NTR重组质粒,纯化后的质粒通过显微注射到ABGO背景单细胞斑马鱼胚胎,经过连续三代正向遗传筛选出稳定遗传的转基因鱼系Tg（scpp5:Dendra2-NTR）。结果:（1）利用1×10-7 M DEAB处理24-36 hpf斑马鱼胚胎后,在胚胎发育的48 hpf、56 hpf以及72 hpf检测咽齿发育情况,原位杂交结果显示斑马鱼咽齿特异性标记基因pitx2和fth1b表达消失,而在3×10-7 M RA处理组,pitx2和fth1b的表达均较对照强;在5 dpf时收集胚胎做茜素红染色,结果显示在1×10-7 M DEAB抑制组,无矿化牙齿形成,但在共聚焦显微镜下观察有未矿化牙胚存在,在3×10-7 M RA组牙齿矿化略强于对照组,共聚焦显微镜下观察也可见较强的3V1、4V1和5V1矿化,说明视黄酸信号在斑马鱼咽齿早期发育过程中发挥作用,抑制或增强视黄酸信号都将影响咽齿的正常发育。（2）对24-36 hpf斑马鱼胚胎用视黄酸抑制剂处理后,神经嵴细胞相关基因表达受到影响,其中标记上皮-间充质转化过程的基因snail1a表达略有下降,标记神经嵴细胞增殖和迁移的基因cad表达减少,表明视黄酸在咽齿发育早期主要通过影响神经嵴细胞的正常活动发挥作用,尤其神经嵴细胞的增殖与迁移。（3）利用转基因鱼Tg（dlx2b:Dendra2-NTR）分别与hsp:cyp26b1-GFP和hsp:aldh1a2-GFP杂交,MTZ特异性损伤咽齿后热激恢复期胚胎,在恢复24小时和恢复48小时后,茜素红染色及共聚焦显微镜观察发现在Tg-hsp:cyp26b1-GFP组重生咽齿矿化较弱,在Tg-hsp:aldh1a2-GFP组中重生咽齿矿化强于对照组,同时重生咽齿的形状及数量并无差别,即在斑马鱼咽齿再生过程中,视黄酸信号在再生咽齿的矿化过程中发挥作用,而不影响再生咽齿的形状和数量。（4）原位杂交显示基因scpp5在3 dpf-13 dpf特异性表达于斑马鱼咽齿,在此基础上,本课题组成功构建Tg（scpp5:Dendra2-NTR）转基因鱼,3 dpf时可在咽齿部位观察到特异性绿色荧光,5 dpf时通过对Tg（scpp5:Dendra2-NTR）胚胎做抗体染色检测,发现基因scpp5融合绿色荧光蛋白Dendra2表达于斑马鱼咽齿周围,包绕斑马鱼咽齿,分泌钙相关蛋白促进咽齿的矿化。结论:视黄酸信号通路在斑马鱼咽齿早期发育过程中发挥重要作用,增强视黄酸信号可以咽齿矿化增强,抑制视黄酸信号则会导致发育障碍,且这种影响可能是通过调控神经嵴细胞的增殖和迁移来实现的;而在斑马鱼咽齿损伤再生过程中视黄酸信号仅轻微影响再生咽齿的矿化,表明视黄酸信号在斑马鱼咽齿发育及再生过程中发挥不同的功能,对早期咽齿发育更具意义。转基因鱼Tg（scpp5:Dendra2-NTR）优化了现有的Tg（dlx2b:Dendra2-NTR）模型,可用于探索更晚期斑马鱼咽齿发育及再生的相关分子机制。
王敏[3]（2020）在《斑马鱼gpr161基因的克隆鉴定及初步功能研究》文中进行了进一步梳理Gpr161蛋白是一种G蛋白偶联受体（G Protein Coupled Receptor,GPCR）[9]。GPCR均是含有7个跨膜结构域的蛋白受体,是参与细胞信号传导的最大的细胞表面分子家族,参与调控多种不同的细胞功能,GPCR是目前各种疾病临床治疗的主要药物靶点[15]。小鼠的研究提示,Gpr161在脊椎动物Hedgehog（Hh）信号通路中发挥重要的作用,Gpr161的缺失会导致小鼠胚胎致死。组织特异性敲除Gpr161导致小鼠出现多并趾、大脑发育不良和头骨闭合不全等畸形。研究人员发现GPR161是Hh通路的负向调控因子,通过调节细胞内cAMP的水平调控Hh通路下游的信号转导[20]。然而,Gpr161在动物发育早期和Hh通路中功能在进化上是否具有保守性并不明确。特别是在人Hh通路相关癌症——髓母细胞瘤大规模测序中并没有发现Gpr161的突变与癌症的发生有关。此外,临床研究中仅有一例关于GPR161缺失后导致患者垂体柄发育异常的报道[26]。这些结果使得在其它模式动物中对于GPR161功能的研究显得格外的重要。为了深入探索GPR161在脊椎动物早期发育和Hh通路中的功能,本研究以斑马鱼为模式动物,对Gpr161进行了克隆和研究,具体内容如下:1.我们通过生物信息学分析,克隆获得了斑马鱼两个gpr161同源基因,分别命名为gpr161a和gpr161b;通过全胚胎原位杂交技术（Whole mount in situ hybridization,WISH）以及实时定量PCR（qRT-PCR）分析了这两个基因的转录情况,发现它们在胚胎发育时期均存在遍在表达[10]。但是gpr161a在神经管和近轴细胞（adaxial cell）中有富集,而gpr161b在神经管的中轴附近富集,提示其功能并不完全冗余,可能存在差异。2.为了进一步研究Gpr161在斑马鱼胚胎发育中的功能,我们应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼gpr161基因的缺失突变体。初步表型分析显示,无论是gpr161a-/-和gpr161b-/-单突变纯合子还是gpr161a-/-与gpr161b-/-双纯合突变体,均可以正常发育,没有出现明显的异常表型。这一结果与小鼠Gpr161缺失突变体不一致。提示Gpr161在脊椎动物中的功能可能并不保守,或者斑马鱼在进化中获得了其他的补偿效应以应对gpr161缺失的效应。3.为了进一步研究Gpr161在Hh信号通路的功能是否保守。我们对斑马鱼gpr161突变体的Hh信号通路的活性进行了干预和分析。通过Hh通路特异性的分子标记ptch2,olig2与nkx2.2a的表达情况,以及慢肌纤维的分化情况对gpr161缺失突变体对不同信号活性干预的应答情况进行了分析,初步的结果显示gpr161缺失突变体本身并没有表现出Hh活性的异常,而且在上调和下调Hh活性的干预下,gpr161突变体与野生型也没有明显的差异,提示Gpr161可能不是斑马鱼Hh通路重要的调控因子,而Gpr161在Hh通路中的功能并不保守。综上所述,本研究基于斑马鱼动物模型,克隆了gpr161同源基因,分析了其表达情况;建立了斑马鱼gpr161缺失突变体模型,并对其表型进行了初步的分析;同时对于缺失突变体Hh通路活性进行了初步的分析,为深入研究gpr161基因的功能提供了重要的实验材料和前期数据的积累,为进一步研究脊椎动物Hh通路的分子机制提供了重要的证据和线索。
龙敏笛[4]（2020）在《Tg（oct4：EGFP）转基因斑马鱼的制备及快速纯化的方法》文中研究指明OCT4在胚胎早期发育,尤其是维持细胞多能性等方面具有重要调节作用。斑马鱼是重要的模式生物,建立荧光标记oct4基因鱼为开展鱼类干细胞研究和应用奠定基础。本文通过构建带有TOL2转座子的PBLK-oct4-EGFP质粒,获得了绿色荧光标记oct4基因的转基因鱼（F0代）;结合雌核发育技术,建立了一种快速制备纯合转基因鱼的方法。具体研究结果如下:1、克隆斑马鱼oct4基因的启动子片段,对PBLK质粒骨架和带有oct4启动子的pMD18-T-oct4质粒同时进行双酶切,利用T4连接酶将oct4启动子连接到酶切后的PBLK质粒上,成功构建了全长为7338bp的带有TOL2转座子的PBLK-oct4-EGFP融合蛋白质粒。2、将PBLK-oct4-EGFP质粒和TOL2转座酶mRNA混合液显微注入斑马鱼受精卵中,获得约53%的绿色荧光胚胎（F0代）。荧光定量PCR对oct4和egfp基因在F0代胚胎中的表达分析表明:斑马鱼oct4基因具有母源性基因表达的特点,合子核基因在囊胚期表达旺盛,随着胚胎细胞的分化,oct4基因表达量随之降低。筛选到的F0代斑马鱼卵巢组织中的卵细胞及产出卵子中均可观察到绿色荧光。3、以遗传物质灭活的红鲫精子作为刺激源,将转基因斑马鱼F0所产的卵子激活,结合热休克抑制第一次有丝分裂进行倍性操作;挑选荧光胚胎,直接获得Tg（oct4:EGFP）转基因斑马鱼。对比传统的测交再自交的转基因鱼纯合方法,通过雌核发育技术,节省了选育时间,是一种快速获得纯合转基因鱼的方法。4、剪取转基因斑马鱼纯合个体尾鳍组织,结合细胞培养技术,建立了Tg（oct4:EGFP）转基因斑马鱼尾鳍成纤维细胞系,为鱼类干细胞发育生物学和诱导多能性干细胞研究提供了重要材料来源。结论:oct4基因在维持细胞多能性方面具有重要作用,是重要的干性因子。在构建PBLK-oct4-EGFP质粒基础上,通过显微注射获得oct4基因荧光标记斑马鱼;结合雌核发育技术,在F1代成功制备了Tg（oct4:EGFP）转基因斑马鱼纯合个体;并建立了Tg（oct4:EGFP）转基因斑马鱼纯合个体尾鳍成纤维细胞系。oct4基因荧光标记鱼和荧光标记细胞系的建立将在鱼类发育生物学、生殖干细胞生物学、诱导多能性干细胞等研究中获得广泛的应用,具有重要的科学价值;同时通过雌核发育创制纯合转基因鱼,打破了通过测交再自交（需历经至少3代）得到纯合转基因斑马鱼的传统方法,具有重要的应用价值。
沈丹[5]（2020）在《Tc1/mariner转座子挖掘、高活性成员鉴定及其在增强子捕获中的应用》文中研究表明随着越来越多生物基因组测序工作的完成,科学界对转座子在生命科学的重要性的理解和认识也逐渐加深。已有研究表明转座子在生物界分布广泛,对基因和基因组进化发挥重要作用,并可能影响物种分化和品种（品系）形成。另外由于转座特性,一些DNA转座子被成功开发成遗传操作工具,如SB,PB和Tol2等,在转基因、基因治疗和功能基因组学研究领域中得到广泛应用,并取得重要进展。其中,Tc1/mariner超家族是一类广泛分布的DNA转座子。到目前为止,已经鉴定到了 10多个具有天然活性的Tc1/mariner转座子,但只有人工分子重构的SB转座子得到广泛应用。本研究对斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族进行了系统挖掘和高活性成员应用评估,并对Tc1/mariner超家族中的DD41D/VS家族的分布和传播等进化特性进行了系统研究,主要包括以下研究内容:1.重头挖掘了斑马鱼基因组中的Tc1/mariner转座子,并进行了系统分类、插入年龄分析、转座酶结构域预测等研究;2.DD41D/VS转座子家族的分布、插入年龄分析、横向传播规律等研究;3.ZB转座子在哺乳动物中的转座活性和特性分析;4.ZB转座子在斑马鱼增强子捕获中的应用研究,捕获增强子鉴定验证;5.ZB转座子介导鼠精子突变体库构建及增强子捕获研究。主要结果如下:1、对Tc1/mariner超家族中另一个家族DD41D（Visitor,VS）进化分析表明:VS转座子在动物中分布广泛,在140个非脊椎动物和30个脊椎动物（其中12个为哺乳动物,包括1个灵长类）和1个植物检测到VS分布。VS在脊椎动物和非脊椎动物中发生了多次横向传播。进化关系和序列相似性矩阵分析显示DD41D/VS与DD37D/maT和DD34D/mariner关系更近,而DD40D是源自DD41D家族,而非一个独立的进化分支。插入年龄分析表明脊椎动物中VS的插入年龄差异明显,鳍鱼类和蟾蜍为年轻插入,其次是蝙蝠和有袋动物,而无颚鱼类和蜥蜴中主要是古老的VS转座插入。细胞试验表明源自蝙蝠基因组中结构完整的VS转座子已经失去转座活性。2、通过斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族的系统挖掘,共鉴定到10个自主和77个非自主Tc1/mariner转座子,占5.41%（90.69 Mb）。进化关系分析显示:Tc1-1DR,Tc1-4DR,Tc1-8BDR,Mariner-6DR,Mariner-7DR,Mariner-13DR,Mariner-15DR和Tc1-21DR这八个转座子属于DD34E/Tc1家族,而Mariner-14DR属于DD37E/TRT家族,Mariner-18DR属于DD×D/pogo家族。这些转座酶都具有保守的DNA结合结构域（DBD）和催化结构域（DDE/D）。其中Tc1-8BDR（命名为ZB转座子）全长1597 bp,中间为1个可编码341 aa的转座酶基因,两侧是201 bp的TIRs,且目标位点重复序列（TSD）为“TA”。ZB转座子在斑马鱼基因组中有25个拷贝,其中能编码完整转座酶的拷贝有20个,同源性大于99%。插入年龄分析显示,ZB转座子最年轻,可能具有较高的活性。3、细胞实验表明高剂量时ZB活性显着高于其他三个常用转座子（SB、PB和Tol2）（p<0.05）,且ZB和SB、PB和Tol2一样也存在转座酶过量抑制现象,但存在细胞和剂量差别,在低剂量（10 ng）转座子转染HepG2细胞和高剂量（500 ng）转染Hela细胞时,四个转座子均出现了过量抑制,但是在高剂量（500ng）转染HepG2细胞时,ZB和Tol2没有出现抑制现象。ZB转座后留下“CA/TG”三碱基“足迹”,与SB和Frog Prince转座子相同。ZB插入偏好性分析表明,ZB转座子是非随机插入到基因组中,对基因调控序列有一定的偏好性,且偏好插入6个TA碱基短回文序列（ATATATAT）。4、设计构建了 ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获载体,并通过显微注射,分别获得60和87个ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获品系。经荧光显微镜检测,ZB介导的增强子捕获效率与Tol2相近,生殖系传递效率分别为55.56%（n=108）和55.77%（n=156）。且ZB比Tol2更倾向于产生单一GFP表达模式后代（p<0.05）,Tol2更倾向于产生多GFP表达模式的后代（表型数≥2）。通过Sp-PCR成功注解了 4个ZB（ZK32,ZK36,ZK47和ZK68）和2个Tol2（TK1和TK4）介导的增强子捕获品系。VISTA注解共获得13个潜在的增强子,并对其中的8个进行了增强子鉴定和活性验证。5、设计构建了鼠增强子捕获载体及ZB转座子介导鼠精子突变体库。通过显微注射,分别制备了 ZB转座子和转座酶的转基因鼠,并成功构建含转座子和转座酶的双转基因公鼠4只（精子突变体库）,与野生的母鼠杂交制备突变体。通过常规PCR和Linker-PCR对12窝,共135个后代小鼠检测,获得72只ZB转座子转基因阳性鼠,61个后代的插入位点与父本的转座子原插入位点一致,11个后代插入到了新位点,ZB转座子重新转座的效率为15.3%（11/72）,高于SB和PB（约10%）。并获得GFP阳性鼠3只（n15、n19和n111）,VISTA注解获得11个潜在的增强子。总体而言,本文系统揭示了Tc1/mariner转座子超家族中DD41D/VS家族在生物界的进化规律,及Tc1/mariner转座子在斑马鱼基因组上构成、种类、进化动力学等特性,成功挖掘了高活性ZB转座子,并系统评估了其转座活性和特性,构建了 ZB介导的鼠精子突变体库,在模式动物斑马鱼和鼠上进行增强子捕获应用研究。证实ZB能够高效介导基因转移,在转基因、基因治疗、功能基因组学等研究中具有很大应用潜力。
张婷[6]（2019）在《铜诱导斑马鱼髓鞘和轴突发育缺陷的分子调控机制》文中指出铜（copper,Cu）是生物体必需的微量元素,直接参与生物体造血发生、神经发育、骨骼形成以及机体免疫等过程。在体内过量会导致鱼类幼鱼运动能力下调,还与多种神经退行性疾病的发生相关,但其调控神经发育的潜在分子机制至今仍鲜有报道。本研究以模式动物斑马鱼（Danio rerio）作为研究对象,通过基因芯片（microarray）技术发现铜胁迫导致幼鱼髓鞘和轴突导向基因表达下调。而髓鞘和轴突是神经元与肌肉等靶器官通讯的基础,且髓鞘和轴突损伤是多种神经退行性疾病的共同病理特征。因此本研究通过转录组分析、整体原位杂交（whole mount in situ hybridization,WISH）以及荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）技术对铜诱导斑马鱼幼鱼髓鞘和轴突发育缺陷的分子表型进行了详细的鉴定。随后,结合转录组测序和胚胎全基因组甲基化测序结果分析,鉴定了铜诱导髓鞘和轴突发育缺陷的关键调控因子,并利用CRISPR/Cas9敲除技术,Morpholinos（MO）敲降技术以及过表达实验,对上述关键调控因子的功能进行了深入的研究,最后借助铜转运突变体,阐明了它们在铜诱导髓鞘和轴突发育中的功能,揭示了铜胁迫导致斑马鱼中枢神经系统（central nervous system,CNS）髓鞘和轴突发育缺陷的分子调控机理。本文主要研究结果如下:1、铜胁迫导致斑马鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷通过表型观察及整体原位杂交检测发现,铜胁迫会导致胚胎孵化率降低、运动能力降低,神经标记基因表达量下调。基因芯片进一步分析发现,铜胁迫造成斑马鱼髓鞘与胶质细胞、轴突导向等神经系统相关的基因表达量下调。接着对髓鞘和轴突的超微结构进行电镜观察发现铜胁迫会导致脊髓处髓鞘变薄甚至是脱失,轴突直径变小。整体原位杂交以及髓鞘和轴突转基因鱼的实时观察结果显示铜胁迫导致脊索处髓鞘和轴突发育缺陷。上述结果表明,铜胁迫导致CNS髓鞘和轴突发育缺陷。2、铜通过抑制Wnt/Notch-hoxb5b信号通路抑制CNS髓鞘和轴突的发育通过基因芯片和整体原位杂交对其调控机理进一步分析时发现转录因子hoxb5b在铜胁迫胚胎中显着性下调。利用Morpholinos（MO）敲降hoxb5b后胚胎呈现与铜胁迫胚胎类似的表型。此外,通过CRISPR/Cas9技术构建hoxb5b突变体,hoxb5b基因敲降和敲除的幼鱼都呈现铜胁迫幼鱼类似的CNS髓鞘和轴突发育缺陷。并且hoxb5b过表达后可以拯救铜胁迫导致的孵化率降低以及CNS髓鞘和轴突发育缺陷,表明铜通过抑制hoxb5b诱导CNS髓鞘和轴突发育缺陷。此外,铜胁迫导致Wnt和Notch信号通路相关基因表达下调,而Wnt和Notch信号通路激活后可以拯救铜胁迫导致的hoxb5b及CNS髓鞘和轴突发育缺陷。综上所述,铜通过Wnt和Notch信号通路抑制hoxb5b的表达进而导致斑马鱼幼鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷。3、铜诱导的fam168等基因的高甲基化及其转录水平降低促进CNS髓鞘和轴突发育缺陷的产生全基因组甲基化分析结果显示,在铜胁迫胚胎中,26个基因甲基化水平显着性上调,其中pou3f1、pou3f2和fam168b与髓鞘和轴突的发育相关,而这些基因以及fam168b的同源基因fam168a的转录水平在铜胁迫组中显着性下调。整体原位杂交结果显示fam168a和fam168b的基因表达模式相似,且与pou3f1的表达也类似。通过转录组测序分析发现,fam168a和fam168b基因敲降胚胎都呈现pou3f1基因敲除胚胎类似的神经和突触发育缺陷。通过整体原位杂交和q RT-PCR进一步的探究发现,fam168a和fam168b功能缺失幼鱼都呈现出CNS髓鞘发育缺陷,与pou3f1基因敲除以及铜胁迫的幼鱼有类似的表型。此外,fam168a,fam168b和pou3f1过表达后可以部分拯救铜胁迫导致的CNS髓鞘和轴突发育缺陷,表明铜胁迫导致的fam168b、pou3f1和pou3f2的高甲基化调控及其转录水平的下调促进CNS髓鞘发育缺陷的产生。4、铜诱导的fam168b基因的高甲基化与其转录水平下降之间的调控关系fam168b启动子高甲基化区域5’缺失片段活性分析结果显示fam168b高甲基化区域的缺失导致fam168的表达降低,表明铜胁迫胚胎中上述基因的高甲基化调控其转录表达。但铜胁迫后fam168b转录水平的下调先于甲基化水平的上调,表明区域甲基化可能是转录复合物和染色体DNA结构变化的次要结果。5、Hoxb5b信号因子与fam168a/fam168b/pou3f1等高甲基化基因之间的调控关系整体原位杂交和q RT-PCR结果显示,hoxb5b功能缺失胚胎中fam168a、fam168b和pou3f1的表达显着性上调,而fam168a、fam168b和pou3f1功能缺失的胚胎hoxb5b转录水平显着上调。而fam168a、fam168b、pou3f1和hoxb5b的转录同时被抑制时会导致铜胁迫幼鱼类似的CNS髓鞘和轴突发育缺陷,表明fam168a/fam168b/pou3f1与Wnt&Notch-hoxb5b信号在铜胁迫胚胎中发挥互为跷跷板的功能,且两条途径共同作用导致CNS髓鞘和轴突发育缺陷。6、铜通过cox17/atp7b调控Wnt/Notch-hoxb5b及fam168a/fam168b/pou3f表观因子共同诱导髓鞘和轴突发育缺陷通过整体原位杂交和q RT-PCR检测不同铜转运突变体幼鱼铜胁迫后髓鞘基因的表达,结果显示,在cox17-/-突变体中,fam168a、fam168b和pou3f1表达量下调,而在atp7b-/-突变体中,pou3f1表达量下调,而fam168a和fam168b的表达量没有显着性差异,此外,hoxb5b在atp7b-/-突变体中表达下调,在cox17-/-突变体中表达不变,表明胚胎铜胁迫后可能导致ROS进而影响Wnt&Notch-hoxb5b信号对髓鞘和轴突发育造成影响,但不影响pou3f1/fam168a/fam168b的甲基化和转录调控。因此,cox17缺失后,铜可能通过影响染色质结构调控表观因子pou3f1/fam168a/fam168b导致髓鞘和轴突发育缺陷。同样的,在atp7b-/-突变体中,铜可以通过抑制Wnt&Notch-hoxb5b导致髓鞘和轴突发育缺陷。
王紫阳[7]（2019）在《纳米银调控斑马鱼胚胎神经系统发育及代谢的研究》文中研究指明纳米银（Ag NPs）由于其优良的杀菌特性,已经被广泛的应用于生物技术和生命科学领域。已有研究发现纳米银会引起脊椎动物胚胎发育畸形,但很少研究其在动物中引起胚胎发育畸形的分子特性和机制。本实验在前期研究发现纳米银胁迫的斑马鱼胚胎呈现运动功能失调等发育缺陷表型,在此基础上,本研究进行深入的分子缺陷表型的鉴定及其潜在调控机制的研究。首先,通过筛查转录组测序结果,分析发现纳米银胁迫的斑马鱼胚胎中晶状体结构蛋白、神经回路和代谢相关基因呈现下调表达。进一步利用整胚原位杂交技术（whole mount in situ hybridization,WISH）和定量荧光聚合酶链式反应技术（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RTPCR）检测验证了这些基因的下调表达。同时,本研究分析了纳米银是通过其纳米颗粒和释放的银离子破坏了运动调节神经回路的形成,进而导致了神经细胞的膜电位异常和触碰响应的功能失调及幼鱼运动行为的异常;分析了纳米银特异性诱导胚胎的晶状体而非视网膜发育的缺陷;进一步分析纳米银调控胚胎代谢的分子特征。本研究结果揭示了纳米银胁迫条件下斑马鱼胚胎的眼睛和神经系统发育缺陷及代谢异常的分子特征及其潜在调控机理。主要结果如下:1.纳米银通过破坏斑马鱼胚胎的神经回路进而诱导异常的触碰响应首先,本研究发现纳米银胁迫胚胎的触碰响应和神经元膜电位呈现异常。通过基因芯片技术和生物信息学分析发现,纳米银胁迫的胚胎中神经发生相关基因表达下调。利用q RT-PCR和WISH技术进一步验证了纳米银或银离子处理的胚胎中多巴胺能神经递质基因otpa、sncgb、gad1b、gad2,突触传递基因robo2、vim和glrbb,以及运动神经元基因isl1和isl2a的表达下调。此外,通过在纳米银胁迫处理的胚胎中添加银离子螯合化合物L-半胱氨酸,发现可以恢复gad1b、gad2和isl1的表达降低,暗示纳米银通过其释放银粒子而破坏鱼类胚胎触碰响应的神经环路形成。2.纳米银诱导斑马鱼胚胎的晶状体而非视网膜发育的缺陷通过显微镜观察和苏木素-伊红染色发现纳米银胁迫处理的胚胎晶状体中有裂缝和液泡。此外,通过基因芯片分析及q RT-PCR和WISH技术验证了纳米银胁迫处理的胚胎中不同晶体蛋白基因的下调表达和视网膜基因的表达正常。此外,通过细胞凋亡和m RNA输出检测发现,纳米银胁迫的胚胎晶状体中未观察到明显的细胞凋亡,并且在纳米银胁迫的胚胎晶状体细胞中观察到正常的m RNA输出,暗示纳米银诱导晶状体标记基因的表达下调及其发育缺陷并不是通过破坏m RNA的输出而产生。3.纳米银影响斑马鱼胚胎发育过程中的代谢Microarray分析揭示了纳米银胁迫的斑马鱼胚胎在24 hpf时代谢基因的表达发生改变。通过q RT-PCR和WISH进一步的检测,我们发现了纳米银胁迫的胚胎糖酵解和酪氨酸代谢途径中部分基因在24 hpf时下调表达,随后在72 hpf的胚胎中这些基因的表达却呈现补偿性上调表达。利用标记糖酵解途径代谢产物的Elase试剂盒,我们检测发现,在纳米银胁迫处理的胚胎中观察到糖酵解途径中的己糖激酶和琥珀酸脱氢酶活性降低而丙酮酸含量的增加,这与在进行性肌营养不良患者中观察到的代谢分子特征相似。此外,本研究推测,在纳米银胁迫的胚胎中,糖酵解代谢的变化通过调节糖酵解代谢物的浓度而不是通过诱导躯干肌细胞中的细胞凋亡和增殖,进而影响肌纤维特化发育过程。同时,在纳米银胁迫的胚胎中,酪氨酸代谢的变化可能与神经回路形成缺陷一起共同导致其触碰响应异常。
孙先定[8]（2019）在《利用斑马鱼研究几种骨骼遗传疾病的发病机制》文中提出骨骼遗传疾病（Skeletal genetic diseases）是一组以全身骨骼生长发育障碍为特征的遗传性骨骼系统疾病。临床上主要表现为各类骨骼组织生长、发育异常,如身材矮小、头颅四肢畸形、脊柱侧弯、骨密度异常等。目前,按照2015年修订的遗传性骨骼疾病国际分类标准,依其已知的分子遗传学基础、病因学和表型,被划分为436种42大类。该类疾病常导致各类出生缺陷,人群总发病率大约1/1500,严重危害国民的身体健康。目前,随着研究的深入,许多骨骼遗传性疾病的致病基因已被鉴定发现,但仍有部分遗传性骨骼疾病的致病基因仍不清楚,有约一半的骨骼遗传疾病的致病机制尚未完全阐明。因此,阐明骨骼发育机制及骨骼遗传性疾病的致病分子机制,将为人类骨骼疾病的早期诊断及有效防治提供更多的理论依据。遗传病患者是研究这些遗传性骨骼疾病最直接的研究对象,但这些遗传资源较难获取,数量相对较少,且考虑到社会伦理和道德的制约,许多的科学实验中不可能利用遗传病患者自身作为实验对象。因此,遗传背景稳定的模式动物是开展遗传病研究的理想对象。斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物,在人类疾病模型中已广泛应用。与鸡、小鼠等传统动物模型相比,斑马鱼具有个体小、繁殖周期短,繁殖力强,体外受精发育,胚胎透明等特点,斑马鱼基因组与人类基因组相似性高达87%。斑马鱼的骨骼尤其是头颅及脊柱与哺乳动物结构组成相似,在骨骼发育过程中的相关信号通路和调控机制高度保守。因此,斑马鱼已成为研究骨骼发育和相关疾病的理想动物模型。我们的研究选取斑马鱼为实验模式动物,利用ENU大规模诱变筛选及CRISPR/Cas9基因敲除技术,聚焦于三种不同的骨骼遗传性疾病开展研究。（1）先天性脊柱侧凸（Congenital scoliosis,CS）是由于胚胎期椎体发育异常导致的脊柱畸形,其具体的遗传病因和潜在机制仍不清楚。通过大规模的诱变筛选可发现引起斑马鱼CS的新基因并进一步阐明其发病机制。（2）软骨毛发发育不良（Cartilage-hair hypoplasia,CHH）是一种常染色体隐性遗传病,以身材矮小、免疫缺陷和毛发稀疏为特征,是由于长链非编码RNA RMRP突变导致的。由于目前还没有可以存活的CHH动物模型,CHH导致骨骼发育异常的致病机制尚未阐明。通过CRISPR/Cas9技术建立rmrp敲除斑马鱼模型来模拟CHH疾病,可进一步研究其发病机制。（3）CATSHL综合症是主要表现为屈曲指,身材高大和听力丧失等临床症状的一种常染色体显性或隐性遗传综合征,是由于FGFR3的杂合或纯合突变导致的。CATSHL综合症导致骨骼发育异常及听力丧失等表型的细胞分子机制尚未完全阐明。通过CRISPR/Cas9技术建立fgfr3敲除斑马鱼模型来模拟CATSHL综合症,可进一步研究其发病机制。研究方法:第一部分:斑马鱼脊柱畸形突变体的筛选及致病基因功能研究1.斑马鱼ENU诱导的大规模遗传筛选:繁殖ENU处理后的F3代胚胎,体视显微镜观察大体表型,钙黄绿素活体染色观察椎体矿化。2.Smt突变体的定位克隆:构建具有单链片段长度多态性群组的斑马鱼品系,通过分离群体分析法（BSA）定位克隆突变基因,注射mRNA进行回救实验。3.整胚原位杂交检测dstyk基因表达模式,CRISPR/Cas9敲除dstyk基因验证突变表型。4.利用标记细胞膜的转基因鱼系Tg（β-actin:ras-GFP）;标记脊索细胞的转基因鱼系Tg（col2a1a:EGFP）分析突变体脊索表型。5.细胞器Tracker活体染色,免疫荧光,整胚原位杂交分析突变体脊索发育异常的原因。6.透射电镜检测突变体脊索和脊索鞘的超微结构变化。7.利用转基因鱼系Tg（col2a1a:EGFP）;Tg（osterix:mCherry）以及钙黄绿素染色分析突变体脊柱畸形原因。8.免疫荧光及转基因鱼系检测DSTYK的亚细胞定位,DSTYK siRNA的敲降实验分析对溶酶体形成的影响。9.免疫荧光,WB检测分析Dstyk敲除抑制溶酶体及脊索液泡生成的分子机制,体外细胞层面及斑马鱼体内层面进行回救实验验证表型变化。第二部分:软骨毛发发育不良的斑马鱼模型构建及发病机制的研究1.利用多序列比对比较斑马鱼rmrp的转录区和启动子区序列的保守性。整胚原位杂交分析斑马鱼rmrp的表达模式。2.利用CRISPR-Cas9技术敲除斑马鱼rmrp,并分析其大体表型。3.阿尔新蓝染色,软骨细胞标记的转基因鱼系Tg（col2a1a:EGFP）及原位杂交分析rmrp突变体的软骨发育表型。4.利用茜素红活体染色及标记成骨细胞的转基因鱼系Tg（osterix:EGFP）分析rmrp突变体的成骨发育表型。5.利用转基因鱼系及HE染色等分析rmrp突变体肠道和头颅血管的发育。6.EdU和TUNEL标记实验分析rmrp突变体的细胞增殖和凋亡的变化。7.WB,定量PCR,免疫荧光,原位杂交等分析rmrp突变表型形成的机制,并进行回救实验观察能否缓解突变表型。第三部分:CATSHL综合征的斑马鱼模型构建及致病机制研究1.利用多序列比对比较斑马鱼fgfr3的编码序列和氨基酸序列的保守性。整胚原位杂交分析斑马鱼fgfr3的表达模式。2.利用CRISPR-Cas9技术敲除斑马鱼fgfr3,分析其大体表型,X线、micro-CT及阿尔新蓝和茜素红全骨架染色分析其骨骼表型。3.利用茜素红活体染色及标记成骨细胞的转基因鱼系Tg（osterix:EGFP）分析fgfr3突变体在不同时间点头颅成骨发育,脊柱发育及鱼鳞片发育的表型。4.利用标记软骨细胞的转基因鱼系Tg（col2a1a:EGFP）分析fgfr3突变体发育不同时间的软骨发育的表型,组织学染色分析fgfr3突变体软骨生长板表型。5.通过EdU细胞标记实验,WB,原位杂交,转基因鱼系等检测分析fgfr3突变体导致各种异常表型的细胞和分子机制。实验结果:第一部分:斑马鱼脊柱畸形突变体的筛选及致病基因功能研究1.经ENU筛选得到一个体节缩短（smt）的突变体,smt突变体有严重的脊柱侧凸和后凸畸形。2.致病基因的定位克隆及回救实验发现smt突变体的表型是由dstyk突变导致的。3.Dstyk在胚胎发育早期广泛分布表达,此后在脊索动态表达。CRISPR/Cas9敲除dstyk基因同样发现有体节缩短及脊柱畸形的表型。4.Dstyk基因突变导致脊索细胞液泡膨胀不完全,导致脊索发育异常。5.Dstyk基因突变导致囊泡转运异常引起脊索液泡生成障碍,脊索中shh、cmn、col8a1a、col9a1b、col11a2表达降低,脊索功能异常。6.超微结构显示dstyk突变体的脊索细胞液泡形成障碍,脊索鞘排列及结构紊乱。7.Dstyk突变导致中轴骨分节异常,脊椎形成缺陷,最终导致脊柱畸形。8.体内及体外研究表明,DSTYK定位在晚期内吞体/溶酶体,参与哺乳动物细胞溶酶体的形成。9.Dstyk敲除激活mTORC1信号通路,抑制TFEB的磷酸化,从而抑制转录因子TFEB的入核,抑制溶酶体和脊索液泡的形成。mTORC1抑制剂Torin1处理可部分回救dstyk敲除后TFEB的入核障碍,部分回救溶酶体生成障碍。Torin1处理dstyk突变体可部分回救脊柱畸形的表型。第二部分:软骨毛发发育不良的斑马鱼模型构建及发病机制的研究1.对人,小鼠和斑马鱼RMRP的转录区和启动子区多序列比对显示rmrp在多种物种间高度保守。Rmrp在包括软骨在内的多种组织中表达。2.CRISPR/Cas9敲除rmrp基因导致下颌发育异常,心包膜水肿,不能形成鱼鳔,眼睛及头部变小。3.Rmrp基因敲除导致咽弓软骨发育不良,软骨发育相关的分子sox9a和col2a1a表达延迟。4.Rmrp突变体膜内成骨明显受抑制,软骨内成骨继发于软骨发育不良而发生延迟,但脊柱椎体矿化加速,矿化的椎体数量显着增加。5.Rmrp突变体肠上皮细胞数量减少,肠绒毛缺失,头颅血管发育畸形。6.Rmrp突变通过影响细胞周期相关基因的表达抑制细胞增殖,可上调凋亡相关基因的表达促进细胞凋亡。7.Rmrp突变可上调经典Wnt/β-catenin信号通路,而使用β-catenin抑制剂XAV939处理可部分缓解rmrp突变体软骨发育不良和椎体矿化增加。第三部分:CATSHL综合征的斑马鱼模型构建及致病机制研究1.对人,小鼠和斑马鱼的fgfr3编码序列和氨基酸序列多序列比对显示fgfr3在多种物种间高度保守。Fgfr3在包括软骨在内的多种组织中表达。2.CRISPR/Cas9敲除fgfr3基因导致颅面骨骼发育畸形,下颌骨和颅骨的骨化受到严重抑制,鱼鳔发育异常。3.Fgfr3突变体膜内成骨及软骨内成骨均明显受抑制,鳞片发育形成也受阻,部分听觉感觉器官发育异常。4.斑马鱼敲除fgfr3导致软骨细胞异常肥大和软骨细胞排列紊乱,破坏了咽弓的发育和模式形成,同时导致部分软骨存在软骨瘤样病变。5.斑马鱼fgfr3突变增强IHH信号,促进软骨细胞增殖。6.Fgfr3突变上调Wnt/β-catenin信号,抑制Wnt信号可部分缓解fgfr3突变所致的软骨发育异常。结论:1.Dstyk突变通过mTORC1/TFEB信号影响脊索液泡的发育,导致中轴骨分节异常及椎体形成缺陷,最终导致脊柱畸形。2.斑马鱼rmrp突变体可部分模拟软骨毛发发育不全遗传病,rmrp突变可通过上调Wnt/β-catenin信号影响软骨发育及骨矿化。3.斑马鱼fgfr3突变体可部分模拟CATSHL综合征,fgfr3突变导致软骨细胞异常肥大和软骨细胞排列紊乱,这些软骨结构异常可导致下颌骨软骨力学改变,导致颅面畸形。
陈发[9]（2018）在《斑马鱼Had31基因在心脏左右不对称发育中的作用研究》文中研究表明心脏左右不对称畸形影响着人们的生活品质,甚至导致死亡。目前对心脏左右不对称发育过程牵涉到的分子机制仍不清楚,因此,研究调控心脏左右不对称发育候选基因的功能及其作用的分子机制具有重要的理论与临床应用意义。本文首先利用斑马鱼模型研究Had31基因在心脏左右不对称发育中的作用。我们检测了Had31在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱,研究结果显示,在胚胎发育到14体节期,Had31在左侧心脏原基的表达明显强于右侧的表达;而当胚胎发育到16体节期,Had31在右侧心脏原基的表达明显强于左侧的表达;当胚胎发育到17体节期,Had31在心脏两侧原基的表达量趋于一致,提示Had31与心脏左右不对称发育相关。本实验室前期建立了Had31敲除品系,我们通过对其后代分析发现,杂合子双亲繁衍的Had31纯合子胚胎出现围心腔肿大、心脏不能正常环化的表型,纯合子双亲交配产的卵不能发育。用心肌标记Myl7和左右不对称发育标记Spaw,Lefty2,Foxa3与Trypsin的实验也显示心脏不能正常环化。因Had31纯合子不育,我们改用吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonucleotides,MOs）敲减Had31的表达进行研究。我们首先利用Had31-GFP质粒在胚胎中的表达分析Had31-MO敲减的Had31-绿色荧光蛋白的表达效率,结果表明Had31-MOs敲减是有效的。我们接着对Had31杂合子双亲繁衍的敲除纯合子胚胎与Had31-MOs敲减胚胎进行突变表型的对比分析,实验结果表明,两者出现相似的围心腔肿大,心脏不能正常环化的表型;用心脏左右不对称发育标记探针进行的胚胎原位杂交结果也获得相似的结果。文献报道,心脏环化的异常可能与早期心脏前体细胞的迁移有关。我们用Myl7为探针检测敲减Had31表达对心肌早期细胞迁移的影响。研究结果表明,Had31导致的心脏环化异常可能与早期心脏前体细胞的迁移有关。Had31在两侧的心脏原基中都有表达,提示Had31可能在中线左右两侧分别调控心脏左右不对称发育。已知位于中线左侧的Nodal-Pitx2信号调控心脏左右不对称发育。跨膜蛋白Nomo是Nodal的拮抗因子。我们通过胚胎原位杂交实验验证了 Nomo对Nodal/Spaw表达的抑制作用。基于本室早期研究发现定位于细胞核和细胞质中的Had31和Nomo存在相互作用,我们假设,在中线左侧信号中,ad31位于Nodal/Spaw信号中Nomo的下游。为了证明该假设,我们通过敲减或增强Nodal/Spaw或Nomo分析Had31的表达,实验结果显示Nodal/Spaw激活Had31的表达。因Nomo是Nodal/Spaw的拮抗因子,预期敲减Nomo应上调Had31在心脏原基左右两侧的表达,而过表达Nomo应下调Had31在心脏原基左右两侧的表达,我们通过胚胎原位杂交获得的结果与预期结果相符,即Nomo在中线两侧都抑制Had31的表达。这些实验结果表明,Had31位于斑马鱼胚胎左侧Nodal信号通路的下游。已知Nodal信号的下游成员Pitx2是成对同源域转录因子,那么,Had31与Pitx2的上下游关系是什么呢?我们进一步的实验结果显示Had31激活Pitx2的表达,提示Pitx2可能位于Had31的下游。如果该推论正确,过表达Pitx2应能拯救Had31的突变表型。我们通过过表达Pitx2证明其确实能够拯救敲减Had31导致的心脏环化异常畸形,表明Had31位于Pitx2的上游。通过上述实验已知Had31激活Pitx2的表达,Nodal/Spaw激活Had31的表达,故预期敲减Nodal/Spaw应下调Pitx2的表达,而过表达Nodal/Spaw应上调Pitx2的表达,我们的胚胎原位杂交结果与预期结果相符。因Had31激活Pitx2的表达,Nomo抑制Had31的表达,故预期敲减Nomo应上调Pitx2的表达,而过表达Nomo应下调Pitx2的表达。我们的胚胎原位杂交结果与预期结果相符。综上所述,我们的研究结果初步表明,Had31是中线左侧信号的新成员,构成Nodal-Had31-Pitx2信号调控心脏左右不对称的发育。最近的研究表明,位于背中线右侧的BMP4-Prrx1a信号调控心脏左右不对称发育。我们假设,在中线右侧信号中,Had31位于BMP4信号的下游。为了证明该假设,我们通过抑制或增强BMP4的表达分析其对Had31表达的影响。胚胎原位杂交实验结果显示BMP4抑制Had31在右侧心脏原基中的表达。已知Prrx1a属成对同源域转录因子,是BMP4-Prrx1a信号轴的下游基因,BMP4激活Prrx1a的表达。那么,Had31与Prrx1a的上下游关系是什么呢?我们的实验结果显示Had31抑制Prrx1a的表达,提示Prrx1a可能位于Had31的下游。我们通过敲减Prrx1a证明其确实能够拯救敲减Had31导致的心脏环化异常畸形,表明Had31位于Prrx1a的上游。我们的上述研究结果表明,Nomo抑制Had31的表达,而Had31抑制Prrx1a的表达,故预期敲减Nomo应下调Prrx1a的表达,而过表达Nomo应上调Prrx1a的表达,我们的胚胎原位杂交结果与预期结果相符。综上所述,Had31可能是BMP4-Prrx1a信号的新成员,可能在背中线右侧通过BMP4-Had31-Prrx1a信号轴调控心脏左右不对称发育。心脏房室瓣膜是心脏器官的一个重要组成结构,已知很多先天性心脏病都伴随着瓣膜缺陷。目前对心脏瓣膜发育过程中牵涉到的分子机制所知有限。本项目进一步研究了Had31和fhl1A基因对斑马鱼瓣膜发育的影响。首先我们研究Had31基因对斑马鱼瓣膜发育的影响。斑马鱼发育52 hpf胚胎进行的原位杂交分析结果显示,Had31敲除纯合子胚胎中的探针Versican和Has2的表达上调;而探针Tbx2b,Notch1b和BMP4的表达不变。这些结果初步说明Had31对斑马鱼心脏瓣膜的发育也存在调控作用。本博士论文研究的另外一个基因为fhl1A。我们课题组早期研究结果显示fhl1A在心脏腔室、心脏房室交界处和骨骼肌中表达。我们利用实验室建立的fhl1A敲除纯合子研究了fhl1A对心脏瓣膜发育的影响。研究结果表明fhl1A纯合敲除品系瓣膜标记基因Versican和BMP4的表达下调,Has2的表达增强。这些结果说明fhl1A确实调控瓣膜的发育。
彭夕洋[10]（2017）在《斑马鱼tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心脏发育中的功能研究》文中提出先天性心脏病是新生儿出生缺陷中发病率和死亡率最高的疾病,研究表明心脏发育调控基因的表达异常是导致先心病的内在原因。阐明心脏在早期发育过程中的基因调控机制就成为治疗先心病的关键。随着斑马鱼成为研究发育生物学和功能基因组学的脊椎动物模型,利用该模型可为探究心脏的早期发育和先心病发生的分子调控机制提供行之有效的研究策略。本文主要利用斑马鱼模型研究了tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心脏早期发育过程中的调控功能。一、tmp3基因在心脏发育中的功能研究tmp3基因为实验室早期克隆的一个心脏发育候选基因,本文利用Tol2转座系统构建的tmp3启动子驱动的EGFP表达转基因斑马鱼品系Tg（tmp3:EGFP）,简称tmp3EGFP。追踪该转基因斑马鱼中EGFP的表达发现,在受精后36,48和56小时（hpf）Tmp3蛋白主要强表达于心脏和骨骼肌中。原位杂交技术检测EGFP早期表达信号发现在40%外包时,表达信号定位于卵裂球边缘生心区;22体节时,信号定位于心锥和骨骼肌;24 hpf,信号定位于心管和骨骼肌;48 hpf,信号定位在骨骼肌和跳动的心脏中。将Tg（tmp3:EGFP）鱼与标记心内膜层细胞的Tg（fli1a:DSRED）鱼及标记心肌层细胞的Tg（myl7:DSRED）鱼分别杂交,对发育到72 hpf的双转基因斑马鱼进行激光共聚焦显微镜单层切面扫描,结果显示心脏中的tmp3基因表达只定位于心肌层。利用TALEN打靶技术构建的tmp3基因敲除斑马鱼品系进行Western blot检测证明,tmp3敲除阳性个体中没有相应的功能型蛋白合成。观察tmp3敲除纯合子的表型发现,tmp3敲除斑马鱼表现为心包肿大,心脏腔室减小,环化异常和躯干发育异常。观察Tg（myl7:DSRED;flk1:EGFP）双转基因tmp3敲除斑马鱼的表型发现,tmp3基因敲除导致斑马鱼心脏腔室减小和房室通道缩窄。为了探究心脏腔室的减小是由于心肌细胞大小的减小还是由于数目的减少导致的,利用细胞膜紧密连接蛋白ZO-1的抗体标记细胞膜,检测tmp3敲除斑马鱼心脏细胞的大小,结果表明tmp3敲除鱼心脏中的细胞大小并未发生显着变化。另外,通过肌球蛋白重链MHC抗体和核内DNA染料DAPI对心肌细胞染色并计数发现,48hpf tmp3敲除鱼心脏中心肌细胞的数量显着减少。证明tmp3基因敲除斑马鱼心脏腔室的变小是由于心肌细胞数量减少导致。Edu细胞增殖分析结果显示tmp3基因敲除后增殖的幼鱼心肌细胞数量显着减少。而TUNEL凋亡细胞分析结果显示tmp3敲除幼鱼心脏细胞的凋亡并未发生显着变化。由此证明tmp3基因通过影响心肌细胞的增殖从而调控斑马鱼早期心脏发育。本实验室早期通过酵母双杂交和COIP相互作用分析筛选出与Tmp3蛋白相互作用的蛋白分子Creb2,那么Tmp3蛋白是否通过与Creb2相互作用从而调控心脏发育呢?本文利用免疫荧光和激光共聚焦扫描检测斑马鱼胚胎心脏内源Tmp3与Creb2蛋白的表达发现,这两个蛋白在72 hpf的幼鱼心脏中存在共定位。进一步的免疫荧光实验证明在H9c2大鼠心肌细胞中TMP3蛋白与CREB2蛋白共定位于心肌细胞的细胞核中。接下来,用免疫荧光检测了诱导向心肌细胞分化的P19小鼠畸胎瘤干细胞在诱导第6天和第10天内源Tmp3和Creb2蛋白的定位。发现在诱导第6天两种蛋白大部分共定位在细胞质中,而在诱导第10天这两种蛋白共定位在细胞核中。提示随着胚胎细胞向心肌细胞分化,Tmp3与Creb2两种蛋白逐渐从细胞质迁移到细胞核中,提示这两个蛋白的入核进程可能与心肌细胞的发育过程相关。由于Tmp3是一个不具备入核信号的跨膜蛋白,为探究Tmp3是否依赖与Creb2的相互作用入核,构建tmp3全长荧光质粒发现该质粒在细胞核与细胞质中均有表达,而除去与Creb2相互作用结构域（134-240AA）后的截短体蛋白Tmp3荧光质粒仅定位在细胞质中。由此证明,Tmp3蛋白是通过与Creb2蛋白相互作用介导入核的。早期心肌细胞增殖和分化的关键调控因子gata4敲减的斑马鱼胚胎与tmp3基因敲除斑马鱼表现出类似的心脏缺陷表型,提示gata4可能是Tmp3-Creb2复合物的下游调控靶标。本文利用RT-qPCR检测了tmp3敲除斑马鱼胚胎中gata4及其调控心肌细胞增殖的下游因子ccnd2a和cdk4的表达。结果表明,gata4,ccnd2a和cdk4在tmp3敲除斑马鱼中均显着下调。由此提示gata4可能是Tmp3-Creb2复合物的下游靶标。另外在tmp3基因敲除斑马鱼一细胞期显微注射gata4mRNA可以一定程度上拯救心脏的发育畸形,从而进一步证明gata4为Tmp3-Creb2复合物调控早期心脏发育的下游靶标。利用RT-qPCR技术检测法洛式四联症（TOF）病人心肌组织中TMP3 mRNA的表达量发现TOF病人心肌组织中TMP3 mR NA的水平显着下调。随后通过测序分析在TOF病人中检测到一个TMP3基因的错义突变（c.820C>T,p.R274C）。将突变的TMP3质粒（R274C,TMP3m）转染到H9c2细胞中,利用荧光报告系统分析发现GATA4基因的上游应答原件CRE-luc荧光报告基因的转录活性较野生型对照组显着降低。而且western blot检测发现TMP3m转染的H9c2细胞中GATA4蛋白的表达量也显着降低。由此可见,TMP3m突变可能通过影响GATA4蛋白的表达从而参与TOF的发病机制。二、hprg1b基因在心脏发育中的功能研究hprg1b基因是实验室前期通过果蝇P因子突变筛选出的另一个早期心脏发育候选基因。本文为了追踪hprg1b基因在心脏早期发育过程中的时空定位,利用Tol2转座系统构建了hprg1b启动子驱动EGFP蛋白表达的转基因斑马鱼品系Tg（hprg1b:EGFP）,简称1bEGFP。追踪胚胎发育过程中绿色荧光信号的表达发现在16hpf hprg1b基因的表达信号定位于侧板中胚层两侧的心脏原基中,随后在20hpf融合信号出现在心锥区域,在24hpf定位于心管的位置,48hpf后信号在心脏中检测到。由此可见,hprg1b基因的时空表达谱与早期心脏的形态建成区域一致。本文将1bE GFP转基因斑马鱼分别与Tg（myl7:DSRED）和Tg（kdrl:MCHERRY）转基因斑马鱼杂交后得到Tg（1bEGFP;myl7DSRED）和Tg（1bEGFP;kdrlMCHERRY）双转基因斑马鱼,观察72 hpf的转基因斑马鱼心脏发现Hprg1b蛋白表达只定位于心肌层。进一步检测75hpf的Tg（1bEGFP;myl7DSRED）双转基因斑马鱼心脏发现hprg1b强表达于流出道,房室通道和流入道处。此时心脏的3D立体图像显示hprg1b只在一部分心肌细胞细胞中表达。流氏细胞仪分析2个月大的Tg（1bEGFP;myl7DSRED）转基因斑马鱼原代心脏细胞发现,hprg1b阳性细胞只占心脏细胞的10.7%,从而提示hprg1b阳性细胞可能是一种特殊的心肌细胞。本文构建了hprg1b过表达质粒pC V/hf,将该质粒转染进入斑马鱼干细胞系Z428中。RT-PCR初步检测发现hprg1b过表达质粒转染1天后Z428细胞中早期心肌细胞标记基因gata4和nkx2.5,心内膜早期标记基因etv2和心肌细胞分化标记基因myh6的表达均出现明显的上调。进一步用ddPCR技术精确定量这四个基因在hprg1b过表达的Z428细胞中的表达变化,发现在hprg1b过表达1天后四个基因的表达与对照组相比均显着上调;2天后,nkx2.5,gata4和myh6的表达均持续增加,但etv2的表达开始下调;第三天,3个心肌细胞标记基因的表达持续上调,但心内膜标记基因etv2却持续下调。由此推断,hprg1b是通过持续诱导心肌细胞早期标记基因的表达,从而调控胚胎干细胞向心肌细胞分化进而调控心脏发育的。三、cxxc5基因在心脏发育中的功能研究CXXC5（CXXC-type zinc-finger protein 5）被报道在其表达的组织中发挥广泛的生理和病理学功能。以往的研究表明CXXC5在心脏中高表达,并且CXXC5与病理性和生理性心肌重构相关,提示CXXC5很可能在心脏发育、心肌分化和心脏疾病的发病机理中发挥重要作用。尽管如此,至今仍缺乏一个直接的证据阐明CXXC5在心脏中的功能。生物信息学分析表明CXXC5的功能结构域在进化上高度保守,因此利用斑马鱼模型探究CXXC5在早期胚胎心脏发育中的功能可为人类早期心脏发育关键调控因子的筛选提供线索。本文利用RT-PCR检测cxxc5基因在斑马鱼早期胚胎中的表达,发现cxxc5在40%外包时起始表达,并持续表达于胚胎与成体斑马鱼中。原位杂交检测cxxc5 mR NA的时空表达模式表明cxxc5在40%外包时表达于卵裂球两侧边缘生心区,在22体节时cxxc5表达于心锥,在24hpf表达于心管,在48hpf表达于心脏。cxxc5的时空表达模式提示cxxc5可能参与调控早期心脏发育。Morpholino敲减cxxc5的表达对心脏发育产生了显着的影响。注射了cxxc5 MO的胚胎约70%表现出环化异常,发育不良和心包水肿的表型。胚胎注射Morpholino后的致死率统计发现,大部分的cxxc5敲减胚胎在第七天死亡。cxxc5MO与cxxc5加帽mR NA共注射可以在一定程度上拯救cxxc5 MO敲减的胚胎表型,说明cxxc5敲减胚胎的表型是由于cxxc5 mRNA表达降低造成的。原位杂交检测心肌标记基因cmlc2的表达,发现24hpf的cxxc5敲减胚胎中cmlc2的表达停留在中线,而并未像野生型一样前端迁移到左眼处。48hpf的cxxc5敲减斑马鱼的心室和心房纵轴间的平均夹角为12°,与野生型的胚胎的平均夹角27°相比显着减小。本文进一步利用Semi-Automated Optical Heartbeat Analysis探究了cxxc5敲减对胚胎心脏的生理学功能的影响。分析表明,cxxc5敲减后,胚胎的心动周期显着延长,心率显着减缓,心脏收缩面积改变率显着减小。由此证明,cxxc5敲减后斑马鱼的心脏功能受损。前期研究表明人类CXXC5与SMADs蛋白（SMAD2,SMAD3）存在相互作用,本文通过生物信息学分析发现人类的CXXC5,SMAD2和SMAD3与斑马鱼中的同源蛋白高度同源。本实验室曾利用COIP和GST-pulldown证明了斑马鱼Cxxc5和Smad2,Smad3的相互作用。于是本文分别检测了TGF-β信号荧光报告质粒CAGA-LUC,BMP信号荧光报告质粒BRE-LUC,和Activin信号荧光报告质粒3TP-LUC在过表达Cxxc5的H9c2细胞中转录活性,结果表明CAGA-LUC和BRE-LUC的荧光活性显着增强,而3TP-LUC的活性没有变化,由此提示cxxc5基因在心肌细胞中影响了TGF-β信号和相关的BMP信号。为了找寻到TGF-β信号中Cxxc5-Smads复合物的靶点,本文分析了几个经典TGF-β信号下游靶基因nkx2.5,gata4,hand2,和has2启动子区域中是否包含MH1结合结构域SBE（Smad-binding element,CAGAC）和CpG岛。结果表明gata4,hand2和has2的启动子中均包含Smad-binding element（CAGAC）位点和CpG岛。RT-PCR分析表明cxxc5敲低的斑马鱼中hand2和has2的表达显着下调。而且胚胎注射hand2加帽mRNA可有效的拯救cxxc5 MO导致的心脏环化缺陷。从而证明cxxc5可能通过TGF-β信号的hand2调控心脏的环化过程。文献报道人类CXXC5基因在先心病患儿术前和术后的表达具有显着差异,本文利用RT-qPCR检测了TOF病人中CXXC5的表达,发现TOF病人中CXXC5 mRNA水平显着下调,提示CXXC5可能是TOF的临床诊断候选靶标分子。上述结果表明,斑马鱼cxxc5是在早期心脏发育中表达的内源性因子,可能在心脏左右不对称的形态建成中发挥重要作用,并且首次在体内证明cxxc5可以通过TGF-β信号调控心脏发育与心脏环化。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细胞培养的研究进展 |
| 1.1.1 鱼类细胞培养的进程 |
| 1.1.2 鱼类细胞培养的方法 |
| 1.1.3 鱼类细胞所需要的培养条件 |
| 1.1.4 鱼类细胞的鉴定 |
| 1.1.5 鱼类细胞系的应用 |
| 1.2 生殖细胞的发育 |
| 1.2.1 鱼类生殖细胞发育的相关因子 |
| 1.2.2 鱼类生殖细胞特异表达基因 |
| 1.3 dazl基因研究进展 |
| 1.3.1 DAZ基因家族的结构和特征 |
| 1.3.2 DAZ家族成员的进化关系 |
| 1.3.3 DAZ家族的相关研究 |
| 1.3.4 鱼类中dazl的表达与功能研究 |
| 1.4 真核启动子 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 系统简介 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 中华鲟五种组织细胞系的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 中华鲟细胞的原代培养 |
| 2.2.4 中华鲟细胞的传代培养 |
| 2.2.5 中华鲟细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.6 中华鲟细胞生长曲线的测定 |
| 2.2.7 中华鲟细胞的染色体分析 |
| 2.2.8 中华鲟细胞18srRNA基因分析 |
| 2.2.9 中华鲟细胞系转染 |
| 2.2.10 中华鲟转基因细胞的构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 中华鲟细胞的原代培养 |
| 2.3.2 中华鲟细胞的传代培养 |
| 2.3.3 中华鲟细胞的冻存和复苏 |
| 2.3.4 中华鲟细胞生长曲线测定 |
| 2.3.5 中华鲟细胞染色体数和核型分析 |
| 2.3.6 中华鲟细胞18SrRNA分析 |
| 2.3.7 中华鲟细胞转染和转基因细胞系的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 青鱼鳍条细胞的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 青鱼鳍条细胞的原代培养 |
| 3.2.4 青鱼鳍条细胞的传代培养 |
| 3.2.5 青鱼鳍条细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.6 青鱼鳍条细胞最适生长条件选择 |
| 3.2.7 青鱼鳍条细胞的染色体分析 |
| 3.2.8 青鱼鳍条细胞分子鉴定 |
| 3.2.9 青鱼鳍条细胞免疫荧光分析 |
| 3.2.10 青鱼鳍条细胞脂质体转染和电转效率分析 |
| 3.2.11 SVCV病毒感染实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 青鱼鳍条细胞的原代培养和传代培养 |
| 3.3.2 青鱼鳍条细胞的冻存和复苏 |
| 3.3.3 青鱼鳍条细胞最适的生长条件 |
| 3.3.4 青鱼鳍条细胞的染色体分析 |
| 3.3.5 青鱼鳍条细胞的分子鉴定 |
| 3.3.6 青鱼鳍条细胞的脂质体转染和电转效率分析 |
| 3.3.7 青鱼鳍条细胞的病毒测试 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 青鱼dazl基因克隆及表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 青鱼dazl基因克隆 |
| 4.2.4 序列比对分析 |
| 4.2.5 青鱼Dazl抗体的制备与验证 |
| 4.2.6 通过sqPCR分析dazlmRNA在不同组织及胚胎发育时期的表达 |
| 4.2.7 通过qRT-PCR定量分析dazlmRNA在不同发育时期胚胎中的表达 |
| 4.2.8 利用原位杂交技术分析dazlmRNA在组织和胚胎发育过程中的分布 |
| 4.2.9 Western blot分析Dazl蛋白在不同组织及胚胎发育不同时期的表达 |
| 4.2.10 免疫组化研究Dazl蛋白在卵巢组织中的空间分布 |
| 4.2.11 青鱼Dazl的亚细胞定位 |
| 4.2.12 青鱼dazl的启动子的扩增 |
| 4.2.13 青鳉dazl基因的的敲除 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 青鱼dazl基因克隆及序列分析 |
| 4.3.2 青鱼Dazl多克隆抗体的制备与验证 |
| 4.3.3 青鱼dazl基因在成体组织中的表达分析 |
| 4.3.4 青鱼dazl在胚胎发育过程中的表达分析 |
| 4.3.5 青鱼Dazl的亚细胞定位 |
| 4.3.6 青鱼dazl启动子克隆 |
| 4.3.7 青鱼dazl启动子活性分析 |
| 4.3.8 青鳉dazl基因的敲除及对青鳉PGCs形成的分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 本论文主要研究结果及创新点 |
| 本论文主要的研究结果 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 引物表 |
| 附录一 引物表(续表) |
| 附录二 质粒图谱 |
| 附录三 发表论文 |
| 致谢 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验一 外源性视黄酸及其抑制剂处理后斑马鱼咽齿发育情况 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1药物处理实验 |
| 1.2.2 原位杂交相关溶液配制 |
| 1.2.3 整胚原位杂交 |
| 1.2.4 茜素红染色 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 外源性RA及DEAB处理后斑马鱼咽齿标记基因表达变化 |
| 2.2 外源性RA及DEAB处理后斑马鱼咽齿发育情况 |
| 3 结论 |
| 实验二 视黄酸信号抑制后神经嵴细胞相关基因表达变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 提取斑马鱼胚胎Total RNA |
| 1.2.2 cDNA合成 |
| 1.2.3 探针合成 |
| 1.2.3.1 探针片段PCR扩增 |
| 1.2.3.2 凝胶电泳回收 |
| 1.2.3.3 TA克隆 |
| 1.2.3.4 DH5α电转感受态制备 |
| 1.2.3.5 电转 |
| 1.2.3.6 质粒筛选、扩增、提取 |
| 1.2.3.7 Dig标记的反义探针制备 |
| 1.2.3.8 探针纯化 |
| 1.2.4 原位杂交 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 成功合成Dig标记的反义探针snail1a、cad |
| 2.2 药物处理后斑马鱼神经嵴细胞标记基因表达变化 |
| 3 结论 |
| 实验三 视黄酸信号合成酶及降解酶过表达鱼构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 亚克隆 |
| 1.2.2 质粒纯化 |
| 1.2.3 显微注射 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 成功构建重组质粒 hsp70l:cyp26b1-GFP 和 hsp70l:aldh1a2-GFP |
| 2.2 成功构建过表达鱼系 hsp:cyp26b1-GFP 和 hsp:aldh1a2-GFP |
| 3 结论 |
| 实验四 视黄酸信号对斑马鱼咽齿再生的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 茜素红染色检测斑马鱼咽齿再生情况 |
| 2.2 共聚焦显微镜观察斑马鱼咽齿再生情况 |
| 3 结论 |
| 实验五 斑马鱼咽齿转基因鱼Tg(scpp5:Dendra2-NTR)构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 抗体染色 |
| 1.2.2 抗体染色相关溶液配制 |
| 1.2.3 PrimerSTAR PCR |
| 2 结果 |
| 2.1 基因scpp5在斑马鱼咽齿的表达情况 |
| 2.2 成功构建重组质粒pBluescript2KS-scpp5-Dendra2-NTR |
| 2.3 抗体染色验证转基因鱼系 Tg(scpp5:Dendra2-NTR)构建成功 |
| 3 结论 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士研究生期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 HEDGEHOG(Hh)信号通路概述 |
| 1.2 Hh信号通路中的G蛋白偶联受体 |
| 1.2.1 SMO作为G蛋白偶联受体的研究 |
| 1.2.2 Gpr161在Hh信号通路中的研究 |
| 1.2.3 前期工作对GRK2 的研究 |
| 1.3 模式生物斑马鱼 |
| 1.3.1 斑马鱼的来源和历史 |
| 1.3.2 斑马鱼作为模式生物的优势 |
| 1.3.3 斑马鱼在Hh信号通路研究中的应用 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 技术 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 Gpr161 的克隆与表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与主要仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验主要试剂及仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 斑马鱼动物材料的获得和常规处理 |
| 2.3.2 生物信息学分析 |
| 2.3.3 斑马鱼胚胎总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2.3.4 载体的构建 |
| 2.3.5 RNA原位杂交探针的合成 |
| 2.3.6 全胚原位杂交实验 |
| 2.3.7 实时定量PCR实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 斑马鱼gpr161 的生物信息学分析 |
| 2.4.2 斑马鱼gpr161 的时空表达分析 |
| 2.4.3 gpr161 各组织差异性分析 |
| 2.4.4 讨论 |
| 第三章 Gpr161 缺失突变体的构建和初步的表型分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与主要仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 显微注射技术 |
| 3.3.2 CRISPR-Cas9 构建斑马鱼突变体 |
| 3.3.3 突变体的鉴定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 突变位点的选择和突变效率的验证 |
| 3.4.2 gpr161 稳定突变体的建立 |
| 3.4.3 突变体鉴定方法的建立 |
| 3.4.4 突变体的表型分析 |
| 3.4.5 讨论 |
| 第四章 Gpr161 缺失突变体在Hh信号通路中的活性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料与主要试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 胚胎的采集和固定 |
| 4.3.2 ptch2,olig2与nkx2.2a探针的构建 |
| 4.3.3 原位杂交染色 |
| 4.3.4 免疫荧光染色 |
| 4.3.5 qRT-PCR分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 gpr161 的缺失不影响Hh通路分子标记的表达以及慢肌纤维的分化 |
| 4.4.2 Gpr161 缺失突变体不改变对于上调Hh通路活性的反应 |
| 4.4.3 Gpr161 缺失突变体不改变抑制HH通路时的反应 |
| 4.4.4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Oct4基因研究进展 |
| 1.1.1 Oct4基因的结构 |
| 1.1.2 Oct4基因的生物学功能 |
| 1.2 绿色荧光蛋白基因研究进展 |
| 1.2.1 绿色荧光蛋白基因的发现及结构及特点 |
| 1.2.2 绿色荧光蛋白基因的应用 |
| 1.3 转基因鱼研究 |
| 1.3.1 转基因动物研究意义及现状 |
| 1.3.2 转基因鱼的制备方法 |
| 1.3.3 Tol2转座子及其应用 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 斑马鱼和红鲫的人工繁殖及胚胎培育 |
| 2.1.1 斑马鱼的人工繁殖及胚胎培育 |
| 2.1.2 红鲫的人工繁殖及胚胎培育 |
| 2.2 斑马鱼oct4基因启动子的获取 |
| 2.2.1 斑马鱼尾鳍DNA提取 |
| 2.2.2 PCR扩增启动子及PCR产物纯化 |
| 2.3 PBLK-oct4-EGFP质粒的构建及鉴定 |
| 2.3.1 限制性内切酶反应 |
| 2.3.2 酶连反应 |
| 2.3.3 重组PBLK-oct4-EGFP质粒的转化 |
| 2.3.4 菌落PCR |
| 2.3.5 测序 |
| 2.3.6 质粒扩增 |
| 2.3.7 小提质粒 |
| 2.4 转座酶mRNA的制备 |
| 2.4.1 pCS-TP质粒酶切 |
| 2.4.2 体外转录 |
| 2.5 显微注射 |
| 2.6 egfp和 oct基因在早期胚胎的表达量检测 |
| 2.6.1 提取及检测总RNA |
| 2.6.2 RNA反转录为c DNA |
| 2.6.3 实时荧光定量PCR |
| 2.7 冰冻切片 |
| 2.8 斑马鱼的雌核发育方法 |
| 2.8.1 红鲫精子的灭活 |
| 2.8.2 斑马鱼的雌核发育及倍性操作 |
| 2.8.3 斑马鱼的雌核发育的鉴定 |
| 2.9 细胞培养 |
| 2.9.1 细胞培养基 |
| 2.9.2 细胞的原代培养 |
| 2.9.3 细胞的传代培养 |
| 2.9.4 细胞的冻存 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 获得PBLK-oct4-EGFP融合蛋白表达载体 |
| 3.1.1 构建PBLK-oct4-EGFP质粒 |
| 3.1.2 TOL2 转座酶m RNA的制备 |
| 3.2 Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼F0 代的建立 |
| 3.2.1 显微注射后斑马鱼胚胎发育观察 |
| 3.2.2 egfp和 oct4 基因在早期胚胎的表达量分析 |
| 3.2.3 转基因斑马鱼F0代的筛选及鉴定 |
| 3.3 Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼雌核发育F1 代纯合体的建立与鉴定 |
| 3.3.1 转基因斑马鱼雌核发育F1代的制备 |
| 3.3.2 转基因斑马鱼雌核发育F1代纯合个体的鉴定.. |
| 3.4 Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼纯合个体尾鳍细胞系的建立 |
| 第四章 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 转座子 |
| 1.1.1 转座子的分类 |
| 1.1.2 DNA转座子的分类 |
| 1.1.3 Tc1/mariner转座子超家族的分类和进化 |
| 1.1.4 转座子的开发应用 |
| 1.2 目前脊椎动物中应用最广泛的转座子 |
| 1.2.1 SB转座子 |
| 1.2.2 PB转座子 |
| 1.2.3 Tol2转座子 |
| 1.3 转座子作为高效增强子捕获基因捕获工具 |
| 1.3.1 增强子的概念 |
| 1.3.2 增强子注释的方法 |
| 1.3.3 转座子作为脊椎动物ET的工具 |
| 1.3.4 三种捕获载体(增强子捕获载体,启动子捕获载体和基因捕获载体) |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第2章 Tc1/mariner超家族中DD41D家族Visitor(VS)的进化分析 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 数据挖掘 |
| 2.1.2 序列和系统发育分析 |
| 2.1.3 VS转座活性分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 VS转座子广泛分布在生物界 |
| 2.2.2 VS的进化动力学分析 |
| 2.2.3 VS转座子的结构特征 |
| 2.2.4 蝙蝠VS的转座活性评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 脊椎动物和哺乳动物中DNA转座子的入侵 |
| 2.3.2 脊椎动物和哺乳动物中DNA转座子的活性 |
| 2.3.3 VS与Tc1/mariner其他家族关系比较 |
| 第3章 斑马鱼基因组转座子的挖掘及进化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 斑马鱼基因组中转座子组成和占比的获得 |
| 3.1.2 进化树的构建 |
| 3.1.3 转座子和转座酶各个结构的预测 |
| 3.1.4 转座子年龄的估计 |
| 3.1.5 转座子拷贝数的统计 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 斑马鱼基因组中转座子的分布及含量 |
| 3.2.2 斑马鱼Tc1/mariner自主转座子的分析 |
| 3.2.3 活性斑马鱼转座子ZB |
| 3.3. 讨论 |
| 3.3.1 斑马鱼基因组中转座子的高丰度 |
| 3.3.2 斑马鱼转座子的多样性 |
| 3.3.3 斑马鱼转座子进化动力学比较 |
| 第4章 ZB转座子在哺乳动物细胞中的转座特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 ZB转座子和转座酶载体的构建 |
| 4.1.2 细胞培养 |
| 4.1.3 高剂量转座子浓度下,不同转座子转座活性的比较 |
| 4.1.4 低剂量转座子浓度下,不同转座子的转座活性比较 |
| 4.1.5 ZB转座子的转座“足迹” |
| 4.1.6 制备ZB转座子文库及Illumina sequencing |
| 4.1.7 插入位点分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 ZB转座子与SB,PB,Tol2转座子的转座效率比较 |
| 4.2.2 ZB和SB转座子的交互作用 |
| 4.2.3 ZB转座子通过“剪切和粘贴”机制进人类基因组 |
| 4.2.4 ZB转座子的插入偏好 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 ZB转座子在人细胞中的高活性 |
| 4.3.2 转座酶越多,转座效率越低 |
| 4.3.3 ZB转座后留下足迹 |
| 4.3.4 ZB转座子的整合偏好 |
| 第5章 ZB转座子在斑马鱼中的增强子捕获应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物及试剂 |
| 5.1.2 斑马鱼增强子捕获载体的构建 |
| 5.1.3 斑马鱼显微注射 |
| 5.1.4 转座子在斑马鱼基因组中整合位点的鉴定 |
| 5.1.5 斑马鱼增强子的预测 |
| 5.1.6 克隆潜在增强子至增强子验证载体 |
| 5.1.7 斑马鱼整胚原位杂交(WISH)及潜在增强子的转录分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 ZB和Tol2介导的增强子捕获效率比较 |
| 5.2.2 ZB介导的斑马鱼增强子捕获品系的注解 |
| 5.2.3 Tol2介导的斑马鱼增强子捕获品系的注解 |
| 5.2.4 潜在增强子的转录活性检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 转座子在转基因斑马鱼中的应用 |
| 5.3.2 ZB转座子可产生转基因斑马鱼 |
| 5.3.3 ZB倾向产生单一表型的斑马鱼后代 |
| 5.3.4 ZK系斑马鱼潜在增强子的注解 |
| 5.3.5 潜在增强子的实验验证 |
| 5.3.6 增强子可以转录出增强子RNA(eRNA) |
| 第6章 ZB转座子在小鼠增强子捕获中的应用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验动物及饲养 |
| 6.1.2 小鼠增强子捕获载体和SB转座子介导的ZB转座酶表达载体的构建 |
| 6.1.3 sp-PCR鉴定小鼠插入位点 |
| 6.1.4 双转基因公鼠(突变体库)的制备 |
| 6.1.5 小鼠潜在增强子的预测 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 ZB转座子制备转基因小鼠 |
| 6.2.2 ZB转座子用于精子突变体库的构建 |
| 6.2.3 增强子捕获小鼠品系的注解 |
| 6.2.4 荧光小鼠的增强子注解 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 ZB转座子可产生转基因小鼠 |
| 6.3.2 小鼠后代中可产生突变小鼠 |
| 6.3.3 荧光小鼠的增强子预测 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 VS在生物界中的分布汇总 |
| 附录二 斑马鱼中自主和非自主转座子汇总 |
| 攻读学位期间获得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 铜概述 |
| 1.1.1 水体中的铜及铜污染 |
| 1.1.2 铜的生物学功能 |
| 1.1.3 铜对生物体发育的影响 |
| 1.1.4 铜对神经系统的影响 |
| 1.2 神经系统发育 |
| 1.2.1 神经系统的形成 |
| 1.2.2 神经系统的结构 |
| 1.2.3 轴突发育 |
| 1.2.4 髓鞘发育 |
| 1.3 神经发育相关的信号通路 |
| 1.3.1 Wnt信号通路 |
| 1.3.2 Notch信号通路 |
| 1.4 甲基化研究 |
| 1.4.1 DNA甲基化 |
| 1.4.2 DNA甲基化与逆境胁迫 |
| 1.4.3 DNA甲基化对神经系统的影响 |
| 1.5 斑马鱼简介 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 所用载体和菌株 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要实验试剂 |
| 2.2 重金属铜胁迫 |
| 2.3 透射电子显微镜技术 |
| 2.4 电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) |
| 2.5 运动行为检测 |
| 2.6 显微注射 |
| 2.7 RNA抽提 |
| 2.8 总cDNA的合成 |
| 2.9 荧光定量PCR |
| 2.10 质粒构建 |
| 2.10.1 探针质粒的构建 |
| 2.10.2 启动子缺失片段质粒的构建 |
| 2.11 反义mRNA探针的合成 |
| 2.12 胚胎整体原位杂交 |
| 2.13 转录组分析 |
| 2.13.1 基因芯片 |
| 2.13.2 转录组测序 |
| 2.14 胚胎总蛋白的提取 |
| 2.15 Western blot分析 |
| 2.16 基因组DNA提取 |
| 2.17 基因组甲基化检测 |
| 2.17.1 基因组甲基化测序 |
| 2.17.2 基因组DNA硫化处理 |
| 2.17.3 PCR验证 |
| 2.18 CRISPR/Cas9 基因编辑技术建立突变体 |
| 2.18.1 gRNA靶位点的选择和确认 |
| 2.18.2 gRNA合成 |
| 2.18.3 Cas9 mRNA的合成 |
| 2.19 突变体筛选 |
| 2.19.1 F0靶点突变效率检测 |
| 2.19.2 F0的可遗传筛选 |
| 2.19.3 筛选携带靶位点突变的F1成鱼 |
| 2.19.4 筛选携带靶位点突变的F2成鱼 |
| 2.20 细胞实验 |
| 2.20.1 细胞的培养与传代 |
| 2.20.2 细胞的冻存及复苏 |
| 2.20.3 细胞转染及双荧光素酶活性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 铜对斑马鱼胚胎发育的影响 |
| 3.2 铜的生物学效应 |
| 3.2.1 铜胁迫对斑马鱼神经和肌肉发育的影响 |
| 3.2.2 铜对斑马鱼胚胎的剂量效应 |
| 3.2.3 铜胁迫斑马鱼胚胎的转录组分析 |
| 3.3 铜对髓鞘细胞及轴突生长的影响 |
| 3.4 铜调控神经发育的信号因子的鉴定 |
| 3.5 Hoxb5b基因对胚胎神经发育方面的功能研究 |
| 3.5.1 Hoxb5b基因功能缺失对胚胎发育的影响 |
| 3.5.2 Hoxb5b基因功能缺失对髓鞘和轴突的影响 |
| 3.5.3 Hoxb5b过表达对铜胁迫幼鱼髓鞘和轴突发育的影响 |
| 3.6 铜调控神经发育的信号通路的鉴定 |
| 3.7 Wnt和 Notch信号通路在铜胁迫髓鞘和轴突发育缺陷胚胎中的功能研究 |
| 3.7.1 Wnt和 Notch信号通路的激活对铜胁迫后hoxb5b的影响 |
| 3.7.2 Wnt信号通路的激活对铜胁迫后髓鞘和轴突发育的影响 |
| 3.7.3 Notch信号通路的激活对铜胁迫后髓鞘和轴突发育的影响 |
| 3.8 铜胁迫斑马鱼胚胎的甲基化分析 |
| 3.8.1 铜胁迫斑马鱼胚胎的甲基化特征 |
| 3.8.2 铜胁迫胚胎高甲基化基因的转录表达特征 |
| 3.8.3 铜胁迫斑马鱼胚胎高甲基化基因与其转录表达的相关性 |
| 3.9 Fam168a和 fam168b在斑马鱼髓鞘发育中的功能研究 |
| 3.9.1 Fam168a和 fam168b在斑马鱼胚胎中的表达模式 |
| 3.9.2 fam168a和 fam168b突变体的构建 |
| 3.9.3 fam168a和 fam168b基因敲降胚胎的转录组分析 |
| 3.9.4 fam168a和 fam168b功能缺失对髓鞘和轴突发育的影响 |
| 3.10 转录因子hoxb5b与表观调控因子在胚胎发育中调控关系的鉴定 |
| 3.11 铜胁迫对铜转运突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
| 3.11.1 铜胁迫对cox17~(-/-)突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
| 3.11.2 铜胁迫对atp7a~(-/-)突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
| 3.11.3 铜胁迫对atp7b~(-/-)突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 铜导致斑马鱼胚胎CNS髓鞘和轴突发育缺陷 |
| 4.2 铜通过下调Wnt&Notch-hoxb5b诱导斑马鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷 |
| 4.3 铜诱导的fam168/pou3f1 DNA高甲基化及其转录水平下调促进髓鞘发育缺陷的形成 |
| 4.4 铜诱导的fam168b高甲基化及其转录水平下调之间的调控关系 |
| 4.5 铜通过cox17/atp7b调控Wnt/Notch-hoxb5b及表观调控因子fam168a/fam168b/pou3f等诱导髓鞘和轴突发育缺陷 |
| 4.6 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1 研究问题的由来 |
| 2 纳米银的生物学效应 |
| 3 斑马鱼神经系统发育及代谢途径过程 |
| 3.1 运动调节神经回路 |
| 3.2 晶状体的发育 |
| 3.3 糖酵解代谢途径 |
| 4 模式生物斑马鱼简介 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第二章 纳米银破坏斑马鱼胚胎的神经回路进而诱导异常的触碰响应 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 所用载体和菌株 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纳米银溶液、上清溶液、银离子溶液的制备 |
| 2.2.2 斑马鱼胚胎胁迫处理和注射处理 |
| 2.2.3 触碰响应分析 |
| 2.2.4 电生理检测 |
| 2.2.5 斑马鱼胚胎RNA的提取 |
| 2.2.6 总cDNA的合成 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 反义mRNA探针的合成 |
| 2.2.9 斑马鱼胚胎整体原位杂交 |
| 2.2.10 基因芯片(Microarray)分析表达谱 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 纳米银胁迫处理的斑马鱼胚胎发生延迟的触碰响应 |
| 3.2 纳米银胁迫的胚胎中神经元膜电位变化 |
| 3.3 Microarray分析揭示了纳米银胁迫的胚胎中神经发生相关基因的下调表达 |
| 3.4 运动神经元基因isl1和isl2a在纳米银胁迫的胚胎中动态表达 |
| 3.5 纳米银胁迫的胚胎中多巴胺能神经元标记物基因gad1b和 gad2 显着下调 |
| 3.6 其他神经相关基因在纳米银胁迫的胚胎中动态表达 |
| 3.7 纳米银胁迫对胚胎神经祖细胞基因表达的影响 |
| 3.8 L-半胱氨酸恢复纳米银胁迫的胚胎中神经发生相关基因的表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 纳米银损伤胚胎的触碰响应和神经元电兴奋性 |
| 4.2 纳米银主要通过破坏神经回路诱导功能失调的运动行为 |
| 4.3 纳米银主要通过释放的离子诱导胁迫胚胎的神经回路的缺陷 |
| 5 小结 |
| 第三章 纳米银影响斑马鱼晶状体而不是视网膜的发育 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纳米银溶液、上清溶液、银离子溶液的制备 |
| 2.2.2 斑马鱼胚胎胁迫处理和注射处理 |
| 2.2.3 晶状体表型的观察 |
| 2.2.4 冰冻切片 |
| 2.2.5 苏木精-伊红染色(H&E)染色 |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.2.7 细胞凋亡的免疫荧光检测 |
| 2.2.8 细胞增殖的免疫荧光检测 |
| 2.2.9 RNA出核的免疫荧光检测 |
| 2.2.10 斑马鱼胚胎RNA的提取 |
| 2.2.11 总cDNA的合成 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR |
| 2.2.13 反义mRNA探针的合成 |
| 2.2.14 斑马鱼胚胎整体原位杂交 |
| 2.2.15 基因芯片分析表达谱 |
| 2.2.16 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 纳米银胁迫的胚胎中眼睛发育缺陷 |
| 3.2 Microarray分析纳米银处理的胚胎中眼睛发育相关基因表达差异 |
| 3.3 纳米银胁迫的胚胎中视网膜细胞正常分化和特化 |
| 3.4 纳米银影响斑马鱼胚胎晶状体的发育 |
| 3.5 纳米银胁迫的胚胎中眼部细胞凋亡和mRNA的正常表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 纳米银诱导晶状体而非视网膜发育异常 |
| 4.2 纳米银通过抑制晶体蛋白表达导致鱼类晶状体白内障 |
| 4.3 纳米银并不是通过诱导细胞凋亡或抑制mRNA的输出破坏晶状体的发育 |
| 5 小结 |
| 第四章 纳米银胁迫斑马鱼胚胎发育过程中的代谢研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纳米银溶液、上清溶液、银离子溶液的制备 |
| 2.2.2 斑马鱼胚胎胁迫处理和注射处理 |
| 2.2.3 酶活性和丙酮酸含量测定 |
| 2.2.4 冰冻切片 |
| 2.2.5 细胞凋亡的免疫荧光检测 |
| 2.2.6 细胞增殖的免疫荧光检测 |
| 2.2.7 斑马鱼胚胎RNA的提取 |
| 2.2.8 总cDNA的合成 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 反义mRNA探针的合成 |
| 2.2.11 斑马鱼胚胎整体原位杂交 |
| 2.2.12 基因芯片分析表达谱 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 纳米银影响早期斑马鱼胚胎代谢相关基因的表达模式 |
| 3.2 纳米银胁迫的胚胎中糖酵解代谢的改变 |
| 3.3 验证酪氨酸途径基因在纳米银胁迫的胚胎中差异表达 |
| 3.4 验证β-丙氨酸代谢途径基因在纳米银胁迫的胚胎中差异表达 |
| 3.5 纳米银胁迫不影响胚胎躯干肌细胞中的细胞凋亡和增殖 |
| 3.6 纳米银胁迫不影响胚胎中躯干肌祖细胞的特化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 纳米银胁迫的胚胎代谢发生异常 |
| 4.2 下调的代谢信号可能诱导纳米银胁迫的胚胎中肌原纤维形成异常和运动功能失调 |
| 4.3 纳米银颗粒和释放的离子可能对斑马鱼代谢途径有不同的影响 |
| 5 小结 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 斑马鱼脊柱畸形突变体的筛选及致病基因功能研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 软骨毛发发育不良的斑马鱼模型构建及发病机制的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CATSHL综合征的斑马鱼模型构建及致病机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 斑马鱼模型在骨骼相关疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景和文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 斑马鱼心脏发育过程 |
| 1.3 斑马鱼作为模式动物的优点 |
| 1.4 斑马鱼心脏发育和人类疾病 |
| 1.5 左右不对称发育 |
| 1.5.1 左右不对称决定 |
| 1.5.2 左右极性的强化 |
| 1.6 纤毛在调控心脏左右不对称发育中的作用 |
| 1.7 心脏瓣膜的建成 |
| 1.8 Had31基因背景介绍 |
| 1.9 fhl1A基因背景介绍 |
| 1.10 本文的研究目标与研究意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 菌株和质粒: |
| 2.1.3 主要溶液 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斑马鱼组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 合成cDNA |
| 2.2.3 PCR反应 |
| 2.2.4 PCR产物和线性化载体的纯化回收 |
| 2.2.5 无缝克隆 |
| 2.2.6 转化(热休克法) |
| 2.2.7 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 合成RNA探针 |
| 2.2.10 斑马鱼胚胎整体原位杂交 |
| 2.2.11 质粒的小量制备 |
| 2.2.12 无内毒素质粒的小量制备 |
| 2.2.13 Western blot |
| 2.2.14 双荧光素酶报告系统 |
| 2.2.15 斑马鱼基因组提取 |
| 2.2.16 斑马鱼morpholino技术 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 斑马鱼Had31基因的功能研究 |
| 3.1.1 用于合成mRNA质粒的构建 |
| 3.1.2 荧光素酶报告质粒和相关过表达质粒的构建 |
| 3.1.3 斑马鱼morpholino有效性鉴定质粒的构建 |
| 3.1.4 转录产物得到的电泳图片 |
| 3.1.5 斑马鱼Had31的表达谱分析 |
| 3.1.6 斑马鱼Had31敲除品系的鉴定 |
| 3.1.7 敲除Had31导致斑马鱼胚胎整体形态出现畸形 |
| 3.1.8 敲除Had31导致成年斑马鱼整体形态出现畸形 |
| 3.1.9 Had31敲除纯合突变体不育 |
| 3.1.10 敲除Had31导致斑马鱼心脏出现线性化的表型 |
| 3.1.11 敲除Had31不影响斑马鱼心房和心室分化 |
| 3.1.12 敲除Had31导致斑马鱼左右不对称标记基因表达紊乱 |
| 3.1.13 斑马鱼Had31 Morpholinos有效性的分析 |
| 3.1.14 敲减Had31导致的斑马鱼胚胎整体形态表型 |
| 3.1.15 敲减Had31导致斑马鱼心脏线性化的表型 |
| 3.1.16 敲减Had31不影响斑马鱼心房和心室的分化 |
| 3.1.17 敲减Had31导致斑马鱼左右不对称标记基因表达紊乱 |
| 3.1.18 斑马鱼Had31基因影响早期心肌细胞的迁移 |
| 3.1.19 Had31在心脏原基左侧通过Nodal-Pitx2信号通路调控左右不对称发育 |
| 3.1.19.1 斑马鱼Nomo、Spaw和Prrx1a Morpholinos的有效性分析 |
| 3.1.19.2 Nomo抑制办Spaw在侧板中胚层的表达 |
| 3.1.19.3 Had31位于中线左侧Nodal信号的下游 |
| 3.1.19.4 Had31位于中线左侧Nodal信号的下游 |
| 3.1.19.5 Had31位于中线左侧信号成员Pitx2的上游并激活Pitx2的表达 |
| 3.1.19.6 过表达Pitx2拯救Had31的突变表型 |
| 3.1.19.7 Spaw激活Pitx2的表达 |
| 3.1.19.8 Nomo抑制渐Pitx2的表达 |
| 3.1.20 Had31在心脏原基左侧通过BMP4-Prrx1a信号通路调控左右不对称发育 |
| 3.1.20.1 斑马鱼BMP4激活Prrx1a的表达 |
| 3.1.20.2 Had31位于中线右侧BMP4信号的下游 |
| 3.1.20.3 Had31抑制Prrx1a在左右侧板中胚层的表达 |
| 3.1.20.4 敲减Prrx1a拯救Had31的突变表型 |
| 3.1.20.5 Nomo激活Prrx1a在左右侧板中胚层的表达 |
| 3.1.20.6 BMP4抑制Pitx2的表达 |
| 3.1.20.7 Spaw抑制Prrx1a的表达分析 |
| 3.1.21 Had31调控心脏左右不对称发育信号的双荧光报告分析 |
| 3.1.22 敲除Had31导致斑马鱼房室瓣膜异常表型 |
| 3.1.23 讨论 |
| 3.2 斑马鱼fhl1A基因的功能研究 |
| 3.2.1 敲除fhl1A导致斑马鱼房室瓣膜异常表型 |
| 3.2.2 讨论 |
| 第四章 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间发表的主要论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景和文献综述 |
| 1.1 斑马鱼心脏发育概述 |
| 1.2 脊椎动物心脏发育的分子调控 |
| 1.2.1 GATA转录因子调控心脏祖细胞的迁移和心肌细胞分化命运 |
| 1.2.2 hand2 调控心脏细胞分化和形态建成 |
| 1.2.3 NKX2.5 维持心脏腔室的特性 |
| 1.2.4 Tbx20 对心祖细胞形成是必须的 |
| 1.2.5 诱导心脏祖细胞的信号通路 |
| 1.3 斑马鱼模型与人类先天性心脏病的研究 |
| 1.3.1 转基因斑马鱼技术 |
| 1.3.2 Morpholino基因敲减技术 |
| 1.3.3 基因敲除技术 |
| 1.4 本文的研究目的 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂与材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器与软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1常规分子生物学实验 |
| 2.2.2 动物实验技术与方法 |
| 第三章 tmp3 基因在心脏发育中的功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 tmp3 在斑马鱼胚胎心脏发育中的时空表达分析 |
| 3.2.2 tmp3 基因敲除斑马鱼品系的建立 |
| 3.2.3 tmp3 基因敲除导致斑马鱼心脏发育畸形 |
| 3.2.4 tmp3 基因调控心祖细胞的增殖 |
| 3.2.5 跨膜蛋白TMP3 的入核机制探究 |
| 3.2.6 tmp3 靶向gata4 调控早期心脏发育 |
| 3.2.7 TMP3 基因的缺陷与人类法洛氏四联症相关 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 hprg1b基因在心脏发育中的功能研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 hprg1b在斑马鱼胚胎心脏发育中的时空表达 |
| 4.2.2 hprg1b在早期胚胎心脏中的定位 |
| 4.2.3 hprg1b阳性心脏细胞类型鉴定 |
| 4.2.4 hprg1b阳性细胞在斑马鱼心脏中所占比值的测定 |
| 4.2.5 hprg1b过表达对斑马鱼干细胞分化命运的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 cxxc5 基因在心脏发育中的功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 cxxc5 基因在早期斑马鱼胚胎发育中的时空表达分析 |
| 5.2.2 敲减cxxc5 基因的表达导致斑马鱼心脏环化畸形 |
| 5.2.3 cxxc5 基因通过TGF-β信号调控斑马鱼心脏的环化发育 |
| 5.2.4 CXXC5 基因的缺陷与人类法洛氏四联症的相关性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 其它研究心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
