郭明哲[1]（2019）在《丙型肝炎病毒复制子新型构建方法的建立及基因3a、6a型病毒株耐药性的研究》文中研究说明HCV（Hepatitis C virus,HCV）丙型肝炎病毒是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒。HCV在全球总人口的大约百分之一中以慢性感染的形式存在,因此HCV感染一直以来是一个沉重的社会负担。近年来直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAA）的出现使得HCV病人的治疗得到极大的改观。但临床资料显示DAA的耐药突变的产生仍是一个严峻的问题。绝大多数HCV病人样品中的HCV病毒无法在体外的肝癌细胞系中建立高效的感染,该现象的分子机制仍未被完全阐明。第一个高效的HCV体外感染模型在2005年由三个实验室同时创建并都依赖了JFH1（Japanese fulminant hepatitis1）共有序列。但迄今为止,JFH1共有序列是唯一一个不需要任何额外改变就能在肝癌细胞系中建立高效感染的HCV序列。由于共有序列无法反映出体内复制HCV序列的真实状态,因此我们拟通过筛选HCV病人血清中准种序列的方法来提高获得具有复制能力序列的可能性。为此我们建立了一种高效的构建HCV复制子cDNA文库的方法,并在稳定表达Sec14L2的Huh7.5.1细胞系中测试了多种基因型HCV复制子cDNA文库的集落形成能力。通过上述的功能筛选策略,我们成功地获得了基因1b,3a,6a型的HCV复制子克隆细胞,而且我们所获得的亚克隆HCV复制子cDNA都有较强的复制能力。后续的序列分析表明每个复制子细胞克隆中都含有不同数量的来自于准种序列的突变,因此我们的实验结果证明来自于准种序列的多样性可以帮助HCV病毒株在肝癌细胞系中复制。使用DAA疗法的基因3型病人的SVR（Sustained virological response）显着低于其他基因型。这个临床现象中比较重要的一个原因是基因3型HCV拥有天然的NS3 DAA耐药性。我们通过基因3a型复制子PR87A7研究了基因3型NS3168Q所介导的NS3 DAA耐药性。并且通过在基因2型的JFH1复制子中引入NS3 168Q及相关位点研究了NS3 168Q稳定存在的分子机制。我们发现NS3168Q的稳定存在需要NS3蛋白酶中其他残基的帮助,其中包括123T。研究显示索磷布韦耐药位点NS5B S282T可以在基因6型病人的基线序列中以较高的频率出现,因此基因6型HCV病毒株中产生索磷布韦耐药突变的壁垒可能低于其他基因型的HCV毒株。为了证明我们的假设,我们研究了基因6a型复制子PR58C4针对索磷布韦的耐药特性,结果显示PR58C4产生NS5B S282T的分子壁垒显着低于基因1b型的Con1复制子。NS5B S282T的产生导致了PR58C4对索磷布韦处理的敏感型的降低,并且NS5B K535R与NS5B S282T的同时存在可能提高了后者的耐药表型。综上所述,我们的研究建立了一种可以用于多种基因型HCV病人样本的复制子构建方法。基因1b型PR50,基因3a型PR87,基因6a型PR58复制子克隆的成功建立证明了我们上述功能筛选策略的通用性及有效性。在基因3a型PR87的耐药研究中,我们的结果对理解HCV耐药突变的产生与病毒复制能力维持之间的平衡提供了新的思路。在基因6a型PR58的索磷布韦耐药研究中,我们发现其产生NS5B S282T耐药突变的分子壁垒较低,同时发现了一个可以提高S282T耐药能力的突变K535R,这对理解临床中复杂耐药性的产生有重要意义。
纪伟[2]（2019）在《HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究》文中研究说明丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）引起的一种主要经血液传播的传染病,呈世界性流行。根据世界卫生组织报告,全球丙型肝炎的流行率平均为3%,估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,每年新增感染者300万-400万例,死亡25万例,占所有传染病死因的第10位。丙型肝炎已经成为困扰全球公共卫生的一个重要问题。目前,由于HCV基因的多样性以及缺乏理想的动物和细胞感染模型,HCV疫苗研究仍面临很多难题。T细胞免疫在急性HCV感染中病毒是否能自发清除起到关键作用。研究表明,在自限性HCV感染的患者或黑猩猩中发生了强烈的HCV特异性CD8+T细胞应答,但在慢性感染的宿主中观察到较弱CD8+T细胞应答。为了探究T细胞在HCV感染自然进程中的特征,及T细胞免疫与疾病进程的相关性,我们招募河北省某村因献血感染HCV的聚集性人群为研究对象,其中的HCV感染者是1970-1990年左右因献血感染,没有接受过任何治疗。我们用NS3蛋白overlapping多肽库体外刺激PBMC,通过流式分析T细胞细胞因子分泌、记忆细胞分型及抑制性分子表达等,探究T细胞免疫在HCV病毒清除组和慢性感染组的特征及差异。结果表明,病毒清除组的CD8+T和CD4+T细胞因子分泌能力显着高于慢性感染组和健康对照组。两组HCV特异性CD8+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和效应性T细胞为主（TEMRA）,而HCV特异性CD4+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和中心记忆T细胞（TCM）为主。在抑制性分子的表达分析中,慢性感染者病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达以PD-1高、TIM-3高表达为主要特征,其与以AST或ALT水平异常和形态病理学变化为特征的肝损伤相关。有趣的是,LAG-3在慢性感染者CD8+T细胞上的表达较低,与ALT或AST呈负相关。我们对长时期的HCV感染者的病毒特异性T细胞免疫的特征进行了研究,并有助于阐明免疫应答在相关临床过程中的作用。同时,我们也对慢性感染者感染的HCV病毒进行了分子水平的研究工作。我们对其感染的HCV病毒通过分子生物学实验进行基因分型,并利用一代测序和二代测序手段获得26条全基因组序列。根据基因分型结果,这些感染者感染的是HCV1b（17）、HCV2a（9）两种基因型。对于一代测序的全基因序列,我们根据MEGA7.0的进化距离分析发现,HCV1b间及HCV2a间的序列都有很高的同源性。通过与国内外序列进行系统发育进化树分析,HCV2a的序列相对聚集,聚集在一个独立的分支上,与国外测得的NDM228等株亲缘关系相对较近。HCV1b的17条序列相对分散。对各蛋白编码区也进行了系统进化分析,结果同全基因序列的分析基本一致。通过二代测序,我们获得的信息有原始reads、拼接序列、每条序列每个位点的测序深度、entropy、mutrate等。26条序列的拼接工作已经完成,数据分析还在进行中。我们在病毒“准种”、重要的T细胞表位和中和抗体表位的免疫逃逸突变等角度进行分析,结合临床数据,探究其与肝脏损伤程度的相关性。另外,MHC分子结构在T细胞免疫研究中起了很重要的作用。MHC分子可以限制TCR对多肽的识别,而且多肽与MHC之间的构象协调作用对于TCR的识别至关重要。如果将构像改变的关键氨基酸突变,就会导致pMHC复合物与TCR的结合变弱。同一 MHC-多肽可以被不同TCR识别,MHC-多肽复合物的柔性变化也是TCR可以交叉识别的原因之一。可以看出,MHC-多肽的结合能力以及它们的构象变化影响了TCR识别。我们通过对H-2Kd-HBV peptide复合物分子结构的分析,并结合HLA-B*4001的结构解析及分析,发现两个复合物结构中都有在一个带正电的氨基酸R和负电氨基酸E构成的两种不同形式的盐桥参与MHC与多肽的结合。我们对两个氨基酸进行了单突变和双突变,通过refolding、CD检测MHC与多肽结合的稳定性,以及H-2Kdtetramer对HBV特异性CD8+T的识别,结果证明了盐桥氨基酸的突变影响了多肽与MHC分子的结合能力及多肽-MHC复合物对TCR的识别。综上所述,本研究探究了 T细胞免疫在HCV感染自然进程中的特征和T细胞免疫与肝脏损伤程度的相关性,并对感染者感染的HCV病毒全序列进行了分析。另外,我们基于H-2Kd-HBV peptide HBc87-95和 HLA-B*4001-SARS N216-225复合物结构发现了盐桥在MHC与多肽结合及MHC-多肽复合物对TCR识别的重要性。该研究工作对HCV和HBV的预防和治疗具有一定的提示性和指导性。
郑峰伟[3]（2017）在《猪瘟病毒非结构蛋白3的结构解析与功能研究》文中认为猪瘟（classical swine fever,CSF）是猪的一种高度致死性传染病,其病原体猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）为黄病毒科瘟病毒属成员。CSFV的基因组为正义的单股线状RNA,大小约12.3 kb,由两端的非翻译区（nontranslated region,NTR）和中间一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）构成。其ORF编码一条大的多聚蛋白（polyprotein）,Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B,经细胞和/或病毒编码的蛋白酶加工产生12种成熟的蛋白。其中非结构蛋白3（nonstructural protein 3,NS3）为一种多功能的蛋白,在病毒基因组复制和感染性病毒的产生中具有重要作用。本论文研究了 CSFV NS3的结构与功能,主要获得了以下成果:采用原核表达系统表达纯化了全长的NS3,在其N端融合了 NS3蛋白酶辅因子 NS4A 的多肽片段（NS4A protease cofactor segment,NS4APCS）,以下称为NS4APCS-3。将NS3丝氨酸蛋白酶活性位点突变（S163A）,构建了 NS3蛋白酶自切割活性丧失的突变体NS4APCS-3S163A。通过大肠杆菌大量表达,亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析进行分离纯化,制备了高纯度的NS4APCS-3S163A蛋白,经结晶初筛和条件优化,得到了高质量的八面体状晶体。经过X-ray衍射数据收集、分子置换和模型优化,解析出了 2.35 A的NS4APCS-3S163A晶体结构。发现了一个新的闭合式构象（closed conformation）,其C末端的5个氨基酸插入蛋白酶的活性口袋,类似于一种NS3-NS4A顺式切割（cis-cleavage）后的状态,且蛋白酶结构域位于解旋酶结构域的背面,主要与解旋酶结构域3相互作用,形成了一个大小约2200 A2的分子内相互作用界面;在NS3表面发现了一个连续的碱性区,推测可能参与解旋酶对底物的结合,尤其是蛋白酶表面的碱性区,暗示NS3蛋白酶对解旋酶刺激作用的分子机制。基于全长NS3的结构分析,将NS3分子内主要的界面相互作用分成3簇,第一簇包含了蛋白酶活性位点P侧（P-side）与解旋酶结构域3 C末端（残基679-683）的相互作用;第二簇包含了三个离子键和边缘的一个疏水性帽子;第三簇由蛋白酶N端桶状结构（N-barrel）的β7b-β8发卡结构,解旋酶结构域3的loop（残基559-563）和解旋酶结构域D2-D3 linker形成。针NS3界面的三簇相互作用,设计了 3组突变,分别引入NS3表达质粒和CSFV全长感染性克隆,研究了界面氨基酸突变对NS3 ATPase和helicase活性的影响,及对CSFV复制和蚀斑形成能力的影响。结果表明,界面突变导致NS3解旋酶活性出现不同程度的下降,但其ATPase活性却不受影响;病毒学试验表明,界面突变会显着降低感染性病毒的产生,病毒的蚀斑形成能力也显着下降。进一步对蛋白酶结构域表面参与形成连续碱性区的4个氨基酸进行突变研究。分别将H24（位于NS4APCS）,R50,K74,K94（位于NS3蛋白酶）突变为非极性的丙氨酸和酸性的天冬氨酸后,突变体NS3的ATPase活性不受影响,而helicase活性普遍下降;基于CSFV感染性克隆的突变分析表明,NS3蛋白酶结构域表面碱性氨基酸突变显着降低了 CSFV基因组的复制和感染性病毒的产生。以上结果暗示CSFV NS3蛋白酶结构域表面碱性区通过与RNA的结合在基因组复制的调节中发挥作用。我们的研究结果有助于加深对CSFV NS3结构与功能的关系以及NS3在病毒基因组复制和感染性病毒产生中作用机制的理解,为阐明CSFV的致病机制和发展疾病防治新技术提供了新的理论依据。
张坤[4]（2017）在《大麦条纹花叶病毒γb蛋白在病毒复制和运动中的新功能解析》文中进行了进一步梳理病毒的基因组相对较小,蛋白编码能力有限,而病毒的侵染、复制、移动、致病等过程均需要一种或者几种病毒蛋白的直接参与。在寄主与病毒长期地共进化过程中,病毒蛋白逐渐进化出同时具有多种功能的特性,并参与病毒侵染循环的不同过程。大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus,BSMV）是一种ss（+）RNA病毒,基因组由α、β和γ3条RNA链组成。RNAα编码的αa蛋白具有解旋酶（HEL）和甲基转移酶（MET）结构域,是病毒的复制酶大亚基;RNAβ编码病毒的外壳蛋白CP和病毒的运动相关蛋白TGBs,RNAy编码的γa具有保守的GDD基序,是病毒的复制酶小亚基。γb是一个分子量为17 kDa的富含半胱氨酸的蛋白,具有致病决定因子、种传相关因子、本生烟上的系统运动决定因子和基因沉默抑制子等多种功能,但其与BSMV其它蛋白间的相互作用并协同调控病毒的复制和运动的研究尚未见报道。前人的研究表明,在BSMV侵染的条件下γb蛋白主要定位于细胞质中,部份能特异性的定位于叶绿体上,但是关于其叶绿体定位的生物学功能却是未知的。为此,利用瞬时表达、Pumilio为基础的ssRNA可视化定位系统、dsRNA可视化定位系统等,在激光共聚焦显微镜（CLSM）下观察到病毒的复制酶αa和γa、病毒的（+）RNA、复制过程中产生的（-）RNA及dsRNA复制中间体均能定位于叶绿体,通过实验证据明确了叶绿体是BSMV的主要复制位点。通过酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）及免疫共沉淀（Co-IP）等技术,首次证明γb蛋白与复制酶αa在体内直接互作,yb被αa招募至病毒的复制位点,互作的关键区域分别为yb蛋白的coiled-coil区（aa 86-127）和复制酶αa的甲基转移酶结构域（aa 1-834）。通过分析γb蛋白缺失或者突变后病毒的复制积累量,以及顺式或反式表达番茄丛矮病毒（TBSV）抑制子p19均不能回补由于γb蛋白的缺失或者突变造成的BSMV复制缺陷等实验,首次发现γb蛋白具有促进病毒复制的新功能,且该功能与其基因沉默抑制子的活性关系不大;通过体外dsRNA解旋酶活性等实验证明γb蛋白促进复制酶αa的解旋酶活性,且该促进作用完全依赖于其ssRNA结合活性。γb蛋白通过与复制酶αa直接互作被招募至BSMV主要复制场所叶绿体、以及作为解旋酶增强子促进病毒复制这些新功能的发现增加了我们对病毒编码的基因沉默抑制子多功能性的进一步认识。作为在本生烟上的系统运动决定因子,γb蛋白参与BSMV运动的具体形式及其调控机制并不清楚。通过分析缺失γb蛋白的BSMV突变体在本生烟和大麦上的运动效率及其致病性,证明了BSMV在不同的寄主植物的运动中对于γb蛋白的需求是不同的,即双子叶植物本生烟需要γb参与,而单子叶植物大麦上却不需要,这可能与植物的维管束组织存在差异有关;利用Y2H及BiFC证明了 γb蛋白与病毒的运动蛋白TGB2发生互作;Co-IP实验证明了 γb蛋白是病毒核糖核蛋白（Ribonucleoprotein,RNP）运动复合物的组分;最后,通过CLSM观察发现,缺失γb蛋白的病毒突变体在本生烟上表现出胞间运动受阻的现象。这些实验初步证明了 γb蛋白能与运动蛋白TGB2于微丝或内质网上互作,并可能作为病毒RNP运动复合物的组分来促进BSMV的胞间运动。γb蛋白促进BSMV复制和运动新功能的发现有助于我们深刻理解病毒编码的基因沉默抑制子和富含半胱氨酸的小病毒蛋白的多功能性。
成军[5]（2006）在《慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略》文中研究表明乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染,与慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌（HCC）的发病密切相关,其发病机理涉及到很多基因的共同参与.病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响,也可能是病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌发病机制的重要机制.酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用,是促进慢性病毒性肝炎发病机理研究,探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径.
钟彦伟[6]（2006）在《干扰素β调节分子机制研究》文中认为乙型、丙型病毒性肝炎严重危害我国人民健康。但是到目前为止还没有有效而可靠的抗病毒根治办法。虽然干扰素α（IFNα）有一定的抗病毒作用,但研究表明仅对30%～40%的病人有效。拉米夫定、阿德福韦酯等虽然有一定抗病毒效果,但长期使用易引起病毒耐药变异,限制了其广泛应用。因此,对IFNα或拉米夫定等治疗无效的患者仍需探索新的治疗途径。 近年来研究表明,干扰素β（IFNβ）与干扰素α一样,是一种具有多种生物学作用的重要细胞因子,虽然其与IFNα抗病毒作用机理相似,但IFNβ具有独特性,而这一独特性与IFNβ的抗病毒效果紧密相关。因而IFNβ在乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗中具有重要应用前景。近年来的临床资料表明,由于IFNβ不易产生抗体,可有效治疗干扰素α治疗无效的慢性乙型肝炎、丙型肝炎患者,而且在治疗慢性丙型肝炎导致的肝细胞癌方面IFNβ比IFNα有更好的抗肿瘤治疗效果。但是到目前为止,IFNβ对于机体的免疫调节和抗病毒、抗肝纤维化、抗肝细胞癌治疗的分子机制还不十分清楚。 本研究利用先进的分子生物学技术,研究肝细胞内影响IFNβ转录调节的因素、IFNβ对肝细胞内基因表达谱的影响以及与IFNβ具有相互作用的肝细胞结合蛋白。以期能从中发现某些有价值的线索,为阐明IFNβ独特的抗病毒功能提供重要的实验依据。 为探索IFNβ对肝细胞内基因表达谱的影响,我们首先以分子生物学技术构建了真核表达质粒pcDNA3.1（-）-IFNβ,以空载体pcDNA3.1（-）为平行对照,转染HepG2细胞,并制备细胞裂解液。应用抑制性消减杂交（SSH）技术,构建差异表达的cDNA消减文库,对阳性克隆进行测序和同源性分析,初步确定IFNβ真核表达质粒转染HepG2细胞后上调或下调的基因;同时应用不同浓度的重组IFNβ刺激对数生长期的HepG2细胞,以生理盐水处理的HepG2细胞为平行对照,制备细胞裂解液。提取总mRNA,逆转录为cDNA,进行SSH的2次杂交PCR扩增,筛选重组IFNβ作用肝细胞后差异表达的基因。抑制性消减杂交结果表明,共获得了25种上调表达的基因,其中包括
陈琳[7]（2006）在《丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP启动子结合蛋白的研究》文中研究表明丙型肝炎病毒（HCV）是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病原,近年来临床发现丙型肝炎的慢性化程度较其他各型病毒性肝炎更为严重。HCV表达十种蛋白质的多肽:C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b,目前还发现核心蛋白C的编码基因通过移框从而编码一种新的17KD的F蛋白,这些蛋白在病毒的复制和繁殖中各有不同的功能,但有些具体功能还不清楚。 其非结构蛋白基因NS2编码的NS2蛋白具有基质金属蛋白酶活性,通过抑制细胞凋亡及抑制肝脏和非肝特异性的启动子及增强子而使病毒持续感染,本课题组张黎颖等研究HCV NS2发现其可上调下调多种肝细胞蛋白,在肿瘤的发生发展中具有重要意义,可能是丙型肝炎发生发展的分子生物学机制之一。NS2TP是本课题组在国内首次发现的具有CHCH（螺旋—卷曲）结构域的新蛋白家族成员,HCV NS2可下调其在HepG2细胞中表达水平,与细胞内外源性脂肪代谢密切相关,推测其在HCV相关肝脂肪变中有重要作用。本课题组在完成NS2TP克隆化和蛋白表达的基础上,已用酵母双杂交完成其结合蛋白的筛选,发现其与细胞信号转导通路当中的多种蛋白可发生作用以外,还确实验证其可与细胞色素P4502E1结合,在免疫调节中具有不可忽视的作用。且经过现代生物信息学技术的分析,NS2TP为分泌型蛋白,定位于胞外,易与各种药物相互作用而可作为药品或药靶。 应用噬菌体展示技术,以NS2TP启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。噬菌体经富集后,筛选出30个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和NS2TP启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白。用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到NS2TP启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究NS2TP的转录调节机制,系统阐述HCV NS2的致病机制提供依据。
胡巍[8]（2005）在《丙型肝炎病毒NS3蛋白酶及抑制肽研究》文中提出丙型肝炎是人类最常见的慢性传染性疾病之一,丙型肝炎病毒（HCV）是丙型肝炎的致病原。目前还没有有效地预防和根治此病的方法。HCVNS3是病毒基因组编码的非结构蛋白,具有多种功能。其氨基端的NS3蛋白酶（1-180aa）是有效抑制病毒复制的重要靶点。本研究利用蛋白重组技术和噬菌体表面展示技术,设计表达和筛选具有抑制HCVNS3蛋白酶活性的抑制多肽,为特异性抗HCV的多肽药物研究奠定基础。 方法:（1） 用原核表达载体pQE-30分别构建含有NS3蛋白酶基因的pQE/NS3和含有单链NS3/4A基因的pQE/NS3/4A重组质粒;用重组质粒转化大肠杆菌M15,化学诱导表达目的蛋白并采用离子交换层析纯化蛋白。（2） 用酵母转化载体pPICZαA,构建含有NS3蛋白酶基因克隆的pPICZaA/NS3和含有单链NS3/4A克隆的pPICZαA/NS3/4A重组质粒;用重组质粒电转化酵母GS115,甲醇诱导表达并分级沉淀纯化NS3蛋白酶。（3） 利用高效原核表达载体pBVIL1和基因合成的方法,构建蛋白酶催化底物NS5A-B重组表达质粒pBVIL1/NS5A-B,转化大肠杆菌HB101,热诱导表达目的蛋白,采用离子交换层析的方法纯化蛋白;在体外用融合NS5A-B蛋白底物建立蛋白酶催化系统,并用SDS-PAGE、ELISA等方法对蛋白酶活性进行测定。（4） 根据蛋白酶底物特异性,设计合成底物竞争性抑制肽基因,并构建原核重组表达载体pBVIL1/H9,表达、纯化底物竞争性抑制肽;在体外用SDS-PAGE鉴定抑制活性。（5） 利用噬菌体表面展示技术,筛选具有抑制活性的NS3蛋白酶抑制肽,并在体外系统鉴定抑制活性。 结果:（1） 测序结果证实,构建的原核表达载体pQE/NS3和pQE/NS3/4A正确,
刘妍[9]（2005）在《丙型肝炎病毒非结构蛋白4A、4B与肝细胞相互作用的机制研究》文中提出丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化和肝细胞癌的发生发展进程密切相关。病毒感染肝细胞后,病毒的核酸、蛋白与肝细胞的核酸、蛋白等生物大分子之间的相互作用是病毒致病的主要分子机制之一。HCV基因组长约9.6kb,含有一个长的开放阅读框架（ORF）,编码一个约3010～3033个氨基酸残基（aa）的多蛋白前体,经宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶加工成至少十种结构蛋白和非结构蛋白,C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。目前还发现核心蛋白C的编码基因通过移框从而编码一种新的17kD的F蛋白,这些蛋白在病毒的复制和繁殖中各有不同的功能,但某些具体机制尚不清楚。本研究以两个非结构蛋白NS4A、NS4B为研究对象,旨在探讨HCV NS4A和NS4B蛋白对肝细胞基因表达谱的调节及与肝细胞蛋白之间的相互作用,对于了解HCV NS4A、NS4B蛋白的致病机制及寻找有效防治HCV的方法具有重要意义。 为研究NS4A、NS4B蛋白的反式激活功能,我们构建了NS4A、NS4B的真核表达载体pcDNA3.1（-）-NS4A和pcDNA3.1（-）-NS4B,分别将其与氯霉素乙酰转移酶报告基因表达质粒pCAT3-Promoter（含有SV40早期启动子）共转染人肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因的表达活性;以表达质粒pcDNA3.1（-）-NS4A和pcDNA3.1（-）-NS4B转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1（-）为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）,构建HCV NS4A、NS4B反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,对筛选的克隆进行测序及同源性分析。结果发现,NS4A、NS4B能够反式激活SV40启动子的转录活性,进而促使其调控的下游CAT基因表达增强,NS4B的反式激活作用强于NS4A。消减杂交分析显示,NS4A、NS4B能够上调肝细胞中多种基因的表达,包括与细胞生长调节、细胞内信号转导、蛋白质翻译合成、肿瘤发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因;此外,我们还筛选到两个新基因,分别命名为NS4A反式激活
成军,董菁,张健,王建军,纪冬,刘妍,钟彦伟,王琳[10]（2004）在《HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化》文中研究指明目的:利用生物信息学（bioinformatics）技术克隆,鉴定人HBsAg前-S1蛋白结合蛋白（PS1BP）编码基因的同源基因. 方法:人PS1BP由表达型cDNA文库的噬菌体展示技术筛选获得.以人的PS1BP的cDNA序列作为参照,对于美国国立卫生研究院（MH）国立医学图书馆（NLM）生物工程信息学研究中心（NCBI）建立的核苷酸序列数据库GenBank,利用同源基因序列比对的在线分析软件BLASTn进行同源基因序列的比对,发现新的来源于大鼠的同源基因.确定大鼠PS1BP的cDNA序列之后,对于大鼠PSIBP蛋白质一级结构序列与人和小鼠的PS1BP蛋白质一级结构序列的同源性进行分析.利用在线分析软件,对于大鼠PS1BP一级结构序列中潜在的修饰和功能位点进行初步的预测分析. 结果:利用噬菌体展示技术获得了人的PS1BP的cDNA序列.以生物信息学技术确定了大鼠PS1BP的cDNA及其编码产物的序列.大鼠PS1BP的cDNA由1455 nt组成,编码产物由484 aa组成.大鼠PS1BP蛋白质一级结构与人和小鼠PS1BP蛋白质一级结构的同源性分别为80.79%（391/484）和92.98%（450/484）.利用在线分析软件,在大鼠PS1BP蛋白质一级结构中还发现了一系列潜在的蛋白质修饰结构位点. 结论:大鼠PS1BP基因及其编码产物序列被确定
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒的流行病学 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的基因型分布 |
| 1.3 丙型肝炎病毒的分子病毒学 |
| 1.3.1 丙型肝炎病毒的基因组结构 |
| 1.3.2 丙型肝炎病毒的生活周期 |
| 1.4 丙型肝炎病毒的研究模型 |
| 1.4.1 丙型肝炎病毒的假病毒模型 |
| 1.4.2 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子模型 |
| 1.4.3 丙型肝炎病毒的细胞感染模型 |
| 1.4.4 丙型肝炎病毒的动物模型 |
| 1.5 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的发展 |
| 1.5.1 丙型肝炎病毒直接抗病毒药物的分类 |
| 1.5.2 直接抗病毒药物相关的耐药突变的总结 |
| 1.6 本课题研究背景 |
| 1.7 本课题研究目标 |
| 第二章 实验材料与试验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白抗体 |
| 2.3 HCV直接抗病毒药物 |
| 2.4 病人血清的来源及RNA的抽提 |
| 2.5 多规格孔板的细胞实验 |
| 2.6 复制子单克隆的分离 |
| 2.7 PCR体系 |
| 2.8 质粒回收与琼脂糖电泳产物回收 |
| 2.9 大肠杆菌感受态DH5α的制备与转化 |
| 2.10 酿酒酵母感受态W303 的制备与转化 |
| 2.11 质粒构建 |
| 2.12 TA平末端克隆与限制性内切酶 |
| 2.13 RNA抽提与反转录 |
| 2.14 HCV RNA的体外转录与转染 |
| 2.15 直接抗病毒药物敏感性的测试 |
| 2.16 免疫荧光 |
| 2.17 免疫印迹 |
| 2.18 HCV序列的生物信息学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 丙型肝炎病毒亚基因组复制子新型构建方法的建立 |
| 3.1.1 丙型肝炎病毒复制子cDNA文库的构建 |
| 3.1.2 丙型肝炎病毒复制子细胞的建立 |
| 3.1.3 基因1b型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.4 基因3a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.1.5 基因6a型病毒复制子细胞复制特点的研究 |
| 3.2 基因3a型丙型肝炎病毒亚基因组复制子耐药相关的研究 |
| 3.2.1 基因3a型复制子对直接抗病毒药物的敏感性研究 |
| 3.2.2 基因3a型复制子对NS3 抑制剂耐药机制的研究 |
| 3.2.3 基因3a型复制子NS3 抑制剂耐药位点D168Q稳定存在的机制研究 |
| 3.3 基因6a型丙型肝炎病毒对索磷布韦耐药机制的研究 |
| 3.3.1 基因6a型复制子索磷布韦耐药性的诱导 |
| 3.3.2 基因6a型复制子耐药型细胞克隆的特点分析 |
| 3.3.3 基因6a型丙型肝炎病毒索磷布韦耐药位点的鉴定研究 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 作者简历 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 ABSTRACT 第一部分 研究内容 |
| 第一章 聚集性献血导致的HCV感染的T细胞免疫研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要实验仪器 |
| 1.2.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 血样的采集与处理 |
| 1.3.3 抗HCV抗体的定性检测 |
| 1.3.4 临床信息的获得 |
| 1.3.5 HCV基因分型 |
| 1.3.6 HCV RNA足量 |
| 1.3.7 HCV多肽库的设计与合成 |
| 1.3.8 HCV特异性T细胞的刺激及流式分析 |
| 1.3.9 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 研究对象的人口学特征 |
| 1.4.2 研究对象的临床特征 |
| 1.4.3 HCV慢性感染者的病毒特征 |
| 1.4.4 HCV病毒清除组与HCV慢性感染组有持续的CD8~+T细胞及CD4~+T细胞应答 |
| 1.4.5 多因子分泌 |
| 1.4.6 HCV特异性T细胞的表型特征 |
| 1.4.7 免疫抑制分子的表达特点 |
| 1.4.8 T细胞免疫与肝功能 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二章 聚集性献血感染HCV的分子生物学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要的试剂及耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HCV RNA提取 |
| 2.3.2 RNA反转录 |
| 2.3.3 全序列引物设计及测序 |
| 2.3.4 序列组装及分析 |
| 2.3.5 二代测序 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HCV病毒基因组的各片段反转录PCR结果 |
| 2.4.2 HCV病毒5'/3' RACE扩增结果 |
| 2.4.3 全基因序列拼接 |
| 2.4.4 序列同源性分析及进化分析 |
| 2.4.5 二代测序 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 盐桥在HBV特异性多肽呈递和T细胞识别中的作用机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验主要仪器 |
| 3.2.2 主要实验耗材及商品试剂 |
| 3.2.3 实验试剂及其配方 |
| 3.2.4 实验动物、菌株、载体 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验所用的多肽合成和载体构建 |
| 3.3.2 H-2K~d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得 |
| 3.3.3 ELISPOT实验 |
| 3.3.4 H-2K~d和HLA-B~*4001分子的表达与纯化 |
| 3.3.5 HLA-B*4001-peptide(GETALALLLL)的结晶条件的筛选 |
| 3.3.6 HLA-B*4001 Χ-射线衍射及结构解析 |
| 3.3.7 圆二色谱实验检测H-2K~d-HBVpeptide的热稳定性 |
| 3.3.8 H-2K~d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H-2K~d分子和HLA-B~*4001-分子的蛋白纯化 |
| 3.4.2 探究H-2K~d/HLA-B~*4001野生型/突变体与多肽的结合能力 |
| 3.4.3 探究H-2-K~d野生型及突变体结合多肽识别TCR |
| 3.4.4 H-2K~d和HLA-B~*4001形成的两种不同的盐桥 |
| 3.4.5 盐桥对MHCI和结合肽的结构构象的影响 |
| 3.4.6 潜在盐桥广泛存在不同脊椎动物中 |
| 3.5 讨论 第二部分 文献综述 |
| 第四章 HCV病毒及细胞免疫概述 |
| 4.1 HCV病毒的流行病学及临床 |
| 4.1.1 HCV的流行 |
| 4.1.2 HCV的临床表现 |
| 4.1.3 HCV病毒的检测和实验室诊断 |
| 4.1.4 HCV的防控及治疗 |
| 4.2 HCV病毒的基本特征 |
| 4.2.1 HCV病毒的形态特征 |
| 4.2.2 HCV病毒的基因组成及全基因组测序 |
| 4.2.3 HCV病毒的生活周期 |
| 4.2.4 HCV病毒的传播及变异 |
| 4.3 HCV病毒感染的免疫反应特征 |
| 4.3.1 血清学反应 |
| 4.3.2 T细胞免疫 |
| 第五章 MHC分子结构免疫学概述 |
| 5.1 MHC的概念 |
| 5.2 MHC的抗原呈递及T细胞识别 |
| 5.2.1 MHCⅠ类途径 |
| 5.2.2 MHCⅡ类途径 |
| 5.2.3 外源抗原的MHCⅠ类途径交叉呈递 |
| 5.3 MHC及相关分子的结构特征 |
| 5.3.1 MHCⅠ类分子的结构特征 |
| 5.3.2 MHCⅡ类分子的结构 |
| 5.3.3 非经典的MHCⅠ类分子结构 |
| 5.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用 |
| 5.4.1 MHC结构研究对于MHC分子分类的影响-HLA超级型及其意义 |
| 5.4.2 MHC分子对TCR识别的限制性 |
| 5.4.3 MHC交叉呈递和TCR交叉识别的结构基础 全文总结 参考文献 附录1 缩略表 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文 致谢 |
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪瘟病毒概述 |
| 1.2 病毒的形态 |
| 1.3 病毒基因组的结构与功能 |
| 1.3.1 非翻译区 |
| 1.3.2 结构蛋白 |
| 1.3.3 非结构蛋白 |
| 1.4 NS3的结构与功能 |
| 1.4.1 NS3蛋白酶的功能 |
| 1.4.2 NS3 NTPase/helicase的功能 |
| 1.4.3 NS3蛋白酶结构域和解旋酶结构域的相互作用 |
| 1.4.4 黄病毒科NS3的结构 |
| 1.4.5 NS3的解旋机制 |
| 1.4.6 NS3与蛋白或核酸的相互作用 |
| 1.5 猪瘟病毒基因组的复制与调控 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、毒株及细胞 |
| 2.1.2 质粒及引物 |
| 2.1.3 常用的酶 |
| 2.1.4 常用仪器、试剂及耗材 |
| 2.1.5 常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的片段的扩增与回收 |
| 2.2.2 酶切与连接 |
| 2.2.3 位点特异性突变 |
| 2.2.4 感受态细胞的制备与质粒转化 |
| 2.2.5 阳性菌落的筛选及鉴定 |
| 2.2.6 蛋白质的诱导表达及鉴定 |
| 2.2.7 蛋白质大量表达及纯化 |
| 2.2.8 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.9 蛋白质结晶及条件优化 |
| 2.2.10 X-ray衍射数据的收集及处理 |
| 2.2.11 结构解析、优化及分析 |
| 2.2.12 RNA的体外转录及纯化 |
| 2.2.13 解旋酶底物的制备 |
| 2.2.14 Helicase活性测定 |
| 2.2.15 ATPase活性测定 |
| 2.2.16 细胞的复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.2.17 质粒DNA及RNA的转染 |
| 2.2.18 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.19 间接免疫荧光检测 |
| 2.2.20 病毒滴度测定 |
| 2.2.21 免疫蚀斑 |
| 第三章 全长NS3蛋白的表达纯化、结晶和结构解析 |
| 3.1 表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.2 重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.1 小量诱导表达及鉴定 |
| 3.2.2 NS3的大量表达及纯化 |
| 3.3 蛋白质结晶及条件优化 |
| 3.4 X-ray衍射数据的收集及结构解析 |
| 3.5 NS3的结构分析 |
| 3.5.1 NS4A~(PCS)-3_(S163A)的结构 |
| 3.5.2 NS3蛋白酶及其辅因子的结构特征 |
| 3.5.3 瘟病毒与HCV中NS3-4A顺式切割的结构证据 |
| 3.5.4 NS3蛋白酶结构域的特征及底物特异性 |
| 3.5.5 NS3分子内相互作用界面的特征 |
| 3.6 蛋白酶辅助解旋酶工作的模型 |
| 3.7 讨论 |
| 第四章 NS3分子内的相互作用与功能 |
| 4.1 突变体的构建及鉴定 |
| 4.1.1 表达突变体的构建 |
| 4.1.2 病毒突变体的构建 |
| 4.2 蛋白突变体的表达及纯化 |
| 4.3 界面突变对ATPase活性的影响 |
| 4.3.1 磷酸根标准曲线的绘制及反应条件的确定 |
| 4.3.2 NS3 ATPase活性的测定 |
| 4.4 界面突变对helicase活性的影响 |
| 4.4.1 解旋底物的制备 |
| 4.4.2 解旋条件的优化 |
| 4.4.3 解旋酶活性的测定 |
| 4.5 界面突变对病毒复制及蚀斑形成的影响 |
| 4.5.1 突变体病毒的拯救 |
| 4.5.2 病毒滴度 |
| 4.5.3 蚀斑形成 |
| 4.6 讨论 |
| 第五章 NS3蛋白酶结构域表面碱性区的功能 |
| 5.1 突变体的构建及鉴定 |
| 5.1.1 表达突变体的构建 |
| 5.1.2 病毒突变体的构建 |
| 5.2 蛋白质的表达及纯化 |
| 5.3 蛋白酶表面碱性氨基酸突变对ATPase活性的影响 |
| 5.4 蛋白酶表面碱性氨基酸突变对helicase活性的影响 |
| 5.5 蛋白酶表面氨基酸突变对病毒拯救和复制的影响 |
| 5.5.1 突变体病毒的拯救 |
| 5.5.2 病毒滴度 |
| 5.6 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 病毒编码蛋白的相互作用及其多功能性 |
| 1.2 正义单链RNA病毒的复制及其调控 |
| 1.3 大麦条纹花叶病毒的研究概述 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 多功能蛋白γb在BSMV复制中的新功能解析 |
| 3.1 叶绿体是BSMV的主要复制场所 |
| 3.2 γb蛋白能定位于BSMV的复制场所 |
| 3.3 γb蛋白与BSMV的复制酶αa直接互作 |
| 3.4 γb与αa蛋白互作的关键区域 |
| 3.5 γb蛋白的抑制子功能对BSMV复制的影响有限 |
| 3.6 γb蛋白显着的影响BSMV RNAα的复制水平 |
| 3.7 γb蛋白通过直接增强αa解旋酶活性来促进BSMV的复制 |
| 3.8 γb蛋白促进BSMV复制的工作模型 |
| 3.9 小结与讨论 |
| 第四章多功能蛋白γb在BSMV运动中的新功能解析 |
| 4.1 γb蛋白对于BSMV在本生烟上的系统运动是必需的 |
| 4.2 γb蛋白对于BSMV在大麦上的系统运动不是必需的 |
| 4.3 γb蛋白与TGB2蛋白直接互作 |
| 4.4 γb蛋白是BSMV的RNP复合物的组分 |
| 4.5 γb蛋白与TGB2蛋白互作区的确定 |
| 4.6 γb蛋白的突变能减弱病毒的胞间运动 |
| 4.7 γb蛋白组成的RNP运动复合物可能沿着微丝结构运动 |
| 4.8 γb蛋白促进BSMV运动可能的工作模型 |
| 4.9 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ BSMV RNAβ及RNAγ-gfp转基因本生烟的培育 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ 引物与质粒列表 |
| 个人简历 |
| 1 肝炎病毒相关基因的克隆化研究 |
| 1.1 肝炎病毒DNA/RNA结合蛋白基因的克隆化 |
| 1.2 肝炎病毒蛋白结合蛋白基因的克隆化 |
| 1.3 肝炎病毒蛋白反式激活基因的克隆化 |
| 2 新基因研究具有很大的挑战性 |
| 3 重视新基因的研究与临床医学的相关性研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 正文 |
| 第一部分 抑制性消减杂交技术研究干扰素β对HepG2细胞基因表达谱的影响 |
| 引言 |
| 第一章 抑制性消减杂交技术筛选IFNβ真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达基因 |
| 第二章 抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ作用HepG2细胞后差异表达基因 |
| 讨论 |
| 第二部分 基因芯片技术筛选干扰素β调节基因 |
| 引言 |
| 第一章 基因芯片技术筛选IFNβ真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达基因 |
| 第二章 基因芯片技术筛选重组干扰素β作用HepG2细胞后差异表达基因 |
| 讨论 |
| 第三部分 噬菌体展示技术筛选干扰素β启动子DNA结合蛋白 |
| 引言 |
| 讨论 |
| 第四部分 干扰素β与肝细胞蛋白之间相互作用的研究 |
| 引言 |
| 第一章 IFNβ酵母“饵”载体的构建及在酵母细胞中表达研究 |
| 第二章 酵母双杂交实验筛选与IFNβ具有相互作用的肝细胞蛋白基因 |
| 讨论 |
| 总结及展望 |
| 文献综述 |
| 附录一 主要仪器设备 |
| 附录二 英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间发表和撰写的文章 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 注释说明清单 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节靶基因(NS2TP)的研究进展 |
| 1.1.1 非结构蛋白NS2的结构和功能 |
| 1.1.2 非结构蛋白NS2与HCV的致病机制 |
| 1.1.3 非结构蛋白NS2反式调节靶基因NS2TP结构和功能 |
| 1.2 噬菌体展示技术研究进展 |
| 1.2.1 噬菌体展示技术的基本原理 |
| 1.2.2 噬菌体展示载体 |
| 1.2.3 噬菌体展示技术在抗体库构建中的应用 |
| 2 HCV-NS2TP启动子报告载体的构建及转录活性的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 噬菌体展示技术筛选HCV NS2TP启动子DNA结合蛋白 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 后记或致谢 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
| 发表文章 |
| 缩略语索引 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HCV NS3蛋白酶基因片段的克隆和原核表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 HCV NS3蛋白酶在酵母表达系统中的可溶性表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 HCV NS3蛋白酶底物的克隆表达与蛋白酶活性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 HCV NS3蛋白酶竞争性底物抑制多肽的表达和抑制活性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 HCV NS3蛋白酶抑制多肽的筛选和抑制活性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 第六部分 丙型肝炎病毒分子生物学特征及其蛋白酶抑制剂研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 博士期间撰写的论文目录 |
| 博士期间发表论文全文 |
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 主要仪器设备 |
| 第一部分 HCV NS4A、NS4B蛋白反式调节肝细胞基因表达谱的研究 |
| 第一节 HCV NS4A、NS4B真核表达载体的构建及其反式激活SV40即刻早期启动子的研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二节 抑制性消减杂交技术筛选HCV NS4A、NS4B蛋白反式调节基因 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 HCV NS4A、NS4B蛋白与肝细胞蛋白之间相互作用的研究 |
| 第一节 HCV NS4A、NS4B酵母“饵”载体的构建及在酵母细胞中表达的研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二节 酵母双杂交实验筛选HCV NS4A、NS4B蛋白的肝细胞结合蛋白 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 HCV NS4A蛋白反式激活新基因的克隆化及在细胞内表达的研究 |
| 第一节 HCV NS4A反式激活蛋白NS4ATP1和NS4ATP2的基因克隆化及生物信息学分析 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二节 NS4ATP1和NS4ATP2在原核大肠杆菌和真核酵母细胞中表达的研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 附录 在读期间发表和撰写的论文 |
