杨飞[1]（2021）在《血清4型禽腺病毒西藏分离株的全基因组序列分析及其对雏鸡的致病性》文中进行了进一步梳理血清4型禽腺病毒（FAdV-4）主要引起包涵体肝炎（inclusion body hepatitis,IBH）和心包积液-肝炎综合征（hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）。2010年始,I群禽腺病毒发病呈增长趋势;自2015年夏季开始该病在我国沿海地区呈流行性爆发,其典型的致病性特征是心脏出血、心包内有大量淡黄色透明液体,肝脏肿大,且呈浅褐色,不仅可以导致鸡只死亡,而且使鸡只的生产性能下降、恢复慢且上市晚,直接影响鸡群健康状态和鸡只的质量,对养禽业危害极大。目前,西藏地区未有关于FAdV-4相关的研究报道,本试验从西藏林芝地区某鸡场疑似心包积液-肝炎综合征的肝组织病料中分离得到一株致病性血清4型禽腺病毒西藏分离株,采用高通量测序获得FAdV-4的全基因组序列,进行遗传进化分析;对FAdV-4在雏鸡中致病性进行研究,预期成果将填补有关FAdV-4在西藏地区研究的空白,不仅可推动FAdV-4在西藏地区的诊断取得新突破,还可丰富FAdV-4的组学数据库,为西藏地区血清4型禽腺病毒的防治提供重要的科学基础。1.一例西藏鸡心包积液-肝炎综合征的临床及分子诊断为明确西藏自治区林芝市某鸡场疑似心包积液-肝炎综合征病原,采集疑似HHS的鸡肝组织病料,通过观察其临床症状、病理学变化,采用显微镜进行包涵体检查,同时基于Hexon基因序列的PCR扩增方法进行分子鉴定,获得Hexon基因序列进行Blast相似性搜索,应用Meg Align和MEGA 7.0软件完成同源性分析及种系发育分析。结果显示,死亡鸡只可见心包积水,肝脏病变明显,肝脏肿大,早期淤血严重;病程长者,肝脏颜色呈土黄色,质脆易碎,镜检可见肝细胞内有核内嗜碱性包涵体,包涵体界线清晰,形状不规则。基于Hexon基因组核苷酸水平的系统进化分析显示,西藏分离株与FAdV-C在同分支上,该毒株与目前国内流行的FAdV-4毒株同源性高达99%-100%。结果提示,从西藏林芝地区死亡鸡只感染的毒株属于血清4型禽腺病毒。2.血清4型禽腺病毒西藏分离株的分离鉴定及全基因组序列分析为了从西藏林芝地区某鸡场出现心包积液肝炎典型症状的鸡肝中成功分离一株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）西藏分离株,并对分离到的FAdV-4全基因组测序分析及基因功能注释。通过尿囊腔注射法接种SPF鸡胚和感染新鲜原代鸡胚肾细胞（chicken embryo kidney,CEK）,经多次传代培养后,获得适应CEK细胞的FAdV-4西藏分离株,且FAdV-4的核酸在CEK细胞传代培养中稳定存在。血凝实验表明,FAdV-4西藏分离株不具备凝集鸡、绵羊、大鼠、小鼠等动物红细胞的能力。病毒半数细胞感染量的测定,使用Reed-Muench公式计算FAdV-4西藏分离毒株第11代细胞适应毒的TCID50为107.25/ml。以0.2 m L/枚剂量的病毒感染SPF鸡胚,结果显示接种组死亡鸡胚个体明显小于未接种组,且解剖死亡鸡胚可见肝脏发黄,肿大,质脆易碎;接种鸡胚组死亡率为100%（40/40）,孵化率为0（0/40）。通过高通量测序获得全基因组序列,测序数据进行拼装并进行序列矫正获得FAdV-4西藏分离株全基因组长43711 bp,GC含量为55%,基因数目为38条;其中长度大于500bp的基因数目28条,长度大于1000 bp的基因数目11条;N50长度为1482 bp;38条基因在8个数据库中注释成功,西藏分离株与FAdV-C在同一分支上,同源性在98.2%-100%之间,且全基因组中开放阅读框（ORF19/27/48）3个编码蛋白的缺失,且有一段长为1966 bp基因片段的缺失突变。结果提示,血清4型禽腺病毒西藏分离株的分离可为进一步研究FAdV-4毒株来源以及致病性提供科学理论基础。3.血清4型禽腺病毒西藏分离株对雏鸡的致病性为了探究FAdV-4西藏分离株对雏鸡的致病性,本试验选取160只雏鸡（10日龄80只,20日龄80只）,不同日龄的雏鸡各分为对照组（20只）、试验组（口服感染:30只、肌肉注射30只）3组,每只雏鸡试验组接种1ml病毒尿囊液,对照组接种1ml 0.9%的Na Cl溶液。通过制作切片观察病理组织学变化,利用实时荧光定量PCR检测各组织FAdV-4的病毒载量,分离FAdV-4血清,检测包括LDH、AST、ALT相关的生化指标,IL-6和IFN-γ细胞因子的表达变化。结果显示,发病初期死亡鸡只死前无明显变化,精神正常,粪便正常,采食正常,突然死亡。剖检雏鸡可见纤维素性心包积水,积水中含胶冻样物质肝脏颜色呈土黄色,质脆易碎,病理组织学结果表明,心肌间质出现水肿、炎性细胞浸润,肝细胞内有核内包涵体,包涵体界线清晰,这些包涵体与核膜之间均有晕圈产生,呈微细颗粒、小球状、圆形等各种形状。荧光定量PCR试验结果显示,在口服感染组和肌肉注射组中的各个脏器均检测有FAdV-4的存在,其中肝脏的病毒载量最高,腺胃、脑中的病毒载量最低,就整体而言各个脏器的病毒载量呈先上升后降低的趋势。生化指标结果表明,试验组组LDH、AST、LAT表达水平高于对照组,10日龄组与20日龄组生化指标动态变化相似。细胞因子表达结果表明,试验组IL-6和IFN-γ表达水平高于对照组,先上升后呈下降趋势,表明雏鸡对FAdV-4西藏分离株的入侵产生免疫应答。结果提示,FAdV-4对雏鸡的致病性损害程度与日龄、感染方式相关。
魏若瑶[2]（2020）在《鸡Ⅰ群禽腺病毒三价灭活苗及卵黄抗体的研制》文中研究表明鸡I群禽腺病毒（FAdV-I）在临床上主要引起鸡的心包积液综合征（HHS）和包涵体肝炎（IBH）,在其12种血清型中,每种血清型都可引起鸡的包涵体肝炎,只有血清4型I群禽腺病毒（FAdV-4）可引起鸡的心包积液综合征。近五年来,这两种疾病在我国多个省份均有暴发,给养禽业带来了较大的经济损失,国内目前也无商品化疫苗进行鸡I群禽腺病毒的防控。鉴于此,本研究选取了三株优势血清型毒株FAdV-2、FAdV-4和FAdV-8b,进行FAdV-Ⅰ三价油乳剂灭活苗和卵黄抗体的制备,以期为鸡I群禽腺病毒的防控提供参考。1 FAdV-2、FAdV-4和FAdV-8b的扩增与三价灭活苗的制备本试验采用鸡肝癌细胞（LMH）扩增FAdV-2、FAdV-4、FAdV-8b,对收取的病毒液进行PCR鉴定和半数细胞培养物感染量（TCID50）测定后,使用终浓度0.15%的甲醛溶液进行灭活,按2:1的油水比制备FAdV-Ⅰ三价灭活苗,并对其质量进行检验。结果表明:LMH细胞可稳定传代,有利于FAdV-Ⅰ的增殖,所收获的FAdV-2、FAdV-4、FAdV-8b 病毒液的 TCID50 依次为 10-6.62/0.1mL、10-7.78/0.1mL、10-7.3/0.1mL;疫苗外观为乳白色均匀乳剂,油包水剂型,稳定性和无菌检验均符合要求,接种7日龄的SPF级雏鸡后一周内可被机体完全吸收,经14d的观察雏鸡精神状态良好,无不良反应。2 禽腺病毒三价油乳剂灭活苗的免疫效力评估将研究一制备的疫苗接种7日龄SPF级雏鸡,进行疫苗的最小免疫剂量、抗体水平效价和临床保护效力检测。结果显示:疫苗最小免疫剂量为0.4mL/只;免疫鸡群抗体水平在免疫后第2周开始上升,第4周达到最高,此时FAdV-2、FAdV-4、FAdV-8b产生的抗体效价分别为1:1230、1:1413、1:1349,而后缓慢下降;对各组鸡接种疫苗14d后分别注射0.2mL的FAdV-2、FAdV-4、FAdV-8b病毒液,经14d观察可见鸡只全部存活,剖检无病理变化且攻毒后第3、5、7、10、14天PCR检测均为阴性,临床保护率为100%。研究表明:所制备的三价油乳剂灭活苗免疫效果好,临床保护率高,可为FAdV-Ⅰ的防控提供参考。3 鸡Ⅰ群禽腺病毒2、4、8b血清型三价卵黄抗体的制备将上述疫苗对产蛋鸡进行三次免疫,于首次免疫后每周收取其血清和卵黄抗体进行效价监测。取抗体效价高于1:1024的卵黄抗体进行质量检验,并将检验合格的卵黄抗体效价稀释为1:1024后接种雏鸡进行预防和治疗试验。结果显示:产蛋鸡的血清和卵黄抗体效价在首次免疫后第2周开始上升,第11周达到最高,而后均维持在1:1024以上;所制备的卵黄抗体质量检验符合要求,雏鸡注射后精神状态良好,14d内无不良反应;对各组鸡只接种1.0mL效价为1:1024的卵黄抗体3d后,注射0.2mL的FAdV-2、FAdV-4、FAdV-8b病毒液,在14d的观察期内雏鸡无死亡现象,剖检无病理变化,且攻毒后第3、5、7、10、14天PCR检测均为阴性,临床保护率为100%;对各组鸡人工感染0.2mL的FAdV-2、FAdV-4、FAdV-8b病毒液1d后注射1.0mL效价为1:1024的卵黄抗体,经14d观察,FAdV-2感染鸡群治愈率达100%,FAdV-4和FAdV-8b感染鸡群治愈率均为90%。表明试验所制备的卵黄抗体质量检验合格,安全性高,对雏鸡感染FAdV-2、FAdV-4和FAdV-8b有良好的预防和治疗作用。
刘蕊[3]（2019）在《禽心包积液-肝炎综合征IgY脂质体的制备及其雏鸡保护试验》文中研究指明腺病毒属中的家禽腺病毒分为众多的血清型,其中Ⅰ群的血清4型（Fowl Adenovirus Serotype 4,FAV-4）引发一种新流行的呈现急性死亡且全群传染的禽类疾病:心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium-hepatitis Syndrome,HHS）。临床症状表现为35周龄的家禽突然出现死亡,尤其多发于肉鸡品种,大体眼观病变可见出血性肝炎和心包积液,鉴于无明显的临床症状,预判该病就十分困难。安卡拉地区首先爆发HHS,随后,中国于2015年开始在多省市爆发且广泛流行,本实验室于2016年7月首次分离鉴定出天津地区FAV-4毒株TJ1607,随后选用1日龄雏鸡,利用TJ1607毒株构建了疾病模型。总结前人的经验,本试验制备了以纯化TJ1607毒株为抗原的弗氏佐剂灭活疫苗,继疫苗质量检验合格后,多次免疫高产蛋鸡,制备精制高免TJ1607 IgY和精制高免TJ1607 IgY脂质体,随后进行了IgY抗体的雏鸡保护试验,显示出一定的防治效果,同时建立了检测血清中TJ1607抗体的间接ELISA方法,具体试验内容如下:1.TJ1607弗氏佐剂灭活疫苗的制备。以增殖和纯化的TJ1607毒株为抗原,以弗氏佐剂为油乳剂,制备TJ1607弗氏佐剂灭活疫苗。疫苗经检验,滴水试验未见分散;无菌检验未见细菌生长;离心试验未见分层;动物试验显示接种健康雏鸡后无不良反应,综上表明所制备的疫苗可用于后续的试验研究。2.TJ1607 IgY抗体的制备。选用高产蛋鸡,将TJ1607弗氏佐剂灭活疫苗对其进行多次接种,第三次接种后的第17天抗体效价达到1:128且持续不变,此时收集鸡蛋,获得高效价的TJ1607卵黄抗体。对提纯条件进行优化,选用水稀释法、辛酸-硫酸铵沉淀法结合透析技术纯化TJ1607高免卵黄抗体,纯化后的IgY抗体效价不变但纯度更高,利用脂质体对其进行包裹,制备精制高免TJ1607 IgY和精制高免TJ1607 IgY脂质体。3.TJ1607血清抗体间接ELISA检测方法的建立。以纯化的TJ1607为抗原包被酶标板,TJ1607血清抗体为一抗,兔抗鸡辣根过氧化物酶为二抗,棋盘法筛选抗原、一抗及二抗的最佳稀释倍数,绘制阳性血清抗体浓度与OD值的标准曲线,计算拟合程度,重复性试验检验建立的检测方法。结果显示,TJ1607抗原的最佳包被浓度为350μg/mL,TJ1607血清抗体的最佳稀释度为1:3000,HRP-IgG（兔抗鸡）的最佳稀释度为1:2000;阳性血清抗体浓度与OD值线性关系良好,线性方程为y=21.751x-3.5781,R2=0.9993;重复性试验显示板内变异系数为1.68%4.88%,板间变异系数为4.03%9.85%,可用于后续血清样品的检测。4.TJ1607 IgY的雏鸡保护试验。攻毒雏鸡保护试验结果表明精制高免TJ1607 IgY对天津地区HHS的治愈率为85%,预防保护率为100%,可有效的防治天津地区HHS的流行。抗体消长动态试验结果表明精制高免TJ1607 IgY与粗制高免TJ1607 IgY相比,吸收较好且产生抗体迅速,达到峰值时间较快,但缓释效果不如粗制IgY,可应用于紧急情况下的防疫和免疫时的多次接种。IgY抗体口服试验结果表明精制高免TJ1607 IgY原液口服无效,制备成精制高免TJ1607 IgY脂质体后,可用于口服免疫。
殷国政[4]（2019）在《Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗及卵黄抗体的研制》文中研究指明Ⅰ群4型禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV-4）可引起鸡心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS）。2015年以来HHS在我国河南、河北、山东、江苏、安徽、广东等地均有发生和流行,可发生于肉鸡、蛋鸡和三黄鸡等,传播速度快,死亡率高,给养鸡业带来了严重的经济损失。本研究从临床病例中分离病毒,制备灭活疫苗和卵黄抗体,为有效防控该病提供技术支持。1Ⅰ群4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性试验2015-2018年,对来自山东、湖北、河北的疑似HHS的临床病例进行了病原的分离鉴定;用分离毒株分别人工感染SPF鸡胚、1日龄和21日龄SPF鸡,采用病理组织学及PCR方法,检测各组织器官的病理学变化、病毒分布及排毒情况。结果发现,感染鸡胚至8dpi全部死亡,6 dpi时死亡胚出现心包积液、肝脏肿大出血等典型病变。1日龄SPF鸡在4dpi时全部死亡,21日龄人工感染的SPF鸡与同居鸡死亡率皆为60%;死亡鸡主要病变在肝脏、心脏及肾脏等器官,其肝脏、心脏、脾脏、胰腺、小肠、肾脏等多器官均检测到该病毒DNA;21日龄感染鸡于3、5、7、14 dpi时均检出泄殖腔排毒,口腔排毒只在7、14 dpi时检出。结果表明该毒株感染性强,致死率高,具有一定的泛嗜性,水平传播能力强,泄殖腔排毒是其主要的排毒方式。2Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗的研制从分离毒株中筛选出免疫原性高的毒株,制备油乳灭活疫苗,并用该疫苗接种21日龄SPF鸡,3周后用两个毒株分别攻毒;采用PCR方法检测排毒和病毒的分布情况;采用ELISA方法监测抗体及白介素-2的含量。结果发现,免疫攻毒鸡均无死亡,在3、5、14 dpi时均未检测到排毒,仅在7 dpi时检出少量排毒,14 dpi时存活鸡的各脏器均未检出病毒DNA;免疫后2周抗体水平逐渐升高,攻毒后开始下降,至第5周时抗体水平开始回升;白介素2含量在攻毒前2-3周变化较小,7 dpi时白介素2含量明显升高。结果表明该疫苗具有良好的免疫原性,使机体对两个毒株的感染均具有强的抵抗力。3Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体的制备及应用采用上述疫苗免疫健康商品蛋鸡,制备卵黄抗体,肌肉注射于SPF鸡,两天后采用FAdV-4分离株进行攻毒,检测病毒的分布及排毒情况。结果发现,至14 dpi试验组、对照组死亡率分别为6.67%和60%（P<0.01差异极显着）;试验组只有肝脏检测到该病毒的DNA,而对照组心脏、脾脏、胰腺等多脏器均能检到;试验组只在7dpi时检到零星排毒,对照组3-7 dpi时均可排毒。表明制备的卵黄抗体能有效中和病毒,使其感染局限在肝脏,抑制机体排毒,为SPF鸡提供有效保护。综上所述,本试验分离毒株致病性强,具有一定的泛嗜性,泄殖腔排毒是其主要的排毒方式;所制备的灭活疫苗和卵黄抗体均能有效保护SPF鸡,使其对Ⅰ群4型禽腺病毒的感染具有较强的抵抗力。
范维[5]（2019）在《禽腺病毒Ⅰ群4型纤突蛋白亚单位疫苗效力评价及胶体金试纸条的初步研究》文中进行了进一步梳理目的:自2012年以来,鸡包涵体肝炎的暴发呈上升趋势,主要表现为血清4型引起的心包积水和鸡包涵体肝炎。目前,对于4型禽腺病毒抗体快速检测方法比较少,大多数传统检测方法不仅检测复杂,而且不能大规模的应用到生产实践中。对于4型禽腺病毒疫苗的防控,国内尚没有获得许可的商品化禽腺病毒疫苗。因此本实验利用禽腺病毒截短的纤突蛋白作为抗原,由实验室自制亚单位疫苗免疫动物后进行效力评价,为有效防控禽4型腺病毒病提供的新途径,同时利用该蛋白制备禽腺病毒病抗体检测试纸条,为后续禽4型腺病毒病诊断研究提供新方法。方法:通过前期筛选选择对纤突蛋白-2从氨基酸283位到氨基酸479位,获得包含纤突-2抗原蛋白决定簇氨基酸序列,然后利用大肠杆菌原核表达系统进行表达、纯化后得到抗原蛋白,将获得抗原蛋白与佐剂乳化后得到亚单位疫苗,然后免疫3周龄SPF鸡只,采用免疫攻毒法和血清中和法对该亚单位疫苗的效力进行评价,免疫和攻毒后不同时期采血备用。将纤突蛋白-2抗原蛋白应用免疫层析技术制备胶体金试纸条,作为4型禽腺病毒抗体检测方法。结果:4型FAd V原核表达后,纤突-2蛋白浓度3269 μg/mL,纯度可达90%以上。免疫攻毒实验结果表明纤突-2蛋白亚单位疫苗最低免疫剂量能达到2.5/羽,保护率达95%以上;血清中和试验结果表明免疫后分离的鸡只血清中和抗体效价可达1:1000;胶体金试纸条试验结果表明纤突-2抗原蛋白制备的胶体金试纸条能够检测出纤突-2亚单位疫苗免后鸡只的抗体水平,其阳性信号均值在维持在300以上,阴性鸡只信号均值在10～50之间。结论:本实验制备FAd V纤突-2蛋白亚单位疫苗免疫鸡只后具有良好的保护效果,能够保护鸡只免受强毒的攻击。由本实验初步制成了 FAd V纤突-2蛋白免疫胶体金试纸条。
魏志鹏[6]（2019）在《一株鸭源血清4型I群禽腺病毒的分离鉴定及其对鹅的致病性》文中进行了进一步梳理心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）主要是由血清4型Ⅰ群禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）引起的一种家禽传染性疾病。该病主要侵害35周龄肉鸡,其典型病变为心包积液和包涵体肝炎。自2015年6月以来,我国许多省份的肉鸡群先后爆发此病,并且从肉鸡群逐渐蔓延至蛋鸡、种鸡群和樱桃谷肉鸭群,严重危害我国养禽业的健康发展。近年来,国内有个别鹅只感染禽腺病毒的报道,但都没有进行深入的研究。本研究中,我们从自然感染的病鸭中分离到一株FAdV-4,并将其命名为SDJN株。通过动物试验确定了其对鹅的致病性,从而证实血清4型禽腺病毒可以同时感染鸭和鹅,为养禽生产上该病的防控提供了一定的流行病学资料。主要研究内容如下:1、本研究采用鸡胚卵黄囊接种法从山东济南以心包积液为主要特征的疑似FAdV-4感染的商品鸭肝脏组织中分离到病毒,并对分离毒株进行PCR鉴定、血凝试验、EID50测定、纯净度检测以及Hexon基因序列测定与分析等试验。PCR结果显示该毒株呈禽腺病毒阳性;该分离株不能够凝集鸡的红细胞;纯净度检测结果表明其他常见病毒PCR检测阴性;病毒的EID50为10-7.15/0.2 mL;将分离株的Hexon基因进行测序,确定该分离毒株为血清4型I群腺病毒,并与已发表的血清4型I群禽腺病毒Hexon基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,表明该毒株与另外两个中国大陆分离株在同一分支上,同源性为99.9%,而与韩国、欧洲、美洲株同源性为98.3%98.6%,相对较远。2、为探究FAdV-4分离株对鹅的致病性,本试验将225只1日龄泰州鹅（75只作为对照鹅,150只作为感染鹅）随机分成9个不同的组（6组作为实验组,另外3组作为阴性对照组）。在其10、20和30日龄时,分别通过口服途径和皮下注射途径人工感染6个实验组的鹅,每只鹅接种1mL含病毒的尿囊液,生理盐水接种鹅作为对照组。连续观察15 d,记录感染后的临床症状,并分别在3、6、9、12和15 dpi时,每组随机选择三只鹅进行剖杀,收集组织器官和血液样本。HE染色观察组织病理学变化、提取组织DNA检测各组织中病毒载量。同时以采集的血液分离血清检测生化指标（ALT,AST,LDH,ALP和UREA）和细胞因子（IL-2和IFN-α）。研究结果表明,10日龄皮下攻毒组的鹅临床症状较为明显,表现为精神抑郁和瘫痪,剖检病变表现为心包积液,肝脏、肺脏、肾脏、胸腺均呈现不同程度的出血或肿胀现象,病理组织学结果显示心肌间质水肿和轻度炎性细胞浸润;肝脏细胞核中出现嗜碱性包涵体;脾脏出淋巴细胞减少和局灶性坏死;肺部动脉壁增厚和肺毛细血管充血;肾脏大量液泡坏死,肾小球肿胀和发炎,肾小管脱落和炎性细胞浸润;法氏囊和胸腺均显示淋巴细胞减少和间质水肿。各日龄口服攻毒组和30日龄皮下攻毒组未表现出明显的临床症状和剖检变化。另外,实时定量PCR检测结果显示,收集的各组织器官均检测到了病毒的存在,其中以肝脏和肾脏中病毒含量较高,小日龄攻毒组鹅的病毒载量高于大日零攻毒组。细胞因子水平检测结果为各攻毒组鹅IL-2和IFN-α水平均先上升后下降,表明鹅对FAdV-4的入侵产生了较为强烈的免疫应答。血液生化指标检测显示,10日龄攻毒组的各项指标显着高于对照组,FAdV-4对鹅的心肝肾造成严重损伤,20日龄攻毒组各项指标稍低于10日龄攻毒组,而30日龄攻毒组各指标和对照组差异不显着。以上结果说明鹅对于FAdV-4的感染呈现一种与年龄相关的抵抗力。
孙芹芹[7]（2019）在《FAdV-4和FAdV-8b分离株感染致病性比较病理学研究》文中研究表明禽腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）是一种无囊膜的双股DNA病毒,属于腺病毒科（Adenoviridae）禽腺病毒属（Aviadenovirus）,根据抗原性的差异,被分为3个群（FAdV-ⅠⅢ）,其中Ⅰ群禽腺病毒FAdV-A又分为5个亚群（AE）、12个血清型（FAdV-1至11,其中FAdV-8分为a和b两型）,FAdV-Ⅰ可引起鸡的心包积液综合征（Hydropericardium syndrome,HPS）和包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）。HPS由血清4型禽腺病毒（FAdV-4）感染所致,IBH可由FAdV-8b、FAdV-7和FAdV-11多种血清型FAdV引起。HPS与IBH患病鸡的肝脏均表现出血性坏死和核内包涵体形成,两者肝脏病变性质相同,但只有HPS发生鸡心包积液病变并造成发病鸡急性死亡。2015年HPS在中国突然大面积爆发流行,发病鸡群表现20%70%的死亡率,给养禽业带来了巨大的经济损失。为了探究HPS和IBH致病性的异同,本研究拟对本实验室分离的FAdV-4和FAdV-8b两血清型FAdV的感染致病性进行比较,通过体内外感染试验,对病毒增殖、炎症因子mRNA表达水平和器官、细胞的损伤性反应等进行差异性比较病理学研究。体内感染实验表明,两种病毒分别通过颈部皮下感染SPF雏鸡,两组感染鸡的临床表现、病毒复制能力、病理学变化等方面有所不同,FAdV-4感染雏鸡表现明显的精神萎靡并发生急性死亡,死亡率达60%;FAdV-8b感染组雏鸡仅表现精神沉郁;通过剖检可以看出FAdV-4引起雏鸡心包腔内胶胨样积液,肝脏斑点状出血、点状坏死,肺脏、脾脏、肾脏、胰腺等器官组织都有不同程度的水肿现象;FAdV-8b感染雏鸡肝脏斑点状出血、点状坏死,但未表现出心包积液病变及广泛性器官组织水肿。病理组织学观察发现,FAdV-4和FAdV-8b均可以引起雏鸡肾脏、胰腺和十二指肠不同程度的炎症反应,法氏囊、胸腺以及脾脏淋巴细胞坏死减少;免疫组化检测发现,FAdV-4和FAdV-8b感染SPF雏鸡的肝脏均表现明显的阳性反应,见病变肝细胞核内棕黄色病毒粒子,但在心脏均未发现阳性病毒粒子;两病毒感染雏鸡的胸腺和法氏囊免疫器官指数前期均低于对照组,而后期免疫器官指数开始升高,在感染后期脾脏的免疫器官指数高于对照组。两病毒相比FAdV-4分离株的致病性强于FAdV-8b。体外感染实验表明,荧光定量检测发现两种病毒可以在肝细胞、鸡肝癌细胞大量复制,在心肌细胞内FAdV-4少量增殖,FAdV-8b的增殖效率极低。两种病毒都不能在心脏成纤维细胞内增殖;通过对Il1b、Tnfα、Il6和Il8细胞因子的mRNA的表达检测发现,两病毒均可以引起肝细胞、鸡肝癌细胞和心肌细胞不同程度的炎性反应,FAdV-8b在肝细胞、鸡肝癌细胞引起上述四种细胞因子mRNA表达比较明显,FAdV-4在心肌细胞引起较强的炎性反应;FAdV-8b在血清中细胞因子含量比FAdV-4感染组高,两病毒在心肌细胞和心脏成纤维细胞上清中细胞因子含量检测并没有较明显的差异。通过致病性比较研究显示,两病毒均能对肝脏鸡肝癌细胞具有较强的感染致病性,两者差异不大;FAdV-4在心脏和CM中表现较强的感染致病能力。
毕靖征[8]（2017）在《两株Ⅰ群禽腺病毒致病性和免疫原性研究》文中认为2015年6月以来,我国多数省份发生了以心包积液、包涵体肝炎为特征的禽腺病毒病。该病主要发生于3～5周龄肉鸡,10～20周龄蛋鸡也有发生,但死亡率低于肉鸡。发病后4～8天为死亡高峰,病程8～15天。死亡率约为30%～70%,给我国养鸡业造成了较大的经济损失。2016年鸭、鹅也有发病报道。该病病原主要为Ⅰ群血清4型禽腺病毒,也有分离到血清8型病毒的。在对本实验室分离自发病鸡的两株4型腺病毒进行培养扩增、序列分析的基础上,研究了两株病毒的致病性和免疫原性,为禽腺病毒病疫苗的研发提供参考和帮助。为了提高腺病毒的病毒含量,将本实验室保存的PZ毒株和HN毒株病料研磨液,卵黄囊途径接种7日龄SPF鸡胚,0.2mL/枚,盲传三代,经PCR鉴定正确后,收集尿囊液,分别标记为PZ、HN。死亡鸡胚主要表现为鸡胚发育不良,鸡胚明显偏小,胚体卷曲,全身出血,肝脏肿大出血。尿囊液无血凝性。序列分析发现,两株病毒Hexon基因各存在一个核苷酸突变,PZ毒株650位的氨基酸也发生了突变。两株病毒Hexon基因序列同源性高达99.9%,与血清4型病毒同源性最高。在对PZ和HN两株禽腺病毒的致病性研究中,将48只29日龄SPF鸡随机平均分为8组,每组6只。采用静脉注射和口服两种途径进行攻毒,同时设阴性对照组。攻毒后每日定时观察鸡的发病情况和症状,死亡鸡解剖观察,采集肝脏等器官进行PCR检测和组织病理观察。结果显示,攻毒发病鸡的临床症状和剖检变化与自然发病鸡一致。病死鸡具有特征性的心包积液-肝炎综合征的表现,腺病毒在机体各组织中均有分布,不同组织病毒含量有差异。肝细胞出现大量的脂肪变性和嗜碱性包涵体。结果表明,PZ和HN两株病毒均为高致病性,能够引起鸡的心包积液-肝炎综合征。选取致病性强的HN毒株制成油乳剂灭活疫苗,初步研究腺病毒的免疫原性,将60只22日龄SPF鸡随机平均分为A、B、C、D、E五组,每组12只,前四组为免疫组,皮下注射制备的腺病毒油乳剂灭活疫苗（HN株）,E组注射灭菌的PBS溶液0.5mL作为空白对照。A、B、C、D组免疫剂量分别为0.2mL、0.3mL、0.5mL、0.8mL,免疫后1、2、3周每组各随机取4只采血后静脉注射攻毒,攻毒量为0.5mL/只。结果表明,当免疫剂量为0.8mL,免疫后3周攻毒的保护率为100%,即能完全抵抗Ⅰ群血清4型禽腺病毒的攻击。表明研制的油乳剂灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。
王婉,王彦红,刘伊,金文杰,石火英[9]（2015）在《鸡包涵体肝炎病原检测及病理学观察》文中研究说明取临床疑似鸡包涵体肝炎病例的肝组织,接种SPF鸡胚获取尿囊液,对获取的尿囊液进行PCR扩增和基因测序分析,成功分离并鉴定出1株鸡包涵体肝炎病毒,同时对送检病例采样进行病理组织学观察。将病死鸡肝组织研磨后,经尿囊腔接种9日龄的SPF鸡胚,用获得的尿囊液提取病毒DNA,成功获得DNA模板。根据已发表的Ⅰ群禽腺病毒hexon全基因的保守区域设计并合成1对引物,用这对引物对病毒的DNA模板进行PCR扩增,结果扩增出与目的基因大小一致的片段。病理学观察见肝组织淤血,细胞核浓缩,发生坏死,核内出现包涵体,伴有脂肪变性。测序分析表明,分离株与Ⅰ群禽腺病毒中血清4型相似性为98.6%,与其他血清型的相似性为68.7%96.9%,与Ⅱ群禽腺病毒的鸡出血性肠炎病毒和Ⅲ群禽腺病毒的减蛋综合征病毒的相似性为44.6%,最终确定分离病毒为Ⅰ群禽腺病毒,为进一步鉴定和分离Ⅰ群禽腺病毒提供了依据。
郝东敏[10]（2014）在《山东地区Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及多价油乳剂灭活疫苗的研制》文中研究表明包涵体肝炎（Inclusion Body Hepatitis, IBH）是由Ⅰ群禽腺病毒（Fowl adenovirusⅠ，FAV-Ⅰ）引起的鸡的一种急性传染病。近年来，包涵体肝炎在我国的发病呈上升趋势，给肉鸡饲养业造成了严重的经济损失。因此，本研究了解了山东省鸡包涵体肝炎的流行情况，挑选了四株优势血清型毒株制备多价油乳剂灭活疫苗，其对鸡包涵体肝炎的防治和养鸡业的健康发展具有重要的应用价值。本研究从山东部分地区采集疑似感染鸡包涵体肝炎的肉鸡肝脏，卵黄囊接种5日龄SPF鸡胚盲传三代，收集尿囊液。经PCR鉴定共分离到8株Ⅰ群禽腺病毒，分别命名为SDLY-1、SDLY-2、SDLY-3、 SDYT-1、SDYT-2、SDYN-1、SDYN-2、SDMY。血凝试验显示分离毒株均无血凝性，扩增分离毒株的Hexon基因序列，与GenBank中发表的其他血清型毒株Hexon基因序列比对，结果显示，8个分离株中有2株与血清2型同源性较高，3株与血清10型同源性较高，3株与血清12型同源性较高。动物回归试验结果显示，发病鸡的症状和剖检变化与自然发病鸡一致。从本实验室近年来分离到的Ⅰ群禽腺病毒中，挑选出四株优势血清型毒株制成多价油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的免疫效果进行评估，对预防包涵体肝炎的发生和流行提供科学依据。将四株不同血清型的Ⅰ群禽腺病毒（FAV-2、 FAV-8、 FAV-10、FAV-12）接种SPF鸡胚，收集尿囊液，经甲醛灭活，以矿物油为佐剂制成多价油乳剂灭活疫苗，并对疫苗物理性状，安全性，最小免疫剂量、免疫效力及抗体消长规律进行检测。结果显示，抗原液以甲醛为灭活剂的最适终浓度为1‰，研制的疫苗为油包水剂型，无菌检验合格，物理性状稳定。接种5日龄白羽肉鸡，注苗后均无不良反应，最小免疫剂量为0.3mL/只。肉鸡免疫2周后开始监测其血清抗体水平，结果显示，免疫后2周抗体效价已达5ng/L以上，25d左右抗体浓度达峰值，之后直至肉鸡出栏，抗体效价均高于10ng/L，对照组一直无抗体产生。免疫后IFN-γ和IL-6含量分别在第3d和第7d达到峰值，随后开始缓慢下降至正常水平。免疫保护性试验结果显示，攻毒后临床保护率为100%，能完全抵抗相应血清型病毒的攻击。各项结果表明，研制的油乳剂灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。
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调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 禽腺病毒分类 |
| 1.1.2 病毒培养 |
| 1.1.3 禽腺病毒的形态结构 |
| 1.1.4 病毒的化学组成和理化特性 |
| 1.1.5 禽腺病毒的基因组结构 |
| 1.1.6 禽腺病毒对宿主免疫系统影响 |
| 1.1.7 禽腺病毒对宿主生理生化指标的影响 |
| 1.2 禽腺病毒的流行病学与致病性 |
| 1.2.1 国内外流行现状 |
| 1.2.2 流行规律与致病性 |
| 1.3 禽腺病毒临床症状与病理变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.3.3 鉴别诊断 |
| 1.4 禽腺病毒的实验室诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 电子显微镜法和包涵体检查 |
| 1.4.3 病毒分离 |
| 1.4.4 分子生物学诊断 |
| 1.4.5 血凝试验 |
| 1.4.6 抗原检测 |
| 1.4.7 抗体检测 |
| 1.5 禽腺病毒疫苗研究 |
| 1.6 防控措施 |
| 1.7 试验目的及意义 |
| 第二章 一例西藏鸡心包积液-肝炎综合征的临床及分子诊断 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样本采集与保存 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要材料及试剂 |
| 2.1.4 病鸡剖检和包涵体检查 |
| 2.1.5 病毒基因组DNA、RNA提取 |
| 2.1.6 Hexon基因扩增及测序 |
| 2.1.7 Hexon基因序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床症状 |
| 2.2.2 病理剖检和包涵体检查 |
| 2.2.3 Hexon基因的PCR扩增结果 |
| 2.2.4 Hexon序列同源性分析及种系发育分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清4 型禽腺病毒西藏分离株的分离鉴定及全基因组序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 病毒悬液的制备 |
| 3.1.4 病毒在鸡胚及鸡胚肾细胞中的传代培养 |
| 3.1.5 血凝实验 |
| 3.1.6 半数细胞感染剂量的测定 |
| 3.1.7 病毒对SPF鸡胚致病性 |
| 3.1.8 病毒全基因组测序分析及基因功能注释 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PCR病原鉴定 |
| 3.2.2 血凝实验结果 |
| 3.2.3 病毒感染力测定结果 |
| 3.2.4 病毒对SPF鸡胚致病性 |
| 3.2.5 全基因组高通量测序结果与分析 |
| 3.2.6 FAdV-4 西藏分离株全基因组遗传进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 血清4 型禽腺病毒西藏分离株对雏鸡的致病性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒悬液的制备 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要材料及试剂 |
| 4.1.5 雏鸡的饲养与样品收集 |
| 4.1.6 病理剖检和病理组织学检查 |
| 4.1.7 荧光定量PCR检测各组织FAdV-4 的病毒载量 |
| 4.1.8 ALT、AST、LDH生化指标检测 |
| 4.1.9 ELISA检测IL-6和IFN-γ |
| 4.1.10 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 临床症状 |
| 4.2.2 病理组织学变化 |
| 4.2.3 组织中病毒载量的检测 |
| 4.2.4 生化指标(LDH、AST、ALT)检测 |
| 4.2.5 细胞因子(IL-6、IFN-γ)检测 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 腺病毒病原学研究 |
| 1.1 腺病毒的分类 |
| 1.2 AdV的结构 |
| 1.3 AdV的理化特性 |
| 1.4 AdV的复制 |
| 2 FAdV-Ⅰ的流行病学研究 |
| 2.1 FAdV-Ⅰ的流行现状 |
| 2.2 FAdV-Ⅰ的剖检变化 |
| 2.3 FAdV-Ⅰ的病理变化 |
| 3 FAdV-Ⅰ的诊断 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 血清学检测 |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 4 FAdV-Ⅰ疫苗研究进展 |
| 4.1 弱毒活疫苗 |
| 4.2 灭活疫苗 |
| 4.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 5 FAdV-Ⅰ卵黄抗体研究进展 |
| 5.1 卵黄抗体的结构 |
| 5.2 卵黄抗体的优势 |
| 5.3 卵黄抗体在禽病中的应用 |
| 6 研究目的及意义 |
| 第二章 实验研究 |
| 研究一 鸡Ⅰ群禽腺病毒2、4、8b血清型病毒的扩增与三价灭活苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与耗材 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 SPF级雏鸡、细胞及毒株 |
| 1.4 试验相关溶液制备 |
| 1.5 LMH细胞扩毒 |
| 1.6 PCR鉴定 |
| 1.7 病毒的半数细胞培养物感染量(TCID_(50))测定 |
| 1.8 疫苗的制备 |
| 1.9 油乳剂灭活苗质量检验 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞扩毒结果 |
| 2.2 PCR检测结果 |
| 2.3 病毒的半数细胞培养物感染量(TCID_(50))测定结果 |
| 2.4 油乳剂灭活苗质量检验 |
| 3 讨论 |
| 研究二 鸡Ⅰ群禽腺病毒2、4、8b血清型三价油乳剂灭活苗的免疫效力评估 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与耗材 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 SPF级雏鸡、鸡胚、细胞及毒株 |
| 1.4 雏鸡最小免疫剂量试验 |
| 1.5 免疫雏鸡抗体效价监测 |
| 1.6 雏鸡攻毒保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 雏鸡最小免疫剂量试验结果 |
| 2.2 免疫雏鸡血清抗体效价监测结果 |
| 2.3 雏鸡攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 研究三 鸡Ⅰ群禽腺病毒2、4、8b血清型三价卵黄抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与耗材 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 产蛋鸡、SPF级雏鸡、细胞及毒株 |
| 1.4 产蛋鸡免疫 |
| 1.5 产蛋鸡血清抗体效价监测 |
| 1.6 卵黄抗体的制备与效价监测 |
| 1.7 卵黄抗体质量检验 |
| 1.8 卵黄抗体效力检验 |
| 2 结果 |
| 2.1 产蛋鸡血清抗体效价监测结果 |
| 2.2 产蛋鸡卵黄抗体效价监测结果 |
| 2.3 卵黄抗体质量检验结果 |
| 2.4 卵黄抗体效力检验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 本试验的目的和意义 |
| 2 禽心包积液-肝炎综合征(HHS)的基本概述 |
| 2.1 病原体的生物学特性 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 致病性 |
| 2.4 诊断技术 |
| 3 禽心包积液-肝炎综合征(HHS)的防治 |
| 3.1 油乳剂灭活疫苗 |
| 3.2 基因工程疫苗 |
| 3.3 DNA重组疫苗 |
| 3.4 防治措施 |
| 4 卵黄抗体概述 |
| 4.1 IgY的产生 |
| 4.2 IgY的特性 |
| 4.3 IgY的优势 |
| 4.4 IgY的应用 |
| 5 脂质体概述 |
| 5.1 脂质体的发现 |
| 5.2 脂质体的特性 |
| 5.3 脂质体的分类 |
| 5.4 脂质体的制备 |
| 5.5 脂质体的应用 |
| 第二章 TJ1607 毒株的纯化与免疫疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 TJ1607 毒株PCR鉴定结果 |
| 2.2 TJ1607 纯化毒株ELD_(50)测定结果 |
| 2.3 剂型检验结果 |
| 2.4 无菌检验结果 |
| 2.5 稳定性检验结果 |
| 2.6 安全性检验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 天津地区HHS的发病原因 |
| 3.2 TJ1607 毒株的增殖 |
| 3.3 TJ1607 毒株的纯化 |
| 3.4 疫苗佐剂 |
| 4 小结 |
| 第三章 精制高免卵黄抗体与IgY脂质体的制备 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 免疫前抗体检测结果 |
| 2.2 免疫后抗体检测结果 |
| 2.3 卵黄免疫球蛋白的检测结果 |
| 2.4 卵黄免疫球蛋白提纯前后的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TJ1607 IgY脂质体的制备 |
| 3.2 TJ1607 IgY的提纯 |
| 3.3 SDS-PAGE配置 |
| 4 小结 |
| 第四章 TJ1607 血清抗体间接ELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 TJ1607 最佳包被抗原和最佳一抗稀释度的选择结果 |
| 2.2 最佳二抗工作浓度的选择结果 |
| 2.3 重复性试验结果 |
| 2.4 标准曲线的绘制结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 ELISA试验中酶标板的选择 |
| 3.2 ELISA试验中抗原的选择 |
| 3.3 ELISA试验中误差的分析 |
| 4 小结 |
| 第五章 TJ1607 卵黄抗体液的动物保护试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 精制TJ1607 卵黄抗体液攻毒动物保护试验结果 |
| 2.2 TJ1607 卵黄抗体液被动抗体动态消长试验结果 |
| 2.3 TJ1607 卵黄抗体液口服试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 IgY对抗体水平的影响 |
| 3.2 IgY脂质体的优势 |
| 3.3 综合防治措施 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 禽腺病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 腺病毒 |
| 1.2 禽腺病毒 |
| 1.3 禽腺病毒的形态特征 |
| 1.4 禽腺病毒的基因组结构及其编码蛋白 |
| 2 Ⅰ群4型禽腺病毒流行病学 |
| 2.1 流行情况 |
| 2.2 临床症状 |
| 2.3 剖检病变 |
| 2.4 传播情况 |
| 3 Ⅰ群4型禽腺病毒诊断方法 |
| 3.1 病毒的分离培养 |
| 3.2 病毒形态学检测 |
| 3.3 血清学检测 |
| 3.4 分子生物学检测 |
| 4 Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗的研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 口服减毒活疫苗 |
| 4.3 重组(亚单位)疫苗 |
| 5 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体的研究进展 |
| 第二章 Ⅰ群4型腺病毒的分离鉴定及致病性试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品的采集 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 参考毒株序列 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 试验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离培养 |
| 2.2 病毒的鉴定 |
| 2.3 Ⅰ群4 型禽腺病毒对鸡胚的致病作用 |
| 2.4 Ⅰ群4 型禽腺病毒对1 日龄SPF鸡的致病性试验 |
| 2.5 Ⅰ群4 型禽腺病毒对21 日龄SPF鸡的致病作用 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 3.2 鸡胚的感染及病变情况 |
| 3.3 1日龄SPF鸡感染结果 |
| 3.4 21日龄鸡的感染及排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 试验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 疫苗毒株的筛选 |
| 2.2 疫苗的制备 |
| 2.3 疫苗的检验 |
| 2.4 疫苗的保护效力研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗毒株的筛选结果 |
| 3.2 最佳灭活条件优化 |
| 3.3 灭活疫苗的性状检验结果 |
| 3.4 灭活疫苗的保护效力 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体的制备及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株与疫苗 |
| 1.2 健康高产蛋鸡 |
| 1.3 引物的合成 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 卵黄抗体的制备 |
| 1.6 SPF鸡的饲养、卵黄抗体的注射与攻毒 |
| 1.7 剖检及病毒在组织脏器中分布情况的PCR检测 |
| 1.8 排毒情况检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 卵黄抗体的性状检验结果 |
| 2.2 卵黄抗体的保护力试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽腺病毒的概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 禽腺病毒分类 |
| 1.2.2 病毒结构 |
| 1.2.3 致病特性 |
| 1.3 禽腺病毒病的流行病学研究 |
| 1.3.1 4型禽腺病毒病在国外的流行情况 |
| 1.3.2 4型禽腺病毒病在国内的流行情况 |
| 1.4 禽4型腺病毒病的诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 病原学诊断 |
| 1.4.3 病理学诊断 |
| 1.4.4 血清学诊断 |
| 1.4.5 其他检测方法 |
| 1.5 防制措施 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 禽腺病毒Ⅰ群4型亚单位疫苗制备和效力评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂和蛋白 |
| 2.1.2 主要细胞、血清和毒株 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 试验动物和地点 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 禽腺病毒Ⅰ群4型亚单位疫苗(F-iber-2)制备 |
| 2.2.2 最低剂量免疫试验和效力试验评价 |
| 2.2.3 禽腺病毒Ⅰ群4型亚单位疫苗(Fiber-2)免疫血清中和试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 最低剂量免疫试验结果 |
| 2.3.2 攻毒保护试验结果 |
| 2.3.3 临床症状 |
| 2.3.4 病理变化 |
| 2.3.5 血清中和试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 胶体金试纸条快速检测4型禽腺病毒抗体方法的初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 蛋白 |
| 3.1.2 血清 |
| 3.1.3 胶体金相关试剂及耗材 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 胶体金试纸条T线、C线划线 |
| 3.2.2 胶体金标记蛋白 |
| 3.2.3 上机喷金 |
| 3.2.4 组装试纸条 |
| 3.2.5 血清样本检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胶体金试纸条特异性检测结果 |
| 3.3.2 胶体金试纸条稳定性试验检测结果 |
| 3.3.3 胶体金试纸条检测Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫血清结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽腺病毒感染的病原学 |
| 1.1.1 禽腺病毒分类 |
| 1.1.2 形态学 |
| 1.1.3 理化特性和培养特性 |
| 1.1.4 分子生物学特性 |
| 1.1.5 禽腺病毒对宿主免疫系统影响 |
| 1.1.6 禽腺病毒对宿主生理生化指标的影响 |
| 1.2 禽腺病毒感染的研究进展 |
| 1.2.1 流行病学 |
| 1.2.2 临床症状 |
| 1.2.3 病理变化 |
| 1.2.4 禽腺病毒的实验室诊断方法 |
| 1.2.5 防控措施 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物、鸡胚、载体、菌株及毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 血清4型I群禽腺病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.2 病料处理与病毒的传代 |
| 2.2.1.3 病毒DNA的提取和PCR鉴定 |
| 2.2.1.4 病毒Hexon基因测序 |
| 2.2.2 血清4型I群禽腺病毒对鹅的致病性 |
| 2.2.2.1 病毒的EID50 测定 |
| 2.2.2.2 试验方案 |
| 2.2.2.3 组织病理学检查 |
| 2.2.2.4 病毒载量检测 |
| 2.2.2.5 细胞因子的检测 |
| 2.2.2.6 血液生化指标检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清4型I群禽腺病毒的分离鉴定 |
| 3.1.1 病毒分离 |
| 3.1.2 PCR鉴定 |
| 3.1.3 Hexon基因序列分析 |
| 3.2 血清4型I群禽腺病毒对鹅的致病性 |
| 3.2.1 临床症状 |
| 3.2.2 剖检病变 |
| 3.2.3 组织病理学检查 |
| 3.2.4 病毒载量检测 |
| 3.2.5 血清中细胞因子的检测 |
| 3.2.6 血清中生化指标的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 FAdV分类 |
| 1.1.2 FAdV的形态结构和理化特性 |
| 1.1.3 FAdV的复制 |
| 1.2 FAdV流行病学 |
| 1.3 FAdV-Ⅰ感染鸡的临床表现、病理变化 |
| 1.3.1 临床表现 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 FAdV感染与免疫反应 |
| 1.5 FAdV感染与炎性反应 |
| 1.6 禽腺病毒病防控措施 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 试验方法与步骤 |
| 2.3.1 FAdV-4和FAdV-8b的纯化 |
| 2.3.2 病毒TCID50的测定 |
| 2.4 动物试验 |
| 2.4.1 免疫器官指数测定 |
| 2.4.2 干湿重检测 |
| 2.4.3 常规石蜡切片方法 |
| 2.4.4 免疫组织化学方法 |
| 2.4.5 病毒DNA的提取 |
| 2.4.6 荧光定量标准曲线的建立 |
| 2.4.7 RNA提取 |
| 2.4.8 RNA反转录及荧光定量检测 |
| 2.5 体外感染试验 |
| 2.5.1 LMH细胞复苏 |
| 2.5.2 LMH细胞计数 |
| 2.5.3 LMH细胞传代 |
| 2.5.4 LMH细胞冻存 |
| 2.5.5 CM、CF的分离培养及鉴定 |
| 2.5.6 病毒在LMH、CM和 CF中感染增殖 |
| 2.6 感染鸡肝脏和心脏组织的炎症因子检测 |
| 2.7 病毒感染LMH和 CM的炎症因子检测 |
| 2.8 炎症因子含量检测 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 FAdV-4和FAdV-8b对 SPF雏鸡致病性比较研究 |
| 3.1.1 两病毒感染雏鸡的临床症状 |
| 3.1.2 感染鸡均表现典型的剖检病变 |
| 3.1.3 感染鸡的肝脏和心脏组织病理学变化 |
| 3.1.4 其他器官的组织病理学变化 |
| 3.1.5 器官水肿病变检测 |
| 3.1.6 免疫器官指数检测 |
| 3.2 两病毒感染致病性研究 |
| 3.2.1 两病毒在感染鸡肝脏和LMH细胞内增殖情况 |
| 3.2.2 两病毒在感染鸡的心脏、CM和 CF中增殖表现 |
| 3.2.3 两病毒感染雏鸡的肝脏和心脏炎症反应 |
| 3.3.3.1 两病毒引起的肝脏炎症反应 |
| 3.3.3.2 两病毒引起的心脏炎症反应 |
| 3.3.3.3 两病毒感染致细胞因子含量检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号和缩略词 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 Ⅰ群禽腺病毒的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 Ⅰ群禽腺病毒的特点 |
| 2.1 病原分类 |
| 2.2 形态学和理化特性 |
| 3 Ⅰ群禽腺病毒的致病性与流行病学 |
| 4 Ⅰ群禽腺病毒病的病理学研究 |
| 4.1 病理剖检病变 |
| 4.2 组织病理学变化 |
| 5 Ⅰ群禽腺病毒的诊断方法 |
| 5.1 病原分离 |
| 5.2 组织病理学诊断 |
| 5.3 血清学诊断方法 |
| 5.4 分子生物学检测 |
| 5.5 中兽医辩证 |
| 6 Ⅰ群禽腺病毒的防治 |
| 6.1 Ⅰ群禽腺病毒油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 6.2 Ⅰ群禽腺病毒基因工程重组亚单位疫苗 |
| 7 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 两株Ⅰ群禽腺病毒的扩增鉴定及序列分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、鸡胚和1%红细胞 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒繁殖与传代 |
| 2.2 病毒DNA的提取 |
| 2.3 病毒的纯净性检测 |
| 2.4 引物设计与合成 |
| 2.5 Hexon基因的PCR扩增 |
| 2.6 目的片段回收测序 |
| 2.7 序列分析与进化树绘制 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 病毒繁殖与传代 |
| 3.2 病毒纯净性检测结果 |
| 3.3 病毒的血凝性 |
| 3.4 Hexon基因的PCR扩增 |
| 3.5 Hexon基因的序列分析 |
| 3.6 氨基酸序列对比分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三篇 试验研究 |
| 第三章 Ⅰ群禽腺病毒的致病性和免疫原性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、实验动物、细胞 |
| 1.2 仪器设备与试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 SPF鸡分组与攻毒 |
| 2.2 组织病理学观察 |
| 2.3 PCR检测鸡病变组织中病毒分布 |
| 2.4 鸡胚原代肝细胞的制备 |
| 2.5 禽腺病毒分离株在CELi上的增殖 |
| 2.6 禽腺病毒病油乳剂灭活疫苗的效力测定 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 FAdV-4对SPF鸡的致病性 |
| 3.2 剖检病变 |
| 3.3 组织病理学变化 |
| 3.4 PCR检测死亡鸡病变组织中病毒分布 |
| 3.5 禽腺病毒在CELi上的增殖 |
| 3.6 禽腺病毒病油乳剂灭活疫苗的效力测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要设备及试剂 |
| 1.2 病料及处理 |
| 1.3 病理学观察 |
| 1.4 鸡胚接种 |
| 1.5 病毒 DNA的提取 |
| 1.6 引物设计和合成 |
| 1.7 鸡包涵体肝炎病毒hexon基因的扩增 |
| 1.8 测序和分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 大体病变结果 |
| 2.2 病理学观察结果 |
| 2.3 PCR检测结果 |
| 2.4 测序结果 |
| 3 讨 论 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡包涵体肝炎的研究进展 |
| 1.1.1 病原学研究 |
| 1.1.2 发病机理的研究 |
| 1.1.3 流行病学研究 |
| 1.1.4 病理学研究 |
| 1.1.5 鸡包涵体肝炎的诊断 |
| 1.1.6 IBH 的鉴别诊断 |
| 1.1.7 鸡包涵体肝炎的预防与治疗 |
| 1.2 禽腺病毒疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 Ⅰ 群禽腺病毒油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 1.2.2 Ⅰ 群禽腺病毒 DNA 疫苗的研制 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料、1%血细胞 |
| 2.1.2 试验鸡胚、动物及毒株 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 试验相关溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 鸡包涵体肝炎多价油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 病毒的 PCR 鉴定结果 |
| 3.1.3 病毒的血凝性 |
| 3.1.4 Hexon 基因的 PCR 扩增结果 |
| 3.1.5 Hexon 基因的序列比对分析 |
| 3.1.6 动物回归试验结果 |
| 3.2 鸡包涵体肝炎油乳剂灭活疫苗的研制结果 |
| 3.2.1 种毒的纯净性检测结果 |
| 3.2.2 种毒鸡胚半数感染量（EID50）的测定结果 |
| 3.2.3 抗原的最佳灭活剂浓度和最佳灭活时间 |
| 3.2.4 灭活油乳剂疫苗常规检验结果 |
| 3.2.5 安全性检验结果 |
| 3.2.6 免疫剂量结果 |
| 3.2.7 ELISA 检测试剂盒标准曲线的绘制 |
| 3.2.8 免疫抗体水平监测结果 |
| 3.2.9 IFN-γ及 IFN-6 水平监测 |
| 3.2.10 攻毒保护性试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
