鲁玉杰,李霁瀛,梅芝建,王争艳,卢少华[1]（2021）在《缓步威伪蝎对几种储粮害虫的捕食偏好性研究》文中认为缓步威伪蝎（Withius piger Simon, 1878）（以下简称:伪蝎）是我国分布主要储粮害虫的一种天敌。研究其毒液和捕食偏好性对于开发储粮害虫的生物防治技术具有重要意义。本文主要研究缓步威伪蝎对不同状态猎物的捕食优先选择性、对不同物种幼虫的捕食偏好性以及伪蝎的毒液和消化液的成分等。研究的主要结果如下:（1）在伪蝎捕食优先选择性中发现,伪蝎一般优先选择捕食活的赤拟谷盗（Tribolium castaneum Herbst）幼虫,其次是动态的死虫,捕食最少的是静态的滤纸。（2）在伪蝎捕食偏好性的研究中,根据伪蝎捕食赤拟谷盗幼虫的数量和捕食锈赤扁谷盗（Cryptolestes ferrugineus Stephens）幼虫的数量计算得出的Cain值小于1,表明对锈赤扁谷盗有明显的捕食偏好性;根据伪蝎捕食杂拟谷盗（Tribolium confusum Jac.du Val）幼虫数量和锯谷盗（Oryzaephilus surinamensis Linne）幼虫的数量计算得出的Cain值小于1,表明伪蝎偏好捕食锯谷盗幼虫;伪蝎在嗜卷书虱（Liposcelis bostrychophia）和嗜虫书虱（L.entomophila）之间捕食量基本相同,计算得出的Cain值也很接近于1,表明伪蝎在两者之间无明显偏好性,但两者的被捕食量都很大。通过以上研究,可以确定伪蝎捕食优先选择动态的、新鲜的猎物,且偏好捕食个体较小的猎物。在捕食过程中,先利用触肢中毒液麻痹猎物后用螯肢中消化液消化猎物,然后吸食。研究发现伪蝎可以捕食多种储藏物害虫,是生物防治的重要对象。
梅芝健[2]（2019）在《黄色花蝽及缓步威伪蝎捕食主要储粮害虫作用效果的研究》文中研究说明研究储粮害虫捕食性天敌的捕食作用,对开发新的生物防治方法、减少化学污染、减少储粮害虫抗药性等具有重要的意义。本文主要确认了两种主要储粮害虫捕食性天敌优势种;研究了黄色花蝽Xylocoris flavipes（Reuter）和缓步威伪蝎Withius piger（Simon,1878）对11种储粮害虫的捕食谱,以及黄色花蝽和缓步威伪蝎对赤拟谷盗Tribolium castaneum（Herbst）、杂拟谷盗Tribolium confusum（Jac.du Val）、嗜虫书虱Liposcelis entomophila、嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila（Badonnel）、锈赤扁谷盗Cryptolestes ferrugineus（Stephens）、烟草甲Lasioderma serricorne（Fabricius）等9种储粮害虫的捕食能力。探讨了缓步威伪蝎捕食嗜卷书虱的功能反应和黄色花蝽对嗜卷书虱、赤拟谷盗、锯谷盗和锈赤扁谷盗的捕食功能反应及其参数,并在模拟仓和实仓条件下研究了黄色花蝽对储粮害虫的控制能力。主要结果如下:1、对第四储粮生态区、第五储粮生态区和第七储粮生态区进行捕食性天敌调查,结果发现黄色花蝽及缓步威伪蝎为储粮害虫捕食性天敌优势种;试验室条件下测定黄色花蝽和缓步威伪蝎的捕食虫谱,发现黄色花蝽可捕食赤拟谷盗、锯谷盗、锈赤扁谷盗、烟草甲、嗜虫书虱、嗜卷书虱等11种重要储粮害虫的幼虫（若虫）和卵;而缓步威伪蝎仅能捕食以上11种储粮害虫的幼虫（若虫）,对卵没有捕食能力。2、缓步威伪蝎捕食赤拟谷盗捕食行为过程分为5个过程:寻找、捕获（钳住猎物）、麻痹、吸食汁液和休息;缓步威伪蝎对赤拟谷盗3龄幼虫日捕食量最大19.0头/日;对3龄烟草甲日捕食最小为1.2头/日;缓步威伪蝎对3龄嗜卷书虱的捕食功能反应研究结果表明:嗜卷书虱在10头160头的密度范围内符合Holling II模型,其中理论最大捕食量为78.7头,发现域为0.03 m2。3、研究了黄色花蝽雌成虫对3龄的赤拟谷盗、锈赤扁谷盗、锯谷盗、嗜卷书虱幼虫（若虫）的防控能力,以及黄色花蝽对9种重要储粮害虫的捕食能力,比较发现黄色花蝽对赤拟谷盗捕食最多,为18.8头/天;在室内条件下研究了黄色花蝽对以上几种储粮害虫的3龄幼虫的捕食功能反应方程,以及对以上储粮害虫寻找效应、种内干扰反应和对不同猎物的捕食偏好。结果表明:黄色花蝽雌成虫对3龄的赤拟谷盗、锈赤扁谷盗、锯谷盗幼虫,嗜卷书虱若虫的捕食功能反应方程均符合HollingⅡ圆盘方程。根据方程拟合发现黄色花蝽对3龄嗜卷书虱日捕食量最多,最大为44.6头/天。黄色花蝽对各种4、害虫的寻找效应均随着猎物密度的增大而减小。当猎物的密度达到一定数量后,随着黄色花蝽数量的增多,捕食猎物的平均捕食率随之下降。通过比较黄色花蝽对不同害虫的偏好选择Cain指数,结果表明黄色花蝽更偏好捕食锯谷盗和锈赤扁谷盗3龄幼虫。5、通过控制模拟仓控制温度为28±1℃、湿度50±10%条件下接入黄色花蝽和在实仓投放一定数量的黄色花蝽。结果表明:投放不同数量黄色花蝽在模拟仓内下,3个月后对4种储藏害虫控害效果均达到70%以上,益害比对储藏害虫并无显着影响,黄色花蝽对4种害虫的控害效果为锯谷盗>嗜卷书虱>锈赤扁谷盗>赤拟谷盗。在第五储粮生态区和第七储粮生态区实仓投放黄色花蝽,韶关库投放98天后发现,对害虫的控害率为56.3%;在长沙库,控害率也达到了56.7%,由此表明黄色花蝽可作为储藏物害虫天敌,且具有研究和应用前景。
苗迪[3]（2018）在《家蚕二分浓核病毒重组病毒的致病性及生物安全性研究》文中提出家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus,BmBDV）属于二分DNA病毒科二分浓核病毒属。BmBDV基因组由两个线性单链分子（VD1,VD2）组成。BmBDV主要在家蚕中肠细胞中复制,导致家蚕患浓核症类似症状。BmBDV基因组结构与细小病毒相似,复制方式与腺病毒类似。因此,BmBDV具有开发成兼具细小病毒与腺病毒特征的病毒载体的潜能。BmBDV通过重组外源基因,可以创建具有特定功能的病毒载体。如通过遗传改造开发成新型安全高效的生物杀虫剂。从东亚钳蝎中分离出的蝎毒素BmK ITa1是一种抑制型抗昆虫毒素,由65个氨基酸残基组成,具有对昆虫专一选择性的神经麻痹致死作用。在BmBDV重组病毒中引入蝎毒素BmK ITa1基因,是否能够增强BmBDV毒杀害虫的作用尚不清楚。本研究的主要内容包括:?构建重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体;?重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒对昆虫细胞和家蚕的感染性;?重组BmK ITa1病毒对哺乳动物细胞的感染性;（4）BmBDV病毒的基因与其它昆虫病毒基因的同源性。研究结果如下;（1）构建重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体。首先构建了BmK ITa1基因表达盒。将公司合成的两端携带酶切位点的BmK ITa1基因插入到杆状病毒立刻极早期基因启动子ie1和sv40加尾信号序列之间,构建成蝎毒素表达盒质粒pT-ie1-BmK ITa1-sv40。然后在BmBDV次要结构蛋白mcp基因中插入蝎毒素BmK ITa1表达盒,构建了重组蝎毒素病毒载体pVD2-mcp/BmK ITa1。（2）重组BmK ITa1基因的BmBDV病毒载体对昆虫细胞和家蚕的感染性。重组病毒pVD2-mcp/BmK ITa1与原病毒基因组（VD1,VD2）线性化后共转染Hi5昆虫细胞。与转染pUC119的对照相比,细胞在转染96小时后出现变圆,漂浮等症状,继续培养出现细胞破裂,与原病毒基因组（线性化的VD1,VD2）感染一致。使用特异性引物反转录PCR在病变细胞中检测到BmK ITa1基因的转录;使用His和VP单克隆抗体Western blot检测到蝎毒蛋白和病毒VP蛋白。将病变的Hi5细胞裂解液经桑叶涂布添食易感BmBDV家蚕幼虫,回感4天后幼虫出现厌食,痉挛,麻痹死亡等症状。表明重组的外源BmK ITa1基因能够在家蚕中肠中表达并增强BmBDV的毒力。（3）重组BmK ITa1病毒对哺乳动物细胞的感染性。重组病毒pVD2-mcp/BmK ITa1与原病毒基因组（VD1,VD2）线性化后共转染小鼠成纤维细胞L929,在转染后细胞生长状态正常,直至转染后10d与空白对照细胞无明显差异。使用反转录PCR未检测到蝎毒素基因的转录;Western blot也未检测到病毒VP蛋白的表达,说明在转染后L929细胞中没有病毒粒子产生,初步认为重组蝎毒素BmBDV载体不感染哺乳动物细胞。（4）BmBDV病毒的基因与其它昆虫病毒基因的同源性。使用Blast搜索序列相似蛋白,进化分析结果显示VD1的ns1和vp基因与浓核病毒的ns1和vp基因同源,DNA聚合酶polB与真核生物自合成DNA转座子（波林顿转座子）中的聚合酶基因同源,ns1和vp基因在同一条链,推测该病毒起源于一个原始的单义浓核病毒,通过基因转移从波林顿转座子中获得了DNA聚合酶基因,并以浓核病毒单义向双义进化机制,组装基因组;VD2的NS3蛋白与颗粒体病毒和双义浓核病毒NS3蛋白同源,次要结构蛋白mcp基因来源于双链RNA呼肠孤病毒,推测VD2起源于一个原始的双义浓核病毒。终上所述,研究表明重组BmK ITa1基因加速家蚕幼虫的死亡,增强了BmBDV致病性;BmBDV对小鼠成纤维细胞L929无感染性,具备哺乳动物生物安全性;进化分析发现VD1起源于单义浓核病毒,VD2起源于双义浓核病毒。本研究对进一步了解BmBDV的特性及其用于病毒载体的研究具有重要意义。
苗艳艳[4]（2017）在《AcMNPV-BmK IT通过调控P35和GP64促进子代病毒增殖的研究》文中进行了进一步梳理杆状病毒是一类有囊膜的双链DNA病毒,易侵染节肢动物,尤其是昆虫。所以,杆状病毒在控制虫害方面发挥重要作用。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）是一种研究最深入的杆状病毒,被广泛用作生物杀虫剂。目前由于其作为杀虫剂还有一定的局限性,所以研究者利用基因工程的方法来提高其杀虫活性,比如删除不必要的基因、插入抗虫毒素基因等。BmK IT是一种来源于东亚钳蝎的昆虫特异性毒素,本实验室前期构建了AcMNPV-BmK IT（IE1）重组病毒,并发现其能提高p35的转录水平。杆状病毒P35作为抗凋亡蛋白,既可以抑制细胞的凋亡,又能促进病毒的增殖。因此,研究AcMNPV-BmK IT通过调控P35蛋白如何影响宿主凋亡与病毒增殖之间的关系对于分析提高病毒的杀虫活性是至关重要的。而GP64蛋白作为出芽型病毒BV特有的囊膜蛋白,对于病毒的出芽是必需的。之前研究表明由AcMNPV IE1启动子介导表达的BmK IT可以提高病毒的复制,那么研究P35蛋白和GP64的调控关系以及BmK IT是否和如何调控GP64的表达进而影响病毒的增殖就显得尤为重要。本课题在实验室前期工作的基础上,通过三部分实验来研究AcMNPV-BmK IT如何调控P35和GP64从而提高子代病毒的增殖,可为揭示AcMNPV介导表达的BmK IT在细胞和分子水平的抗虫机制提供依据。第一部分:重组病毒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP的构建。利用Bac to Bac系统将Ac-p35基因与Ac-gp64基因插入中间载体pFastBacDual-EGFP,获得重组质粒pFastBacDual-p35-EGFP和pFastBacDual-gp64-EGFP。再将重组质粒转入DH10Bac感受态,获得重组杆粒Bacmid-p35-EGFP和Bacmid-gp64-EGFP。接着,将重组杆粒Bacmid-p35-EGFP和Bacmid-gp64-EGFP转染Sf9细胞,获得重组病毒颗粒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP。通过蚀斑实验测定病毒活力,AcMNPV-p35-EGFP的活力为2×106 pfu/ml,而AcMNPV-gp64-EGFP的病毒的活力为1×106 pfu/ml。这为后续研究提供了材料。第二部分:AcMNPV-BmK IT通过调控P35蛋白影响宿主凋亡与病毒增殖之间的互作。本课题组前期实验结果表明AcMNPV-BmK IT（IE1）与AcMNPV相比可提高病毒的复制,并能上调病毒凋亡抑制基因p35的转录水平,那么P35蛋白的上调表达会对宿主细胞产生怎样的影响?这一节我们分析了过表达P35是如何影响宿主凋亡与病毒增殖之间的互作。首先,为分析P35如何影响宿主Sf9细胞关键凋亡蛋白SfP53的表达,我们用AcMNPV和AcMNPV-p35-EGFP侵染Sf9细胞,western blot检测了SfP53的表达情况。结果表明,与对照组相比,AcMNPV-p35-EGFP侵染36 h后能够延缓SfP53的表达,且其表达量在病毒侵染48 h后达到最大,是AcMNPV处理组的1.4倍。由于P53是ATM与ATR最重要的底物之一,那么过表达P35又是如何调控DNA损伤应答?用喜树碱（CPT）、AcMNPV和AcMNPV-p35-EGFP处理Sf9细胞,western blot检测了组蛋白H2AX的磷酸化水平。结果表明,两组病毒处理组均能观察到与喜树碱（CPT）处理组中类似的现象,但是AcMNPV-p35-EGFP处理组在侵染Sf9细胞12-36 h后,H2AX的磷酸化水平明显高于AcMNPV处理组组。为了进一步分析强烈的DNA损伤应答是否与病毒的复制有关,我们检测了gp64基因的转录水平以及子代病毒的生成量。结果表明,与AcMNPV处理组相比,AcMNPV-p35-EGFP能够显着的提高gp64的转录水平,并且在侵染96 h后,转录水平是AcMNPV处理组的39524.60倍。而且较AcMNPV处理组,子代病毒的产量从病毒侵染24 h后开始有显着性变化,直到侵染96 h后,子代病毒的产量提高了25.5%。为了进一步研究过表达P35后病毒与宿主之间的相互关系,用Realtime-PCR检测了P35对病毒凋亡抑制基因iap1/2的影响,结果表明,过表达P35均能提高iap1/2的转录水平,但是更有利于iap1的转录,在病毒侵染96 h后,其转录水平是AcMNPV处理组的47952.18倍。以上结果揭示了AcMNPV-BmK IT通过调控P35来提高子代病毒增殖的机制。第三部分:为了验证上述机制,我们选择受P35调控的重要的病毒囊膜蛋白GP64为研究对象,分析受AcMNPV早、晚期启动子IE1、P10和PH调控的三种病毒AcMNPV-BmK IT（IE1,P10,PH）对GP64的表达进而对病毒增殖的影响。首先,为明确GP64在子代病毒生成中的作用,我们用AcMNPV与AcMNPV-gp64-EGFP处理Sf9细胞,检测子代病毒的生成量,结果表明,AcMNPV-gp64-EGFP侵染Sf9细胞26 h、32 h后,较AcMNPV处理组,子代病毒的生成量分别提高了11.34%、12.69%,这说明GP64是子代病毒囊膜生成过程中关键的蛋白,过表达GP64可提高子代病毒的增殖量。接着,为了分析重组病毒AcMNPV-BmK IT对子代病毒生成关键蛋白GP64定位与表达的影响,用AcMNPV、AcMNPV-BmK IT（IE1,P10,PH）四种病毒侵染细胞6-32 h,免疫荧光分析不同处理组中不同时间点GP64的定位以及积累量,结果表明,在四种病毒侵染6 h后均有GP64的表达,但经IE1启动子调控的BmK IT处理组,提早了GP64蛋白在细胞质的积累并向细胞膜转移,推测有利于病毒的提早出芽。而相较于AcMNPV-BmKIT（IE1）处理组,经P10和PH启动子调控的BmK IT处理组,推迟了GP64在细胞质中的大量积累,但这也为病毒的出芽提供了有利的条件。这些结果说明不同启动子调控表达的BmK IT对GP64的分布以及表达量均有明显的影响。最后,分别用三种重组病毒以及野生型病毒处理Sf9细胞6-32 h,取上清检测子代病毒的生成量,结果经统计学分析表明,三种重组病毒处理组子代病毒的生成量高于野生型病毒处理组,并且经P10调控的BmK IT处理组病毒的生成量要高于经IE1以及PH调控的BmK IT处理组。在病毒侵染细胞32 h后,AcMNPV-BmK IT（P10）处理组中,子代病毒的生成量比AcMNPV、AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-Bm K IT（PH）处理组分别提高了15.7%、12.3%、10.5%。以上结果证实了AcMNPV介导表达的BmK IT能够促进p35基因的表达,进而促进gp64基因的表达,最终促进子代病毒的增殖。本实验结果可进一步推进基于重组昆虫特异性毒素的AcMNPV病毒感染宿主分子机理的研究,并对提高昆虫杆状病毒杀虫剂活性和科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。
刘霞,薛保平,章旭日,白占涛[5]（2016）在《东亚钳蝎蝎毒组分初测》文中认为为探明陕北东亚钳蝎蝎毒的组分含量,挖掘陕北产蝎子资源的医药用价值,本研究采用Lowry法、苯酚比色法、索氏提取法、冷冻干燥法等经典方法,对采自延安市宝塔区杨家岭后山的东亚钳蝎蝎毒中的可溶性蛋白质、总糖、粗脂肪、水分及不溶物含量等进行了测定。结果表明,该地特产蝎子的蝎毒干粉中,可溶性蛋白含量为46.3%,总糖含量为3.43%,粗脂肪含量为7.23%,不溶物质含量为31.8%,蝎毒液中水分含量为90%。这些结果为陕北产蝎毒的功能组分研究与商品化提供了一定的实验依据。
姚梦[6]（2016）在《大理石纹蝎多肽毒素的基因克隆、原核表达与纯化研究》文中研究说明大理石纹蝎（Lychas mucronatus）是广泛分布于我国南部以及东南亚等地区的蝎子物种。研究表明大理石纹蝎分泌的毒液中含有大量的生物活性成分,是许多新型药物试剂研发的天然资源宝库。大理石纹蝎子毒液中富含许多有着三或四对二硫键的小分子多肽毒素。这些多肽类毒素能够高特异性地与多种电压敏感型通道发生作用,进而可以改变电压门控的动力学特征或者阻断通道的离子电流,故而具有着极其重要的生理功能和研究价值。由于从蝎子活体中直接分离出组分不一的多肽蝎毒素是相当的困难,二硫键的存在又使得化学合成按照蛋白质天然构象进行折叠的多肽毒素同样有很大的难度,故而采用基因重组技术来获取高产量的活性多肽毒素逐渐成为研究热点。GT028649和GT028758是从dbEST数据库中检索获得的可能具有生理活性的大理石纹蝎多肽毒素分子。它们分别由62个和63个氨基酸组成,其中都含有八个半胱氨酸,配对形成了四对二硫键。通过RF克隆方法将这两种毒素分子的DNA序列插入到表达载体pET-His-SUMO中,利用大肠杆菌表达系统在E.coli SHuffle菌株中自动诱导表达重组蛋白。表达出的融合蛋白经过镍柱亲和层析和超滤纯化之后,利用Ulp1激酶对其进行消化酶切,切除与目的蛋白相连的His-SUMO融合标签。通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）进一步分离纯化酶切液获得高纯度的目的蛋白。使用MALDI-TOF/TOF仪对冻干之后的蛋白样品进行质谱鉴定分析,结果显示表达出的两种蛋白分子量分别为7279.3230Da和7280.6279 Da,与GT028649和GT028758的分子量理论值（分别为7278 Da和7281 Da）相一致,表明实验成功的表达纯化出了含有四对二硫键的蝎毒素分子,后续的实验中也会对这两种表达蛋白产物进行电生理活性检测。本文研究为深入探究蝎毒素的结构功能以及新型多肽类药物的研发等奠定了基础。
孙正博[7]（2012）在《重组蝎氯毒素靶向抗神经胶质瘤及其肿瘤诊断研究》文中研究说明神经胶质瘤是一种起源于胶质细胞的原发性颅内肿瘤,是中枢神经系统最常见而又最难诊治的恶性肿瘤,致死率高,患者平均存活时间不到一年。近年来恶性胶质瘤的发病率也不断上升,是当前34岁以下肿瘤患者的第二位死亡原因。胶质瘤难于诊治的原因主要是因为其具有高度的浸润和转移性,增殖速度快,早期边界不明显,缺乏有效的诊断、治疗方法。研究发现,胶质瘤细胞与其它肿瘤不同之处在于它表达一种特殊的氯离子通道电流,其恶性程度与氯离子通道电流呈正相关。天然有毒动物毒液中富含有数量众多的离子通道电流抑制多肽。据此在蝎毒液中发现了对胶质瘤具有重要治疗和诊断价值的一类毒素多肽：蝎氯毒素。与此同时,基于纳米荧光材料的荧光探针检测技术越来越受到人们的重视,成为物理学、化学、生命科学与医学的重要交叉研究领域。利用蝎氯毒素的胶质瘤细胞靶向性和纳米材料的荧光特性,开展蝎氯毒素-纳米荧光复合物靶向抗神经胶质瘤及其诊断研究有重要的意义。本文首先根据蝎氯毒素CTX多肽的一级结构序列,采用overlapping PCR方法,获得了N端连着小肠激酶酶切位点编码序列的CTX基因片段,选用原核表达载体pGEX-6p-1,构建了重组表达载体pGEX-6p-1-CTX,转化入大肠杆菌Rosetta （DE3）,IPTG诱导表达GST-CTX融合蛋白（gCTX）。重组表达的融合蛋白经GSH亲和层析胶纯化,超滤离心脱盐浓缩后,用小肠激酶进行酶切,通过HPLC分离纯化获得重组CTX多肽,约1.5mg/L培养物,纯度大于95%以上。经质谱鉴定,重组CTX多肽的分子量大小为3998.03Da,考虑到CTX形成的4对二硫键所带来分子量8Da的减少,检测结果与理论分子量3997.58Da完全一致。建立了重组表达蝎氯毒素多肽CTX的技术体系,获得了高纯度的重组蝎氯毒素多肽CTX。将稀土上转换荧光纳米微粒进行氨基化表面修饰,再与重组蝎氯毒素CTX多肽偶联,制备了蝎毒素CTX-稀土荧光纳米探针（CTX:UCNPs）.检测了CTX:UCNPs复合物的荧光强度、荧光稳定性、细胞毒性等探针性能。在动物水平上采用上转换活体成像系统,完成了对小鼠皮下异殖神经胶质瘤的靶向标记与可视化检测,系统研究了蝎氯毒素-稀土纳米探针体外细胞和体内活体肿瘤的靶向标记。实验结果表明,应用所合成的蝎毒素CTX-稀土荧光纳米探针,可实现活体肿瘤在近红外照射下的可视化检测与荧光成像。另外,采用同样的方法重组表达了蝎氯毒素gCTX融合蛋白,并建立了神经胶质瘤大鼠荷瘤模型,以此开展了重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白体内靶向抑制神经胶质瘤增殖和转移的实验。结果显示,给药17后的大鼠肿瘤体积和重量都明显小于对照组,对神经胶质瘤的生长抑制率达到85.454±3.41%。给药27后解剖动物,发现重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白对神经胶质瘤的转移抑制率达到50%。将1311和Cy5.5分别螯合于重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白,计算动物各组织相应的%ID/g变化和观察近红外光激发后gCTX-Cy5.5螯合物在肿瘤组织中是否产生明显的受激荧光,试验结果发现重组蝎氯毒素gCTX融合蛋白对神经胶质瘤有特异的靶向性。基于重组gCTX融合蛋白具有特异靶向抗神经胶质瘤增殖与转移功能,以其为模版,合成了具有靶向神经胶质瘤,且能够激发可见近红外荧光的蝎氯毒素-金纳米簇复合物（Au@（gCTX）NCs）,系统检测了该Au@（gCTX） NCs复合物的荧光强度、荧光稳定性、细胞毒性等探针性能,在细胞水平上并对其靶向抑制神经胶质瘤的生长与转移进行了初步研究。结果显示,蝎氯毒素-金纳米簇Au@（gCTX）NCs复合物能够特异靶向神经胶质瘤细胞,并能在体外抑制神经胶质瘤细胞的生长,其生长抑制率为42.23±1.51%。同时也能够有效抑制金属基质蛋白酶2（MMP-2）的活性,其抑制率为60.34±0.05%。因此,合成的蝎氯毒素-金纳米簇Au@（gCTX） NCs复合物具有靶向抗神经胶质瘤的作用。本论文结合蝎氯毒素对胶质瘤的高特异靶向功能和纳米微粒独特的生物荧光特性,设计与制备了2种蝎氯毒素-纳米荧光复合物,且这2种蝎氯毒素-纳米荧光复合物在体内外具有靶向抗神经胶质瘤功能,显示了在神经胶质瘤的诊断与治疗方面可能有潜在的价值。
胡涛[8]（2012）在《腺病毒介导的东亚钳蝎类氯通道神经毒素（Ad-rBmK CTa）联合替莫唑胺（TMZ）对U251细胞体外作用研究》文中研究说明脑胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤，起源于神经上皮。在我国，其发病率约占颅脑肿瘤的44%左右。同人体其它各个系统的肿瘤一样，严重威胁着人民的健康与生命。胶质瘤有多种发病原因，其最根本原因可能是抑癌基因失活和癌基因被激活以及相关分子信号通路的改变。手术切除、放射外科、化学药物等传统治疗方法，效果仍难以令人满意。除了传统的治疗方法外，尚包括基因靶向治疗、免疫治疗以及联合治疗等多种生物治疗方法，并且成为目前胶质瘤治疗研究的热点。近年来，国内外一些学者发现蝎毒素具有肿瘤抑制作用，并不断深入研究，发现蝎毒素中的某些成分对胶质瘤细胞具有靶向作用，可作用于胶质瘤细胞膜上不同类型的离子通道，从而产生一定的肿瘤抑制作用。目前，国内学者研究最多的氯离子通道蝎毒素是从东亚钳蝎（Buhtus maretnsii Karhsch，BmK）粗毒中提取的BmK CT，可特异性靶向作用于神经胶质瘤细胞，抑制细胞的生长、侵袭与转移。国内山西大学分子生物研究所付月君等学者依据BmKCT cDNA序列，进行优化重组，得到东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素基因（recombinant BmK CT artiafet，rBmK CTa），并申请了专利。本项研究是在山西大学分子生物研究所的大力指导、帮助下，利用已提取的东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素基因rBmK CTa，用腺病毒对其进行包装。经体外实验，初步研究该基因对U251脑胶质瘤细胞的抑制作用。同时联合细胞毒性化疗药物替莫唑胺（TMZ）共同作用于该胶质瘤细胞，探讨相关肿瘤抑制作用。本课题首先构建腺病毒介导的东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素，即Ad-rBmKCTa。应用AdEasy-1System腺病毒载体系统，将rBmK CTa基因克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV，从而得到重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-rBmK CTa。随后，经酶切等作用，与腺病毒的pAdEasy-1骨架质粒共转化BJ5183菌进行同源重组，构建出重组的腺病毒质粒pAd-rBmK CTa。再经PacI酶切、线性化后的重组质粒转染293A细胞，成功构建出Ad-rBmK CTa。经PCR初步鉴定，确定为Ad-rBmK CTa后，再反复感染293A细胞进行大量扩增。继而采用氯化铯梯度离心法提纯、浓缩该病毒。最后，经测定该病毒效价达3.5x1012pfu／ml。其次，本课题体外分别将Ad-rBmK CTa、TMZ以及二者联合作用于U251细胞，通过MTT实验观察各自对该细胞的抑制作用。结果显示随着Ad-rBmK CTa效价、TMZ浓度升高以及作用时间延长等，对U251细胞的抑制增强，最高抑制率分别达82.81%、83.2%和94.27%。FCM检测细胞凋亡，发现Ad-rBmK CTa和TMZ单独作用时，促细胞凋亡作用并不明显。而二者联合作用时，促凋亡作用明显增强，细胞凋亡率可达32%。同时，联合作用U251细胞，其细胞周期阻滞时相提前，约62.5%细胞停滞于G0G1期。通过Western blot实验比较相关凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Bcl-2表达水平，进一步证实二者联合产生的促凋亡作用大于单一作用。同时，因Bcl-2蛋白是细胞的两种程序性死亡凋亡和自噬的联系纽带，所以考虑对U251细胞的抑制作用尚存在促进自噬作用。目前研究已证实TMZ促进胶质瘤细胞自噬是其肿瘤抑制的主要机制之一。我们认为二者联合作用产生细胞抑制的机理可能为：二者产生协同效应，大大增加了促凋亡作用；Ad-rBmK CTa通过抑制MMP-2活性，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，并促使细胞阻滞于细胞周期时相的早期，增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，自噬作用增强。综上所述,腺病毒介导的rBmK CTa基因可以抑制U251胶质瘤细胞增殖；Ad-rBmK CTa和TMZ联合靶向作用产生协同效应，对肿瘤细胞的抑制作用显着增强。但协同作用机制尚不完全明了，我们将继续深入研究，进一步阐明Ad-rBmK CTa联合TMZ作用机理。同时，下一步将进行小鼠活体研究，为腺病毒介导的rBmK CTa基因靶向治疗以及联合化疗提供更有力的理论依据。随着国内外相关研究的不断发展，rBmK CTa极可能发展成为新的细胞毒素类药物，为治疗脑胶质瘤提供新的希望。
殷丽天[9]（2009）在《东亚钳蝎氯离子通道毒素的生物活性研究》文中指出蝎（scorpion）是一种古老的物种,蝎尾部毒腺内储存的蝎毒素不仅是其捕食、御敌的重要器官,也是治疗人类某些疾病的良药。蝎毒素的主要成分是20～90个氨基酸构成的小分子多肽,一般含3～4对二硫键,可以选择性的与动物可兴奋细胞膜上的钠、钾、钙、氯离子通道结合,引起通道电流的阻断或门控动力学的改变。本课题组的前期研究根据大肠杆菌偏爱密码子,优化了东亚钳蝎（Buthusmartrnsii Karsch,BmK）氯离子通道毒素BmK CT基因序列（Accession Number:AF135821）,并将此人工合成的基因命名为BmK CTa。该序列编码的氯离子通道毒素由35个氨基酸组成,含4对二硫键,与从以色列蝎（Leiurus quinquestriatus）中分离得到的氯离子通道毒素chlorotoxin有68%的同源性,推测它们可能具有近似的生物学功能。Chlorotoxin可以选择性的结合并抑制人脑神经胶质瘤细胞上的基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）,从而抑制神经胶质瘤细胞的转移扩散。前期的体外研究表明,rBmK CTa对神经胶质瘤细胞有较强的毒性作用,对神经胶质瘤具有潜在的治疗价值。所以,对BmK CT生物学功能的进一步研究具有一定的理论意义和应用价值。本研究将重组东亚钳蝎氯离子通道毒素rBmK CTa进行原核可溶性表达,并获得较高纯度的rBmK CTa,分析了该毒素对神经胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力的影响,并研究了它与细胞表面可能的受体蛋白MMP-2的相互作用关系。通过人神经胶质瘤的原位荷瘤裸鼠动物模型观察了rBmK CT在小鼠体内的代谢动力学分布。本研究的主要结果如下:1.建立了rBmK CTa（recombinant BmK CT artifact）的可溶性表达与纯化方法。通过pRSETc表达系统将按照大肠杆菌偏爱密码子优化后的BmK CT基因在大肠杆菌BL21（DE3）中获得表达。Western blot表明,目的蛋白主要以单体形式存在。利用Ni-NTA亲和层析一步纯化得到了纯度较高的单体重组BmK CTa,最终每升培养液中可获得纯蛋白1.5～2.1 mg,为下一步研究其生物学功能奠定了基础。2.分析了rBmK CTa对神经胶质瘤细胞SHG-44的迁移、侵袭能力的影响,并通过细胞免疫组化、明胶酶谱与Western blot方法,分析rBmK CTa作用前后SHG-44细胞中MMP-2的表达及活性变化。结果表明,rBmK CTa可减慢SHG-44细胞的生长与迁移速度,其抑制细胞迁移IC50为0.28μM。同时,rBmK CTa能够抑制在侵袭转移中起重要作用的MMP-2的表达,使MMP-2分泌减少,这种减少呈剂量依赖性趋势。上述结果表明,rBmKCTa通过抑制MMP-2的表达,从而抑制了肿瘤细胞与细胞外基质（ECM）的黏附及ECM的降解,降低了肿瘤细胞迁移能力。流式细胞术分析表明,0.4μM～3.2μM重组BmK CTa作用后,SHG-44细胞G0/G1期所占比例增加,S期所占比例减少,使细胞生长阻滞于G0/G1期。在3.2μM的rBmK CTa作用24 h时,细胞的凋亡率接近50%。结果提示,rBmK CTa对于神经胶质瘤具有潜在的治疗价值,有望成为新型的靶向性药物。3.利用RT-PCR法从SHG-44细胞中克隆得到基质金属蛋白酶2（MMP-2）基因,将其C端的胞外区部分构建入表达载体pExSecI中,并在大肠杆菌中获得表达。MMP-2C主要以包涵体的形式存在,通过变复性和亲和层析,从而获得可溶的MMP-2C蛋白。利用pull down方法确定MMP-2C与rBmK CTa可以在体外相互作用。据此推测,rBmK CTa抑制MMP-2的表达,可能是通过二者的直接相互作用而实现。4.将rBmK CTa的C末端引入2个Tyr残基,并在pExSecI分泌型表达系统中表达ZZ-rBmK CTa-Tyr,通过IgG Sepharose纯化该蛋白。用标准Iodogen法进行ZZ-rBmK CTa的131I标记,纸层析测定放化纯为90%。建立了含人神经胶质瘤的荷瘤鼠模型,经尾静脉和颅内注射分别将17.9μCi和2μCi标记蛋白注入小鼠体内。在注射给药后的10个时间段,通过SPECT观察小鼠体内标记蛋白的动力学分布。结果显示,131I-ZZ-rBmK CTa通过两种给药方式均可快速通过体液循环穿过小鼠的血脑屏障。在给药后24 h,检测标记蛋白在小鼠左脑、右脑、胃、肾脏、脾脏、肝脏、后肢肌肉、肺、心脏等12个器官的分布情况。分析表明,131I-ZZ-rBmK CTa在大脑中的比放射性量,在右脑（肿瘤）处蛋白含量明显高于左脑正常组织,T/NT值分别为1.25和4.13,说明ZZ-rBmK CTa与神经胶质瘤细胞可以特异性结合。以上结果提示,脑神经胶质细胞和神经细胞膜上的某些受体分子对rBmK CTa有较强的亲和性。
曹俊娜,王蕾,黄睿,齐伟,张振强,刘文第[10]（2009）在《蝎毒素ITX氨基酸含量及蛋白质组分分析》文中研究说明目的:测定蝎毒素ITX样品中17种氨基酸的含量,分析并鉴定其中某些蛋白质组成成分。方法:将常压柱分离得到的蝎毒素蛋白ITX利用L-8800氨基酸分析仪进行氨基酸含量分析;以17cmp H3～10固相pH梯度胶条（IPG）为第一向IEF,18%SDS聚丙烯酰胺凝胶为第二向进行双向电泳;PDQuest7.1.1分析软件分析电泳图谱,筛选目的蛋白,然后对重现性和稳定性良好的蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和串联质谱（MS/MS）分析,得到肽质量指纹图谱（PMF）数据,登录网站http://www.matrixscience.com,用Mas-cot程序检索NCBInr数据库,鉴定蛋白质。结果:ITX17种氨基酸的含量从0.14%～11.35%不等;从蝎毒素ITX蛋白样品中共筛选出9个等电点不同,相对分子质量约为5800的蛋白点,其中蛋白点1、2、3、4位于酸性区,蛋白点5、6、7、8、9位于碱性区。获得了4、6号蛋白点多肽的PMF数据。结论:测定了蝎毒素ITX蛋白的氨基酸含量;建立蝎毒素ITX蛋白质组学研究方法,为后续工作奠定了基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试虫及培养 |
| 1.1.2 试剂仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 缓步威伪蝎捕食优先选择性行为观察 |
| 1.2.2 缓步威伪蝎捕食偏好性研究 |
| 1.3 数据分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 缓步威伪蝎捕食优先选择性行为观察 |
| 2.2 缓步威伪蝎捕食偏好性的研究 |
| 2.2.1 缓步威伪蝎对赤拟谷盗幼虫和锈赤扁谷盗幼虫的捕食偏好性研究 |
| 2.2.2 缓步威伪蝎对杂拟谷盗幼虫和锯谷盗幼虫的捕食偏好性研究 |
| 2.2.3 缓步威伪蝎对嗜卷书虱和嗜虫书虱的捕食偏好性 |
| 3 讨论 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 生物防治研究现状 |
| 1.2 伪蝎研究进展 |
| 1.2.1 伪蝎分类学研究进展 |
| 1.2.2 伪蝎形态学及生态学研究 |
| 1.2.3 伪蝎捕食行为研究 |
| 1.2.4 蛛形纲毒液研究 |
| 1.3 黄色花蝽研究进展 |
| 1.3.1 黄色花蝽形态学研究进展 |
| 1.3.2 黄色花蝽捕食及应用研究进展 |
| 1.4 捕食性天敌捕食功能反应的重要性 |
| 1.5 本文研究的目的意义 |
| 1.6 主要研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 研究技术路线 |
| 第2章 储粮害虫捕食性天敌优势种调查及捕食谱 |
| 2.1 虫调地点及方法 |
| 2.1.1 采集地点 |
| 2.1.2 调查方法及采集方法 |
| 2.1.3 采集工具 |
| 2.1.4 采集标签 |
| 2.2 缓步威伪蝎及黄色花蝽捕食谱试虫与试验方法 |
| 2.2.1 试验试虫 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 储粮害虫捕食性种类的确定 |
| 2.3.2 伪蝎种的鉴定 |
| 2.3.3 黄色花蝽及缓步威伪蝎对主要储粮害虫的捕食谱 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 缓步威伪蝎对储粮害虫捕食行为研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 伪蝎培养 |
| 3.1.2 仪器及试剂 |
| 3.1.3 缓步威伪蝎捕食赤拟谷盗幼虫行为观察 |
| 3.1.4 缓步威伪蝎对9 种害虫日捕食量研究 |
| 3.1.5 缓步威伪蝎对嗜卷书虱捕食功能反应研究 |
| 3.1.6 缓步威伪蝎优先捕食选择行为研究 |
| 3.1.7 缓步威伪蝎对储粮害虫捕食偏好性研究 |
| 3.2 Cain指数 |
| 3.3 数据处理 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 缓步威伪蝎对赤拟谷盗幼虫捕食行为过程 |
| 3.4.2 缓步威伪蝎对9 种不同储粮害虫捕食能力 |
| 3.4.3 缓步威伪蝎对嗜卷书虱捕食功能反应 |
| 3.4.4 缓步威伪蝎优先捕食选择行为观察 |
| 3.4.5 伪蝎对不同储粮害虫的捕食偏好性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 黄色花蝽对几种储藏物害虫捕食作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验试虫 |
| 4.1.2 黄色花蝽对几种储藏物害虫的捕食功能反应模型的建立 |
| 4.1.3 黄色花蝽Hassell种内干扰研究 |
| 4.1.4 黄色花蝽捕食偏好性研究 |
| 4.1.5 黄色花蝽对9 种储粮害虫的捕食量研究 |
| 4.2 数据处理 |
| 4.2.1 捕食功能反应HollingⅡ圆盘方程的计算 |
| 4.2.2 黄色花蝽雌成虫Hassell干扰反应模型的计算 |
| 4.2.3 黄色花蝽对几种害虫寻找效应模型的计算 |
| 4.2.4 Cain指数 |
| 4.2.5 黄色花蝽对9 种储粮害虫捕食量 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 黄色花对几种储藏物害虫的捕食功能反应模型 |
| 4.3.2 黄色花蝽种内干扰对捕食作用的影响 |
| 4.3.3 黄色花蝽对几种储粮害虫寻找效应 |
| 4.3.4 黄色花蝽对几种害虫捕食偏好性 |
| 4.3.5 黄色花蝽对9 种害虫捕食量 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 黄色花蝽对储粮害虫捕食效果评价 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验试虫 |
| 5.1.2 试验材料 |
| 5.1.3 黄色花蝽在模拟粮仓内对4 种储粮害虫控制效果 |
| 5.1.4 实仓内防治效果试验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 模拟粮仓条件下黄色花蝽对4 种害虫控害效果 |
| 5.2.2 实仓投放黄色花蝽效果评价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 家蚕二分浓核病毒 |
| 1.1.1 家蚕二分浓核病毒简介 |
| 1.1.2 家蚕二分浓核病毒基因组结构与功能 |
| 1.1.3 BmBDV基因组的克隆、病毒拯救及病毒载体的研究 |
| 1.2 BmBDV对家蚕的致病性 |
| 1.3 蝎毒素分类与生物学功能 |
| 1.4 立项依据及研究意义 |
| 1.4.1 立项依据 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 1.5 主要研究内容、技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 重组蝎毒素家蚕二分浓核病毒载体的构建 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 主要试剂及溶液 |
| 2.1.3 实验所用仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 含蝎毒素Bm K ITa1 表达盒质粒pT-ie1-BmK ITa1-sv40 的构建. |
| 2.2.2 重组Bm K ITa1的BmBDV克隆质粒构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Bm K ITa1 表达盒质粒pT-ie1-BmK ITa1-sv40 的构建 |
| 2.3.2 重组Bm K ITa1的BmBDV基因组质粒构建 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 重组蝎毒素病毒对昆虫细胞的感染性 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 质粒和细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 实验中所用仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 转染质粒的准备 |
| 3.2.2 Hi5 细胞的共转染 |
| 3.2.3 转染后Hi5 细胞的反转录检测 |
| 3.2.4 转染后Hi5 细胞的Western blot检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组病毒基因组共转染对Hi5 细胞的致病性 |
| 3.3.2 转染后Hi5 细胞中蝎毒素基因的转录 |
| 3.3.3 转染后Hi5 细胞中病毒基因和蝎毒素基因的表达 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 重组蝎毒素病毒对家蚕的感染性 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转染后Hi5 细胞的收集与处理 |
| 4.2.2 感染后Hi5 细胞沉淀悬浮液添食家蚕幼虫 |
| 4.2.3 感染后家蚕幼虫的解剖 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 共转染Hi5 细胞回感家蚕幼虫 |
| 4.3.2 共转染Hi5 细胞回感的家蚕幼虫中肠组织观察 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 重组蝎毒素病毒对哺乳动物细胞的感染性 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液 |
| 5.1.3 实验所用仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 转染实验质粒的准备 |
| 5.2.2 哺乳动物细胞的共转染 |
| 5.2.3 转染后哺乳动物细胞的培养与观察 |
| 5.2.4 共转染哺乳动物细胞的反转录PCR检测 |
| 5.2.5 共转染的哺乳动物细胞Western blot检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 全基因组共转染对哺乳动物细胞的致病性 |
| 5.3.2 哺乳动物细胞中重组病毒非结构蛋白基因的转录 |
| 5.3.3 哺乳动物细胞中重组病毒结构蛋白的表达 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 家蚕二分浓核病毒的起源与进化 |
| 6.1 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 ns1 基因起源于浓核病毒 |
| 6.2.2 vp基因与细小病毒衣壳蛋白基因同源 |
| 6.2.3 pol B基因与B家族DNA聚合酶同源 |
| 6.2.4 ns3 基因与颗粒体病毒、浓核病毒基因同源 |
| 6.2.5 mcp基因与呼肠孤病毒衣壳蛋白基因同源 |
| 6.3 讨论与小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 工作总结 |
| 7.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 硕士期间参与的课题 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.2 杆状病毒的分类以及生活史 |
| 1.1.3 昆虫杆状病毒表达载体系统 |
| 1.1.4 重组杆状病毒的研究进展 |
| 1.2 病毒感染与DNA损伤应答 |
| 1.3 杆状病毒与宿主的凋亡相关基因 |
| 1.3.1 细胞凋亡 |
| 1.3.2 杆状病毒p35基因 |
| 1.3.3 杆状病毒iaps基因 |
| 1.3.4 草地贪夜蛾Sfp53基因 |
| 1.4 杆状病毒囊膜融合蛋白GP64 |
| 1.5 蝎神经毒素 |
| 1.5.1 蝎神经毒素概述 |
| 1.5.2 蝎毒素的分类及作用 |
| 1.5.3 东亚钳蝎神经毒素 |
| 1.6 论文设计思路 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究方法 |
| 1.6.3 实验方案 |
| 1.6.4 研究创新点 |
| 第二章 重组杆状病毒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要生化试剂 |
| 2.2.3 菌株与细胞 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组质粒pFastBacDual-p35-EGFP与pFastBacDual-gp64-EGFP的构建 |
| 2.3.2 转座重组获得杆粒Bacmid-p35-EGFP与Bacmid-gp64-EGFP |
| 2.3.3 昆虫Sf9细胞的培养 |
| 2.3.4 重组杆粒Bacmid-p35-EGFP以及Bacmid-gp64-EGFP转染昆虫Sf9细胞 |
| 2.3.5 转染上清液感染体外培养的昆虫Sf9细胞 |
| 2.3.6 蚀斑实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组质粒pFastBacDual-p35-EGFP与pFastBacDual-gp64-EGFP的PCR以及酶切鉴定 |
| 2.4.2 重组杆粒Bacmid-p35-EGFP与Bacmid-gp64-EGFP的鉴定 |
| 2.4.3 重组病毒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP的获得 |
| 2.4.4 重组病毒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP的活性鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 AcMNPV-BmK IT通过调控P35蛋白影响宿主凋亡与病毒增殖之间的互作 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞和病毒 |
| 3.2.2 生化试剂 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞的培养 |
| 3.3.2 Real-time PCR检测AcMNPV凋亡抑制基因p35、囊膜蛋白基因gp64及iap1、iap2的转录水平 |
| 3.3.3 Western blot检测在AcMNPV-p35-EGFP侵染的Sf9细胞中P35-EGFP和SfP53的表达 |
| 3.3.4 病毒粒子滴度检测 |
| 3.3.5 Western blot检测在AcMNPV-p35-EGFP侵染的Sf9细胞中 γ-H2AX的表达情况 |
| 3.4.实验结果 |
| 3.4.1 AcMNPV-BmK IT可上调抗凋亡基因p35的转录水平 |
| 3.4.2 Sf9细胞总RNA的提取与分析 |
| 3.4.3 AcMNPV-p35-EGFP侵染Sf9细胞能够延缓SfP53的下调 |
| 3.4.4 AcMNPV-p35-EGFP侵染Sf9细胞引发较强的DNA损伤应答反应 |
| 3.4.5 过表达P35促进gp64转录和子代病毒的生成 |
| 3.4.6 过表达P35更有利于iap1转录水平的提高 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 AcMNPV-BmK IT可调控P35下游蛋白GP64的表达促进病毒增殖 |
| 4.1.引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞和病毒 |
| 4.2.2 生化试剂 |
| 4.2.3 主要试剂的配制 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞的培养 |
| 4.3.2 制片 |
| 4.3.3 Western blot检 测在AcMNPV-gp64-EGFP侵 染的Sf9细 胞中GP64-EGFP的表达 |
| 4.3.4 病毒粒子滴度测定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 过表达GP64促进子代病毒的生成 |
| 4.4.2 重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1，PH，P10)侵染Sf9细胞后，对GP64蛋白定位的分析 |
| 4.4.3 重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1，PH，P10)侵染Sf9细胞后，促进子代病毒的生成 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 蝎毒干粉的制备 |
| 1.3 蝎毒中可溶性蛋白含量的测定 |
| 1.4 蝎毒中总糖含量的测定 |
| 1.5 蝎毒中总脂含量的测定 |
| 1.6 蝎毒中水分及不溶物含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蝎毒中可溶性蛋白含量的测定结果 |
| 2.2 蝎毒中总糖含量的测定结果 |
| 2.3 蝎毒中总脂肪含量的测定结果 |
| 2.4 蝎毒中水分含量及不溶物质含量的测定结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多肽毒素基因克隆、异源表达与纯化的研究进展 |
| 1.1.1 多肽毒素基因克隆的研究进展 |
| 1.1.2 多肽类毒素异源表达研究进展 |
| 1.1.3 多肽毒素分离纯化的研究进展 |
| 1.2 本文的研究背景和思路 |
| 第二章 利用大肠杆菌表达系统表达两种大理石纹蝎多肽毒素 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验器材与试剂准备 |
| 2.2.1 实验器材 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 部分溶液、试剂的制备 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1设计构建重组的表达质粒pET-His-SUMO-GT028649和pET-His-SUMO-GT028758 |
| 2.3.2 GT028649和GT028758的自动诱导表达 |
| 2.3.3 蛋白纯化 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 重组质粒pET-His-SUMO-GT028649和pET-His-SUMO-GT028758的构建 |
| 3.2 重组质粒pET-His-SUMO-GT028649的表达纯化及质谱鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒pET-His-SUMO-GT028649的自动诱导表达与镍柱亲和层析纯化 |
| 3.2.2 GT028649的反相高效液相色谱纯化及质谱鉴定 |
| 3.3 重组质粒pET-His-SUMO-GT028758的表达纯化及质谱鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 工作总结 |
| 4.2 工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附录A 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 蝎毒素 |
| 1.1 蝎的种类 |
| 1.2 蝎毒素的组成和分类 |
| 1.3 蝎毒素的功能 |
| 2 蝎氯毒素的发现、结构与功能 |
| 2.1 蝎氯毒素的发现与来源 |
| 2.2 蝎氯毒素的分子生物学特征 |
| 2.3 蝎氯毒素结构与功能的关系 |
| 3 神经胶质瘤 |
| 3.1 神经胶质瘤的起源 |
| 3.2 神经胶质瘤的危害 |
| 3.3 神经胶质瘤的生物学特点 |
| 3.4 神经胶质瘤与蝎氯毒素 |
| 4 多肽在分子成像和医学诊断中的应用 |
| 4.1 基于多肽的成像探针的设计 |
| 4.2 多肽探针的成像应用模式 |
| 5 本论文的目的与意义 |
| 第二章 重组蝎氯毒素CTX的表达、纯化与鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CTX表达载体的构建 |
| 2.2 融合蛋白的表达、纯化和酶切 |
| 2.3 CTX多肽的RP-HPLC分离纯化与鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 蝎氯毒素-稀土纳米探针体内外对神经胶质瘤的靶向性研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs的制备 |
| 2.2 蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs的物理性质 |
| 2.3 蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs的体外对神经胶质瘤的靶向性 |
| 2.4 蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs的体内对神经胶质瘤的靶向性 |
| 2.5 蝎氯毒素-稀土纳米探针CTX：UCNPs体内外的初步毒性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 重组蝎氯毒素蛋白靶向抗神经胶质瘤的研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蝎氯毒素gCTX蛋白的制备与鉴定 |
| 2.2 重组蝎氯毒素gCTX体内对神经胶质瘤生长的抑制 |
| 2.3 重组蝎氯毒素gCTX体内对神经胶质瘤转移的抑制 |
| 2.4 重组蝎氯毒素gCTX对体内神经胶质瘤的靶向性 |
| 3 讨论 |
| 第五章 蝎氯毒素-金纳米簇复合物抑制神经胶质瘤细胞生长与转移研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 蝎氯毒素-金纳米簇复合物的制备 |
| 2.2 蝎氯毒素-金纳米簇复合物的特征与鉴定 |
| 2.3 蝎氯毒素-金纳米簇复合物对神经胶质瘤细胞的靶向性 |
| 2.4 蝎氯毒素-金纳米簇复合物体外抑制神经胶质瘤的生长 |
| 2.5 蝎氯毒素-金纳米簇复合物体外抑制神经胶质瘤的转移 |
| 3 讨论 |
| 研究总结与展望 |
| 参考文献 |
| 研究生期间已发表和待发表的论文及申请的专利 |
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 绪论—胶质瘤治疗现状及蝎毒素研究概况 |
| 1. 胶质瘤概述及治疗现状 |
| 1.1 胶质瘤病因 |
| 1.2 胶质瘤的治疗方法 |
| 2. 蝎毒素概述及研究进展 |
| 2.1 蝎及其药用史 |
| 2.2 蝎毒素分子结构 |
| 2.3 蝎毒素分类 |
| 2.4 多种离子通道蝎毒素 |
| 3. 氯离子通道蝎毒素 |
| 3.1 氯离子通道 |
| 3.2 胶质瘤细胞的 CLC 通道 |
| 3.3 氯离子通道蝎毒素 |
| 4. 实验设计 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 课题技术路线图 |
| 4.3 实验创新点 |
| 5. 参考文献 |
| 第二部分 腺病毒介导的 rBmK CTa 基因构建及 U251 细胞的培养 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒 pAdTrack-CMV- rBmK CTa 的构建与鉴定 |
| 3.2 同源重组质粒 pAd- rBmK CTa 的构建与鉴定 |
| 3.3 重组腺病毒 rBmK CTa 基因的 PCR 鉴定 |
| 3.4 同源重组腺病毒 pAd- rBmK CTa 转染 293A 细胞 GFP 的表达 |
| 3.5 腺病毒 Ad- rBmK CTa 的滴度测定 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三部分 腺病毒介导的 rBmk CTa 基因联合替莫唑胺对 U251 细胞体外作用研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Ad-rBmK CTa 对 U251 细胞体外作用实验结果 |
| 3.2 TMZ 对 U251 细胞体外作用实验结果 |
| 3.3 Ad-rBmK CTa 联合 TMZ 对 U251 细胞体外作用实验结果 |
| 3.4 Western blot 检测相关凋亡蛋白 Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 细胞周期及细胞凋亡概述 |
| 4.2 Ad-rBmK CTa 对 U251 细胞作用 |
| 4.3 替莫唑胺（TMZ）对 U251 细胞作用 |
| 4.4 Ad-rBmK CTa 联合 TMZ 对 U251 细胞作用 |
| 5. 参考文献 |
| 总结 |
| 附录 1. 实验图表 |
| 附录 2. 博士学位期间发表论文情况及参加课题、参编图书 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 蝎神经毒素概述 |
| 2.1 蝎神经毒素的组成与性质 |
| 2.2 蝎神经毒素的特征与分类 |
| 2.3 蝎神经毒素的进化 |
| 2.4 蝎神经毒素的结构与功能 |
| 2.5 重组蝎神经毒素的表达 |
| 2.6 蝎神经毒素的生物活性测定 |
| 3 蝎氯离子通道毒素与氯离子通道 |
| 3.1 蝎氯离子通道毒素 |
| 3.2 神经胶质瘤细胞的氯离子通道 |
| 4 蝎毒素抗肿瘤作用及可能机制 |
| 4.1 蝎毒素的抗肿瘤作用 |
| 4.2 基质金属蛋白酶与神经胶质瘤的侵袭性 |
| 5 蝎神经毒素在治疗神经胶质瘤中的应用 |
| 6 本研究的立题背景及意义 |
| 6.1 研究背景 |
| 6.2 研究目的、意义及创新点 |
| 7 参考文献 |
| 第二章 东亚钳蝎氯离子通道毒素(rBmK CTa)在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组表达质粒pRSETc-rBmK CTa的构建 |
| 3.2 重组菌的诱导表达分析 |
| 3.3 融合蛋白His-rBmK CTa的纯化 |
| 3.4 融合蛋白His-rBmK CTa的Western blot分析 |
| 3.5 目的蛋白表达量的分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BmK CT基因和蛋白的序列分析 |
| 4.2 rBmK CTa表达及纯化分析 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rBmK CTa对神经胶质瘤细胞SHG-44迁移、侵袭能力的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 rBmK CTa对SHG-44细胞生长的抑制作用 |
| 3.2 rBmK CTa对SHG-44细胞迁移的影响 |
| 3.3 rBmK CTa对SHG-44细胞中MMP-2表达活性的影响 |
| 3.4 rBmK CTa对细胞周期和凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 神经胶质瘤细胞的生长、侵袭性 |
| 4.2 神经胶质瘤中MMP-2的表达 |
| 4.3 蝎毒素rBmK CTa对SHG-44细胞周期的影响 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 基质金属蛋白酶MMP-2C的表达、纯化及其与rBmK CTa相互作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MMP-2基因的克隆 |
| 3.2 MMP-2C表达载体的构建 |
| 3.3 ZZ-MMP-2C的诱导表达 |
| 3.4 ZZ-MMP-2C的变复性和纯化 |
| 3.5 MMP-2C与rBmK CTa体外相互作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BmK CT对MMP-2作用区域的的分析 |
| 4.2 BmK CT与神经胶质瘤细胞作用方式的探讨 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 rBmK CTa在脑原位荷瘤鼠体内的代谢动力学和靶向性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组表达质粒pExSecI-rBmK CTa-Tyr的构建和鉴定 |
| 3.2 重组蛋白ZZ-rBmK CTa的表达与纯化 |
| 3.3 ZZ-rBmK CTa的放射性碘标记 |
| 3.4 ZZ-rBmK CTa在脑原位荷瘤鼠体内的代谢动力学和靶向性分析 |
| 3.5 脑组织切片病理学检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 总结 |
| 展望 |
| 附录Ⅰ 缩略词 |
| 附录Ⅱ 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 蛋白标本的处理 |
| 1.4 氨基酸含量测定 |
| 1.5 双向凝胶电泳 |
| 1.6 质谱检测 |
| 1.7 数据库检索 |
| 2 结果 |
| 2.1 蝎毒素ITX蛋白氨基酸含量测定结果 |
| 2.2 凝胶中蝎毒素相关蛋白点 |
| 2.3 蝎毒素相关蛋白点的PMF图谱分析 |
| 3 讨论 |
