王欢[1]（2021）在《lsgB基因介导的脂寡糖α2，3-唾液酸化在副猪革拉瑟氏菌致病中的作用及机制研究》文中研究表明副猪革拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis,GPS）属于巴氏杆菌科的一种短小杆菌,是猪上呼吸道常在菌。在机体受到应激、免疫力低下或继发感染条件下,侵入上皮细胞、进入血液引发宿主的革拉瑟氏病。该病多发于断奶仔猪,或常见于与其他细菌和/或病毒混合感染的猪群,对生猪养殖业造成严重的经济损失。目前,对该病原的研究主要是对病原毒力因子的挖掘,但对其在上呼吸道定殖以及突破呼吸道屏障的研究较少。已有研究表明:能造成全身系统性感染的菌株都含有lsg B基因,其编码一个α2,3-唾液酸转移酶蛋白,但其具体的机制尚不清楚。本研究从构建lsg B基因缺失菌株出发,在体外细胞模型上证实了该基因缺失能显着降低GPS跨越单层细胞屏障的能力、降低GPS侵入细胞能力、降低GPS在健康猪血清中的存活能力,并发现lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化能识别巨噬细胞表面结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素1（Siglec1）,促进TGF-β1的分泌。我们探究了TGF-β1对上皮屏障完整性的影响,深入分析了TGF-β1调控GPS侵入上皮细胞的机制,主要研究内容如下:1.lsg B基因介导LOS发生α2,3-唾液酸化利用自然转化的方法,我们在5型临床分离的强毒株SH0165（以下称野生菌株）中成功获得lsg B基因缺失菌株,并通过穿梭质粒在缺失菌株中回补该基因成功构建其互补菌株。通过高效液相色谱（HPLC）检测证实:相较于野生菌株和互补菌株,缺失菌株表面的α2,3-唾液酸化水平显着降低,lsg B基因造成GPS菌株去唾液酸化。分别提取上述三株菌的LOS,PAGE银染实验进一步证实去唾液酸化降低LOS分子量,表明lsg B基因编码唾液酸转移酶的作用是修饰GPS的LOS发生α2,3-唾液酸化。2.lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化影响GPS致病力为探究LOS唾液酸化对GPS致病力的影响,我们分别在猪肾上皮细胞（PK-15）和猪髋动脉内皮细胞（PIEC）上进行了黏附侵入实验,结果表明缺失菌株对于上述两种细胞的侵入能力显着减弱,而黏附能力显着增强。分析LOS结构发现,LOS去唾液酸化后暴露了半乳糖残基,通过半乳糖预处理PK15细胞,再进行黏附实验发现缺失菌株黏附增强的现象被显着抑制。同时,我们探究了唾液酸化对GPS在血清中存活能力的影响,血清杀菌实验结果表明缺失菌株在健康猪血清中的存活率显着降低。WB实验结果表明,缺失菌株表面结合的补体抑制因子f H显着低于野生菌株和互补菌株。流式细胞术结果进一步证实沉积在缺失菌株表面C3b和攻膜复合体（MAC）的量显着高于野生菌株和互补菌株。上述结果表明,GPS唾液酸化通过结合补体抑制因子f H降低菌体表面C3b的沉积和MAC的形成,促进GPS在健康猪血清中存活率。小鼠实验结果表明缺失lsg B基因影响GPS对小鼠的致死率。上述结果表明。lsg B基因在GPS致病过程中发挥重要作用。3.α2,3-唾液酸化促进肺泡巨噬细胞TGF-β1的产生在本研究中,通过细菌的Pull Down实验,我们证实了野生菌株能够与重组的Siglec1发生相互作用,而缺失菌株结合较弱。WB和LOS-ELISA证实LOS的α2,3-唾液酸化与重组的Siglec1发生相互作用。野生菌株和缺失菌株及它们的LOS刺激猪肺泡巨噬细胞3D4/21后,WB检测Siglec1蛋白水平表达,证实α2,3-唾液酸化诱导更高水平的Siglec1表达。免疫组化进一步证实α2,3-唾液酸化诱导Siglec1在肺部的高表达。免疫共沉淀证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1能促进DAP12和Syk表达并形成三聚体激活下游级联反应。通过干扰RNA实验证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1/DAP12/Syk三聚体能促进上清中TGF-β1的分泌。WB证实去α2,3-唾液酸化的缺失菌株激活p38的磷酸化显着低于野生菌株,抑制p38通路后上清中TGF-β1的分泌显着减少。同时,通过抑制剂实验进一步证实Syk抑制剂显着抑制p38磷酸化和上清中TGF-β1的分泌。综上所述,α2,3-唾液酸化通过识别巨噬细胞表面受体Siglec1形成Siglec1/DAP12/Syk三聚体影响p38磷酸化调控TGF-β1的分泌。4.TGF-β1诱导GPS侵入上皮细胞及跨越上皮细胞屏障为证实分泌的TGF-β1对上皮屏障的影响。我们通过重组的TGF-β1蛋白对NPTr细胞进行了体外实验。ECIS结果证实TGF-β1能剂量依赖降低NPTr细胞形成的电阻屏障,TGF-β1受体抑制剂证实其降低NPTr电阻屏障依赖其受体发挥作用。WB结果进一步证实TGF-β1能降低NPTr细胞形成的电阻屏障是下调了NPTr细胞间的紧密连接蛋白。此外,我们还发现TGF-β1能通过依赖其受体的方式增加GPS对上皮细胞的侵入。通过WB和荧光素酶报告系统证实TGF-β1能增加GPS侵入NPTr细胞是通过下调Fn的表达来实现的。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对Fn蛋白进行敲除,证实Fn能影响GPS对气管上皮细胞的侵入能力。以上结果表明,lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS突破上皮细胞屏障过程中发挥作用,细菌通过α2,3-唾液酸化修饰利用宿主免疫细胞表面受体来调控上皮细胞屏障入侵深层组织。5.α2,3-唾液酸化修饰诱导宿主免疫细胞耐受通过构建体外耐受模型,我们发现去α2,3-唾液酸化显着降低LOS诱导的免疫细胞耐受水平,降低耐受细胞上清和小鼠血清中TNF-α的含量,降低Siglec1的表达。在耐受细胞中,WB和co-IP结果表明α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1受体来上调其接头分子DAP12和炎症抑制因子SHIP,并形成复合物。共聚焦实验证实去α2,3-唾液酸化减弱Siglec1与SHIP的相互作用。WB证实耐受细胞中去α2,3-唾液酸化降低p65磷酸化并降低上清中TNF-α和NO的分泌量。干扰RNA实验进一步证实耐受细胞中SHIP的上调依赖于Siglec1的激活。小鼠耐受模型中,α2,3-唾液酸化显着上调小鼠脾脏巨噬细胞中Siglec1的表达。以上结果证实,α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1上调SHIP诱导内毒素耐受。本研究证实了lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS致病力、突破上呼吸道屏障和逃避宿主天然免疫中发挥重要作用。本研究深入探究了α2,3-唾液酸化在GPS在逃避宿主天然免疫、突破屏障和逃避补体杀伤过程中的重要作用,为更好的理解GPS引发系统性疾病提供理论依据。
蔡艺丹[2]（2021）在《经颈静脉肝内门体分流术对肝硬化门静脉高压患者肠道屏障功能的影响》文中认为目的:探讨肝硬化门静脉高压食管胃静脉破裂出血患者肠道菌群特征及经颈静脉门体分流术（Transjugular intrahepatic portosystemic shunt,TIPS）降低门静脉压力对肝硬化门静脉高压患者肠道屏障功能的影响。方法:采取前瞻性队列研究方法,以15例肝硬化门静脉高压食管胃静脉曲张破裂出血行择期TIPS治疗的患者为研究对象,以同期年龄性别相匹配的15例健康志愿者为对照组。分别于术前、术后1周及术后12周采集患者的血液及粪便标本。采用血细胞分析仪检测血常规,全自动生化分析仪检测肝功和肾功能,全自动凝血分析仪检测患者的凝血功能,酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测血浆脂多糖（LPS）、二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸（DLAC）水平。粪便标本进行细菌16Sr RNA测序分析,对比各组患者肠道菌群丰度、多样性及结构差异。结果:（1）TIPS能有效降低肝硬化食管胃静脉曲张破裂出血患者的门静脉压力,术后门静脉压有明显下降,由术前的34.59±6.02mm Hg,降至术后的24.42±5.88mm Hg,与术前相关差异有统计学意义（t=10.107,P<0.001）。（2）TPIS术后1周复查肝肾功能与术前相比ALT有一过性升高,Cr较术前下降,术后12周复查患者肝肾功能都较术前所改善。（3）TIPS对肠黏膜通透性的影响:TIPS术后DLAC有一过性升高,术后1周与对照组相比差异具有统计学意义（F=3.39,P=0.026）。而对反映肠黏膜通透性改变的其他指标LPS、DAO影响不大,各时间点与对照组相比差异均无统计学意义（P≧0.05）。（4）菌群α-多样性:肝硬化门静脉高压食管胃静脉曲张患者肠道菌群的丰富度及多样性明显降低,与对照组相比差异具有统计学差异（chao1 P<0.001,ACE P<0.001,Shannon P<0.001,Simpson P=0.026）。术后1周菌群丰富度与对照组相比其丰富度及多样性显着较低,差异有统计学意义（chao1 P<0.001,ACE P<0.001,Shannon P<0.001,Simpson P=0.015）。TIPS术后12周的菌群丰富度及多样性与术前相比均明显上升,差异有统计学意义（chao1 P=0.025,ACE P=0.037,shannon P<0.001,simpson P<0.001）,菌群多样性较术后1周明显升高,差异有统计学意义（shannon P<0.001,simpson P<0.001）。TIPS术后12周群丰富度接近正常对照组水平,与正常对照组相比无显着差异（P≧0.05）。（5）菌群β-多样性:TIPS术前及术后1周比较组间β-多样性无显着性差异,TIPS术后12周和TIPS术前、TIPS术后1周相比,β-多样性均有显着性差异（P<0.001,P<0.001）,对照组和TIPS术前、TIPS术后1周相比,β-多样性均有显着性差异（P<0.001,P<0.001）,TIPS术后12周和对照组间β-多样性无显着性差异。（6）在门水平上,与TIPS术前相比较,TIPS术后12周脱硫杆菌门、Campilobacterota等丰度明显升高。与TIPS术后一周相比脱硫杆菌门丰度明显升高。与正常对照组相比,TIPS术前拟杆菌门、脱硫杆菌门、脱铁杆菌门、Campilobacterota等丰度明显下降。与正常对照组相比,TIPS术后1周梭杆菌门、脱铁杆菌门、脱硫杆菌门、Campilobacterota等丰度明显升高。（7）在属水平上,与TIPS术前相比较,TIPS术后12周链球菌属丰度明显下降,布劳特氏菌属、乳杆菌属、梭状芽胞杆菌属等丰度明显升高。与正常对照组相比,TIPS术前克雷伯氏菌属、链球菌属、肠球菌属、罗氏菌属、Hungatella等丰度明显升高,罗斯氏菌属、普雷沃氏菌属、巨单胞菌属、噬氢菌属、念珠菌支原体属、乳杆菌属、布劳特氏菌属、梭状芽胞杆菌、假单胞菌属等丰度明显下降。结论:1、TIPS能有效降低肝硬化门静脉高压食管胃静脉曲张破裂出血患者的门静脉压力,支架分流后对患者的肝功能没有明显影响。2、TIPS术后早期患者的肠黏膜通透性可能会一过性增加。3、肝硬化门静脉高压食管胃静脉破裂出血后患者肠道菌群物种丰度及多样性下降,有益菌减少,有害菌增加。4、TIPS降低门静脉压力后,随着时间的延长患者肠道菌群会逐渐得到改善,物种丰度及多样性增加,有益菌增加,有害菌减少,有利于患者肝功能的改善。
王国秀[3]（2020）在《肾足细胞内补体激活通过内皮素系统介导三氯乙烯致免疫性肾损伤机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景三氯乙烯（trichloroethylene,TCE）是一种卤代烃类有机溶剂,在工业上广泛用作金属清洗剂和溶脂剂等。在中国,每年至少有2万名新工人受到TCE暴露的威胁。工人可通过皮肤和呼吸系统接触三氯乙烯感染职业性三氯乙烯药疹样皮炎（occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,ODMLT）,引起多器官的免疫性损伤。该病病情凶险,病死率较高,临床表现除皮肤损害、发热、肝脏损害和浅表淋巴结肿大外,肾脏损害也是其重要临床表现之一,肾功能衰竭是导致ODMLT患者死亡的主要原因之一,研究TCE致免疫肾损伤的分子机制对于预防和治疗ODMLT具有重要意义。ODMLT通常被认为是抗原特异性T淋巴细胞介导的Ⅳ型变态反应。然而,近年来越来越多的研究表明,仅用Ⅳ型变态反应不能完全解释ODMLT的发病机理,尤其是其引起多脏器严重损伤的机制。临床和动物实验研究发现,补体系统在TCE致敏诱导的多器官免疫性损伤中也发挥了重要的作用。补体系统主要通过经典激活途径（Classical pathway,CP）,凝集素活化途径（Lectin pathway,LP）,和旁路激活途径（alternative pathway,AP）三个途径被激活,这些途径均导致中心组分补体C3裂解成生物活性片段C3a和C3b。本课题组前期研究发现,TCE经皮致敏小鼠后其肾脏肾小球中补体C3的沉积量明显增加,提示TCE致敏后肾脏局部产生的补体被激活。那么,TCE致敏后肾脏局部补体系统的激活是否介导肾脏的免疫损伤?其作用的具体分子机制是什么?大量研究证实,补体激活与内皮素-1（endothelin-1,ET-1）信号系统相关,补体系统和内皮素系统的同时活化在许多实验模型和临床病例中都有报道。而内皮素-1是肾脏损伤的标志,不仅可以作为重要的促炎症因子,诱导TNF-α、IL-1β、ICAM-1等炎性细胞因子的分泌,导致肾脏的炎症损伤;同时,内皮素-1可以通过与主要在肾脏内皮细胞上表达的内皮素B型受体（Endothelin type B receptor,ETBR）结合,介导内皮型一氧化合成酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）系统功能受损,减少NO的合成,引起ET-1/NO动态平衡失调,导致内皮细胞功能障碍,进而加重肾脏损伤。因此我们推测,TCE致敏引起的肾脏局部补体的激活,可通过进一步活化内皮素系统介导肾脏的炎症反应和肾脏内皮细胞功能障碍,进而导致肾脏的免疫损伤。研究目的建立TCE经皮致敏小鼠模型,分别采用拮抗补体激活的Cat Li,及ETBR的特异性抑制剂BQ-788对TCE致敏小鼠进行预处理,探讨TCE致敏后肾脏局部补体的激活通过内皮素系统介导肾脏免疫性损伤的具体分子机制。本项目的研究结果将进一步丰富TCE致敏引起的免疫性肾损伤的复杂作用机理,为防治ODMLT免疫性多器官损伤提供理论依据。第一部分肾足细胞内补体激活促进内皮素分泌和炎症反应介导三氯乙烯致免疫性肾损伤研究方法建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠模型,使用能拮抗补体激活的Cat Li进行预处理,采用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）和免疫荧光（Immunofluore-scence,IF）法检测各组小鼠肾组织中C3、C3a的表达和组织定位,分别采用检测试剂盒和苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组小鼠肾功能和肾组织病理学改变,分别采用RT-PCR、IHC、ELISA法检测小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达,IHC法检测各组肾组织中TNF-α,IL-1β,ICAM-1等炎症细胞因子的表达情况,并采用Western blot法检测各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38 MAPK炎症信号通路的蛋白表达水平,探讨TCE致敏后肾脏局部补体的激活通过促进ET-1分泌及其相关炎症因子的释放,介导肾脏免疫性损伤的分子机制。结果1.各组小鼠致敏情况空白对照组和溶剂对照组小鼠分别5只,其背部皮肤都没有水肿和红斑,致敏评分都为0,致敏率均为0.00%;TCE处理组小鼠共20只,其中有8只小鼠致敏评分≥1,12只小鼠致敏评分为0,致敏率为40.00%;TCE+Cat Li联合处理组小鼠共20只,其中7只小鼠致敏评分≥1,13只小鼠致敏评分为0,致敏率为35.00%。2.各组小鼠肾组织中补体C3、C3a的沉积IHC法检测补体C3和C3a在小鼠肾组织中的沉积情况。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组以及TCE未致敏组、TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中无明显C3和C3a沉积;与溶剂对照组相比,补体C3和C3a在TCE致敏小鼠肾组织的沉积量显着增加（P<0.05）,且主要在肾小球中表达。经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织中C3和C3a的沉积量较TCE致敏组明显减少（P<0.05）。这些数据表明,TCE致敏小鼠肾小球中的补体系统被激活,而Cat Li能有效抑制肾脏中补体系统的活化。3.各组小鼠肾组织中补体C3、C3a的定位免疫荧光双染色法检测肾脏中C3（C3a）和Nephrin（肾足细胞标志蛋白）的共定位。空白对照组小鼠肾小球中未见明显C3和C3a沉积;而在TCE致敏组小鼠肾小球中,Nephrin表达阳性的足细胞中可以检测到大量C3和C3a。结果表明,TCE致敏小鼠肾脏补体的激活主要定位于肾小球足细胞。4.各组小鼠的肾功能检测血清Cr和BUN是反映肾功能的检测指标。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组肾功能无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠血清Cr和BUN水平显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组小鼠血清Cr和BUN水平较溶剂对照组虽有所升高,但与TCE致敏组相比明显下降（P<0.05）。结果说明,TCE致敏后出现肾功能损伤,而Cat Li通过拮抗肾足细胞内补体的活化,改善了TCE致敏小鼠损伤的肾功能。血清Cys-C和尿微量白蛋白/肌酐（Albumin-creatinin ration,ACR）水平反映肾小球滤过功能。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组间肾小球滤过功能无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组血清Cys-C和尿ACR水平与TCE致敏组相比显着下降（P<0.05）。结果表明,TCE致敏后小鼠肾脏肾小球滤过功能受损,而Cat Li通过拮抗足细胞内补体的活化,改善了TCE致敏小鼠受损的肾小球滤过功能。5.各组小鼠肾脏病理学检测采用HE染色检测各组小鼠肾脏病理损伤情况。病理检查发现,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织结构清晰、正常;TCE致敏组小鼠肾组织可见明显的炎性细胞浸润、细胞肿胀,可见空泡样病变和肾小球肥大;TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织病理损伤程度与TCE致敏组相比明显减轻,肾小球大小甚至恢复正常。6.各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达首先采用实时定量PCR法检测各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA水平。检测结果显示,肾组织中ET-1的m RNA水平在空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组、TCE+Cat Li未致敏组间无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组小鼠肾组织中ET-1的m RNA水平显着升高（P<0.05）;Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组肾组织中ET-1 m RNA水平与TCE致敏组相比明显降低（P<0.05）。采用IHC、ELISA法检测各组小鼠肾组织中ET-1的蛋白水平。IHC染色显示,空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中ET-1的蛋白沉积均较少,且无显着性差异（P>0.05）;而TCE致敏组肾组织中ET-1的蛋白沉积量明显增多（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组肾组织中ET-1的蛋白沉积量较TCE致敏组明显减少（P<0.05）。ELISA结果也显示,小鼠肾组织中ET-1含量在空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组间无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组肾组织中ET-1含量显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织中ET-1含量明显降低（P<0.05）。7.各组小鼠肾组织中炎性细胞因子的表达7.1各组小鼠肾组织中TNF-α的沉积IHC检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中TNF-α的蛋白沉积较少,且差异无统计学意义（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织中可见TNF-α的蛋白沉积量显着增多（P<0.05）;尽管TCE+Cat Li致敏组肾组织中TNF-α的蛋白沉积量较溶剂对照组也有所增多（P<0.05）,但与TCE致敏组相比,其肾组织中TNF-α的蛋白沉积量显着减少（P<0.05）。7.2各组小鼠肾组织中IL-1β的沉积IHC染色显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织IL-1β蛋白沉积较少,且无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组肾组织中IL-1β的蛋白沉积显着增多（P<0.05）;而经Cat Li预处理后,IL-1β在TCE+Cat Li致敏组小鼠肾组织中的蛋白沉积量较TCE致敏组明显减少（P<0.05）。7.3各组小鼠肾组织中ICAM-1的沉积IHC染色显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+Cat Li未致敏组小鼠肾组织中ICAM-1的蛋白沉积较少,且差异无统计学意义（P>0.05）;TCE致敏组肾组织中ICAM-1的沉积量显着增多（P<0.05）;而与TCE致敏组相比,TCE+Cat Li致敏组肾组织中ICAM-1的蛋白沉积量明显减少（P<0.05）。8.各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38 MAPK信号通路蛋白表达水平Western blot法检测各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38 MAPK信号通路蛋白的表达水平。结果显示,p38和p65的蛋白表达量在所有处理组之间均无显着差异（P>0.05）。其磷酸化蛋白P-p38和P-p65的蛋白表达在空白对照组和溶剂对照组间也无显着差异（P>0.05）;而P-p38和P-p65在TCE致敏组肾组织中表达显着升高（P<0.05）;经Cat Li预处理后,TCE+Cat Li致敏组肾组织中P-p65和P-p38的蛋白表达量与TCE致敏组相比明显下降（P<0.05）。结果表明,Cat Li通过拮抗肾足细胞内补体的活化,显着下调了NF-κBp65和p38 MAPK信号的表达,NF-κBp65和p38MAPK通路参与了足细胞内补体激活介导的TCE致免疫肾损伤的过程。结论1.TCE致敏后其肾组织中补体C3和C3a表达显着升高,且主要沉积在足细胞,表明TCE致敏小鼠肾脏足细胞内的补体系统被活化;2.TCE致敏后肾足细胞内补体的激活上调了肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达,肾脏的ET-1系统被活化;3.上调的ET-1作为促炎因子,促进了TNF-α,IL-1β,ICAM-1等炎性细胞因子的释放,导致肾脏的炎性损伤;4.p38MAPK和NF-κBp65炎症信号通路蛋白在TCE致敏小鼠肾脏中的表达显着增多,而Cat Li预处理能明显降低其表达,表明p38 MAPK和NF-κBp65信号通路参与了足细胞补体激活介导的肾脏炎症损伤的作用过程。第二部分内皮素系统通过ETBR介导肾脏内皮细胞功能障碍加重三氯乙烯致免疫性肾损伤研究方法建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠模型,使用ETBR的特异性抑制剂BQ-788进行预处理,分别采用检测试剂盒和苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组小鼠肾功能及肾脏组织病理学改变;采用IHC法检测各组小鼠肾组织中血管内皮细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）、细胞间黏附分子（Intercellular adhesion molecules 1,ICAM-1）的表达水平,比较各组小鼠肾脏内皮细胞功能损害情况;采用试剂盒法检测各组小鼠肾组织中一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase,NOS）的活力;采用RT-PCR和IHC法检测各组小鼠肾组织中内皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）的m RNA和蛋白表达情况;采用试剂盒法检测各组小鼠肾组织中一氧化氮（Nitric oxide,NO）水平,探讨TCE致敏后肾组织中内皮素系统通过ETBR介导肾脏的免疫性损伤的作用机制。结果1.各组小鼠经皮致敏情况空白对照组和溶剂对照组小鼠分别5只,其背部皮肤均无水肿和红斑症状,致敏评分都为0,致敏率均为0.00%;TCE处理组小鼠共18只,其中有7只小鼠致敏评分≥1,11小鼠致敏评分为0,致敏率为38.89%;TCE+BQ-788联合处理组小鼠共18只,其中6只小鼠致敏评分≥1,12只小鼠致敏评分为0,致敏率为33.33%。2.各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白的表达分别采用RT-PCR、ELISA法检测各组小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达。RT-PCR检测结果显示,肾组织中ET-1的m RNA水平在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组间无显着差异（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织中ET-1的m RNA水平与溶剂对照组相比显着升高（P<0.05）。ELISA检测结果显示,空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组肾组织中ET-1含量无显着性差异（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织ET-1含量显着升高（P<0.05）。结果表明,TCE致敏小鼠肾组织中ET-1的m RNA和蛋白表达均显着升高,肾脏的内皮素系统被活化,与研究一结果一致。3.各组小鼠肾功能检测血清Cr和BUN水平是反映肾功能的检测指标,检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾功能无显着差异（P>0.05）;而TCE致敏组血清Cr和BUN水平与溶剂对照组相比显着升高（P<0.05）;经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组小鼠血清Cr和BUN水平虽较溶剂对照组也有所升高,但与TCE致敏组相比显着下降（P<0.05）。血清Cys-C和尿微量白蛋白/肌酐（ACR）水平反映肾小球滤过功能。检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组间肾小球滤过功能无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平显着升高（P<0.05）;经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平明显降低（P<0.05）。这些结果表明,TCE致敏后小鼠肾功能和肾小球滤过功能受损,而BQ-788通过拮抗ETBR,改善了内皮素系统活化介导的TCE致小鼠肾功能和肾小球滤过功能损伤。4.各组小鼠肾脏组织病理学检测采用HE染色检测各组小鼠肾组织病理损伤情况。病理检查发现,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾脏组织结构清晰无异常,无炎性细胞浸润,病理学无明显改变;而TCE致敏组小鼠肾脏可见明显的炎性细胞浸润,肾小球肿大,肾脏细胞发生空泡样病变;TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织炎性细胞浸润情况明显减轻,肾小球肿大情况明显改善,细胞的空泡样病变情况明显减少,病理损伤较TCE致敏组明显减轻。5.ETBR在肾组织中的定位采用免疫荧光双标法检测TCE致敏组小鼠肾组织ETBR和CD31（内皮细胞标志蛋白）的共定位。结果显示,ETBR主要在肾脏内皮细胞上表达。6.各组小鼠肾脏内皮细胞损伤情况6.1 RT-PCR法检测各组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达量均无显着差异（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达均显着升高（P<0.05）;而经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的m RNA表达水平较TCE致敏组均明显下降（P<0.05）。6.2免疫组化染色法检测各组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的沉积结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的蛋白沉积很少,且无显着差异（P>0.05）;TCE致敏组肾组织中VCAM-1、ICAM-1的蛋白沉积量显着增多（P<0.05）;而经BQ-788预处理后,VCAM-1、ICAM-1在TCE+BQ-788致敏组肾组织中的蛋白沉积量明显减少（P<0.05）。结果表明,TCE致敏小鼠肾脏内皮细胞发生功能障碍或损伤,而BQ-788通过拮抗ETBR有效改善了内皮素系统介导的肾脏内皮细胞功能障碍。7.各组小鼠肾组织中一氧化氮合酶（NOS）活力采用NOS检测试剂盒检测各组小鼠肾组织中NOS活力。结果显示,空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中的NOS活力无显着差异（P>0.05）;但与溶剂对照组相比,TCE致敏组小鼠肾组织中NOS活力明显降低（P<0.05）;经BQ-788预处理,TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织NOS活力较TCE致敏组明显升高（P<0.05）。8.各组小鼠肾组织中内皮型一氧化氮合酶（e NOS）的m RNA和蛋白表达本实验采用RT-PCR和免疫组化法检测各组小鼠肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达。结果显示,肾组织中e NOS的m RNA和蛋白水平在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组间差异无统计学意义（P>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;虽然TCE+BQ-788致敏组肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达水平较溶剂对照组也有所降低（P<0.05）,但与TCE致敏组相比,其肾组织中e NOS的m RNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。9.各组小鼠肾组织中NO水平采用NO检测试剂盒检测各组小鼠肾组织中NO含量。结果显示,小鼠肾组织中NO含量在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组、TCE+BQ-788未致敏组间无显着差异（P>0.05）;而TCE致敏组小鼠肾组织中NO含量显着降低（P<0.05）;经BQ-788预处理后,TCE+BQ-788致敏组肾组织中NO含量明显升高（P<0.05）。结论1.TCE致敏后,肾组织中ET-1含量和m RNA表达量显着升高,肾脏内皮素系统被活化;2.肾脏内皮素系统通过与内皮细胞表面ETBR结合,抑制肾组织中NOS的活力,降低e NOS的m RNA和蛋白表达,减少NO的合成和释放,造成NO/ET-1动态平衡失调,介导肾脏内皮细胞功能障碍,进而加重TCE致免疫性肾损伤。3.BQ-788通过抑制ETBR,可有效减轻内皮素系统介导的肾脏内皮细胞功能障碍,改善了TCE致敏小鼠的免疫性肾损伤。
郭敏[4]（2020）在《炎性细胞因子表达水平在创伤性ARDS及肺部感染和胸部手术患者的差异性分析及临床预后》文中指出目的:探讨炎性细胞因子IL-6,IL-10,IFN-γ和TNF-α,IL-1β,IL-4,IL-8在创伤性ARDS患者和肺部感染及胸部手术患者外周血中表达水平差异性及相关性,并为临床治疗提供理论参考。方法:（1）选取2017年05月至2019年12月在我院重症医学科收治的94例创伤性ARDS患者作为实验组。根据患者病情严重程度并参考2012年柏林标准将入组患者划分为轻度组（A组）、中度组（B组）以及重度组（C组）。对比各组患者入院时的血气分析结果、病情最重时的APACHEⅡ评分水平和ICU入住时间;通过CT扫描观察3组患者肺部影像结果;采用ELISA检测方法,检测所有患者入院当天和治疗后第2、5、7天清晨空腹静脉血血清中IL-6、IL-10、IFN-γ的水平;（2）健康对照组（D组）:选择在同一时期在同一医院的健康查体的40名健康成人,采用ELISA检测方法,检测清晨空腹静脉血血清中IL-6、IL-10、IFN-γ的水平;（3）肺部感染患者组（E组）:选取2019年11月1日至2020年3月31日在我院呼吸与危重症医学科住院的肺部感染患者32例为平行对照组,采用流式细胞法对其入院第2天和治疗7天后分别进行细胞因子检测;（4）胸部手术患者组（F组）:选取同期住院的胸部手术患者24例,采用流式细胞法对术前和手术后2天分别进行细胞因子检测作为平行对照研究。结果:（1）比较实验组三组患者入院时的血气分析:pH、PO2和PCO2水平均存在统计学差异（P<0.05）。各组间比较表明,肺损伤程度越重,血清p H水平和动脉血氧分压越低,二氧化碳分压越高。对各组患者APACHEⅡ评分和ICU入住时间分析,提示随疾病程度增加,患者评分水平不断上升,ICU入住时间不断延长;（2）各组创伤性ARDS患者血清IL-6、IL-10和IFN-γ平均表达水平均高于健康对照组（P<0.05）;（3）各实验组患者血清IL-6表达水平比较:三组患者血清IL-6含量自创伤后开始增高,在第1～2天达到高峰,之后逐渐下降,C组较A、B组达峰时间更长,增高程度更高,差异具有明显统计学意义（P=0.000）;（4）各实验组患者血清IL-10表达水平分析:自创伤后血清IL-10含量开始增高,在第1～2天达到高峰,之后逐渐下降,C组较A、B组达峰时间更长,增高程度更高。但其在早期差异明显（P<0.05）,5天后差异无统计学意义（P>0.05）,提示在损伤后期血清IL-10表达水平与损伤程度无相关性;（5）各实验组患者血清IFN-γ表达水平分析:自创伤后血清IFN-γ含量开始增高,在第1天即达到高峰,之后逐渐下降。病情越重,增高程度越大,差异具有明显统计学意义（P=0.000）;（6）对各实验组患者血清中IL-6、IL-10、IFN-γ的浓度与病情严重程度（APACHE II）行相关性分析,均呈正相关（均P<0.05）;（7）各实验组肺部CT影像:A组患者CT影像提示肺组织密度较正常组织无明显改变,B组患者CT影像表现为双肺透过性减低,部分肺叶可见多发斑片状磨玻璃状密度影,C组患者影像提示斑片状磨玻璃影范围较B组增大,可有合并肺不张或血气胸。（8）E组患者治疗前后细胞因子表达水平结果:血IL-1β,IL-4,IL-6,IFN-γ在肺部感染性疾病患者中,治疗7天前后表达水平没有差异性（P>0.05）,而IL-8,IL-10和TNF-α表达水平差异具有统计学意义（P<0.05）。（9）F组患者手术前后细胞因子表达水平:肺部创伤手术患者术前与术后第2天血IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ和TNF-α的表达水平具有差异性（P<0.05）,而IL-1β,IL-4表达水平无差异性（P>0.05）。结论:（1）IL-6、IL-10、IFN-γ在创伤性ARDS患者血清中的表达水平较健康对照组升高,且在不同程度的创伤性ARDS患者的血清中表达量不同;通过联合检测各项炎症因子水平,对创伤性ARDS的早期诊断及严重程度的评估具有重要的临床意义。（2）细胞因子IL-8,IL-10和TNF-α表达水平可以预测肺部感染性疾病患者治疗效果,而IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ和TNF-α表达水平可以评估胸外科创伤手术后患者疗效和指导用药。
王丽丽[5]（2020）在《股肿证型部分临床理化指标的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:观察对比中医“股肿”（下肢深静脉血栓形成deep vein thrombosis,DVT）二个证型之间及与非“股肿”患者的相关的理化检查指标（炎症指标、血流变学指标、风湿四项、自身抗体十五项、抗心磷脂抗体、抗核抗体、肿瘤六项、免疫球蛋白、补体等）的差异,借以探讨中医证型临床理化检查指标的相关性,寻找特征性指标,在中医“辨证论治”原则指导下,逐步在中医证型中归纳添加现代医学临床理化指标内容,形成相关的、不偏离“辩证论治”原则的中医证型新的主证和兼证内容;丰富中医的内涵、提供中西医结合的新思路!方法:本研究病例源自2016年03月至2019年12月本院周围血管外科门诊、住院的患者,符合纳入标准115例,年龄范围为15岁～96岁,其中男性患者58例,女性患者57例。并设立55例非股肿患者为对照研究组。通过统计学处理,分析股肿患者中医证型情况,并对本病中医证型与相关观察指标进行探讨。结果:1.本研究共收入115例“股肿”患者,根据辨证论治分型,分为两个主证组,脉络湿邪瘀滞证55例,脉络湿热瘀阻证60例;同时设立55名非股肿患者为对照研究组。2.两个主证之间进行年龄组、性别、血型的差异性比较:经检验,年龄P>0.05,无统计学意义;性别P>0.05,无统计学意义;血型P>0.05,无统计学意义,表明不同年龄段、性别、血型的分组之间,股肿患者中医证型间不存在差异性。3.两证型间高血压病史、冠心病病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史、肿瘤病史的差异性分析:肿瘤史P=0.007<0.01,有非常显着的统计学意义;余检测指标P>0.05,无统计学意义。4.两证型之间相关理化指标差异性分析:白细胞计数、中性粒细胞百分比、C-反应蛋白无统计学意义（P>0.05）;免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、补体C3、补体C4无统计学意义（P>0.05）;尿酸、抗链球菌溶血素O、类风湿因子、抗环瓜氨酸肽抗体无统计学意义（P>0.05）;甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原125、糖类抗原153、糖类抗原199、糖类抗原724的无统计学意义（P>0.05）;无统计学意义（P>0.05）;暂不认为在股肿不同证型间以上检验指标存在差异性。5.将非股肿对照组患者分别与股肿两证型比较发现:非股肿患者在白细胞计数、中性粒细胞百分比、免疫球蛋白A、尿酸、甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原125、糖类抗原153、糖类抗原199、D-二聚体均有统计学差异（P<0.05）,提示股肿患者与非股肿患者之间有显着差异性。在免疫球蛋白G、免疫球蛋白M的比较中发现非股肿对照组患者与股肿患者无明显差异性。统计学中发现糖类抗原724在非股肿对照组中与股肿脉络湿邪瘀滞证间的比较无差异性（P>0.05）,在脉络湿热瘀阻证间的比较具有差异性（P<0.05）。结论:股肿（下肢深静脉血栓形成Deep vein thrombosis,DVT）患者中同时有肿瘤病史者,其糖类抗原724多见于脉络湿邪瘀滞证。在与非股肿患者对比时发现在脉络湿热瘀阻证间的比较具有差异性,结果提示:可试行将糖类抗原724这一指标纳入“股肿”脉络湿热瘀阻证型中,作为判断股肿合并肿瘤患者与非股肿患者的“兼证”依据。
黄海金[6]（2020）在《氟比洛芬酯对烧伤SD大鼠早期认知功能的影响及其机制研究》文中提出研究背景:烧伤是毁灭性的伤害,通常会导致高发病率、情绪低落以及生活质量的下降。除了紧张的即时护理外,烧伤通常还需要进行长期治疗、多次门诊就诊（换药等）以及多次重建性外科手术和住院治疗,这些与烧伤有关的健康后果通常会给烧伤受害者及其家人带来额外的社会经济负担。热损伤促进组织炎症和疼痛,这是很难控制的。已有研究表明,麻醉和镇痛可以影响大鼠烧伤模型的结果。不同的外周机制似乎与烧伤疼痛有关,但仍需进一步研究。大量的临床前期研究和一些回顾性临床证据表明,麻醉可能损害认知能力。越来越多的临床前期研究证据表明麻醉剂是神经元发育和功能强大的调制器,可能导致有害的作用。本研究旨在探究氟比洛芬酯是否足以减少烧伤引起的痛觉和炎症,以及对早期认知的影响,阐明氟比洛芬酯治疗大鼠热损伤模型、减轻早期认知功能损伤的分子机理。研究目的:POD是老年患者常见的术后并发症,在非心脏手术后的老年患者中,POD的发生率为3.6%-28.3%。氟比洛芬酯理论上通过抑制烧伤局部的炎症反应及中枢神经系统的炎症反应、减轻疼痛,减少认知功能损伤的发生。因此,本研究的目的是通过研究氟比洛芬酯对老年SD大鼠烧伤后早期认知功能的影响,并探讨其可能的机制,为临床烧伤患者术后认知功能损伤的防治提供可靠的实验依据。实验一:氟比洛芬酯对烧伤大鼠早期认知和炎症的影响研究方法:通过构建老年大鼠烧伤模型,利用HE染色判断模型是否成功,实验分组为:1)正常对照组（Contro1）;2)烧伤模型组（Model）;3)氟比洛芬酯低剂量处理组（5mg/kg）;4)氟比洛芬酯中剂量处理组（10mg/kg）;5)氟比洛芬酯高剂量处理组（15mg/kg）。将各组大鼠（n=6）按上述分组处理,正常对照组不做烧伤处理。建模前30分钟/建模后24h给药,第3天处死大鼠。利用Von Frey法测量各组大鼠在烧伤后12、24、36、48、60、72h的机械痛阈值,评价大鼠疼痛行为学;通过Morris水迷宫实验观察大鼠的空间记忆和学习能力;HE染色检测各组皮肤和海马组织的病理结果;ELISA检测各组血清中TNF-α、CINC-1、IL-6和IL-1β表达水平;TUNEL染色检测各组海马组织凋亡的结果。研究结果:模型建造成功。烧伤SD大鼠经氟比洛芬酯处理治疗后,烧伤引起的游滞区组织的表皮层变薄、真皮层结构肿胀、胶原结构改变、局部炎症浸润、组织破坏等损伤倾向有所减轻,并随剂量增加,这一作用更加明显。给予氟比洛芬酯处理治疗后,大鼠机械痛阈值较模型组显着升高（P<0.05）,各剂量处理组组间差异不显着。Morris水迷宫实验显示,烧伤使大鼠空间记忆和学习能力下降,而氟比洛芬酯处理治疗后,大鼠的空间记忆和学习能力有所改善。海马HE染色结果显示烧伤使大鼠海马组织出现病理改变,经氟比洛芬酯处理治疗后,海马病理学改变有所改善,但各剂量处理组组间差异不明显。与正常对照组相比,模型组的TNF-α、CINC-1、IL-6和IL-1β含量都明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,各氟比洛芬酯处理组的TNF-α、CINC-1、IL-6和IL-1β含量都明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,各剂量处理组组间差异不显着。与正常对照组相比,模型组的大鼠海马组织凋亡明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,氟比洛芬酯处理治疗组的大鼠海马组织凋亡明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;并且氟比洛芬酯高剂量处理组（15mg/kg）下降最为明显。研究结论:氟比洛芬酯处理后抑制了炎症因子TNF-α、CINC-1、IL-6和IL-1β的表达,缓解痛觉过敏,减轻大鼠早期认知功能损伤。实验二:氟比洛芬酯影响烧伤大鼠早期认知的分子机制研究方法:通过构建老年大鼠烧伤模型,利用HE染色判断模型是否成功,实验分组为:1)正常对照组（Control）;2)烧伤模型组（Model）;3)氟比洛芬酯低剂量处理组（5mg/kg）;4)氟比洛芬酯中剂量处理组（10mg/kg）;5)氟比洛芬酯高剂量处理组（15mg/kg）。建模前30分钟/建模后24h给药,根据实验一中机械痛阈值的结果,选择造模后48h处死各组大鼠（n=6）。HE染色检测各组皮肤和海马组织的病理结果;qPCR检测各组BDNF、Caspase3、GFAP和MMP9的mRNA表达水平;免疫组化染色检测各组BDNF的表达和定位情况;Westernblot检测各组BDNF、Caspase3、p38和p-p38蛋白表达水平。研究结果:模型建造成功。与正常对照组相比,模型组大鼠海马组织的BDNF、Caspase3、GFAP和MMP9的mRNA表达水平显着升高,并且BDNF、caspase3和p-p38的蛋白表达明显升高,差异均具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,各氟比洛芬酯处理治疗组海马组织的BDNF、Caspase3、GFAP和MMP9的mRNA表达水平显着下降,并且BDNF、caspase3和p-p38的蛋白表达明显下降,差异均具有统计学意义（P<0.05）,各剂量处理组组间的BDNF、Caspase3、GFAP和MMP9的mRNA表达水平及BDNF、caspase3和p-p38的蛋白表达水平差异不显着。研究结论:氟比洛芬酯通过抑制烧伤SD大鼠p38信号通路,使BDNF、Caspase3、GFAP和MMP9的mRNA表达及BDNF、caspase3和p-p38的蛋白表达下降,从而减轻大鼠早期认知功能损伤。
荚杨洋[7]（2020）在《艾塞那肽对2型糖尿病患者血小板聚集功能的影响》文中认为目的了解胰高糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂艾塞那肽对2型糖尿病患者血小板聚集功能及凝血功能的影响,以期为GLP-1受体激动剂的临床应用及糖尿病心血管疾病的防治提供理论依据。方法选取2018年10月至2019年11月于安徽医科大学第一附属医院内分泌科就诊的新诊断的2型糖尿病患者30例作为病例组,仅接受生活方式干预,未予任何降糖药物治疗以及抗血小板聚集治疗,糖基化血红蛋白A1c（Hb A1c）7.5～10.0%。其中男20例,女10例,年龄22～62岁,糖尿病病程1周～24月,体重指数（BMI）24.2-36.3 kg/m2。选取同期在安徽医科大学第一附属医院健康管理中心接受健康体检的糖耐量正常人群30例作为对照组,其中男21例,女9例,年龄24～59岁,BMI 24.5-36.0 kg/m2,均未接受抗血小板聚集治疗。其中病例组患者接受为期8周的艾塞那肽治疗,起始治疗为5μg皮下注射,每日两次,4周后改为10μg皮下注射,每日两次,持续4周。检测病例组治疗8周前后以及对照组受试者外周血血小板计数（PLT）、血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、国际标准化率（INR）、纤维蛋白原含量（FIB）、血浆凝血酶时间（TT）,并测定胶原（COLL）、肾上腺素（EPI）、花生四烯酸（ACA）、二磷酸腺苷（ADP）诱导剂诱导的血小板聚集功能指标。应用配对t检验比较病例组治疗8周前后观察指标的改变,采用Pearson相关分析和多元逐步回归分析探讨影响艾塞那肽治疗前后血小板聚集、止凝血指标的相关因素。结果1)与对照组相比较,病例组受试者治疗前的TG、FPG、Hb A1c水平均显着高于对照组（P<0.05）,两组间性别构成、年龄、体重、BMI、腰围、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）均无显着差异（P>0.05）。2)与对照组相比较,病例组受试者治疗前的FIB水平、以肾上腺素为诱导剂的血小板聚集率、以二磷酸腺苷为诱导剂的血小板聚集率、以花生四烯酸为诱导剂的血小板聚集率均显着高于对照组（P<0.05）,两组间PT、PT%、INR、APTT、TT、FDP、DD、以胶原为诱导剂的血小板聚集率均无显着差异（P>0.05）。3)与治疗前相比较,治疗8周后病例组患者的体重、BMI、腰围、SBP、TC、甘油三酯（TG）、LDL-C、空腹血糖（FPG）、Hb A1c均明显降低（P<0.05）,HDL-C明显增高（P<0.05）,DBP有降低,但无统计学差异（P>0.05）。4)与治疗前相比较,治疗8周后病例组患者的FIB水平、以花生四稀酸为诱导剂的血小板聚集率、以肾上腺素为诱导剂的血小板聚集率均明显降低（P<0.05）。而PT、PT%、INR、APTT、TT、FDP、DD、以胶原为诱导剂的血小板聚集率、以二磷酸腺苷为诱导剂的血小板聚集率在治疗前后均无显着差异（P>0.05）。5)Pearson相关分析显示,在治疗8周后病例组患者中,无论是以肾上腺素为诱导剂的血小板聚集率改变值（Δ血小板聚集率（肾上腺素））还是以花生四烯酸为诱导剂的血小板聚集率改变值（Δ血小板聚集率（花生四烯酸））,均与BMI改变值（ΔBMI）、腰围改变值（Δ腰围）、体重改变值（Δ体重）、胆固醇改变值（ΔTCH）、甘油三酯改变值（ΔTG）、低密度脂蛋白改变值（ΔLDL-C）、高密度脂蛋白改变值（ΔHDL-C）、空腹血糖改变值（ΔFPG）、糖化血红蛋白A1c改变值（ΔHb A1c）、纤维蛋白原改变值（ΔFIB）均无明显相关性（P>0.05）。结论2型糖尿病患者中血小板聚集率明显增高,艾塞那肽可抑制2型糖尿病患者中以肾上腺素及花生四烯酸为诱导剂的血小板聚集率,而且这种效应可能与药物的减重、降糖、调脂疗效无关。
李亚楠[8]（2020）在《肠道菌群在2型糖尿病发生发展中的作用及对糖代谢的影响》文中提出目的 分析高海拔地区藏、汉两民族健康人群肠道菌群的特征及差异;探讨2型糖尿病（T2DM）患者肠道菌群特征及其与胰岛素抵抗间的关系;并进一步观察粪菌移植（FMT）对T2DM患者肠道菌群和糖代谢的影响。方法1.招募年龄、性别相匹配的健康藏族与汉族志愿者各10人,行常规体检,进行饮食习惯问卷调查分析两组人群饮食结构特点,收集晨起粪便标本,行16SrRNA高通量测序分析两组人群肠道菌群特征,比较藏族人群与汉族人群肠道菌群的差异并探讨其差异的影响因素。2.选择2017年3月至2018年1月收治的46例汉族T2DM患者纳为观察组,同时选择同期体检的50例汉族健康体检者纳为对照组,采集空腹外周血,检测空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1C）、空腹胰岛素（FINS）、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等指标,计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）,同时收集晨起粪便标本,分析两组人群肠道菌群特征,比较两组人群肠道菌群结构差异,探讨T2DM患者肠道菌群失调与胰岛素抵抗的相关性。3.招募2018年4月-6月就诊的血糖控制不达标（HbA1C≥7.0%）汉族、男性T2DM患者5人作为受试者,通过口服粪菌糊胶囊行FMT治疗,分别于第1、2天及第7、8天行FMT,随访6周,检测FMT治疗前及治疗6周后体重、腰围、HbA1C、TG、FPG、FINS,对比FMT治疗前后受试者血糖、HbA1C、HOMA-IR、体重指数（BMI）、腰围、TG、肠道菌群特征及降糖药物剂量的变化,评估口服粪菌糊胶囊行FMT治疗T2DM的有效性及安全性。结果1.藏、汉族两组人群在肠道菌群种类和丰度上均存在明显差异。在生物门类学水平上藏族人群的拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌（Proteobacteria）丰度高于汉族人群,厚壁菌门（Firmicutes）、软壁菌门（Tenericutes）、放线菌门（Actinobacteria）丰度低于汉族人群。在生物菌种水平上藏族人群拟杆菌中的普氏菌（Prebotella）、双歧杆菌（Bifidobacteriales）及厚壁菌门中的乳杆菌（Lactobacillales）丰度低于汉族人群。经Pearson相关性分析得出,肠道菌群中拟杆菌的丰度与饮食结构中蛋白质（畜牧禽蛋类）的摄入量呈正相关（藏族r=0.834,0.696;汉族r=0.903,0.815,P均<0.05）,普氏菌的丰度与细粮的摄入量呈正相关（汉族r=0.879,0.772,P<0.05）,软壁菌门的丰度与蔬菜、水果的摄入量呈正相关（汉族r=0.726,0.526,P<0.05）,乳杆菌的丰度与细粮的摄入量呈正相关（藏族r=0.799,0.639;汉族r=0.672,0.452,P均<0.05）。2.T2DM组柔嫩梭菌、肠球菌丰度显着高于健康对照组[（5.78±1.12）logN/g vs（5.21±1.01）logN/g,（4.61±0.89）logN/g vs（4.23±0.87）logN/g,P均<0.05],拟杆菌与大肠杆菌丰度显着低于对照组[（6.64±1.07）logN/g vs（7.41±1.05）logN/g,（1.91±0.54）logN/g vs（2.18±0.55）logN/g,P<0.05],两组球形杆菌、乳杆菌、普氏菌及双歧杆菌丰度无显着性差异（P>0.05）;两组TC、TG、HDL-C、LDL-C及HOMA-IR间存在显着性差异[（5.77±1.13）mmol/L vs（4.02±0.58）mmol/L,（3.41±0.67）mmol/L vs（1.36±0.35）mmol/L,（1.21±0.46）mmol/L vs（1.63±0.43）mmol/L,（3.59±0.89）mmol/L vs（1.89±0.51）mmol/L,（1.02±0.23）vs（3.68±1.01）,P 均<0.05];经Pearson相关性分析得出,拟杆菌丰度与HOMA-IR指数呈负相关（r=-0.264,P<0.05）,肠球杆菌丰度与TG水平呈正相关、与HDL-C水平呈负相关（r=0.313,-0.247,P<0.05）,柔嫩梭菌丰度与HDL-C水平呈负相关、与HOMA-IR指数呈正相关（r=-0.221,0.314,P<0.05）。3.5名汉族受试者口服粪菌糊胶囊行FMT后随访6周,均无发热、恶心、腹泻等不良反应,FMT治疗后6周受试者拟杆菌门与厚壁菌门（B/F）的比值较移植前上升,乳杆菌丰度较移植前上升,梭状芽孢杆菌（Clostridia）丰度较移植前下降。受试者FPG、2hPG、HbA1C、HMOA-IR较FMT前均有所改善[9.76±1.38)mmol/l vs（6.64±0.79）momol/l,（13.3±1.56）mmol/l vs（8.82±0.81）mmol/l,（9.46±1.22）%vs（6.22±2.05）%,（6.6±1.08）vs（4.89±0.82）,P均<0.05],其中2位受试者降糖药物剂量有所减少（受试者1每日甘精胰岛素剂量减少12u并停用口服阿卡波糖50mgtid、受试者2每口甘精胰岛素剂量减少4u）。同时观察到受试者TG、BMI、腰围均有所下降[（3.62±0.58）mmol/l vs（2.98±0.34）mmol/l,（24.46±1.45）kg/m2 vs（24.02±1.47）kg/m2,（92.8±3.42）cm vs（86.4±3.78）cm,P均<0.05]。结论1.藏、汉两民族人群肠道菌群存在差异,主要表现为B/F的比值,藏族人群B/F比值高于汉族人群,其差异与饮食结构不同有关,肠道菌群中拟杆菌的丰度与饮食结构中蛋白质（畜牧禽蛋类）的摄入量呈正相关,普氏菌的丰度与细粮的摄入量呈正相关,软壁菌门的丰度与蔬菜、水果的摄入量呈正相关,乳杆菌的丰度与细粮的摄入量呈正相关。2.T2DM患者存在肠道菌群失调、胰岛素抵抗及脂代谢紊乱现象,主要表现为柔嫩梭菌、肠球菌丰度升高,拟杆菌与大肠杆菌丰度降低,拟杆菌丰度与HOMA-IR指数呈负相关,肠球杆菌丰度与TG水平呈正相关、与HDL-C水平呈负相关,柔嫩梭菌丰度与HDL-C水平呈负相关、与HOMA-IR指数呈正相关。T2DM患者肠道菌群失调可能通过引起代谢性内毒素血症及胆汁酸代谢异常,影响患者脂代谢并加重胰岛素抵抗,最终促进糖尿病的发生和发展。3.T2DM患者行FMT治疗后肠道菌群紊乱情况有所改善,表现为B/F比值有所上升,具体菌种水平上乳杆菌丰度较移植前上升,梭状芽孢杆菌丰度较移植前下降。FMT还可改善T2DM患者血糖控制、血脂、BMI、腰围,改善胰岛功能,减少降糖药物剂量。口服粪菌糊途径行FMT创伤小、可操作性强、安全有效,患者更容易接受。
朱颖[9]（2019）在《局部肾素血管紧张素系统在免疫性肾病中变化的研究》文中进行了进一步梳理第一部分 肾脏肾素血管紧张系统在儿童免疫性肾病中的变化研究目的观察免疫性肾病患儿肾组织中血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）、血管紧张素转换酶1（ACE1）、血管紧张素-（1-7）[Ang-（1-7）]、血管紧张素转换酶2（ACE2）表达及尿血管紧张素原（uAGT）含量在儿童免疫性肾病中的变化,探讨局部肾素血管紧张素系统（RAS）激活与病情严重程度的相关性及uAGT作为反应肾内RAS活性标志物的可能性。方法对经肾活检明确病理的原发性肾病综合征（PNS）21例、IgA肾病（IgAN）30例,急性链球菌感染后肾小球肾炎（APSGN）5例,C3肾小球肾炎（C3GN）1例,紫癜性肾炎（HSPN）103例,狼疮性肾炎（LN）11例,肝豆状核变性（HLD）伴肾损伤1例进行横向研究。评估患儿的一般情况、临床指标,采用免疫组织化学法检测Ang Ⅱ、ACE1、AAng-（1-7）、ACE2在儿童肾脏内的表达,ELISA法检测患儿uAGT的变化;应用计算机图像处理系统分析免疫组化结果;并分析uAGT与肾内RAS成分表达含量及24h尿蛋白排泄量的相关性。以病理结果为肾小球轻微病变44例作为肾脏免疫组化对照组,以2018年6～12月我院儿保科50例健康体检儿作为正常组检测血、尿指标。结果（1）与对照组相比,PNS患儿肾内Ang Ⅱ、ACE1表达增高,ACE2、Ang-（1-7）表达下降（P<0.05）;与正常组及对照组相比,PNS组uAGT/uCr水平增加（P<0.05）;uAGT/uCr水平与肾脏内RAS表达、24h尿蛋白排泄量具有相关性（P<0.05）;（2）与对照组相比,IgAN患儿肾内Ang Ⅱ、ACE1表达增高,ACE2、Ang-（1-7）表达下降（P<0.05）,且随病理级别加重,差异越加明显;与正常组及对照组相比,IgAN组uAGT/uCr水平增加（P<0.05）;uAGT/uCr水平与肾脏内RAS表达、24h尿蛋白排泄量具有相关性（P<0.05）;（3）与对照组相比,HSPN患儿肾内Ang Ⅱ、ACE1表达增高,ACE2、Ang-（1-7）表达下降（P<0.05）,且随病理级别加重,差异越加显着;与正常组及对照组相比,HSPN组uAGT/uCr水平增加（P<0.05）;uAGT/uCr水平与肾脏内RAS表达、24h尿蛋白排泄量具有相关性（P<0.05）;（4）与对照组相比,LN患儿肾内Ang Ⅱ、ACE1表达增高,ACE2、Ang-（1-7）表达下降（P<0.05）,ⅣV级中变化最为明显;与正常组及对照组相比,LN组uAGT/uCr水平增加（P<0.05）;uAGT/uCr水平与肾脏内RAS表达、24h尿蛋白排泄量具有相关性（P<0.05）;（5）与对照组相比,APSGN、C3GN、HLD伴肾损伤等免疫性肾病患儿肾内Ang Ⅱ、ACE1表达增高,ACE2、Ang-（1-7）表达下降;与正常组及对照组相比,APSGN、C3GN、HLD伴肾损伤组uAGT/uCr水平增加。结论儿童多数免疫性肾病存在局部RAS激活现象,RAS活性与病情严重程度有相关性;uAGT/uCr可以作为反映肾内RAS活性的标志物,对评估肾脏疾病严重程度具有重要临床意义。第二部分血管紧张素（1-7）通过抑制NF-κB通路保护脓毒症急性肾损伤的研究目的观察脂多糖（LPS）诱导小鼠脓毒症急性肾损伤（SA-AKI）的发生情况及血管紧张素（1-7）[Ang-（1-7）]对SA-AKI小鼠肾脏组织形态学、肾脏血管紧张素系统（RAS）、炎症反应、氧化应激及核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响,探讨SA-AKI小鼠肾脏RAS活化与NF-κB信号通路激活的关系及Ang-（1-7）对SA-AKI小鼠保护作用的分子机制。方法应用颈内注射脂多糖（LPS）方法建立SA-AKI小鼠实验模型,C57BL/6近交系雄性小鼠80只,按随机数字表分为正常对照组、Ang-（1-7）组、脓毒症组（LPS组）、脓毒症加Ang-（1-7）组[LPS+Ang-（1-7）组]4组,每组20只。实验第15天杀鼠后取血标本和肾组织标本,应用全自动生化分析仪检测小鼠血清中尿素氮、肌酐水平,ELISA法检测血清、肾组织中炎症指标变化,化学比色法检测肾皮质氧化应激指标改变、免疫组织化学技术观察肾组织血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）表达情况,Western Blot检测肾组织NF-κB-p65、IκBα蛋白的表达,并观察肾组织病理改变。结果（1）与正常对照组相比,SA-AKI组小鼠血清肌酐、尿素氮上升（P<0.05）;炎症指标TNF-α、IL-1β、IL-6,脂质过氧化产物MDA明显上升,肾组织中Ang Ⅱ表达及NF-κB磷酸化水平明显增加,抗氧化产物SOD、T-AOC及肾组织中IκBα蛋白表达明显下降（P<0.05）;肾组织病理肾损伤明显;（2）Pearson相关分析显示肾脏Ang Ⅱ含量与NF-κB-p65相对蛋白含量呈正相关,与IκBα相对蛋白含量呈负相关（P<0.05）;（3）Ang-（1-7）干预组小鼠尿素氮、肌酐、TNF-α、IL-1β、IL-6水平,MDA含量,及肾组织Ang Ⅱ表达、NF-κB磷酸化水平均低于SA-AKI组,SOD、T-AOC及IκBα蛋白含量均高于SA-AKI组（P<0.05）;病理显示肾损伤减轻。结论（1）LPS诱导SA-AKI小鼠存在肾脏RAS过度激活,肾组织Ang Ⅱ表达增加,炎症损伤及氧化应激反应严重,肾脏炎症通路NF-κB活化;（2）SA-AKI小鼠肾组织RAS活性与NF-κB活化程度相关;（3）Ang-（1-7）能够通过降低肾脏Ang Ⅱ水平,下调NF-κB通路的表达,减轻炎症反应及氧化应激,保护SA-AKI。
唐亚杰[10]（2019）在《下丘脑室旁核对病原系统性炎症的响应和调控功能的研究》文中指出内毒素脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的活性成分,当注射到动物体内时,会诱导机体产生大量的细胞因子,从而引发全身系统性炎症和一系列特定的病理生理和行为改变。但是这些改变在宿主防御中的作用很大程度上是未知的。免疫系统与神经内分泌系统之间的相互作用是生物体克服炎症或感染等疾病状态的必要条件。下丘脑室旁核（PVN）是一个重要的核团,它通过整合神经内分泌、自主神经和行为反应,对体内平衡的变化（如感染）做出反应。下丘脑室旁核借助神经脉冲获得大量信息,当机体出现异常时,就会释放各种化学物质到垂体,从而调节机体内稳态的平衡。本研究旨在利用神经生物学技术手段,特异性操控下丘脑室旁核,通过分析细胞因子、神经递质、神经肽、激素等来初步探索下丘脑室旁核在神经内分泌免疫系统中发挥的作用;同时,通过分析动物在系统性炎症模型中的行为,对下丘脑室旁核在宿主防御过程中的作用进行初步探索。以上研究为进一步探索在受到外来病原入侵时,神经系统是如何对机体进行调控的提供了新的理论基础。本课题的研究内容主要分为以下几个方面:1.LPS引起的系统性炎症对小鼠内稳态及行为的影响腹腔注射LPS能导致小鼠中枢、外周细胞因子的升高和下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的激活,引起免疫激活。其中下丘脑与垂体组成的完整的神经内分泌功能系统,也会被LPS影响。为了探索LPS引起的全身系统性炎症对小鼠内稳态和行为的影响,我们对垂体前叶细胞进行了基因表达谱的分析和动物行为的测定。分析结果显示,LPS注射1 h后引起特异激素、神经肽及其相应的信号通路的改变,并产生大量的细胞因子,导致机体的稳态失衡;同时,LPS注射24 h内,小鼠出现饮食、饮水的下降、运动能力的下降、耗氧量的降低、体温的下降等一系列的疾病行为特征。2.下丘脑室旁核在LPS引起的系统性炎症下对小鼠内稳态的调控免疫荧光染色和光纤钙信号检测技术的结果显示,在LPS刺激引起的系统性炎症下,PVN对该刺激产生了明显的神经响应。为了研究在该刺激下,下丘脑室旁核是如何影响并调控机体内稳态的,我们利用化学遗传学的技术手段抑制PVN内神经元的放电活动,以抑制神经递质的释放,从而达到抑制神经元活动的效果。通过分析,我们确定了一些重要的激素、受体、神经肽及一些重要的信号通路,它们对于下丘脑室旁核在炎症下对机体进行调控是至关重要的。3.下丘脑室旁核在LPS引起的系统性炎症下对小鼠行为的影响中枢神经系统的一项重要功能是根据变化来调控动物的行为。前期结果显示LPS注射后,会引起体重的降低和体温的下降。为了理解这种神经系统调节背后的机制,我们利用病毒示踪技术对下丘脑室旁核进行了全脑输入网络的示踪。通过分析发现,下丘脑室旁核与大脑内其他核团之间存在广泛的联系,包括控制动物摄食的“饥饿中枢”—下丘脑外侧核和体温调节中枢—下丘脑视前区。接着利用化学遗传学的技术手段对其进行操控,结果显示,在应对外来病原刺激的情况下,下丘脑室旁核会通过一系列的调控手段使小鼠的体温和体重得以快速的恢复。因此得出,下丘脑室旁核在病原菌刺激反应中起着尤为重要的作用。4.激活下丘脑室旁核可以缓解疾病行为利用化学遗传学技术手段对下丘脑室旁核激活的实验结果显示,当PVN被激活后,因LPS刺激机体导致的体重降低和体温下降的恢复时间明显缩短,这表明下丘脑室旁核被激活后,可以通过释放激素、细胞因子等对疾病行为的恢复起重要作用。本研究利用病毒示踪技术对下丘脑室旁核的全脑输入网络的示踪有助于更好的理解它在参与整合感知信息、传递并调节内分泌活动、生理功能等方面的作用。通过利用化学遗传学技术对下丘脑室旁核进行功能操控,揭示出其在对抗LPS刺激中的重要调节作用,补充人们对下丘脑室旁核在对抗疾病中的功能认识。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 副猪革拉瑟氏菌研究进展 |
| 1.1.1 副猪革拉瑟氏菌病原学及流行病学 |
| 1.1.2 副猪革拉瑟氏菌致病机制研究进展 |
| 1.1.3 副猪革拉瑟氏菌LOS及其修饰机制 |
| 1.1.4 小结与展望 |
| 1.2 唾液酸化研究进展 |
| 1.2.1 唾液酸简述 |
| 1.2.2 微生物唾液酸和类唾液酸分子合成机制的追溯 |
| 1.2.3 唾液酸转移酶研究进展 |
| 1.2.4 唾液酸化的生物学意义 |
| 1.2.5 小结与展望 |
| 1.3 唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素Siglecs |
| 1.3.1 Siglecs家族简述 |
| 1.3.2 Siglec1简述 |
| 1.3.3 Siglecs参与病原体免疫反应的研究进展 |
| 1.3.4 小结与展望 |
| 1.4 呼吸道屏障简述 |
| 1.4.1 呼吸道黏液屏障 |
| 1.4.2 呼吸道上皮细胞屏障 |
| 1.4.3 呼吸道病原菌的竞争及屏障破坏 |
| 1.4.4 胞外基质与呼吸道屏障 |
| 1.4.5 小结与展望 |
| 1.5 转化生长因子研究进展简述 |
| 1.5.1 转化生长因子简述 |
| 1.5.2 TGF-β1信号转导 |
| 1.5.3 转化生长因子的主要功能 |
| 1.5.4 小结与展望 |
| 1.6 内毒素耐受研究进展 |
| 1.6.1 内毒素耐受简述 |
| 1.6.2 内毒素耐受分子机制 |
| 1.6.3 内毒素耐受对疾病的影响 |
| 1.6.4 小结与展望 |
| 第2章 目的与意义 |
| 第3章 副猪革拉瑟氏菌lsgB基因功能的初步研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和细胞 |
| 3.1.2 相关质粒 |
| 3.1.3 试剂和试剂盒 |
| 3.1.4 培养基及抗生素的配制 |
| 3.1.5 主要溶液及其配制 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.1.7 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 副猪革拉瑟氏菌株的复苏和传代培养 |
| 3.2.2 p KWHK自杀性质粒的构建 |
| 3.2.3 lsgB基因缺失菌株的筛选 |
| 3.2.4 lsgB缺失菌株的RT-PCR鉴定 |
| 3.2.5 p SWHG穿梭质粒的构建 |
| 3.2.6 lsgB互补菌株的构建 |
| 3.2.7 野生菌株、缺失菌株及互补菌株生长曲线比较 |
| 3.2.8 野生菌株、缺失菌株及互补菌株的血清杀菌实验 |
| 3.2.9 热酚-水法(hot phenol-water)提取细菌内毒素(大量制备) |
| 3.2.10 鲎试剂终点显色法测定内毒素活性 |
| 3.2.11 脂多糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染 |
| 3.2.12 野生菌株、缺失菌株及互补菌株的自身凝集能力检测 |
| 3.2.13 野生菌株、缺失菌株及互补菌株对细胞黏附及侵入能力检测 |
| 3.2.14 野生菌株、缺失菌株及互补菌株与血清补体抑制因子f H结合实验 |
| 3.2.15 流式细胞术 |
| 3.2.16 黏附抑制实验 |
| 3.2.17 毒力评估实验 |
| 3.2.18 高效液相色谱检测唾液酸含量 |
| 3.2.19 统计学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 缺失菌株缺失长度的选择 |
| 3.3.2 pKWHK和pSWHG重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.3 lsgB基因缺失菌株及互补菌株的PCR鉴定 |
| 3.3.4 lsgB基因缺失菌株RT-PCR和qPCR鉴定 |
| 3.3.5 lsgB基因缺失不影响GPS菌株的生长 |
| 3.3.6 lsgB基因缺失影响GPS菌株LOS末端的唾液酸化 |
| 3.3.7 lsgB基因缺失影响GPS菌株抵抗血清杀伤的能力 |
| 3.3.8 lsgB基因缺失影响GPS菌株对细胞的黏附和侵入 |
| 3.3.9 lsgB基因缺失影响GPS菌株的自身凝集 |
| 3.3.10 LOS唾液酸化影响补体fH因子在GPS菌株表面的沉积 |
| 3.3.11 LOS唾液酸化影响GPS菌株的毒力 |
| 第4章 lsgB-介导的LOS唾液酸化在GPS突破气管上皮屏障中的作用探究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和细胞 |
| 4.1.2 相关质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细菌侵入和Transwell实验 |
| 4.2.2 ELISA试剂盒测定TGF-β1分泌量 |
| 4.2.3 免疫组化 |
| 4.2.4 细菌与重组蛋白pull-down实验 |
| 4.2.5 Western Blot |
| 4.2.6 荧光定量PCR(qPCR) |
| 4.2.7 免疫共沉淀 |
| 4.2.8 siRNA干扰 |
| 4.2.9 细胞的转染及co-IP |
| 4.2.10 LOS-ELISA |
| 4.2.11 流式细胞术 |
| 4.2.12 双荧光素酶实验 |
| 4.2.13 利用CRISPR-Cas9技术在NPTr细胞中构建基因缺失细胞系 |
| 4.2.14 ECIS测定细胞的跨细胞电阻值 |
| 4.2.15 感染动物组织采样 |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 LOS唾液酸化诱导巨噬细胞Siglec1分子的高表达 |
| 4.3.2 LOS唾液酸化诱导肺泡巨噬细胞产生TGF-β1 |
| 4.3.3 唾液酸化的LOS通过Siglec1/DAP12/Syk轴促进TGF-β1分泌 |
| 4.3.4 猪源Siglec1胞内存在ITAM-like基序 |
| 4.3.5 p38参与Siglec1/DAP12/Syk介导的TGF-β1产生 |
| 4.3.6 TGF-β1影响气管上皮细胞屏障功能 |
| 4.3.7 LOS唾液酸化调控TGF-β1的产生来促进GPS的跨细胞迁移 |
| 4.3.8 LOS唾液酸化调控TGF-β1的产生来促进GPS侵入细胞 |
| 第5章 LOS唾液酸化在诱导免疫细胞耐受中的作用及机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和细胞 |
| 5.1.2 相关质粒 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 GPS和HI的LOS提取及去唾液酸化 |
| 5.2.2 内毒素耐受动物模型和细胞模型 |
| 5.2.3 小鼠脾脏单细胞悬液的制备 |
| 5.2.4 脾脏单细胞表面的染色 |
| 5.2.5 RAW264.7细胞免疫荧光染色及激光共聚焦 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 去唾液酸化的LOS降低巨噬细胞内毒素耐受能力 |
| 5.3.2 去唾液酸化减弱耐受细胞Siglec1和SHIP的表达及其相互作用 |
| 5.3.3 Siglec1是内毒素耐受潜在分子靶标 |
| 5.3.4 DAP12对下游信号的特异性调控 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 lsgB基因功能的初步探索 |
| 6.2 Siglecs与细菌感染的“磋商” |
| 6.3 唾液酸在机会致病菌中的“变装” |
| 6.4 机会致病菌的“无声”入侵 |
| 6.5 小结与展望 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 研究对象 |
| 3 血浆DAO、DLAC、LPS检测 |
| 4 粪便16Sr RNA检测 |
| 5 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.病例筛选流程 |
| 2.基本资料特征 |
| 3.门静脉压力变化 |
| 4.肝功能、肾功能、凝血功能变化 |
| 5.血浆内毒素水平变化 |
| 6.肠黏膜通透性改变 |
| 7.粪便菌群分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道屏障与肝脏疾病的关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 肾足细胞内补体激活促进内皮素分泌和炎症反应介导三氯乙烯致免疫性肾损伤 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 内皮素系统通过ETBR介导肾脏内皮细胞功能障碍加重三氯乙烯致免疫性肾损伤 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 三氯乙烯致多系统免疫性损伤机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 血清IL-6、IL-10、IFN-γ与创伤性ARDS差异性及相关性 |
| 资料与方法 |
| 1、一般资料 |
| 2、方法 |
| 3、疗效观察 |
| 4、统计学方法 |
| 结果 |
| 1、临床指标监测结果 |
| 2、影像学结果 |
| 3、各组患者血清中炎症因子IL-6、IL-10、IFN-的表达水平与健康对照组比较 |
| 4、各组患者血清中IL-6的表达情况 |
| 5、各组患者血清中IL-10的表达情况 |
| 6、各组患者血清中IFN-γ的表达情况 |
| 7、血清中IL-6、IL-10、IFN-γ水平与病情严重程度的相关性分析 |
| 第二部分 炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-γ与肺部感染性疾病及胸部手术患者的差异性及相关性 |
| 材料与方法 |
| 1、一般资料 |
| 2、方法 |
| 3、统计学方法 |
| 结果 |
| 1、E组:肺部感染者抗炎治疗前后血清IL-1β,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10 和TNF-α,IFN-γ表达水平 |
| 2、F组:肺部手术患者手术前后血清IL-1β,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10和TNF-α,IFN-γ表达水平 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 资料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 现代医学疾病诊断标准 |
| 3 “股肿”中医诊断标准 |
| 4 “股肿”病例纳入标准 |
| 4.1 试验组纳入标准 |
| 4.2 对照组纳入标准 |
| 5 “股肿”病例排除、剔除标准 |
| 5.1 病例排除标准 |
| 5.2 病例剔除标准 |
| 6 研究观察指标 |
| 7 统计学处理 |
| 第二章 临床研究结果 |
| 1 股肿中医证型之间与性别的差异性 |
| 2 股肿中医证型之间与血型的差异性 |
| 3 股肿中医证型之间与年龄段分布的差异性 |
| 4 股肿中医证型之间与既往病史的差异性 |
| 5 不同分组之间与炎症指标的差异性 |
| 6 不同分组之间与免疫球蛋白、补体的差异性 |
| 7 不同分组之间与尿酸、抗链球菌溶血素O等的差异性 |
| 8 不同分组之间与甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原的差异性 |
| 9 不同分组之间与D-二聚体的差异性 |
| 第三章 分析讨论 |
| 1 理论认识 |
| 1.1 DVT的现代医学理论认识 |
| 1.1.1 深静脉血栓形成 |
| 1.1.2 深静脉血栓形成病因 |
| 1.1.3 深静脉血栓形成病理生理的认识 |
| 1.2 DVT的中医理论认识 |
| 1.2.1 股肿 |
| 1.2.2 股肿辨证分型 |
| 1.3 现代医学关于相关临床指标的认识 |
| 1.3.1 D-二聚体与DVT |
| 1.3.2 尿酸与DVT |
| 1.3.3 炎症因子与DVT |
| 1.3.4 免疫类指标与DVT |
| 1.3.5 凝血因子与DVT |
| 1.3.6 肿瘤细胞因子与 DVT |
| 1.4 中医学关于相关检测指标的认识 |
| 1.4.1 D-二聚体的认识 |
| 1.4.2 尿酸与同型半胱氨酸的认识 |
| 1.4.3 炎症因子的认识 |
| 1.4.4 免疫类指标的认识 |
| 1.4.5 凝血因子的认识 |
| 1.4.6 肿瘤坏死因子的认识 |
| 1.5 中医“股肿”证型与现代医学研究的相关性 |
| 2 检验结果分析 |
| 2.1 股肿的中医不同证型与一般情况的分析 |
| 2.2 股肿的中医不同证型与临床检测指标的分析 |
| 第四章 结论 |
| 第五章 不足与展望 |
| 1 不足 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表1 |
| 缩略词表2 |
| 综述 深静脉血栓形成临床理化指标与中医证型的相关研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究背景 |
| 研究意义 |
| 研究内容及方法 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.1 烧伤 |
| 1.2 严重烧伤对认知的影响 |
| 1.2.1 烧伤治疗过程中麻醉对认知障碍的影响 |
| 1.2.2 烧伤引起的炎症对认知障碍的影响 |
| 1.3 烧伤疼痛管理 |
| 1.3.1 疼痛管理的问题 |
| 1.3.2 烧伤疼痛的治疗 |
| 1.3.3 未来的疼痛目标和考虑因素 |
| 1.4 本研究选择氟比洛芬酯的原因 |
| 第二部分 氟比洛芬酯对烧伤大鼠早期认知和炎症的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 技术路线图 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 实验试剂与仪器 |
| 2.3.2 实验动物 |
| 2.4 实验数据统计 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 HE染色判断模型 |
| 2.5.2 疼痛行为学改变 |
| 2.5.3 Morris水迷宫结果 |
| 2.5.4 各组大鼠皮肤组织病理结果 |
| 2.5.5 各组TNF-α、CINC-1、IL-6和IL-1β表达结果 |
| 2.5.6 各组大鼠海马组织病理结果 |
| 2.5.7 各组大鼠海马组织凋亡结果 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 结论 |
| 第三部分 氟比洛芬酯影响烧伤大鼠早期认知的分子机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 技术路线图 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 实验试剂与仪器 |
| 3.3.2 实验动物 |
| 3.4 实验数据统计 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 HE染色判断模型 |
| 3.5.2 各组大鼠海马组织基因mRNA表达水平 |
| 3.5.3 各组大鼠海马组织BDNF蛋白的表达 |
| 3.5.4 各组大鼠海马组织caspase3、p38和p-p38蛋白的表达 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 术后认知功能障碍的研究进展 |
| 1. POCD的临床诊断 |
| 2. POCD的发病机制与相关学说 |
| 2.1 炎症反应 |
| 2.2 中枢胆碱能系统功能降低 |
| 2.3 突触修饰假说 |
| 2.4 蛋白异常学说 |
| 3. POCD与循环标致物 |
| 3.1 炎性因子 |
| 3.2 S-100蛋白 |
| 3.3 神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE) |
| 3.4 脑源性神经营养因子(Brain-derived neuron factor, BDNF) |
| 3.5 C反应蛋白(C-reaction protein, CRP) |
| 3.6 载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)等位基因 |
| 3.7 微RNA(microRNA, miRNA) |
| 3.8 神经胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP) |
| 3.9 胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1.IGF-1) |
| POCD的影响因素 |
| 1. 疼痛与镇痛 |
| 2. 麻醉药 |
| 3. 麻醉方式 |
| 4. 年龄 |
| 5. 手术因素 |
| 6. 麻醉深度 |
| 7. 其他因素 |
| 治疗与预防 |
| 1. 右美托咪定 |
| 2. 利多卡因 |
| 3. 乌司他丁 |
| 4. 磷酸肌酸钠 |
| 5. 环氧酶抑制剂 |
| 6. 中医药方面 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩写一览表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.对象与方法 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 5.总结 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简介 |
| 致谢 |
| 综述 GLP-1受体激动剂心血管保护作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 健康藏族与汉族人群肠道菌群的差异研究 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 2型糖尿病患者肠道菌群特征及其与胰岛素抵抗间的关系 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 粪菌移植对2型糖尿病患者肠道菌群和糖代谢的影响 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 本研究存在的局限性及展望 |
| 1. 本研究的不足之处 |
| 2. 展望 |
| 综述(一) 肠道菌群与2型糖尿病的关系 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 1型糖尿病与肠道菌群的关系及其免疫相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 临床研究肾脏肾素血管紧张系统在儿童免疫性肾病中的变化研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 动物实验血管紧张素(1-7)通过抑制NF-κB通路保护脓毒症急性肾损伤的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 LPS引发的系统性炎症与神经内分泌免疫系统 |
| 1.1.1 LPS诱导细胞因子合成与系统性炎症 |
| 1.1.2 中枢神经系统对系统性炎症的感知 |
| 1.1.3 系统性炎症下神经对免疫系统的影响 |
| 1.1.4 系统性炎症下免疫对神经系统的影响 |
| 1.2 神经-内分泌-免疫网络的概述 |
| 1.2.1 神经-内分泌-免疫网络的结构和功能基础 |
| 1.2.2 神经、内分泌与免疫三大系统之间的相互调节 |
| 1.3 下丘脑室旁核在神经-内分泌-免疫系统中的功能作用 |
| 1.3.1 下丘脑室旁核在中枢神经系统的结构与功能基础 |
| 1.3.2 下丘脑室旁核与内分泌、免疫系统间的功能联系 |
| 1.4 下丘脑室旁核在维持机体内稳态中的地位 |
| 1.4.1 体温调节与机体内稳态间的关系 |
| 1.4.2 体温的调节机制 |
| 1.4.3 系统性炎症下体温调节的意义 |
| 1.4.4 下丘脑室旁核障碍与疾病 |
| 1.5 本研究中应用的现代生物学方法的简介 |
| 1.5.1 病毒的环路示踪技术 |
| 1.5.2 光遗传学技术 |
| 1.5.3 化学遗传学技术 |
| 1.5.4 光纤钙信号检测技术 |
| 1.5.5 组织透明技术的应用 |
| 1.5.6 高通量测序技术的应用 |
| 第二章 本研究的目的与意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 试验材料和设备 |
| 3.1.1 病毒、菌株、细胞和实验动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.4 细胞培养产品 |
| 3.1.5 实验设备 |
| 3.1.6 相关软件 |
| 3.1.7 培养基及缓冲液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒的构建 |
| 3.2.2 重组质粒制备与鉴定 |
| 3.2.3 病毒制备方法 |
| 3.2.4 免疫组织化学实验 |
| 3.2.5 小鼠脑部神经环路标记及鉴定 |
| 3.2.6 鼠脑切片的图像配准、计数和统计分析 |
| 3.2.7 小鼠脑部钙信号记录 |
| 3.2.8 组织透明 |
| 3.2.9 组织分离与建库 |
| 3.2.12 小鼠行为的观察与分析 |
| 第四章 LPS诱导的系统性炎症模型的建立 |
| 4.1 LPS剂量的确定 |
| 4.2 LPS诱导的系统性炎症与小鼠疾病行为 |
| 4.3 LPS诱导的系统性炎症对小鼠垂体基因表达谱的影响 |
| 第五章 中枢神经系统对LPS引起的系统性炎症的响应 |
| 5.1 免疫荧光检测中枢神经系统对LPS引起的系统性炎症的响应 |
| 5.2 在体光纤检测下丘脑室旁核在系统性炎症下的动态激活 |
| 第六章 下丘脑室旁核对垂体内分泌系统的调节 |
| 6.1 下丘脑室旁核操控系统的构建 |
| 6.1.1 嗜神经病毒的选择 |
| 6.1.2 病毒血清型的确定 |
| 6.1.3 特异性启动子的选择 |
| 6.1.4 激活、抑制系统的构建 |
| 6.2 下丘脑室旁核操控系统的验证 |
| 6.3 下丘脑室旁核在LPS诱导的系统性炎症下对垂体内分泌的调控 |
| 第七章 下丘脑室旁核在病原系统性炎症下对小鼠体重和体温的影响 |
| 7.1 下丘脑室旁核在病原系统性炎症条件下对小鼠体重的调节 |
| 7.2 下丘脑室旁核在系统性炎症下对小鼠体温的调节 |
| 第八章 感知调控内稳态的环路基础 |
| 8.1 下丘脑室旁核全脑输入网络 |
| 8.2 下丘脑室旁核与垂体的结构联系 |
| 第九章 激活下丘脑室旁核对疾病行为的缓解 |
| 9.1 激活下丘脑室旁核对小鼠垂体内分泌系统的影响 |
| 9.2 激活下丘脑室旁核对小鼠行为的改变 |
| 9.3 激活下丘脑室旁核对疾病行为的缓解 |
| 第十章 讨论 |
| 10.1 系统性炎症对垂体内分泌系统的影响 |
| 10.2 中枢神经系统在系统性炎症下的响应 |
| 10.3 下丘脑室旁核在系统性炎症下对垂体内分泌系统的调控 |
| 10.4 下丘脑室旁核在系统性炎症下对小鼠行为的调控 |
| 10.5 对下丘脑室旁核的全脑输入网络解析 |
| 10.6 激活下丘脑室旁核对疾病行为的缓解作用 |
| 10.7 课题展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
