陈霞[1]（2019）在《木薯有性四倍体杂种优势及其机理研究》文中指出木薯（Manihot esculenta Crantz）起源于南美洲,现普遍种植于热带和亚热带地区,木薯块茎根富含淀粉,在已知淀粉作物中淀粉含量最高,加上其对生长环境的高适应性,木薯已成为重要的经济和能源等多用途作物。随着木薯淀粉及其深加工业产品的需求量不断增加,木薯的产量无法适应市场的需求,因此选育优良的木薯品种显得尤为重要。利用多倍体育种进行木薯遗传改良,选育符合市场需求的新种质具有很大的潜力,特别是通过有性多倍化,促进不同的优良基因组间遗传物质重组,产生杂种优势,可加速对目标性状的筛选及对优良品种的选育。本研究以前期工作中得到的木薯有性四倍体（ST）及其母本华南5号、父本华南10号为主要供试材料,在确定木薯有性四倍体倍性纯合和稳定的基础上,对有性四倍体及其双亲的基本农艺性状、生理生化指标、抗逆性、块根亚显微结构和块根酒精发酵转化率等展开系统的比较分析,阐明了木薯有性四倍体产生的杂种优势,并结合转录组学等手段揭示了其中较显着杂种优势块根性状早熟和抗采后生理衰变的变异机理,为筛选木薯优良性状提供理论依据和研究方向。主要研究结果如下:1、采用流式细胞术和叶片染色体计数法测定了木薯有性四倍体的细胞DNA含量及染色体数,明确了其为纯合四倍体,且倍性具有稳定性。对田间种植的木薯有性四倍体及其双亲SC5/SC10生长发育不同时期的基本农艺性状进行了比较分析,连续测定三代无性繁殖系F1/F2/F3。结果显示:木薯有性多倍化后,农艺性状产生了一定的杂种优势。其株型产生巨大性效应,其株高、茎粗及地上部分鲜重在发育的各个时期都显着高于双亲,且无分枝现象。叶片相关指标也呈现巨大性特征,其叶型指数、叶面积、叶柄长在发育的各个时期都显着高于双亲;叶柄颜色变为紫红色,但叶片数量显着低于双亲。块根相关指标也发生了显着变化,其块根直径在发育的各个时期显着高于父本,与母本无显着性差异;块根长度与双亲无显着差异;块根鲜重在膨大期显着高于双亲;块根干物率在膨大期显着高于双亲,于成熟期略低于双亲;块根淀粉含量积累时期发生变化,表现为提早于双亲,缩短了块根的成熟期,于膨大期淀粉含量显着高于双亲,且直链/支链比与双亲差异较大,即淀粉成分发生改变。2、对木薯有性四倍体及其双亲成熟期植株进行叶片光合特性和叶绿素含量进行测定。结果显示:木薯有性四倍体叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度以及水分利用率均显着高于双亲,其中净光合速率、水分利用率分别比母本SC5高39.48%、5.74%,比父本SC10高63.72%、20.11%;叶片总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量也均显着高于两亲本,与光合特性参数相吻合。采用高效液相法对木薯有性四倍体及其双亲不同发育时期功能叶、茎秆韧皮部汁液、块根可溶性糖测定比较,分析发现ST在生长发育的不同时期其叶片中的蔗糖、葡萄糖、果糖的含量变化趋势与两亲本相似,其中蔗糖含量在植后130 d后均显着高于双亲;ST在生长发育的前期其茎秆中的蔗糖运输较3、多,含量显着高于两亲本,而发育后期块根对蔗糖利用能力降低抑制了蔗糖的运输,茎秆中蔗糖含量减少;ST在生长发育的不同时期其块根中蔗糖、葡萄糖、果糖的含量变化趋势与两亲本不一致,表现为发育前期蔗糖含量利用率快,块根中蔗糖含量显着低于双亲;发育后期蔗糖利用能力降低,块根中蔗糖逐渐积累,并高于双亲。表明木薯有性四倍体对蔗糖的分解利用模式发生了改变,利用蔗糖进行淀粉积累的时期主要为块根膨大前期。4、分别对木薯有性四倍体及其二倍体亲本进行耐旱、耐阴、耐盐和块根抗采后生理衰变等抗逆性指标评价。结果表明:在干旱胁迫下ST的生长发育较二倍体亲本被抑制程度较低,并可响应落叶机制来减少水分的利用与蒸发;避光胁迫下ST相对于二倍体亲本对避光的耐受力具有明显的优势,其在遮光胁迫下可继续生长发育较长时间,叶片变形但可保持生命力,而二倍体亲本则植株叶片黄化临近死亡;盐胁迫下,ST组织培养幼苗叶片生长发育比二倍体亲本缓慢,但根系更为粗壮,ST由于苗茎更粗壮,相对于二倍体具有一定的耐盐抗逆性,但其本身耐盐性也较低;ST块根相对于双亲具有很强的耐采后生理腐烂能力（PPD）,其薯块可在室温下储藏5 w以上保持薯肉新鲜,双亲则在2 w内完全腐烂变质。5、采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察木薯有性四倍体及其双亲块根淀粉粒的内部结构及表面大小形态。观察发现ST淀粉粒中“斑马条纹”的密度与双亲不同,即ST淀粉粒的内部结构发生了变化,ST淀粉粒大小介于两亲本之间,淀粉粒外部形态与双亲无明显差异。另外ST膨大期块根淀粉粒填充程度显着高于双亲而成熟期淀粉填充程度与双亲无显着差异,且与膨大后期基本一致,表明ST淀粉颗粒填充时期提前,与淀粉含量积累趋势一致。6、采用气相色谱法分别测定木薯有性四倍体及其双亲块根发酵全过程的酒精含量。结果显示ST块根的酒精转化率趋势与双亲基本一致,在发酵开始的前32 h,酒精含量增加较快,之后增长变缓,36 h后酒精不再增加。发酵停止后,其酒精含量略高于双亲,但差异不显着。此外,发酵8-12h时期内ST的酒精转化速率具有明显的加速阶段。7、对木薯有性多倍体及其双亲膨大期块根进行转录组学比较分析,结果发现ST有性多倍体化后基因表达发生了变化。与母本SC5相比,有2934个差异表达基因,其中1385个基因上调,1549个基因下调;与父本SC10相比,有3171个差异表达基因,其中1592个基因上调,1579个基因下调。这些差异表达基因主要涉及参与生物调节,代谢过程,定位,应激反应和发育过程等。Pathway富集分析显示,ST与双亲相比在“类黄酮生物合成物”和“糖酵解/糖异生”代谢途径显着富集。“类黄酮生物合成物”代谢途径可能与ST抗逆性增强和块根表皮颜色变化相关,“糖酵解/糖异生”代谢途径可能与ST块根淀粉积累和干物率发生变化有关,需要进一步研究验证。7、结合转录组学手段对ST块根早熟杂种优势机理进行研究,结果表明ST与父母本相比,差异表达基因主要集中在块根中蔗糖的分解利用阶段,包括4个基因显着上调表达,分别为转化酶基因:MeNINV8/MeVINV3、蔗糖合成酶基因:MeSuSy2、已糖激酶:MeHXK 2,其中已糖激酶基因MeHXK2差异表达达到极显着水平;1个基因下调表达（转化酶基因:MeVINV2）。而块根中淀粉的合成阶段关键酶基因表达无显着差异。表明ST膨大期块根淀粉含量高于亲本主要是通过对蔗糖的代谢阶段进行调控。进一步对ST及其亲本生长发育不同时期淀粉积累关键酶活性进行测定,证明了 ST块根淀粉提早填充和块根提前膨大成熟主要由块根中转化酶和己糖激酶进行调控。8、分别从生理生化、细胞、分子基因水平上研究了 ST块根抗采后生理衰变（PPD）杂种优势机理。结果显示:ST块根在储存过程中其品质指标干物率、β-胡萝卜素和淀粉含量都比双亲更稳定。在采后生理衰变胁迫下,ST及其双亲都会通过调节与抗逆性相关的代谢酶活系统来清除活性氧,延迟腐烂变质,但ST相对于双亲的酶活系统响应更为活跃,且储藏60 h和2w是ST清除活性氧的酶活调控代谢的关键时期。此外,ST块根抗PPD的最主要响应机制为在染色体加倍基因重组后其块根恢复了类似于其他薯类伤修复的功能,来响应抗采后生理衰变,通过相关酶代谢调控合成木质素来加固细胞壁的结构以此抵御微生物的侵染,从而达到耐储藏,Wiesner染色实验也验证了伤修复产物木质素的存在。进一步对与木质素合成相关的关键酶基因家族的表达进行统计研究,共获得木薯木质素合成途径关键酶10个基因家族（PAL1-6,C4H,4CL,C3H,CCoACMT 1-11,CCR 1-2,F5H 1-2,COMT1-4,CAD1-3,POD1-7）,ST 块根储藏过程中 PAL2/5/6、4CL、C3H、CCoAOMT 1/6、CCR 2、CAD 2、POD3基因与双亲相比显着上调,表明这些基因是响应木质素合成的关键基因,而COMT和F5H基因家族主要呈现下调趋势,表明ST倾向于合成G型木质素单体形成结构较紧密的木质素类型,来抵御细胞壁受微生物的侵染。
于心怡[2]（2019）在《转Bar基因木薯的获得及抗除草剂的分析》文中认为木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的热带经济作物,也是有潜力的能源物质。近些年木薯种植面积不断减少,其中虫害、草害仍然影响木薯的产量,其中草害是影响木薯优质高产的主要生物因素之一。因此,培育抗除草剂的木薯新品种是木薯产业的迫切需求。本研究将通过农杆菌介导法,以木薯愈伤组织为材料,将Bar基因转入华南8号木薯（SC8）中,并通过DNA、RNA、蛋白水平上的鉴定、抗除草剂的功能鉴定对转基因植株进行了研究,筛选出抗除草剂的转基因木薯株系,为木薯草害防控奠定基础。取得主要实验结果如下:（1）从田间消毒获得木薯SC8的组培苗,大批量扩繁获得足够的SC8腋芽来诱导愈伤组织。结果表明,在含有 0.25 mg/L,0.5 mg/L,1 mg/L,1.5 mg/L,2mg/L的2,4-D的MS培养基和含有12 mg/L的毒莠定的CIM培养基中,含有0.25 mg/L 2,4-D的MS培养基诱导愈伤组织的效率最好。但就玻璃化和褐化两个因素来说,CIM培养基比其他含有2,4-D的MS培养基的比率低。（2）通过农杆菌介导法转Bar基因到SC8的愈伤组织中,结果表明,当农杆菌侵染的OD值为0.8,转化后再生的MS培养基中含有0.75 mg/L的ZT时,出芽率与转化率较好,分别为60%和30%。（3）提取转基因植株的DNA,进行PCR检测,结果表明,在87株转基因植株中有12株阳性植株。（4）提取转基因植株的RNA,进行RT-PCR检测,结果表明,在12株阳性植株中有4株植株在转录水平上表达。（5）提取12株阳性转基因植株的蛋白,用含有GFP标签的抗体做Western Blotting检测GFP蛋白的表达,结果表明,在12株阳性转基因SC8植株中,有3株转基因植株中外源基因有效表达。（6）用不同浓度的草铵膦（Basta）进行筛选,对SC8的未转化的苗进行浓度筛选。用稀释 8000 倍（12.5 mg/L）,稀释 4000 倍（25 mg/L）,稀释 3000 倍（33.33 mg/L）,稀释 2000 倍（50 mg/L）,稀释 1500 倍（66.67 mg/L）,稀释 1000 倍（100 mg/L）,稀释500倍（200 mg/L）的浓度进行筛选。结果表明,木薯SC8的致死浓度为稀释500倍（200 mg/L）的Basta,半致死浓度为稀释1000倍（100 mg/L）的Basta。为得到更加精确的筛选浓度,再用稀释500倍（200 mg/L）、稀释 600 倍（166.67 mg/L）、稀释 700 倍（142.85 mg/L）、稀释 850 倍（117.65mg/L）、稀释1000倍（100 mg/L）Basta处理SC8组培苗,得出在稀释850倍的Basta时作为筛选浓度较佳。把3株有蛋白表达和1株无蛋白表达的转基因植株进行稀释850倍（117.65 mg/L）的Basta浓度筛选,结果表明3株有蛋白表达的转基因植株均对Basta有抗性。
晋琳[3]（2018）在《基于iTRAQ技术的高直链和高支链木薯块根蛋白质组学研究》文中提出木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）植物,为世界上重要的粮食作物,与马铃薯、甘薯并称世界三大薯类作物。在众多淀粉作物中,木薯块根淀粉含量高,可达20%-40%,最具有发展潜力。淀粉在人们日常生活中被广泛应用,淀粉以直链淀粉与支链淀粉两种形式存在,直链淀粉遇碘变蓝色,支链淀粉遇碘变紫红色,它们因具有不同的功能和特点,被运用于不同的加工领域。本研究通过与国际热带农业中心（CIAT）合作,引进其高直链淀粉木薯品种（5G160-13）和高支链淀粉木薯品种（AM1288-17和AM206-5）作为试验材料,以在海南推广种植的华南5号（SC5）作为对照,利用iTRAQ技术从全蛋白角度研究调控木薯块根淀粉合成的代谢通路,通过在线String软件构建差异蛋白生物调控互作网络,采用酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术和qRT-PCR技术等确定调控直链淀粉和支链淀粉合成相关的关键蛋白,为今后高直链和高支链淀粉木薯品种的选育提供一定的理论依据。主要结果如下:1、切开5G160-13、AM1288-17、AM206-5和SC5四个品种鲜薯横切面,用碘化钾喷洒整个横切面,观察横切面颜色变化。结果显示:AM206-5和AM1288-17变成紫红色,5G160-13和SC5变成蓝色。2、本研究得到二级谱图总数329085张,匹配谱图数量35065张,匹配特有肽段谱图数量24725张;鉴定到肽段数量13742,其中特有肽段序列数量10645;鉴定蛋白质数量为3971个。以SC5为对照,SC5与5G160-13差异蛋白808个,上调表达397个,下调表达411个;SC5与AM1288-17差异蛋白共有495个,上调表达299个,下调表达266个;SC5与AM206-5差异蛋白共有729个,上调表达345个,下调表达384个。3、以KEGG数据库为参考,将103条代谢途径,884个差异蛋白进行功能注释,分为10大类,分别是:碳代谢和能量代谢（含15条代谢通路;284个差异蛋白）、类脂化合物代谢（10条;42个）、氨基酸代谢（17条;142个）、辅助因子和维生素代谢（7条;40个）、核苷酸代谢（2条;38）、其他次生代谢产物（13条;50个）、遗传信息处理、折叠、分类、降解、复制与修复（11条;88个）、细胞内的运输和代谢（3条;35个）、遗传信息加工,翻译,转录（6条,130个）、环境信息处理,膜转运,信号转导,生物系统与环境适应（7条;35个）。4、本研究主要研究碳代谢与能量代谢通路中与直链淀粉和支链淀粉合成代谢相关的关键蛋白,这些蛋白质主要包括:6-磷酸葡萄糖异构酶（AT5G42740）、磷酸葡萄糖异构酶1（PGI1）、磷酸甘油酸酯激酶（PGK） （PGK1）、醇化酶 1（ENO1,ENOC）、苹果酸酶（MDH,mMDH1,PMDH1）、ATP柠檬酸盐（Pro-S）-裂解酶（ACLB-2）、磷酸丙糖异构酶（TIM,TPI）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPC1）、丙酮酸激酶（PKP-ALPHA）（AT5G08570）、L-乳酸脱氢酶（AT4G17260）、二氢硫辛酰胺脱氢酶（mtLPD1）、丙酮酸盐脱氢酶E1组分（MAB1）、柠檬酸合成酶（ATCS）、苹果酸脱氢酶（NADP,PAT5G58330）等,它们对淀粉积累、直链淀粉和支链淀粉的合成起到关键调控作用。5、利用qRT-PCR方法验证iTRAQ数据分析结果。表明:mMDH1、PMDH1、MDH（苹果酸酶）、PGI（6-磷酸葡萄糖异构酶）、ENO1（烯醇酶）、GAPC1（磷酸甘油酸脂激酶）、TIM（磷酸丙糖异构酶）等蛋白在碳代谢与能量代谢通路中对直链淀粉与支链淀粉积累起到关键作用。6.利用在线String软件构建10大类差异蛋白的生物调控互作网络。找到连线条数较多的蛋白,其中主要是催化蛋白和结合蛋白。7、酵母双杂和双分子荧光互补验证蛋白互作关系。酵母双杂结果表明GBSSI无自激活作用,该蛋白与APL3没有互作关系。然而,双分子荧光互补实验结果表明GBSSI与APL3、SBE2.2之间有相互作用,但互作信号弱,说明它们之间的互作关系弱。
雷宁[4]（2018）在《木薯TCP转录因子家族的鉴定及MeTCP4的抗逆功能研究》文中进行了进一步梳理低温和干旱严重影响植物生长和繁殖。为适应不良环境变化,植物在生理及生化水平上发育了多种调节机制。早有研究证明,植物在适应逆境胁迫的过程中,常伴随着逆境胁迫相关基因的表达。TCP转录因子家族基因参与植物生长及环境胁迫的多重调节,目前该家族基因在木薯中少有研究。因此研究木薯TCP家族基因在低温及干旱胁迫下的系统发育及表达模式,对木薯育种有指导意义。本研究通过生物信息学和分子生物学方法对木薯TCP家族进行了系统的研究。同时克隆了 MeTCP4基因,通过对该基因在拟南芥中的超量表达研究其功能。主要研究结果如下:1.木薯全基因组共编码36个TCP家族成员基因,命名编号分别为:MeTCP2至MeTCP23。木薯TCP家族基因具有典型的TCP结构域。36个木薯TCP基因编码蛋白质所含氨基酸的个数范围是73到562;相关分子质量范围是8.3到58.1KDa;等电点范围是5.53到10.08。系统进化树分析结果显示木薯TCP家族基因能够被分为8个不同亚族（A—H）,木薯TCP家族基因与拟南芥TCP家族基因亲缘关系最为接近。2.木薯TCP家族基因结构及保守结构域分析显示:同一亚族中的木薯TCP基因,其外显子的长度及内含子的个数呈现出相似的外显子-内含子分布,此结论与系统进化分析结果一致。36个木薯TCP基因中有16个基因没有内含子;除了 MeTCP16基因含有4个内含子外,其它的基因含有1至3个内含子。木薯TCP家族成员基因编码的蛋白质共有20个保守结构域,命名为:motif1到motif20。同一亚族木薯TCP基因具有相似的结构域构成,不同亚族之间高度分离。3.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析结果显示:木薯MeTCP家族成员在不同组织中表达量不同,大部分基因在茎、叶、牙尖中的表达量均高于根中的表达量。木薯TCP家族成员基因在不同组织中的表达量差异很大,而且单个基因在不同组织中的表达量也有差异。木薯TCP家族差异性表达基因中,有一些基因在特定组织中的表达量很高。例如:MeTCP2a、MeTCP3a、MeTCP5b、MeTCP8a、MeTCP13a 和MeTCP20d在叶中特异性高表达,表明这些基因在叶器官中发挥重要作用。4.实时荧光定量PCR检测ABA、GA3、IAA、JA、ZT和6-BA处理下36个木薯TCP基因的表达水平。结果发现:6种激素均能够引起木薯TCP家族基因出现差异性表达水平。同时发现木薯TCP家族中有22个TCP基因对ABA特别敏感,说明这些基因或许介导ABA信号途径参与调控植物非生物胁迫过程。5.低温和干旱胁迫下,RNA-seq分析木薯TCP家族基因表达模式显示:低温和干旱胁迫处理下,分别有18个和24个木薯TCP基因的表达量显着改变,且倍数变化大于2倍,推测其可能参与木薯适应低温和干旱胁迫过程。木薯MeTCPs家族基因启动子区顺式作用调控原件分析发现:低温和干旱胁迫下,12个显着上调或下调表达的木薯TCP基因其启动子区存在共有的顺式作用调控原件,推测这些共有的顺式作用原件可能参与胁迫响应过程。6.MeTCP4基因开放性阅读框（ORF）长1269bp,编码422个氨基酸,预测编码蛋白质相对分子质量为45.75KD,理论等电点为6.17。从木薯基因组中成功克隆得到MeTCP4基因全长cDNA。荧光定量RT-PCR结果显示:MeTCP4基因在各组织器官都有表达,根部表达最低、茎次之、叶子中表达最高并且MeTCP4基因受干旱及低温胁迫抑制。7.拟南芥转化获得35s::rMeTCP4过表达拟南芥植株,表型观察发现:转基因拟南芥相比野生型拟南芥来说,其莲座叶较小、较圆、常暗绿色,整体长势较紧凑,簇状型生长;叶片边缘较野生型拟南芥圆滑。低温胁迫下,转基因拟南芥中MeTCP4的过表达提高了脯氨酸和可溶性糖含量;降低了 MDA的含量。说明MeTCP4基因能够增强转基因拟南芥对低温胁迫的适应机制。qRT-PCR分析结果显示:35s::rMeTCP4过表达拟南芥植株中响应低温胁迫关键基因（CBF转录因子、RD29a、COR15a和COR47）均较野生型显着上调表达,说明MeTCP4直接影响了低温胁迫关键基因的表达,增强了 35s::rMeTCP4过表达转基因拟南芥植株的耐寒性。8.低温胁迫下,转基因型与野生型拟南芥差异表达基因GO富集分析发现:其差异基因GO富集主要集中在氧化还原酶活性、过氧化物酶活性、抗氧化剂活性和催化剂活性方面。RNA-seq结果显示:许多响应低温和ABA胁迫相关的基因出现显着差异性表达,多数在转基因拟南芥中显着上调表达;qPCR验证与RNA-seq结果保持一致。
耿梦婷[5]（2017）在《MeFtsZ1基因调节木薯淀粉体分裂研究》文中提出木薯块根富含淀粉,是热带及亚热带地区重要的粮食作物,同时木薯淀粉在工业上具有广泛的用途。淀粉粒的大小是影响淀粉特性及其工业应用的重要因素。淀粉体是植物贮藏器官合成及积累淀粉粒的场所,淀粉粒的大小与淀粉体的体积密切相关。淀粉体与叶绿体都由前质体发育而成,它们的分裂与增殖都是在质体分裂相关蛋白的精确调控下完成的,这些蛋白表达量的改变将会干扰质体的正常分裂,形成较大的质体。FtsZ 蛋白（Filamenting temperature-sensitive mutantZ）可以在质体分裂位点聚集形成FtsZ环（Z环）为质体的分裂提供动力,FtsZ是质体分裂的关键基因。本实验室前期已经从木薯基因组中克隆获得3个FtsZ基因（MeFtsZ1、MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2）,并发现它们的表达与木薯块根淀粉的积累有关。本研究将木薯3个MeFtsZ基因在拟南芥植株中表达,以探讨MeFtsZ基因在木薯质体分裂过程中的作用;同时利用块根特异启动子,在木薯块根中对MeFtsZ1基因进行过量表达和反义抑制,为最终实现木薯淀粉体及淀粉粒的基因工程遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.将3个MeFtsZs基因转入拟南芥,在拟南芥中进行了功能分析。利用真空渗入法,将MeFtsZ1-GFP、MeFtsZ2-1-GFP和MeFtsZ2-2-GFP载体转化拟南芥,筛选获得阳性拟南芥植株。表达木薯MeFtsZ基因的拟南芥,叶绿体数目减少,体积增大,MeFtsZ蛋白呈点状、块状或纤丝状分布于拟南芥叶绿体,然而转基因拟南芥的植株形态、叶绿素含量与野生型相比没有发生变化。表明MeFtsZ蛋白的存在,干扰了拟南芥叶绿体Z环的形成,质体分裂过程不能顺利完成。2.在MeFtsZs转基因拟南芥中,分析了 基因的过量表达对与质体分裂相关基因表达的影响。MeFtsZs基因在拟南芥中过量表达,可以影响拟南芥质体分裂相关基因的表达。MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2基因对拟南芥植株中质体分裂相关基因表达的影响相似:AtFtsZ1、AtFtsZ2-1、AtFtsZ2-2、AtARC5、AtARC6、AtSulA 等基因的表达量显着上升,AtARC3、AiMinE1、AtCRL、AtMCD1等基因的表达量显着下降,AtMinD1、AtPD V1、AtPD V2、AtCDP1、AtCLMP等基因的表达量差异不显着。表达MeFtsZ1基因对拟南芥植株中质体分裂相关基因表达,显着降低了AtFtsZ1和AtCRL基因表达量,其余基因表达量没有发生显着差异。3.利用根特异表达启动子,将MeFtsZ1基因在华南8号木薯（SC8）根中进行过量和反义抑制表达,探讨了 MeFtsZ1基因对木薯淀粉体的影响。构建了MeFtsZ1基因的块根过量表达载体pVKH-SpoA-MeFtsZ1和块根反义抑制表达载体pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1,通过木薯子叶转化华南8号木薯（SC8）,获得转pVKH-SpoA-MeFtsZ1载体的再生株系14个,转pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1载体的再生株系13个。通过PCR检测,结果发现4个转pVKH-SpoA-MeFtsZ1载体的再生株系（分别命名为TR-OE1、TR-OE2、TR-OE3、TR-OE4）和5个pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1载体的再生株系（分别命名为 TR-T1、TR-T2、TR-T3、TR-T4、TR-T5）为转基因阳性株系。4.转基因组培苗经过炼苗移栽,进行大田种植。利用电子扫描显微镜观察转基因木薯块根淀粉体。结果发现:与非转基因的木薯（SC8）相比,转基因株系TR-OE2和TR-T5的淀粉体和淀粉粒显着增大,并且含有单个淀粉粒的淀粉体增多。Southern-blot分析表明,载体的T-DNA单拷贝整合到TR-OE2和TR-T5株系的基因组中。qPCR分析表明:MeFtsZ1的插入影响了 在木薯块根中的表达,其中过量表达提高了 在木薯中的表达,反义表达降低了 在木薯中的表达;但是该基因的插入并没有影响其它与质体分裂相关基因的表达。5.田间种植第二代TR-OE2和TR-T5转基因木薯株系,并对它们的生长进行了测定。结果发现TR-OE2和TR-T5转基因木薯植株的株高、叶长、叶宽、叶柄长、叶片数、茎粗、块根长度、块根直径、块根数、干物质率均与非转基因的SC8木薯没有显着差异。6.田间种植第二代TR-OE2和TR-T5转基因木薯株系,并对它们的淀粉粒进行了测定。结果发现TR-OE2与SC8块根淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉含量没有差别。但抑制MeFtsZ1基因表达的TR-T5株系的淀粉含量略微降低。淀粉粒度分析结果发现,转基因株系的淀粉粒显着增大,TR-T5在20～30 μm范围及>30μm范围的淀粉粒数量显着高于SC8,分别是SC8的2倍和66倍;TR-OE2在>30 μm范围的淀粉粒数量是SC8的24倍。TR-OE2和TR-T5在20～30 μm范围及>30 μm范围的淀粉粒体积显着高于SC8。7.测定转基因植株（TR-OE2、TR-T5）与非转基因植株（SC8）的淀粉合成相关酶的活性（AGPase、GBSS、SSS、SBE）,发现它们的活性差异并不显着。表明在块根中过量表达或反义抑制MeFtsZ1基因不会影响淀粉合成关键酶的活性,转基因木薯淀粉粒大小的改变不是由淀粉合成关键酶酶活性变化引起的。8.转基因株系TR-OE2、TR-T5与非转基因SC8的块根淀粉粘度曲线具有明显差别。TR-OE2的峰值粘度（Peak Viscosity）和崩解值（Breskdown）显着降低,糊化温度（Pasting Temperrture）和峰值时间（Peak Time）显着提高,而热糊粘度（Hot Paste Viscosity）、最终粘度（Final Viscosity）和回生值（consistence）没有发生变化;TR-T5的峰值粘度、糊化粘度和最终粘度显着降低,糊化温度显着提高,而崩解值、回生值和峰值时间没有发生变化。表明木薯淀粉粒大小的改变,可以引起淀粉粘度特性的改变。9.转基因株系TR-OE2、TR-T5与非转基因SC8的块根淀粉糊化的热特性曲线具有明显差别。TR-OE2 的起始温度（Onset temperature）、峰值温度（Peak temperature）和结束温度（End temperature）均显着高于SC8;TR-T5的起始温度和结束温度显着低于SC8,峰值温度没有发生改变;TR-OE2、TR-T5和SC8的热焓（Endothermic enthalpy）差异不显着。以上结果表明木薯淀粉粒大小的改变,可以引起淀粉糊化过程中的热力学特性的改变。
王雨晴[6]（2016）在《木薯膜联蛋白家族基因的克隆及功能分析》文中指出木薯（Manihot esculenta Crantz）是热带亚热带地区重要的块根淀粉作物,也是中国热区重要的经济作物。木薯喜温热、不耐霜,低温是木薯生长发育及地理种植受限的重要因素,利用转基因技术有针对性的改良木薯耐寒性、提高木薯抗寒能力具有重大意义。膜联蛋白（Annexins,Ann）是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,广泛存在于动植物的各种组织细胞中。植物膜联蛋白在植物生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用。本研究采用RT-PCR技术,从木薯中分离了 10个木薯膜联蛋白基因MeAnnl-10,通过对这些基因及其启动子生物信息学分析以及基因表达分析,初步探讨了木薯MeAnns基因在非生物胁迫中的功能,同时发现在4℃低温胁迫下MeAnnl0的相对表达量可以快速提高,进一步对MeAnnl0基因的亚细胞定位及拟南芥中的表达进行了研究,初步分析MeAnn10基因的功能以及对低温的响应。主要研究结果如下:1、采用RT-PCR技术,从木薯（SC8）中分离克隆了 10个木薯膜联蛋白基因MeAnn1-10。登录号分别为:MeAnn1（KM975562）、MeAnn2（KM975563）、MeAnn3（KM975564）、MeAnn4（KM975569）、MeAnn5（KM975565）、MeAnn6（KM975566）、MeAnn7（KM975567）、MeAnn8（KM975567）、MeAnn9（KP171695）、Me Ann 10（KP171696）。2、进化分析表明,木薯MeAnns蛋白与拟南芥膜联蛋白、蓖麻膜联蛋白及杨树膜联蛋白亲缘关系较近。3、染色体定位分析显示,10个MeAnns基因分布在木薯6条染色体上;结构分析显示,10个MeAnns基因具有4-6个外显子,但长度彼此不同。4、保守结构域分析显示,MeAnns基因编码的蛋白具有4个典型的annexin重复结构域（Domain Ⅰ-Ⅳ）（MeAnn5、MeAnn6 无 Domain Ⅰ）;在 Domain Ⅰ 和 DomainⅣ中含有典型的Ⅱ型Ca2+结合位点（K/GXGT-38-D/E）;此外Domain Ⅰ中还含有一个磷脂和血红素结合位点,Domain Ⅲ中的F-actin结合基序（IRI）,Domain Ⅳ中含GTP结合位点（DXXG）。5、蛋白结构分析显示,MeAnns蛋白与AtAnn1蛋白的3D结构类似,均含由5个 α-helix（A-B）组成的膜联蛋白 Domain,其中 A、B α-helix loop 区与 D、E α-helix loop区相互靠近组成一个保守的Ca2+结合位点;此外,每一个MeAnn蛋白还含有其他与Ca2+结合有关的“XGD”motif。综上所述,我们分离克隆的10个木薯MeAnns属于植物膜联蛋白家族的成员。6、启动子分析显示,MeAnns启动子区域具有多种胁迫响应元件,如:LTR、HSE、MBS、TC-rich repeats、ABRE、ERE、TCA-element、TGA-element 及 GARE-motif等,推测木薯MeAnns可能参与非生物胁迫应答、激素信号应答及光合作用的调控。7、基因表达分析显示:1)MeAnns基因的表达具有组织特异性,其中MeAnn4、MeAnn9分别在根和叶中优势表达;2)MeAnns基因表达受外源Ca2+浓度调节,MeAnn10基因的表达受Ca2+浓度诱导明显上调,其峰值为起始值的157倍,MeAnn5对Ca2+诱导十分敏感;3)木薯MeAnns基因能够通过不同方式响应盐、干旱、低温、高温及氧化胁迫,300 mmol/LNaCl处理后MeAnn10基因表达显着提高（16倍）;MeAnn7受干旱及高温诱导,同时对氧化胁迫很敏感;MeAnn6、MeAnn7和MeAnn10能积极响应低温胁迫,低温胁迫后其峰值分别为起始值的23.8、101.2、24.4倍;4)MeAnns基因表达受外源植物激素调控,其中MeAnn1、MeAnn4、MeAnn5及MeAnn10基因在外源ABA、GA、IAA、SA及JA处理下,相对表达值均上调。8、木薯MeAnn10能快速响应低温胁迫,在4℃低温胁迫3 h时,显着提高11.7倍,在12h达到峰值并一直保持较高水平的表达。推测其在低温应答中起重要作用,因而对MeAnn10进行深入研究。构建融合表达载体p1300-MeAnn10:GFP并转化木薯,获得稳定表达的MeAnn1O:GFP蛋白的愈伤组织,细胞定位结果显示MeAnn10:GFP基因主要定位于细胞质和细胞核中。9、将MeAnn10构建植物过表达载体pVKH-35S-MeAnn10并转化拟南芥,获得过量表达转基因植株。表型分析显示:低温处理后Col-0型拟南芥叶片受损、白化死亡,而转基因植株却长出新叶,说明转MeAnn10基因的拟南芥耐寒能力更强。在正常生长条件下,MeAnn10转基因和Col-0型拟南芥中的叶绿素、电导率、SOD、MDA、可溶性糖及脯氨酸的含量差异不显着,而低温胁迫后转基因拟南芥的叶绿素、SOD、可溶性糖及脯氨酸含量均显着高于野生型;相对电导率及MDA含量明显低于Col-0型拟南芥;说明MeAnn10转基因拟南芥低温抗寒性比Col-0型。qRT-PCR分析发现,低温胁迫3 d后,拟南芥中MeAnn10基因显着上调。上述结果进一步验证MeAnn10基因能响应低温胁迫。
彭丽[7]（2014）在《木薯四倍体诱导关键技术研究》文中研究指明木薯（Manihot esculenta Crantz）是热带亚热带重要的粮食作物和能源作物,具有广泛的应用价值。本试验选用华南205、华南5号和华南8号为材料,在本实验室已建立的木薯组培快繁体系上,进一步对体细胞胚、脆性愈伤诱导条件进行试验,在此基础上建立木薯胚性悬浮细胞体系;在大田和离体条件下用秋水仙素对木薯进行四倍体诱导,期望获得多倍体木薯植株;对木薯原生质体分离、培养和细胞电融合进行研究,为后续木薯细胞融合育种提供参考。主要结果如下:1、适合华南205嫩叶和腋芽体细胞胚诱导培养基分别为CBM+68 mg/L2,4-D和CBM+12 mg/L picloram,诱导率分别为28.89%和73.33%;用适合华南205嫩叶和腋芽体细胞胚诱导培养基去诱导华南8号和华南5号的嫩叶和腋芽,华南8号嫩叶和腋芽体细胞胚的诱导率分别为70.00%和74.00%,华南5号的分别为32.00%和42.00%。适合木薯脆性胚性愈伤诱导培养基为GD+10 mg/L pi-cloram。2、以木薯脆性胚性愈伤组织为材料,进行木薯细胞悬浮培养体系的建立及优化,结果表明,木薯的胚性细胞悬浮培养系的初始接种量和液体培养基装液量以0.7 g/30 ml为宜;适合木薯胚性细胞悬浮培养的培养基为SH+10 mg/L pi-cloram+40 g/L蔗糖,pH5.8;继代周期为6 d。3、用秋水仙素处理木薯大田苗腋芽和离体组培苗,通过形态观察初步筛选变异茎段,采用流式细胞仪和根尖压片技术鉴定倍性,筛选多倍体,经多次继代繁殖,本试验获得稳定的四倍体木薯植株。试验获得的四倍体植株同二倍体比较,四倍体叶片宽度和叶形指数与二倍体间差异均达极显着水平;四倍体的保卫细胞更长更宽,气孔比二倍体气孔更大;四倍体植株叶片气孔密度比二倍体气孔密度更小。4、对木薯叶片和胚性悬浮细胞进行原生质体分离及培养,研究酶种类及浓度、酶解时间、酶解温度对叶肉原生质体和胚性悬浮细胞分离效果的影响,结果表明,适合木薯叶肉原生质体分离的最佳酶组合为:0.75%纤维素酶R-10、0.75%离析酶R-10、0.05%果胶酶Y-23;适合木薯胚性悬浮细胞原生质体分离的最佳酶组合为:1.0%纤维素酶R-10、0.2%离析酶R-10、0.05%果胶酶Y-23。最佳酶解时间为14 h,酶解温度为28℃。用TM2G培养基对木薯原生质体进行液体浅层培养,原生质体初始培养时,TM2G培养基中葡萄糖浓度宜为55 g/L60g/L,培养密度为5×105个/ml。5、用Eppendorf Multiporator电融合仪对木薯原生质体进行电融合时,适合的电融合参数为:交变电场强度（AC）100 v/cm,交变电场作用时间50 s,直流脉冲强度（DC）1500 v/cm,直流脉冲次数2次,直流脉冲作用时间45μs。
岑湘涛[8]（2014）在《两个木薯品种组织培养再生体系建立的研究》文中进行了进一步梳理本研究以木薯主栽品种华南124和华南205为试验材料,进行了以下方面的研究：以华南205带腋芽茎段为外植体建立了华南205木薯组培快繁体系,探讨了影响木薯组培快繁的因素；以木薯品种华南124和华南205无菌芽叶片、茎段、叶柄为试材,探究影响木薯植株再生的因素,旨在为木薯的离体快速繁殖、及进一步利用基因工程技术对木薯进行遗传改良提供理论和技术依据。主要研究结果如下：1.木薯顶芽以下第3-6节腋芽适合作为外植体,该部位较容易灭菌,外植体成活率相对较高；对外植体采用0.1%多菌灵溶液浸泡1h预处理能降低污染率；7-8月取样外植体适宜的灭菌方法为75%酒精20+0.1%HgCl210min；9-10取样外植体适宜的灭菌方法为75%酒精20s+0.1%HgCl212min；水培芽最适宜的灭菌方法是0.1%HgCl2溶液处理5min。2.木薯腋芽萌发较适合的初代培养基为MS+6-BA0.5mg/L；较适合的继代增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L,以丛芽形式增殖,增殖系数达4.5。较适宜的生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L,生根率为100%,平均根数为5.1。3.在以两个品种的叶片、叶柄和幼嫩茎段诱导不定芽的试验中,华南124能从叶片、叶柄和幼嫩茎段诱导产生愈伤组织,并分化出不定芽,产生再生植株,叶片还能直接分化不定芽；华南205只有叶片可以通过诱导愈伤组织分化不定芽,叶柄和茎段诱导的愈伤组织未分化不定芽。
农艳丰[9]（2014）在《农杆菌介导木薯“新选048”遗传转化体系的初步建立》文中研究说明木薯是重要的旱地经济作物及能源植物,广西是我国木薯的主产区,木薯“新选048"品种是广西主栽品种之一,具有抗旱、高产的特点,具有很好的经济价值。通过农杆菌介导,在优良木薯品种中转入抗逆性基因,获得既高产优质又具抗性的木薯新品种,是木薯育种的有效途径。本研究通过农杆菌介导,在木薯“新选048"中转入抗逆性基因,获得如下研究结果：1.以腋芽为外植体的再生体系建立灭菌：春秋季节取外植体,以0.1％HgCl2处理12min灭菌效果最好,污染率控制在30%以内,而成活率达到56.7%。初代诱导培养：添加KT的培养基外植体萌芽率比添加6-BA和TDZ的要高,最适培养基为MS+KT0.5mg/L,外植体腋芽萌发率可达85.0%,增殖培养：细胞分裂素与NAA配比的效果比单使用细胞分裂素或者与赤霉素配比的都好,以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基为最佳的增殖培养基,增殖率高,平均芽高度最高,可达5cm。生根培养：在合适的浓度下,单独添加NAA.IBA.IAA的培养基诱导的生根率都可达到100%,平均根数以MS+NAA0.6mg/L培养基的最多,达6.9条。移栽：控制空气湿度尤为重要,相对湿度太大,则容易引起组培苗植株茎段发霉腐烂,影响成活率。试验中,移栽18d后存活率不足10%,因此移栽技术还需进一步的研究。2、无菌叶片再生体系的建立选择无菌叶片诱导愈伤组织,最适诱导培养基为MS+2,4-D5.0mg/L,诱导率可达90%以上,愈伤组织淡黄色透明松软,在进一步培养中容易转化为胚性愈伤组织。愈伤组织的增殖培养基则以MS+2,4-D3.0mg/L为适宜,增殖率为90%。愈伤组织分化采用6-BA和NAA配合以及硫酸铜两种处理来诱导不定芽,结果6-BA和NAA配合处理并没有无菌芽的分化,而MS+CuSO4200mg/L处理有不定芽分化,但分化率不高。3、遗传转化体系的初步建立以无菌叶片和愈伤组织作为材料进行抗生素选择压的试验,以确定培养材料细胞全部死亡的最低抗生素浓度。试验结果为叶片抗生素选择压的培养基为MS+3.0mg/L2,4-D+2.3g/L Km,而愈伤组织抗生素选择压的培养基为MS+3.0mg/L2,4-D+2.5g/L Km.以携带目的基因的根癌农杆菌侵染无菌叶片,以5min为好,GUS瞬时表达率先升高后降低,最高为83.3%；对愈伤组织转化的效率以10min侵染时间相对较好,GUS瞬时表达率为85%。共培养时间2d对无菌叶片转化的效率最好,GUS瞬时表达率为77.8%。研究结果初步建立了农杆菌介导木薯“新选048"的遗传转化体系。
赖杭桂[10]（2014）在《木薯2n配子途径诱导多倍体的研究》文中指出木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界三大薯类作物之一,具有突出的高光效、高淀粉产量、抗旱、耐瘠薄等生物学特性,是热带、亚热带重要的粮食作物和新兴能源作物,木薯的有性多倍化通过染色体加倍的剂量效应及遗传物质的重组效应对木薯的遗传性状改良具有良好的应用前景。本研究以木薯优良栽培品种华南5号、华南7号及华南10号为主要试验材料,系统开展了木薯大、小孢子染色体加倍技术,2n雌雄配子的杂交效应及三倍体幼胚挽救技术研究,揭示了木薯2n花粉发生及其细胞学机制,木薯花粉萌发特性及木薯三倍体胚胎败育现象,为木薯的有性多倍化育种提供了技术理论基础。主要研究结果如下：（1）采用醋酸-铁矾苏木精染色法观察了木薯花序发育小孢子母细胞减数分裂过程,明确了木薯小孢子母细胞减数分裂进程与花序及雄蕊外部形态特征的相关性,应用秋水仙素溶液棉浸法对木薯花序进行诱导,获得了加倍2n花粉。结果表明：当幼嫩花序长度约为1.5～2.0cm,侧生小花梗开始出现,雄蕊直径约为1.0～1.5mm时,木薯小孢子母细胞进入减数分裂前期Ⅰ至中期Ⅰ；该时期采用0.15⒍0.45%秋水仙素+1%二甲基亚砜（DMSO）处理花序3-5d,可以获得2n雄配子,其中,以0.3%秋水仙素浓度诱导效果最佳,平均诱导率为10.42%,最高诱导率达12.56%。（2）研究小孢子母细胞染色体在减数分裂过程的异常行为,揭示了木薯2n配子发生的主要细胞学机制及其遗传效应。观察表明,木薯2n花粉形成的主要途径为小孢子母细胞染色体在减数分裂过程中纺锤体定位发生异常,在减数分裂中期Ⅱ出现平行纺锤体和八字形纺锤体,同源染色体在减数分裂末期Ⅱ发生再组合,导致胞质分裂时产生二分体和三分体。由于重组孢子含有整套亲本染色体组中的所有非姊妹染色单体,在遗传效应上属于FDR遗传型配子。（3）采用石蜡切片法对木薯胚珠分化至成熟胚囊的整个发育过程进行了详细的细胞学观察,并对其相对应的雌花外部形态特征进行相关性分析,提出了以花序及雌蕊发育形态为参照即时判别木薯大孢子发生进程的方法。采用秋水仙素溶液棉浸法对大孢子母细胞进入减数分裂前期Ⅰ的木薯花芽进行诱导,通过诱导后花序存活率及雌花变异率明确了木薯大孢子染色体加倍的适宜处理强度,获得了雌花变异率达88.9%的诱导效果。（4）应用花粉原位萌发技术观察分析了品种内自交和品种间异交授粉的花粉管萌发及花粉管生长特性,首次验证了木薯在自交和异交授粉亲和性的差异。通过联苯胺-过氧化氢法进行了柱头可授性检测,明确了木薯雌蕊柱头的最佳授粉时间为雌花开放后2-5h。提出了选择年内最后1-2次顶端分枝花序及缩短隔离套袋时间的木薯人工授粉的杂交关键技术,为提高木薯有性杂交育种及有性多倍体育种效率提供了有效技术指导。（5）木薯的1n与2n花粉授粉后在柱头上都能正常萌发,大花粉粒在柱头上萌发速度及花粉管生长速度与1n花粉基本同步,说明木薯2n花粉具备与1n花粉相同的授精竞争能力。采用1n与2n的混合花粉授粉,稔实率和座果率均显着低于自然花粉授粉后的稔实率和座果率,显示出不同倍性的混合花粉用于木薯有性杂交可能存在障碍,胚胎败育现象明显存在,杂交种子后代中未能检测出三倍体植株。而采用诱导后SC5变异雌花的杂交种子后代中获得2株有性四倍体,表明了诱导2n雌配子的有效性及木薯四倍体种胚具可育性。（6）通过木薯的胚珠及幼胚离体培养,提出了以花后30-40d木薯的幼胚培养效果较佳,成苗率可达68.4%-77.0%。首次应用胚挽救技术获得木薯三倍体植株,采用木薯诱导后的雌花与正常雄花杂交,在亲本组合SC5（♀）XSC7（♂）及SC10（♀）×SC7（♂）的杂种幼胚培养中获得了118株组培幼苗,成苗率为64.1%,其中变异植株19株,幼苗变异率为16.1%,并通过根尖细胞染色体鉴定检测出三倍体植株。因此,胚挽救技术可有效应用在木薯三倍体育种。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物多倍体育种研究进展 |
| 1.1.1 植物多倍体的起源与分类 |
| 1.1.2 植物多倍体的生物学特征 |
| 1.1.3 多倍体在植物育种中应用 |
| 1.1.4 多倍体杂种优势研究进展 |
| 1.2 木薯及其多倍体育种研究进展 |
| 1.2.1 木薯概况 |
| 1.2.2 木薯多倍体育种研究进展 |
| 1.3 木薯块根研究进展 |
| 1.3.1 木薯块根淀粉合成研究进展 |
| 1.3.2 木薯块根抗采后生理衰变(PPD)研究进展 |
| 1.3.3 木薯块根酒精产业研究进展 |
| 1.4 目的意义及研究思路 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 供试材料 |
| 2.2 杂交后代幼苗倍性鉴定 |
| 2.2.1 流式细胞仪检测 |
| 2.2.2 叶片染色体数目检测 |
| 2.3 木薯有性四倍体及其双亲生长发育不同时期基本农艺性状测定 |
| 2.3.1 株型相关指标 |
| 2.3.2 叶片相关指标 |
| 2.3.3 块根相关指标 |
| 2.3.4 淀粉含量 |
| 2.4 木薯有性四倍体及其双亲生理生化指标测定 |
| 2.4.1 功能叶光合特性测定 |
| 2.4.2 功能叶叶绿素含量测定 |
| 2.4.3 高效液相色谱法测定功能叶/茎秆韧皮部汁液/块根可溶性糖 |
| 2.5 木薯有性四倍体及其亲本抗逆性实验 |
| 2.5.1 干旱胁迫 |
| 2.5.2 遮阴胁迫 |
| 2.5.3 盐胁迫 |
| 2.5.4 采后块根生理衰变胁迫 |
| 2.6 木薯有性四倍体及其亲本块根亚显微结构观察 |
| 2.6.1 块根膨大期淀粉粒透射电镜观察 |
| 2.6.2 块根成熟期淀粉粒树脂半薄切片制片 |
| 2.6.3 块根成熟期淀粉粒扫描电镜观察 |
| 2.7 木薯有性四倍体块根酒精转化率分析 |
| 2.7.1 酿酒酵母的活化 |
| 2.7.2 种子液制备 |
| 2.7.3 酒精发酵液的制备方法 |
| 2.7.4 气相色谱法测定样品中的酒精含量 |
| 2.8 木薯有性四倍体及其亲本膨大期块根转录组学分析 |
| 2.8.1 RNA提取、cDNA文库的构建及转录组测序 |
| 2.8.2 比对参考基因组及转录本组装 |
| 2.8.3 表达量统计 |
| 2.8.4 差异表达基因(DEGs)统计及其GO功能注释/KEGG Pathway分析 |
| 2.8.5 与糖酵解/糖异生相关基因的Q-PCR验证 |
| 2.9 木薯有性四倍体块根淀粉提前填充分析 |
| 2.9.1 木薯块根淀粉积累相关的代谢通路及其关键基因筛选 |
| 2.9.2 块根中蔗糖与淀粉代谢关键酶活性测定 |
| 2.10 木薯有性四倍体采后块根抗生理衰变(PPD)分析 |
| 2.10.1 采后块根处理及取样 |
| 2.10.2 采后储藏不同时间块根重要品质指标测定 |
| 2.10.3 采后储藏不同时间块根生理生化指标测定 |
| 2.10.4 采后储藏不同时间块根与木质素合成相关的关键酶基因的表达分析 |
| 2.10.5 新鲜块根细胞壁亚显微结构透射电子显微镜观察 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 杂交后代倍性及稳定性鉴定 |
| 3.2 木薯有性四倍体及其双亲基本农艺性状比较分析 |
| 3.2.1 株高比较分析 |
| 3.2.2 茎粗比较分析 |
| 3.2.3 分枝高/分枝数比较分析 |
| 3.2.4 地上部分重比较分析 |
| 3.2.5 叶片长比较分析 |
| 3.2.6 叶片单片裂叶宽比较分析 |
| 3.2.7 叶柄长比较分析 |
| 3.2.8 叶面积比较分析 |
| 3.2.9 叶片数比较分析 |
| 3.2.10 块根长度比较分析 |
| 3.2.11 块根直径比较分析 |
| 3.2.12 块根鲜重比较分析 |
| 3.2.13 块根干物率比较分析 |
| 3.2.14 淀粉含量比较分析 |
| 3.3 木薯有性四倍体及其双亲生理生化指标比较分析 |
| 3.3.1 叶片光合特性比较分析 |
| 3.3.2 叶片叶绿素含量比较分析 |
| 3.3.3 功能叶、茎秆韧皮部汁液、块根可溶性糖比较分析 |
| 3.4 木薯有性四倍体及其亲本抗逆性观察分析 |
| 3.4.1 抗旱性比较分析 |
| 3.4.2 抗遮阴性比较分析 |
| 3.4.3 耐盐性比较分析 |
| 3.4.4 块根抗采后腐烂变质比较分析 |
| 3.5 块根亚显微结构观察 |
| 3.5.1 膨大期块根淀粉粒透射电镜观察比较 |
| 3.5.2 成熟期块根淀粉粒半薄切片观察比较 |
| 3.5.3 成熟期块根淀粉粒扫描电镜观察比较 |
| 3.6 木薯有性四倍体及其亲本块根酒精转化率比较分析 |
| 3.7 木薯有性四倍体及其亲本块根转录组学比较分析 |
| 3.7.1 转录组测序及数据统计 |
| 3.7.2 木薯有性四倍体及其亲本差异表达基因(DEGs)分析 |
| 3.7.3 品种间差异表达基因Go/ Pathway功能分析 |
| 3.7.4 Q-PCR验证 |
| 3.8 木薯有性四倍体块根淀粉提前填充机理分析 |
| 3.8.1 淀粉与蔗糖代谢通路中差异表达的关键酶基因筛选 |
| 3.8.2 蔗糖与淀粉代谢关键酶活性比较分析 |
| 3.9 木薯有性四倍体块根抗采后生理衰变(PPD)机理 |
| 3.9.1 采后生理衰变观察比较 |
| 3.9.2 采后块根品质指标干物率比较 |
| 3.9.3 采后块根品质指标β-胡萝卜素比较 |
| 3.9.4 采后块根品质指标淀粉含量比较 |
| 3.9.5 多酚含量及多酚氧化酶活性比较 |
| 3.9.6 H_2O_2含量及抗氧化酶(SOD/CAT/POD)活性比较 |
| 3.9.7 木质素含量及PAL酶活性比较 |
| 3.9.8 块根横切面细胞壁木质素成分染色观察 |
| 3.9.9 采后储藏不同时间木薯块根总RNA的提取 |
| 3.9.10 与木质素合成相关的关键酶基因家族统计 |
| 3.9.11 与木质素合成相关的关键酶基因家族的表达分析 |
| 3.9.12 新鲜块根细胞壁厚度及透射电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多倍化对木薯生长特性的影响 |
| 4.2 有性多倍化提高了木薯叶片光合特性及叶绿素含量 |
| 4.3 木薯有性多倍体根茎叶中蔗糖动态变化与淀粉含量的关系及其早熟机理探讨 |
| 4.4 木薯有性多倍体抗逆性具有明显的杂种优势 |
| 4.5 多倍体杂种优势与基因调控 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 木薯生长概况 |
| 1.2 草害及除草剂对木薯生长的影响 |
| 1.3 抗除草剂育种的研究现状 |
| 1.3.1 杂草危害及耐除草剂作物的价值 |
| 1.3.2 抗除草剂相关基因及其利用研究进展 |
| 1.3.3 转基因抗除草剂作物育种研究进展 |
| 1.4 木薯转基因研究进展 |
| 1.4.1 木薯转基因技术的发展状况 |
| 1.4.2 转基因技术在木薯分子育种中的应用 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 本实验所用菌株及载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液及培养基配方 |
| 2.2 含有Bar基因的载体pEGAD |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 木薯组培苗的快速繁殖与愈伤组织的诱导 |
| 2.3.2 植物表达载体的农杆菌转化 |
| 2.3.3 农杆菌浸染愈伤组织 |
| 2.3.4 转基因植株DNA的提取 |
| 2.3.5 PCR筛选阳性转基因植株 |
| 2.3.6 RT-PCR检测基因在转基因木薯中的表达 |
| 2.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3.8 鉴定转基因阳性植株的抗除草剂Basta功能 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 华南8号愈伤诱导及再生体系的建立 |
| 3.1.1 华南8号组培苗的获得 |
| 3.1.2 腋芽诱导的愈伤组织再生体系的建立 |
| 3.1.3 体胚诱导的脆性胚性愈伤组织再生体系建立 |
| 3.1.4 叶片诱导的愈伤组织再生体系建立 |
| 3.1.5 三种再生体系时间的对比 |
| 3.2 SC8腋芽诱导的愈伤组织遗传转化体系的建立 |
| 3.2.1 农杆菌侵染浓度对木薯遗传转化效果的影响 |
| 3.2.2 玉米素浓度对不定芽诱导的影响 |
| 3.2.3 华南SC8愈伤组织转化体系的形成 |
| 3.3 转化再生植株的鉴定 |
| 3.3.1 DNA水平上检测阳性植株 |
| 3.3.2 RNA水平上检测阳性植株 |
| 3.3.3 蛋白质水平上鉴定阳性植株 |
| 3.3.4 鉴定阳性植株对除草剂的抗性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 木薯再生体系建立的探究 |
| 4.2 农杆菌介导基因转化体系中条件的优化 |
| 4.3 抗除草剂转基因植株在Basta下的情况分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 蛋白质组学研究进展 |
| 1.1.1 蛋白质组学概述 |
| 1.1.2 蛋白质组学研究的主要内容 |
| 1.1.3 蛋白质组学的主要研究方法 |
| 1.1.4 木薯蛋白质组学研究进展 |
| 1.2 木薯块根淀粉合成以及直链淀粉与支链淀粉的合成过程 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验器材 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 iTRAQ分析 |
| 2.2.2 差异蛋白的pathway富集分析与生物信息学分析 |
| 2.2.3 木薯块根RNA的提取 |
| 2.2.4 RNA样品质量检测 |
| 2.2.5 逆转录合成第一链cDNA |
| 2.2.6 基因APL3、GBSSI、SBE2.2的克隆 |
| 2.2.7 基因APL3、GBSSI的载体构建 |
| 2.2.8 Y2HGold酵母感受态制备及转化 |
| 2.2.9 诱饵表达载体的毒性和自激活检测 |
| 2.2.10 共转化验证互作蛋白 |
| 2.2.11 双分子荧光互补APL3、GBSSI、SBE2.2载体构建 |
| 2.2.12 实时定量分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 淀粉验证 |
| 3.2 iTRAQ测序结果 |
| 3.2.1 肽段匹配误差分析 |
| 3.2.2 重复性分析 |
| 3.2.3 基本鉴定信息 |
| 3.2.4 蛋白质相对分子质量分布 |
| 3.2.5 肽段长度分布 |
| 3.2.6 肽段序列覆盖度 |
| 3.2.7 Unique肽段数量分布 |
| 3.2.8 差异蛋白统计 |
| 3.2.9 GO注释 |
| 3.2.10 COG注释 |
| 3.3 差异蛋白的Pathway分析 |
| 3.3.1 碳代谢和能量代谢相关的差异蛋白 |
| 3.3.2 类脂化合物代谢相关的差异蛋白 |
| 3.3.3 氨基酸代谢相关的差异蛋白 |
| 3.3.4 辅助因子和维生素代谢相关的差异蛋白 |
| 3.3.5 核苷酸代谢的差异蛋白 |
| 3.3.6 其他次生代谢产物合成相关的差异蛋白 |
| 3.3.7 遗传信息处理、折叠、分类、降解、复制与修复相关的差异蛋白 |
| 3.3.8 细胞内的运输和代谢过程相关的差异蛋白 |
| 3.3.9 遗传信息加工,翻译,转录相关的差异蛋白 |
| 3.3.10 环境信息处理、膜转运、信号转导、生物系统与环境适应相关的差异蛋白 |
| 3.4 差异蛋白相互作用调控网络构建 |
| 3.4.1 碳代谢和能量代谢的互作调控网络分析 |
| 3.4.2 类脂化合物代谢相关蛋白的互作网络分析 |
| 3.4.3 氨基酸代谢相关蛋白的互作分析 |
| 3.4.4 辅助因子和维生素代谢相关蛋白的互作网络分析 |
| 3.4.5 核苷酸代谢相关蛋白的互作网络分析 |
| 3.4.6 其他次生代谢产物合成相关蛋白的互作网络分析 |
| 3.4.7 遗传信息处理、折叠、分类、降解、复制与修复相关蛋白的互作网络分析 |
| 3.4.8 细胞内运输和代谢过程相关蛋白的互作网络分析 |
| 3.4.9 遗传信息加工,翻译,转录的互作分析 |
| 3.4.10 环境信息处理,膜转运,信号转导,生物系统与环境适应相关蛋白的互作网络分析 |
| 3.5 木薯块根RNA提取与检测 |
| 3.6 APL3、GBSSI、SBE2.2基因的克隆 |
| 3.7 酵母双杂交载体构建 |
| 3.7.1 诱饵和猎物载体构建 |
| 3.7.2 诱饵载体的毒性检测 |
| 3.7.3 诱饵载体的自激活检测 |
| 3.7.4 共转化验证互作蛋白 |
| 3.8 双分子荧光互补载体构建 |
| 3.9 qRT-PCR验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 差异蛋白表达与木薯块根淀粉积累相关性 |
| 4.2 转录水平与蛋白表达水平的相关性 |
| 4.3 木薯块根淀粉积累相关蛋白的相互调控作用 |
| 4.4 木薯块根差异蛋白质的相互作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
| 资助项目 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 课题提出 |
| 2 木薯简介 |
| 3 植物适应非生物胁迫环境的研究进展 |
| 3.1 植物适应非生物胁迫环境的生理生化研究进展 |
| 3.2 植物适应非生物胁迫环境在分子生物学上的研究进展 |
| 4 TCP转录因子研究进展 |
| 5 生物信息学研究现状 |
| 6 本研究目的及意义 |
| 7 实验思路及技术路线 |
| 第二章 木薯TCP家族生物信息学分析及其表达模式研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 生化试剂 |
| 1.1.3 实验仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验材料的培养及处理方法 |
| 1.2.2 木薯MeTCPs家族基因的查找及序列特征分析 |
| 1.2.3 木薯MeTCPs家族基因结构特征及系统进化关系分析 |
| 1.2.4 木薯MeTCPs家族基因保守结构域及启动子分析 |
| 1.2.5 木薯MeTCPs家族RNA-seq分析 |
| 1.2.6 木薯MeTCPs家族基因实时荧光定量PCR引物设计 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 木薯TCP家族生物信息学分析 |
| 2.1.1 木薯TCP家族基因成员及其序列特征鉴定 |
| 2.1.2 木薯TCP家族系统进化树分析 |
| 2.1.3 木薯TCP家族基因结构及保守结构域分析 |
| 2.2 木薯MeTCPs基因表达量分析 |
| 2.2.1 木薯MeTCPs基因在不同组织中的表达量分析 |
| 2.2.2 木薯MeTCPs基因不同激素处理下的表达量分析 |
| 2.2.3 木薯MeTCPs基因在低温及干旱胁迫下的表达模式分析 |
| 2.2.4 木薯MeTCPs基因在各种非生物胁迫下的表达量分析 |
| 2.2.5 木薯MeTCPs家族基因启动子区顺式作用调控原件分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 木薯TCP家族成员基于生物信息学的探讨 |
| 3.2 MeTCPs家族基因表达分析 |
| 4 结论 |
| 第三章 木薯MeTCP4转录因子的功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 生化试剂 |
| 1.1.4 实验仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验材料的培养及处理方法 |
| 1.2.2 木薯MeTCP4的克隆 |
| 1.2.3 植物表达载体的构建 |
| 1.2.4 农杆菌感受态的制备及转化方法 |
| 1.2.5 农杆菌介导的拟南芥转化及筛选 |
| 1.2.6 转基因拟南芥DNA分子水平鉴定 |
| 1.2.7 转基因拟南芥RNA分子水平鉴定 |
| 1.2.8 实时荧光定量PCR反应体系和程序 |
| 1.2.9 RNA-seq检测拟南芥的差异表达基因 |
| 1.3.0 拟南芥生理生化测定 |
| 1.3.1 拟南芥根伸长量测定 |
| 2 结论分析 |
| 2.1 木薯MeTCP4基因的克隆及表达分析 |
| 2.1.1 木薯总RNA提取与cDNA合成 |
| 2.1.2 木薯MeTCP4基因的克隆,序列及编码蛋白的特性分析 |
| 2.1.3 木薯MeTCP4基因组织分布表达及逆境胁迫下的表达模式分析 |
| 2.2 木薯MeTCP4基因功能的验证 |
| 2.2.1 植物超表达载体的构建 |
| 2.2.2 转基因拟南芥植株的鉴定 |
| 2.3 过表达MeTCP4拟南芥功能鉴定 |
| 2.3.1 转基因拟南芥植株的表型观察 |
| 2.3.2 低温胁迫下转基因拟南芥的根的伸长量分析 |
| 2.3.3 低温胁迫下拟南芥存活率分析 |
| 2.3.4 低温胁迫下转基因拟南芥的生理生化分析 |
| 2.3.5 低温胁迫下转基因拟南芥下游与低温及干旱相关基因的表达分析 |
| 2.3.6 拟南芥响应低温胁迫差异表达基因分析 |
| 2.3.7 拟南芥响应低温胁迫差异表达基因GO功能分析 |
| 2.3.8 RNA-seq检测差异表达基因 |
| 2.3.9 qPCR验证RNA-seq结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 木薯MeTCP4基因的克隆及表达模式分析 |
| 3.2 MeTCP4基因的功能探讨 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物质体分裂研究进展 |
| 1.1.1 质体的起源 |
| 1.1.2 质体分裂机制 |
| 1.1.3 质体分裂相关蛋白的研究 |
| 1.2 FtsZ基因的研究进展 |
| 1.2.1 FtsZ基因及其特征 |
| 1.2.2 FtsZ蛋白与其他蛋白之间的相互作用 |
| 1.2.3 FtsZ蛋白与淀粉品质改良的相关性 |
| 1.3 木薯及其淀粉的研究进展 |
| 1.3.1 关于木薯 |
| 1.3.2 木薯淀粉的经济价值 |
| 1.3.3 木薯淀粉品质改良的研究进展 |
| 1.4 转基因技术及其在木薯育种中的应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验试剂与材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 植物实验材料 |
| 2.1.3 载体与菌株 |
| 2.2 木薯FtsZ基因融合GFP基因植物表达载体的构建 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 PCR扩增MeFtsZ基因 |
| 2.2.3 PCR产物的纯化 |
| 2.2.4 基因及载体的双酶切 |
| 2.2.5 酶切产物的回收 |
| 2.2.6 基因与植物表达载体连接 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.8 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.9 菌液PCR筛选阳性克隆及测序分析 |
| 2.2.10 质粒的提取 |
| 2.2.11 质粒的PCR及酶切验证 |
| 2.3 表达载体转化LBA4404根癌农杆菌 |
| 2.3.1 LBA4404根癌农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 植物表达载体转化LBA4404根癌农杆菌感受态细胞 |
| 2.3.3 重组农杆菌的筛选与鉴定 |
| 2.4 拟南芥转化 |
| 2.4.1 拟南芥种子的无菌种植 |
| 2.4.2 拟南芥的转化 |
| 2.4.3 拟南芥阳性植株的筛选及移栽 |
| 2.5 转基因拟南芥的分子鉴定 |
| 2.5.1 转基因拟南芥基因组DNA的小量提取 |
| 2.5.2 转基因拟南芥的PCR鉴定 |
| 2.5.3 转基因拟南芥总RNA的提取及反转录 |
| 2.5.4 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定 |
| 2.6 转基因拟南芥表型鉴定 |
| 2.6.1 拟南芥叶片树脂半薄切片的制片及电子透射显微镜的观察 |
| 2.6.2 转基因拟南芥叶绿体观察及数目统计 |
| 2.7 转基因拟南芥中质体分裂相关基因的表达量分析 |
| 2.8 MeFtsZ1基因的块根过量表达载体构建 |
| 2.8.1 引物设计 |
| 2.8.2 PCR扩增MeFtsZ1基因 |
| 2.8.3 PCR产物的纯化 |
| 2.8.4 MeFtsZ1基因及载体的双酶切 |
| 2.8.5 酶切产物的回收 |
| 2.8.6 MeFtsZ1基因连接植物表达载体 |
| 2.8.7 菌液PCR筛选阳性克隆、测序 |
| 2.8.8 pVKH-SpoA-MeFtsZ1质粒的提取及鉴定 |
| 2.9 MeFtsZ1基因的块根反义表达载体的构建 |
| 2.9.1 引物设计 |
| 2.9.2 反义片段的PCR扩增 |
| 2.9.3 反义片段的纯化 |
| 2.9.4 反义片段及载体的双酶切 |
| 2.9.5 目的片段的回收、连接及转化 |
| 2.9.6 阳性克隆筛选、测序 |
| 2.9.7 pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1的质粒提取、PCR及酶切验证 |
| 2.10 华南8号木薯的遗传转化及分子鉴定 |
| 2.10.1 工程菌液的制备 |
| 2.10.2 木薯遗传转化相关培养基配制 |
| 2.10.3 木薯体细胞胚的诱导及子叶的形成 |
| 2.10.4 农杆菌侵染木薯子叶及植株再生 |
| 2.10.5 转基因木薯组培苗的PCR鉴定 |
| 2.10.6 转基因木薯植株的炼苗、移栽 |
| 2.10.7 转基因木薯的田间种植及样品采集 |
| 2.10.8 转基因木薯块根淀粉体观察 |
| 2.10.9 转基因木薯的质体分裂相关基因表达分析 |
| 2.10.10 转基因木薯的Soutern-blot分析 |
| 2.11 转基因木薯块根淀粉合成关键酶(AGPase,GBSS,SSS,SBE)的酶活性分析 |
| 2.11.1 块根粗酶液的制备 |
| 2.11.2 AGPase的酶活性分析 |
| 2.11.3 GBSS和SSS的酶活性分析 |
| 2.11.4 SBE的酶活性分析 |
| 2.12 转基因木薯块根淀粉特性分析 |
| 2.12.1 木薯块根淀粉的提取 |
| 2.12.2 淀粉特性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 植物表达载体MeFtsZ1-GFP、MeFtsZ2-1-GFP相MeFtsZ2-2-GFP的构建 |
| 3.2 木薯FtsZ基因在拟南芥质体分裂中的作用 |
| 3.2.1 FtsZ基因在拟南芥中的转化 |
| 3.2.2 转基因拟南芥基因组DNA提取 |
| 3.2.3 转基因拟南芥的PCR鉴定 |
| 3.2.4 转基因拟南芥总RNA的提取 |
| 3.2.5 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定 |
| 3.2.6 转基因拟南芥的表型观察 |
| 3.2.7 转基因拟南芥中叶绿体数目及叶绿素的变化 |
| 3.2.8 转基因拟南芥中质体分裂相关基因的表达量分析 |
| 3.3 MeFtsZ1基因在木薯块根的过量表达及反义抑制 |
| 3.3.1 MeFtsZ1基因的块根过量表达载体的构建 |
| 3.3.2 MeFtsZ1基因的块根反义表达载体的构建 |
| 3.3.3 木薯的遗传转化 |
| 3.3.4 转基因木薯的基因组DNA提取 |
| 3.3.5 木薯转基因植株的PCR鉴定 |
| 3.3.6 转基因木薯组培苗的炼苗及移栽 |
| 3.3.7 转基因木薯的淀粉体观察 |
| 3.3.8 MeFtsZ1在转基因木薯的表达及质体分裂相关基因的表达分析 |
| 3.3.9 转基因木薯的Soutern-blot分析 |
| 3.4 转基因木薯的田间生长测定 |
| 3.4.0 株高的测定 |
| 3.4.1 叶长的测定 |
| 3.4.2 叶宽的测定 |
| 3.4.3 叶柄长的测定 |
| 3.4.4 叶片数的统计 |
| 3.4.5 茎粗的测定 |
| 3.4.6 块根长度的测定 |
| 3.4.7 块根直径的测定 |
| 3.5 转基因木薯的淀粉合成相关酶分析 |
| 3.6 产量性状分析 |
| 3.7 转基因木薯的淀粉特性分析 |
| 3.7.1 淀粉体观察及淀粉粒度分析 |
| 3.7.2 淀粉粘度分析 |
| 3.7.3 淀粉热特性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MeFtsZ蛋白定位于叶片中的叶绿体上 |
| 4.2 转MeFtsZ基因影响拟南芥叶绿体的分裂 |
| 4.3 MeFtsZ1基因参与木薯块根淀粉体的分裂 |
| 4.4 木薯淀粉体分裂与淀粉粒大小、形态的关系 |
| 4.5 转MeFtsZ1基因对木薯生长及产量的影响 |
| 4.6 木薯淀粉粒大小对淀粉粘度特性的影响 |
| 4.7 木薯淀粉粒大小对淀粉热特性的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 木薯概述 |
| 2 植物响应低温胁迫的研究进展 |
| 2.1 低温胁迫对植物的影响 |
| 2.2 植物响应低温胁迫的分子调控 |
| 3 膜联蛋白研究进展 |
| 3.1 植物膜联蛋白研究进展 |
| 3.2 木薯低温响应的研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 5 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 菌株与载体 |
| 1.3 主要药品及试剂 |
| 1.4 培养基及添加成分 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA提取 |
| 2.2 反转录反应 |
| 2.3 第一链cDNA检测 |
| 2.4 MeAnns基因的分离 |
| 2.5 MeAnns基因生物信息学分析 |
| 2.6 MeAnns启动子生物信息学分析 |
| 2.7 MeAnns基因表达分析 |
| 2.8 MeAnn10基因亚细胞定位分析 |
| 2.9 MeAnn10基因在拟南芥中的功能分析 |
| 第三章 实验结果及分析 |
| 1 MeAnns基因分离、鉴定及生物信息学分析 |
| 1.1 木薯总RNA的提取 |
| 1.2 MeAnns基因cDNA的分离及鉴定 |
| 1.3 MeAnns蛋白系统进化分析 |
| 1.4 MeAnns基因染色体定位分析 |
| 1.5 MeAnns基因结构分析 |
| 1.6 MeAnns基因蛋白序列分析 |
| 1.7 MeAnns蛋白结构分析 |
| 2 MeAnns启动子生物信息学分析 |
| 3 MeAnns基因表达分析 |
| 3.1 cDNA检测 |
| 3.2 qRT-PCR引物的特异性检测 |
| 3.3 MeAnns基因组织特异性表达分析 |
| 3.4 不同浓度Ca~(2+)对MeAnns基因表达的影响 |
| 3.5 不同非生物胁迫下MeAnns基因的表达分析 |
| 3.5.1 盐胁迫下MeAnns基因的表达分析 |
| 3.5.2 干旱胁迫下MeAnns基因的表达分析 |
| 3.5.3 低温胁迫下MeAnns基因的表达分析 |
| 3.5.4 高温及氧化胁迫下MeAnns基因的表达分析 |
| 3.6 不同激素处理对MeAnns基因表达的影响 |
| 4 MeAnn10基因在木薯细胞中的定位 |
| 4.1 MeAnn10基因融合表达载体的构建与鉴定 |
| 4.2 MeAnn10基因在木薯细胞中的定位 |
| 5 MeAnn10基因在拟南芥中的功能分析 |
| 5.1 植物表达载体pVKH-35S-MeAnn10的构建 |
| 5.2 pVKH-35S-MeAnn10转基因拟南芥的鉴定 |
| 5.3 pVKH-35S-MeAnn10转基因拟南芥耐寒性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 硕士在读期间撰写及发表的论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 木薯概述 |
| 1.1.1 木薯生物学特性 |
| 1.1.2 木薯主要作用和发展前景 |
| 1.1.3 木薯在我国的种植和研究现状 |
| 1.2 木薯组织培养体系研究 |
| 1.2.1 器官发生途径 |
| 1.2.2 初级体细胞胚途径 |
| 1.2.3 木薯脆性愈伤组织及悬浮培养 |
| 1.3 多倍体育种 |
| 1.3.1 秋水仙素诱导多倍体 |
| 1.3.2 植物原生质体融合 |
| 1.3.3 木薯多倍体育种研究进展 |
| 1.4 研究的内容及意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第二章 木薯体细胞胚诱导和悬浮培养 |
| 2.1 材料与仪器试剂 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 木薯体细胞胚胎发生 |
| 2.2.2 脆性胚性愈伤诱导 |
| 2.2.3 木薯胚性悬浮细胞系的建立 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 木薯体细胞胚胎发生 |
| 2.3.2 脆性胚性愈伤诱导 |
| 2.3.3 悬浮细胞系的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 秋水仙素诱导同源多倍体木薯 |
| 3.1 材料与仪器试剂 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 秋水仙素诱导方法 |
| 3.2.2 倍性鉴定方法 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 秋水仙素田间诱变分析 |
| 3.3.2 离体诱变 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 影响秋水仙素诱导因素 |
| 3.4.2 多倍体筛选与鉴定 |
| 第四章 木薯原生质体融合条件优化 |
| 4.1 材料与仪器试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 木薯原生质体分离 |
| 4.2.2 原生质体纯化 |
| 4.2.3 原生质体计数 |
| 4.2.4 原生质体活性测定 |
| 4.2.5 原生质体培养 |
| 4.2.6 原生质体电融合 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 分离液酶组合对木薯原生质体分离的影响 |
| 4.3.2 酶解时间对木薯原生质体分离的影响 |
| 4.3.3 酶解温度对木薯原生质体分离的影响 |
| 4.3.4 原生质体培养 |
| 4.3.5 木薯原生质体电融合 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 原生质体分离纯化及培养 |
| 4.4.2 木薯原生质体电融合 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 目录 |
| 1 前言 |
| 1.1 木薯资源概况 |
| 1.1.1 木薯的起源、传播与分布 |
| 1.1.2 木薯生物学特性 |
| 1.1.2.1 木薯的植株形态 |
| 1.1.2.2 木薯的器官 |
| 1.1.3 木薯的分类 |
| 1.1.3.1 根据氢氰酸的含量划分 |
| 1.1.3.2 生育期长短划分 |
| 1.1.3.3 生产利用价值划分 |
| 1.1.3.4 经济利用价值与用途划分 |
| 1.1.3.5 根据形态特征划分 |
| 1.1.4 木薯的经济价值及用途 |
| 1.2 木薯组培快繁的研究进展及影响木薯组培快繁的因素 |
| 1.2.1 木薯组织培养快速繁殖研究进展 |
| 1.2.2 影响木薯组培快繁的因素 |
| 1.2.2.1 基因型 |
| 1.2.2.2 外植体选择 |
| 1.2.2.3 外植体灭菌 |
| 1.2.2.4 基本培养基的选择 |
| 1.2.2.5 生长调节物质的影响 |
| 1.2.2.6 影响木薯组织培养的其他因素 |
| 1.3 本研究的目的意义、研究内容 |
| 1.3.1 研究目的意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.2.1 木薯品种华南205组织培养快繁体系的建立 |
| 1.3.2.2 木薯离体器官再生体系的建立 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试品种 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.2.1 华南205组织培养快速繁殖体系的建立 |
| 2.1.2.2 木薯无菌芽不同器官离体再生研究 |
| 2.1.2.3 主要试剂和配制方法 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 华南205组织培养快速繁殖体系的建立 |
| 2.2.1.1 外植体表面灭菌及初代培养 |
| 2.2.1.2 木薯无菌芽的继代增殖 |
| 2.2.1.3 无菌芽生根 |
| 2.2.1.4 培养条件 |
| 2.2.2 木薯无菌芽不同器官离体再生研究 |
| 2.2.2.1 不同器官直接分化不定芽 |
| 2.2.2.2 愈伤组织的诱导 |
| 2.2.2.3 愈伤组织诱导不定芽分化 |
| 2.2.2.4 培养条件 |
| 2.2.2.5 调查指标 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 华南205组织培养快速繁殖体系的建立 |
| 3.1.1 外植体表面灭菌及初代培养 |
| 3.1.1.1 外植体表面灭菌 |
| 3.1.1.2 不同外植体部位的灭菌效果 |
| 3.1.1.3 多菌灵预处理对木薯外植体灭菌效果的影响 |
| 3.1.1.4 间歇灭菌法的外植体灭菌效果 |
| 3.1.1.5 不同HgCl_2处理时间的水培芽灭菌效果 |
| 3.1.1.6 初代培养基的筛选 |
| 3.1.2 木薯无菌芽的继代增殖 |
| 3.1.3 生根培养 |
| 3.2 木薯无菌芽不同器官离体再生研究 |
| 3.2.1 木薯无菌芽不同器官直接分化不定芽 |
| 3.2.1.1 不同激素和浓度对木薯无菌芽叶片直接诱导不定芽的影响 |
| 3.2.1.2 不同激素和浓度对木薯无菌芽叶柄和茎段直接诱导不定芽的影响 |
| 3.2.2 愈伤组织的诱导 |
| 3.2.2.1 木薯无菌芽叶片愈伤组织的形态观察 |
| 3.2.2.2 木薯无菌芽茎段和叶柄愈伤组织的形态观察 |
| 3.2.2.3 不同浓度的2,4-D对木薯叶片愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.2.4 不同2,4-D与6-BA浓度组合对叶片愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.2.5 暗培养对木薯叶片愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.2.6 不同影响因素对无菌芽茎段愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.2.7 不同影响因素对无菌芽叶柄愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2.3 愈伤组织的分化 |
| 3.2.3.1 叶片愈伤组织的分化 |
| 3.2.3.2 茎段和叶柄愈伤组织的分化 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 华南205组培快繁体系建立 |
| 4.1.1.1 外植体选择 |
| 4.1.1.2 外植体灭菌 |
| 4.1.1.3 激素对木薯继代增殖的影响 |
| 4.1.1.4 激素对木薯组培苗生根的影响 |
| 4.1.2 木薯无菌芽不同器官离体再生研究 |
| 4.1.2.1 无菌芽不同器官再生能力比较 |
| 4.1.2.2 不同激素及配比对愈伤组织诱导的影响 |
| 4.1.2.3 暗培养时间对愈伤组织诱导的影响 |
| 4.1.2.4 激素对愈伤组织分化的影响 |
| 4.1.3 两个木薯品种再生能力的比较 |
| 4.2 结论 |
| 4.2.1 外植体表面灭菌及初代培养 |
| 4.2.2 木薯无菌芽的继代增殖和生根培养 |
| 4.2.3 两个品种木薯离体器官再生体系建立 |
| 4.3 有待进一步研究的内容 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 木薯的经济价值 |
| 1.1.1 木薯是生产淀粉的主要来源 |
| 1.1.2 木薯的食用价值 |
| 1.1.3 木薯茎叶是加工禽畜饲料的来源 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 木薯的组织培养研究现状 |
| 1.2.2 木薯的育种研究 |
| 1.2.3 木薯的转基因研究现状 |
| 1.3 选题背景及目的意义 |
| 1.3.1 选题背景 |
| 1.3.2 选题目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 农杆菌菌株与质粒 |
| 2.1.3 主要仪器设备及组织培养试剂 |
| 2.1.4 培养基种类 |
| 2.1.5 GUS 染液 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 木薯组织培养 |
| 2.2.2 叶片再生体系的建立 |
| 2.2.3 遗传转化体系的建立 |
| 2.2.4 根癌农杆菌侵染液的准备和GUS组织化学检测 |
| 2.3 培养条件 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 外植体灭菌及初代培养 |
| 3.1.1 0.1% HgCl_2对外植体灭菌的影响 |
| 3.1.2 0.1% HgCl_2和75%酒精配合对外植体灭菌的影响 |
| 3.1.3 不同季节取材对外植体灭菌的影响 |
| 3.1.4 抗生素培养基对外植体灭菌的影晌 |
| 3.1.5 人工激素对外植体腋芽萌发的影响 |
| 3.2 增殖培养 |
| 3.2.1 6-BA、TDZ、KT对芽增殖的影响 |
| 3.2.2 6-BA、KT与NAA配比对芽增殖的影响 |
| 3.2.3 6-BA与GA3配比对增殖的影响 |
| 3.3 生根培养 |
| 3.3.1 不同浓度NAA、IBA、IAA对无菌芽生根的影响 |
| 3.3.2 多效唑对生根的影响 |
| 3.3.3 添加活性炭对生根的影响 |
| 3.3.4 组培苗移栽 |
| 3.4 再生体系的建立 |
| 3.4.1 愈伤组织诱导 |
| 3.4.2 愈伤组织增殖培养 |
| 3.4.3 愈伤组织分化培养 |
| 3.5 遗传转化体系的初步建立 |
| 3.5.1 叶片抗生素选择压的确定 |
| 3.5.2 愈伤组织抗生素选择压的确定 |
| 3.5.3 不同侵染时间对无菌叶片转化的影响 |
| 3.5.4 不同共培养时间对叶片转化的影响 |
| 3.5.5 不同侵染时间对愈伤组织转化的影响 |
| 4 结论 |
| 4.1 以腋芽为外植体的再生体系建立 |
| 4.2 无菌叶片再生体系的建立 |
| 4.3 遗传转化体系的建立 |
| 5 讨论 |
| 5.1 课题的创新之处 |
| 5.2 讨论 |
| 5.2.1 外植体的灭菌 |
| 5.2.2 外植体初代培养及无菌芽增殖培养 |
| 5.2.3 无菌芽生根培养 |
| 5.2.4 组培苗移栽 |
| 5.2.5 再生体系的建立 |
| 5.2.6 遗传转化体系的影响因素 |
| 6 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 前言 |
| 1.1 木薯生物学特性及选育种基本概况 |
| 1.1.1 木薯的分布及经济地位 |
| 1.1.2 木薯的生物学基本特性 |
| 1.1.3 木薯选育种基本概况 |
| 1.2 植物多倍体育种研究进展 |
| 1.2.1 无性多倍化与有性多倍化 |
| 1.2.1.1 无性多倍化 |
| 1.2.1.2 有性多倍化 |
| 1.2.2 多倍体的特征特性 |
| 1.2.3 人工获得多倍体的方法 |
| 1.2.4 多倍体的鉴定 |
| 1.3 植物2n配子育种研究进展 |
| 1.3.1 2n配子的诱导 |
| 1.3.2 2n配子发生机制 |
| 1.3.3 2n配子三倍体育种 |
| 1.3.4 胚挽救技术在三倍体育种的应用 |
| 1.3.5 分子生物学技术在2n配子育种的应用 |
| 1.4 木薯多倍体育种研究进展 |
| 1.4.1 自然途径选择多倍体 |
| 1.4.2 田间茎尖、腋芽诱导多倍体 |
| 1.4.3 离体培养法诱导多倍体 |
| 1.4.4 木薯种间杂交获得多倍体 |
| 1.4.5 四倍体与二倍体杂交获得三倍体 |
| 1.4.6 问题及展望 |
| 1.5 目的意义、研究思路及技术路线 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 木薯小孢子母细胞减数分裂进程及花序形态特征 |
| 2.2.2 2n小孢子诱导时期及2n花粉的诱导方法 |
| 2.2.3 二分体、三分体的观察及2n花粉估测 |
| 2.2.4 2n花粉粒直径的测定 |
| 2.2.5 诱导后花序发育及及雄花外部形态变异 |
| 2.2.6 大孢子发生与雌配子体发育过程观察 |
| 2.2.7 2n雌配子诱导方法 |
| 2.2.8 2n雌配子诱导效应 |
| 2.2.9 木薯花粉活力测定 |
| 2.2.10 花粉原位萌发方法 |
| 2.2.11 雌蕊柱头可授性检测 |
| 2.2.12 木薯人工杂交授粉方法 |
| 2.2.13 木薯胚珠培养方法 |
| 2.2.14 木薯幼胚培养方法 |
| 2.2.15 雌花诱导后杂交种幼胚培养 |
| 2.2.16 杂交苗倍性检测方法 |
| 2.2.17 统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 木薯2n花粉诱导及其细胞学机制 |
| 3.1.1 小孢子母细胞减数分裂过程观察 |
| 3.1.2 木薯花芽形态特征与小孢子发生进程的关系 |
| 3.1.3 秋水仙素诱导木薯2n花粉 |
| 3.1.3.1 2n花粉发生及其细胞学机制 |
| 3.1.3.2 木薯自然2n配子检测 |
| 3.1.3.3 不同处理组合2n花粉发生频率估测 |
| 3.1.3.4 不同品种处理2n花粉发生频率 |
| 3.1.3.5 木薯2n花粉粒直径测定及比率估算 |
| 3.1.3.6 诱导后花序发育状况及适宜处理强度 |
| 3.1.4 诱导后花序及雄花外部形态变异 |
| 3.2 木薯大孢子发育及2n雌配子诱导效应研究 |
| 3.2.1 胚珠分化及孢原细胞发育 |
| 3.2.2 大孢子的发生 |
| 3.2.3 雌配子体的发育 |
| 3.2.4 木薯大孢子发生及雌配子体发育进程与花序、雌蕊形态特征的对应关系 |
| 3.2.5 2n雌配子诱导时期及处理时间的确定 |
| 3.2.6 诱导后花序发育状况及适宜处理强度分析 |
| 3.2.7 诱导后雌花发育外部形态变异 |
| 3.3 木薯杂交授粉亲和性及2n配子杂交效应 |
| 3.3.1 木薯顶端分枝花序发育特性及选择 |
| 3.3.2 木薯花粉活力测定 |
| 3.3.3 木薯花粉萌发及花粉管发育特征观察 |
| 3.3.4 品种内自交花粉粒萌发及花粉管生长 |
| 3.3.5 品种间异交花粉管萌发及花粉管生长 |
| 3.3.6 自交、异交授粉后花粉管萌发及花粉管生长的差异 |
| 3.3.7 自交、异交人工授粉后结果率 |
| 3.3.8 2n与1n花粉参与受精能力的比较 |
| 3.3.9 雌蕊柱头最佳授粉状态的确定 |
| 3.3.10 2n雄配子杂交效应 |
| 3.3.11 2n雌配子杂交效应 |
| 3.4 木薯多倍体幼胚离体培养 |
| 3.4.1 木薯胚珠离体培养 |
| 3.4.2 木薯幼胚离体培养 |
| 3.4.3 诱导后的杂种幼胚培养 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 木薯2n花粉诱导及其细胞学机制 |
| 4.1.1 木薯小孢子母细胞减数分裂过程观察方法的优化 |
| 4.1.2 秋水仙碱诱导木薯2n配子适宜时期 |
| 4.1.3 木薯2n花粉发生的细胞学机制 |
| 4.1.4 不同处理时间产生二分体和三分体的比例 |
| 4.1.5 提高木薯2n花粉得率及育种利用效率 |
| 4.2 木薯大孢子发育及2n雌配子诱导效应 |
| 4.2.1 木薯大孢子发生与雌配子体发育 |
| 4.2.2 大孢子发育进程与小孢子发育的相关性 |
| 4.2.3 木薯雌花诱导的变异效果 |
| 4.3 木薯杂交授粉亲和性及2n配子杂交效应 |
| 4.3.1 木薯人工授粉的关键技术 |
| 4.3.2 木薯2n配子参与受精的能力 |
| 4.4 胚挽救技术在木薯三倍体育种中的应用 |
| 4.4.1 木薯胚珠培养技术探讨 |
| 4.4.2 木薯三倍体幼胚培养的可行性 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
