秦英惠[1]（2021）在《赤点石斑鱼神经坏死病毒的分离鉴定及其B2蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应机制研究》文中研究指明鱼类病毒性神经坏死病（Virus nervous necrosis,VNN）是由神经坏死病病毒（Nervous necrosis virus,NNV）引起的一种严重威胁世界水产养殖业的传染性疾病,可导致120多种鱼类不同程度的损伤,严重制约了水产养殖业的可持续发展。本研究从病毒的分离鉴定、单克隆抗体的制备和逃逸宿主Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）反应三个方面进行研究,以期为后续建立石斑鱼神经坏死病毒的快速检测方法、解析其致病机制和筛选抗病毒药物靶点提供了工具和理论基础。具体研究内容和结果如下:1、RGNNV的分离和鉴定:通过RT-PCR、细胞培养、组织切片和电镜观察等技术从广东某养殖场患病的杂交虎龙石斑鱼成鱼中分离鉴定出一株石斑鱼神经坏死病毒。肉眼观察患病鱼呈体色发黑、眼球突出、腹部膨大、侧翻打转等临床症状,发病水温28℃,对可能造成石斑鱼发病的病原进行PCR检测,结果只有NNV的T4引物扩增出条带,测序结果表明该产物与Genbank中已报道的NNV衣壳蛋白（Cp）序列相似性最高。组织切片表明患病鱼脑部可见明显的空斑,而且患病鱼脑组织匀浆液过滤除菌后接种的SSN-1细胞、GF-1细胞和GS细胞出现明显的细胞病变效应（CPE）。蔗糖密度梯度离心获得高纯度的病毒,电镜下该病毒粒子呈球形,是典型的NNV形态。分段扩增获得RNA1和RNA2全长,进化树分析结果显示分离得到的病毒属于NNV中的RGNNV基因型,命名为RGNNV-HL。浸泡感染和腹腔注射RGNNV-HL均能导致实验鱼大量死亡,14天累计死亡率分别为90%和83.3%。2、抗RGNNV衣壳蛋白（Cp）单克隆抗体的制备:首先扩增获得衣壳蛋白（Cp）的开放阅读框,双酶切后连接至pET-28a质粒得到融合衣壳蛋白的表达质粒（pET-28a-Cp）,转化后挑取含有pET-28a-Cp的BL21（DE3）阳性克隆进行IPTG诱导。SDS-PAGE结果表明42 kDa处有明显加粗蛋白条带。Ni+柱纯化后获得高纯度融合表达的衣壳蛋白（rCp）。以rCp为免疫原免疫Balb/c小鼠,经过细胞融合、HAT筛选、酶联免疫吸附实验和有限稀释法克隆后得到三株可以持续分泌抗RGNNV衣壳蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞。免疫印迹实验（western blot）表明三株单抗均能特异性识别RGNNV的衣壳蛋白。间接免疫荧光（IFAT）结果显示,三株单抗均可特异性识别RGNNV病毒粒子,可以用于后续RGNNV快速检测方法的建立。3、RGNNV B2蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应的机制研究:首先,笔者发现RGNNV感染能显着抑制poly（I:C）激活的IFNφ1启动子活性。分别过表达RGNNV的结构蛋白和非结构蛋白,检测它们对IFNφ1启动子活性的影响,结果表明RGNNV的A蛋白明显上调IFNφ1启动子活性,而B1蛋白和B2蛋白抑制IFNφ1启动子的活化且B2蛋白的抑制能力更强,因此选择B2蛋白进一步研究。将B2蛋白和RLRs信号通路关键分子共表达以期筛选出其靶向分子,结果表明B2蛋白显着抑制共表达分子活化IFNφ1启动子的能力。免疫印迹实验表明B2蛋白能抑制所有共转RLRs信号通路接头分子的表达,接着笔者发现B2蛋白能明显降低组成型启动子（CMV）的启动活性,笔者猜测B2蛋白可能是一个宿主转录或翻译抑制因子。为了验证这一猜想,笔者分别检测了过表达B2蛋白后CMV启动子启动的荧光素酶的mRNA表达量和稳定性,结果表明过表达B2蛋白后荧光素酶的mRNA水平明显降低但其稳定性并无显着变化,至此确定B2蛋白抑制宿主的转录。由于RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）在宿主的转录过程中发挥着不可或缺的作用,因此检测了B2蛋白对RNAP Ⅱ的影响,结果表明B2蛋白可抑制RNAP Ⅱ的表达和磷酸化,而且B2蛋白的这种功能并不受其线粒体定位的影响。至此确定RGNNV B2蛋白通过影响RNAPⅡ及其磷酸抑制细胞转录间接抑制RLRS介导的Ⅰ型干扰素反应。
徐安乐[2]（2021）在《维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫的影响及其相关机制的研究》文中指出维生素E对大部分水产动物而言,是一种必须营养素,在机体中不能自主合成,必需通过外源补充。研究表明,饲料配方中维生素E缺乏或过量均会对某些鱼造成不利的影响。研究水产动物维生素E的需求量在水产动物健康可持续养殖发展中具有重要意义。本研究以珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）为研究对象,从生理生化、组织学观察以及转录组学水平分析了维生素E在珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫方面所起的作用,具体结果如下:（1）设计了6个不同浓度的维生素E饲料（高效液相色谱法实测VE值:12.10,32.15,45.17,75.72,135.78,263.37 mg/kg）开展84天的养殖试验（后简称养殖试验）,得出:135.78 mg/kg左右的维生素E能显着提高珍珠龙胆石斑鱼（平均初重:20.48±0.20 g）增重率、存活率、促进免疫器官的生长发育,以及改善肌肉品质;可维持肝脏、肌肉以及血清中维生素E含量的动态平衡,供应机体生长需求,同时能降低血脂含量,维持机体健康;可以提高血清、头肾、脾脏和肝脏的免疫能力以及抗氧化能力,提高肠道和肝脏对营养物质的吸收,降低脂质过氧化反应。对照组和135.78 mg/kg试验组在生长性能和免疫性能上存有显着性差异。与此同时,与其他组织相比,在消化性能上,肝脏和前肠对维生素E影响的反应更为敏感,在免疫方面,头肾对维生素E影响的反应更为敏感。以增重率为评估指标做拟合曲线分析维生素E的最适添加量为130.13 mg/kg。（2）135.78 mg/kg的维生素E能维持肝细胞结构和功能稳定,促进肠道组织生长和维持其完整性,促进头肾分泌免疫相关的物质来提高机体免疫,通过调节脾脏的淋巴细胞数量,促进鱼类非特异性免疫。（3）开展哈维氏弧菌感染试验（后简称细菌感染试验）。设置对照组和最适维生素E添加量组饲料（VE实际含量分别为10.38和132.15 mg/kg）养殖珍珠龙胆石斑鱼（平均体重:80.48±3.30 g）,周期70天,随后,用半致死剂量哈维氏弧菌（8.86×106CFU/ml）注射感染石斑鱼,观察7天,比较细菌感染前后试验组与对照组在血清、肝脏、头肾和脾脏上的免疫和抗氧化方面的变化,得出维生素E能提高机体抗氧化能力和抗病能力。组织学观察进一步得出维生素E在保护肝脏、头肾和脾脏抗细菌感染中发挥了重要作用。（4）养殖试验mRNA分析结果表明,维生素E诱导肝脏、前肠和头肾分别产生了366、69和9023个差异表达基因。这些差异表达基因,在肝脏中主要可富集到与细胞凋亡,肝组织代谢和肝组织免疫相关的通路上,在前肠组织中,则主要富集到了与代谢相关的通路上,在头肾组织中,主要富集到了与免疫相关的通路上。（5）细菌感染试验的mRNA分析结果显示,鱼摄食适量的维生素E能通过提高肝脏中的代谢补偿以抵抗哈维氏弧菌的侵袭,而缺乏维生素E的鱼,在哈维氏弧菌侵袭后,其炎症和病变会进一步加剧;摄食适量维生素E的鱼在经过哈维氏弧菌侵袭后,其头肾免疫相关通路被高度激活,在免疫防御机制中发挥重要作用,而维生素E摄入量不足,可能会导致自身免疫疾病,在受哈维氏弧菌侵袭后,头肾会出现病理性引诱某些酶类分泌和某些基因上调。（6）养殖试验的miRNA分析结果表明,维生素E可能主要通过调节mi R-34-x来影响肝脏组织的代谢和免疫;通过调节mi R-122-x和mi R-735-x来维持肠道健康,为肠道正常消化吸收营养物质提供良好的内环境;通过调节mi R-1357-x和miRNA-31-x来影响头肾的免疫和抗氧化能力。细菌感染试验的miRNA分析结果表明,维生素E可能通过调节mi R-1246-x、mi R-1260-x、mi R-7133-x（和y）、mi R-29-x（和y）以及mi R-122-x等的差异表达来影响头肾免疫能力。（7）养殖试验的miRNA-mRNA分析结果表明,维生素E可调控mi R-551-x、mi R-3604-x和mi R-193-y的上调以及mi R-883-y、novel-m0222-3p和mi R-34-x的下调来维持肝脏细胞功能,提高肝脏代谢能力和免疫能力;通过调节mi R-31-x、mi R-735-x和mi R-1357-x等（均下调）影响头肾的免疫和抗氧化能力,同时也会调控一些novel miRNA如novel-m0200-5p、novel-m0183-3p和novel-m0184-5p（均下调）等影响免疫过程。细菌感染试验的miRNA-mRNA关联分析得出,维生素E可能主要通过影响mi R-1260-x、mi R-7133-x（和y）和mi R-1246-x等的上调以及mi R-129-x、mi R-122-x和mi R-735-x等的下调来调控头肾抗哈维氏弧菌的感染。综上,维生素E在珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫方面有重要调节作用。本研究从一定程度上揭示了维生素E的促生长和提高免疫的功能实质以及丰富了珍珠龙胆石斑鱼的生物信息学资料。
魏盟智[3]（2020）在《利用基因工程微藻预防石斑鱼神经坏死病研究》文中研究表明石斑鱼是一种富含多种矿物质元素和维生素,深受消费者喜爱的海水食用鱼,也是我国东南沿海（福建、广东、海南）等地区重要水产养殖鱼类。近年来,在人工养殖石斑鱼过程中深受虹彩病毒病、肠炎、寄生虫病等多种疾病困扰,其中尤以病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis,VNN）最为严重,该病在损害养殖户利益的同时也极大阻碍了我国水产养殖业的发展。VNN主要爆发于海水鱼类的育苗期间即幼鱼期和稚鱼期,是由病原神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）入侵鱼体,导致患病鱼行为异常,运动失衡,厌食绝食,最终死亡的一种大危害性、高发生率的病毒性疾病。距今为止,尚未发现有特效药物、有效疫苗或比较好的防治手段去预防或治疗该病,故到目前为止石斑鱼的养殖工作仍然受到很大的阻碍。因此本研究利用转基因微藻混合海水鱼饲料,投喂石斑鱼使其从幼苗阶段就开始获得持续性抗原免疫,来预防病毒性神经坏死病。本研究已从以下方面进行:生物饵料的筛选、纯化、保种、大规模培养;使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR表达载体转化入小球藻中,经筛选、DNA鉴定后选出转基因小球藻。先利用转基因小球藻配合海水鱼饲料制作混合饲料投喂石斑鱼,而后进行攻毒实验,并对其预防效果进行评价。研究结果如下:1、采用平板划线法将小球藻保存于固体TAP培养基,并通过逐级扩大培养法进行扩大培养。使用封闭式光生物反应器养殖小球藻,共获得纯净无污染的小球藻液1500L,将生产得到的小球藻用于石斑鱼混合饲料的制作。2、培养纯净无污染的轮虫作为石斑鱼养殖中的生物饵料,从养殖用水盐度、pH、饵料投喂量方面确定了“S”型褶皱臂尾轮虫养殖条件。经本研究结果显示养殖用水盐度20～30时,轮虫种群密度、日平均增殖率达到最大。盐度10～20时,种群密度随盐度升高而增加,当盐度低于10,随盐度降低轮虫增殖效率逐渐下降,盐度低于5轮虫彻底死亡;当pH在7.5～8.5范围时,种群密度、日平均增殖率达到最大值;在盐度、pH、温度等条件适宜情况下,本实验所设置的各个投喂量梯度中维持轮虫培养液中小球藻密度在5×106个/mL以上获得最大种群密度,故得出结论投喂间隔越短、投喂量越大,轮虫种群增长速率越快,最终可以达到的种群密度也会略有上升。3、使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR重组载体转入小球藻中,电击条件为:转化电压800V～1600V,脉冲长度032μs,脉冲间隔200ms,脉冲次数90次,电击2～3次;使用10μg/mL巴龙霉素固体TAP培养基进行筛选,并对已筛选过的小球藻进行DNA鉴定,最终获得8株转基因小球藻,对转基因小球藻进行扩大培养,共获得1500L转基因小球藻液。4、将采收的小球藻藻液离心,刮取藻泥,按藻泥:饲料（1:1）比例制作混合饲料,最终制得950g的混合饲料颗粒。使用混合饲料连续投喂石斑鱼,饲养10天后进行攻毒实验。将已经确定病毒拷贝数的病毒提取液（24copies/μL）,使用腹腔注射的方法进行攻毒。攻毒过后从分子水平、细胞学水平、生物学水平进行效果评价。结果显示在攻毒48h后实验组石斑鱼眼、脑组织内病毒含量相比于对照组石斑鱼分别降低了 51.70%、48.47%、53.02%;攻毒48h后取石斑鱼眼、脑组织,制作组织切片可清晰看到鱼眼视网膜、脑组织开始出现空泡化病理变化;攻毒后第2、4、6、10、14天对各组石斑鱼取样测定石斑鱼体内神经坏死病毒拷贝数,结果表明,实验组石斑鱼体内病毒增长趋势、病毒拷贝数要低于对照组;攻毒14天后统计最终成活率。最终成活率:DGNNVRNAi1混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%,DGNNVRNAi2混合饲料组相较于对照组提高了 22.0%,DGNNVRNAi3混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%。综上所述,经实验结果分析表明转pMaa7IR/DGNNVIR基因小球藻在预防石斑鱼神经坏死病方面有一定作用,可以有效地抑制病毒在石斑鱼体内增殖。
熊羽[4]（2020）在《神经坏死病毒反向遗传系统构建及病毒改造》文中研究表明神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）属于Betanodavirus病毒属,引起鱼类的病毒性神经坏死（viral nervous necrosis,VNN）,主要侵蚀鱼类的中枢神经系统,使受感染部位出现细胞空泡化病变。神经坏死病毒在全球范围内造成了幼鱼和成年鱼类的高致病率和高死亡率,极大地影响了海水以及淡水水产养殖业的发展。NNV为无包膜的单链正义双节段RNA病毒,包含基因组RNA1和RNA2以及转录产生的亚基因组RNA3分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、衣壳蛋白以及B2蛋白。目前市场上针对神经坏死病毒感染多以预防为主,在水平以及垂直层面进行消毒控制病毒传播和感染,而针对神经坏死病毒的疫苗的研究较少,且主要以灭活疫苗以及衣壳蛋白等构建的亚单位疫苗为主,存在着保护力不够、使用需伴有佐剂等弊端。因此本课题拟对神经坏死病毒进行减毒改造,为后续疫苗的研究提供一种新思路。1、首先构建了一套反向遗传操作系统用于神经坏死病毒的体外拯救,以便于后续的遗传操作实验。本实验基于三套不同启动子策略的NNV包装质粒,摸索了四种不同的拯救方案（T7原核启动子转染B7GG细胞并与SSN-1细胞共培养、CMV真核启动子转染293T细胞、T7原核与CMV真核双启动子转染293T与B7GG混合培养细胞、T7原核启动子转染B7GG细胞）,最终成功建立了一套适合于神经坏死病毒的拯救系统（T7原核启动子转染B7GG细胞）。2、利用建立的反向遗传操作系统对神经坏死病毒B2蛋白进行突变构建NNV病毒致弱毒株,并体外拯救出神经坏死病毒B2蛋白突变株病毒。对B2蛋白突变株病毒进行了病毒增殖曲线的测定,拯救的未突变病毒以及B2蛋白突变株病毒的增殖速度相比于NNV野生毒株更为缓慢,但病毒增殖能力有所降低;在对细胞毒性蛋白Endo-G和抗病毒通路相关蛋白Mx1的荧光定量检测中,拯救的未突变病毒和B2蛋白突变株病毒引起的两种蛋白表达均远低于野生毒株。同时在B2蛋白突变株病毒感染斑马鱼在体实验中,B2蛋白突变株病毒引起的C反应蛋白以及肿瘤坏死因子的表达水平较野生毒株相比降低,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中,脑部空洞化病变程度减弱。因此,构建的NNV病毒B2蛋白突变株毒力减弱,有助于后续基于B2蛋白突变株病毒的基因工程疫苗开发。3、另外,根据神经坏死病毒对神经系统的高度嗜性,对病毒的RNA1区段进行改造,在3’端添加了具有神经环路标记功能的标签,以此来尝试将神经坏死病毒开发成鱼类的神经环路示踪病毒。在RNA1区段的3’端使用蛋白linker（GGGGS）添加e GFP的C端短肽（E11）,利用反向遗传操作系统进行病毒体外拯救后,SSN-1敏感系细胞的感染实验、RT-PCR检测以及带有e GFP的N端（G1-10）转基因斑马鱼在体实验均无法检测到病毒。再次使用更加短小的HA标签和首尾不同位置以及不同连接序列的尝试,最终在使用2倍蛋白linker和F2A将HA标签连接在神经坏死病毒的3’尾端两种改造方式中,通过RT-PCR可以检测到病毒RNA依赖的RNA聚合酶的表达,以及细胞免疫荧光实验可以检测到HA标签的表达,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中同样可以检测到NNV病毒的存在。综上,我们建立了体外拯救神经坏死病毒的方法,并且成功构建出B2蛋白突变株病毒,一定程度上降低了对宿主的毒性作用;另外确定了使用2倍蛋白linker和F2A在病毒基因组上添加HA短肽的方法,为NNV病毒作为神经环路示踪的研究提供了可能。由于病毒基因组的局限性和拯救系统的不完善,在病毒的拯救效率和增殖能力上与野生毒株相比有一定差距,因此还需进一步的摸索和优化。
胡哲[5]（2019）在《丹东市某猪场流行性腹泻诊断及防制研究》文中指出近几年来,PED广泛流行,已成为制约全球养猪业发展的顽疾和难题。本课题通过丹东市某猪场2013-2017年度连续6次爆发流行性猪腹泻疫病发病规律、病原检测和防制措施的探索研究,为规模化猪场PED的快速诊断与鉴别诊断、快速扑灭与有效防制提供重要思路、科学依据和宝贵经验。本试验于2013-2017年度采用临床检查、发病统计、病理剖解、PEDV胶体金试纸条检查、PEDV的RT-PCR对954头病猪进行诊断和鉴别诊断。结果:本病流行特点多发生在寒冷季节,各种猪只都发病,但仔猪缺少抗体最易感,日龄越小病死率越高,治疗效果不尽理想;仔猪典型症状为拉黄白色或灰褐色水样粪便,迅速脱水衰竭而亡;特征病变为小肠壁变薄、肠系膜淋巴结肿大、出血、胃黏膜充血或出血、肾脏有出血点、脾脏边缘梗死;p H试纸检测为弱酸性,PEDV胶体金试纸条检测564头为强阳性;RT-PCR检测PEDV为阳性,S1基因测序确诊为2011年PEDV流行毒株感染,与AJ1102同源率97.5%,KDGG13-2013同源率97.2%,与CH-LNC-2012S、USA2014、South Korea-2008同源率97.0%,与PEDV4-S-3同源率96.6%。本课题于2015年度进行仔猪药物治疗对比试验:将受试10日龄以内腹泻仔猪随机分为5组,每组30头。1组为西药治疗组,2组为中药治疗组,3组为中西医结合治疗组,4组为补液盐+干扰素诱导剂治疗组,5组为致病不治疗对照组。结果4组效果最好,治疗有效率和痊愈率分别为56.7%、30%。于2016年度进行母猪返饲防制对比试验:试验分3个组,1组返饲对象是临产前15d以内的妊娠母猪,2组返饲对象是临产前15～30d的妊娠母猪,对照组母猪不作任何处理。结果试验2组效果最好,腹泻率和死淘率分别为43.77%、34.74%,均与对照组差异显着（P<0.05）。于2016年2月至2017年10月进行综合防制改进方案实施效果对比试验:采用母猪返饲+自家组织苗接种+配套生物安全综合措施,母猪和仔猪抗原阳性率均明显降低,抗体阳性率提高19%～34%,母猪产仔和仔猪成活数显着提升;仔猪腹泻发病率、死淘率分别降至4.7%、0.37%,有效防止了PED的发生。试验结果表明:快速科学诊断是防制PED的前提条件,（口服补液盐+干扰素诱导剂）+隔离消毒+母猪返饲+自家组织苗接种+配套生物安全综合措施是防制PED的有效措施。
郭德权[6]（2019）在《转NNVCP基因衣藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病》文中认为石斑鱼是一种含有高蛋白、低脂肪的上等食用鱼,是我国人工养殖的重要经济鱼类。其中,石斑鱼的主要养殖品种是珍珠龙胆石斑鱼。珍珠龙胆石斑鱼常因感染鱼类病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis,VNN）而损失惨重。VNN是养殖鱼类的常发病,其危害大,死亡率高达65-100%。隶属于罗达病毒科（Nodaviridae）,目前认为其有四种基因型。通过病毒血清型研究表明,4种基因型外壳蛋白的254～256位氨基酸为主要抗原决定簇,说明外壳蛋白基因可以用作抗原基因。目前,由于没有特效疫苗和特异药物防治石斑鱼病毒性神经坏死病,所以石斑鱼苗养殖受到VNN的严重制约。而微藻能进行光合作用,是最原始的初级生产者成员,也在水产养殖中有巨大作用,特别在水产动物的小苗阶段。衣藻（Chlamydomonas）生长周期短、是水体中常见优势藻类,适生性强,是幼鱼的天然饵料。而外壳蛋白含抗原决定簇,可以作为抗原在饵料微藻中表达,得到抗原蛋白,使得饲喂了转病毒性神经坏死病病毒外壳蛋白（NNVCP）基因衣藻的石斑鱼持续获得抗原免疫。因此,采用转NNVCP基因衣藻来预防VNN具有广阔的应用前景。本论文从以下方面进行研究:经济藻株的保种、分离纯化和扩培;构建pCAMBIA1302-NNVCP重组载体;将重组载体采用玻璃珠转化法转入莱茵衣藻;并进行不同种类,不同浓度的抗性筛选;随后对筛选的藻株进行DNA、RNA水平验证;收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗,对其初步确诊断为VNN;采用转基因微藻混合饲料进行预防石斑鱼VNN实验,其研究结果如下:1、经济藻株的保种、分离、纯化和扩培对六种经济藻株的液态不纯藻株采用稀释分离法进行分离,成功分离纯化出六种经济藻株液态纯种;采用10、20、40、60、80、100 μg/ml浓度的氨苄青霉素,对其采用平板划线法,成功在固体培养基上纯化出盐藻、海水小球藻、扁藻。并将纯化的藻种分别用对应的培养基进行保种。采用逐步放大培养法,对3种经济藻株进行液态扩培,每次扩培终体积为100 L,期间总共扩培5次,总共扩培经济藻株体积500L。本实验不仅增加了实验室藻株资源库的种类,扩培的藻株用于苗种企业生产实践,实现了产研学的价值。2、重组载体的构建、转化衣藻及筛选通过NCBI查找NNVCP基因与pCAMBIA1302载体重组,成功构建表达载体pCAMBIA1302-NNVCP。并将pCAMBIA1302-NNVCP真核表达载体转入衣藻。对pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株进行抗性筛选。结果显示:pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株分别通过含有潮霉素2、5、10、15 μg/ml TAP固体培养基进行筛选,筛选成功的藻株有42株,最终接种在含有10μg/ml潮霉素的固体TAP培养基。3、转基因藻株的鉴定、保种、扩培和采收对抗性筛选后的转基因藻株进行鉴定,对其进行DNA、RNA提取,并进行PCR验证。结果显示:在pCAMBIA1302-NNVCP藻株中,有26株呈阳性。将得到的26株转基因藻株保种在含有对应抗生素的平板培养基,并进行转基因藻液态扩培,扩培出pCAMBIA1302-NNVCP-14/15/16藻液质量分别为60.2g、66.7g、69.2g、65.7g,为转基因微藻预防石斑鱼VNN提供实验材料。4、海南珍珠龙胆石斑鱼苗VNN的初步诊断收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗。通过诊断,结果显示:出现了典型VNN症状,对患病鱼体进行了寄生虫学检查,结果为阴性;采用RT-PCR方法、采用OIE推荐引物,VNN的PCR产物特异性片段大小为421 bp;采用细胞肿大病毒、虹彩病毒检测引物,采用RT-PCR方法排除混合感染,以此初步诊断为VNN。在此之前,很少有报道VNN在冬季发生,因此本研究对深入探索VNN具有重要意义,并且为攻毒实验提供材料。5、转基因微藻预防珍珠龙胆石斑鱼VNN实验探究出两种简易自制转基因工程微藻混合饲料的制作方法。连续十天喂食转基因混合饲料后,进行攻毒实验。从分子水平、细胞学水平、生物学水平结果显示:攻毒24小时后实验组脑组织中VNN病毒外壳蛋白mRNA含量比饲料对照组分别下降了67.25%、36.61%、77.17%;攻毒24小时实验组脑组织空泡化数量比对照组少,空泡化病变比对照组轻微;实验组平均存活率比饲料对照组高出33.33%,表明转NNVCP基因衣藻对预防石斑鱼病毒性神经坏死病有一定的作用。
齐雪霏[7]（2019）在《长链非编码RNA在支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病中的表达和分析的研究》文中提出研究目的:本研究的目的是探索支气管哮喘患者和正常对照外周血CD4+T细胞中长链非编码RNA（lnc RNA）和信使RNA（m RNA）的表达情况,预测差异性表达的长链非编码RNA的可能生物学功能与信号通路,并结合临床资料,寻找与哮喘疾病发生发展有关的生物标志物并探索其临床意义。方法:以Arraystar Human Lnc RNA Microarray Version 3.0.检测支气管哮喘患者和正常对照组外周血CD4+T细胞lnc RNA和m RNA的表达谱,通过数据分析找到差异性表达的lnc RNA与m RNA。对差异性表达的m RNA进行基因本体分析和信号通路分析,富集出与之相关的生物学功能和信号通路,以此推测lnc RNA的功能。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）对数据进行验证。用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析lnc RNA的诊断价值。与临床数据相结合,探索lnc RNA与疾病特征的相关性。通过共表达分析,寻找更多与之相关的基因。结果:与正常对照组相比,在哮喘组发现2725个差异性表达的lnc RNA,其中863个表达上调,1862个表达下调;发现2676个差异性表达的m RNA,其中1320个表达上调,1356个表达下调。通过q RT-PCR验证,发现4个具有统计学差异的差异性表达的lnc RNA,分别是ENST00000444682、ENST00000566098、ENST00000583179和ENST00000579468,其中ENST00000444682为表达上调,其他为表达下调。ROC曲线分析差异性表达lnc RNA的诊断价值,ENST00000444682、ENST00000566098、ENST00000583179和ENST00000579468的曲线下面积分别是0.7058、0.9026、0.8361和0.8316。生物信息学分析发现在“细胞因子与细胞因子受体相互结合”、“细胞因子活性”、“免疫应答反应”等项目中有显着富集。斯皮尔曼相关性分析发现,ENST00000579468与呼出气流速峰值具有相关性,ENST00000566098与CD4+T中白介素-13的表达量具有相关性。结论:与正常对照相比,哮喘患者外周血CD4+T细胞中lnc RNA和m RNA表达谱有显着改变,差异性表达的lnc RNA可能通过调节CD4+T细胞中细胞因子的表达参与Th2型免疫反应,有潜力成为诊断疾病及判断疾病状态的生物标志物。研究目的:本研究的目的是探究急性发作期COPD患者（AECOPD）、稳定期COPD患者（stable-COPD）外周血CD4+T细胞长链非编码RNA（lnc RNA）和信使RNA（m RNA）的表达情况,预测差异性表达的长链非编码RNA的可能生物学功能与靶基因,并结合临床资料,寻找与疾病发生发展有关的生物标志物。方法:以Arraystar Human Lnc RNA Microarray Version 3.0.检测急性发作期COPD患者、稳定期COPD患者和正常对照外周血CD4+T细胞lnc RNA和m RNA的表达谱,通过数据分析找到差异性表达的lnc RNA与m RNA。对差异性m RNA进行共表达分析和内源性竞争RNA分析,通过基因本体分析和信号通路分析,预测lnc RNA的生物学功能和信号通路,以此推测lnc RNA的靶基因。通过荧光实时定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）对数据进行验证。用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析lnc RNA的诊断价值。与临床数据相结合,探究lnc RNA与疾病特征的相关性。结果:与正常对照组相比,AECOPD组有1517个lnc RNA和2289个m RNA发生表达水平变化;与stable-COPD组相比,AECOPD组有2284个lnc RNA和3364个m RNA表达水平发生变化;与正常对照组相比,COPD组有1517个lnc RNA和2158个m RNA发生表达变化。通过q RT-PCR验证,AECOPD组中ENST00000447867和NR-026690的表达量高于其他组,并具有统计学差异。通过ROC曲线分析验证过的差异性表达RNA的诊断价值,NR-026690有潜力成为区分AECOPD和stable-COPD的生物标志物,曲线下面积为0.8377。对与lnc RNA有共表达关系的差异性表达的m RNA进行生物信息学分析,发现在“调节Th17免疫反应”、“c AMP信号通路”方面出现富集,并推测ENST00000447867和NR-026690的靶基因是RAPGEF3。QRT-PCR发现ENST00000447867和NR-026690与CD4+T细胞中的RAPGEF3表达量具有相关性。Lnc RNA-mi RNA-m RNA网络图发现ENST00000447867和NR-026690与RAPGEF3之间有许多共同的mi RNA识别位点。结论:与正常对照相比,AECOPD患者、stable-COPD患者外周血CD4+T细胞中lnc RNA和m RNA表达谱都发生了改变。ENST00000447867和NR-026690可能成为诊断COPD并区别AECOPD和stable-COPD的生物标志物。ENST00000447867和NR-026690可能通过mi RNA海绵吸附作用调节RAPGEF3,进而影响COPD的发生与发展。
张美玲[8]（2018）在《水稻纹枯病菌中2个双分体病毒的基因组结构与功能研究》文中研究指明由水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn AG-1 IA）引起的水稻纹枯病（rice sheath blight）是水稻（Oryza sativa L.）最重要的病害之一。近年来随着真菌病毒研究的开展,水稻纹枯病菌中的真菌病毒也逐渐被发现和研究。已报道的水稻纹枯病菌中的真菌病毒主要为双链RNA（double-stranded RNA,ds RNA）病毒,包括双分体病毒、内源病毒和暂未分类的真菌病毒等。已有研究表明,有的真菌病毒对寄主真菌的生物学性状有一定的影响。而目前,关于水稻纹枯病菌中的真菌病毒对原始寄主真菌的影响的研究甚少。为发现更多的新的真菌病毒,并明确某些真菌病毒对寄主真菌的影响,本研究以实验室保存的13个已知含有真菌病毒的水稻纹枯病菌为研究对象,进行了新真菌病毒的筛选、真菌病毒的基因组结构与功能分析以及真菌病毒对寄主真菌的影响等一系列研究工作。现将主要研究结果报道如下:1.用反转录PCR（RT-PCR）的方法对本实验室前期初步筛选出的13个含有真菌病毒的水稻纹枯病菌株进行新真菌病毒的筛选,结果发现:B240和B261菌株中存在水稻纹枯病菌ds RNA病毒1（Rhizoctonia solani ds RNA virus 1,Rs V1）,菌株A111中只存在病毒Rs V1的片段1,说明了病毒Rs V1的片段1的单独侵染性。水稻纹枯病菌双分体病毒2（Rhizoctonia solani partitivirus 2,Rs PV2）存在于A5和B261菌株中。而A82、A102、A105、A106、A154、A182、D122、D168和Y1等9个菌株中含有与Rs V1和Rs PV2不同的真菌病毒。根据这9个菌株中病毒核酸的琼脂糖凝胶电泳条带,挑选A105和D122两个菌株为本研究的深入研究对象。2.从水稻纹枯病菌A105菌株中分离到一个新的真菌病毒,命名为水稻纹枯病菌ds RNA病毒3（Rhizoctonia solani ds RNA virus 3,RsRV3）。RsRV3基因组含有两个ds RNA片段（ds RNA1和ds RNA2）,大小分别为1890 bp和1811 bp,各含有一个开放阅读框（open reading frame,ORF）,分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）和外壳蛋白（coat protein,CP）。对病毒粒子进行负染观察,发现该病毒具有等轴的病毒粒子,直径约为20 nm。系统发育分析表明,RsRV3与双分体病毒科（Partitiviridae）的a-双分体病毒属（Alphapartitivirus）成员具有较高的相似性。因此确定真菌病毒RsRV3是隶属于双分体病毒科（Partitiviridae）、a-双分体病毒属（Alphapartitivirus）的一个新的ds RNA真菌病毒。3.从水稻纹枯病菌D122菌株中分离到另一个新的真菌病毒,命名为水稻纹枯病菌ds RNA病毒5（Rhizoctonia solani ds RNA virus 5,RsRV5）。RsRV5基因组含有两个ds RNA片段（ds RNA1和ds RNA2）,大小分别为1894 bp和1755 bp,各含有一个开放阅读框（open reading frame,ORF）,分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）和外壳蛋白（coat protein,CP）。对病毒粒子进行负染观察,发现该病毒具有等轴的病毒粒子,直径约为20 nm。系统发育分析表明,RsRV5与双分体病毒科（Partitiviridae）的γ-双分体病毒属（Gamapartitivirus）成员具有较高的相似性。因此确定病毒RsRV3是隶属于双分体病毒科（Partitiviridae）、γ-双分体病毒属（Gamapartitivirus）的一个新的ds RNA真菌病毒。4.病毒脱除方法主要有菌丝尖端法、菌丝尖端与病毒抑制剂结合法、菌丝碎段法和原生质体再生法等。为了获得带毒和不带毒的等基因系菌株,以便建立真菌病毒与寄主真菌的互作体系,本研究利用原生质体再生法成功地把病毒RsRV5从寄主中脱除。对等基因系带毒菌株D122和脱毒菌株D122-P的生物学性状进行比较,病毒RsRV5对寄主的生长速率没有明显影响,但在7 d时间内能提高寄主真菌产色素能力,使寄主真菌产菌核量变少,致病力稍有降低。5.对等基因系的水稻纹枯病菌野生型带毒（RsRV5）菌株D122和不带毒菌株D122-P样本进行转录组测序和生物信息学分析,比较两种样本在转录水平上的差异,旨在了解真菌病毒对寄主真菌转录组的影响。结果表明:测序数据的有效比对序列数为127380018,能够比对到参考基因组的序列数为96371422,比对百分比都达到了70%以上。鉴定出可变剪接事件65535个,其中内含子滞留所占比例最大,外显子跳跃次之。差异基因表达分析表明,病毒RsRV5脱除后,基因rna6273和rna6673表达显着上调,基因rna9529表达显着下调,其中rna6273和rna9529编码未知功能的蛋白,rna6273编码蛋白激酶抑制剂（PKI）功能域蛋白（domain-containing protein）。综上所述,本研究阐明了2种新发现的双分体病毒（RsRV3和RsRV5）的基因组结构与功能的关系,并初步阐明了真菌病毒RsRV5对寄主真菌生物学性状和转录组的影响。
陈文捷[9]（2017）在《赤点石斑神经坏死病毒感染GF-1和SSN-1细胞的microRNA组与转录组研究》文中指出鱼类神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）也称为β野田病毒（betanodavirus）,是野田病毒（Nodaviridae）家族的一员。NNV感染导致的疾病称为病毒性神经坏死症（viral nervous necrosis,VNN）或者病毒性脑病和视网膜病（viral encephalopathy and retinopathy,VER）,最初分离自患病的海洋鱼类,现在已在120多种不同的养殖和野生鱼类中被报道,严重危害着水产养殖业。近年来,越来越多的证据表明NNV开始在淡水鱼类中流行,感染实验也表明很多淡水鱼类容易受到NNV感染。虽然各国学者在NNV感染的预防和治疗方面投入了大量的研究,但对NNV致病的分子机制还没有完全阐明。通过研究赤点石斑神经坏死病毒（Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV）感染敏感细胞系的microRNA（miRNA）表达谱和转录组测序,可以获得大量RGNNV和宿主相互作用的信息,这些结果将有助于了解RGNNV的复制和致病机制,进而为VER的综合防控提供新的策略。虽然目前已经建立了一些对NNV敏感的细胞系,但来自鱼类神经组织的敏感细胞系还很少,因此,寻找来自鱼类神经组织的NNV敏感细胞系是十分必要的。本研究首先以斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）鳍条细胞系（Grouper fin cells,GF-1）为对象,利用RNA-Seq技术（Illumina）测定了GF-1细胞在RGNNV感染后3和24小时（hour,h）的miRNA表达谱。随后分别研究了GF-1细胞和来自纹月鳢（Channa striatus）鱼苗的SSN-1细胞（striped snakehead fish cells）在RGNNV感染后3和24 h的转录组,在转录组分析的基础上,进一步对NNV感染导致的细胞凋亡途径进行分析,并对两个转录组进行了比较研究。我们还采用鳜脑细胞（Chinese perch brain,CPB）,研究了CPB对RGNNV的敏感性,并在此基础上研究了鳜对RGNNV的敏感性。研究结果如下:1.通过solexa深度测序研究RGNNV感染后GF-1细胞的miRNA表达谱,利用miRDeep2 v2.0.5软件将测序结果与斑马鱼基因组比对,一共鉴定出了220种已知miRNA,预测了18种新的miRNA。利用IDEG 6软件,分别在RGNNV感染后3和24 h的GF-1细胞中鉴定到了51和16种差异表达的miRNA（Differentially expressed miRNA,DE-miRNA）;对DE-miRNA的靶基因进行预测、功能注释及分析,这些靶基因与广泛的生理调控有关,如转录调控、氧化还原、蛋白水解、细胞凋亡和免疫应答等。通过随机挑选了6个新预测的miRNA进行RT-PCR验证,结果表明这些新的miRNA在GF-1细胞中能够表达。通过随机挑选了6个DE-miRNA进行qRT-PCR验证,这些DE-mi RNA的表达趋势与测序结果一致,表明miRNA组测序结果可信;验证了4个DE-miRNA（miR-1,-30b,-150,-184）对RGNNV复制的影响,qRT-PCR和Western blot表明过表达这四种miRNA可以显着地促进RGNNV在GF-1细胞中的复制。2.通过HiSeq 2500测序,一共从四个GF-1细胞样品中获得127,259,258 clean reads,经De novo拼接一共获得了111,860条平均长度为624 bp的unigene;通过blast比对,一共有35,390 unigene（31.64%）得到注释。差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG）筛选表明,感染后3和24 h分别有226和117个DEG。进一步对凋亡通路的DEG进行分析,推测RGNNV诱导GF-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的Bax和Drp1蛋白来进行;对5个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,结果与HiSeq 2500测序的结果一致,证实转录组结果是可信的;通过发光法检测Caspase-3,-8和-9的活性,结果表明RGNNV感染可以导致GF-1细胞中Caspase-3,-8,-9活性的显着升高。3.经HiSeq 2000测序,一共从四个SSN-1细胞样品中获得253,338,544 clean reads,经De novo拼接一共获得了93,372条平均长度为829 bp的unigene。通过blast比对,一共有18,974 unigene（20.32%）得到注释。DEG筛选表明,感染后3和24 h分别有2,640和3,211个DEG;对凋亡通路的DEG进行分析,结果表明RGNNV诱导SSN-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的EndoG蛋白来进行;对7个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,与转录组测定的结果相符,表明测序结果是可信的;通过Annexin V-FITC/PI和DAPI染色,证实RGNNV感染或过表达EndoG可以导致SSN-1细胞的凋亡。4.比较RGNNV诱导GF-1和SSN-1细胞凋亡的途径,在RGNNV感染GF-1和SSN-1细胞的转录组研究中,外源性凋亡途径相关基因的表达都没有发生显着的上调。在内源性凋亡途径方面,RGNNV感染后GF-1细胞中Bax以及Drp1的表达水平显着升高,而SSN-1细胞在RGNNV感染后,EndoG的表达水平显着升高,这三种蛋白都参与线粒体介导的细胞凋亡。此外,在内质网（Endoplasmic reticulum,ER）应激反应方面,RGNNV感染后,Bip的表达水平在GF-1和SSN-1细胞中都发生了显着上调,最终导致线粒体介导的细胞凋亡。由此我们推测RGNNV感染可以通过线粒体和内质网介导的凋亡途径来诱导细胞凋亡,具体的机制还需要进一步研究。5.评估了来自淡水鱼类鳜脑组织的细胞系CPB对RGNNV的敏感性。qRT-PCR检测表明RGNNV在CPB细胞中可以良好地复制。Annexin V-FITC/PI和DAPI两种染色途径证实RGNNV感染可以导致CPB细胞的凋亡。进一步评估鳜对RGNNV的敏感性,通过眼球注射,RGNNV可以感染鳜并导致鳜出现神经症状,表现为游泳异常;对鳜脑组织进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察,感染的鳜脑组织出现大量的细胞空泡化;电镜（electronic microscope,EM）扫描发现在感染的鳜脑组织里有大量紧密排列的病毒粒子,并且大量线粒体出现了肿胀,这一现象与线粒体膜电位损失是否有关还需要进一步的研究。对RGNNV敏感的淡水鱼类脑细胞株CPB的发现,将为RGNNV的致病性研究提供有力的工具。
梁国智[10]（2017）在《NDRV可视化RT-LAMP及其核酸试纸条检测方法建立与初步应用》文中研究表明新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus,NDRV）病为一种新发疫病,其病变特征主要表现为肝脏不规则坏死、斑块状出血和心肌、法氏囊出血等。该病发病率和病死率虽然差别较大,但患病鸭日龄愈小,发病率、病死率愈高。自2005年以来,该病由福建、广东及浙江等地向其它地域蔓延并传播迅速,导致养鸭业的经济发展严重受损。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新型核酸扩增技术,该技术主要利用靶序列68个特定位点获得46种特异性引物,在Bst聚合酶参与及固定温度下,一般在3060 min内就能结束链置换扩增反应。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术在LAMP技术基础上加入反转录酶,一步完成全部反应。该技术具有强特异性、高敏感性、快速及所需仪器设备简单等优点。本论文针对NDRV检测技术进展及临床检测需要,以NDRV-QY为研究对象,根据GenBank中注册的NDRVσB蛋白基因序列,采用LAMP在线引物设计软件及Primer–BLAST、Oligo 7.0和Larsergene 7.0 PrimerSelect进行引物设计及筛选。采用聚合酶链式反应（PCR）扩增获得σB蛋白基因序列,连接PMD18-T载体,成功构建重组阳性质粒,并测序得到全长1 104 bp。结合本研究设计的6种特异性引物,将RT-LAMP技术同钙黄绿素相结合,建立了NDRV可视化RT-LAMP快速检测方法,并对反应条件进行优化;同时,将RT-LAMP技术与核酸试纸条技术相结合,建立了NDRV RT-LAMP核酸试纸条快速检测方法。并采用两种方法对疑似新型鸭呼肠孤病临床病料进行检测。研究结果表明,所建两种RT-LAMP检测方法特异性强,且能在65℃条件下50 min内完成反应,能最低检测出200 fg的NDRV RNA及阳性质粒,比传统RT-PCR敏感100倍。对15份临床疑似混合病料的检测中,新建的两种检测方法与RT-PCR阳性检测率相同。对12份临床疑似病料进行检测中,新建的两种方法阳性检测率高于RT-PCR。对健康雏番鸭进行NDRV尿囊液攻毒后检测,结果显示两种RT-LAMP快速检测方法比常规RT-PCR方法的阳性检出率高10.71%,能从腹腔攻毒48 h后小鸭粪便中检测出NDRV。本研究针对NDRV建立的RT-LAMP钙黄绿素可视化方法及其核酸试纸条方法具有比常规RT-PCR方法更加特异敏感、快速简便等优势,为新型鸭呼肠孤病的早期诊断及疫情监测提供重要技术支持,适合于基层及现场的推广使用。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 神经坏死病毒研究进展 |
| 1.1.1 神经坏死病毒的分布及流行规律 |
| 1.1.2 神经坏死病毒的分类 |
| 1.1.3 神经坏死病毒的超微结构 |
| 1.1.4 神经坏死病毒的基因组特征 |
| 1.1.5 神经坏死病毒编码蛋白的主要功能 |
| 1.1.6 神经坏死病毒的致病机制 |
| 1.1.7 神经坏死病毒的感染途径及体内传播方式 |
| 1.1.8 神经坏死病毒的检测方法 |
| 1.1.9 神经坏死病毒疫苗的开发 |
| 1.2 鱼类干扰素研究进展 |
| 1.2.1 RLRs介导的Ⅰ型干扰素抗病毒信号通路 |
| 1.3 鱼类病毒逃逸RLRs介导Ⅰ型干扰素的研究进展 |
| 1.3.1 抑制RLRs的检测和活化 |
| 1.3.2 抑制RLRs的信号传递 |
| 1.3.3 抑制JAK/STAT信号通路 |
| 1.3.4 降解ISGs分子 |
| 1.3.5 抑制宿主转录或翻译 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 石斑鱼神经坏死病毒的分离与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验鱼 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验所需试剂的配制 |
| 2.1.5 实验细胞 |
| 2.1.6 病鱼检查 |
| 2.1.7 组织病理学观察 |
| 2.1.8 病毒的分离 |
| 2.1.9 病毒滴度测定 |
| 2.1.10 病毒的鉴定(RT-PCR法) |
| 2.1.11 全基因组序列测定及分析 |
| 2.1.12 病毒粒子的形态观察 |
| 2.1.13 病毒的纯化 |
| 2.1.14 人工感染实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 病鱼的症状观察及病理切片观察 |
| 2.2.2 寄生虫及致病菌分离 |
| 2.2.3 RT-PCR结果 |
| 2.2.4 病毒的分离 |
| 2.2.5 病毒滴度测定 |
| 2.2.6 超薄切片观察病毒粒子 |
| 2.2.7 病毒蛋白图谱及负染电镜图 |
| 2.2.8 基因组序列测定及分析 |
| 2.2.9 系统发育树分析 |
| 2.2.10 人工感染实验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 抗RGNNV衣壳蛋白(Cp)单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物、病毒与细胞 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 衣壳蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.2 三免后小鼠血清效价测定 |
| 3.2.3 单克隆抗体的筛选结果及亚型分析 |
| 3.2.4 单克隆抗体腹水效价测定 |
| 3.2.5 单克隆抗体的western blot分析 |
| 3.2.6 单克隆抗体的间接免疫荧光分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RGNNV B2 蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应的机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 RNA提取及反转录 |
| 4.1.5 真核表达质粒的构建 |
| 4.1.6 细胞转染 |
| 4.1.7 RT-qPCR |
| 4.1.8 双荧光素酶报告实验 |
| 4.1.9 Western blot |
| 4.1.10 细胞活性实验-MTT法 |
| 4.1.11 mRNA稳定性实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RGNNV抑制poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ反应 |
| 4.2.2 RGNNV B2蛋白抑制poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ反应 |
| 4.2.3 B2 蛋白抑制RLRs介导的IFN-Ⅰ反应 |
| 4.2.4 B2 蛋白抑制宿主的转录 |
| 4.2.5 B2 蛋白下调RNA聚合酶Ⅱ的表达 |
| 4.2.6 B2 蛋白促进RGNNV的增殖 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 维生素E的性质与功能简介 |
| 1.1.1 维生素E的本质特征 |
| 1.1.2 维生素E在动物体内的吸收与代谢 |
| 1.1.3 维生素E在动物体内发挥的作用 |
| 1.1.4 水产领域维生素E研究及目前存在的问题 |
| 1.2 珍珠龙胆石斑鱼研究文献综述 |
| 1.2.1 珍珠龙胆石斑鱼的起源、分类以及生物学特征 |
| 1.2.2 珍珠龙胆石斑鱼育种学研究 |
| 1.2.3 珍珠龙胆石斑鱼营养学研究 |
| 1.2.4 珍珠龙胆石斑鱼病害学研究 |
| 1.2.5 珍珠龙胆石斑鱼转录水平研究 |
| 1.2.6 其他研究 |
| 1.2.7 存在的问题 |
| 1.3 转录组学研究 |
| 1.3.1 转录组学研究方法概述 |
| 1.3.2 转录组学高通量测序技术的发展历程 |
| 1.3.3 转录组测序在水产动物上的应用 |
| 1.4 本课题研究的内容及意义 |
| 1.4.1 本研究拟解决的问题 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 1.4.4 研究意义 |
| 1.4.5 创新点 |
| 第2章 维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫的影响 |
| 2.1 维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长、抗氧化、免疫及消化酶活性的影响 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.1.4 小结 |
| 2.2 饲料中添加维生素E对珍珠龙胆石斑鱼各组织形态结构的影响 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.2.4 小结 |
| 第3章 维生素E最适添加量对珍珠龙胆石斑鱼抗病力的影响 |
| 3.1 哈维氏弧菌半致死试验 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 维生素E最适添加量对珍珠龙胆石斑鱼抗病力相关生理指标的影响 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果与分析 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 哈维氏弧菌和维生素E对珍珠龙胆石斑鱼免疫组织形态结构的影响 |
| 3.3.1 材料和方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.3.3 讨论 |
| 3.3.4 小结 |
| 第4章 mRNA测序分析维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫的影响 |
| 4.1 养殖试验样品的mRNA测序及分析 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.4 讨论 |
| 4.1.5 小结 |
| 4.2 细菌感染试验样品的mRNA测序及分析 |
| 4.2.1 材料与方法 |
| 4.2.2 结果 |
| 4.2.3 讨论 |
| 4.2.4 小结 |
| 第5章 miRNA测序分析维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫的影响 |
| 5.1 养殖试验样品的miRNA测序及分析 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 结果 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.1.5 小结 |
| 5.2 细菌感染试验样品的miRNA测序及分析 |
| 5.2.1 材料与方法 |
| 5.2.2 结果 |
| 5.2.3 讨论 |
| 5.2.4 小结 |
| 第6章 维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫调控的miRNA-mRNA分析 |
| 6.1 养殖试验样品的miRNA-mRNA关联分析 |
| 6.1.1 材料与方法 |
| 6.1.2 结果 |
| 6.1.3 讨论 |
| 6.1.4 小结 |
| 6.2 细菌感染试验样品的miRNA-mRNA关联分析 |
| 6.2.1 材料与方法 |
| 6.2.2 结果 |
| 6.2.3 讨论 |
| 6.2.4 小结 |
| 第7章 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间已发表或待发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 病毒性神经坏死病研究现状 |
| 1.1.1 石斑鱼病毒性神经坏死病概述 |
| 1.1.2 病毒性神经坏死病的临床症状 |
| 1.1.3 病毒性神经坏死病的传播途径 |
| 1.1.4 病毒性神经坏死病的地理分布 |
| 1.1.5 病毒性神经坏死病的防控 |
| 1.1.6 病毒性神经坏死病的检测与诊断技术 |
| 1.2 微藻的应用现状 |
| 1.2.1 微藻概述 |
| 1.2.2 微藻的应用 |
| 1.3 褶皱臂尾轮虫的应用现状 |
| 1.3.1 褶皱臂尾轮虫介绍 |
| 1.3.2 褶皱臂尾轮虫的应用 |
| 1.4 本实验的目的、意义与技术路线 |
| 1.4.1 实验研究的目的与意义 |
| 1.4.2 实验技术路线 |
| 2. 微藻的保种和扩大培养 |
| 2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 2.1.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 藻种的保存 |
| 2.2.2 微藻的扩大培养 |
| 2.2.3 两种生物反应器培养藻类对比 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3. 轮虫的培养 |
| 3.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 3.1.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 测定pH对褶皱臂尾轮虫影响的方法 |
| 3.2.2 测定盐度对褶皱臂尾轮虫影响的方法 |
| 3.2.3 测定投喂间隔对褶皱臂尾轮虫影响的方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 pH对褶皱臂尾轮虫生长的影响 |
| 3.3.2 盐度对褶皱臂尾轮虫的影响 |
| 3.3.3 投喂间隔对褶皱臂尾轮虫的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4. 转化小球藻(HOC5)及鉴定 |
| 4.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器及试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 pMaa7IR/DGNNVIR表达载体转化小球藻HOC5 |
| 4.2.2 转基因小球藻的鉴定 |
| 4.2.3 转pMaa7IR/DGNNVIR小球藻的基因相对表达量测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 电击法转化小球藻HOC5及筛选 |
| 4.3.2 小球藻藻株转化子DNA检测 |
| 4.3.3 转DGNNVRNAi载体小球藻的基因相对表达量 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5. 转基因小球藻的保种、扩培以及混合饲料的制作 |
| 5.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器及试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 转基因小球藻的保种 |
| 5.2.2 藻株的扩大培养及收集 |
| 5.2.3 转基因小球藻混合饲料的制作 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6. 石斑鱼病毒性神经坏死病的诊断 |
| 6.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器及试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 发病情况调查 |
| 6.2.2 寄生虫病检查 |
| 6.2.3 细菌、真菌性传染病检查 |
| 6.2.4 病毒性疾病检查 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7. 转基因小球藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病实验 |
| 7.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器及试剂 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 转基因小球藻混合饲料投喂石斑鱼 |
| 7.2.2 神经坏死病毒提取液滴度的测定 |
| 7.2.3 攻毒石斑鱼试验 |
| 7.2.4 转基因小球藻预防VNN效果评价 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 转基因小球藻投喂石斑鱼 |
| 7.3.2 最佳注射神经坏死病毒提取液滴度的确定 |
| 7.3.3 攻毒石斑鱼结果 |
| 7.3.4 转基因小球藻预防石斑鱼VNN效果评价 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8. 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1.文献综述 |
| 1.1 神经坏死病毒 |
| 1.2 神经坏死病毒反向遗传系统 |
| 1.3 神经坏死病毒传播与检测 |
| 1.4 神经坏死病毒鱼用疫苗 |
| 1.5 鱼类免疫系统以及抗病毒作用 |
| 1.6 神经坏死病毒在神经生物学中的潜在应用 |
| 2.目的与意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒、病毒、细菌、细胞、抗体 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 实验仪器及耗材 |
| 3.1.4 主要的工具酶,抗体,试剂以及血清 |
| 3.1.5 主要的培养基、抗生素、缓冲液及其配置 |
| 3.1.6 主要的生物学软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病毒拯救的反向遗传学的建立 |
| 3.2.2 B2突变质粒的构建 |
| 3.2.3 B2突变质粒的验证 |
| 3.2.4 B2突变株NNV拯救 |
| 3.2.5 B2突变株病毒感染实验 |
| 3.2.6 B2突变株病毒毒力实验 |
| 3.2.7 NNV添加E11标签 |
| 3.2.8 NNV-RNA1-E11 的拯救与验证 |
| 3.2.9 病毒基因组RNA1区段改造 |
| 3.2.10 改造后病毒拯救与验证 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 神经坏死病毒(NNV)拯救方法的建立 |
| 4.1.1 NNV病毒的拯救方案一 |
| 4.1.2 NNV病毒的拯救方案二 |
| 4.1.3 NNV病毒的拯救方案三 |
| 4.1.4 NNV病毒的拯救方案四 |
| 4.2 NNV病毒的致弱改造 |
| 4.2.1 NNV病毒B2蛋白突变株质粒的构建 |
| 4.2.2 NNV病毒B2蛋白突变株质粒的验证 |
| 4.3 B2蛋白突变株NNV病毒的拯救与浓缩 |
| 4.4 B2蛋白突变株病毒增殖曲线测定 |
| 4.5 B2蛋白突变株病毒B2缺失验证 |
| 4.5.1 NNV感染SSN-1 细胞验证B2 蛋白表达 |
| 4.5.2 测序验证B2蛋白突变株病毒B2蛋白的突变 |
| 4.6 B2蛋白突变株病毒感染SSN-1细胞对抗病毒相关蛋白影响 |
| 4.7 B2蛋白突变株病毒斑马鱼在体感染实验 |
| 4.8 NNV病毒的神经示踪改造 |
| 4.8.1 NNV示踪病毒载体构建 |
| 4.8.2 NNV-E11示踪病毒的拯救与验证 |
| 4.8.3 HA标签的NNV病毒改造 |
| 4.8.4 NNV-HA病毒拯救与验证 |
| 4.8.5 NNV-HA示踪病毒扩增与浓缩 |
| 4.8.6 NNV-HA病毒斑马鱼在体验证 |
| 4.9 后期实验展望 |
| 5.讨论 |
| 5.1 神经坏死病毒反向遗传操作系统的建立 |
| 5.2 B2蛋白突变株病毒的构建 |
| 5.3 神经坏死病毒改造用以神经环路示踪 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 猪流行性腹泻病原学 |
| 2 猪流行性腹泻流行特点 |
| 3 猪流行性腹泻传播途径 |
| 4 猪流行性腹泻发病机理 |
| 5 猪流行性腹泻诊断方法与鉴别诊断 |
| 5.1 感观诊断与鉴别诊断 |
| 5.2 实验室诊断与鉴别诊断 |
| 6 猪流行性腹泻常规防制措施 |
| 7 本研究的目的意义 |
| 第二章 发病猪场流行性腹泻的诊断 |
| 1 材料 |
| 1.1 目标猪场 |
| 1.2 用品、药品及设施 |
| 1.3 PEDV试剂与器材 |
| 1.4 PEDV、RT-PCR样品 |
| 1.5 PCR检测设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 临床检查 |
| 2.2 发病统计 |
| 2.3 病理解剖 |
| 2.4 PEDV胶体金试纸条检查 |
| 2.5 PEDV的RT-PCR检查 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 发病情况(发病率、死淘率) |
| 3.3 剖检病理变化 |
| 3.4 PEDV胶体金试纸条检测结果 |
| 3.5 RT-PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 生猪抗体水平低是爆发PED的直接原因 |
| 4.2 猪舍设施陈旧老化是爆发PED的客观原因 |
| 4.3 生物安全体系缺失是爆发PED的主观原因 |
| 4.4 人员和饲养管理不到位是爆发PED的重要原因 |
| 5 小结 |
| 第三章 仔猪流行性腹泻防制方法研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 仔猪药物治疗效果对比试验材料 |
| 1.2 母猪人工返饲效果对比试验材料 |
| 1.3 综合防制改进方案实施效果对比试验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 仔猪药物治疗效果对比试验方法 |
| 2.2 母猪人工返饲预防效果对比试验方法 |
| 2.3 综合防制改进方案实施效果对比试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 仔猪药物治疗效果对比试验结果分析 |
| 3.2 母猪人工返饲效果对比试验结果分析 |
| 3.3 综合防制改进方案实施效果对比试验结果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 口服补液盐和干扰素诱导剂的治疗作用 |
| 4.2 返饲母猪的选择对PEDV免疫抗体的影响 |
| 4.3 病料选择、处理和使用对返饲效果的影响 |
| 4.4 疫苗选择与接种对PEDV免疫效果的影响 |
| 4.5 免疫抑制性疫病对PED免疫效果的影响 |
| 4.6 建立生物安全屏障对防控PED至关重要 |
| 4.7 霉变饲料饲喂母猪对PED发生的影响 |
| 5 小结 |
| 5.1 10日龄以内发病仔猪无特效药物 |
| 5.2 临产前15~30d的妊娠母猪返饲好 |
| 5.3 母猪返饲+自家组织苗接种效果好 |
| 5.4 隔离消毒是防制PED的重要手段 |
| 5.5 综合防制改进方案可有效防止PED发生 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)的研究进展 |
| 1.1.1 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)的发现、命名及分类 |
| 1.1.2 VNN的地理分布、结构、理化性质 |
| 1.1.3 VNN的传播途径及危害 |
| 1.1.4 VNN的检测方法及防治 |
| 1.2 微藻的应用前景 |
| 1.3 研究的意义及技术路线 |
| 1.3.1 研究的目的意义 |
| 1.3.2 研究的技术路线 |
| 2. 经济藻株的保种、分离纯化和扩培 |
| 2.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器、试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 藻类的保种 |
| 2.2.2 藻类的分离 |
| 2.2.3 藻类的纯化 |
| 2.2.4 藻类的扩培 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 小结 |
| 3. 重组载体的构建 |
| 3.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器、试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 NNVCP基因的引物设计 |
| 3.2.2 构建pCAMBIA1302-NNVCP重组载体 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 小结 |
| 4. 细胞核表达载体转化莱茵衣藻CC425及鉴定 |
| 4.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器、试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 pCAMBIA1302-NNVCP载体转化莱茵衣藻CC425 |
| 4.2.2 转基因藻株的DNA的鉴定（李亚军等,2014;高寒等,2016) |
| 4.2.3 转基因藻株的RNA的鉴定 |
| 4.2.4 转基因藻株的RT-PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 小结 |
| 5. 转基因藻株的保种、扩培和采收 |
| 5.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器、试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 转基因藻株的保种 |
| 5.2.2 转基因藻株的液态扩大培养 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 小结 |
| 6.海南石斑鱼苗病毒性神经坏死病的诊断 |
| 6.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器、试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 发病情况的调查 |
| 6.2.2 实验室检查 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 小结 |
| 7. 转NNVCP基因衣藻预防珍珠龙胆石斑鱼VNN实验 |
| 7.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器、试剂 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 转基因微藻混合饲料的制作 |
| 7.2.2 微藻混合饲喂石斑鱼 |
| 7.2.3 最佳麻醉浓的确定 |
| 7.2.4 NNV攻毒石斑鱼 |
| 7.2.5 转基因微藻防治VNN效果评价 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 小结 |
| 8. 讨论与结论 |
| 8.1 讨论 |
| 8.1.1 藻株的分离方法和培养方式 |
| 8.1.2 莱茵衣藻 |
| 8.1.3 转NNVCP基因衣藻预防珍珠龙胆石斑鱼的成效 |
| 8.2 展望 |
| 8.3 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 缩略词 |
| 2 部分实验操作步骤 |
| 2.1 从大肠杆菌中抽提质粒（上海生工） |
| 2.2 组织病理切片制作的主要步骤（徕创生物） |
| 2.3 E.coli DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.4 病毒DNA提取步骤 |
| 2.5 病毒RNA提取步骤 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 华中科技大学博士学位论文创新点概述 |
| 前言 |
| 第一部分 长链非编码RNA在支气管哮喘患者外周血CD4+T细胞中的表达和分析的研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 长链非编码RNA在慢性阻塞性肺疾病患者外周血CD4+T细胞中的表达与分析的研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA在肺部疾病中的表达及作用机制的研究进展 |
| 1.LncRNA的生物学特点和功能 |
| 2.LncRNA与肺部疾病 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 附录2 攻读学位期间撰写与发表的研究论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词及英汉对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 水稻纹枯病研究进展 |
| 1.1.1 水稻纹枯病及其病原菌 |
| 1.1.2 水稻纹枯病菌的致病机理 |
| 1.1.3 水稻纹枯病菌的防治 |
| 1.2 真菌病毒的研究进展 |
| 1.2.1 真菌病毒的主要类群 |
| 1.2.1.1 +ssRNA病毒 |
| 1.2.1.2 -ssRNA病毒 |
| 1.2.1.3 ssDNA病毒 |
| 1.2.1.4 dsRNA病毒 |
| 1.2.2 双分体真菌病毒 |
| 1.2.2.1 双分体真菌病毒的发展历程和分类 |
| 1.2.2.2 双分体真菌病毒与寄主的相互作用 |
| 1.2.2.3 双分体真菌病毒的转染和脱除 |
| 1.2.3 弱毒真菌病毒在植物病害生物防治中的应用 |
| 1.2.3.1 弱毒真菌病毒的发现 |
| 1.2.3.2 弱毒真菌病毒在植物病害生物防治中的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 第2章 水稻纹枯病菌中新的真菌病毒的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试菌株与培养基 |
| 2.2.2 酶和其他试剂 |
| 2.2.3 仪器和设备 |
| 2.2.4 供试菌株的活化、培养与菌丝收集 |
| 2.2.5 真菌病毒筛选引物 |
| 2.2.6 Total RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.6.1 总RNA体取 |
| 2.2.6.2 模板cDNA的合成 |
| 2.2.7 RT-PCR的方法筛选目的菌株 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总RNA提取及c DNA合成结果 |
| 2.3.2 RT-PCR筛选结果 |
| 2.3.2.1 以病毒RsV1片段1检测 |
| 2.3.2.2 以病毒RsV1片段2检测 |
| 2.3.2.3 以病毒RsPV2片段1检测 |
| 2.3.2.4 以病毒RsPV2片段2检测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 水稻纹枯病菌A105中dsRNA全长cDNA克隆与序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株及培养基 |
| 3.2.2 载体和引物 |
| 3.2.3 酶及其他试剂 |
| 3.2.4 仪器和设备 |
| 3.2.5 全基因组cDNA克隆 |
| 3.2.5.1 病毒核酸的抽提 |
| 3.2.5.2 病毒核酸性质鉴定 |
| 3.2.5.3 病毒核酸样品的纯化 |
| 3.2.5.4 随机引物合成cDNA |
| 3.2.5.5 pMD18-T转化和阳性克隆的筛选 |
| 3.2.5.6 DsRNA末端序列的扩增 |
| 3.2.6 序列拼接及分析 |
| 3.2.7 病毒粒子提取与观察 |
| 3.2.8 SDS-PAGE凝胶的制备及病毒粒子结构蛋白的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 A105 菌株中病毒的核酸类型和dsRNA的 c DNA合成 |
| 3.3.2 A105 菌株中两条dsRNA片段的全基因组序列 |
| 3.3.3 蛋白质序列比较和系统进化分析 |
| 3.3.4 病毒粒子的负染观察及核酸检测 |
| 3.3.5 病毒粒子结构蛋白 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 水稻纹枯病菌D122 菌株中dsRNA的全长c DNA克隆与序列分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 真菌菌株及培养基 |
| 4.2.2 载体和引物 |
| 4.2.3 酶及其他试剂 |
| 4.2.4 仪器和设备 |
| 4.2.5 全基因组cDNA克隆 |
| 4.2.5.1 病毒核酸的提取和dsRNA样品纯化 |
| 4.2.5.2 随机引物合成cDNA |
| 4.2.5.3 pMD18-T转化和阳性克隆的筛选 |
| 4.2.5.4 DsRNA末端序列的扩增 |
| 4.2.5.5 序列拼接及分析 |
| 4.2.6 D122菌株中的病毒粒子 |
| 4.2.6.1 病毒粒子提取与观察 |
| 4.2.6.2 病毒粒子核酸检测 |
| 4.2.7 Northern杂交 |
| 4.2.7.1 探针的制备和标记 |
| 4.2.7.2 定量标记反应效率 |
| 4.2.7.3 DsRNA样品的电泳 |
| 4.2.7.4 DsRNA的转膜和固定 |
| 4.2.7.5 Northern杂交 |
| 4.2.7.6 免疫检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 D122 菌株中病毒的核酸类型和病毒dsRNA的 c DNA合成 |
| 4.3.2 D122 菌株中两条dsRNA片段的全基因组序列结构分析 |
| 4.3.3 蛋白质序列比较和系统进化分析 |
| 4.3.4 病毒粒子的负染观察及核酸检测 |
| 4.3.5 RsRV5病毒粒子结构蛋白 |
| 4.3.6 D122菌株中病毒cDNA序列的验证 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 真菌病毒RsRV5的转染和脱除 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试菌株及其培养基 |
| 5.2.2 酶及试剂 |
| 5.2.3 仪器和设备 |
| 5.2.4 水稻纹枯病菌原生质体的制备 |
| 5.2.4.1 酶液的配制 |
| 5.2.4.2 菌丝体的培养 |
| 5.2.4.3 原生质体的制备 |
| 5.2.5 RsRV5的转染 |
| 5.2.5.1 对峙培养法转染 |
| 5.2.5.2 病毒粒子转染 |
| 5.2.6 RsRV5的脱除 |
| 5.2.6.1 菌丝尖端法 |
| 5.2.6.2 病毒抑制剂和菌丝尖端结合法 |
| 5.2.6.3 菌丝碎段法 |
| 5.2.6.4 原生质体再生法 |
| 5.2.7 病毒RsRV5的转染和脱除检测 |
| 5.2.8 RsRV5对寄主真菌的影响 |
| 5.2.8.1 衍生菌株D122-P培养性状的测定 |
| 5.2.8.2 衍生菌株D122-P致病力的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 RsRV5的转染和脱除检测结果 |
| 5.3.2 衍生菌株D122-P生物学性状的测定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 水稻纹枯病菌等基因系的带毒D122和不带毒D122-P的转录组分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试菌株和培养基 |
| 6.2.2 酶和其他试剂 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.2.4 测序样品制备及Hiseq3000测序 |
| 6.2.4.1 总RNA提取与质量检测 |
| 6.2.4.2 文库构建 |
| 6.2.4.3 Hiseq3000测序 |
| 6.2.5 生物信息学分析 |
| 6.2.5.1 基因组注释整理及表达量分析 |
| 6.2.5.2 差异表达基因分析 |
| 6.2.5.3 差异表达GO富集分析和PATHWAY富集分析 |
| 6.2.5.4 差异表达基因聚类分析 |
| 6.2.5.5 可变剪切分析 |
| 6.2.5.6 SNV和 InDel分析 |
| 6.2.6 荧光定量qRT-PCR验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 总RNA质量检测 |
| 6.3.2 测序数据质量分析 |
| 6.3.2.1 数据质量统计 |
| 6.3.2.2 数据质量评估 |
| 6.3.3 与参考基因组比对分析 |
| 6.3.4 基因表达分析 |
| 6.3.5 RNA-seq整体质量评估 |
| 6.3.6 基因表达水平对比 |
| 6.3.7 基因差异表达分析 |
| 6.3.8 可变剪接分析 |
| 6.3.9 SNV/InDel在基因组功能区分布 |
| 6.3.10 荧光定量qRT-PCR验证 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文讨论与结论 |
| 7.1 关于水稻纹枯病菌中新dsRNA真菌病毒的快速有效筛选 |
| 7.2 关于水稻纹枯病菌A105 菌株中的dsRNA病毒及其分类 |
| 7.3 关于水稻纹枯病菌D122 菌株中的dsRNA病毒及其分类 |
| 7.4 关于水稻纹枯病菌D122 菌株中的dsRNA病毒与寄主真菌的互作 |
| 7.5 本研究的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 本文中用到的部分试剂的配方 |
| 附录 B 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 (Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 NNV的研究历史 |
| 1.2 NNV的命名、分类和分布 |
| 1.3 NNV的基因组结构特征 |
| 1.4 NNV编码的蛋白与主要功能 |
| 1.4.1 RNA聚合酶 |
| 1.4.2 B1蛋白 |
| 1.4.3 B2蛋白 |
| 1.4.4 衣壳蛋白 |
| 1.5 NNV的检测、流行病学和感染模式的建立 |
| 1.6 高通量测序技术在水产动物病毒研究中的应用 |
| 1.6.1 转录组测序技术 |
| 1.6.2 小RNA深度测序技术 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 RGNNV感染GF-1 细胞的microRNA表达谱研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 GF-1 细胞的培养 |
| 2.1.5 细胞样品的收集 |
| 2.1.6 总RNA提取 |
| 2.1.7 总RNA样品质量检测 |
| 2.1.8 solexa高通量测序 |
| 2.1.9 测序数据处理与分析 |
| 2.1.10 qRT-PCR验证差异表达miRNA |
| 2.1.11 RT-PCR和qRT-PCR检测novel miRNA |
| 2.1.12 miRNA mimic转染 |
| 2.1.13 病毒基因的qRT-PCR检测 |
| 2.1.14 病毒基因的Western blot检测 |
| 2.1.15 统计学方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA样品的提取和质量鉴定 |
| 2.2.2 测序质量分析与产量统计 |
| 2.2.3 小RNA长度分布 |
| 2.2.4 小RNA分类统计 |
| 2.2.5 与斑马鱼基因组比对结果 |
| 2.2.6 已知miRNA的鉴定和新miRNA的预测 |
| 2.2.7 miRNA家族分析 |
| 2.2.8 miRNA表达量分析 |
| 2.2.9 miRNA差异表达分析 |
| 2.2.10 RT-PCR和qRT-PCR验证测序结果 |
| 2.2.11 miRNA靶基因预测及注释 |
| 2.2.12 差异表达miRNA靶基因GO及KEGG富集分析 |
| 2.2.13 参与宿主免疫调控的miRNA潜在靶基因分析 |
| 2.2.14 转染miRNA mimic对RGNNV复制影响的初步研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 RGNNV感染GF-1 细胞的转录组研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒与细胞 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 GF-1 细胞的培养 |
| 3.1.5 细胞样品的收集 |
| 3.1.6 总RNA提取 |
| 3.1.7 总RNA样品质量检测 |
| 3.1.8 solexa高通量测序 |
| 3.1.9 测序数据处理与分析 |
| 3.1.10 Caspase-3，-8，-9 活性检测 |
| 3.1.11 统计学方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA样品质量检测 |
| 3.2.2 测序产量统计与质量分析 |
| 3.2.3 转录组测序文库质量评估 |
| 3.2.4 De novo序列组装结果 |
| 3.2.5 Unigene功能注释 |
| 3.2.6 Unigene表达量分析 |
| 3.2.7 差异表达基因 (DEG) 筛选 |
| 3.2.8 差异表达基因 (DEG) 功能注释 |
| 3.2.9 凋亡通路相关的unigene分析以及qRT-PCR验证 |
| 3.2.10 Caspase-3，-8，-9 活性检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RGNNV感染SSN-1 细胞的转录组研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 SSN-1 细胞的培养 |
| 4.1.5 细胞样品的收集 |
| 4.1.6 总RNA提取 |
| 4.1.7 总RNA样品质量检测 |
| 4.1.8 solexa高通量测序 |
| 4.1.9 测序数据处理与分析 |
| 4.1.10 SSN-EndoG序列特征和进化分析 |
| 4.1.11 SSN-EndoG的克隆、重组质粒的构建及转染 |
| 4.1.12 RGNNV感染或过表达EndoG诱导SSN-1 细胞凋亡的观察 |
| 4.1.13 免疫荧光检测EndoG在SSN-1 细胞中的表达 |
| 4.1.14 统计学方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNA样品质量检测 |
| 4.2.2 测序产量统计与质量分析 |
| 4.2.3 De novo序列组装结果 |
| 4.2.4 Unigene功能注释 |
| 4.2.5 差异表达基因 (DEG) 筛选 |
| 4.2.6 差异表达基因的GO功能分类 |
| 4.2.7 差异表达基因的KEGG通路分析 |
| 4.2.8 与凋亡通路有关的差异表达基因分析及qRT-PCR验证 |
| 4.2.9 SSN-EndoG的序列分析 |
| 4.2.10 RGNNV感染或过表达EndoG可以诱导SSN-1 细胞的凋亡 |
| 4.2.11 RGNNV感染可以诱导SSN-1 细胞中EndoG的大量表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 RGNNV感染GF-1 和SSN-1 细胞的转录组比较研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 GF-1 和SSN-1 细胞转录组测序组装结果比较 |
| 5.2.2 GF-1 和SSN-1 细胞转录组unigene注释及功能富集比较 |
| 5.2.3 RGNNV感染前后GF-1 和SSN-1 细胞的DEG比较 |
| 5.2.4 RGNNV感染GF-1 和SSN-1 细胞凋亡途径相关的unigene比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 斜带石斑鱼GF-1 细胞和纹月鳢SSN-1 细胞unigene的同源物种分析 |
| 5.3.2 已有 NNV 感染相关的转录组测序比较 |
| 5.3.3 RGNNV诱导GF-1 和SSN-1 细胞凋亡途径的比较 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 鳜脑细胞CPB及鳜对RGNNV敏感性的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要试剂及仪器 |
| 6.1.3 主要试剂的配制 |
| 6.1.4 CPB细胞的培养 |
| 6.1.5 RGNNV的分离 |
| 6.1.6 RT-PCR检测RGNNV |
| 6.1.7 RGNNV感染CPB细胞的形态学观察和RT-PCR验证 |
| 6.1.8 qRT-PCR检测RGNNV在CPB细胞上的增殖 |
| 6.1.9 RGNNV诱导CPB细胞凋亡的检测 |
| 6.1.10 眼球注射检测鳜对RGNNV的敏感性 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 石斑鱼病料RGNNV检测 |
| 6.2.2 CPB细胞对RGNNV敏感 |
| 6.2.3 RGNNV感染可以诱导CPB细胞的凋亡 |
| 6.2.4 RGNNV可以感染鳜脑组织并造成鳜游泳异常 |
| 6.2.5 H&E染色可见鳜脑组织的空泡化 |
| 6.2.6 电镜观察可见鳜脑组织中的RGNNV病毒粒子 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 斜带石斑鱼GF-1 细胞已知miRNA统计 |
| 附录2 斜带石斑鱼GF-1 细胞新预测miRNA统计 |
| 附录3 斜带石斑鱼GF-1 和GS细胞中鉴定到的已知miRNA比较 |
| 附录4 比较斜带石斑鱼和其它代表性动物的miRNA种类 |
| 附录5 RGNNV感染后 3 h GF-1 细胞中的差异表达miRNA |
| 附录6 RGNNV感染后 24 h GF-1 细胞中的差异表达miRNA |
| 附录7 免疫相关KEGG通路的斜带石斑鱼miRNA靶基因分析 |
| 附录8 SSN-1 转录组KEGG通路列表 |
| 附录9 RGNNV感染SSN-1 细胞后DEG的KEGG通路 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文常用缩写词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 新型鸭呼肠孤病毒的研究进展 |
| 1.1.1 病原学特点 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 病理表现 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 LAMP技术研究进展 |
| 1.2.1 RT-LAMP技术的概述 |
| 1.2.2 RT-LAMP技术原理 |
| 1.2.3 RT-LAMP产物的检测方法 |
| 1.2.4 RT-LAMP技术优点 |
| 1.2.5 RT-LAMP检测技术的应用 |
| 1.3 核酸试纸条技术研究进展 |
| 1.3.1 核酸试纸条检测原理 |
| 1.3.2 核酸试纸条技术的优点 |
| 1.3.3 核酸试纸条技术的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与筛选 |
| 2.2.2 NDRV阳性质粒的构建 |
| 2.2.3 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的建立 |
| 2.2.4 NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法的建立 |
| 2.2.5 可视化RT-LAMP及核酸试纸条检测方法临床应用研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 引物设计和筛选 |
| 3.1.1 引物保守性 |
| 3.1.2 引物特异性 |
| 3.1.3 引物的比对及筛选 |
| 3.1.4 NDRV RT-LAMP反应的最佳引物 |
| 3.2 NDRV阳性质粒构建结果及分析 |
| 3.3 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的建立及分析 |
| 3.3.1 NDRV RT-LAMP反应条件的优化 |
| 3.3.2 NDRV RT-LAMP反应体系优化 |
| 3.3.3 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP反应最佳反应体系和反应条件 |
| 3.3.4 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法产物的酶切鉴定 |
| 3.3.5 NDRV RT-LAMP方法的特异性分析 |
| 3.3.6 NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的敏感性测定及对比分析 |
| 3.4 NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法的建立及分析 |
| 3.4.1 建立NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法反应体系和反应条件 |
| 3.4.2 NDRV RT-LAMP核酸试纸条方法的敏感性分析 |
| 3.5 两种NDRV RT-LAMP检测方法的临床应用研究结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的诊断方法应用现状 |
| 4.2 两种RT-LAMP检测方法的特点及评价 |
| 4.3 靶基因的选择 |
| 4.4 RT-LAMP引物的设计及筛选 |
| 4.5 RT-LAMP反应条件的优化 |
| 4.5.1 反应温度 |
| 4.5.2 反应时间 |
| 4.5.3 钙黄绿素和锰离子比例优化 |
| 4.5.4 Mg~(2+)浓度优化 |
| 4.5.5 甜菜碱浓度优化 |
| 4.5.6 dNTPs浓度优化 |
| 4.5.7 Bst DNA聚合酶浓度优化 |
| 4.5.8 环引物 |
| 4.5.9 内外引物比例的优化 |
| 4.6 RT-LAMP特异性分析 |
| 4.7 RT-LAMP方法的灵敏度分析 |
| 4.8 两种RT-LAMP检测方法的临床应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表和录用的论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
