晏婧[1]（2021）在《人胚骨骼干祖细胞的起源研究》文中研究说明骨骼干细胞（Skeletal stem cells,SSCs）是一群具有自我更新并分化产生软骨细胞、成骨细胞和基质细胞“三谱系”的组织特异性干细胞。作为骨发育过程中的重要事件,越来越多的证据表明骨骼干细胞在骨骼发育和损伤修复过程中发挥重要作用,其起源及表型和功能富集一直受到广泛关注。通过目的分选和遗传谱系示踪研究,多潜能和自我更新的骨骼干细胞陆续在早期出生后小鼠生长板、静息区和骨膜中鉴定出来。最新研究显示,骨骼干细胞也存在于17周的人类胎儿长骨生长板中。然而,骨骼干细胞在人类早期胚胎中的起源、分子特征及其调控机制仍不清楚。在本研究中,首先,我们选取了初级骨化中心发生前后,孕5周人类胚胎上下肢芽及孕8周四肢长骨进行单细胞转录组高通量测序。肢芽和长骨的整合分析鉴定发现了16个主要细胞类群。其中肢芽样本富集显着异质性的间质细胞和上皮细胞类群,且通过已知的标志基因我们在转录组上进一步将肢芽沿着近端-远端和前端-后端轴进行匹配分析;而长骨样本则富集软骨细胞和成骨前体细胞类群。此外,根据非监督分层聚类分析、主成分分析及假时序分析,我们在肢芽和长骨样本中发现高表达TWIST2和PDGFRA的的成骨-软骨祖细胞（Osteo-chondrogenic progenitor,OCP）,提示最早的骨骼干祖细胞可能包含于其中。其次,我们通过对胚胎长骨的成骨-软骨祖细胞进一步分群聚类,在转录组上得到了3群干祖细胞类群,包括肢芽来源的TWIST2+间质细胞、高表达CXCL2和PDGFRA的骨髓基质细胞、以及一群具有分化为软骨细胞和成骨前体细胞潜能的胚骨骼干祖细胞（e SSPCs）。转录调控网络分析发现,胚骨骼干祖细胞富集转录因子FOXP1/2网络。免疫荧光染色进一步显示FOXP1/2+细胞主要定位于软骨膜外层和新生的初级骨化中心内部,这也与此前在小鼠中发现的软骨外膜前体细胞非常相似。随后,通过差异基因筛选,我们明确了一组用于分选富集胚骨骼干祖细胞群体的细胞表面标志物:PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+,并发现其具有较强的体外克隆形成能力。连续性克隆传代及体内外分化实验证明,胚骨骼干祖细胞具有自我更新和成软骨、成骨分化潜能,但无法维持造血微环境。此外,我们对孕8周人类胚胎脑颅骨进行了单细胞转录组测序,发现了一群同样具有相似表型:PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+的神经嵴源性细胞（Neural crest derived cells,NCDCs）,其同样富集FOXP1/2转录因子网络,并在颅骨矢状缝和软骨膜内富集,暗示这群神经嵴源性细胞可能在颅骨发育和膜内成骨过程中发挥重要作用。综上所述,本研究首次绘制了早期人类胚胎骨骼形成过程中的单细胞图谱,是国际上首次针对早期人类胚胎骨骼干细胞起源的研究,从转录组和功能学层面鉴定了一群位于软骨膜外层的胚胎骨骼干祖细胞（e SSPCs）,揭示了人胚骨骼生成过程中的细胞异质性和谱系层级,有助于深入理解人类骨骼发育及损伤修复机制,为骨骼再生障碍性疾病的治疗提供了新思路。
高田林[2]（2016）在《黄芪多糖三维立体培养小鼠MC-3T3-E1成骨细胞的生物学效应研究》文中指出随着社会老龄化的加重,骨质疏松等骨相关症状和疾病已经引起社会的广泛关注和重视,骨健康已经成为社会关注的一个焦点。同时,由于车祸等物理损伤以及骨肿瘤术后造成的骨缺损均需要人体进行合理的膳食来促进骨组织的再生和修复。黄芪已经作为食疗方剂的一部分进入到人们的生活中。其主要成分黄芪多糖,已被证明具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、治疗糖尿病、抗病毒、保肝、抗炎和促进造血等生物学效应。本研究旨在通过体外细胞学替代法评价黄芪多糖对骨组织生长分化的生物学效应。第一部分,本研究选择了小鼠成骨细胞系MC-3T3-E1作为体外评价的细胞模型,通过24h细胞毒性实验,检测黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞的半抑制浓度（IC50）为12.22mg/m L。通过细胞的IC50设置了实验浓度梯度为0.001、0.01、0.1和1mg/m L。通过CCK-8检测MC-3T3-E1细胞增殖发现黄芪多糖在0.001-0.1mg/m L浓度范围内随着浓度的升高表现出明显促进成骨细胞增殖的作用。而在ALP活性和钙沉积方面,黄芪多糖组表现出了促进细胞ALP活性和钙结节生成的作用。同时通过RT-PCR检测MC-3T3-E1细胞成骨相关基因的表达和激光免疫荧光共聚焦观察发现,黄芪多糖能够提高MC-3T3-E1细胞Runx2、OPN、OCN基因的表达水平和促进Col-I的分泌。总之,黄芪多糖表现出了一定的促进MC-3T3-E1成骨细胞增殖和分化的作用,进而说明黄芪多糖能够促进骨组织的再生。第二部分,本研究尝试建立以微载体为基础的三维立体培养评价方法。首先通过静电滴注装置和海藻酸钠分子辅助固型,制备了以明胶分子为主体的细胞微载体。通过对接收液Ca Cl2的浓度、明胶/海藻酸钠溶液浓度、电压、注射器针头与接收装置的距离以及注射器针头内径的探索,我们制备出球形规则,粒径大小均一的明胶/海藻酸微载体。用于后期评价的微载体制备条件为:Ca Cl2浓度为0.1M、明胶/海藻酸混合溶液浓度为12%、电压为10Kv、注射器针头与接收装置的距离为10cm、注射器针头内径0.6mm。第三部分,在制备出大量细胞微载体后,本研究建立了细胞/微载体三维立体培养方法,即将细胞接种于微载体表面进行三维立体培养,并评价了黄芪多糖在该培养条件下对MC-3T3-E1成骨细胞的生物学效应。发现在细胞增殖方面,该条件下黄芪多糖组的细胞增殖表现出,培养1d时没有明显的促进细胞增殖的作用,培养3d后表现出一定的促进细胞增殖的作用,但是在1mg/m L浓度时有所减弱。细胞在微载体表面生长良好,呈现成骨细胞的长梭形形态。通过p NPP检测ALP活性发现,黄芪多糖组在该培养条件下表现出了促进细胞ALP活性的作用。同时通过RT-PCR检测成骨相关基因的表达发现,黄芪多糖能够促进成骨细胞Runx2、OPN和OCN的表达水平。因此,黄芪多糖在细胞/微载体培养条件下表现出了一定的促进MC-3T3-E1成骨细胞增殖和分化的作用;同时由于该三维立体培养有利于细胞间的相互接触和保持稳定的微环境,该培养方法具备应用于体外替代动物实验进行生物学评价的潜力。第四部分,本研究建立了细胞@微载体三维立体培养方法,即将细胞包被于微载体的内部进行三维立体培养,并评价了黄芪多糖在该条件下对MC-3T3-E1成骨细胞的生物学效应。通过CCK-8检测细胞增殖发现,该条件下黄芪多糖组的细胞增殖表现出,在培养早期没有明显的促进增殖的作用,培养3d后表现出一定的促进细胞增殖的作用。在ALP活性方面,黄芪多糖组在该条件下表现出了促进细胞ALP活性的作用。同时通过成骨相关基因的表达检测发现,黄芪多糖能够促进成骨细胞Runx2、OPN和OCN的表达水平。同样说明了黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖和分化的促进作用;同时由于该三维培养条件下,细胞在微载体内部更接近其在机体组织中的状态,该三维立体培养方法也具备应用于体外替代动物实验评价食品提取物生物学活性的潜力。第五部分,本研究通过MC-3T3-E1成骨细胞的增殖、ALP活性和不同阶段成骨相关基因表达的检测,比较了不同培养条件下黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞生物学效应的特点。发现在细胞增殖方面,二维平面培养在早期比较明显,而细胞/微载体三维立体培养条件下在7d时的细胞增殖优于二维平面培养,说明细胞/微载体三维立体培养方法适合中长期的生物效应评价。而细胞@微载体三维立体培养方法表现出了相对较弱的细胞增殖速率,但是亦能说明黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞增殖的促进作用。在细胞成骨分化方面,两种动态培养条件下的细胞ALP活性和成骨相关基因的表达更为明显,尤其是细胞@微载体培养条件下,各实验组均表现出明显优于二维平面培养的ALP活性以及成骨相关基因的表达。说明三维培养条件下更利于评价黄芪多糖对成骨分化的作用。综上所述,三种培养方法均可用于体外评价黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞生物学效应的研究,二维平面培养在早期细胞增殖方面最明显,细胞/微载体三维立体培养适合中长期的评价,细胞@微载体三维立体培养在细胞分化方面表现最优。
张力[3]（2012）在《骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨分化及引导性骨再生的研究》文中研究指明目的：本实验拟以成肌细胞和骨碎补总黄酮（assemble flavone of rhizome drynaria，AFDR）为研究对象，探讨AFDR对体外培养转睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophicfactor, CNTF）基因的成肌细胞增殖、成骨细胞分化的影响及AFDR促进其向成骨细胞诱导分化的作用机制；并将AFDR含药血清预处理的转CNTF成肌细胞微囊化处理达到免疫隔离效果，与负载骨形态发生蛋白（Bone morpnogenetic protein,BMP）的透明质酸（Hyaluronicacid,HA）钠凝胶载体、引导性骨再生（guided bone regeneration,GBR）膜——硅胶管联合构建新型组织工程化人工骨，通过动物在体实验观察引导性骨再生（GBR）促进骨缺损修复的效果；评价成肌细胞作为新型种子细胞、AFDR作为新型成骨诱导因素应用于骨组织工程学研究的可行性。材料与方法：第一部分转染CNTF基因促进大鼠成肌细胞去分化的实验研究取新生5d清洁级Wistar大鼠4只，采用改良法体外分离、培养、纯化成肌细胞，并进行鉴定备用。应用质粒快速提取盒提取CNTF质粒DNA，通过阳离子脂质体法介导转染大鼠成肌细胞影响其分化过程，促使其保持去分化的干细胞状态，并对转染细胞的细胞活性、表达情况和细胞分化率等进行相关检测，结果进行统计学处理；第二部分骨碎补总黄酮促进转CNTF成肌细胞向成骨分化的实验研究及机制探讨取健康12月龄雌性Wistar大鼠20只，随机分为高、中、低剂量给药组及空白血清对照组，每组5只，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”给予AFDR灌胃，无菌条件下由腹主动脉取血、离心、取上清、灭活补体、抽滤除菌制备不同浓度AFDR含药血清；将转CNTF成肌细胞按实验设计分为A、B、C、D、E5组分别加入相应培养液进行预处理，其中A组（高浓度AFDR组）：培养液为高浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；B组（中浓度AFDR组）：培养液为中浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；C组（低浓度AFDR组）：培养液为低浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；D组（空白血清组）：培养液为空白血清+成骨诱导剂；E组（标准培养液组）：培养液为完全培养液。连续培养21天，观察预处理后转CNTF成肌细胞的增殖、成骨分化情况，进行MTT测定，碱性磷酸酶、茜素红、I型胶原染色观察，骨钙素、钙沉积量、ALP比活性等成骨标志物检测及成骨、成脂相关基因测定，并进行统计学分析。第三部分微囊化骨碎补总黄酮预处理转CNTF成肌细胞促进引导性骨再生的实验研究取第二部分中C组培养液（低浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂）对转CNTF成肌细胞进行成骨诱导分化，行相关检测后继续培养备用。对上述转CNTF成肌细胞及AFDR预处理的转CNTF成肌细胞进行微囊化处理，测定细胞存活率。取清洁新西兰大白兔24只行桡骨缺损造模，根据处置条件随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，每组6只动物，以硅胶管为GBR膜，分别植入不同的移植物，其中Ⅰ组为AFDR预处理转CNTF成肌细胞微囊与负载BMP的HA凝胶组，Ⅱ组为转CNTF基因成肌细胞微囊与负载BMP的HA凝胶组，Ⅲ组为仅负载BMP的HA凝胶组，Ⅳ组为仅注入HA凝胶组，术后进行大体观察、X线测定及组织学染色的检测，并进行统计学分析。结果：1.采用改良方法可获得生长状态良好的成肌细胞，通过扫描电镜及结蛋白抗体染色鉴定呈阳性；通过实验可成功提取CNTF质粒并转染大鼠成肌细胞，转染CNTF的成肌细胞能分泌表达CNTF mRNA，其细胞分化率下降而处于去分化状态。2.实验成功获取高、中、低浓度AFDR含药血清及空白血清；采用不同浓度AFDR含药血清（包括空白血清）对转CNTF成肌细胞进行预处理，并与标准培养液培养的转CNTF成肌细胞进行观察比较。（1）倒置相差显微镜下观察：培养过程中AFDR预处理的转CNTF成肌细胞大多向梭形、多角形转化，有的带有数个突起，在继续培养过程中逐渐形成多个散在的岛状致密细胞群结构，细胞密集成旋涡状，中间细胞排列紧密模糊，逐渐被含有高折射的空泡和深色颗粒的基质包埋形成白色钙化结节，其中以低浓度AFDR含药血清组最为明显；（2）MTT结果显示：不同处理组中转CNTF成肌细胞随着时间迁移均呈现不同程度的增殖，在第5-6天时达到增殖高峰，第7天开始呈现下降趋势。在同一时间点上，在低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组OD值高于标准培养液组（p＜0.05），其中低浓度AFDR含药血清组的作用最强；（3）碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Ⅰ型胶原的免疫组化染色结果显示：除标准培养液组染色呈阴性外，其余各组转CNTF成肌细胞的胞质中均分别出现紫黑色颗粒或块状沉淀、橘红色的沉淀、棕黄色颗粒沉淀，呈相应染色阳性，而且以低浓度AFDR组反应最强，高浓度AFDR组最弱，中浓度AFDR组与空白血清组相当；（4）成骨细胞标志物检测显示：①OCN含量在细胞培养第7d时，五组间差异没有统计学意义（p＞0.05），在培养第14d和第21d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组中OCN分泌量均高于标准培养液组，低浓度AFDR组OCN分泌量明显高于中浓度AFDR组、空白血清组，差异有统计学意义（p＜0.05）；在不同时间点同组之间进行比较发现，除高浓度AFDR组和标准培养液组外，其余三组中第21dOCN分泌量均明显高于第14d、第7dOCN分泌量，且第14d OCN分泌量亦高于第7dOCN分泌量；②钙沉积量测定在培养第3d、6d、9d时，五组间差异没有统计学意义（p＞0.05）；在第12d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组中钙沉积量均高于空白血清组、标准培养液组，而低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组3组间中钙沉积量及空白血清组、标准培养液组2组间中钙沉积量均没有统计学差异；在培养第15d、18d和第21d时，五组间差异均有显着性意义（p＜0.01），进一步两两比较，培养第15d、18d和第21d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组中钙沉积量均高于标准培养液组，而且空白血清组亦钙沉积量均高于标准培养液组；③ALP比活性测定在不同时间点进行不同处理组间方差分析结果显示，在培养第1d、3d时，五组间差异没有统计学意义（p＞0.05）；在第7d、11d、14d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组中ALP比活性均明显高于高浓度AFDR组、标准培养液组，且低浓度AFDR组ALP比活性明显高于中浓度AFDR组、空白血清组，差异有统计学意义（p＜0.05），中浓度AFDR组、空白血清组中ALP比活性差异没有统计学意义（p＞0.05）；高浓度AFDR组与标准培养液组中ALP比活性均极低，且差异没有统计学意义（p＞0.05）。（5）在第14d时检测5组Cbfa1mRNA、ALP mRNA、PPARγ mRNA表达，结果显示各组间差异均有显着性意义（P＜0.05或P＜0.01），以低浓度AFDR组对转CNTF成肌细胞向成骨细胞分化过程中Cbfa1mRNA、ALP mRNA、PPARγ mRNA表达的影响最为显着。即低浓度AFDR（按AFDR67.5mg/kg.d给药）组成骨相关因子Cbfa1mRNA、ALP mRNA表达最高，成脂相关因子PPARγ mRNA表达最低。3.微囊化细胞体外存活良好，微囊外形完整无粘连，大小较均一，囊内细胞清晰可见；动物在体实验中Ⅰ组微囊化AFDR预处理转CNTF成肌细胞与BMP因子组引导性再生促进骨缺损修复的各项指标均优于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组3组，组间差异均有显着性，p<0.05。结论：1.应用CNTF基因转染成肌细胞能够抑制成肌细胞体外成肌分化，保持成肌细胞去分化状态，为成肌细胞被用作组织工程研究的种子细胞提供理论基础。2.转CNTF成肌细胞在体外经成骨诱导剂诱导后能够转化为成骨前体细胞。3.AFDR含药血清可显着促进转CNTF成肌细胞的体外增殖和成骨分化，提示AFDR具有开发为促进骨折愈合、抗骨质疏松新药的潜力。4.AFDR含药血清促进转CNTF成肌细胞体外增殖和成骨分化均以低浓度AFDR含药血清作用最强，而高浓度AFDR含药血清抑制其增殖、分化，说明AFDR对转CNTF成肌细胞体外增殖和成骨分化与其浓度相关。5.AFDR含药血清促进转CNTF成肌细胞体外成骨分化机制与其在成骨分化过程上调Cbfa1mRNA、ALP mRNA表达，下调PPARγ mRNA表达有关。6.AFDR和成肌细胞联合应用可促进骨缺损的修复，两者可应用于骨组织工程学研究。7.创新性的应用引导性骨再生理论将透明质酸钠凝胶和硅胶管的应用于骨缺损的修复可以取得良好的修复效果，且两者已应用于临床，可以作为良好的骨组织工程材料。
杨济洲[4]（2010）在《国新牌骨痛膏促进家兔骨愈合的实验研究》文中提出研究背景骨折是骨科临床的常见病和多发病,随着社会经济的发展,交通运输高度发达,而且中国逐渐迈入老龄化社会,骨折成高发态势。据统计约有5%-10%的骨折可因各种原因发生骨折迟缓性愈合及不愈合。目前,国外对于药物促进骨折愈合的研究较少,国内的研究也多侧重于中药内服,相对中药内服促进骨愈合而言,外用中药促进骨愈合的研究水平不高。中医药治疗骨折已有漫长的历史,经验丰富。1931年出土的《居延汉简》中就记录了汉代军医以膏药为主治疗各种创伤的方药和方法,可见早在秦汉时代应用敷贴治疗骨伤就已经很普遍了。因此利用现代分子生物学及细胞生物学深入研究并揭示外用中药治疗骨折的疗效及机制有重要的现实意义和社会意义。国新牌骨痛膏源自吉林省民间验方,为促进骨愈合的一种外用膏剂,在临床应用多年,疗效确切,治愈大量骨折、骨不连、骨坏死病人,但是作用机制仍不清楚,本研究拟通过检测血生化指标、X线评分、组织切片观察、胶原分型、骨形态发生蛋白（BMP-2）免疫组化、骨形态发生蛋白（BMP-2）原位杂交等方法验证其促进促进骨愈合的效果,从现代医学的角度探讨其促进骨愈合的的作用机制,进而从现代医学角度为外用中药促进骨愈合提供更为科学的依据。研究目的探讨国新牌骨痛膏促骨愈合效果,揭示其促进骨愈合的可能机理。研究方法将30只日本大耳白兔均以手术造成双桡骨中段宽约3mm、深达髓腔的骨缺损模型,术后观察日本大白兔的一般情况。再将造模成功的30只日本大耳白兔随机分成国新牌骨痛膏外用药组和空白对照组,再将每组15只随机分成三个亚组,即第1周取标本组（A组）、第2周取标本组（B组）、第4周取标本组（C组）,空白对照组以石膏固定,给药组外敷国新牌骨痛膏后以石膏固定,给药组每2天换一次药,1周处死A组,2周处死B组,4周处死C组。每组处死前均予耳缘静脉取血,检测血中ALP、钙、磷、镁浓度,两组行t检验；处死后拍摄双侧桡骨侧位X光片肉眼观察评分,A、B、C各组行t检验比较；病理学HE、Masson染色观察；Ⅰ、Ⅲ型胶原苦味天狼星染色后偏正光显微镜观察分析；免疫组化法检测桡骨缺损处骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP-2）的表达,测MOD值后A、B、C各组行t检验；原位杂交法检测桡骨缺损处骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP-2）的表达,测MOD值后A、B、C各组行t检验。研究结果术后各组实验兔的一般情况良好；术后1、2、4周时,生化指标检查：给药组与对照组血中ALP、钙、磷、镁及钙磷乘积值均无统计学差异；放射学检查：术后第1周给药组即有骨痂形成,对照组未见骨痂生长。术后第2周两组均可见骨痂形成,给药组骨折缺损区有较完全的骨痂填满并见大量外骨痂形成,对照组骨折缺损区可见软性骨痂填充,大部分无外骨痂。术后第4周给药组缺损区骨皮质重建,骨干外形恢复,髓腔再通,对照组缺损区骨痂基本填满,仍有连接性骨痂阴影,髓腔未通。各组X线片肉眼观察评分结果给药组的得分均高于空白对照组,统计学差异显着；病理学HE、Masson染色观察发现给药组第1周即出现骨痂,第2周外骨痂明显,第4周缺损部位骨痂中胶原明显减少,骨缺损修复质量好。对照组第1周时未见骨痂形成,第2周大部分无外骨痂,第4周缺损部位骨痂仍含有大量胶原,修复质量较给药组差；Ⅱ、Ⅲ型胶原苦味天狼星染色结果,给药组的Ⅰ型胶原出现较对照组早,且Ⅰ型胶原含量高；BMP-2免疫组化及原位杂交结果给药组BMP-2mRNA的表达出现时间早于对照组,表达程度明显优于对照组,统计学差异显着。结论（1）国新牌骨痛膏对血ALP、钙、磷、镁及钙磷乘积没有影响。（2）国新牌骨痛膏可以促进Ⅰ型胶原的表达。（3）国新牌骨痛膏可以调节BMP-2的合成、分泌并促进BMP-2的表达（4）国新牌骨痛膏可以使骨痂提前出现,提高骨愈合质量,缩短愈合时间,促进骨愈合
卓丽玲[5]（2009）在《钙、磷对体外培养SD大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化影响的研究》文中进行了进一步梳理随着人们对骨代谢疾病的重视,研究不同因子对成骨细胞（osteoblast,OB）的影响已成为当今热点。OB有形成骨骼、调节细胞外骨基质成分的构成以及骨基质矿化的功能。因此,OB功能状态与骨骼生长塑造、再造及骨质疏松的发展有着极其密切的联系。有些疾病可以通过增加OB的数量或增强OB的活性而引起骨量的增加。钙和磷是骨骼的重要物质成分,骨代谢过程必然涉及动物机体对钙、磷的吸收和代谢。摄入充足的钙、磷对保持动物的骨骼完好至关重要。体内钙、磷代谢的平衡和钙磷在细胞内、外液中浓度的稳定对维持正常骨代谢有重要作用。因此,建立一种快速获得OB的培养方法,研究钙、磷对OB体外增殖、分化及矿化的影响,对骨质疏松症的研究有重要的理论和指导意义。本试验选用5 d SD大鼠头盖骨作为试验用OB的来源,通过胰蛋白酶预消化后,剪碎,经Ⅱ型胶原酶消化获得细胞,采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、钙化结节染色鉴定,经台盼蓝染色、“反复贴壁法”纯化后,进行了成活率和纯度分析,用MTT法检测了一个生长周期内OB的活性分布,成功建立了SD大鼠头盖骨OB体外培养模型;在体外培养的基础上,在培养液中添加不同浓度的钙、磷及其比例,共分9组,分别为不添加任何成分的对照组、添加1、2、4 mmol/L钙组、添加1、2、4 mmol/L磷组、钙磷比1∶2（添加1 mmol/L钙+2 mmol/L磷）组和钙磷比2∶1（添加2 mmol/L钙+1 mmol/L磷）组。分别从OB的形态学、OB分泌ALP活性、OB分泌蛋白、Ⅰ型胶原（collagen type I,Col-I）)、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）的含量、OB表达ALP、Col-I、OPN、骨钙素（bone glaprotein,BGP）mRNA的含量及OB内Ca2+沉积及体外钙化等指标进行了分析,详细的研究了钙、磷及其比例对乳鼠头盖骨OB增殖、分化及矿化的影响。结果表明,①本试验培养的头盖骨OB,经ALP染色鉴定,并计数,OB纯度高达98.06%,台盼蓝染色计数分析,原代OB成活率为88.69%,传代的OB成活率高达94.12%,且在一个生长周期内,在第3、4 d进入对数生长期,细胞融合并开始重叠生长,在第7 d达到峰值,并进入钙化期,随后细胞进入衰减期。因此,本试验将选择在细胞融合时定为钙、磷处理OB的时间点,检测处理后第2、5、8 d的各种指标;②与对照组比较,添加钙各组均促进OB增殖,且有剂量效应,钙4 mmol/L从第2 d开始差异显着（P<0.05）,钙1、2 mmol/L从第5 d开始差异显着（P<0.05）,而钙磷比（2:1、1:2）只在第8 d差异显着（P<0.05）。而添加磷对OB增殖作用影响不明显。③与对照组比较,添加钙使OB胞体饱满,表面针状突起增多,形态结构无破损,细胞膜、核膜完整,线粒体轻度肿胀,添加磷及不同钙磷比使OB胞体扁平,针状突起减少,但形态结构无破损,细胞膜、核膜完整。④与对照组比较,添加钙、磷及其比例在第2、5、8 d均抑制细胞内ALP活性（P<0.05）,在第5 d抑制其mRNA的表达（P<0.01）,但在第2、8 d却促进其mRNA的表达（P<0.05）。⑤与对照组比较,添加钙、磷及其比例各试验组除1 mmol/L钙外,在第2 d均促进Col-I分泌（P<0.01）,钙各组和1 mmol/L磷在第5 d和钙各组和1、2 mmol/L磷和钙磷比（2:1）在第8 d均抑制其分泌（P<0.05或P<0.01）,在第2、8 d均促进其mRNA表达（P<0.01）,在第5 d除钙磷比（1:2）外均抑制其mRNA表达（P<0.01）。⑥与对照组比较,添加钙、磷及其比例作用后,各试验组均促进OPN mRNA的表达（P<0.01）,除第2 d钙1、2 mmol/L组外,均促进其分泌（P<0.05）。⑦与对照组比较,添加钙、磷及其比例作用后,各试验组均促进BGP mRNA的表达（P<0.01）。⑧与对照组比较,添加钙、磷及其比例作用后,各试验组均能促进OB内Ca2+的沉积及体外钙化。表明,钙（1、2、4 mmol/L）及钙磷比（1∶2 ,2∶1 ）能促进OB增殖、分化及体外钙化,利于新骨的形成。磷（1、2、4 mmol/L）能促进OB的分化及体外钙化,但对增殖作用不明显。
刘诚成[6]（2009）在《Indian hedgehog过表达对软骨细胞生物学影响的实验研究》文中提出目的:观察ExGen 500介导的Indian hedgehog（pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh）过表达对体外培养的人胚软骨细胞的生物学效应,并检测重组基因Ihh-eGFP对Ihh的功能是否具有影响。方法:1、通过基因克隆技术将Ihh目的基因构建入载体质粒pSNAV2.0中,另外运用重叠PCR技术将增强绿色荧光蛋白构建入pSNAV-Ihh载体质粒中。2、人胚软骨细胞的分离,培养并通过免疫组织化学和透射电镜观察鉴定。3、用ExGen 500将构建好的载体质粒pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh分别转染到培养的人胚软骨细胞模型中,以pSNAV空质粒为对照,通过绘制软骨细胞增殖曲线,MTT测细胞增殖活力,半定量RT-PCR测转染后软骨细胞内Ihh及其受体Ptc的mRNA的表达差异来研究Ihh对软骨细胞的生物学效应。结果:1、成功的构建了pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh两种克隆质粒,通过菌液PCR、测序检验所构建克隆无突变。2、成功分离、培养人胚软骨细胞,经过特殊染色、免疫组化染色鉴定所培养的人胚软骨细胞具有正常软骨细胞的特性。透射电镜观察证明所培养的软骨细胞具有正常软骨细胞的超微结构。3、经过绿色荧光显微镜检测到ExGen 500介导的pSNAV-Ihh-eGFP在体外培养的人胚软骨细胞内表达,转染效率约为35%。两试验组在细胞增殖、细胞活力及mRNA表达方面明显高于对照组（p<0.05）,而两实验组之间无明显差异（p>0.05）。结论:经ExGen 500介导的pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh在人胚软骨细胞内可达到35%的转染效率,转染体外培养的人胚软骨细胞后,在与细胞增殖有关的多个指标均有明显增高,证实Ihh对体外培养的人胚软骨细胞有促进其增殖作用。重组基因Ihh-eGFP不影响Ihh对体外培养人胚软骨细胞的功能。
来晓瑜[7]（2009）在《一个新的人间充质干细胞特异性表面抗原的鉴定和间充质干细胞亚群生物学特性的研究》文中研究说明间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,是当前干细胞研究领域的热点,在组织器官缺损性疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病、遗传缺陷等疾病的治疗中有着巨大的临床应用前景。随着MSCs临床应用的进程,对MSCs生物学特性的研究和认识提出了更高的要求。一直以来,骨髓MSCs被认为是骨髓单个核细胞中具有贴壁的特性、并可在体外培养增殖和诱导多向分化的非造血系统的干细胞。值得注意的是,迄今为止MSCs尚未发现有特异性的表面分子。目前国际公认的MSCs表型特征为:细胞表面CD73、CD90、CD105等抗原呈阳性,而CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等造血谱系分子表达阴性。由于缺乏鉴定细胞的特异性标志,导致对MSCs的生物学特征缺乏严格统一的定义,制约了对MSCs生物学特性的研究和认识,使得MSCs的检测、分离纯化以及应用均面临着巨大的难题。第1章人间充质干细胞特异性单克隆抗体及其抗原特征的鉴定为发现新的MSCs特异的表面标志,以期深入研究MSCs的生物学特性,本研究以培养的人骨髓MSCs为免疫原免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术研究制备了具有自主知识产权的入骨髓MSCs特异性单克隆抗体ZUB1（专利号:ZL200510061034.2）,并对ZUB1单克隆抗体及其识别抗原的生物学特性进行了深入研究。通过对抗体种属和组织细胞特异性鉴定,证实ZUB1单克隆抗体针对人MSCs有高度的特异性和敏感性,ZUB1可识别骨髓、脂肪组织、脐带组织和脐带血来源的MSCs,与大鼠、小鼠和兔骨髓MSCs均无交叉反应。Western-blot结果显示,ZUB1单克隆抗体识别一种分子量约为250KD的抗原分子,该种抗原在13种人血液系统恶性疾病细胞株和10种人实体组织细胞株均无表达。骨髓、脂肪组织、脐带组织和脐带血来源的MSCs在传代扩增过程中形态基本一致,流式细胞术检测传代扩增细胞表达ZUB1抗原的阳性率分别为97.58±0.68%、89.50±3.97%、96.63±1.23%、87.23±4.07%,此外CD29、CD44、CD105、CD166、CD146阳性标记出现单峰,CD3、CD14、CD19、CD34、CD117、CD133、CD45、CD235a、HLA-DR均表达阴性,传代细胞ZUB1抗原和其他各表面抗原表达均无显着性差异。当诱导骨髓MSCs向成骨细胞和脂肪细胞定向分化时,流式细胞检测显示ZUB1抗原表达相应减弱,提示ZUB1抗原可作为MSCs干细胞特征的标志分子,且可能参与了MSCs分化的细胞活动。为进一步鉴定ZUB1单克隆抗体识别的抗原表位,我们通过Western-blot实验证实ZUB1单克隆抗体识别的抗原分子量约为250KD,应用ZUB1单克隆抗体通过免疫沉淀的方法从人骨髓MSCs细胞裂解液中获取与ZUB1抗体特异性结合的蛋白质,ZUB1抗体蛋白复合物经SDS-PAGE电泳分离后切取蛋白质条带,质谱分析提示ZUB1单克隆抗体识别的分子量为250KD的抗原肽段为非肌性肌球蛋白-9重链（non-muscle myosin heavy chain 9,NMMHCⅡa）。生物信息学分析提示该类细胞骨架蛋白的同型异构体在不同组织和干细胞的不同分化阶段有不同的异构体的表达,MSCs特异的形态特征和细胞骨架结构与其多向分化潜能是相适应的。该研究进一步丰富了对骨髓MSCs特异性分子特征的认识,也为进一步研究MSCs分化等细胞活动提供了一个重要的线索。第2章ZUB1抗原阳性骨髓间充质干细胞亚群的鉴定和生物学特性的研究随着对体外培养MSCs的生物学特性认识的深入,研究者利用不同的表面分子分离骨髓单个核细胞以期进一步研究和鉴定骨髓原始MSCs及其不同亚群的生物学特性。利用ZUB1单克隆抗体,我们建立了ZUB1+骨髓MSCs的分离培养体系,并深入研究了ZUB1+骨髓MSCs亚群的生物学特性。应用ZUB1单克隆抗体通过免疫磁珠分选骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测分选后细胞纯度为61.52±6.69%,分选后获得的ZUB1+骨髓单个核细胞体积较小、核质比大,符合干细胞的形态学特征。ZUB1+骨髓单个核细胞培养3天后细胞贴壁呈梭形,5天后细胞扩增明显,梭形贴壁细胞增殖呈集落样分布,培养15天左右贴壁细胞达80%～90%汇合,细胞形态均一,且具有很好的增殖活性,细胞扩增至第8代细胞生长曲线无明显差异。流式细胞术分析显示ZUB1+骨髓单个核细胞贴壁培养后具有MSCs的表型特性,且可诱导向成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。因此,ZUB1单克隆抗体可用于分离富集ZUB1+骨髓MSCs亚群。一直以来MSCs缺乏特异性分子标志,目前尚无有效的指标可以鉴定骨髓中不同亚群的原始MSCs的含量。CFU-F可用于评估骨髓单个核细胞中MSCs集落的形成情况,也是目前用于评估骨髓中原始MSCs的数量的主要指标之一。将未分选的骨髓单个核细胞、及磁珠分选后ZUB1+和ZUB1-骨髓单个核细胞按2×104/cm2、1×103/cm2、2×104/cm2的细胞密度分别接种培养,细胞培养15d,ZUB1+骨髓单个核细胞形成CFU-F的数量和直径明显多于未分选的骨髓单个核细胞,而ZUB1-骨髓单个核细胞未见集落形成。按照每105单个核细胞计算ZUB1单克隆抗体分选骨髓单个核细胞的CFU-F富集指数（Enrichment Factor）为193.09±32.81,且ZUB1+骨髓MSCs增殖较快。为进一步分析ZUB1+骨髓MSCs的表型特征,对MSCs公认的一系列表面分子检测结果显示该类细胞的表型一致:CD29、CD105、CD166、CD146表达阳性,而CD3、CD14、CD19、CD33、CD235a、HLA-DR、CD45、CD34、CD133、CD117为阴性。由此,我们认为ZUB1单克隆抗体可有效地富集骨髓单个核细胞中的MSCs,ZUB1抗原可以作为研究骨髓原始MSCs的分子标志;ZUB1+骨髓MSCs体外培养增殖较快,并可多向分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。本研究制备了具有自主知识产权的抗入骨髓MSCs特异性单克隆抗体,并证实ZUB1抗原针对人MSCs有高度的特异性,可用于人MSCs的检测、鉴定以及富集骨髓中原始MSCs。ZUB1抗原为一种在MSCs中特异的细胞骨架蛋白,参与了MSCs定向分化的生命活动。骨髓细胞中ZUB1+骨髓单个核细胞作为一个新的骨髓MSCs亚群,丰富了对MSCs生物学特性的认识,并为MSCs的研究带来新契机。
顾建红[8]（2009）在《1α,25-（OH）2D3介导成骨细胞影响破骨细胞形成及活化的研究》文中进行了进一步梳理骨代谢是维持骨组织不断更新,保持生命活力的基本过程,这一过程是依靠骨再建（bone remodeling）完成的。大量研究表明,动物骨营养不良的发生主要是破骨细胞（osteoclasts,OC）引起的骨吸收大于成骨细胞（osteoblasts,OB）引起的骨再建。许多研究认为,骨代谢调控因子主要通过调节OB表达核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）及骨保护素（osteoprotegerin,OPG）,从而间接调控OC的形成及骨吸收功能。维生素D及其活性代谢物是动物钙、磷代谢的重要调节因素之一。然而,钙、磷及维生素D制剂的疗效却参差不齐。因此进一步理解维生素D在骨骼生理和病理学中的确切机制有助于更好地防止代谢性骨病。本文研究了不同浓度1α,25-（OH）2D3对体外培养OB增殖、分化及RANKL、OPG蛋白和mRNA表达的影响,并观察了RANKL对体外培养OC形成及骨吸收活性的影响,旨在阐明维生素D调节骨代谢的部分机制。1. 1α,25-（OH）2D3对体外培养成骨细胞增殖、分化及周期的影响2.5 g/L胰酶和1 g/LⅡ型胶原酶两步消化法分离3-4日龄SD大鼠乳鼠颅盖骨细胞。采用倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态,碱性磷酸酶（ALP）特异染色鉴定OB。在此基础上,向培养体系中添加不同浓度的1α,25-（OH）2D3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)。作用24、48、72 h,MTT法测定OB增殖率、PNPP法测定ALP活性,流式细胞仪测定OB周期。结果显示,10-9 mol/L 1α,25-（OH）2D3作用24、48、72 h均促进OB增殖（P<0.05或P<0.01）,抑制ALP活性（P<0.01）;10-8、10-7 mol/L作用24、48 h,OB增殖率与对照组差异不显着（P>0.05）,但24 h时ALP活性均明显升高（P<0.05或P<0.01）,48 h则抑制了ALP活性并使OB滞留在G2/M期（P<0.05或P<0.01）;72 h时10-7 mol/L组OB增殖率极显着低于其余各组（P<0.01）,并又使ALP活性升高（P<0.01）。说明,低浓度1α,25-（OH）2D3(10-9 mol/L)促进OB增殖,抑制其分化;中高浓度1α,25-（OH）2D3(10-8、10-7 mol/L)抑制OB增殖,促进其分化,并使细胞滞留在G2/M期。2. 1α,25-（OH）2D3对体外培养成骨细胞骨架、GJIC及[Ca2+]i的影响在OB培养的基础上,不同浓度的1α,25-（OH）2D3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)作用20 min、24 h,流式细胞仪测定[Ca2+]i;24、48 h,荧光显微镜观察F-actin及细胞间隙连接通讯（GJIC）。结果显示,20 min时,不同浓度1α,25-（OH）2D3组[Ca2+]i均显着高于对照组（P<0.05）;24 h时10-9 mol/L组[Ca2+]i则显着低于对照组（P<0.05）,其余各组间差异不显着（P>0.05）,此时10-8、10-7 mol/L组大部分细胞变得扁平,F-actin排列较对照组有序,形成应力纤维;48 h时,对照组及10-9 mol/L组F-actin表达减少,10-9 mol/L组GJIC极显着弱于对照组（P<0.01）,而10-8、10-7 mol/L组大部分细胞F-actin表达完好,GJIC均极显着强于其余两组（P<0.01）。说明,1α,25-（OH）2D3能够影响钙离子通道,同时低浓度1α,25-（OH）2D3(10-9 mol/L)抑制F-actin表达及细胞间隙连接通讯,中高浓度1α,25-（OH）2D3(10-8、10-7 mol/L)则能维持OB形态,增强细胞间隙连接通讯。3. 1α,25-（OH）2D3对体外培养成骨细胞超微形态结构的影响在OB体外培养的基础上,不同浓度1α,25-（OH）2D3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)处理48 h,扫描电镜、透射电镜观察OB超微形态结构。结果,与对照组比较,10-9 mol/L 1α,25-（OH）2D3组细胞铺展较好,表面针状突起、胞内线粒体增多;10-8 mol/L 1α,25-（OH）2D3组细胞趋于扁平,表面突起减少,变得细长,内质网增多;10-7 mol/L 1α,25-（OH）2D3组细胞外基质中大量丝状纤维连接成网状,细胞内线粒体较少,出现大量空泡及钙颗粒沉积。说明,低浓度1α,25-（OH）2D3(10-9 mol/L)能促进OB增殖,而中高浓度1α,25-（OH）2D3(10-8、10-7 mol/L)抑制OB增殖,促进细胞外胶原形成及基质矿化。4. 1α,25-（OH）2D3对体外培养成骨细胞RANKL及OPG表达的影响在OB体外培养的基础上,不同浓度1α,25-（OH）2D3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)作用24、48、72 h,分别采用ELISA及FQ-PCR法测定RANKL、OPG蛋白及mRNA含量。结果,10-8、10-7 mol/L 1α,25-（OH）2D3较对照组、10-9 mol/L组显着或极显着促进RANKL蛋白及mRNA的表达（P<0.05或P<0.01）;10-9、10-8 mol/L 1α,25-（OH）2D3在不同时间,较对照组显着或极显着促进OPG蛋白及mRNA的表达（P<0.05或P<0.01）,而10-7 mol/L则极显着抑制OPG mRNA表达（P<0.01）;最终,10-9 mol/L组48 h时RANKL/OPG比值增高（P<0.05）,10-8、10-7 mol/L 1α,25-（OH）2D3组RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值则始终高于对照组和10-9 mol/L组（P<0.01）。说明,1α,25-（OH）2D3可剂量依赖性地上调RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值,促进OC的生成及骨吸收功能,增强骨更新。5. RANKL对体外培养破骨细胞形成和活化的影响分离5-6周龄ICR小鼠长骨骨髓细胞,分两阶段培养。第一阶段分三组（A、对照组[不添加任何因子];B、50 ng/mL RANKL;C、25 ng/mL M-CSF）培养3 d,进入第二阶段（Ⅰ、对照组[不添加任何因子];Ⅱ、25 ng/mL M-CSF;Ⅲ、25 ng/mL M-CSF + 50 ng/mL sRANKL）继续培养。倒置显微镜观察细胞形态,酸性磷酸酶（ACP）染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及扫描电镜观察骨吸收陷窝,鉴定OC的生成及骨吸收活性,同时荧光显微镜观察F-actin。结果,第一阶段培养3 d,对照组和50 ng/mL RANKL组细胞均无贴壁及增殖能力,而25 ng/mL M-CSF明显促进细胞贴壁与增殖。第二阶段培养2 d,25 ng/mL M-CSF + 50 ng/mL RANKL组较25 ng/mL M-CSF组出现更多单核巨细胞,随着时间的延长单核巨细胞增多,出现2个核以上的巨细胞,且M-CSF存在的各组细胞均可表达ACP活性;培养9 d,25 ng/mL M-CSF + 50 ng/mL sRANKL组出现3个核的TRAP阳性OC（10.17±1.55个/孔）,OC数极显着高于对照组（0个/孔）和25 ng/mL M-CSF组（0.67±0.69个/孔）（P<0.01）。同时,sRANKL可诱导F-actin的表达,促进骨吸收陷窝的生成。说明,RANKL在M-CSF存在时可诱导OC的生成及骨吸收活性,但OC数量仍不多。
贾英民[9]（2009）在《补肾方药有效成分配伍对体外培养大鼠成骨细胞生物学活性的实验性比较研究》文中研究指明目的:骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种全身性代谢性骨病,是目前世界上发病率、死亡率及保健费用消耗较大的疾病之一。据统计全世界目前约有2亿人患有骨质疏松。骨质疏松症发病常“静悄悄”,“不知不觉”,一旦发现多已经发展到一定程度,因此越来越引起人们的重视。从细胞学水平上来研究骨质疏松的发病机理及其药效评价已经成为基础与临床研究的热点。成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡在维持骨的正常结构和代谢中具有重要作用。骨质疏松是由于骨吸收和骨形成解偶联,骨吸收大于骨形成导致骨量丢失而引起。大量资料显示:成骨细胞的增殖抑制、分化程度降低是造成骨质疏松的重要原因。中医药学（TCM）认为骨与肾的关系密切,其在预防和治疗骨质疏松及骨折方面存在着悠久的历史。祖国医学古典医籍《黄帝内经》中,有很多类似于骨质疏松的名称的记载,历代也有不少治疗骨质疏松的名方。本实验中补肾方药由熟地黄、淫羊藿、山药、丹参、骨碎补、独活组成。有效部位的单体化合物依次是梓醇、淫羊藿苷、薯蓣皂苷元、丹参酮ⅡA、柚皮苷、羟甲香豆素。细胞培养技术（Cell culture technique）,是生命科学研究中一个必不可少的技术。我们多次酶消化-贴块法对SD大鼠原代成骨细胞的体外培养,而获得足够数量的成骨细胞。首先观察成骨细胞在生长过程中的形态学变化,进而以体外培养的SD大鼠成骨细胞56代为实验对象,采用补肾方药不同单体配伍、生药配伍、淫羊藿苷单体进行成骨细胞干预性培养,在不同浓度、不同时间及不同配伍的情况下,采用噻唑蓝法（MTT）和对硝基苯二钠基质动力学法（pNPP）分别对大鼠成骨细胞的增殖与分化进行测定。通过比较和观察补肾方药不同配伍对成骨细胞的增殖和分化的影响,从而初步确定补肾方药及其组分配伍有效性及其有效浓度范围。方法:1、我们选用新生（<24h）SD大鼠颅盖骨为试验材料,采用多次酶消化-贴块法对大鼠原代成骨细胞的体外培养。倒置显微镜下对原代成骨细胞形态学变化进行观察;2、补肾方药的配伍分组:依据中医基础理论和方剂学配伍规律将补肾方药中“地黄+淫羊藿+山药”和“骨碎补+丹参+独活”各分为一类,即:“补药”（Tonics Medicine,TMed）和“泻药”（Cathartic Medicine,CMed）。“补药”（TMed）和“泻药”（CMed）分为生药（Crude Drug）（原药直接提取的成分）和单体（monomer）（有效化学成分）两种,称为“补药生药配伍组（crude Tonics Herbs Compatibility Groups,cTHCG）”和“泻药生药配伍组（crude Cathartic Herbs Compatibility Groups,cCDCG）”,分别用“CT”组和“CC”组表示;“补药单体配伍组（monomer Tonics Drug Compatibility Group,mTDCG）”和“泻药单体配伍组（monomer Cathartic Drug Compatibility Group,mCDCG）”分别用“MT”和“MC”表示。补肾方药的试验分组:分8组,①CT>CC组,②CT=CC组,③CT<CC组,④空白组（BlankGroup,BG）,⑤MT>MC组,⑥MT=MC组,⑦MT<MC组,⑧淫羊藿苷组（Icariin Monomer Group,IG）。3、补肾方药配伍的用药比例:“补药”（TMed）>“泻药”（CMed）:地黄:淫羊藿:山药:骨碎补:丹参:独活（2:2:2:1:1:1）;“补药”（TMed）=“泻药”（CMed）:地黄:淫羊藿:山药:骨碎补:丹参:独活（1:1:1:1:1:1）;“补药”（TMed）<“泻药”（CMed）:地黄:淫羊藿:山药:骨碎补:丹参:独活（1:1:1:2:2:2）;4、用噻唑蓝比色法（MTT）法测成骨细胞的增殖;加入浓度各为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml的补肾方药及中药单体;继续培养24h、28h、72h后,加入MTT 20μl,用酶标仪测定OD值,观察对大鼠成骨细胞增殖的影响。5、用对硝基苯二钠基质动力学法（pNPP）测定大鼠成骨细胞的分化;换上补肾方药及中药单体,加药浓度各为10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml后;继续培养24h、28h、72h后,吸弃培养液,加入0.25ml 0.1%Triton溶液,按试剂盒说明测定,结果以每克蛋白中碱性磷酸酶（ALP）的国际单位（U/g protein）表示,该方法通过对ALP含量的测定,进而可反映OB的分化情况。结果:1、多次酶消化-贴块法大鼠原代成骨细胞的体外培养的形态学观察1.1倒置显微镜下观察发现,原代成骨细胞由大鼠颅盖骨周爬出,贴壁、展开,呈多边形、三角形;刚接种的成骨细胞呈球形,24h内存活细胞已沉降贴壁,完全展开,呈三角形、梭状形,核明显增大;传代培养5天,细胞形态可见多样化;培养815天,可见长索性、多角形、条索形,汇合时细胞呈铺路石状,可重叠生长;15天后,可出现胶原堆积和钙盐沉积。1.2碱性磷酸酶染色可观察到成骨细胞酶活性部位呈现紫色细颗粒状。2、MTT法测定补肾方药对大鼠成骨细胞的增殖2.1与对照组相比,浓度为10ng/ml时,在24 h测定MT>MC组增高（P<0.05）;在48h测得CT>CC组, CT=CC组, MT>MC组,有明显促增殖作用（P<0.05）;在72 h浓度下,MT>MC组具有显着促增殖作用（P<0.05）;2.2与对照组相比,浓度为20ng/ml时,在24 h测定CT>CC组和MT>MC组有促增殖作用（P<0.05）;在48h测得CT>CC组、MT>MC组具有促增殖作用,以CT>CC组明显（P<0.05）;在72 h,CT>CC和MT>MC组具有促增殖作用（P<0.05）;2.3与对照组相比,浓度为30ng/ml下,在24 h测定CT>CC组有明显促增殖作用（P<0.05）;在48h测得CT>CC组,MT>MC组,MT<MC组具有促增殖作用（P<0.05）;在72h浓度下,CT>CC组促增殖作用强（P<0.05）;3、对硝基苯磷酸二钠基质动力学法（PNPP）测定补肾方药对大鼠成骨细胞的分化影响3.1与对照组相比,浓度为10 ng/ml时,在24 h是测定MT>MC组ALP增高P<0.05);在48h测得MT>MC组有明显促ALP作用（P<0.05）;在72h测得结果,MT>MC组,MT=MC组的ALP含量明显升高,（P<0.05）;3.2与对照组相比,浓度为20ng/ml时,在24 h测定CT>CC组、CT=CC组、MT>MC组和MT=MC组有促ALP作用（P<0.05）;在48h和72 h测定ALP的含量, CT>CC组有明显的促ALP分泌作用（P<0.05）;3.3与对照组相比,浓度为30ng/ml下,在24h是测定CT>CC组、MT>MC组有促ALP分泌作用,CT>CC组较明显（P<0.05）;在48h和72 h测得CT>CC组有促明显的促ALP分泌作用（P<0.05）;结论:1、补药单体配伍组>泻药单体配伍组（MT>MC）在10ng/ml浓度72h时测得的结果最高,推断低浓度的单体配伍对大鼠成骨细胞的增殖和分化具有促进作用;2、补药单体配伍组>泻药单体配伍组（MT>MC）可能具有量-效和时-效关系。推断其量效关系为:随着浓度（剂量）的增加对大鼠成骨细胞的增殖和分化作用反而减弱;同一浓度下,24h与72h相比较推断其时-效关系:72h时具有明显的促进成骨细胞增殖和分化的作用;3、补药生药配伍组>泻药生药配伍组（CT>CC）在30ng/ml时具有促进成骨细胞增殖和分化的作用,推断其量-效和时-效关系为:随着浓度（剂量）和时间的增加对大鼠成骨细胞的增殖和分化作用而增强;4、补药>泻药（TMed>CMed）的配伍关系,对成骨细胞具有更好的干预效果;就本方剂来讲起效部位可能是梓醇、淫羊藿苷、薯蓣皂苷元、丹参酮ⅡA、柚皮苷、羟甲香豆素之间的配伍;补肾方药由熟地黄、山药、淫羊藿、丹参、骨碎补、独活生药之间的配伍优于单体有效成分配伍,可能在生药配伍之中还有其他未知的成分;5、中药方剂的复杂性来源于在中药配伍的过程中新产生的或者含有其他未知的成分。通过本实验的研究为中药方剂学的研究进行了有益的探索,为中医学和中西医结合基础和临床提供一个实验性思路和方法。
夏扬[10]（2008）在《海藻酸钠—明胶共混体系为载体的可注射式组织工程骨的研究》文中研究说明目的:探讨海藻酸钠—明胶共混体系为载体的可注射式组织工程骨的理化性能、生物相容性及其在临床上的应用前景。方法:从兔骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行体外培养、分离和扩增,诱导向成骨细胞分化并进行检测和观察。探讨了不同浓度的氯化钙溶液对成骨细胞的影响作用。研究不同配比共混体系的理化性能和不同消毒方法对其的影响作用和成骨细胞在体系中的生物学行为。在从细胞遗传学角度考察了共混体系安全性的基础上,进行动物实验,观察材料的组织相容性和不同时间段新骨的形成。结果:骨髓间充质干细胞经诱导培养后分化为成骨细胞,Ca2+浓度对成骨细胞的代谢活性有影响作用。共混体系理化性能随不同配比的浓度、温度有所变化。各种消毒方法对其理化性能均有影响,其中,以高压蒸汽法对海藻酸钠粉末的影响最小。成骨细胞在共混体系中,呈悬浮状生长并增殖。植入共混体系/成骨细胞凝胶的动物,未见到有染色体型畸变。凝胶注射植入实验兔皮下后有软骨样组织和骨组织形成,并以软骨化骨的形式修复了实验动物的颅骨极限缺损。结论:骨髓间充质干细胞可通过体外诱导培养分化为成骨细胞。不同浓度和作用时间的氯化钙对成骨细胞具有影响作用。海藻酸钠—明胶共混体系的理化性能可满足作为成骨细胞载体的需要。高压蒸汽对海藻酸钠粉末进行消毒的方法对共混体系的理化性能影响最小。共混体系无明显致染色体型畸变作用。通过注射方式在动物软组织中有异位成骨作用。可以用来进行骨缺损的修复。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验小鼠 |
| 1.1.2 基础试剂 |
| 1.1.3 流式抗体与免疫组织抗体信息 |
| 1.1.4 实验仪器和设备 |
| 1.1.5 实验耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人胚样本取材 |
| 1.2.2 肢芽或长骨样本单细胞悬液准备 |
| 1.2.3 流式细胞分析和分选 |
| 1.2.4 成纤维集落形成和间充质成球分析实验 |
| 1.2.5 三系分化实验:成脂、成骨和成软骨分化实验 |
| 1.2.6 核糖核酸提取和定量聚合酶链反应 |
| 1.2.7 肾包膜下移植 |
| 1.2.8 肾包膜下移植切片的五色套染法 |
| 1.2.9 免疫荧光染色 |
| 1.2.10 苏木素-伊红染色 |
| 1.2.11 单细胞转录组测序 |
| 1.2.12 单细胞转录组测序数据的处理 |
| 1.2.13 非线性降维和聚类 |
| 1.2.14 物种比较分析 |
| 1.2.15 差异基因表达分析 |
| 1.2.16 单细胞基因调控网络分析 |
| 1.2.17 重建单细胞发育轨迹 |
| 1.2.18 转录组速率分析 |
| 1.2.19 转录本平均的细胞分选 |
| 1.2.20 基因功能注释分析 |
| 1.2.21 基因集分析 |
| 1.2.22 表面标志和转录因子分析 |
| 1.2.23 统计和重复性分析 |
| 1.2.24 线上数据获得途径 |
| 第二章 肢芽和长骨发育过程中单细胞转录组的整合分析 |
| 2.1 人胚肢芽和长骨样本的获得及预处理 |
| 2.2 人胚肢芽和长骨转录组数据中群体的整合性解析 |
| 第三章 肢芽发育过程中间质谱系特征的解析 |
| 3.1 肢芽发育过程中的群体转录组特征解析 |
| 3.2 肢芽发育过程中的进化保守性分析 |
| 第四章 长骨发育过程中成骨软骨谱系特征的解析 |
| 4.1 长骨发育过程中成骨软骨谱系群体转录组解析 |
| 4.2 长骨发育过程中的进化保守性分析 |
| 第五章 CADM1 鉴定为胚骨骼干祖细胞的表面分子 |
| 5.1 胚骨骼干祖细胞表面标志筛选和原位验证 |
| 5.2 CADM1 富集胚骨骼干祖细胞的功能学验证 |
| 第六章 胚骨骼干祖细胞自我更新,并经历成骨软骨生成分化 |
| 6.1 胚骨骼干祖细胞的自我更新和体外分化潜能解析 |
| 6.2 胚骨骼干祖细胞的体内分化潜能解析 |
| 第七章 脑颅骨发育过程中成骨生成谱系特征解析 |
| 7.1 颅骨发育中群体转录组特征解析 |
| 7.2 颅骨和长骨发育群体比较分析 |
| 7.3 颅骨群体不同源性群体成骨发育轨迹解析 |
| 第八章 结论、讨论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 讨论 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 综述:骨发育和修复的骨骼干细胞 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黄芪多糖 |
| 1.1.1 黄芪多糖的结构特点 |
| 1.1.2 黄芪多糖的生物学效应 |
| 1.2 动物实验替代法 |
| 1.2.1 3R原则 |
| 1.2.2 替代法（Alternatives） |
| 1.2.3 国外动物实验替代法研究的现状与发展 |
| 1.3 体外细胞学实验替代动物实验 |
| 1.3.1 正常体细胞体外培养 |
| 1.3.2 肿瘤细胞体外培养 |
| 1.4 三维细胞培养（Three-dimensional cell culture, 3D cell culture） |
| 1.4.1 三维细胞培养技术 |
| 1.4.2 微载体立体培养技术 |
| 1.4.3 明胶材料在三维立体培养中的应用 |
| 1.4.4 海藻酸盐水凝胶 |
| 1.5 本论文选题内容、目标、意义及创新 |
| 1.5.1 本课题的研究内容 |
| 1.5.2 本课题的研究目标 |
| 1.5.3 本课题的研究特色及创新之处 |
| 第2章 黄芪多糖在二维平面细胞培养中的生物学效应 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.2 MC-3T3-E1成骨细胞系培养及传代 |
| 2.1.3 黄芪多糖细胞毒性测定及实验剂量选择 |
| 2.1.4 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖影响的检测 |
| 2.1.5 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞ALP活性影响的检测 |
| 2.1.6 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞钙沉积影响的检测 |
| 2.1.7 黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因影响的检测 |
| 2.1.8 MC-3T3-E1成骨细胞激光免疫荧光共聚焦观察 |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞毒性剂量-反应关系 |
| 2.2.2 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖的影响 |
| 2.2.3 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞ALP活性的影响 |
| 2.2.4 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞钙沉积的影响 |
| 2.2.5 黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因的影响 |
| 2.2.6 MC-3T3-E1成骨细胞激光免疫荧光共聚焦观察 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 明胶/海藻酸微载体的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂与仪器 |
| 3.1.2 明胶/海藻酸微载体的制备 |
| 3.1.3 不同明胶和海藻酸钠比例制备微载体 |
| 3.1.4 不同浓度CaCl_2溶液作为接收液制备微载体 |
| 3.1.5 不同明胶和海藻酸钠总固体浓度制备微载体 |
| 3.1.6 不同电压制备微载体 |
| 3.1.7 不同距离制备微载体 |
| 3.1.8 不同注射器针头内径制备微载体 |
| 3.1.9 光学倒置显微镜观察 |
| 3.1.10 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同明胶和海藻酸钠比例对微载体的影响 |
| 3.2.2 不同浓度CaCl_2溶液作为接收液对微载体的影响 |
| 3.2.3 不同明胶和海藻酸钠总固体浓度对微载体的影响 |
| 3.2.4 不同电压对微载体的影响 |
| 3.2.5 不同距离对微载体的影响 |
| 3.2.6 不同注射器针头内径对微载体的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 黄芪多糖在细胞/明胶/海藻酸微载体三维立体培养中的生物学效应 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂与仪器 |
| 4.1.2 MC-3T3-E1细胞的接种和培养 |
| 4.1.3 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖影响的检测 |
| 4.1.4 MC-3T3-E1 成骨细胞活-死（Live-Dead）细胞染色 |
| 4.1.5 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞ALP活性影响的检测 |
| 4.1.6 黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因影响的检测 |
| 4.1.7 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖的影响 |
| 4.2.2 MC-3T3-E1成骨细胞形态和活-死细胞染色观察 |
| 4.2.3 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞ALP活性的影响 |
| 4.2.4 黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 黄芪多糖在细胞@明胶/海藻酸微载体三维立体培养中的生物学效应 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要试剂与仪器 |
| 5.1.2 MC-3T3-E1细胞的包被和培养 |
| 5.1.3 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖影响的检测 |
| 5.1.4 MC-3T3-E1成骨细胞活-死细胞染色 |
| 5.1.5 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞ALP活性影响的检测 |
| 5.1.6 黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因影响的检测 |
| 5.1.7 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖的影响 |
| 5.2.2 MC-3T3-E1成骨细胞形态和活-死细胞染色观察 |
| 5.2.3 黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞ALP活性的影响 |
| 5.2.4 黄芪多糖对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 二维平面培养和三维立体培养的比较 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要试剂与仪器 |
| 6.1.2 二维平面培养和三维立体培养对MC-3T3-E1细胞增殖影响的比较 |
| 6.1.3 二维平面培养和三维立体培养对MC-3T3-E1细胞ALP活性影响的比较 |
| 6.1.4 二维平面培养和三维立体培养对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因影响的比较 |
| 6.1.5 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 二维平面培养和三维立体培养对MC-3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 6.2.2 二维平面培养和三维培养对MC-3T3-E1细胞ALP活性的影响 |
| 6.2.3 二维平面培养和三维培养对MC-3T3-E1细胞成骨相关基因的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 研究中的不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 一、骨碎补及其黄酮类成分促进骨损伤修复的研究进展 |
| 二、成肌细胞及其在骨科中应用的研究进展 |
| 第一部分：转染 CNTF 基因促进大鼠成肌细胞去分化的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 第二部分：骨碎补总黄酮促进转 CNTF 成肌细胞向成骨分化的实验研究及机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 第三部分：微囊化骨碎补总黄酮预处理转 CNTF 成肌细胞促进引导性骨再生的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照及缩略语检索 |
| 文献综述一 中医促进骨愈合的研究进展 |
| 1.中医药促进骨愈合的机理 |
| 1.1 改善血液循环 |
| 1.2 促进钙盐的沉积 |
| 1.3 促进胶原基因的表达和胶原蛋白的合成 |
| 1.4 提高成骨细胞活性 |
| 1.5 提高微量元素的含量 |
| 1.6 调节内分泌 |
| 1.7 刺激骨生长因子的分泌与合成 |
| 2.中医促进骨愈合的治疗进展 |
| 2.1 单味中药研究进展 |
| 2.2 中药方剂内治法促进骨愈合 |
| 2.3 中药外治法促进骨愈合 |
| 2.4 针灸促进骨愈合 |
| 2.5 小针刀促进骨愈合 |
| 2.6 中药电热夹板促进骨愈合 |
| 3.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 骨生长因子研究进展 |
| 1.骨生长因子概述 |
| 1.1 BMP |
| 1.2 TGF-β |
| 1.3 FGF |
| 1.4 IGF |
| 1.5 VEGF |
| 2.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 国新牌骨痛膏促进家兔骨愈合的实验研究 |
| 前言 |
| 料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物与试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 动物模型制作方法 |
| 2.3 给药方法 |
| 2.4 标本取材 |
| 2.5 观察指标 |
| 2.6 图像采集分析 |
| 2.7 统计方法 |
| 结果 |
| 1.一般情况 |
| 2.生化指标测定结果 |
| 3.放射学检查结果 |
| 4.组织学观察结果 |
| 5.Ⅰ、Ⅲ型胶原苦味天狼星染色结果 |
| 6.BMP-2免疫组化染色结果及分析 |
| 7.BMP-2原位杂交染色结果及分析 |
| 讨论 |
| 1.方药立法依据 |
| 2.对ALP、钙、磷、镁及钙磷乘积的影响 |
| 3.促进骨形成修复 |
| 4.对Ⅰ、Ⅲ型胶的影响 |
| 5.对骨形态发生蛋白(BMP-2)的影响 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 钙、磷与骨代谢 |
| 1 骨代谢 |
| 1.1 破骨细胞与骨吸收 |
| 1.2 成骨细胞与骨形成 |
| 2 钙代谢 |
| 3 磷代谢 |
| 4 钙、磷与骨代谢 |
| 第二章 成骨细胞的体外培养及应用 |
| 1 成骨细胞的生物学特性 |
| 2 成骨细胞的原代培养 |
| 2.1 酶消化法 |
| 2.2 组织块移行生长法 |
| 2.3 骨内成骨细胞培养法 |
| 2.4 骨膜内成骨细胞培养 |
| 2.6 不同种属成骨细胞的培养 |
| 3 成骨细胞的鉴定 |
| 3.1 形态观察 |
| 3.2 生物学鉴定 |
| 4 成骨细胞的应用 |
| 5 成骨细胞的应用前景 |
| 第三章 体外成骨细胞的表型分化及其蛋白表达 |
| 1 成骨细胞的起源及体内生长发育 |
| 2 体外成骨细胞的分化及蛋白表达 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 成骨细胞原代培养方法的建立及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液的配制 |
| 2.2 成骨细胞的分离 |
| 2.2.1 成骨细胞的取材 |
| 2.2.2 消化传代 |
| 2.2.3 成骨细胞的纯化 |
| 2.3 活细胞的观察检测 |
| 2.3.1 台盼蓝染色 |
| 2.3.2 形态学观察 |
| 2.4 成骨细胞的鉴定 |
| 2.4.1 碱性磷酸酶（ALP）染色 |
| 2.4.2 矿化结节染色 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞成活率 |
| 3.2 成骨细胞原代及传代培养的生物学特征 |
| 3.3 碱性磷酸酶染色光镜观察 |
| 3.4 矿化结节光镜观察 |
| 4 讨论 |
| 第二章 钙、磷对成骨细胞形态及细胞增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液的配制 |
| 2.2 成骨细胞的培养 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.4 成骨细胞表面结构的观察 |
| 2.5 成骨细胞超微结构的观察 |
| 2.6 成骨细胞增殖的检测（MTT 法） |
| 2.7 成骨细胞细胞周期的检测 |
| 2.8 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 成骨细胞表面结构变化 |
| 3.2 成骨细胞超微结构的变化 |
| 3.3 成骨细胞的增殖 |
| 3.4 成骨细胞细胞周期的变化 |
| 4 讨论 |
| 第三章 钙、磷对成骨细胞体外表型分化功能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 成骨细胞的培养 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 细胞内碱性磷酸酶活性的检测（PNPP） |
| 2.4 细胞内总蛋白质的检测（BCA 法） |
| 2.5 Ⅰ型胶原的检测（酶联免疫吸附法） |
| 2.6 骨桥蛋白的检测（免疫组化法） |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 碱性磷酸酶活性变化 |
| 3.2 蛋白质含量的变化 |
| 3.3 Ⅰ型胶原含量的变化 |
| 3.4 骨桥蛋白含量的变化 |
| 4 讨论 |
| 第四章 钙、磷对成骨细胞Ca~(2+)、GJIC 和矿化功能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 成骨细胞的培养 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 细胞内Ca~(2+)测定 |
| 2.4 成骨细胞间隙连接通讯（GJIC）测定 |
| 2.5 钙化功能检测 |
| 2.6 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞内Ca~(2+)沉积的变化 |
| 3.2 细胞间隙连接通讯的变化 |
| 3.3 体外钙化功能的变化 |
| 4 讨论 |
| 第五章 钙、磷对成骨细胞标志性蛋白mRNA 表达的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 成骨细胞的培养 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 采样前准备 |
| 2.4 RNA 的提取 |
| 2.5 引物设计 |
| 2.6 cDNA 的制备 |
| 2.7 荧光定量PCR 反应 |
| 2.8 Ct 值与△△ct 计算方法及结果分析 |
| 2.9 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA 的检测 |
| 3.2 钙、磷对ALP、Col-Ⅰ、OPN 和BGP mRNA 的表达的影响 |
| 3.2.1 熔解曲线分析 |
| 3.2.2 ALP、Col-Ⅰ、OPN 和BGP mRNA 表达实时荧光定量结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 材料和方法 |
| 材料 |
| 1.1 质粒、细菌、细胞 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 方法 |
| 1.目的基因的获取 |
| 1.1 Ihh及eGFP引物的设计及合成 |
| 1.2 PCR扩增Ihh目的基因片段 |
| 1.2.1 PCR扩增体系(25ul)扩增Ihh基因片段 |
| 1.2.2 PCR大反应扩增体系体系(200ul)扩增Ihh |
| 1.2.3 Ihh目的基因片断的切胶回收 |
| 1.3 重叠PCR扩增Ihh-eGFP |
| 1.3.1 PCR扩增体系(25ul)分别扩增Ihh及eGFP |
| 1.3.2 PCR大反应扩增体系(200ul)分别扩增Ihh及eGFP |
| 1.3.3 Ihh及eGFP目的基因片断的切胶回收 |
| 1.3.4 重叠PCR扩增Ihh-eGFP的融合基因 |
| 1.3.5 PCR大反应体系(200ul)扩增Ihh-eGFP的融合基因 |
| 1.4 Ihh及Ihh-eGFP的大反应体系PCR反应产物的酶切与纯化 |
| 1.4.1 Ihh及Ihh-eGFP的大反应体系PCR反应产物的酶切 |
| 1.4.2 Ihh杆GFP DNA酶切体系的纯化回收 |
| 2.穿梭质粒pSNAV的获取和鉴定 |
| 2.1 大肠杆菌感受态的制备和pSNAV的转化 |
| 2.2 碱裂法小量提取质粒pSNAV |
| 2.3 pSNAV的酶切与纯化 |
| 3.纯化后质粒pSNAV与Ihh及Ihh-eGFP片段的连接反应 |
| 3.1 质粒pSNAV与Ihh的连接: |
| 3.2 质粒pSNAV与Ihh-eGFP片段 |
| 3.3 连接产物pSNAV-Ihh-eGFP的扩增 |
| 3.4 菌液PCR鉴定连接 |
| 3.5 质粒pSNAV-Ihh及pSNAV-Ihh-eGFP的测序 |
| 4.人胚软骨细胞的分离、培养、鉴定 |
| 4.1 人胚软骨细胞的分离 |
| 4.2 人胚软骨细胞的原代培养 |
| 4.3 人胚软骨细胞的传代培养 |
| 4.4 人胚软骨细胞的组织化学染色鉴定 |
| 4.4.1 软骨细胞特殊染色鉴定 |
| 4.4.2 软骨细胞免疫组织化学染色鉴定 |
| 4.4.3 软骨细胞透射电镜观察 |
| 5.pSNAV-Ihh及pSNAV-Ihh-eGFP分别转染人胚软骨细胞的生物学效应 |
| 5.1.基因体外表达人胚软骨细胞模型的建立 |
| 5.2.ExGen 500介导pSNAV-Ihh及pSNAV-Ihh-eGFP转染人胚软骨细胞生物学效应 |
| 5.2.1 ExGen 500介导pSNAV-Ihh-eGFP转染条件的优化 |
| 5.2.2 Ihh对细胞增殖生长曲线的研究 |
| 5.2.3 Ihh对细胞增殖活力的研究(MTT) |
| 5.2.4 细胞内Ihh基因及其受体PTCH的半定量分析 |
| 5.2.4.1 分别提取转染后软骨细胞中的总RNA |
| 5.2.4.2 分别逆转录提取出的总RNA |
| 5.2.4.3 Ihh及其受体PTCH的RT-PCR反应体系 |
| 第二章 结果 |
| 6.载体构建结果 |
| 6.1 Ihh目的基因PCR扩增结果 |
| 6.2 Ihh及eGFP目的基因PCR扩增结果: |
| 6.3 Ihh-eGFP融合基因重叠PCR扩增结果 |
| 6.4 pSNAV-Ihh的构建结果 |
| 6.5 pSNAV-Ihh-eGFP的构建结果 |
| 7.人胚软骨细胞培养结果 |
| 7.1 倒置显微镜观察结果 |
| 7.2 甲苯胺蓝染色结果 |
| 7.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果 |
| 7.4 培养软骨细胞投射电镜观察结果 |
| 8.目的基因转染后对软骨细胞的生物学效应 |
| 8.1 ExGen 500介导pSNAV-Ihh-eGFP转染条件的优化结果 |
| 8.2 Ihh对细胞增殖生长曲线的研究 |
| 8.3 Ihh对细胞增殖活力的研究(MTT) |
| 8.4 细胞内Ihh基因及其受体PTCH的半定量分析 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 目次 |
| 1 第1章 人间充质干细胞特异性单克隆抗体及其抗原特征的鉴定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体的制备 |
| 1.3.2 抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体ZUB1特异性鉴定 |
| 1.3.3 间充质干细胞表面抗原的检测 |
| 1.3.4 间充质干细胞ZUB1抗原表达规律的分析 |
| 1.3.5 间充质干细胞ZUB1抗原分子的鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 2 第2章 ZUB1抗原阳性骨髓间充质干细胞亚群的鉴定和生物学特性的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ZUB1抗原阳性骨髓间充质干细胞亚群的分离 |
| 2.3.2 ZUB1抗原阳性骨髓间充质干细胞亚群的体外培养 |
| 2.3.3 ZUB1抗原阳性骨髓间充质干细胞亚群CFU-F检测 |
| 2.3.4 ZUB1抗原阳性骨髓间充质干细胞亚群免疫表型的分析 |
| 2.3.5 ZUB1抗原阳性骨髓间充质干细胞亚群体外诱导多向分化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 总结 |
| 4 综述间充质干细胞生物学特性研究的历史与现状 |
| 4.1 间充质干细胞概念的由来 |
| 4.2 间充质干细胞的分离培养 |
| 4.3 间充质干细胞的自我更新和多向分化 |
| 4.4 间充质干细胞的免疫特性 |
| 4.5 间充质干细胞的异质性 |
| 4.6 骨髓原始间充质干细胞的免疫表型和细胞亚群 |
| 4.7 循环中间充质干细胞的特性 |
| 4.8 间充质干细胞与造血微环境 |
| 4.9 间充质干细胞与肿瘤 |
| 4.10 间充质干细胞的临床应用 |
| 4.11 小结与展望 |
| 5 参考文献 |
| 6 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 综述 |
| 第一章 成骨细胞、破骨细胞与骨代谢 |
| 1 骨 |
| 1.1 骨的构造及理化性质 |
| 1.2 骨重建 |
| 1.3 骨代谢 |
| 2 成骨细胞生物学特性 |
| 2.1 成骨细胞来源及发育 |
| 2.2 成骨细胞骨形成功能 |
| 2.3 成骨细胞相关病理学 |
| 3 破骨细胞生物学特性 |
| 3.1 破骨细胞来源及发育 |
| 3.2 破骨细胞骨吸收功能 |
| 4 成骨细胞和破骨细胞之间的通讯 |
| 4.1 成骨细胞-破骨细胞通讯 |
| 4.2 骨再建过程中成骨细胞与破骨细胞之间的通讯 |
| 5 展望 |
| 第二章 维生素D 对骨骼的作用 |
| 1 维生素D 来源及活性 |
| 2 维生素D 代谢 |
| 3 维生素D 作用的两种机制 |
| 3.1 维生素D 作用的基因途径 |
| 3.2 维生素D 作用的非基因途径 |
| 4 维生素D 对骨代谢的调节作用 |
| 4.1 维生素D 对钙、磷代谢的影响 |
| 4.2 维生素D 对骨细胞的直接效应 |
| 5 总结与展望 |
| 第三章 RANKL/RANK/OPG 与骨代谢 |
| 1 RANKL |
| 1.1 RANKL 的结构与表达 |
| 1.2 RANKL 促进破骨细胞分化及活化 |
| 1.3 RANKL 信号机制 |
| 2 RANK |
| 2.1 RANK 的结构与表达 |
| 2.2 RANK 对破骨细胞的影响 |
| 3 OPG |
| 3.1 OPG 的结构与表达 |
| 3.2 OPG 抑制破骨细胞分化及活化 |
| 3.3 OPG 的作用机制 |
| 4 RANKL/OPG 的表达与调节 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞增殖分化及周期的影响 |
| 1 材料、试剂及仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 成骨细胞培养 |
| 2.2 成骨细胞形态观察及鉴定 |
| 2.3 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞功能的影响 |
| 2.4 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞周期的影响 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 成骨细胞形态及特性 |
| 3.2 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞功能的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 成骨细胞生物学特性与鉴定 |
| 4.2 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞增殖的影响 |
| 4.3 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞分泌ALP 的影响 |
| 4.4 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞周期的影响 |
| 第二章 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞骨架、GJIC 及[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 1 材料、试剂 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 成骨细胞培养 |
| 2.2 成骨细胞内[Ca~(2+)]_i 的测定 |
| 2.3 荧光显微镜观察成骨细胞F-actin |
| 2.4 成骨细胞间隙连接通讯功能（GJIC）测定 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞内[Ca~(2+)]_i 的影响 |
| 3.2 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞F-actin 的影响 |
| 3.3 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞间隙连接通讯的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞内[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 4.2 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞F-actin 的影响 |
| 4.3 1α,25-(OH)_2D_3 对成骨细胞GJIC 的影响 |
| 第三章 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞超微形态结构的影响 |
| 1 材料、试剂 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 成骨细胞培养 |
| 2.2 扫描电镜观察成骨细胞表面形态 |
| 2.3 透射电镜的观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 成骨细胞表面超微形态 |
| 3.2 成骨细胞内部超微形态 |
| 4 讨论 |
| 第四章 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞RANKL 及OPG 表达的影响 |
| 1 材料、试剂及仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 成骨细胞培养 |
| 2.2 免疫组化法测定OPG 及RANKL 的表达 |
| 2.3 成骨细胞内RANKL、OPG mRNA 表达的测定 |
| 2.4 成骨细胞内RANKL、OPG 蛋白含量测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化测定RANKL 及OPG 的表达 |
| 3.2 总RNA 的检测 |
| 3.3 不同浓度1α,25-(OH)_2D_3对成骨细胞内RANKL、OPG mRNA 表达的影响 |
| 3.4 不同浓度1α,25-(OH)_2D_3对OB 内RANKL、OPG 蛋白含量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同浓度1α,25-(OH)_2D_3 对RANKL 蛋白及mRNA 表达的影响 |
| 4.2 不同浓度1α,25-(OH)_2D_3 对OPG 蛋白及mRNA 的影响 |
| 4.3 不同浓度1α,25-(OH)_2D_3对RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG的影响 |
| 第五章 RANKL 对体外培养破骨细胞形成及活化的影响 |
| 1 材料、试剂及仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 破骨细胞诱导培养 |
| 2.2 破骨细胞生长的形态学观察 |
| 2.3 破骨细胞染色及计数 |
| 2.4 破骨细胞细胞骨架F-actin 染色 |
| 2.5 象牙片吸收陷窝的检测 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 破骨细胞活体形态 |
| 3.2 破骨细胞TRAP 染色结果 |
| 3.3 破骨细胞骨架 F-actin |
| 3.4 象牙片吸收陷窝观测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RANKL 对破骨细胞生成及活化的影响 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文及获奖情况 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 补肾方药有效成分配伍对体外培养大鼠成骨细胞生物学活性的实验性比较研究 |
| 引言 |
| 第一部分 多次酶消化-贴块法对SD 大鼠原代成骨细胞的体外培养 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 补肾方药有效成分配伍对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的实验性比较研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述一 体外培养成骨细胞技术研究进展 |
| 综述二 补肾方剂对成骨细胞体外培养干预的研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 文献综述 |
| 第一部分 骨组织工程中的种子细胞 |
| 第二部分 骨组织工程的支架材料 |
| 第三部分 天然类可注射骨组织工程材料的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 主要设备和试剂 |
| 研究内容 |
| 第一部分 种子细胞的研究 |
| 实验一 兔骨髓基质细胞的培养及诱导成骨的研究 |
| 实验二 不同浓度氯化钙对成骨细胞的细胞毒性研究 |
| 第一部分 阶段小结 |
| 第二部分 有关海藻酸钠—明胶共混体系的研究 |
| 实验三 海藻酸钠—明胶共混体系的构建及有关物理性能的研究 |
| 实验四 不同消毒方法对海藻酸钠—明胶共混体系理化性能的影响 |
| 实验五 海藻酸钠—明胶共混体系凝胶与成骨细胞的相容性研究 |
| 实验六 海藻酸钠—明胶共混体系的致畸、致突变实验 |
| 第二部分 阶段小结 |
| 第三部分 海藻酸钠—明胶共混体系凝胶的体内实验 |
| 实验七 海藻酸钠—明胶共混体系凝胶体内异位成骨的研究 |
| 实验八 海藻酸钠—明胶共混体系凝胶修复颅骨极限缺损的研究 |
| 第三部分 阶段小结 |
| 全文总结 |
| 附图 |
